特表 2024-543510 トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２及びその検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-21

(54)【発明の名称】トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２及びその検出方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20241114BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20241114BHJP

   C12N 15/32 20060101ALI20241114BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20241114BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20241114BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20241114BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241114BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20241114BHJP

   C12Q 1/6832 20180101ALN20241114BHJP

   A23L 33/125 20160101ALN20241114BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A ZNA

A01H6/46

C12N15/32

C12N15/82 Z

C12Q1/6851

C12Q1/6876 Z

C12N15/09 110

C12Q1/686

C12Q1/6832 Z

A23L33/125

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529141

(86)(22)【出願日】2022-11-14

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 US2022079794

(87)【国際公開番号】W WO2023091888

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】63/264,098

(32)【優先日】2021-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/266,435

(32)【優先日】2022-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500207899

【氏名又は名称】パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】コン，ビン

(72)【発明者】

【氏名】クレイン，バージニア

(72)【発明者】

【氏名】ルー，アルバート エル．

(72)【発明者】

【氏名】ムッティ，ジャスディープ エス．

(72)【発明者】

【氏名】パスカル，エム．アレハンドラ

(72)【発明者】

【氏名】ラインハルト クレープス，クリステン デニス

(72)【発明者】

【氏名】バン ダイク，マリア マグダレナ

(72)【発明者】

【氏名】イン，ジャミン

【テーマコード（参考）】

4B018

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018LE06

4B018MD49

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ04

4B063QQ13

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書に開示される実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡコンストラクトに関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含む昆虫抵抗性コーン植物並びに試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２の存在を検出するためのアッセイ及びその組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２６及び配列番号２９に示されるとおりのヌクレオチド配列又は配列番号２６及び配列番号２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物。

【請求項2】

前記遺伝子型は、配列番号２７及び配列番号３０に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２７及び配列番号３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項3】

前記遺伝子型は、配列番号２８及び配列番号３１に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２８及び配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項4】

作動可能に連結された第１及び第２の発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトであって、前記第１の発現カセットは、
１）ＭＭＶエンハンサー、
２）ＬＬＤＡＶプロモーター、
３）ｚｍ－ｉ６イントロン、
４）ｃｒｙ１Ｂ．３４、及び
５）ｏｓ－ｕｂｉターミネーター
を含む、ＤＮＡコンストラクト。

【請求項5】

請求項４に記載のＤＮＡコンストラクトを含む植物。

【請求項6】

コーン植物である、請求項５に記載の植物。

【請求項7】

配列番号２１に示される配列又は配列番号２１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む植物。

【請求項8】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２。

【請求項9】

請求項８に記載のコーンイベントの植物部位。

【請求項10】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む種子であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択されるＤＮＡ分子を含み、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、種子。

【請求項11】

請求項１０に記載の種子から成長したコーン植物又はその部位。

【請求項12】

請求項８に記載のコーン植物から作製されたトランスジェニック種子。

【請求項13】

請求項１２に記載の種子から成長したトランスジェニックコーン植物又はその部位。

【請求項14】

配列番号２１及び２６～３１並びにその完全長相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。

【請求項15】

配列番号２２～２５及びその完全長相補体から選択される核酸配列を含むアンプリコン。

【請求項16】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来する生物学的試料であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記試料中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、生物学的試料。

【請求項17】

トランスジェニックコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の植物、植物組織又は種子を含む、請求項１６に記載の生物学的試料。

【請求項18】

前記トランスジェニックコーン植物イベントＤＰ－９１０５２１－２から抽出されたＤＮＡ試料であり、前記ＤＮＡ試料は、配列番号２１～３１及びその相補体から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、請求項１７に記載の生物学的試料。

【請求項19】

コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される、請求項１６に記載の生物学的試料。

【請求項20】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来し、且つ配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含む抽出物であって、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、抽出物。

【請求項21】

前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記抽出物中で検出可能である、請求項２０に記載の抽出物。

【請求項22】

トランスジェニックコーン植物イベントＤＰ－９１０５２１－２の植物、植物組織又は種子を含む、請求項２１に記載の抽出物。

【請求項23】

コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される組成物であり、前記組成物は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の抽出物。

【請求項24】

交配種コーン種子を作製する方法であって、
ａ）配列番号２１～３１から選択されるヌクレオチドを含む第１の近交系コーン系統と、異なる遺伝子型を有する第２の近交系系統とを有性交配すること、
ｂ）前記交配から後代を成長させること、及び
ｃ）それにより作製された前記交雑種子を収穫すること
を含む方法。

【請求項25】

前記第１の近交系コーン系統は、雌又は雄親である、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

鱗翅目害虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、
ａ）第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と有性交配し、それにより複数の第１世代後代植物を作製することであって、前記第１又は第２の親コーン植物は、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含む、作製すること、
ｂ）前記第１世代後代植物を自殖させ、それにより複数の第２世代後代植物を作製すること、及び
ｃ）前記イベントＤＰ－９１０５２１－２を含み、且つ鱗翅目害虫に対して抵抗性のある前記第２世代後代植物から選択すること
を含む方法。

【請求項27】

交配種コーン種子を作製する方法であって、
ａ）請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含む第１の近交系コーン系統を、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含まない第２の近交系系統と有性交配すること、及び
ｂ）それにより作製された前記交雑種子を収穫すること
を含む方法。

【請求項28】

コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む第２世代後代植物を、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡを欠く前記親植物と戻し交配し、それにより鱗翅目害虫に対して抵抗性のある戻し交配後代植物を作製するステップを更に含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、
ａ）前記試料を、第１のＤＮＡ分子対及び第２の異なるＤＮＡ分子対に接触させることであって、それにより、
１）コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用されるとき、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる第１のアンプリコンを産生し、及び
２）ＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用されるとき、ＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡの診断指標となる第２のアンプリコンを産生する、接触させること、
ｂ）核酸増幅反応を実施すること、及び
ｃ）そのように産生された前記アンプリコンを検出することであって、両方のアンプリコンの存在の検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡに対してヘテロ接合性であることを示し、前記第１のアンプリコンのみの検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡに対してホモ接合性であることを示す、検出すること
を含む方法。

【請求項30】

前記第１のＤＮＡ分子対は、プライマー対配列番号６及び７を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記第１及び第２のＤＮＡ分子対は、検出可能標識を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記検出可能標識は、蛍光標識である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記検出可能標識は、プライマー分子の１つ以上と共有結合的に会合される、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

コーン核酸を含む試料中における、イベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、
ａ）前記試料を、プライマー対であって、イベントＤＰ－９１０５２１－２からのゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応で使用されるとき、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生するプライマー対に接触させること、
ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりイベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる前記アンプリコンを産生すること、及び
ｃ）イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる前記アンプリコンを検出すること
を含む方法。

【請求項35】

イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる前記核酸分子は、前記核酸増幅連鎖反応によって産生されるアンプリコンである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記試料をプローブに接触させることを更に含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記プローブは、検出可能標識を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記検出可能標識は、前記プローブと共有結合的に会合される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ポリメラーゼ連鎖反応方法の結果として、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生するために、試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ鋳型を標的化する１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドプライマー。

【請求項40】

ａ）第１のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号６に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含み、及び
ｂ）第２のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号７に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含む、請求項３５に記載の複数のポリヌクレオチドプライマー。

【請求項41】

前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーは、少なくとも１８ヌクレオチドである、請求項４０に記載のプライマー。

【請求項42】

試料中における、イベントＤＰ－９１０５２１－２に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ）トウモロコシＤＮＡを含む前記試料を、ポリヌクレオチドプローブであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２からのＤＮＡとハイブリダイズし、且つ前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、非ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブに接触させること、
ｂ）前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、及び
ｃ）前記ＤＮＡへの前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含み、ハイブリダイゼーションの検出は、イベントＤＰ－９１０５２１－２の存在を示す、方法。

【請求項43】

核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸を検出するためのキットであって、前記核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は前記標的配列とのハイブリダイゼーション時、前記試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸配列の存在の診断指標となる、キット。

【請求項44】

前記核酸分子は、配列番号６～３１からのヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

前記核酸分子は、配列番号６～３１及びその相補体から選択されるプライマーである、請求項４３に記載のキット。

【請求項46】

前記遺伝子型は、配列番号２８又は配列番号３１の一方に１、２、３、４又は５つのヌクレオチドの変化を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のコーン植物。

【請求項47】

配列番号３に示されるヌクレオチド配列又は配列番号３の前記ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項48】

ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、前記方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含む、方法。

【請求項49】

前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントの前記ＤＮＡを修飾して、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントの前記ＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記修飾ＤＮＡ配列において重複された配列番号２６又は配列番号２９の全て又は一部を有する修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントの前記ＤＮＡを修飾して、配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項52】

前記除去は、配列番号３の１つ以上の調節エレメントからの、前記１つ以上の調節エレメントの活性に実質的に影響しない除去を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントの前記ＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記修飾ＤＮＡ配列から配列番号２６又は配列番号２９の全て又は一部が除去された修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントの前記ＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記修飾ＤＮＡ配列から配列番号３の少なくとも３０％が除去された修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

配列番号３の少なくとも８０％は、前記修飾ＤＮＡ配列から除去される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

配列番号３の全ては、前記修飾ＤＮＡ配列から除去される、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントゲノム編集システムと共に使用するためのガイドポリヌクレオチドを生成する方法であって、配列番号３の少なくとも一部を認識する１つ以上のガイドポリヌクレオチドを設計することと、前記ガイドポリヌクレオチドを合成することとを含む方法。

【請求項58】

受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有するＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡを修飾する方法であって、ゲノム改変組成物の一部として、請求項５７に記載の１つ以上のガイドポリヌクレオチドを前記ＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡに導入して、前記ＤＰ－９１０５２１－２イベントの前記ＤＮＡを修飾することを含む方法。

【請求項59】

ＣＡＳポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及びＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントドナーＤＮＡを含むＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントゲノム編集システム。

【請求項60】

受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有する、ＡＴＣＣに寄託されたＤＰ－９１０５２１－２イベントの少なくとも１つの発現カセットを修飾する方法であって、ゲノム編集技術を使用して、少なくとも１つの発現カセットを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２イベントに由来する得られたトウモロコシ植物は、少なくとも１つの修飾されたカセットを含む、方法。

【請求項61】

ｃｒｙ１Ｂ．３４の発現を改変することを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

商品植物製品を作製する方法であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含むコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物から生成された穀粒を加工することを含み、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、前記穀粒は、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される商品植物製品に加工され、前記組成物／商品植物製品は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む、方法。

【請求項63】

鱗翅目昆虫を防除する方法であって、前記鱗翅目昆虫を、イベントＤＰ－９１０５２１－２の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に曝すことを含む方法。

【請求項64】

前記鱗翅目昆虫は、ツマジロクサヨトウ（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記鱗翅目昆虫は、アメリカタバコガの幼虫（アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ））である、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記鱗翅目昆虫による被害は、イベントＤＰ－９１０５２１－２に由来するトウモロコシ穀粒又は穀実について防除される、請求項６３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本願は、２０２１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２６４，０９８号及び２０２２年１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２６６，４３５号明細書の利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された配列表の参照
２０２２年１０月２５年に作成され、９３キロバイトのサイズを有する、「８７６３＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」というファイル名を有するＸＭＬフォーマット配列表が本明細書と同時にコンピュータ可読形式で提出される。このＸＭＬフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本明細書に開示される実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡコンストラクトを含む植物分子生物学の分野に関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含む昆虫抵抗性コーン植物並びに試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２の存在を検出するためのアッセイ及びその組成物も含む。

【背景技術】

【0004】

コーンは、重要な作物であり、世界の多くの地域の主要な食料源である。害虫によって引き起こされる被害は、化学農薬などの防護対策が講じられているにもかかわらず、世界のコーン作物損失の主な要因である。このような事情を踏まえて、虫害の防除及び従来の化学農薬の必要性の低減を目的として、コーンなどの作物に昆虫抵抗性をもたらす遺伝子操作が行われている。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の一群は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）由来のδ－エンドトキシン群である。δ－エンドトキシンは、綿、ジャガイモ、イネ、ヒマワリ及びコーンなどの作物植物で問題なく発現されており、特定の状況で昆虫害虫に対する優れた防除を提供することが分かっている。（Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：９３９－９４３；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３１３－３２１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１５１－１１５５；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１０１－１１０４；ＰＣＴ公報国際公開第０１／１３７３１号パンフレット；及びＢｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）。

【0005】

植物におけるトランス遺伝子の発現は、個々の目的遺伝子の発現をドライブするカセットの向き及び組成並びに植物ゲノム中での位置（恐らくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）又は組込み部位の近くにある転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近接性に起因する）を含め、多くの異なる要因に影響されることが公知である（Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７）。

【0006】

有性交配の後代が目的のトランス遺伝子を含むかどうかを決定するため、特定のイベントの存在を検出することが可能であれば有利となるであろう。

【0007】

トランス遺伝子の存在の検出は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸プローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によって可能である。これらの検出方法では、概して、多くのＤＮＡコンストラクトについてコード領域が交換可能であるという理由のため、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子など、使用頻度の高い遺伝子エレメントに焦点が置かれている。結果として、かかる方法は、異なるイベント間、特に同じＤＮＡコンストラクト又は極めて類似したコンストラクトを使用して作られたイベント間を区別するには、挿入された異種ＤＮＡに隣接するフランキングＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でない限り、有用でないこともある。

【発明の概要】

【0008】

本実施形態は、昆虫抵抗性コーン（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））植物イベントＤＰ－９１０５２１－２、別名「トウモロコシ系統ＤＰ－９１０５２１－２」、「トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２」及び「ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ」、コーン植物イベントＤＰ－９１０５２１－２のＤＮＡ植物発現コンストラクト並びにコーン植物イベントＤＰ－９１０５２１－２及びその後代におけるトランス遺伝子コンストラクト、フランキング及び挿入（標的遺伝子座）領域を検出するための方法及び組成物に関する。

【0009】

一態様では、組成物及び方法は、昆虫抵抗性の単子葉作物植物を作製及び選択する方法に関する。組成物は、植物細胞及び植物で発現したときに昆虫に対する抵抗性を付与するＤＮＡコンストラクトを含む。一態様では、宿主細胞に導入され、そこで複製する能力のある、植物細胞及び植物で発現したときに植物細胞及び植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡコンストラクトが提供される。トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２は、プラスミドＰＨＰ７９６２０の形質転換によって産生された。本明細書に記載されるとおり、これらのイベントは、ｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子（ポリヌクレオチド配列番号４及びアミノ酸配列番号５）カセット（表１）を含み、これは、ある種の鱗翅目植物害虫に対する抵抗性を付与するものである。この昆虫防除成分は、鱗翅目昆虫種に対する有効性を示した。

【0010】

一部の実施形態は、本明細書に記載されるとおりのＤＰ－９１０５２１－２の特異的フランキング配列に関し、これを使用して、生物学的試料中のＤＰ－９１０５２１－２の同定方法を開発することができる。より詳細には、本開示は、ＤＰ－９１０５２１－２の５’及び／又は３’フランキング領域に関し、これを使用して特異的プライマー及びプローブを開発することができる。更なる実施形態は、かかる特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＤＰ－９１０５２１－２の存在の同定方法に関する。

【0011】

一部の実施形態によれば、試料中のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡプライマーセットであって、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーンから抽出されたゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応で使用されるとき、それぞれコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生するＤＮＡプライマーセットに接触させること、（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりアンプリコンを産生すること、及び（ｃ）アンプリコンを検出することを含む。一部の態様では、プライマーセットは、配列番号６及び７と、任意選択で配列番号８を含むプローブとを含む。

【0012】

一部の実施形態によれば、試料中のＤＰ－９１０５２１－２イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡプローブ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーンから抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子に接触させること、（ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、及び（ｃ）イベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーンから抽出されたＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。より具体的には、試料中のＤＰ－９１０５２１－２イベントに対応するＤＮＡ分子の存在の検出方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、イベントにユニークな配列、例えばジャンクション配列を含むＤＮＡプローブ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２から抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子に接触させること、（ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、及び（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。

【0013】

加えて、ＤＰ－９１０５２１－２特異的領域を検出するものである、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を同定するためのキット及び方法が提供される。

【0014】

ＤＰ－９１０５２１－２の少なくとも１つのジャンクション配列を含むＤＮＡ分子が提供され、ジャンクション配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、その挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞のＤＮＡとの間に位置するジャンクションにまたがる。ジャンクション配列の検出は、ＤＰ－９１０５２１－２イベントの診断指標となり得る。

【0015】

一部の実施形態によれば、昆虫抵抗性コーン植物を作製する方法は、（ａ）昆虫に対する抵抗性を付与する、本明細書に開示される発現カセットを含む第１の親コーン系統を、かかる発現カセットを欠いている第２の親コーン系統と有性交配し、それにより複数の後代植物を作製するステップ、及び（ｂ）昆虫抵抗性のある後代植物を選択するステップを含む。かかる方法は、任意選択で、後代植物を第２の親コーン系統と戻し交配することにより、昆虫抵抗性のある純種コーン植物を作製する更なるステップを含み得る。

【0016】

一部の実施形態は、昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、コーン細胞をＤＮＡコンストラクトＰＨＰ７９６２０で形質転換すること、形質転換されたコーン細胞をコーン植物に成長させること、昆虫に対して抵抗性を示すコーン植物を選択すること、及びコーン植物を稔性のコーン植物に更に成長させることを含む方法を提供する。この稔性のコーン植物を自家受粉するか、又は適合性のあるコーン品種と交配させることにより、昆虫抵抗性の後代を作製することができる。一部の実施形態は、コーン植物は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含み、前記遺伝子型は、配列番号２６及び配列番号２９に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。

【0017】

一部の実施形態は、生物学的試料中のトウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２を同定するためのＤＮＡ検出キットに更に関する。このキットは、ＰＣＲ同定プロトコルでの使用のための、ＤＰ－９１０５２１－２の５’又は３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、ＤＰ－９１０５２１－２の非天然標的遺伝子座ＤＮＡ内にあるか又はフランキングＤＮＡ内にある配列を特異的に認識する第２のプライマーとを含む。更なる実施形態は、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントＤＰ－９１０５２１－２の特異的領域と約８０％～１００％の配列同一性を有する配列に対応するか又はそれと相補的な配列を有する特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントＤＰ－９１０５２１－２の５’又は３’フランキング領域の一部を含む特異的領域に対応し得る。一部の実施形態では、第１又は第２のプライマーは、配列番号６～７、９～１０、１２～１３、１５～１６又は１８～１９のいずれか１つを含む。

【0018】

本明細書に開示される実施形態に包含される方法及びキットは、限定されないが、植物、植物材料又は植物材料を含むか若しくはそれに由来する生産物、限定されないが、食品又は飼料生産物（生鮮品又は加工品）などでイベントＤＰ－９１０５２１－２を同定することなど、種々の目的に使用することができ、加えて又は代わりに、本方法及びキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料との選別を目的としてトランスジェニック植物材料を同定するために使用することができ、加えて又は代わりに、本方法及びキットは、トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む植物材料の品質を決定するために使用することができる。本キットは、検出方法の実施に必要な試薬及び材料も含有し得る。

【0019】

更なる実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物又はその一部、限定されないが、コーン植物ＤＰ－９１０５２１－２の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核及び卵細胞の核並びにこれらに由来する後代に関する。別の実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２のトウモロコシ植物及び種子を標的とするＤＮＡプライマー分子は、特異的アンプリコン産物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ｐｍｉ、ｍｏ－ｐａｔ及びｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子カセットを含むプラスミドＰＨＰ７９６２０の概略図を示す。ＦＲＴ１及びＦＲＴ８７に隣接する組換え断片領域を、パーティクルボンバードメントによる形質転換中にトウモロコシゲノムに挿入した。プラスミドＰＨＰ７９６２０のサイズは、１７，７６３ｂｐである。（配列番号１）。

【図2】ｐｍｉ、ｍｏ－ｐａｔ及びｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子カセットを示すＰＨＰ７９６２０組換え断片領域の概略図を示す。組換え断片のサイズは、１３，９１７ｂｐである（配列番号２）。

【図3】ＤＰ－９１０５２１－２の形質転換及び開発の概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本明細書で使用されるとき、単数形「１つの」、「及び」及び「その」には、文脈上特に明確に指図されない限り、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「細胞」という表現は、複数のかかる細胞を含み、「そのタンパク質」という表現は、１つ又は複数のタンパク質及びその均等物を含む等となる。特に明示されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。添付の配列表に列挙され、本明細書で参照される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示される。各核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、表示される鎖を参照することによって相補鎖が含まれることが理解される。

【0022】

本開示の組成物は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託された種子並びにそれに由来する植物、植物細胞及び種子を含む。本出願人らは、２０２１年５月２６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０－２２０９ ＵＳＡにおいてトウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２の少なくとも６２５個の種子を寄託した（特許寄託番号ＰＴＡ－１２７０７８）。これらの寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づき管理されることになる。２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託されたこの種子は、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ－Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、７２５０ ＮＷ ６２^ｎｄ Ａｖｅｎｕｅ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｉｏｗａ ５０１３１－１０００によって管理されている寄託物から取られた。この申請の係属中は、Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓの長官及び申請に対して長官がその権利を有すると認めた者がこの寄託物を入手できる。本願の任意の請求項が許可されると、本出願人らは、米国特許法施行規則第１．８０８条に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０－２２０９による交配種トウモロコシの少なくとも６２５個の種子の寄託物の試料を公衆に利用可能にする。トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２の種子のこの寄託物は、公的寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間若しくは最後に請求があったときから５年又は本特許の効力が続く間のいずれか長い期間にわたって管理されることになり、その期間中に生存不能になった場合、交換されることになる。加えて、本出願人らは、寄託時に試料の生存能力についての指示を提供することを含め、米国特許法施行規則第１．８０１～１．８０９条の全ての要件を満たしている。本出願人らは、生物物質の移動又はその商業的な輸送に対して法が課す制限を撤回する権限を有しない。本出願人らは、本特許に基づき与えられるその権利又は植物品種保護法（合衆国法典第７巻第２３２１条以下）に基づくイベントＤＰ－９１０５２１－２に適用可能な権利のいかなる侵害も免除しない。無許可の種子増殖は禁止されている。種子は規制を受けることもある。

【0023】

第１の遺伝子カセット（ｐｍｉ遺伝子カセット）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）を含有する。植物組織で発現されたＰＭＩタンパク質は、マンノースを炭素源として用いて組織成長を可能にする形質転換中の選択マーカーとしての役割を果たす。ＰＭＩタンパク質は、３９１アミノ酸長であり、約４３ｋＤａの分子量を有する。ＰＨＰ７９６２０の組換え断片領域に存在するとき、ｐｍｉ遺伝子は、プロモーターを欠いているが、それは、フリッパーゼ組換え標的部位ＦＲＴ１の隣に位置するため、適切に置かれたプロモーターによる組換え後発現が可能である。ｐｍｉ遺伝子のターミネーターは、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））プロテイナーゼ阻害剤ＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子に由来するターミネーター領域である（Ｋｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。１つの更なるターミネーターが第１及び第２のカセット間に存在する：トウモロコシ１９－ｋＤａゼイン（Ｚ１９）遺伝子に由来するターミネーター領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ２４７６４７；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この更なるターミネーター要素は、下流のカセットへの潜在的な転写干渉を防止することが意図される。転写干渉は、両方がごく近接している場合、ある遺伝子の別の遺伝子に対する転写の抑制として定義される（Ｓｈｅａｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。遺伝子カセット間の１つ又は複数の転写ターミネーターの配置は、転写干渉の発生を減少させることが示されている（Ｇｒｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。

【0024】

第２の遺伝子カセット（ｍｏ－ｐａｔ遺伝子カセット）は、ＰＡＴタンパク質をコードするストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｏ－ｐａｔ）遺伝子のトウモロコシ最適化型を含有する（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。発現されたＰＡＴタンパク質は、ホスフィノトリシンに対する耐性を与える。ＰＡＴタンパク質は、１８３アミノ酸長であり、約２１ｋＤａの分子量を有する。ｍｏ－ｐａｔ遺伝子の発現は、カリフラワーモザイクウイルスゲノム由来の３５Ｓターミネーター領域（ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター；Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｇｕｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２）と共に、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））アクチン（ｏｓ－アクチン）遺伝子のプロモーター及びイントロン領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０１８１５９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ１５５４０８．１）によって制御される。２つの更なるターミネーターが転写干渉を防止するために第２及び第３のカセット間に存在する：ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））ユビキチン（ｓｂ－ｕｂｉ）遺伝子（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ遺伝子ＩＤ Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００．１；米国特許第９７２５７３１号明細書［Ａｂｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７］）及びγ－カファリン（ｓｂ－ｇｋａｆ）遺伝子（ｄｅ Ｆｒｅｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）のそれぞれに由来するターミネーター領域。

【0025】

第３の遺伝子カセット（ｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子カセット）は、ｃｒｙ１Ｂ－クラス遺伝子の変異体、ｃｒｙ１Ｃａ１遺伝子及びｃｒｙ９Ｄｂ１遺伝子（両方ともバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来する）（それぞれ国際公開第２０１６０６１１９７号パンフレット［Ｉｚｕｍｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２０１６］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３９６．１；米国特許第７５４１５１７号明細書［Ｆｌａｎｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９］）に由来する配列を含むキメラ遺伝子であるｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子を含有する。発現されたＣｒｙ１Ｂ．３４タンパク質は、中腸上皮の破壊を引き起こすことによって特定の鱗翅目害虫に対して有効である。Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質は、１，１４９アミノ酸長であり、約１２９ｋＤａの分子量を有する。ｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子の発現は、ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）ゲノム由来のエンハンサー領域（Ｄｅｙ ａｎｄ Ｍａｉｔｉ，１９９９）、ラミウム奇形葉関連ウイルス由来のプロモーター領域（ＬＬＤＡＶ）ゲノム（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、トウモロコシ翻訳開始因子６（ｚｍ－ｉ６）遺伝子由来のイントロン領域（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ遺伝子ＩＤ ＧＲＭＺＭ２Ｇ３１８４７５；米国特許第１０３４４２９０号明細書［Ｄｉｅｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９］）及びトウモロコシエクステンシン（ｚｍ－エクステンシン）遺伝子由来の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１１１１９４７．２；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１４９１８）の２コピーによって制御される。ｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子のターミネーターは、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））ユビキチン（ｏｓ－ｕｂｉ）遺伝子由来のターミネーター領域である（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ遺伝子ＩＤ ＬＯＣ＿Ｏｓ０６ｇ４６７７０．１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００）。

【0026】

ＰＨＰ７９６２０組換え断片領域は、２つのフリッパーゼ（ＦＬＰ）組換え標的配列、ＦＲＴ１及びＦＲＴ８７部位（それぞれＰｒｏｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）並びに１つのｌｏｘＰ（Ｄａｌｅ ａｎｄ Ｏｗ，１９９０）及び２つのａｔｔＢ組換え部位、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ３（それぞれＨａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００及びＫａｔｚｅｎ，２００７；Ｃｈｅｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）を含有する。これらの部位は、機能するために、植物中に天然に存在しない特定のリコンビナーゼ酵素を必要とすることから、これらの部位単独の存在は、何ら組換えを引き起こさない（Ｃｏｘ，１９８８；Ｄａｌｅ ａｎｄ Ｏｗ，１９９０；Ｔｈｏｒｐｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９８）。

【0027】

一部の実施形態によれば、ＤＰ－９１０５２１－２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２７０７８）と称される新規コーン植物を同定するための組成物及び方法が提供される。本方法は、ＤＰ－９１０５２１－２の５’及び／又は３’フランキング配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づく。ＰＣＲ反応で利用されたとき、トランスジェニックイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークなアンプリコンを産生することになるプライマー配列を含むＤＮＡ分子が提供される。一実施形態では、こうした分子を含むコーン植物及び種子が企図される。更に、こうしたプライマー配列を利用して、ＤＰ－９１０５２１－２イベントを同定するためのキットが提供される。

【0028】

本明細書で使用されるとき、用語「コーン」は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）又はトウモロコシを意味し、野生トウモロコシ種を含め、コーンと共に育種され得る全ての植物品種を含む。

【0029】

本明細書で使用されるとき、用語「昆虫抵抗性」及び「害虫に影響を与えること」は、限定されないが、昆虫を死滅させること、成長を遅らせること、生殖能力を低減すること、摂餌を阻害することなどを含め、任意の発生段階にある昆虫の摂餌、成長及び／又は行動に変化を生じさせることを指す。

【0030】

本明細書で使用されるとき、用語「殺害虫活性」及び「殺昆虫活性」は、適切な時間長さにわたって生物又は物質を摂餌させた後及び／又はそれに曝露した後、限定されないが、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避並びに害虫の他の行動的及び身体的変化を含め、多くのパラメータによって測定することのできる生物又は物質（例えば、タンパク質など）の活性を指して同義語として使用される。例えば、「殺害虫タンパク質」は、単独で又は他のタンパク質との組み合わせで殺害虫活性を示すタンパク質である。

【0031】

本明細書で使用されるとき、「インサートＤＮＡ」は、植物材料の形質転換に使用される発現カセット内にある異種ＤＮＡを指し、一方、「フランキングＤＮＡ」は、植物などの生物に自然に存在するゲノムＤＮＡのもの又は元のインサートＤＮＡ分子にとって異質な、形質転換法によって導入される外来性（異種）ＤＮＡのもの、例えば形質転換イベントに関連する断片のいずれも指し得る。「フランキング領域」又は「フランキング配列」は、本明細書で使用されるとき、元の非天然インサートＤＮＡ分子の直接上流にそれと隣接して位置するか、且つ／又は直接下流にそれと隣接して位置するかのいずれかの少なくとも１０ｂｐ（一部の狭義の実施形態では、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ及び最大で少なくとも５０００ｂｐ）の配列を指す。外来性ＤＮＡの形質転換手順により、各形質転換体に特徴的でユニークな種々のフランキング領域を含む形質転換体が生じ得る。従来の交配を通じて組換えＤＮＡが植物に導入されるとき、概してそのフランキング領域は変化しないことになる。数世代の植物育種及び従来の交配を通じてフランキング領域に一塩基変化が起こる可能性もあり得る。形質転換体は、異種インサートＤＮＡ片とゲノムＤＮＡとの間若しくは２つのゲノムＤＮＡ片間又は２つの異種ＤＮＡ片間にユニークなジャンクションを含むことにもなる。「ジャンクション」は、２つの特異的ＤＮＡ断片がつながっている箇所である。例えば、ジャンクションは、インサートＤＮＡがフランキングＤＮＡにつながっているところに存在する。ジャンクション箇所は、天然の生物に見られるものと比べて修飾された形態で２つのＤＮＡ断片が一体につながっている形質転換生物にも存在する。「ジャンクションＤＮＡ」は、ジャンクション箇所を含むＤＮＡを指す。本開示に示されるジャンクション配列は、トウモロコシゲノムＤＮＡとインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所を含んで、そのジャンクション箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２６）、そのジャンクション箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号２７）及びそのジャンクション箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号２８）の範囲に及ぶもの並びにインサートの３’末端とトウモロコシゲノムＤＮＡとの間に位置するジャンクション箇所を含んで、そのジャンクション箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２９）、そのジャンクション箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号３０）及びそのジャンクション箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号３１）の範囲に及ぶものである。本開示に示されるジャンクション配列は、標的遺伝子座とインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所も含む。一部の実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２の配列番号８又は２１は、標的遺伝子座とインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所を表す。フランキング領域を伴う完全なインサートは、配列番号３に表される。

【0032】

一実施形態では、コーンイベントＤＰ－９１０５２１を含む種子、植物及び植物部位であって、前記種子、植物及び植物部位は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１から選択されるＤＮＡ配列又は配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択されるＤＮＡ配列を含み、コーンイベントＤＰ－９１０５２１種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、種子、植物及び植物部位が提供される。別の実施形態では、コーンイベントＤＰ－９１０５２１を含む種子、植物及び植物部位であって、前記種子、植物及び植物部位は、配列番号３又は配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コーンイベントＤＰ－９１０５２１種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、種子、植物及び植物部位が提供される。

【0033】

本明細書で使用されるとき、核酸配列に言及した「異種」は、性的適合性のない異なる種を起源とするか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座がその天然形態と比べて実質的に修飾されている核酸配列である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのヌクレオチド配列の由来となった種と異なる種のものであり得るか又は同じ種のものである場合、そのプロモーターが自然中でそのヌクレオチド配列に作動可能に連結されて見出されることはない。異種タンパク質は、外来種を起源とし得るか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によってその元の形態と比べて実質的に修飾されている。

【0034】

用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有する核酸分子、すなわち作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳発現パターンに影響を及ぼす能力を有するものを指す。従って用語「遺伝子調節活性」は、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現に対し、その作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすことによって影響を及ぼす能力を指す。遺伝子調節活性は、正及び／又は負であり得、その効果は、その時間的、空間的、発生的、組織、環境、生理学的、病理学的、細胞周期及び／又は化学的応答の質によると共に、定量的又は定性的指標によっても特徴付けられ得る。

【0035】

「プロモーター」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する能力のあるヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。これに従えば、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することのできるヌクレオチド配列であり、プロモーターの固有のエレメントであり得るか、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され得るか、又は更に合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当業者によれば、異なる調節エレメントは、異なる組織又は細胞型における、又は異なる発生段階にある、又は異なる環境条件に応答した遺伝子の発現を導き得ることが理解される。ほとんどの細胞型でほぼ常に核酸断片の発現を生じさせるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義付けられていないため、異なる長さの核酸断片が同一の又は類似したプロモーター活性を有し得ることが更に認識される。

【0036】

「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡでは翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を含め、多くのパラメータに影響を及ぼし得る。

【0037】

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びその他の、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼす能力のある調節シグナルをコードする配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。

【0038】

ＤＮＡコンストラクトは、１つ以上の発現カセットを提供する一体に連結されたＤＮＡ分子の集合体である。ＤＮＡコンストラクトは、細菌細胞における自己複製が可能となるようにされた、機能性遺伝子エレメント、すなわちとりわけプロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、３’終結領域を提供するＤＮＡ分子の導入に有用な様々なエンドヌクレアーゼ酵素制限部位を含むプラスミドであり得るか、又はＤＮＡコンストラクトは、発現カセットなど、ＤＮＡ分子の線状の集合体であり得る。ＤＮＡコンストラクト内に含まれる発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写をもたらすのに必要な遺伝子エレメントを含む。発現カセットは、原核細胞又は真核細胞で発現するように設計することができる。本実施形態の発現カセットは、植物細胞で発現するように設計される。

【0039】

本明細書に開示されるＤＮＡ分子は、目的の生物における発現用の発現カセットに提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していること及び２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、隣接していて、且つ同じリーディングフレームにあることを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーターと第２の配列との間の機能的連結を指し示すことが意図され、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ、それを媒介する。カセットは、加えて、生物に同時形質転換しようとする少なくとも１つの追加的な遺伝子を含有し得る。代わりに、そうした１つ又は複数の追加的な遺伝子は、複数の発現カセット上又は複数のＤＮＡコンストラクト上に提供され得る。

【0040】

発現カセットは、５’から３’の転写方向に、宿主としての役割を果たす生物において機能性の転写及び翻訳開始領域、コード領域並びに転写及び翻訳終結領域を含み得る。転写開始領域（例えば、プロモーター）は、宿主生物にとって未変性若しくは類似体であり得るか、又は外来性若しくは異種であり得る。加えて、プロモーターは、天然配列であり得るか、又は代わりに合成配列であり得る。発現カセットは、加えて、発現カセットコンストラクトに５’リーダー配列を含有し得る。そのようなリーダー配列は、翻訳を強化するように働き得る。

【0041】

本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック」には、概して、その遺伝子型が異種核酸の存在によって変化し（当初からそのように変化したもの並びに初期トランスジェニックからの有性交配又は無性繁殖によって作り出されたものを含む）、且つかかる異種核酸を保持している任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位又は植物が含まれることが理解されるべきである。

【0042】

トランスジェニック「イベント」は、目的のトランス遺伝子を含む核酸発現カセットを含めた、１つ又は複数の異種ＤＮＡコンストラクトによる植物細胞の形質転換、トランス遺伝子が植物のゲノムに挿入されることによって生じる植物集団の再生及び特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる植物の選択によって作製される。イベントは、トランス遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは植物体の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」は、形質転換体と別の品種との間での有性異系交配によって作製された後代も指し、この後代は、異種ＤＮＡを含む。反復親との戻し交配後、その交配の後代には、形質転換した親からの挿入されたＤＮＡ及び連結しているフランキングゲノムＤＮＡが同じ染色体位置に存在する。後代植物は、従来の育種技法の結果として生じるインサートの配列変化を含み得る。用語「イベント」は、挿入されたＤＮＡと、その挿入されたＤＮＡに直接隣接するフランキング配列とを含む元の形質転換体からのＤＮＡであって、挿入されたＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体及び自殖によって生じる後代）と、その挿入されたＤＮＡを含まない親系統との有性交配の結果として、目的のトランス遺伝子を含め、挿入されたＤＮＡを受け取る後代に受け継がれることが期待されるであろうＤＮＡも指す。

【0043】

昆虫抵抗性ＤＰ－９１０５２１－２コーン植物の育種は、初めに、昆虫抵抗性を付与する本実施形態の発現カセットによる形質転換に由来するトランスジェニックＤＰ－９１０５２１－２イベント植物及びその後代を有する第１の親コーン植物を、かかる発現カセットを欠いている第２の親コーン植物と有性交配し、それにより複数の第１の後代植物を作製すること、及び次に昆虫に対して抵抗性のある第１の後代植物を選択すること、及び第１の後代植物を自殖させ、それにより複数の第２の後代植物を作製すること、及び次に第２の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択することによることができる。これらのステップは、第１の昆虫抵抗性の後代植物又は第２の昆虫抵抗性の後代植物を第２の親コーン植物又は第３の親コーン植物と戻し交配し、それにより昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製することを更に含み得る。用語「自殖」は、同じ生物からの配偶子及び／又は核の合体を含め、自家受粉を指す。

【0044】

本明細書で使用されるとき、用語「植物」には、全植物、植物の部位、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞及びその後代への言及が含まれる。一部の実施形態では、トランスジェニック植物の部位は、本明細書に開示されるＤＮＡ分子で以前に形質転換されていて、従って少なくとも一部はトランスジェニック細胞からなるトランスジェニック植物又はその後代を起源とする、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚並びに花、茎、果実、葉及び根を含む。

【0045】

本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞」には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子が含まれる。使用し得る植物クラスは、概して、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含めた、形質転換技法に適している高等植物クラスと同程度に広範である。

【0046】

「形質転換」は、核酸断片を宿主生物のゲノムに移入する結果、遺伝的に安定して受け継がれるようになることを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主植物は、「トランスジェニック」植物と称される。

【0047】

本明細書で使用されるとき、用語「後代」は、イベントＤＰ－９１０５２１－２の文脈では、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む親植物の任意の世代の子孫を指す。

【0048】

本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞への導入能及びそこでの複製能のある組換えコンストラクト、典型的にはＤＮＡコンストラクトに取り込まれ得る。かかるコンストラクトは、複製システム並びに所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写能及び翻訳能を有する配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定したトランスフェクション又はトランスジェニック植物の構築に好適ないくつかのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５；補遺、１９８７）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＦｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下にある１つ以上のクローニングされた遺伝子並びに優勢選択マーカーを含む。かかる植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導性の若しくは構成的な、環境的に若しくは発生的に調節された又は細胞特異的若しくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及び／又はポリアデニル化シグナルも含有することができる。

【0049】

インサートを植物細胞のゲノムに導入する過程では、インサート及び／又はゲノムフランキング配列の何らかの欠失又は他の変化が起こることも珍しくない。従って、本明細書に提供されるプラスミド配列の関連性のあるセグメントは、切断を含む何らかの軽微な変異を含む可能性がある。本明細書に提供されるフランキング配列及びジャンクション配列についても、この可能性がある。従って、本主題のフランキング及び／又はインサート配列と何らかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、本主題の開示の範囲内にある。本開示の配列との同一性は、本明細書に例示される又は記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。本明細書に提供されるとおりのハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション条件も、本主題の開示のかかる植物及びポリヌクレオチド配列を定義するのに用いることができる。フランキング配列＋完全インサート配列を含む配列は、寄託された種子を基準として確認することができる。

【0050】

一部の実施形態では、２つの異なるトランスジェニック植物を交配することにより、２つの独立に分離する加えられた外因性遺伝子を含む子孫を作製することもできる。適切な後代の自殖により、加えられた外因性遺伝子に関してホモ接合の植物を作製することができる。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も栄養繁殖と同じく企図される。

【0051】

「プローブ」は、従来の合成の検出可能標識又はレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤又は酵素が取り付けられている単離核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、例えばイベントからのＤＮＡを含むコーン植物又は試料からであるかにかかわらず、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２からの単離されたＤＮＡの鎖と相補的である。プローブには、デオキシリボ核酸又はリボ核酸が含まれるのみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、且つその標的ＤＮＡ配列の存在の検出に使用することができるポリアミド及び他の修飾ヌクレオチドも含まれる。

【0052】

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールする単離核酸であり、それによりプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドが形成され、次にはそれが標的ＤＮＡ鎖に沿ってポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより伸張される。プライマー対とは、例えばＰＣＲ又は他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅へのその使用を指す。「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡセグメントの増幅に用いられる技法である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，８００，１５９号明細書を参照されたく；参照により本明細書に援用される）。

【0053】

プローブ及びプライマーは、操作者が決定したハイブリダイゼーション条件又は反応条件で標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択の検出方法で有用となるのに十分な長さである任意の長さであり得る。概して、１１ヌクレオチド以上の長さ、１８ヌクレオチド以上及び２２ヌクレオチド以上が用いられる。かかるプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。実施形態に係るプローブ及びプライマーは、標的配列と完全なＤＮＡ配列類似性の連続するヌクレオチドを有し得るが、標的ＤＮＡ配列と異なり、且つ標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイズ能を保持しているプローブが従来方法によって設計され得る。プローブはプライマーとしても使用され得るが、概して標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、増幅過程に使用されない。

【0054】

特異的プライマーは、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を同定するための「特異的プローブ」として使用し得るアンプリコンを作製するため、組込み断片の増幅に使用され得る。プローブによる試料への結合を許容する条件下でプローブが生物学的試料の核酸にハイブリダイズすると、その結合を検出することができ、従って生物学的試料中にイベントＤＰ－９１０５２１－２が存在すると指示することが可能となる。本開示のある実施形態では、特異的プローブは、適切な条件下でイベントの５’又は３’フランキング領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、且つそれに隣接する外来性ＤＮＡの一部も含む配列である。特異的プローブは、イベントの特異的領域と少なくとも８０％、８０及び８５％、８５及び９０％、９０及び９５％及び９５及び１００％同一の（又は相補的な）配列を含み得る。

【0055】

プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５（定期更新）（以下では「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５」）；及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、バージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；及びＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５（登録商標）、１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー分析ツールなど、この目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列から導き出すことができる。加えて、当業者に公知の手引きを用いて配列を目視で読み取り、プライマーを手作業で同定することができる。

【0056】

「キット」は、本明細書で使用されるとき、本開示の方法の実施形態の実施、より詳細には生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２の同定を目的とした一組の試薬及び任意選択で説明書を指す。キットが使用され得、その構成要素は、品質管理（例えば種子ロットの純度）、植物材料中又は限定されないが、食品又は飼料生産物など、植物材料を含むか又はそれに由来する材料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２の検出を目的として具体的に調整することができる。「植物材料」は、本明細書で使用されるとき、植物から入手されたか又はそれに由来する材料を指す。

【0057】

本明細書に開示されるフランキングＤＮＡ及びインサート配列をベースとするプライマー及びプローブを使用すると、開示される配列を従来の方法により、例えば、かかる配列のリクローニング及びシーケンシングにより確認する（及び必要に応じて修正する）ことができる。核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション又は増幅方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベントからのＤＮＡの存在を同定し得る。

【0058】

核酸分子は、別の核酸分子の「相補体」であると、それらが完全な相補性又は最小限の相補性を呈する場合に言われる。本明細書で使用されるとき、分子は、それらの分子の一方のあらゆるヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的であるとき、「完全な相補性」を呈すると言われる。２つの分子は、それらが少なくとも従来の「低いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが従来の「高いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９により、且つＨａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．により、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に記載されており、従って完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱によって分子が二本鎖構造を形成する能力が完全になくならない限りは許容できる。核酸分子がプライマー又はプローブとしての役割を果たすために、利用される詳細な溶媒及び塩濃度の下で配列が安定した二本鎖構造を形成することを可能とするのに十分な相補性がありさえすればよい。

【0059】

ハイブリダイゼーション反応では、特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、決定的因子は、最終的な洗浄溶液のイオン強度及び温度である。熱的融点（Ｔ_ｍ）は、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズするときの（一定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔ_ｍはＭｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７－２８４：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％形態）－５００／Ｌ（式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）から概算することができる。Ｔ_ｍは、１％のミスマッチ毎に約１℃ずつ低下する。このように、所望の同一性の配列をハイブリダイズさせるため、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を調整することができる。例えば、＞９０％の同一性を有する配列を得たい場合、Ｔ_ｍを１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列及びその相補配列についてのＴ_ｍより約５℃低くなるように選択される。しかしながら、一部の実施形態では、他のストリンジェンシー条件が適用され得、重度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも１、２、３又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも６、７、８、９又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、低いストリンジェンシー条件は、Ｔ_ｍよりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができるなどが含まれる。

【0060】

この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の組成並びに所望されるＴ_ｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に記載されることを理解するであろう。所望ミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ_ｍをもたらす場合、使用者は、より高い温度を用いることができるように、ＳＳＣ濃度を増加させることを選択し得る。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳述されている。

【0061】

一部の実施形態では、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子と同じ長さを有する。一部の実施形態では、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長い又は短い。一部の実施形態では、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１％、２％、３％、４％又は５％長い又は短い。一部の実施形態では、相補配列は、ヌクレオチド毎に見たときに相補的であり、すなわちミスマッチのヌクレオチドがない（いずれのＡもＴと対合し、いずれのＧもＣと対合する）ということになる。一部の実施形態では、相補配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ未満のミスマッチを含む。一部の実施形態では、相補配列は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％又はそれ未満のミスマッチを含む。

【0062】

参照配列（対象）に対する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大限のパーセント配列同一性を実現した後、いかなるアミノ酸保存的置換も配列同一性の一部と見なすことなく、候補配列（問い合わせ）中、参照配列のそれぞれのアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージとして決定される。パーセント配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にある様々な方法において、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２などの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較下の配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを実現するためにどのアルゴリズムが必要かを含め、配列のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。２つの配列間のパーセントの同一性は、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（例えば、クエリ配列のパーセントの同一性＝クエリ配列と対象配列との間の同一の位置の数／クエリ配列の位置の総数×１００）。

【0063】

特定の増幅プライマー対を使用した標的核酸配列の（例えば、ＰＣＲによる）増幅に関して、ストリンジェントな条件とは、プライマーが対応する野生型配列（又はその相補体）を有したならばＤＮＡ熱増幅反応で結合し、任意選択でユニークな増幅産物であるアンプリコンを産生するであろう標的核酸配列に限り、そのプライマー対がハイブリダイズすることを許容するものである。

【0064】

本明細書で使用されるとき、「増幅されたＤＮＡ」又は「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交配から得られたコーン植物が、本明細書に開示されるコーン植物からのトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するため、コーン植物の組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接するフランキング配列に由来する第１のプライマーと、挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含むＤＮＡプライマー対を使用した核酸増幅方法に供すると、イベントＤＮＡの存在の診断指標となるアンプリコンが産生される。代わりに、第２のプライマーは、フランキング配列に由来し得る。アンプリコンは、同様にイベントの診断指標になる長さ及び配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の合計長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって産生可能な任意の長さのアンプリコンに至るまでの範囲の長さであり得る。代わりに、プライマー対は、挿入されたＤＮＡの両側にあるフランキング配列に由来することができ、そのため、ＰＨＰ７９６２０発現コンストラクトのインサートヌクレオチド配列全体並びにトランスジェニックインサートに隣接する配列の一部分を含むアンプリコンが産生されることになる。フランキング配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列から離れた位置にあり得、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大で増幅反応の限界に至るまでの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマー二量体を具体的に除外する。

【0065】

核酸増幅は、ＰＣＲを含め、当技術分野で公知の様々な核酸増幅方法のいずれによっても達成され得る。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書並びにＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）（上掲）に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ＫｂのゲノムＤＮＡ及び最大４２ＫｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５－５６９９，１９９４）。本開示の実施形態の実施では、ＤＮＡ増幅のこれらの方法並びに当技術分野で公知の他の方法を用いることができる。具体的な実験室条件に合わせて具体的なＰＣＲプロトコルの幾つものパラメータを調整する必要があり得ること及びわずかに変更され得、それでもなお同様の結果を集めることが可能であることが理解される。それらの調整は、当業者に明らかであろう。

【0066】

これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出され得、その技術としては、限定されないが、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４１６７－４１７５，１９９４）が挙げられ、隣接するフランキングＤＮＡ配列及び挿入ＤＮＡ配列の両方と重複する、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。目的の領域のＰＣＲ（例えば、挿入配列中に１つのプライマー及び隣接するフランキング配列中に１つのプライマーを用いる）後、一本鎖ＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、予想される次の塩基に特異的なＤＮＡポリメラーゼ及び標識ｄｄＮＴＰを用いる一塩基伸長反応の鋳型として機能し得る。読取り値は、蛍光又はＥＬＩＳＡベースであり得る。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるインサート／フランキング配列の存在を指示している。

【0067】

別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（２０００）Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８－２４によって記載されるとおりのパイロシーケンシング技法である。この方法では、隣接するＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域からの一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入された配列に１つのプライマー及びフランキング配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸及びルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個別に加え、取込みの結果、光シグナルが生じ、それを測定する。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション並びに単一塩基又は多塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／フランキング配列の存在を指示している。

【0068】

Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２－４９８によって記載される蛍光偏光も、アンプリコンを検出するために使用され得る方法である。この方法を用いて、フランキングと挿入されたＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入されたＤＮＡに１つのプライマー及びフランキングＤＮＡ配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの取込みが起こる。取込みは、偏光の変化として蛍光光度計を用いて測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／フランキング配列の存在を指示している。

【0069】

定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量化する方法として記載され、市販品製造者が提供する説明書の中で十分に理解されている。簡潔に言えば、かかるｑＰＣＲ方法の１つでは、フランキングとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及びフランキングゲノム配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＦＲＥＴプローブがハイブリダイズする結果、蛍光部分の切断及び放出が起こり、ＦＲＥＴプローブのクエンチング部分から離れる。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによるフランキング／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

【0070】

Ｔｙａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３－３０８に記載されるとおり、配列検出における使用のための分子ビーコンが記載されている。簡潔に言えば、フランキングとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブがユニークな構造である結果、それは、蛍光部分とクエンチング部分とをごく接近した状態に保つ二次構造を備えることになる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（例えば、インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及びフランキング配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＰＣＲ増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズする結果、プローブ二次構造が取り除かれて、蛍光部分とクエンチング部分とが空間的に分離する。蛍光シグナル結果。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによるフランキング／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

【0071】

アンプリコン内に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応によって産生されたアンプリコンの検出に用いられるなおも別の方法である。

【0072】

害虫としては、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）等、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）から選択される昆虫が挙げられる。

【0073】

鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の幼虫及び成虫が対象とされ、これには、限定されないが、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）のアワヨトウ、ネキリムシ、シャクトリムシ及びタバコガである、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＪＥ Ｓｍｉｔｈ）（ツマジロクサヨトウ）；シロイチモジヨトウ（Ｓ．ｅｘｉｇｕａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ビートアワヨトウ）；ハスモンヨトウ（Ｓ．ｌｉｔｕｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ハスモンヨトウ、クラスターキャタピラー）；マメストラ・コンフィグラタ・ウォーカー（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ Ｗａｌｋｅｒ）（バーサヨトウムシ）；ヨトウガ（Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コナガ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ Ｈｕｆｎａｇｅｌ）（タマナヤガ）；Ａ．オルトゴニア・モリソン（Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（ウエスタンカットワーム）；ニセタナヤガ（Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（グラニュレートカットワーム）；アラバマ・アルギラセア・ヒューブナー（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（コットンリーフワーム）；イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（キャベツルーパー）；ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ）（ダイズシャクトリムシ）；アンチカルシア・ゲマタリス・ヒューブナー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ベルベットビーンキャタピラー）；ヒペナ・スカブラ・ファブリシウス（Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（グリーンクローバーワーム）；ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ニセアメリカタバコガ）；プセウダレチア・ユニプンクタ・ハワース（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（ヨトウムシ）；アセチス・ミンダラ・バーンズ・アンド・マクダノー（Ａｔｈｅｔｉｓ ｍｉｎｄａｒａ Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｍｃｄｕｎｎｏｕｇｈ）（ラフスキンカットワーム）；エウクソア・メソリア・ハリス（Ｅｕｘｏａ ｍｅｓｓｏｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（ダークサイデッドカットワーム）；ミスジアオリンガ（Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（ミスジアオリンガ）；Ｅ．ビデラ・ファブリシウス（Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（クサオビリンガ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（アメリカボールワーム）；アメリカタバコガ（Ｈ．ｚｅａ Ｂｏｄｄｉｅ）（アメリカタバコガの幼虫又はオオタバコガの幼虫）；メランコリ・ピクタ・ハリス（Ｍｅｌａｎｃｈｒａ ｐｉｃｔａ Ｈａｒｒｉｓ）（ゼブラキャタピラー）；エギラ（キシロミゲス）・クリアリス・グロート（Ｅｇｉｒａ（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）ｃｕｒｉａｌｉｓ Ｇｒｏｔｅ）（シトラスカットワーム）；メイガ科（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ）の穿孔虫、繭を作る昆虫、ウェブワーム、コーンワーム及び葉を食い荒らす幼虫である、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ヨーロッパアワノメイガ）；アミエロイス・トランシテラ・ウォーカー（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ（ネーブルオレンジワーム）；スジコナマダラメイガ（Ａｎａｇａｓｔａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ）（スジコナマダラメイガ）；スジマラダメイガ（Ｃａｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ）（アーモンド蛾）；ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（ニカメイガ）；Ｃ．パルテルス（Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）（ソルガムボーラー）；ガイマイツヅリガ（Ｃｏｒｃｙｒａ ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ）（ガイマイツヅリガ）；ウスギンツトガ（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（コーンルートウェブワーム）；シバツトガ（Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ Ｚｉｎｃｋｅｎ）（ブルーグラスウェブワーム）；コブノメイガ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ）（コブノメイガ）；デスミア・フネラリス・ヒューブナー（Ｄｅｓｍｉａ ｆｕｎｅｒａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（グレイプリーフフォルダー）；ジアファニア・ヒアリナタ・リンネ（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（メロンワーム）；アメリカウリメイガ（Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ Ｓｔｏｌｌ）（ピックルワーム）；ジアトラエア・グランジオセラ・ダイアー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ Ｄｙａｒ）（サザンウエスタンコーンボーラー）、Ｄ．サッカラリス・ファブリシウス（Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（サトウキビボーラー）；エオレウマ・ロフチニ・ダイアー（Ｅｏｒｅｕｍａ ｌｏｆｔｉｎｉ Ｄｙａｒ）（メキシコライスボーラー）；チャマダラメイガ（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（タバコ（カカオ）蛾）；ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ハチノスツヅリガ）；クロオビクロメイガ（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（ソドウェブワーム）；ホメオソマ・エレクテラム・フルスト（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ Ｈｕｌｓｔ）（ヒマワリ蛾）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｚｅｌｌｅｒ）（レサーコーンストークボーラー）；コハチノスツヅリガ（Ａｃｈｒｏｉａ ｇｒｉｓｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（コハチノスツヅリガ）；ヘリキスジノメイガ（Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（シロオビノメイガ）；オルサガ・シリサリス・ウォーカー（Ｏｒｔｈａｇａ ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（チャノキウェブ蛾）；マメノメイガ（Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ Ｇｅｙｅｒ）（マメノメイガ）；シメマダラメイガ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（シメマダラメイガ）；イッテンオオメイガ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ Ｗａｌｋｅｒ）（イッテンオオメイガ）；ウデア・ルビガリス・グネ（Ｕｄｅａ ｒｕｂｉｇａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ）（セロリリーフタイヤー）；並びにハマキガ科（Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ）のハマキムシ、芽を食う毛虫、シードワーム及びフルーツワームである、アクレリス・グロブラナ・ウォルシンガム（Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（ウエスタンブラックヘッドバドワーム）；Ａ．バリアナ・ファーナルド（Ａ．ｖａｒｉａｎａ Ｆｅｒｎａｌｄ）（イースタンブラックヘッドバドワーム）；アルキプス・アルギロスピラ・ウォーカー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ Ｗａｌｋｅｒ）（フルーツツリーリーフローラー）；Ａ．ロサナ・リンネ（Ａ．ｒｏｓａｎａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヨーロッパリーフローラー）；及び他のハマキ種（Ａｒｃｈｉｐｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コカクモンハマキ（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｖｏｎ Ｒｏｅｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ）（リンゴコカクモンハマキ）；コキリス・ホスペス・ウォルシンガム（Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（バンデッドサンフラワーモス）；シディア・ラチフェレアナ・ウォルシンガム（Ｃｙｄｉａ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（フィルバートワーム）；コドリンガ（Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コドリンガ）；プラチノタ・フラベダナ・クレメンス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（マダラハマキムシ）；Ｐ．スツルタナ・ウォルシンガム（Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（オムニボラスリーフローラー）；ホソバヒメハマキ（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ Ｄｅｎｉｓ＆Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｅｌｌｅｒ）（ヨーロッパブドウツルガ）；リンゴシロヒメハマキ（Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ ｏｃｅｌｌａｎａ Ｄｅｎｉｓ＆Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｅｌｌｅｒ）（アイスポッテッドバッドモス）；ホソバヒメハマキ（Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（グレイプベリーモス）；ブドウホソハマキ（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ブドウの害虫蛾）；ボナゴタ・サルブリコラ・メイリック（Ｂｏｎａｇｏｔａ ｓａｌｕｂｒｉｃｏｌａ Ｍｅｙｒｉｃｋ）（ブラジルアップルリーフローラー）；ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ Ｂｕｓｃｋ）（ナシヒメシンクイ）；スレイマ・ヘリアンサナ・ライリー（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ Ｒｉｌｅｙ）（サンフラワーバッドモス）；アルギロテニア種（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｓｐｐ．）；及びコリストネウラ種（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｓｐｐ．）が挙げられる。

【0074】

鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の選択される他の作物栽培学的害虫としては、限定されないが、アルソフィラ・ポメタリア・ハリス（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（秋シャクトリムシ）；モモキバガ（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ）（モモキバガ）；アニソタ・セナトリアＪ．Ｅ．スミス（Ａｎｉｓｏｔａ ｓｅｎａｔｏｒｉａ Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）（オレンジストライプオークワーム）；ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）（柞蚕蛾）；カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（カイコ）；ブックラトリクス・ツルベリエラ・バスク（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ Ｂｕｓｃｋ）（コットンリーフパーフォレーター）；ミヤマモンキ（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（アルファルファキャタピラー）；ダタナ・インテジェリマ・グロート・アンド・ロビンソン（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ Ｇｒｏｔｅ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）（クルミキャタピラー）；デンドロリムス・シビリクス・チェトヴェリコフ（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ）（シベリアシルク蛾）、ニレシャクトリムシ（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ニレシャクトリムシ）；エラニス・チリアリア・ハリス（Ｅｒａｎｎｉｓ ｔｉｌｉａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（リンデンルーパー）；エウプロクチス・クリソルホエア・リンネ（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（シロバネドクガ）；ハリシナ・アメリカナ・ゲラン・メヌヴィル（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）（グレイプリーフスケルトナイザー）；ヘミロイカ・オレビアエ・コックレル（Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ ｏｌｉｖｉａｅ Ｃｏｃｋｒｅｌｌ（レンジキャタピラー）；アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ Ｄｒｕｒｙ）（アメリカシロヒトリ）；ケイフェリア・リコペルシセラ・ウォルシンガム（Ｋｅｉｆｅｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（トマトピンワーム）；ランブダ・フィスセラリア・フィスセラリア・フルスト（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ Ｈｕｌｓｔ）（イースタンヘムロックルーパー）；Ｌ．フィスセラリア・ラグブローサ・フルスト（Ｌ．ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｌｕｇｕｂｒｏｓａ Ｈｕｌｓｔ）（ウエスタンヘムロックルーパー）；ヤナギドクガ（Ｌｅｕｃｏｍａ ｓａｌｉｃｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（キアシドクガ）；マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（マイマイガ）；マンジュカ・キンケマクラタ・ハワース（Ｍａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（ファイブスポットスズメガ、トマトスズメガ）；タバコスズメガ（Ｍ．ｓｅｘｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（トマトスズメガ、タバコスズメガ）；ナミスジフユナミシャク（Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ナミスジフユナミシャク）；パレアクリタ・ベマタ・ペック（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｖｅｒｎａｔａ Ｐｅｃｋ）（スプリングカンカーワーム）；オオタスキアゲハ（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ Ｃｒａｍｅｒ）（オオタスキアゲハ）；フリガニジア・カリフォルニカ・パッカード（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｐａｃｋａｒｄ）（カリフォルニアオークワーム）；ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ）（ミカンハモグリガ）；フィロノリクテル・ブランカルデラ・ファブリシウス（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（スポテッドテンチフォームリーフマイナー）；オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（オオモンシロチョウ）；モンシロチョウ（Ｐ．ｒａｐａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（モンシロチョウ）；エゾスジグロシロチョウ（Ｐ．ｎａｐｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（エゾスジグロシロチョウ）；プラチプチリア・カルジュイダクチラ・ライリー（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ Ｒｉｌｅｙ）（アーティチョークプルームモス）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コナガ）；ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（ワタアカミムシ）；チョウセンシロチョウ（Ｐｏｎｔｉａ ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ ａｎｄ Ｌｅｃｏｎｔｅ）（サザンキャベッジワーム）；サブロデス・エーグロタータ・グニー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ Ｇｕｅｎｅｅ）（オムニボラスルーパー）；シズラ・コンシナＪ．Ｅ．スミス（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ）（レッドハンプトキャタピラー）；バクガ（Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ Ｏｌｉｖｉｅｒ）（バクガ）；タウメトポエア・ピチオカムパ・シファーミュラー（Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（マツノギョウレツケムシガ）；コイガ（Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ Ｈｕｍｍｅｌ）（コイガ）；トマトキバガ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ Ｍｅｙｒｉｃｋ）（トマトキバガ）；ヨーロッパリンゴスガ（Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヨーロッパリンゴスガ）；ヘリオシス・スブフレキサ・グニー（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ Ｇｕｅｎｅｅ）；マラコソマ種（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）及びオルギア種（Ｏｒｇｙｉａ ｓｐｐ．）が挙げられる。

【0075】

一部の実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、追加的な形質のスタックを更に含み得る。ポリヌクレオチド配列のスタックを含む植物は、従来の育種方法によるか又は遺伝子工学的方法を介するかのいずれか一方又は両方によって入手することができる。それらの方法としては、限定されないが、各々が目的のポリヌクレオチドを含む個別の系統を育種すること、本明細書に開示される遺伝子を含むトランスジェニック植物を後続の遺伝子で形質転換すること及び単一の植物細胞への遺伝子の同時形質転換が挙げられる。本明細書で使用される「スタックされた」という用語には、同じ植物に存在する複数の形質を有すること（すなわち両方の形質が核ゲノムに組み込まれること、１つの形質が核ゲノムに組み込まれ、１つの形質が色素体のゲノムに組み込まれること又は両方の形質が色素体のゲノムに組み込まれること）が含まれる。

【0076】

一部の実施形態では、単独での又は１つ以上の追加的な昆虫抵抗性形質とスタックした、本明細書に開示されるＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、１つ以上の追加的な入力形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス抵抗性、ストレス耐性、病害抵抗性、雄性不稔、柄強度など）又は出力形質（例えば、収量の増加、加工デンプン、油プロファイルの向上、均衡のとれたアミノ酸、リジン又はメチオニン高値、消化性の増加、繊維品質の向上、耐乾性など）とスタックすることができる。このように、本実施形態を用いると、幾つもの作物栽培学的害虫を柔軟に且つコスト効率よく防除する能力のある、向上した作物品質の完全な作物栽培学的パッケージを提供することができる。

【0077】

更なる実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、限定されないが、米国特許第８，１０１，８２６号明細書、同第６，５５１，９６２号明細書、同第６，５８６，３６５号明細書、同第６，５９３，２７３号明細書及び国際公開第２０００／０１１１８５号パンフレットに開示されるＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書及び同第８，５１３，４９２号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書、同第７，２７６，５８３号明細書及び同第８，７５９，６２０号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ａ毒素；又は米国特許第７，３０９，７８５号明細書、同第７，５２４，８１０号明細書、同第７，９８５，８９３号明細書、同第７，９３９，６５１号明細書及び同第６，５４８，２９１号明細書に開示されるＣｒｙ３４／３５毒素を含めた、１つ以上の追加的な殺昆虫性毒素とスタックされ得る。更なる実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、これらのＢｔ殺昆虫性毒素及び他の抗甲虫目活性Ｂｔ殺昆虫性形質を含む１つ以上の追加的なトランスジェニックイベント、例えば、米国特許第７，７０５，２１６号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８６３；米国特許第８，８８４，１０２号明細書に開示されるイベントＭＩＲ６０４；米国特許第９，１３３，４７４号明細書に開示されるイベント５３０７；米国特許第７，８７５，４２９号明細書に開示されるイベントＤＡＳ－５９１２２；米国特許第８，５７５，４３４号明細書に開示されるイベントＤＰ－４１１４；米国特許第９，４４１，２４０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ ８７４１１；及び米国特許第８，６８６，２３０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８８０１７（これらは、全て参照により本明細書に援用される）とスタックされ得る。一部の実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、ＭＯＮ－８７４２９－９（ＭＯＮ８７４２９イベント）；ＭＯＮ８７４０３；ＭＯＮ９５３７９；ＭＯＮ８７４２７；ＭＯＮ８７４１９；ＭＯＮ－００６０３－６（ＮＫ６０３）；ＭＯＮ－８７４６０－４；ＬＹ０３８；ＤＡＳ－０６２７５－８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；ＭＩＲ１６２；ＧＡ２１；ＭＺＤＴ０９Ｙ；ＳＹＮ－０５３０７－１；ＤＰ－９１５６３５－２；ＤＰ－２３２１１；及びＤＡＳ－４０２７８－９とスタックされ得る。

【0078】

更なる実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントは、１つ以上の追加的な以下の提供される除草剤耐性形質とスタックされ得る。グリホサート除草剤は、ＥＰＳＰＳ酵素（５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ）を阻害することによる作用機序を含む。この酵素は、植物の成長及び発達に不可欠な芳香族アミノ酸の生合成に関与している。様々な酵素機構が当技術分野で公知であり、それは、この酵素を阻害するのに用いられ得る。このような酵素をコードする遺伝子は、本開示の遺伝子調節エレメントに作動可能に連結され得る。ある実施形態では、選択マーカー遺伝子としては、限定されないが、グリホサート耐性遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ、このような遺伝子としては、突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子、例えば２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ｃｐ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子、ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ｄｇｔ－２８遺伝子；ａｒｏＡ遺伝子；及びグリホサート分解遺伝子、例えばグリホサートアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｔ）及びグリホサートオキシダーゼ遺伝子（ｇｏｘ）が挙げられる。これらの形質は、Ｇｌｙ－Ｔｏｌ（商標）、Ｏｐｔｉｍｕｍ（登録商標）ＧＡＴ（登録商標）、Ａｇｒｉｓｕｒｅ（登録商標）ＧＴ及びＲｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ（登録商標）として現在販売されている。グルホシネート及び／又はビアラホス化合物に対する耐性遺伝子としては、ｄｓｍ－２、ｂａｒ及びｐａｔ遺伝子が挙げられる。ｂａｒ及びｐａｔ形質は、ＬｉｂｅｒｔｙＬｉｎｋ（登録商標）として現在販売されている。２，４－Ｄ、例えば、ａａｄ－１遺伝子（ａａｄ－１遺伝子は、アリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤に対する更なる活性を有することに留意されたい）及びａａｄ－１２遺伝子（ａａｄ－１２遺伝子は、ピリジルオキシアセテート合成オーキシンに対する更なる活性を有することに留意されたい）に対する抵抗性を与える耐性遺伝子も含まれる。これらの形質は、Ｅｎｌｉｓｔ（登録商標）作物保護技術として販売されている。ＡＬＳ阻害剤（スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルチオベンゾエート及びスルホニルアミノ－カルボニル－トリアゾリノン）に対する抵抗性遺伝子は、当技術分野で公知である。これらの抵抗性遺伝子は、最も一般的に、ＡＬＳコード遺伝子配列に対する点突然変異から生じる。他のＡＬＳ阻害剤抵抗性遺伝子としては、ｈｒａ遺伝子、ｃｓｒ１－２遺伝子、Ｓｒ－ＨｒＡ遺伝子及びｓｕｒＢ遺伝子が挙げられる。これらの形質のいくつかは、商標Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）で販売されている。ＨＰＰＤを阻害する除草剤としては、ピラゾロン、例えば、ピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ及びトプラメゾン；トリケトン、例えば、メソトリオン、スルコトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロン；及びジケトニトリル、例えば、イソキサフルトールが挙げられる。これらの例示的なＨＰＰＤ除草剤は、公知の形質によって耐性を与えられ得る。ＨＰＰＤ阻害剤の例としては、ｈｐｐｄＰＦ＿Ｗ３３６遺伝子（イソキサフルトールに対する抵抗性について）及びａｖｈｐｐｄ－０３遺伝子（メソトリオンに対する抵抗性について）が挙げられる。オキシニル（ｏｘｙｎｉｌ）除草剤耐性形質の例としては、ｂｘｎ遺伝子が挙げられ、これは、除草剤／抗生物質ブロモキシニルに対する抵抗性を与えることが示されている。ジカンバに対する抵抗性遺伝子としては、国際ＰＣＴ公報番号国際公開第２００８／１０５８９０号パンフレットに開示されるジカンバモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｄｍｏ）が挙げられる。ＰＰＯ又はＰＲＯＴＯＸ阻害剤型除草剤（例えば、アシフルオルフェン、ブタフェナシル、フルプロパジル、ペントキサゾン、カルフェントラゾン、フルアゾレート、ピラフルフェン、アクロニフェン、アザフェニジン、フルミオキサジン、フルミクロラック、ビフェノックス、オキシフルオルフェン、ラクトフェン、ホメサフェン、フルオログリコフェン及びスルフェントラゾン）に対する抵抗性遺伝子は、当技術分野で公知である。ＰＰＯに対する抵抗性を与える例示的な遺伝子は、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＰＯ酵素（Ｌｅｒｍｏｎｔｏｖａ Ｉ ａｎｄ Ｇｒｉｍｍ Ｂ，（２０００）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｉｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ＩＸ ｏｘｉｄａｓｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２２：７５－８３．）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＰＯ遺伝子（Ｌｉ，Ｘ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌ Ｄ．２００５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＰＰＯ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｒｏｐｓ．Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．６１：２７７－２８５及びＣｈｏｉ ＫＷ，Ｈａｎ Ｏ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｙｕｎ ＹＣ，Ｍｏｏｎ ＹＨ，Ｋｉｍ ＭＫ，Ｋｕｋ ＹＩ，Ｈａｎ ＳＵ ａｎｄ Ｇｕｈ ＪＯ，（１９９８）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ，ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ，ｖｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：５５８－５６０）の過剰発現を含む。ピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンに対する抵抗性遺伝子としては、ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子（例えば、Ａｃｃ１－Ｓ１、Ａｃｃ１－Ｓ２及びＡｃｃ１－Ｓ３）が挙げられる。シクロヘキサンジオン及び／又はアリールオキシフェノキシプロパン酸に対する抵抗性を与える例示的な遺伝子としては、ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ及びキザロホップが挙げられる。最後に、トリアジン又はベンゾニトリルを含む、光合成を阻害し得る除草剤は、ｐｓｂＡ遺伝子（トリアジンに対する耐性）、１ｓ＋遺伝子（トリアジンに対する耐性）及びニトリラーゼ遺伝子（ベンゾニトリルに対する耐性）によって耐性を与えられる。上に掲げた除草剤耐性遺伝子は、それらに限定することを意図しない。任意の除草剤耐性遺伝子が本開示によって包含される。

【0079】

一部の実施形態では、開示される組成物は、ゲノム編集技術を用いて植物のゲノムに導入することができるか、又は植物のゲノムに既に導入されているポリヌクレオチドは、ゲノム編集技術を用いて編集され得る。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどのゲノム編集システムを用いて植物のゲノムにおける所望の位置に導入することができる。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、部位特異的挿入のため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてゲノムにおける所望の位置に導入することができる。植物ゲノムにおける所望の位置は、育種に適しているゲノム領域など、挿入が所望される任意の標的部位であり得るか、又は既存の目的形質を含むゲノムウィンドウに位置する標的部位であり得る。既存の目的形質は、内因性形質又は以前に導入された形質のいずれである可能性もある。

【0080】

一部の実施形態では、開示されるポリヌクレオチドが既にゲノムに導入されている場合、ゲノム編集又はゲノム改変技術を用いて、隣接する染色体ゲノム配列を含む、その導入されたポリヌクレオチド配列を改変又は修飾し得る。開示される組成物に導入することのできる部位特異的修飾には、限定されないが、配列修復オリゴヌクレオチドを単独で利用するか、又はドナーＤＮＡと共に若しくはドナーＤＮＡなしで、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの部位特異的ゲノム修飾ツールを利用することを含め、部位特異的修飾を導入するための任意の方法を用いて作製されるものが含まれる。開示されるポリヌクレオチド（ゲノムフランキング及びジャンクション配列を含む）に対する部位特異的修飾としては、限定されないが、コドン使用に対する変化、調節エレメント、例えば、プロモーター、イントロン、ターミネーター、エンハンサー、５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は他の非コード配列及びポリヌクレオチドの他の領域に対する変化が挙げられ、修飾は、得られるトウモロコシ植物の表現型の特徴に悪影響を与えない。修飾ポリヌクレオチド配列を含有するＤＰ－９１０５２１－２イベント植物も本明細書で想定される。

【0081】

部位特異的修飾を導入するのに好適なＣａｓポリペプチドとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃａｓ－α、Ｃａｓ１４）、Ｃａｓ１２ｌ（Ｃａｓ－β）、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１タンパク質）、Ｃａｓ１３（Ｃ２ｃ２タンパク質）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３タンパク質）、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０又はこれらの組み合わせ又は複合体が挙げられる。一部の態様では、トランスポゾン関連ＴｎｐＢ、プログラム可能なＲＮＡガイドされたＤＮＡエンドヌクレアーゼが使用され得る。

【0082】

一部の態様では、ゲノム編集システムは、１つ以上の部位特異的修飾を標的ポリヌクレオチド配列に導入して、修飾標的配列をもたらす、Ｃａｓ－α（例えば、Ｃａｓ１２ｆ）エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」及び「変更標的配列」は、同義的に使用され、非改変標的配列を比較したとき、少なくとも１つの改変又は修飾を含む本明細書に開示の標的配列を指す。そのような改変又は修飾としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）若しくは置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。

【0083】

一部の態様では、ゲノム編集システムは、Ｃａｓ－αエンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及び任意選択でドナーＤＮＡを含む。いくつかの例示的なＣａｓ－αエンドヌクレアーゼは、例えば、国際公開第２０２０１２３８８７号パンフレットに記載されている。

【0084】

一部の態様では、ゲノム編集システムは、Ｃａｓポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及び任意選択でドナーＤＮＡを含み、標的ポリヌクレオチド配列の編集は、Ｃａｓポリペプチド媒介二本鎖切断の後に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）を含む。二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、切断を修復するように活性化される。破損した末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は、非相同末端結合経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。結果として、欠失、挿入又はその他の再配列も考えられる（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。代わりに、二本鎖切断は、相同ＤＮＡ配列間の相同組換えによって修復することができる。二本鎖切断の周囲の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関係するエキソヌクレアーゼ活性によって改変されると、遺伝子変換経路は、例えば、非分割性体細胞又はＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列を利用できる場合、原初の構造を取り戻すことができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２－５２）。異所性及び／又は後成的ＤＮＡ配列も相同組換えのためのＤＮＡ改変鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。

【0085】

一部の態様では、ゲノム編集システムは、Ｃａｓポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及びドナーＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓポリペプチドのゲノム標的部位内に挿入される目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトである。二本鎖切断がエンドヌクレアーゼによって標的部位に導入されると、ドナーＤＮＡの第１及び第２の相同領域は、それらの対応するゲノム相同領域による相同組換えを起こして、ドナーＤＮＡと標的ゲノム領域との間のＤＮＡの交換を生じ得る。そのため、この提供される方法により、植物ゲノム中での標的部位における二本鎖切断にドナーＤＮＡの目的のポリヌクレオチドが組み込まれ、それにより元々の標的部位が変更され、変更ゲノム標的部位が生じる。

【0086】

一部の態様では、ゲノム編集システムは、塩基編集因子及び複数のガイドポリヌクレオチドを含み、標的ポリヌクレオチド配列の編集は、複数の核酸塩基編集を標的ポリヌクレオチド配列に導入して、変異ヌクレオチド配列をもたらすことを含む。他の態様は、ゲノム編集システムを用いて生成された修飾ＤＰ－９１０５２１－２イベント植物を含む。

【0087】

標的ゲノム配列の１つ以上の核酸塩基は、ある場合には、塩基をあるタイプから別のタイプに、例えばシトシンからチミンに又はアデニンをグアニンに変化させるように化学的に改変され得る。一部の態様では、複数の塩基、例えば２つ以上、５つ以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上又は更に１００超、２００以上、最大で数千もの塩基が修飾又は改変されて、複数の修飾塩基を有する植物が生成され得る。

【0088】

任意の塩基編集複合体、例えばＲＮＡガイドポリペプチドに関連する塩基編集因子（例えば、デアミナーゼに関連するｄＣａｓなど）を用いて、生物のゲノムにおける所望の遺伝子座を標的とするか又はそれに結合し、標的ゲノム配列の１つ以上のヌクレオチドを化学修飾することができる。

【0089】

部位特異的ヌクレオチド塩基変換は、ゲノム中に１つ以上の編集を生成するために、１つ以上のヌクレオチド変化を改変するために達成され得る。これらには、例えば、Ｃ・ＧからＴ・Ａにすることによって媒介される部位特異的塩基編集又はＡ・ＴからＧ・Ｃへの塩基編集デアミナーゼ酵素が挙げられる（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６３０５）（２０１６）；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ ５３３（７６０３）（２０１６）：４２０－４）。シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼタンパク質に融合された、触媒的に「失活した」又は不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）ポリペプチド、例えば不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ｆ（ｄＣａｓ１２ｆ）又は本明細書に開示される別のＣａｓポリペプチドは、ＤＮＡ切断を導入せずにＤＮＡ塩基を改変し得る特異的な塩基エディターになる。塩基エディターは、Ｃ－＞Ｔ（又は反対の鎖上でＧ－＞Ａ）に変換するか、又はアデニンをイノシンに変換するアデニン塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチドによって特定される編集ウィンドウ内のＡ－＞Ｇ変化をもたらす。核酸塩基における変化をもたらす任意の分子が「塩基編集因子」である。ｄＣａｓは、標的部位においてゲノム配列と相同性を共有するガイドポリヌクレオチドと機能複合体を形成し、デアミナーゼ分子と更に複合体形成される。ガイドされたＣａｓポリペプチドは、標的配列を認識し、それに結合し、二本鎖を開裂して、個々の塩基を露出させる。シチジンデアミナーゼの場合、デアミナーゼは、シトシン塩基を脱アミノ化し、ウラシルを生成する。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）は、ＵがＣに再び変換されることを防止するために提供される。その後、ＤＮＡ複製又は修復機構がウラシルをチミンに（ＵからＴ）変換し、対向する塩基（以前には元のＧ－Ｃ対におけるＧ）からアデニンへのその後の修復により、Ｔ－Ａ対が生成される。

【0090】

挿入されたイベント及び／又はフランキングゲノムＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドは、プライム編集技術を用いて修飾され得る。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ５７６，１４９－１５７（２０１９）を参照されたい。プライム編集複合体は、逆転写酵素ドメインに融合され、ｐｅｇＲＮＡと複合体形成された、ＲＮＡガイドされたＤＮＡニッキングドメイン、例えば、Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓｄ１２ｆ１ニッカーゼ）を含有するプライム編集タンパク質を含む。ＰＥ－ｐｅｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ含有鎖に切れ目を入れることにより、ゲノムにおける所望の位置に標的化ＤＮＡ編集を導入することができる。得られる３’末端は、選択されたプライマー結合部位にハイブリダイズし、次にｐｅｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型を用いて、所望の編集を含む新たなＤＮＡ配列の逆転写をプライミングする。開示される組換え発現カセットの得られる調節発現エレメントは、切断され得るか、又は本明細書に例示若しくは記載される調節エレメント配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0091】

他の修飾は、ＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡの他の部分に対する修飾を含み得る。一部の実施形態では、ゲノム改変技術を用いて、本明細書に記載される１つ以上の発現カセットを、同じ染色体の１つ以上の異なる位置又はトウモロコシ若しくは異なる作物の異なる染色体に再配置することができる。このような実施形態では、本明細書に記載されるジャンクション配列（配列番号２６及び／又は２９）の１つ以上を含むポリヌクレオチドは、部分的に若しくは完全に発現カセットによって保持され得るか又は除去され得る。更に、本明細書に記載されるゲノムフランキング配列は、部分的に若しくは完全に発現カセットによっても保持され得るか又は除去され得る。

【0092】

別の実施形態では、ゲノム改変技術を用いて、本明細書に記載される５’又は３’ジャンクション配列に物理的に近接して１つ以上のトランス遺伝子又は発現カセットを共配置する（ｃｏ－ｌｏｃａｔｅ）ことができる。染色体における物理的位置に関して、共配置されたトランス遺伝子及び／又は発現カセットは、５’又は３’ジャンクション配列から例えば約１メガベース（ＭＢ；１００万ヌクレオチド）、約５００キロベース（Ｋｂ；１０００ヌクレオチド）、約４００Ｋｂ、約３００Ｋｂ、約２００Ｋｂ、約１００Ｋｂ、約５０Ｋｂ、約２５Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約５Ｋｂ、約４Ｋｂ、約３Ｋｂ、約２Ｋｂ、約１Ｋｂ、約５００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド又はそれ未満だけ隔てられ得る。染色体における遺伝学的な距離に関して、共配置されたトランス遺伝子及び／又は発現カセットは、５’又は３’ジャンクション配列から例えば約１０ｃＭ、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５又は０．１ｃＭだけ隔てられ得る。例えば、上述される追加的なトランスジェニックイベントの１つ以上から得られる発現カセットの１つ以上は、本明細書に記載される５’又は３’ジャンクション配列に物理的に近接して共配置され得る。

【0093】

別の実施形態では、ジャンクション配列（配列番号２６又は２９）の１つを含むポリヌクレオチドは、挿入された異種ＤＮＡの一端又は両端において導入され得る。例えば、５’ジャンクション配列を含むポリヌクレオチドは、欠失され、３’ジャンクション配列を含むポリヌクレオチドで置換され得るか又はその逆であり得る。

【0094】

別の実施形態では、ゲノム編集技術を用いて、ＤＰ－９１０５２１－２イベントの挿入されたＤＮＡのポリヌクレオチドの少なくとも１つを反転させることにより、以前に導入されたポリヌクレオチドを修飾することができる。かかるゲノム編集技術を用いて、以前に導入されたポリヌクレオチドを、導入されたポリヌクレオチドの範囲内での１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失及び／又は置換によって修飾することができる。代わりに、二本鎖切断技術を用いて、導入されたポリヌクレオチドに追加的なヌクレオチド配列を付加することができる。付加し得る追加的な配列としては、限定されないが、エンハンサー及びプロモーター配列など、追加的な発現エレメントが挙げられる。欠失され得る配列としては、限定されないが、欠失される場合に機能に悪影響を与えない調節エレメント又はその部分が挙げられる。発現パターンを調節する（例えば、特定の組織における殺虫ポリペプチドの発現レベルを低下させる）ための修飾も、導入される発現カセットに対する部位特異的修飾で想定される。

【0095】

別の実施形態では、ゲノム改変技術を用いて、２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有するＤＰ－９１０５２１－２イベントの１つ以上の発現カセットの全て又は一部を欠失させるか又は修飾することができる。この実施形態では、２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有するＤＰ－９１０５２１－２イベントに由来する得られるトウモロコシ植物は、本明細書に記載される発現カセットの一部を含むか、本明細書に記載される発現カセットを含まないか、又は本明細書に記載される発現カセットの修飾を含み得る。

【0096】

別の実施形態では、標的化ＤＳＢ技術を用いて、殺昆虫性の活性があるタンパク質の分子スタックを作成するため、追加的な殺昆虫性の活性があるタンパク質を植物のゲノムの範囲内で本明細書に開示される本開示の組成物にごく近接して位置させ得る。

【0097】

別の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド配列を認識するガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計すること、前記ガイドポリヌクレオチドを合成するか又は得ること及びゲノム改変組成物の一部として前記ガイドポリヌクレオチドを導入して、２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有するＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡを修飾することを含む方法で使用される。このような得られる修飾は、本明細書に例示される又は記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0098】

実施形態は、本明細書に記載されるゲノム改変技術を用いて生成される修飾ＤＰ－９１０５２１－２イベント植物を含む。

【0099】

一実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２６及び配列番号２９に示されるとおりのヌクレオチド配列又は配列番号２６及び配列番号２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物を含む。

【0100】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２７及び配列番号３０に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２７及び配列番号３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物を含む。

【0101】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２８及び配列番号３１に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２８及び配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物を含む。

【0102】

一実施形態は、作動可能に連結された第１及び第２の発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトを含み、前記第１の発現カセットは、
１）ＭＭＶエンハンサー、
２）ＬＬＤＡＶプロモーター、
３）ｚｍ－ｉ６イントロン、
４）ｃｒｙ１Ｂ．３４、及び
５）ｏｓ－ｕｂｉターミネーター
を含む。

【0103】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態の少なくとも１つの作動可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトを含む植物を含む。

【0104】

更なる実施形態は、いずれかの先の実施形態の少なくとも１つの作動可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトを含む植物であって、コーン植物である、植物を含む。

【0105】

一実施形態は、配列番号２１に示される配列又は配列番号２１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む植物を含む。

【0106】

一実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む。

【0107】

他の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の植物部位であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、植物部位を含む。

【0108】

一実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む種子であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択されるＤＮＡ分子を含み、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、種子を含む。

【0109】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む種子から成長したコーン植物又はその部位であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択されるＤＮＡ分子を含み、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、コーン植物又はその部位を含む。

【0110】

更なる実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物から作製されたトランスジェニック種子であって、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、トランスジェニック種子を含む。

【0111】

他の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２のコーン植物から作製された種子コーンから成長したトランスジェニックコーン植物又はその部位であって、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、トランスジェニックコーン植物又はその部位を含む。

【0112】

一実施形態は、配列番号２１及び２６～３１並びにその完全長相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含む。

【0113】

一実施形態は、配列番号２２～２５及びその完全長相補体から選択される核酸配列を含むアンプリコンを含む。

【0114】

一実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されている、生物学的試料又は抽出物を含む。

【0115】

別の実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にいずれかの先の実施形態の受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、前記生物学的試料は、トランスジェニックコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の植物、植物組織又は種子を含む、生物学的試料又は抽出物を含む。

【0116】

別の実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にいずれかの先の実施形態の受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、前記生物学的試料又は抽出物は、トランスジェニックコーン植物イベントＤＰ－９１０５２１－２から抽出されたＤＮＡ試料であり、前記ＤＮＡ試料は、配列番号２１～３１及びその相補体から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、生物学的試料又は抽出物を含む。

【0117】

別の実施形態は、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅方法又は核酸ハイブリダイゼーション方法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にいずれかの先の実施形態の受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される、生物学的試料又は抽出物を含む。

【0118】

一実施形態は、交配種コーン種子を作製する方法であって、
ａ）配列番号２１～３１から選択されるヌクレオチドを含む第１の近交系コーン系統と、異なる遺伝子型を有する第２の近交系系統とを有性交配すること、
ｂ）前記交配から後代を成長させること、及び
ｃ）それにより作製された交雑種子を収穫すること
を含む方法を含む。

【0119】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態の交配種コーン種子を作製する方法であって、第１の近交系コーン系統は、雌又は雄親である、方法を含む。

【0120】

一実施形態は、鱗翅目害虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、
ａ）第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と有性交配し、それにより複数の第１世代後代植物を作製することであって、前記第１又は第２の親コーン植物は、イベントＤＰ－９１０５２１－２を含む、作製すること、
ｂ）第１世代後代植物を自殖させ、それにより複数の第２世代後代植物を作製すること、及び
ｃ）イベントＤＰ－９１０５２１－２を含み、且つ鱗翅目害虫に対して抵抗性のある第２世代後代植物から選択すること
を含む方法を含む。

【0121】

別の実施形態は、交配種コーン種子を作製する方法であって、
ａ）請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含む第１の近交系コーン系統を、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含まない第２の近交系系統と有性交配すること、及び
ｂ）それにより作製された交雑種子を収穫すること
を含む方法を含む。

【0122】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態の、鱗翅目害虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２を含む第２世代後代植物を、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡを欠く前記親植物と戻し交配し、それにより鱗翅目害虫に対して抵抗性のある戻し交配後代植物を作製するステップを更に含む方法を含む。

【0123】

一実施形態は、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、
ａ）前記試料を、第１のＤＮＡ分子対及び第２の異なるＤＮＡ分子対に接触させることであって、それにより、
１）コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用されるとき、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる第１のアンプリコンを産生し、及び
２）ＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用されるとき、ＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡの診断指標となる第２のアンプリコンを産生する、接触させること、
ｂ）核酸増幅反応を実施すること、及び
ｃ）そのように産生されたアンプリコンを検出することをであって、両方のアンプリコンの存在の検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡに対してヘテロ接合性であることを示し、第１のアンプリコンのみの検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡに対してホモ接合性であることを示す、検出すること
を含む方法を含む。

【0124】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、第１のＤＮＡ分子対は、プライマー対配列番号６及び７を含む、方法を含む。

【0125】

更なる実施形態は、いずれかの先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、第１及び第２のＤＮＡ分子対は、検出可能標識を含む、方法を含む。

【0126】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、検出可能標識は、蛍光標識である、方法を含む。

【0127】

更なる実施形態は、いずれかの先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、検出可能標識は、プライマー分子の１つ以上と共有結合的に会合される、方法を含む。

【0128】

一実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、
ａ）試料を、プライマー対であって、イベントＤＰ－９１０５２１－２からのゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応で使用されるとき、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生するプライマー対に接触させること、
ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりイベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生すること、及び
ｃ）イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを検出すること
を含む方法を含む。

【0129】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となる核酸分子は、核酸増幅連鎖反応によって産生されるアンプリコンである、方法を含む。

【0130】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、試料をプローブに接触させることを更に含む方法を含む。

【0131】

更なる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、試料を、いずれかの先の実施形態のプローブに接触させることを更に含み、プローブは、検出可能標識を含む、方法を含む。

【0132】

更なる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、試料をプローブに接触させることを更に含み、プローブは、いずれかの先の実施形態の検出可能標識を含み、検出可能標識は、蛍光標識である、方法を含む。

【0133】

更なる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、試料をプローブに接触させることを更に含み、プローブは、いずれかの先の実施形態の検出可能標識を含み、検出可能標識は、プローブと共有結合的に会合される、方法を含む。

【0134】

一実施形態は、ポリメラーゼ連鎖反応方法の結果として、イベントＤＰ－９１０５２１－２の診断指標となるアンプリコンを産生するために、試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２ ＤＮＡ鋳型を標的化する１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドプライマーを含む。

【0135】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態に記載の複数のポリヌクレオチドプライマーを含み、
ａ）第１のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号６に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含み、及び
ｂ）第２のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号７に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含む。

【0136】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のプライマーを含み、第１のプライマー及び第２のプライマーは、少なくとも１８ヌクレオチドである。

【0137】

一実施形態は、試料中における、イベントＤＰ－９１０５２１－２に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ）トウモロコシＤＮＡを含む試料を、ポリヌクレオチドプローブであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２からのＤＮＡとハイブリダイズし、且つ前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、非ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブに接触させること、
ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、及び
ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出すること
を含み、ハイブリダイゼーションの検出は、イベントＤＰ－９１０５２１－２の存在を示す、方法を含む。

【0138】

一実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸を検出するためのキットであって、核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーション時、試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸配列の存在の診断指標となる、キットを含む。

【0139】

別の実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸を検出するためのキットであって、核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーション時、いずれかの先の実施形態の試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸配列の存在の診断指標となり、核酸分子は、配列番号６～３１からのヌクレオチド配列を含む、キットを含む。

【0140】

別の実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸を検出するためのキットであって、核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーション時、いずれかの先の実施形態の試料中のイベントＤＰ－９１０５２１－２にユニークな核酸配列の存在の診断指標となり、核酸分子は、配列番号６～３１及びその相補体から選択されるプライマーである、キットを含む。

【0141】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、遺伝子型は、配列番号２８又は配列番号３１の一方に１、２、３、４又は５つのヌクレオチドの変化を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物を含む。

【0142】

別の実施形態は、いずれかの先の実施形態のコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２の遺伝子型を含むコーン植物であって、配列番号３に示されるヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含むコーン植物を含む。

【0143】

一実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含む、方法を含む。

【0144】

別の実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、いずれかの先の実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0145】

別の実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、いずれかの先の実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記修飾ＤＮＡ配列において重複された配列番号２６又は配列番号２９の全て又は一部を有する修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0146】

別の実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、いずれかの先の実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0147】

更なる実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、いずれかの先の実施形態の配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記除去は、配列番号３の１つ以上の調節エレメントからの、前記１つ以上の調節エレメントの活性に実質的に影響しない除去を含む、方法を含む。

【0148】

更なる実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、いずれかの先の実施形態の配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記前記修飾ＤＮＡ配列から配列番号２６又は配列番号２９の全て又は一部が除去された修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0149】

別の実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、いずれかの先の実施形態の配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、修飾ＤＮＡ配列であって、前記修飾ＤＮＡ配列から配列番号３の少なくとも３０％が除去された修飾ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0150】

更なる実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、いずれかの先の実施形態の配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含み、配列番号３の少なくとも８０％は、前記修飾ＤＮＡ配列から除去される、方法を含む。

【0151】

更なる実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントを修飾する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、方法は、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム改変技術を適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを修飾することを含み、前記ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントのＤＮＡを修飾して、いずれかの先の実施形態の配列番号３からの除去を含む修飾ＤＮＡ配列を生成することを含み、配列番号３の全ては、前記修飾ＤＮＡ配列から除去される、方法を含む。

【0152】

一実施形態は、ＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントゲノム編集システムと共に使用するためのガイドポリヌクレオチドを生成する方法であって、配列番号３の少なくとも一部を認識する１つ以上のガイドポリヌクレオチドを設計することと、前記ガイドポリヌクレオチドを合成することとを含む方法を含む。

【0153】

別の実施形態は、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有するＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡを修飾する方法であって、ゲノム改変組成物の一部として、いずれかの先の実施形態のＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントゲノム編集システムと共に使用するための前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドをＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡに導入して、ＤＰ－９１０５２１－２イベントのＤＮＡを修飾することを含む方法を含む。

【0154】

一実施形態は、ＣＡＳポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及びＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントドナーＤＮＡを含むＤＰ－９１０５２１－２コーンイベントゲノム編集システムを含む。

【0155】

一実施形態は、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有する、ＡＴＣＣに寄託されたＤＰ－９１０５２１－２イベントの少なくとも１つの発現カセットを修飾する方法であって、ゲノム編集技術を使用して、少なくとも１つの発現カセットを修飾することを含み、ＤＰ－９１０５２１－２イベントに由来する得られたトウモロコシ植物は、少なくとも１つの修飾されたカセットを含む、方法を含む。

【0156】

別の実施形態は、受託番号ＰＴＡ－１２７０７８を有する、ＡＴＣＣに寄託されたＤＰ－９１０５２１－２イベントの少なくとも１つの発現カセットを修飾する方法であって、ゲノム編集技術を使用して、少なくとも１つの発現カセットを修飾することを含み、ＤＰ－９１０５２１－２イベントに由来する得られたトウモロコシ植物は、いずれかの先の実施形態の少なくとも１つの修飾されたカセットを含み、ｃｒｙ１Ｂ．３４の発現を改変することを含む、方法を含む。

【0157】

別の実施形態は、商品植物製品を作製する方法であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含むコーンイベントＤＰ－９１０５２１－２植物から生成された穀粒を加工することを含み、前記コーンイベントＤＰ－９１０５２１－２種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２７０７８で寄託されており、前記穀粒は、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される商品植物製品に加工され、前記組成物／商品植物製品は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む方法を含む。

【0158】

一実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫をイベントＤＰ－９１０５２１－２の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に曝すことを含む方法を含む。

【0159】

別の実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫をイベントＤＰ－９１０５２１－２の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に曝すことを含み、鱗翅目昆虫は、ツマジロクサヨトウ（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））である、方法を含む。

【0160】

更に別の実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫をイベントＤＰ－９１０５２１－２の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に曝すことを含み、鱗翅目昆虫は、アメリカタバコガの幼虫（アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ））である、方法を含む。

【0161】

更なる実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫をイベントＤＰ－９１０５２１－２の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に曝すことを含み、鱗翅目昆虫による被害は、イベントＤＰ－９１０５２１－２に由来するトウモロコシ穀粒又は穀実について防除される、方法を含む。

【0162】

一部の実施形態では、ＤＰ－９１０５２１－２イベントを含むコーン植物は、種子処理で処理され得る。一部の実施形態では、種子処理は、殺真菌剤、殺昆虫剤又は除草剤であり得る。

【0163】

以下の実施例は、実例として提供され、限定することを意図しない。

【実施例】

【0164】

実施例１．Ｃｒｙ１Ｂ．３４をコードするコンストラクトを含むトランスジェニック植物のカセット設計
イベントを生成するため分子スタックに使用されるＣｒｙ１Ｂ．３４発現用のカセット設計は、遺伝子試験形質転換実験における有効性及び発現に基づき選択した。多数の異なる調節エレメント（プロモーター、イントロン）及び他のエレメント（ターミネーター）を遺伝子試験実験で評価した。多数の異なる調節エレメントを使用して、収量及び形質有効性についての発現パターンを評価した。

【0165】

選択したイベントコンストラクト、プラスミドＰＨＰ７９６２０（配列番号１）のＴ－ＤＮＡ領域のｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子カセットに含まれる遺伝子エレメントを表１に記載する。

【0166】

【表1】

【0167】

実施例２．アグロバクテリウム形質転換によるトウモロコシの形質転換並びにｃｒｙ１Ｂ．３４、ｐａｔ及びｐｍｉ遺伝子を含むトランスジェニック植物の再生
プラスミドＰＨＰ７９６２０によるＳＳＩ形質転換のパーティクルボンバードメントにより、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシイベントを作製した。ＳＳＩ形質転換のパーティクルボンバードメントは、本質的に、米国特許出願公開第２０１９／０３７６０７３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり実施した。

【0168】

Ｃｒｙ１Ｂ３４を有するＰＨＰ７９６２０を、ｚｍ－ｏｄｐ２を含有するＰＨＰ２１８７５、ｚｍ－ｗｕｓ２を含有するＰＨＰ７３７５２及びＦＬＰＭを含有するＰＨＰ５０９６と共に、１０のＳＳＩ系統の６０００の未熟胚（各ＳＳＩ系統に６００の未熟胚を含む）中に同時ボンバードメント（ｃｏ－ｂｏｍｂａｒｄ）した。１０５日間の選択及び再生工程後、合計５９個のＴ０小植物が再生した。全てのＴ０小植物からＰＣＲ分析用に試料を採取し、挿入されたｃｒｙ１Ｂ．３４、ｐｍｉ及びｍｏ－ｐａｔの存在及びコピー数を確かめた。この分析に加えて、Ｔ０小植物を発生遺伝子、ｚｍ－ｏｄｐ２及びｚｍ－ｗｕｓ２の非存在についてＰＣＲによって分析した。挿入遺伝子の単一コピーを含み、発生遺伝子を含まないと決定された植物を更なる温室増殖に選択した。これらのＰＣＲ選択されたＴ０品質イベントからの試料を、サザン・バイ・シーケンシングを用いた更なる分析用に収集し、挿入された遺伝子が正しい標的遺伝子座にあり、いかなる遺伝子破壊もないことを確認した。トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２は、遺伝子の単一コピーを含むことが確認された（実施例３及び４を参照されたい）。これらの選択されたＴ０植物を形質有効性及びタンパク質発現に関してアッセイした。全ての基準を満たすＴ０植物を先に進め、近交系系統と交配させることにより、更なる試験用の種子を作製した。形質転換及びイベント開発の概略図を図３に提示する。

【0169】

実施例３．トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２の同定
ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ内に含まれるｐｍｉ、ｍｏ－ｐａｔ及びｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子並びにＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシの挿入部位にわたるゲノムジャンクションの検出のために、５４ｂｐ～１１３ｂｐにわたる領域を、各ユニークな配列に固有のプライマー及びＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いて増幅した。更に、各アッセイで、各アッセイの定性的評価及び定量的評価の両方のため並びにＰＣＲ反応中に十分な質及び量のＤＮＡが存在することを実証するため、内因性参照遺伝子、高移動度グループＡ（ｈｍｇ－Ａ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７１８７４．１）の７９ｂｐ領域が二重鎖で使用されることを確認した（Ｋｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ｈｍｇ－Ａからのデータを、採点に関する計算に使用した。データを、確認された陽性又はコピー数検量用ゲノム対照並びに陰性ゲノム対照のいずれかの性能と比較した。

【0170】

リアルタイムＰＣＲ反応は、熱活性化ＤＮＡポリメラーゼ５’ヌクレアーゼ活性を利用した。２つのプライマー及び１つのプローブを、５’蛍光レポーター色素及び３’クエンチャー色素を含むプローブを用いて標的ＤＮＡにアニールした。各ＰＣＲサイクルでは、ポリメラーゼにより、レポーター色素を、アニールされたプローブから切断して、それぞれのその後のサイクルによって強化される蛍光シグナルを発生させた。試料アンプリコンの発光強度が検出閾値を超えて上昇したサイクルは、Ｃ_Ｔ値と呼ばれた。増幅が発生しなかった場合、Ｃ_Ｔは機器によって計算されず、４０．００のＣ_Ｔ値を割り当てられた。

【0171】

試験試料のコピー数を決定しようとした場合、コピー数検量用対照（目的の遺伝子の所定のコピー、例えば、１又は２コピーを含むことが知られている試料）を内因性遺伝子及び目的の遺伝子の両方についての対照として使用した。倍率差を用いて、各試験試料についてのコピー数を適用した。倍率差又は倍率変化は、２^－ΔＣＴの式を用いて計算される。ΔＣ_Ｔを、上述されるように試験試料及びコピー数検量用対照について計算した。１のコピー数を、２－コピー検量用対照と比較して０．７５の最大範囲で０～０．７の倍率変化を生じる試料集団に適用した。同様に、２のコピー数を、単一コピー検量用対照と比較して０．９１の最大範囲で１．５～２．２の範囲の倍率変化を生じる試料集団に適用し、３のコピー数を、２－コピー検量用対照と比較して０．３５の最大範囲で１．３～１．５の範囲の倍率変化を生じる試料集団に適用した。

【0172】

ゲノムＤＮＡを、Ｆ１及びＢＣ１世代のそれぞれからの約１００の植物についてＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ葉組織から単離した。ＤＮＡ試料を、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ_２－ＥＤＴＡ）及びトリス塩酸塩を含むアルカリ性緩衝液を用いて抽出した。１反応当たり約３ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した。

【0173】

標的イベント及びトランス遺伝子を裏付ける各アッセイをｈｍｇ－Ａ内因性参照アッセイと多重化した。反応混合物を調製し、それぞれＰＣＲ反応のための目的の遺伝子及び内因性遺伝子の両方を裏付けるための全ての成分を含んでいた。３０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が添加剤として含まれるＢｉｏｌｉｎｅ ＳｅｎｓｉＦａｓｔ（商標）プローブＬｏ－ＲＯＸマスターミックスであるベースマスターミックスを使用した。プライマーの個々の濃度は、分析検証中に確立される最適な濃度に応じて、１反応当たり３００ｎＭ～９００ｎＭで変化した。１反応当たりのプローブの個々の濃度は、８０ｎＭ～１２０ｎＭであった。アッセイ対照は、水又はトリス－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）からなる鋳型なし対照（ＮＴＣ）並びにコピー数検量用対照及び陰性対照を含んでおり、これらは全て、行われる各アッセイについて検証された。ＰＣＲ分析中に使用されるアニーリング温度及びサイクル数が表４に示される。各ＰＣＲ分析に使用されるプライマー及びプローブが表２及び３に示される。

【0174】

２００のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物（Ｆ１及びＢＣ１世代のそれぞれからの１００の植物）の収集された葉試料から単離されたゲノムＤＮＡ試料を、コピー数検量用対照、陰性及びＮＴＣ対照と共に、ｐｍｉ及びｍｏ－ｐａｔ遺伝子に固有のプライマー対及びプローブ並びにｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子の５’及び３’領域並びにＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシにおけるＰＨＰ７９６２０組換え断片挿入のユニークな同定を可能にするＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシに固有の挿入部位の存在下でＳｅｎｓｉＦａｓｔ（商標）プローブＬｏ－ＲＯＸマスターミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いてｑＰＣＲ増幅に供した。アッセイ及びＤＮＡ品質監視のために、トウモロコシｈｍｇ－Ａは、内因性対照として各反応を用いて二重鎖に含まれた。各ｑＰＣＲ反応を、約３ｎｇ（０．５μＬの体積）の単離されたゲノムＤＮＡを用いて３μＬの総体積で設定した。

【0175】

ｑＰＣＲコピー数分析の結果は、プラスミドＰＨＰ７９６２０のＴ－ＤＮＡ内の遺伝子の単一コピーの安定した組込み及び分離を示し、次世代への移行が実証された。

【0176】

プラスミドＰＨＰ７９６２０からの組換え断片の範囲内にあるＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシの挿入部位並びに遺伝子に相当するサイズ５４ｂｐ～１１３ｂｐの範囲のＰＣＲ産物を増幅し、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシの葉試料並びに８個のコピー数検量用ゲノム対照で観察したが、８個の陰性ゲノム対照及び８個のＮＴＣ対照の各々には存在しなかった。各アッセイについて合計４回実施したが、観察された結果は同じであった。各試料及び全ての対照でＣ_Ｔ値、ΔＣ_Ｔ値及びコピー数を計算した。

【0177】

トウモロコシ内因性参照遺伝子ｈｍｇ－Ａを使用して７９ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシからの葉試料並びに８個のコピー数検量用対照及び８個の陰性ゲノム対照で観察した。試験した８個のＮＴＣ対照では、内因性遺伝子の増幅は観察されず、Ｃ_Ｔ値は求めなかった。各試料について、二重鎖で各アッセイを実施し、挿入部位及び全ての遺伝子について合計４回分析したが、各回とも、観察された結果は同じであった。各試料について、Ｃ_Ｔ値、ΔＣ_Ｔ値及びコピー数（該当する場合）を計算した。

【0178】

コンストラクト特異的ＰＣＲアッセイの感度を評価するため、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシＤＮＡを対照トウモロコシゲノムＤＮＡで希釈した結果、様々な量のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ（５ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、２５０ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２０ｐｇ、１０ｐｇ及び５ｐｇ）を含む合計５ｎｇのトウモロコシＤＮＡの試験試料が得られた。これらの様々な量のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシＤＮＡは、全トウモロコシゲノムＤＮＡ中１００％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．４％、０．２％及び０．１％のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシＤＮＡに相当する。様々な量のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシＤＮＡをｐｍｉ及びｍｏ－ｐａｔ遺伝子、ｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子の５’及び３’領域並びにＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシの挿入部位についてリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。これらの分析に基づいて、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシについて５ｎｇの全ＤＮＡにおける検出限界（ＬＯＤ）は、ｐｍｉについて約５００ｐｇ（１０％）、ｍｏ－ｐａｔについて２５０ｐｇ（５％）、ｃｒｙ１Ｂ．３４について２５０ｐｇ（５％）及びイベントＤＰ－９１０５２１－２について２５０ｐｇ（５％）であることが分かった。記載される各アッセイの決定された感度は、多くのスクリーニング適用に十分である。各濃度を合計５回試験した。試験対象の増幅が各レプリケートで検出されない時点で前述の濃度が検出限界であることが分かった。

【0179】

イベント特異的及びコンストラクト特異的アッセイを用いたＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのリアルタイムＰＣＲ分析により、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシにおけるイベントＤＰ－９１０５２１－２並びにｐｍｉ及びｍｏ－ｐａｔ及びｃｒｙ１Ｂ．３４遺伝子の定量化検出によって実証されるとおりの、試験した葉試料におけるプラスミドＰＨＰ７９６２０からの組換え断片の単一コピーの安定した組込み及び分離が確認される。これらの結果は、実施した全てのレプリケートｑＰＣＲ分析間で再現可能であった。ｈｍｇ－Ａを検出するためのトウモロコシ内因性参照遺伝子アッセイでは、全ての試験試料及び陰性対照で予想どおり増幅され、且つＮＴＣ試料では検出されなかった。記載される条件下での各アッセイの感度は２５０ｐｇ～５００ｐｇ ＤＮＡの範囲であり、いずれも、多くのＰＣＲによるスクリーニング適用に十分である。

【0180】

【表2】

【0181】

【表3-1】

【0182】

【表3-2】

【0183】

【表3-3】

【0184】

【表4】

【0185】

実施例４．完全性及びコピー数に関するＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのサザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）分析
Ｔ０世代のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシからゲノムＤＮＡを抽出した。サザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）は、プローブベースの配列捕捉、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技法及びバイオインフォマティクス手順を利用して、トウモロコシゲノム内にある挿入されたＤＮＡを単離、シーケンシング及び同定するものである。多数のユニークなシーケンシングリードをコンパイルし、それらを形質転換プラスミド配列と比較することにより、挿入されたＤＮＡに起因するユニークなジャンクションがバイオインフォマティクス解析で同定され、それを用いて植物ゲノム内にある挿入の数を決定することができる。ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのＴ０植物をＳｂＳによって分析し、挿入コピー数を決定した。

【0186】

捕捉プローブとしてのオーバーラップビオチン化オリゴヌクレオチドの設計には、ＰＨＰ７９６２０プラスミド配列を包含する一連のユニークな配列を使用した。捕捉プローブは、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｉｎｃ．によって設計され、合成された。プローブセットは、濃縮プロセス中にＰＨＰ７９６２０形質転換プラスミド配列を標的とするように設計された。これらのプローブをトウモロコシゲノムと比較することにより、ＰＨＰ７９６２０に由来する配列と同時に捕捉され、シーケンシングされるであろうトウモロコシゲノム配列のレベルを決定した。

【0187】

別個のＮＧＳライブラリをＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ及び対照トウモロコシについて構築した。本質的に、Ｚａｓｔｒｏｗ－Ｈａｙｅｓ，ｅｔ ａｌ（２０１５）に記載されるとおり、ＳｂＳを実施した。２ラウンドのハイブリダイゼーションを通じてシーケンシングライブラリを捕捉プローブにハイブリダイズさせることにより、標的配列を濃縮した。ＮＧＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ）後、シーケンシングリードをトリミング及び品質保証のためにバイオインフォマティクスパイプラインに入力した。トウモロコシゲノム及び意図される挿入の配列及びＰＨＰ７９６２０に対してリードをアラインメントし、ゲノム及びプラスミド配列の両方を含むリードをジャンクションリードと同定した。ジャンクションリードを意図される挿入の配列とアラインメントすると、挿入されたＤＮＡの予想される挿入に対する相対的な境界が示される。

【0188】

内因性トウモロコシ配列に起因する推定ジャンクションを同定するため、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物と同じように対照トウモロコシゲノムＤＮＡライブラリを別々に捕捉し、シーケンシングした。これらのライブラリは、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物試料の深度の約５倍の平均深度までシーケンシングした。これにより、プローブによって捕捉された内因性ジャンクションが対照試料で検出されるため、それらをＤＰ９１０５２１トウモロコシ試料で同定し、除去することが可能となる確率が高くなった。

【0189】

コンストラクトＰＨＰ７９６２０に由来するＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシで挿入の組込み及びコピー数を決定した（図１）。

【0190】

ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのＴ０植物に対してＳｂＳを行い、ゲノム中の挿入コピー数を決定した。ＳｂＳリードを予想挿入領域とアラインメントしたところ、ゲノムフランキング配列とランディングパッドとの間に２つのユニークなジャンクションが得られた。ＦＲＴ１部位及びＦＲＴ８７部位は、ＰＨＰ７９６２０からの標的形質遺伝子が部位特異的組込み（ＳＳＩ）ランディングパッドに組み込まれた２つの位置である。この植物では、他にＰＨＰ７９６２０配列とトウモロコシゲノムとの間のジャンクションが検出されなかったことから、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシに追加的なプラスミド由来の挿入は存在しないことが示される。加えて、ＰＨＰ７９６２０の非隣接領域間のジャンクションはなかったことから、挿入されたＤＮＡに検出可能な再配列又は切断はないことが示される。更に、Ｔ０植物にトウモロコシゲノム配列とＰＨＰ７９６２０の骨格配列との間のジャンクションはなかったことから、ＤＰ９１０５２１トウモロコシにプラスミド骨格配列が取り込まれなかったことが実証される。

【0191】

ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのＴ０植物のＳｂＳ分析により、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシにＰＨＰ７９６２０からの所望の遺伝子を含む単一の挿入があること及びそのゲノムに追加的な挿入が存在しないことが実証された。

【0192】

ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのＴ０植物に対してサザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）分析を行うことにより、挿入コピー数を確認した。結果は、植物にＰＨＰ７９６２０からの所望の遺伝子を含む単一の挿入を示す。対照植物にＰＨＰ７９６２０配列とトウモロコシゲノムとの間のジャンクションは検出されなかったことから、予想どおり、これらの植物がＰＨＰ７９６２０に由来するいかなる挿入も含まなかったことが示される。更に、分析したＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ植物にプラスミド骨格配列は検出されなかった。ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシのＴ０植物のＳｂＳ分析により、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシにＰＨＰ７９６２０からの所望の遺伝子を含む単一の挿入があること及びそのゲノムに追加的な挿入が存在しないことが実証された。

【0193】

表５に示される以下のジャンクション配列は、サザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）分析によって実証された。

【0194】

【表5】

【0195】

実施例５．トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２の抗昆虫有効性
ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシを、ツマジロクサヨトウ、サウスウエスタンコーンボーラー及びヨーロッパアワノメイガに対する抗昆虫活性Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質の有効性について圃場で評価した。圃場試験を北米のトウモロコシ栽培地域（米国及びプエルトリコ；表６）で２０２０年に実施した。各圃場地点では、単一畝試験区を３反復で無作為化完備型乱塊法実験設計において配置した。畝は、地点に応じて、１３～１５フィート（４．０～４．６ｍ）の長さであった。畝間の間隔は、３０インチ（７６ｃｍ）であった。種子植栽密度は、１畝当たり約２２個の種子であった。全ての試験及び対照試験区について、従来の雑草防除プログラムを、必要に応じて手作業での除草を含む、その地域の通常の最良の慣行に従って実施し、地上での殺虫剤施用は適用しなかった。作物栽培学的慣行は、所与の地点における全ての試験区について均一にした。

【0196】

【表6】

【0197】

ツマジロクサヨトウ（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））評価
プエルトリコの場所では、ツマジロクサヨトウが天然に外寄生していたため、人工的な外寄生は行わなかった。試験区を、植物がＶ８～Ｖ９生育段階に達したとき、ツマジロクサヨトウ植物損傷について視覚的に評価した。試験区における４番目の植物から開始して、１０の連続した植物がＤａｖｉｓスケール（０～９）を用いて葉損傷について個別に採点され、０のスコアは、目に見える植物損傷なしを示し、９のスコアは、植物がほぼ完全に破壊されたことを示した（表７）。

【0198】

Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ地点において、植物がＶ４生育段階に達したとき、天然の外寄生に人工的な外寄生を追加した。畝における４番目の植物から開始して、１試験区当たり７つの連続した植物を、各植物の輪生に適用される、ツマジロクサヨトウ新生幼虫及び市販のトウモロコシの穂軸グリットを含む混合物により人工的に外寄生させた。１日空けた２回の別々の適用を、１適用当たり４０匹の新生幼虫の目標外寄生率で各植物に対して行った。植物がＶ７生育段階になったとき、最後の外寄生日の１４日後、試験区をツマジロクサヨトウ植物損傷について視覚的に評価した。中間の５つの外寄生された植物を、以下の表に記載されるＤａｖｉｓスケール（０～９）を用いて、葉損傷について個別に採点した。

【0199】

【表7】

【0200】

サウスウエスタンコーンボーラー（ジアトラエア・グランジオセラ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ））評価
各圃場地点について、人工的な外寄生を、第１及び第２世代の両方からの外寄生をシミュレーションするために２つの別個の時点で行った。１回目の人工的な外寄生を、植物がＶ８生育段階に達したときに行った。畝における４番目の植物から開始して、１試験区当たり少なくとも７つの連続した植物を、１植物当たり３０～５０匹の新生幼虫の割合で各植物の輪生に適用される、サウスウエスタンコーンボーラー新生幼虫及び市販のトウモロコシの穂軸グリットを含む混合物により人工的に外寄生させた。第２世代のサウスウエスタンコーンボーラーを模擬することを意図した２回目の人工的な外寄生を、試験区における植物の約５０％が花粉を飛散させているとき、Ｒ１生育段階に行った。新生幼虫－グリット混合物を、１適用当たり４５～５０匹の新生幼虫の割合で７日の期間内に２回、第一穂の葉の襟部に適用した。

【0201】

植物がＲ１生育段階になったとき、１回目の人工的な外寄生の２～３週間後、試験区をサウスウエスタンコーンボーラー植物損傷について視覚的に評価した。中間の５つの外寄生された植物を、ＳＷＣＢ１ＬＦ視覚的採点スケール（９～１）を用いて、葉損傷について個別に採点し、９のスコアは、植物損傷なし又はごく少ない目に見える植物損傷を示し、１のスコアは、葉の３分の２超に１インチを超えるサイズの加害痕を有する植物を示した（表８）。

【0202】

【表8】

【0203】

更に、植物がＲ５～Ｒ６生育段階になったとき、最後の外寄生日の約５０日後、試験区を第２世代サウスウエスタンコーンボーラー植物損傷について視覚的に評価した。中間の５つの外寄生された植物を茎トンネリングの合計センチメートルについて個別に評価した。各植物について、各採点される植物の茎を第一穂の上の第４節間の上端から植物の基部まで縦方向に分割した。長さ０．５ｃｍ未満のトンネル又は入口穴は、合計トンネル長さに含まれなかった。

【0204】

ヨーロッパアワノメイガ（ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））評価
各圃場地点について、人工的な外寄生を、第１及び第２世代の両方からの外寄生をシミュレーションするために２つの別個の時点で行った。１回目の人工的な外寄生を、植物がＶ５～Ｖ８生育段階になったときに行った。畝における４番目の植物から開始して、１試験区当たり少なくとも７つの連続した植物を、各植物の輪生に適用される、ヨーロッパアワノメイガ新生幼虫及び市販のトウモロコシの穂軸グリットを含む混合物により人工的に外寄生させた。各地点において、植物を、Ｒｅａｓｎｏｒ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ及びＹｏｒｋの場所で１適用当たり２０～５１匹の新生幼虫並びにＷｉｎｄｆａｌｌの場所で１適用当たり９３～１０５匹の新生幼虫の外寄生率で、７日間の期間中に３回外寄生させた。

【0205】

第２世代のヨーロッパアワノメイガを模擬することを意図した２回目の人工的な外寄生を、試験区における植物の約５０％が花粉を飛散させているとき、植物がＶＴ～Ｒ１生育段階に達したときに行った。新生幼虫－グリット混合物を、Ｒｅａｓｎｏｒ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ及びＹｏｒｋの場所で１適用当たり３１～７２匹の新生幼虫並びにＷｉｎｄｆａｌｌの場所で１適用当たり９１～１１７匹の新生幼虫の外寄生率で、９日間の期間内に３回、各植物の輪生に適用した。

【0206】

第１世代の評価のために、植物がＶ１０～Ｒ１生育段階になったとき、最後の人工的な外寄生の１６～３３日後、試験区をヨーロッパアワノメイガ植物損傷について視覚的に評価した。中間の５つの外寄生された植物を、ＥＣＢＬＦ１視覚的採点スケール（９～１）を用いて、葉損傷について個別に採点し、９のスコアは、植物損傷なし又はごく少ない目に見える植物損傷を示し、１のスコアは、葉の３分の２超に１インチを超えるサイズの加害痕を有する植物を示した（表９）。

【0207】

【表9】

【0208】

第２世代について、植物がＲ２～Ｒ５生育段階になったとき、最後の第２世代の人工的な外寄生日の４０～６０日後、試験区をヨーロッパアワノメイガ植物損傷について視覚的に評価した。中間の５つの外寄生された植物を茎トンネリングの合計センチメートルについて個別に評価した。各植物について、各採点される植物の茎を第一穂の上の第４節間の上端から植物の基部まで縦方向に分割した。長さ０．５ｃｍ未満のトンネル又は入口穴は、合計トンネル長さに含まれなかった。

【0209】

統計的分析：
地点間：地点間のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ及び陰性対照トウモロコシについての葉損傷評価及び茎トンネリング測定に適用された線形混合モデルを用いて、統計的分析を実施した。データを各トウモロコシ害虫について別々にモデル化した。地点（Ｌ）_ｉ、反復（Ｒ）_ｊ、イベント（Ｅ）_ｍ、試験区（Ｋ）_ｋ及び植物ｓのＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ（Ｙ_{ｉｊｍｋｓ}）についてのデータを全体平均μ、地点、地点×反復、イベント、地点×イベント、各地点内の試験区（Ｋ／Ｌ）_ｉｋ及び各地点内の残差（ε／Ｌ）_{ｉｊｍｋｓ}についての要因の関数としてモデル化した。モデルは、以下のとおりに規定され得る。
Ｙ_{ｉｊｍｋｓ}＝μ＋Ｌ_ｉ＋（Ｌ×Ｒ）_ｉｊ＋Ｅ_ｍ＋（Ｌ×Ｅ）_ｉｍ＋（Ｋ／Ｌ）_ｉｋ＋（ε／Ｌ）_{ｉｊｍｋｓ}
ここで、イベント及び地点は、固定効果として処理され、他の効果は全て、平均０の独立した正規分布に従う確率変数として処理された。処理平均は、モデルフィッティングから推定された。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、処理効果を比較した。

【0210】

個々の地点：各地点を各害虫について別々にモデル化した。反復（Ｒ）ｉ、イベント（Ｅ）ｎ、試験区（Ｋ）ｋ及び植物ｓのＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシ（Ｙｉｎｋｓ）についてのデータを全体平均μ、反復、イベント、試験区及び残差εｉｎｋｓについての要因の関数としてモデル化した。モデルは、以下のとおりに規定され得る。
Ｙ_ｉｎｋｓ＝μ＋Ｒ_ｉ＋Ｅ_ｎ＋Ｋ_ｋ＋ε_ｉｎｋｓ
ここで、イベントは、固定効果として処理され、他の効果は全て、平均０の独立した正規分布に従う確率変数として処理された。処理平均は、モデルフィッティングから推定された。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、処理効果を比較した。

【0211】

場所間及び個別の場所の分析の両方について、差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。全ての統計的データ分析及び比較を、ＡＳＲｅｍｌ－Ｒ ３．０（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ，２００９）を用いて実施した。

【0212】

植物損傷結果の要約は、ツマジロクサヨトウ（表１０）、サウスウエスタンコーンボーラー（表１１）及びヨーロッパアワノメイガ（表１２）について以下に示される。これらの結果は、高い昆虫圧力（ｉｎｓｅｃｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下において、これらの試験におけるツマジロクサヨトウ、サウスウエスタンコーンボーラー及び第２世代ヨーロッパアワノメイガについて、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシで発現される抗昆虫活性Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質が陰性対照と比較して食害からの保護を提供することを示す。これらの試験における昆虫圧力は、第１世代ヨーロッパアワノメイガについて低かったが、ＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシで発現される抗昆虫活性Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質は、陰性対照トウモロコシと比較して食害からの保護を提供した。

【0213】

【表10】

【0214】

【表11】

【0215】

【表12】

【0216】

実施例６．トウモロコシイベントＤＰ－９１０５２１－２の作物栽培学及び収量圃場評価
ＤＰ－９１０５２１－２を含む作物栽培学圃場試験は、収量データを生成すること及び他の作物栽培学的特性を評価することであった。イベントに関して試験した全ての近交系及び交雑系材料は、単一のＴ０植物から生成した。

【0217】

交雑系試験
２つの交雑系試験は、一方の試験が１６地点及び他方が１０地点の合計２６地点において、各地点２反復のエントリーリストとして植付けを行った。２６地点中１０地点から穀粒を回収した。共通の背景の各エントリーを、各試験内で５つの試験品又は合計で１０の試験品と交配して、試験用の交雑種子を作成した。実験は、試験品に関して枝分れにし、エントリーは各枝分れの範囲内で無作為化した。各植付け地点において、生育期全体を通じて様々な観察及びデータを収集した。野生型エントリー（ＷＴ）又は比較用基準とも称される、同じ遺伝学を有するが、Ｃｒｙ１Ｂ．３４のないエントリーと比較するため、以下の作物栽培学的特性を分析した（表１３）：
１．）着雌穂高（ＥＡＲＨＴ）：植物上の地際から最上位にある発育した雌穂の着生節位までの測定値。着雌穂高はインチ単位で測定される。
２．）シルキングまでの成長度日（ＧＤＵＳＬＫ）：測定値は、試験区における植物の５０％が露出されたひげを有するときの累計成長度日を記録する。このデータセットについて１日換算は約１．５成長度日である。
３．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地際から止葉基部までのドローンによる計測値。稈長はインチ単位で測定される。
４．）水分（ＭＳＴ）：収穫時のパーセント穀粒水分の測定値。
５．）収量：各試験区から収穫された穀粒の重量記録。報告されるブッシェル／エーカー収量の計算は、各試験区の水分測定値で調整することにより行った。

【0218】

近交系試験
近交系試験は、８地点で各地点２反復のエントリーリストとして植付けを行った。分析用に４地点から穀粒を収穫した。各地点で一方の反復をコンストラクト設計に関して枝分れにした。他方の反復は、完備型乱塊法で植え付けた。近交系試験用に作物栽培学的データ及び観測を収集し、野生型エントリー（ＷＴ）又は同じ遺伝子型で形質のないバージョンとの比較のため分析した。近交系試験用に生成されたデータには、以下の作物栽培学的形質が含まれた（表１４）：
１．）着雌穂高（ＥＡＲＨＴ）：植物上の地際から最上位にある発育した雌穂の着生節位までの測定値。着雌穂高はインチ単位で測定される。
２．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地際から止葉基部までの測定値。稈長はインチ単位で測定される。
３．）雌穂測光法収量（ＰＨＴＹＬＤ）：各試験区から収穫された雌穂の画像からの計算上の収量推定値。示される値の単位はブッシェル／エーカーである。

【0219】

試験結果
交雑系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。この多地点分析では、主効果コンストラクト設計を固定効果と見なす。地点、背景、試験品、イベント、背景×コンストラクト設計、試験品×コンストラクト設計、試験品×イベント、地点×背景、地点×コンストラクト設計、地点×試験品、地点×背景×コンストラクト設計、地点×試験品×コンストラクト設計、地点×イベント、地点×試験品×イベント及び地点内の反復数についての要因を変量効果と見なす。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景についてコンストラクト設計の推定及びイベントの予測を生成した。Ｔ検定を行うことにより、コンストラクト設計／イベントをＷＴと比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

【0220】

近交系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。この多地点分析では、主効果コンストラクト設計を固定効果と見なす。地点、背景、イベント、背景×コンストラクト設計、地点×背景、地点×コンストラクト設計、地点×背景×コンストラクト設計、地点×イベント及び地点内の反復数についての要因を変量効果と見なす。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景についてコンストラクト設計の推定及びイベントの予測を生成した。Ｔ検定を行うことにより、コンストラクト設計／イベントをＷＴと比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

【0221】

【表13】

【0222】

【表14-1】

【0223】

実施例７．タンパク質発現及び濃度
タンパク質抽出
Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質濃度の分析のために、処理された葉組織副試料を１０ｍｇの目標重量で秤量した。試料を、ポリソルベート２０（ＰＢＳＴ）を含有する０．６０ｍｌの冷却したリン酸緩衝生理食塩水で抽出した。抽出した試料を遠心し、次に上清を除去し、分析用に調製した。

【0224】

Ｃｒｙ１Ｂ．３４タンパク質濃度の決定
分析前に試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。Ｃｒｙ１Ｂ．３４特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）をインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流し、結合したＣｒｙ１Ｂ．３４タンパク質を、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした別のＣｒｙ１Ｂ．３４特異的抗体と共にインキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＣｒｙ１Ｂ．３４抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を、プレートリーダーを使用して決定した。

【0225】

ＰＡＴタンパク質濃度の決定
分析前に試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。別のＰＡＴ特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）を、酵素ＨＲＰにコンジュゲートしたＰＡＴ特異的抗体とコインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＰＡＴ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルのＯＤを、プレートリーダーを使用して決定した。

【0226】

ＰＭＩタンパク質濃度の決定
分析前に試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。ＰＭＩ特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）をインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流し、結合したＰＭＩタンパク質を、酵素ＨＲＰにコンジュゲートした別のＰＭＩ特異的抗体と共にインキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＰＭＩ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルのＯＤを、プレートリーダーを使用して決定した。

【0227】

タンパク質濃度を決定するための計算
各一組の試料ウェルについて入手されたＯＤ値をタンパク質濃度値に変換するために必要な計算は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートデータソフトウェアを使用して実施した。

【0228】

各ＥＬＩＳＡプレートには、検量線を含めた。検量線の方程式をソフトウェアによって求め、このソフトウェアは二次関数の当てはめを用いて各一組の検量線ウェルについて入手されたＯＤ値をそれぞれの検量線濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関係付けるものであった。
調整後濃度＝補間した試料濃度×希釈係数

【0229】

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰソフトウェアによって求められた調整後試料濃度値を以下のとおりｎｇ／ｍｌからｎｇ／ｍｇ試料重量に変換した。

【0230】

【表14-2】

【0231】

結果
２世代のＤＰ－９１０５２１－２トウモロコシからのＶ９葉組織中のＣｒｙ１Ｂ．３４ ＰＡＴ及びＰＭＩタンパク質について、タンパク質濃度結果（平均値、標準偏差及び範囲）を決定した。

【0232】

【表15】

【0233】

本開示の様々な例示される実施形態の上記の説明は、網羅的であること又は開示される詳細な形態に範囲を限定することを意図しない。本明細書では、具体的な実施形態及び例が例示を目的として説明されているが、当業者が認識するであろうとおり、本開示の範囲内で様々な均等な改良形態が可能である。本明細書に提供される教示は、上記に説明される例以外の他の目的に適用することができる。上記の教示に鑑みて、多くの改良形態及び変形形態が可能であり、従って、それらは、添付の特許請求の範囲内にある。

【0234】

上記の詳細な説明に鑑みて、これら及び他の変更形態がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態にその範囲を限定するものと解釈されてはならない。

【0235】

背景、詳細な説明及び実施例で引用される各文献の開示全体（特許、特許出願、ジャーナル論文、抄録、マニュアル、書籍又は他の開示を含む）は、全体として参照により本明細書に援用される。

【0236】

使用される数（例えば、量、温度、濃度等）に関して、正確さを確保するように努めたが、幾らかの実験誤差及び偏差が許容されなければならない。特に指示されない限り、部数は、重量部数であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、セルシウス度単位であり、及び圧力は、大気圧又はその近傍の圧力である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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【国際調査報告】