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特表2024-543591心血管ｍｉＲＮＡの発現プロファイルに基づく妊娠合併症の予測方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】心血管ｍｉＲＮＡの発現プロファイルに基づく妊娠合併症の予測方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20241114BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241114BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20241114BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241114BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
G01N33/50 P
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532948
(86)(22)【出願日】2022-12-13
(85)【翻訳文提出日】2024-07-31
(86)【国際出願番号】 CZ2022050129
(87)【国際公開番号】W WO2023109988
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】PV2021-562
(32)【優先日】2021-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CZ
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524063752
【氏名又は名称】ジェネスペクター エス．アール．オー．
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】イロナ フロマドニコワ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA13
2G045AA25
2G045CA25
2G045DA14
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS14
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
子癇前症、胎児発育不全、妊娠高血圧、在胎不当過小児、早産などの妊娠合併症の予測方法、及び慢性高血圧の検出方法。妊娠中の女性をスクリーニングして、妊娠週数１０～１３週の期間に採取した末梢静脈全血における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを測定し、一方で該１つ又は複数のｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ及びｍｉＲ－５７４－３ｐの群から選択される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
妊娠した女性をスクリーニングして、妊娠週数１０から１３週の間に採取した末梢静脈全血における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを測定し、一方で前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１－３ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－１６－５ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１７－５ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－２１－５ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－２４－３ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１００－５ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－１２６－３ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１４３－３ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－１４５－５ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－１５５－５ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－１９５－５ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－２１０－３ｐ、その発現低下を測定するｍｉＲ－２２１－３ｐ、その発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－３４２－３ｐ、その発現上昇を測定するｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、及びその発現上昇又は発現低下を測定するｍｉＲ－５７４－３ｐの群から選択されることを特徴とする、子癇前症、胎児発育不全、妊娠高血圧、在胎不当過小児、及び早産の形の妊娠合併症を予測する方法、並びに慢性高血圧を検出する方法。
【請求項2】
子癇前症を予測するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現上昇したｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－２１－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１２６－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４３－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４５－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ及び発現上昇したｍｉＲ－５７４－３ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
胎児発育不全を予測するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現上昇したｍｉＲ－１６－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１００－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４３－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４５－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１９５－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－３４２－３ｐ及び発現上昇したｍｉＲ－５７４－３ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
妊娠高血圧を予測するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現上昇したｍｉＲ－１８１ａ－５ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
在胎不当過小児を予測するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現上昇したｍｉＲ－１－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１２６－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ及び発現上昇したｍｉＲ－４９９ａ－５ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
早産を予測するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現低下したｍｉＲ－１６－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－２１－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－２４－３ｐ、発現低下したｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、発現低下したｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、発現低下したｍｉＲ－１４５－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－１５５－５ｐ、発現低下したｍｉＲ－２１０－３ｐ及び発現低下したｍｉＲ－３４２－３ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記早産が自然早産又は前期破水の形であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
慢性高血圧を検出するための前記スクリーニングされたｍｉＲＮＡが、発現上昇したｍｉＲ－１－３ｐ、発現上昇したｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、発現上昇したｍｉＲ－１２６－３ｐ及び発現上昇したｍｉＲ－１４６ａ－５ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子生物学的方法、主に定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用したノンコーディング核酸及び発現マーカ、具体的にはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分析分野、並びに妊娠における困難な状態の発生を予測するためのスクリーニングにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
妊娠中、母親又は胎児は、妊産婦及び周産期の罹患率及び死亡率に著しく寄与するいくつかの合併症を経験することがあり得る。これらは主に子癇前症（ＰＥ）、胎児発育不全（ＦＧＲ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、在胎不当過小児（ＳＧＡ）、及び自然早産（ＳＰＴＢ）又は前期破水（ＰＰＲＯＭ）の形の早産（ＰＴＢ）である。更に、慢性高血圧（ＣＨＨ）はＰＥ発症のリスクファクタとみなされる。母親及び胎児の健康又は生命に対する深刻な脅威に加えて、これらの合併症は母親及びその子供の代謝又は心血管及び脳血管系における不可逆的変化を引き起こし、これらの変化は検出されないままであり得、また、これらの症状は数年にわたって現れ得ることが、科学論文、例えば文献Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１（２１），ｐ８４１３（非特許文献１）又はＨｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｓ．Ｍｅｄ．２０２１，１１，ｐ３９（非特許文献２）から公知である。従って、現代医学の目的は、いずれこれらの合併症を予測すること、理想的には発生を防止する、又はその過程及び影響を少なくとも緩和することである。
【0003】
臨床診療における現行基準は、母親の個体群統計データ、個人歴及び産科既往歴、臨床的特徴（ボディマス指数、平均動脈圧）、子宮動脈の超音波検査の結果、並びに血清分析物の測定値であるベータｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピンの遊離ベータサブユニット）、ＰＡＰＰ－Ａ（妊娠関連血漿タンパク質Ａ）及びＰＩＧＦ（胎盤増殖因子）などのアルゴリズム処理データに基づく予測モデルである。妊娠第１期中に検査を行い、その結果は２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、並びにＰＥ及びＦＧＲの形の妊娠合併症の発症確率として示される。ＰＥ発症確率が上昇する事例において、低用量のアセチルサリチル酸の使用が次に指示される。しかしながら、この予測モデルの欠点はＧＨ、つまり上述の別の合併症を予測することができないことであり、更にこのモデルではＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡ及びＰＴＢを良好に予測できないことが臨床データにより示されている。このアルゴリズムによりＰＥを良好に予測するのは、妊娠中にこの合併症を発症する女性の３分の１のみであり、ＦＧＲは女性の約４分の１のみであることが臨床データにより示されている。従って、目的は他の妊娠合併症も予測することができる信頼できる方法を見出すことでもある。
【0004】
上記妊娠合併症を母親及び子供たちの心血管マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のエピジェネティックプロファイルの変化と関連づける方法は、チェコ国特許発明第３０８１０２号明細書（特許文献１）及び３０８１７８号明細書（特許文献２）から公知である。ｍｉＲＮＡは、転写後レベルの遺伝子発現に影響し、遺伝子発現を調節する１８～２５ヌクレオチド長の小さなノンコーディングＲＮＡ分子である。いくつかの組織には、特徴的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルがある。病理過程で、この発現プロファイルが長期又は不可逆的に変化することがあり、診断に使用することができる。上記文献は、代謝機能及び心血管系に作用し、妊娠合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ）により誘発される２９のｍｉＲＮＡの発現プロファイルに関する分娩後及び出産後変化を記載している。末梢静脈全血におけるｍｉＲＮＡバイオマーカレベルを測定することにより、妊娠合併症を発症した母親、並びに子供たちの心血管疾患に対する感受性を予測することができた。しかしながら、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルの観察された変化は、通常妊娠第３期にのみ現れる、つまり妊娠週数２０週以降にのみ現れる過去の妊娠合併症からもたらされるため、妊娠第１期中、つまり妊娠週数１０～１３週の期間の合併症を予測する方法を開発するために、これらの引用文献から公知の知識を使用することはできない。言い換えると、妊娠合併症を経験後の所与のｍｉＲＮＡレベルの増減値は、合併症発症前のこれらの値に何ら一致しておらず、完全に独立している。引用特許文献に記載される技術が、所与の妊娠合併症の発症及び進行により引き起こされる変化に基づいているため、発症前にこれらの合併症を予測するためにこれらの変化を使用することはできない。
【0005】
妊娠中にＰＥ、ＦＧＲ又はＧＨを経験した患者の胎盤組織におけるｍｉＲＮＡの発現プロファイルに変化があることは、科学論文、例えば文献Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１５，１０（９）（非特許文献３）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１０，２０２，ｐ４６６（非特許文献４）、Ｌｙｋｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２０１８，６１，ｐ２４（非特許文献５）、又はＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２０１３，３４，ｐ７９９（非特許文献６）から公知である。これらの所見は、採取した胎盤組織を分析することにより遡及的に得られた。文献Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｔｉｓｌ．Ｍｅｄ．Ｊ．２０１７，１１８（９），ｐ５２３（非特許文献７）は、ＰＥ発症を予測するマーカとしてｍｉＲ－１４５の使用可能性を示唆しているが、出産後の胎盤組織でのみｍｉＲ－１４５発現を試験している。Ｌｉｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ－ＬＲｅｓ．２０２１，２２８，ｐ１３（非特許文献８）は、妊娠１２週目にＰＥの発症を予測する血漿マーカとしてｍｉＲ－１２５ｂの使用可能性を示唆しているが、このＰＥの予測モデルはｍｉＲ－１２５ｂ、妊娠前ＢＭＩ及び出産時の妊娠期間の組合せに基づくものであり、妊娠期間は原則として所定のＰＥ予測に適用できない。
【0006】
更に、妊娠週数２４～３６週の期間において、選択した循環ｍｉＲＮＡレベルのＰＥ症状が疑われる間の変化の例が記載された（Ｍｕｎａｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．２０１６，５，ｐ６８６（非特許文献９））。いくつかの循環ｍｉＲＮＡは、ＰＥを予測するマーカとしての使用が提案されているが、その深刻な変種のみである（Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｉｗａｎ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１４，５３，ｐ２３２（非特許文献１０））。胎盤特異的循環ｍｉＲＮＡ、つまり胎盤組織で排他的に発現するｍｉＲＮＡは、ＰＥ（Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１７，１２（２）（非特許文献１１））又はＰＥ、ＦＧＲ及びＧＨ（Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１９，２０，ｐ２９７２（非特許文献１２））を予測するための使用が提案されている。引用文献には、血清又は血漿で、或いは血漿エクソソームの一部として自由に循環するマーカが記載されている。血漿エクソソームの処理は困難で面倒なプロセスであり、臨床診療で広く使用するのに好適でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】チェコ国特許発明第３０８１０２号明細書
【特許文献2】チェコ国特許発明第３０８１７８号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１（２１），ｐ８４１３
【非特許文献2】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｓ．Ｍｅｄ．２０２１，１１，ｐ３９
【非特許文献3】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１５，１０（９）
【非特許文献4】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１０，２０２，ｐ４６６
【非特許文献5】Ｌｙｋｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２０１８，６１，ｐ２４
【非特許文献6】Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２０１３，３４ ｐ７９９
【非特許文献7】Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｔｉｓｌ．Ｍｅｄ．Ｊ．２０１７，１１８（９），ｐ５２３
【非特許文献8】Ｌｉｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ－ＬＲｅｓ．２０２１，２２８，ｐ１３
【非特許文献9】Ｍｕｎａｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．２０１６，５，ｐ６８６
【非特許文献10】Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｉｗａｎ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１４，５３，ｐ２３２
【非特許文献11】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１７，１２（２）
【非特許文献12】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１９，２０，ｐ２９７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、一般的な設備の分子遺伝学研究室でさえ大規模で容易に使用でき、頻繁に議論されるＰＥ及びＦＧＲだけでなく、現在の臨床診療において予測にわずかな可能性しかないＧＨ、ＳＧＡ及びＰＴＢを正しく高い信頼性で予測することができ、更に多くの女性で潜在的に検出されないことがあるリスクファクタとしてのＣＨＨを検出することができる方法を開発することにより、先行技術の欠点を排除することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、標準的な第１期のスクリーニング中、つまり妊娠週数１０～１３週の期間に妊娠した女性から採取した末梢静脈全血のサンプルにおける２５の特異的なｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）のレベルをＲＴ－ｑＰＣＲ法により測定することに基づく。このｍｉＲＮＡ群から好適なサブセットを選択することにより、高い確率及び信頼性でＰＥ、ＦＧＲ、ＧＨ、ＳＧＡ及びＰＴＢの発症を予測し、ＣＨＨを検出することができる。
【0011】
上記ｍｉＲＮＡレベルの変化と、ＰＥ又はＦＧＲの形の現在又は過去の妊娠合併症との関連が既に科学文献に提示されており、従って先行技術から公知であるが、それを予測に使用することは、これらの文献から明らかでないか、又は容易に推測されない。これは記載されたｍｉＲＮＡが多数であり、起こり得る発現レベルの変化の変動が大きく、個別の妊娠合併症を予測するためにマーカの不明なサブセットを選択する必要性があるためである。
【0012】
本方法は、妊娠第１期の女性１２，０００名からの選択したサンプルの分析、これらの分析結果の統計処理、及びモニターした女性のその後の妊娠過程との比較に基づき開発された。
【0013】
まず、採取した血液を白血球溶解液に処理した。その後、含有されるＲＮＡを抽出し、続いて短鎖ＲＮＡを単離する。標準的及び配列特異的化学物質、すなわちｍｉＲＮＡ特異的ステムループＲＴプライマ、ｍｉＲＮＡ特異的フォワード及びリバースＰＣＲプライマ、並びにｍｉＲＮＡ特異的ＭＧＢプローブの存在下、周期的に繰り返す個別の工程のために理想的な温度条件を維持する装置において、２段階ＲＴ－ｑＰＣＲ反応を使用し、得られた精製溶液を分析する。各工程において、プローブから放出される蛍光信号を測定し、サイクルを通常合計で４０～４５回繰り返す。プログラムの終了後、Ｃｔ値を個別のチャネルで読み取り、結果はモニターした元の核酸分子数と一致する。白血球溶解液からのＲＮＡ抽出及びＲＴ－ｑＰＣＲ分析は現在の分子診断で標準である。この手順は速く、実施が容易で、容易に自動化できる。従って、この診断方法は、多くの遺伝子実験室における実施、及び臨床診療における幅広い使用に好適である。
【0014】
選択したｍｉＲＮＡ発現の正規分布は、合併症を起こすことなく生理学的妊娠をした女性のサンプルに基づき決定した。続いて、これらのレベルを妊娠中にモニターした合併症のいずれかを発症した女性からのサンプルにおけるｍｉＲＮＡレベルと比較し、クラスカル・ウォリス検定及びマン・ホイットニー検定を使用して、結果を統計的に処理した。各個別の妊娠合併症について、ｍｉＲＮＡの特異的なセットを選択した。これらのｍｉＲＮＡすべてが所与の合併症の発症前に発現上昇し（選択したすべてのｍｉＲＮＡが発現低下するＰＴＢを除く）、これらの組合せを使用して、偽陽性率が著しく低く、著しく高い感度で合併症を予測することができる。一般的に許容される値は、偽陽性率１０％である。
【0015】
個々の妊娠合併症を予測するため、及び妊娠合併症を発症する１つのリスクファクタ（ＣＨＨ）を検出するためのバイオマーカとして好適なｍｉＲＮＡの選択は以下の通りである。
・ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ：ＧＨ、ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ：ＧＨ、ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１５５－５ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１４５－５ｐ：ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＳＧＡで発現上昇； ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１６－５ｐ：ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－５７４－３ｐ：ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－３４２－３ｐ：ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１００－５ｐ：ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ：ＣＨＨ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ：ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇
・ｍｉＲ－２１－５ｐ：ＰＥで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１７－５ｐ：ＰＥで発現上昇
・ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ：ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ：ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ：ＧＨ、ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ：ＧＨ、ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１５５－５ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１４５－５ｐ：ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ：ＣＨＨ、ＰＥ、ＳＧＡで発現上昇； ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１６－５ｐ：ＰＥ、ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－５７４－３ｐ：ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－３４２－３ｐ：ＦＧＲで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１００－５ｐ：ＦＧＲ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ：ＣＨＨ、ＳＧＡで発現上昇
・ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ：ＰＥ、ＦＧＲで発現上昇
・ｍｉＲ－２１－５ｐ：ＰＥで発現上昇；ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１７－５ｐ：ＰＥで発現上昇
・ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ：ＰＴＢで発現低下
・ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ：ＳＧＡで発現上昇
【0016】
子癇前症（ＰＥ）
妊娠中にＰＥを発症した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の８つのｍｉＲＮＡの発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、偽陽性率（ＦＰＲ）１０％で５３．０％の症例を予測することができた。臨床及び研究室検査並びに既往歴に基づく産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを用いた先行技術の方法では、同じ女性群において３３．３％の症例しか検出できなかった。このように、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法を使用し、先行技術の手法よりも著しく高い確率でＰＥの発症を良好に予測することができる。また、所定の予測アルゴリズムを利用した方法を使用すると、ＰＥの早期型、つまり妊娠の３４週目以前に生じるＰＥしか予測できず、一方でｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠２０週目以降の任意の妊娠段階で生じるＰＥのいずれかの形（早期ＰＥ、後期ＰＥ、軽度ＰＥ及び重度ＰＥ）を予測することができた。
妊娠中にＰＥを発症した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の８つのｍｉＲＮＡの発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、偽陽性率（ＦＰＲ）１０％で５３．０％の症例を予測することができた。臨床及び研究室検査並びに既往歴に基づく産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを用いた先行技術の方法では、同じ女性群において３３．３％の症例しか検出できなかった。このように、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法を使用し、先行技術の手法よりも著しく高い確率でＰＥの発症を良好に予測することができる。また、所定の予測アルゴリズムを利用した方法を使用すると、ＰＥの早期型、つまり妊娠の３４週目以前に生じるＰＥしか予測できず、一方でｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠２０週目以降の任意の妊娠段階で生じるＰＥのいずれかの形（早期ＰＥ、後期ＰＥ、軽度ＰＥ及び重度ＰＥ）を予測することができた。
【0017】
胎児発育不全（ＦＧＲ）
妊娠中にＦＧＲを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の１０のｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで４０．２％の症例を予測することができた。臨床及び研究室検査並びに既往歴に基づく産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを用いた先行技術の方法では、同じ女性群において２８．０％の症例しか検出できなかった。このように、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法を使用し、先行技術の手法よりも著しく高い確率でＦＧＲを良好に予測することができる。また、所定の予測アルゴリズムを利用する方法を使用すると、妊娠３７週目以前に生じるＦＧＲしか予測できず、一方でｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠３７週目以降に生じるＦＧＲを含む、妊娠週数２０週以降の任意の妊娠段階で生じるＦＧＲを予測することができた。
妊娠中にＦＧＲを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の１０のｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで４０．２％の症例を予測することができた。臨床及び研究室検査並びに既往歴に基づく産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを用いた先行技術の方法では、同じ女性群において２８．０％の症例しか検出できなかった。このように、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法を使用し、先行技術の手法よりも著しく高い確率でＦＧＲを良好に予測することができる。また、所定の予測アルゴリズムを利用する方法を使用すると、妊娠３７週目以前に生じるＦＧＲしか予測できず、一方でｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠３７週目以降に生じるＦＧＲを含む、妊娠週数２０週以降の任意の妊娠段階で生じるＦＧＲを予測することができた。
【0018】
他の妊娠合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ又はＳＧＡ）を発症していない自然早産（ＳＰＴＢ）又は前期破水（ＰＰＲＯＭ）の形の早産（ＰＴＢ）
早産した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の１２のｍｉＲＮＡに関する発現低下をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴の知識を知らなくても、１０％のＦＰＲで５２．８％の症例を予測することができた。現在、妊娠の第１期では事実上不可能であるが、任意の明らかな臨床的要因を有することなく早産が起こる症例を予測することもできた。所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、非常に限られた程度でしかこの合併症を予測することができず、更にＳＰＴＢの症例のみである（初産の女性の２０％、２回以上出産した女性の３０％）。また、所定の予測アルゴリズムを利用する方法を使用すると、ＳＰＴＢの早期型、つまり妊娠３４週目以前に生じるＳＰＴＢしか予測できず、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠週数２４週以降の任意の妊娠段階で生じるＳＰＴＢ及びＰＰＲＯＭのどちらも予測することができた。
早産した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の１２のｍｉＲＮＡに関する発現低下をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴の知識を知らなくても、１０％のＦＰＲで５２．８％の症例を予測することができた。現在、妊娠の第１期では事実上不可能であるが、任意の明らかな臨床的要因を有することなく早産が起こる症例を予測することもできた。所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、非常に限られた程度でしかこの合併症を予測することができず、更にＳＰＴＢの症例のみである（初産の女性の２０％、２回以上出産した女性の３０％）。また、所定の予測アルゴリズムを利用する方法を使用すると、ＳＰＴＢの早期型、つまり妊娠３４週目以前に生じるＳＰＴＢしか予測できず、ｍｉＲＮＡバイオマーカを利用する方法では、妊娠週数２４週以降の任意の妊娠段階で生じるＳＰＴＢ及びＰＰＲＯＭのどちらも予測することができた。
【0019】
慢性高血圧（ＣＨＨ）
それ自体がＰＥ発症のリスクファクタとなる慢性高血圧の女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の４つのｍｉＲＮＡは発現上昇することが多かった：ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで７９．３％の症例を発見することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用した先行技術の方法は、特に患者の既往歴に基づいており、ＰＥを発症するリスクを評価する際、ＣＨＨはリスクファクタの１つとしてデータの一部である。既往歴の収集中に、患者がこの既往歴データを提供しない場合、後のＰＥを発症するリスクの計算に含まれない。
それ自体がＰＥ発症のリスクファクタとなる慢性高血圧の女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の４つのｍｉＲＮＡは発現上昇することが多かった：ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで７９．３％の症例を発見することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用した先行技術の方法は、特に患者の既往歴に基づいており、ＰＥを発症するリスクを評価する際、ＣＨＨはリスクファクタの１つとしてデータの一部である。既往歴の収集中に、患者がこの既往歴データを提供しない場合、後のＰＥを発症するリスクの計算に含まれない。
【0020】
在胎不当過小児（ＳＧＡ）
妊娠中に胎児がＳＧＡを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の８つのｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで８３．８％の症例を予測することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、この合併症を予測することができない。
妊娠中に胎児がＳＧＡを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下の８つのｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで８３．８％の症例を予測することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、この合併症を予測することができない。
【0021】
妊娠高血圧（ＧＨ）
妊娠中にＧＨを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下のｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで２２．９％の症例を予測することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、この合併症を予測することができない。
妊娠中にＧＨを経験した女性において、第１期中に採取した末梢静脈全血における以下のｍｉＲＮＡに関する発現上昇をモニタリングすることで、最も好適に予測できることが判明した：ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ。この方法を使用すると、女性の更なる臨床検査を行わず、又は病歴を知らなくても、１０％のＦＰＲで２２．９％の症例を予測することができた。産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法では、この合併症を予測することができない。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図１はＰＥ予測に関する８つの選択されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）の発現上昇の統計解析から得られた、組み合わせたスクリーニング及び個別のｍｉＲＮＡのＲＯＣ（受信者操作特性）曲線を表す。
【図2】図２はＦＧＲ予測に関する１０の選択されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）の発現上昇の統計解析から得られた、組み合わせたスクリーニング及び個別のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線を表す。
【図3】図３は他の妊娠合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ又はＳＧＡ）を発症しておらず、ＳＰＴＢ又はＰＰＲＯＭの形のＰＴＢ予測に関する１２の選択されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ）の発現低下の統計解析から得られた、組み合わせたスクリーニング及び個別のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線を表す。
【図4】図４はＣＨＨの検出に関する４つの選択されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ）の発現上昇の統計解析から得られた、組み合わせたスクリーニング及び個別のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線を表す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
実施例１
実施例１は、末梢静脈全血の試験サンプル及びリファレンスサンプルにおいて、ｍｉＲＮＡ量を測定するＲＴ－ｑＰＣＲ分析の一般的な実施を記載する。リファレンスサンプルは、選択した内在性コントロール（ＲＮＵ５８Ａ及びＲＮＵ３８Ｂ）の同時に測定した量に対して標準化されたものである。
実施例１は、末梢静脈全血の試験サンプル及びリファレンスサンプルにおいて、ｍｉＲＮＡ量を測定するＲＴ－ｑＰＣＲ分析の一般的な実施を記載する。リファレンスサンプルは、選択した内在性コントロール（ＲＮＵ５８Ａ及びＲＮＵ３８Ｂ）の同時に測定した量に対して標準化されたものである。
【0024】
酸性フェノール及びクロロホルムの混合物を使用し、解凍した白血球溶解液からＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡから長鎖ＲＮＡを更に除去し、グラスファイバフィルタを有するカラム、及び個別の単離工程に異なる濃度のエタノールを使用して短鎖ＲＮＡを濃縮する。短鎖ＲＮＡを含有する単離したＲＮＡを２段階ＲＴ－ｑＰＣＲ反応のテンプレートとしてそのまま使用する。以下の１６℃で３０分、４２℃で３０分及び８５℃で５分の条件下、逆転写を行う。その後、以下の９５℃で１０分、９５℃で１５秒及び６０℃で１分の条件下、ポリメラーゼ連鎖反応を行う。この工程後、ＦＡＭ及びＲＯＸチャネル（蛍光の標準化のためのパッシブレファレンス）で毎回蛍光を測定する。このサイクルを合計４０から４５回繰り返す。このプログラムの終了後、個別のチャネルのＣｔ値を読み取る。１つのサンプル内において、測定したｍｉＲＮＡ、又は内在性コントロールとして機能する短鎖ＲＮＡについて、ＦＡＭチャネルでＣｔ値が得られる。これらの値は生体サンプルにおける個別の遺伝子発現に相当する。標準化した発現値は、測定したサンプルにおけるｍｉＲＮＡのＣｔ値から内在性コントロールのＣｔ値（ＲＮＵ５８Ａ及びＲＮＵ３８Ｂの幾何平均）を引くことにより得られる。相対定量のために、実施したすべての分析で使用されるリファレンスサンプルでも、調査したｍｉＲＮＡ及び内在性コントロールのすべての発現を同時に測定する。
【0025】
実施例２
実施例２は、選択したｍｉＲＮＡレベルのデータを統計解析する一般的な実施を記載する。
実施例２は、選択したｍｉＲＮＡレベルのデータを統計解析する一般的な実施を記載する。
【0026】
シャピロ－ウィルク検定によるデータの非正規分布のため、ノンパラメトリック検定を実験データの評価に使用する。ｍｉＲＮＡの遺伝子発現はマン・ホイットニー検定を使用して個別の群間で比較され、比較した群が２を超える場合、クラスカル・ウォリス検定を使用した後、事後解析を行う。統計学的有意水準は、ｐ＜０．０５値に設定する。ＲＯＣ（受信者操作特性）曲線もそれぞれのｍｉＲＮＡについて作成する。曲線下面積、個別のｍｉＲＮＡの感度及び特異度、並びに最適カットオフ値（いわゆる基準）を評価する。更に、所与のｍｉＲＮＡバイオマーカの最適カットオフ値及び感度を９０．０％の特異度で測定する。これは１０．０％の偽陽性率（ＦＰＲ）で特異的なｍｉＲＮＡの発現が上昇又は低下した女性の割合に関する情報に相当する。更に、所与の状況についてｍｉＲＮＡバイオマーカの最適な組み合わせを選択するために、ロジスティック回帰及びＲＯＣ解析を組み合わせた統計解析を実施する。この適用により、以下のパラメータ：曲線下面積、感度、特異度、最適カットオフ値及び特異度９０．０％におけるｍｉＲＮＡバイオマーカの所与の組み合わせの感度が得られる。
【0027】
実施例３
実施例３は、バイオマーカとして心血管ｍｉＲＮＡを使用して妊娠合併症を予測する方法を開発するために、生体サンプルの好適なセットを採取及び選択することを記載する。
実施例３は、バイオマーカとして心血管ｍｉＲＮＡを使用して妊娠合併症を予測する方法を開発するために、生体サンプルの好適なセットを採取及び選択することを記載する。
【0028】
末梢静脈全血２００μＬを妊娠１０から１３週目の女性約１２０００人から採取する。赤血球を除去することにより白血球の細胞溶解液を調製した後、－８０℃で急速冷凍保存する。患者の出産後、すべての合併症及び出産過程を含む、妊娠の全期間にわたって完全な健康状態が知られている女性からのサンプルを特異的に選択する。生理学的な妊娠過程を有する患者、つまり任意の合併症を発症しておらず、産科及び婦人科データベースのためのコンピュータアプリケーション内で、所定の予測アルゴリズムを利用する先行技術の方法を使用した第１期出生前スクリーニングにおいて、陰性結果を有する患者８０名をコントロールグループとして選択する。個々の合併症の調査のため、以下の患者群：妊娠中にＰＥと診断された患者６６名、妊娠中にＦＧＲと診断された患者８２名、早産（ＳＰＴＢ又はＰＰＲＯＭ）し、同時にほかの合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ又はＳＧＡ）を経験しなかった患者１０６名、慢性高血圧の患者２９名、妊娠中にＳＧＡと診断された患者３７名、妊娠中にＧＨと診断された患者８３名が選択される。これらの選択された患者の血液サンプルを実施例１に記載される手順に従って分析し、２５の選択したｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）。実施例４から９において、高い信頼性で個々の妊娠合併症を予測するため、それぞれの実施例で示される好適なｍｉＲＮＡの半分超を毎回使用する。それぞれの実施例で示される好適なｍｉＲＮＡすべてを使用することで信頼性は最も高くなる。
【0029】
実施例４
実施例４は、選択した患者サンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＰＥを良好に予測することを記載する。
実施例４は、選択した患者サンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＰＥを良好に予測することを記載する。
【0030】
モニターした患者６６名が妊娠中にＰＥを発症し、患者１７名が軽度、患者４９名が重度のＰＥである。モニターした患者のうち、１４名が妊娠週数３４週以前に出産し（早期ＰＥ）、５２名は妊娠週数３４週以降に出産している（後期ＰＥ）。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載される手順に従って分析し、８つの選択したｍｉＲＮＡのレベルを測定する（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）。これらの選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現上昇は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最小値を超えており、患者６６名のうち３５名（軽度ＰＥ９名、重度ＰＥ２６名、早期ＰＥ５名、後期ＰＥ３０名）で観察され、これは５３．０％の症例における良好な予測に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する。
【0031】
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
【表3】
【0034】
【表4】
【0035】
【表5】
【0036】
【表6】
【0037】
【表7】
【0038】
【表8】
【0039】
【表9】
【0040】
実施例５
実施例５は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＦＧＲを良好に予測することを記載する。
実施例５は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＦＧＲを良好に予測することを記載する。
【0041】
モニターした患者８２名は妊娠中にＦＧＲと診断されており、患者５名は妊娠週数３２週以前に出産し（早期ＦＧＲ）、７７名は妊娠週数３２週以降に出産している（後期ＦＧＲ）。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載される手順に従って分析し、選択した１０のｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ）。これらの選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現上昇は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最小値を超えており、患者８２名のうち３３名（早期ＦＧＲ２名、後期ＦＧＲ３１名）で観察され、これは４０．２％の症例における良好な予測に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する：
【0042】
【表10】
【0043】
【表11】
【0044】
【表12】
【0045】
【表13】
【0046】
【表14】
【0047】
【表15】
【0048】
【表16】
【0049】
【表17】
【0050】
【表18】
【0051】
【表19】
【0052】
【表20】
【0053】
実施例６
実施例６は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、他の妊娠合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ又はＳＧＡ）を発症していないＳＰＴＢ又はＰＰＲＯＭの形のＰＴＢを良好に予測することを記載する。
実施例６は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、他の妊娠合併症（ＧＨ、ＰＥ、ＦＧＲ又はＳＧＡ）を発症していないＳＰＴＢ又はＰＰＲＯＭの形のＰＴＢを良好に予測することを記載する。
【0054】
他の妊娠合併症を発症していないモニターした患者１０６名は、妊娠週数３７週以前に自然早産（患者４１名）又は前期破水（患者６５名）し、患者２９名は妊娠週数３４週以前に出産し、患者７７名は妊娠週数３４週以降に出産している。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載の手順に従って分析し、選択した１２のｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ）。これらの選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現低下は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最大値未満であり、患者１０６名のうち５６名（ＳＰＴＢ１３名、ＰＰＲＯＭ４３名、３４週以前のＰＴＢ１２名、３４週以降のＰＴＢ４４名）で観察され、これは５２．８％の症例における良好な予測に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する。
【0055】
【表21】
【0056】
【表22】
【0057】
【表23】
【0058】
【表24】
【0059】
【表25】
【0060】
【表26】
【0061】
【表27】
【0062】
【表28】
【0063】
【表29】
【0064】
【表30】
【0065】
【表31】
【0066】
【表32】
【0067】
【表33】
【0068】
実施例７
実施例７は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＣＨＨを良好に検出することを記載する。
実施例７は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＣＨＨを良好に検出することを記載する。
【0069】
モニターした患者２９名はＣＨＨである。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載の手順に従って分析し、選択した４つのｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ）。これらの選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現上昇は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最小値を超えており、患者２９名のうち２３名で観察され、これは７９．３％の症例における良好な検出に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する。
【0070】
【表34】
【0071】
【表35】
【0072】
【表36】
【0073】
【表37】
【0074】
【表38】
【0075】
実施例８
実施例８は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＳＧＡを良好に予測することを記載する。
実施例８は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＳＧＡを良好に予測することを記載する。
【0076】
モニターした患者３７名の胎児は妊娠中にＳＧＡと診断され、これらの患者は妊娠週数３３から４０週の間に出産し、患者４名は妊娠週数３４週以前に出産し（早期ＳＧＡ）、３３名は妊娠週数３４週以降に出産している（後期ＳＧＡ）。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載の手順に従って分析し、選択した８つのｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ）。これらの選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現上昇は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最小値を超えており、患者３７名のうち３１名（早期ＳＧＡ１名、後期ＳＧＡ３０名）で観察され、これは８３．８％の症例における良好な予測に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する。
【0077】
【表39】
【0078】
【表40】
【0079】
【表41】
【0080】
【表42】
【0081】
【表43】
【0082】
【表44】
【0083】
【表45】
【0084】
【表46】
【0085】
【表47】
【0086】
実施例９
実施例９は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＧＨを良好に予測することを記載する。
実施例９は、選択した患者のサンプルにおける選択したｍｉＲＮＡマーカを使用し、ＧＨを良好に予測することを記載する。
【0087】
モニターした患者８３名は妊娠中にＧＨと診断されている。これらの選択した患者の血液サンプルを実施例１に記載の手順に従って分析し、選択したｍｉＲＮＡレベルを測定する（ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ）。この選択したｍｉＲＮＡバイオマーカの発現上昇は、そのレベルがＦＰＲ１０％での統計解析により決定される最小値を超えており、患者８３名のうちの１９名で観察され、これは２２．９％の症例における良好な予測に相当する。得られたデータの統計解析は、以下の特異度、感度、９５％ＣＩ及び基準の値を提供する。
【0088】
【表48】
【産業上の利用可能性】
【0089】
心血管ｍｉＲＮＡの発現プロファイルに基づき妊娠合併症を予測する方法は、婦人科及び産科の臨床診療、採取した生体物質サンプルの研究室分析において、産業的に適用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】