特表 2024-543596 官能化繊維の調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-21

(54)【発明の名称】官能化繊維の調製方法

(51)【国際特許分類】

   D06M 10/02 20060101AFI20241114BHJP

   D04H 1/728 20120101ALI20241114BHJP

   D06M 16/00 20060101ALI20241114BHJP

   C07K 1/22 20060101ALN20241114BHJP

【ＦＩ】

D06M10/02 C

D04H1/728

D06M16/00 Z

C07K1/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024533049

(86)(22)【出願日】2022-12-02

(85)【翻訳文提出日】2024-08-02

(86)【国際出願番号】 US2022080784

(87)【国際公開番号】W WO2023102503

(87)【国際公開日】2023-06-08

(31)【優先権主張番号】63/285,364

(32)【優先日】2021-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/285,369

(32)【優先日】2021-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/285,373

(32)【優先日】2021-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520030844

【氏名又は名称】ディーディーピー スペシャルティ エレクトロニック マテリアルズ ユーエス リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100228005

【弁理士】

【氏名又は名称】澤田 英之

(72)【発明者】

【氏名】トムリンソン イアン

(72)【発明者】

【氏名】フリスク サイモン

(72)【発明者】

【氏名】ディーツ マーティン

【テーマコード（参考）】

4H045

4L031

4L047

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA57

4H045BA60

4H045BA62

4H045DA76

4H045EA60

4H045GA26

4L031AA12

4L031AA13

4L031AA18

4L031AA20

4L031BA39

4L031CB05

4L047AA19

4L047AA26

4L047AA29

4L047AB02

4L047AB08

4L047CB10

4L047CC16

4L047EA22

(57)【要約】

０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有するナノウェブを官能化して、官能化ナノウェブを製造する方法が記載される。本方法は、ナノウェブを、大気圧プラズマ中でビニルモノマーに曝露し、次いで、他の分子を活性部位に結合することができる分子に曝露することを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有するナノウェブを官能化して、官能化ナノウェブを製造するための方法であって、前記方法が、
ａ）前記ナノウェブ及びビニルモノマーを大気プラズマに曝露して、被覆されたナノウェブを生成する工程と、
ｂ）前記被覆されたナノウェブと、共有結合を形成することができる分子を含むエアロゾルとを、大気圧プラズマに暴露する工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記ナノウェブが非炭水化物ポリマーである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ナノウェブが、ＰＶＤＦ、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、又はポリイミドを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ビニルモノマーが、少なくとも１つのエポキシ基を含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記共有結合を形成することができる分子が、ヒドロキシル、アミン、又はチオール基の少なくとも１つを含む分子を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記エアロゾルが、不揮発性緩衝液を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ビニルモノマーが、（ｉ）エポキシアルコール、又は（ｉｉ）アセチレンアルコールの、エステル又はエーテルを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記分子が、活性部位にタンパク質を結合することができる、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記分子が、少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記タンパク質が、活性部位に他のタンパク質を結合することができる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有するナノウェブを官能化して、官能化ナノウェブを製造するための方法であって、前記方法が、
ａ）前記ナノウェブ及びビニルモノマーを大気プラズマに曝露して、被覆されたナノウェブを生成する工程と、
ｂ）前記被覆されたナノウェブを、共有結合を形成することができる分子に曝露する工程と
を含む、方法。

【請求項12】

前記ナノウェブが非炭水化物ポリマーである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ナノウェブが、ＰＶＤＦ、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、又はポリイミドを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ビニルモノマーが、少なくとも１つのエポキシ基を含む、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記共有結合を形成することができる分子が、ヒドロキシル、アミン、又はチオール基の少なくとも１つを含む分子を含む、請求項１１～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記ビニルモノマーが、（ｉ）エポキシアルコール、又は（ｉｉ）アセチレンアルコールの、エステル又はエーテルを含む、請求項１１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有するナノウェブを官能化して、タンパク質を含む官能化ナノウェブを製造するための方法であって、前記方法が、
ａ）前記ナノウェブ、第一のビニルモノマー、及び第二のビニルモノマーを、大気圧プラズマに暴露して、被覆されたナノウェブを生成する工程と、
ｂ）前記被覆されたナノウェブを、共有結合を形成することができる分子に曝露する工程と
を含む、方法。

【請求項18】

前記ナノウェブが非炭水化物ポリマーである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ナノウェブが、ＰＶＤＦ、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、又はポリイミドを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第一のビニルモノマーが、少なくとも１つのエポキシ基を含む、請求項１７～１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

少なくとも１つの親水性基を含む第二のビニルモノマーを更に含む、請求項１７～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記共有結合を形成することができる分子が、ヒドロキシル、アミン、又はチオール基の少なくとも１つを含む分子を含む、請求項１７～２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記エアロゾルが不揮発性緩衝液を含む、請求項１７～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記第一のビニルモノマーが、（ｉ）エポキシアルコール、又は（ｉｉ）アセチレンアルコールの、エステル又はエーテルを含む、請求項１７～２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記分子が、少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項１７～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記タンパク質が、他のタンパク質を活性部位に結合することができる、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、クロマトグラフィーに有用な官能化ナノウェブを製造するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物製剤、特に、抗体由来の治療薬、例えば、モノクローナル抗体の製造中に、アフィニティ捕捉及び溶出精製工程が、頻繁に使用される。この工程は、最も典型的には、クロマトグラフィー支持体にコンジュゲートされたタンパク質リガンドによる、所望の治療薬の結合を含む。いくつかの支持体材料は、タンパク質リガンドを官能化支持体表面に結合させる前に、表面官能化を必要とする。繊維は、例えば、Ｚ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，８７７（２００９）３６８６－３６９４に示すように、支持体材料として使用され、繊維は、空気プラズマに曝露し、次いで、メタクリル酸の液相に浸漬して反応させ、官能化繊維を製造する。別の工程では、液相反応において、タンパク質は、タンパク質上のアミノ基を介して、官能化繊維に結合される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有する、ナノウェブを官能化して、官能化ナノウェブを製造する方法に関し、前記方法は、
ａ）前記ナノウェブ及びビニルモノマーを大気プラズマに曝露して、被覆されたナノウェブを生成する工程と、
ｂ）前記被覆されたナノウェブと、共有結合を形成することができる分子、好ましくは、タンパク質を含むエアロゾルとを、大気プラズマに暴露する工程とを含む、方法である。

【0004】

本発明は更に、０．１～５μｍの平均貫通細孔径及び４０～９０体積％の多孔度を有する、ナノウェブを官能化して、タンパク質を含む官能化ナノウェブを製造する方法に関し、前記方法は、
ａ）前記ナノウェブ及びビニルモノマーを大気プラズマに曝露して、被覆されたナノウェブを生成する工程と、
ｂ）前記被覆されたナノウェブを、（ｉ）他のタンパク質を活性部位に結合することができ、（ｉｉ）遊離チオール基を含むタンパク質に、曝露する工程と
を含む、方法である。

【発明を実施するための形態】

【0005】

特に明記されない限り、全ての百分率は、重量百分率（重量％）であり、そして全ての温度は、℃である。特に明記されない限り、平均は算術平均である。特に指定されない限り、全ての操作は、室温（１８～２５℃）で実施される。「（メタ）アクリレート」、「（メタ）アクリル」、及び「（メタ）アクリルアミド」という用語は、各々、アクリレート又はメタクリレート、アクリル又はメタクリル、及びアクリルアミド又はメタクリルアミド、（集合的に、「アクリルモノマー」）を意味する。アクリルポリマーは、（メタ）アクリル酸、アルキル、グリシジル若しくはヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルキル、グリシジル及び／若しくはヒドロキシアルキル（メタ）アクリルアミド、又はそれらの組み合わせの、少なくとも５０重量％の重合単位を含むポリマーである。炭水化物ポリマーは、糖分子の重合単位を含むポリマー、すなわち、多糖であり、エーテル基又はエステル基を介して官能化された多糖類は、この定義内にあると考えられる。

【0006】

ランダムに分布した繊維のウェブは、一般に、「不織布」と呼ばれる。繊維は、互いに結合されてもよく、又は結合されなくてもよく、好ましくは、結合されない。「ナノウェブ」は、少なくとも１つのナノファイバーを含む、不織布ウェブである。ナノウェブはまた、「ナノファイバーマット」と呼ばれてもよい。好ましくは、ナノウェブ中の繊維は「連続的」であり、すなわち、ウェブを形成するために、１つの連続的な流れの中で敷設される。繊維径は、ＳＥＭ写真検査によって、決定することができる。好ましくは、繊維は、０．１～１μｍの直径を有する。好ましくは、繊維の少なくとも９５％は、繊維の長さに基づいて、記載された範囲の直径を有する。好ましくは、繊維の９５％未満が記載された範囲の直径を有する場合、繊維径は、少なくとも５０回の測定、好ましくは、少なくとも１００回の測定の、算術平均である。

【0007】

好ましくは、ナノウェブは、少なくとも０．１５μｍ、好ましくは、少なくとも０．２μｍ、好ましくは、少なくとも０．２５μｍ、好ましくは、２μｍ以下、好ましくは、１μｍ以下、好ましくは、０．５μｍ以下の、平均貫通細孔径を有する。平均貫通細孔径は、材料ポロメトリー測定から計算された量であり、乾燥試料は様々な流量で空気流に供され、次いで、既知の表面張力の流体で湿潤され、空気流は、材料の最後に湿潤した細孔が空気で排出されるまで、一定に増加する流量で戻される。平均貫通細孔は、湿潤流曲線と交差する乾燥空気流曲線の、１／２勾配から決定される。繊維径と平均貫通細孔径との関係を、決定した。Ｓｉｍｍｏｎｄｓらは、不織布の平均繊維径Ｄ_fiberから、平均貫通細孔径Ｄ_mean,poreを決定するために、以下の関係を提案した（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ＧＥ，Ｂｏｍｂｅｒｇｅｒ ＪＤ，Ｂｒｙｎｅｒ ＭＡ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｎｏｎｗｏｖｅｎｓ ｔｏ ｍｅｅｔ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｅｎｇ Ｆｉｂｅｒｓ Ｆａｂｒｉｃｓ．２００７；２ （１），１－１５参照）。
Ｄ_mean,pore＝０．３９２６７＊Ｄ_fiber／（１－多孔度）

【0008】

好ましくは、ナノウェブは、４０～９０体積％、好ましくは、少なくとも５０体積％、好ましくは、少なくとも６０体積％、好ましくは、８５体積％以下、好ましくは、８０体積％以下、好ましくは、７５体積％以下の、多孔度を有する。ナノファイバーマットを通る流体の流れは、高い多孔度によって促進され、細孔径が小さいと、基材の結合容量が改善すると考えられる。好ましくは、細孔径が、０．１～１ミクロンである場合、多孔度は、５０～９０体積％である。好ましくは、細孔径が、０．１～０．５ミクロンである場合、多孔度は、６５から８５体積％であり、多孔度は、以下の式から計算される：
多孔度＝１－（繊維の質量（ｇ／ｃｍ²））／（ナノファイバーマットの厚み（ｃｍ）×ポリマー密度（ｇ／ｃｍ³））

【0009】

好ましくは、繊維は、合成ポリマー、好ましくは、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）、ポリ（フッ化ビニリデン－ｃｏ－トリフルオロエチレン）などのＰＶＤＦのコポリマー、ポリアミド、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリイミド、又はそれらの組み合わせを含み、好ましくは、繊維は、ＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン、ナイロン、又はそれらの組み合わせを含む。好ましくは、ＰＶＤＦポリマーは、１００，０００～２，０００，０００、好ましくは、２００，０００～５００，０００ダルトンの、数平均分子量を有する。好ましくは、ポリアミドは、５，０００～４０，０００、好ましくは、１０，０００～２０，０００の、数平均分子量を有する。好ましくは、ポリエーテルスルホンは、２０，０００～８０，０００、好ましくは、４０，０００～６０，０００の、数平均分子量を有する。本発明の好ましい実施形態では、繊維は、ＰＶＤＦを含み、好ましくは、繊維は、少なくとも５０重量％、好ましくは、少なくとも８０重量％、好ましくは、少なくとも９０重量％、好ましくは、少なくとも９５重量％のＰＶＤＦを含む。

【0010】

好ましくは、ビニルモノマーは、少なくとも１つのエポキシ基を含み、好ましくは、１～４個、好ましくは、１～２個、好ましくは、１個である。好ましくは、ビニルモノマーは、（ｉ）エポキシアルコール、又は（ｉｉ）アセチレンアルコールの、エステル又はエーテルを含む。好ましくは、ビニルモノマーは、エポキシアルコール、好ましくは、グリシジルアルコール（例えば、ビニルグリシジルエーテル）のエーテルである。好ましくは、ビニルモノマーは、エポキシアルコールのエステルである。好ましくは、エステルは、（メタ）アクリレートエステルである。好ましくは、エポキシアルコールは、グリシジルアルコールである。好ましくは、ビニルモノマーは、グリシジルアルコールの（メタ）アクリレートエステル、好ましくは、グリシジル（メタ）アクリレートである。

【0011】

好ましい実施形態では、ナノウェブは、少なくとも１つのエポキシ基を含むビニルモノマーの導入前に、少なくとも１つの親水性基を含むビニルモノマーに、プラズマ中で曝露される。好ましくは、親水性基は、ヒドロキシル、カルボン酸、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコールであり、好ましくは、ヒドロキシルである。好ましくは、ビニルモノマーは、エステルアルキル基上に親水性基を有する（メタ）アクリレートエステル、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、又は（メタ）アクリル酸であり、好ましくは、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、好ましくは、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２－ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、２－ヒドロキシプロピルメタクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、４－ヒドロキシブチルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、又はそれらの混合物であり、好ましくは、ＨＥＭＡ、又はＨＥＡである。別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの親水性基を含むビニルモノマーを、ビニルモノマー、及びナノウェブと同時に接触させる。

【0012】

共有結合を形成することができる分子には、求核基を含む分子が含まれ得るが、これらに限定されない。これらの求核基には、ヒドロキシル、アミン、又はチオール基が含まれ得るが、これらに限定されない。これらの基は、とりわけ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、ポリ核酸、ウイルス、及び細胞に見出すことができる。好ましくは、共有結合を形成することができる分子は、タンパク質である。

【0013】

本発明の１つの好ましい実施形態では、繊維、ビニルモノマー、及びタンパク質は、同時にプラズマ環境中に存在する。本発明の別の好ましい実施形態では、最初に、繊維を、プラズマ中でビニルモノマーで官能化し、次いで、官能化繊維を、プラズマ中でタンパク質と接触させる。別の好ましい実施形態では、最初に、繊維を、プラズマ中でビニルモノマーで官能化し、次いで、官能化繊維を、水性媒体中でタンパク質と接触させる。

【0014】

好ましくは、タンパク質は、遊離システインチオール基、すなわち、ジスルフィド結合の一部ではないチオール基（－ＳＨ）を含み、前記タンパク質は、他のタンパク質を活性部位に結合することに関して、活性である。好ましくは、遊離システインチオール基を含むタンパク質は、タンパク質結合部位の完全性、すなわち、他のタンパク質を結合するためのタンパク質の活性を、維持するために必要とされない、タンパク質中のジスルフィド結合を開裂させることによって得られる。好ましくは、そのｐＨで還元されるタンパク質の安定性に応じて、１．５～９．０の間のｐＨで使用することができる、トリス（２－カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（ＴＣＥＰ．ＨＣｌ）を使用して、ジスルフィドを還元する。還元のための典型的なｐＨは、非リン酸緩衝液、例えば、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ホウ酸塩を使用して、ｐＨ３～ｐＨ８である。ＴＣＥＰの１つの利点は、それがチオール基を含有せず、したがって、タンパク質の遊離スルフヒドリルを、ナノファイバー上のエポキシド基と反応させる前に、除去を必要としないことである。更なる還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール（ＭＥ）、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩（２－ＭＥＡ．ＨＣｌ）が含まれ、これらは全て、典型的には、中性ｐＨ付近で利用される。これらの３つの試薬は、全て遊離チオール基を含み、タンパク質をナノファイバーと反応させ、タンパク質のコンジュゲーション中の競合反応を低減する前に、濾過によってタンパク質から除去することができる。システイン－システインジスルフィド結合は、多くの場合、タンパク質構造を維持する方法として、タンパク質中に見出され、これらのジスルフィド結合の開裂は、タンパク質の変性をもたらし得る。βシート、ヘリックスバンドル、及びヘアピン構造などの他の構造的特徴は、ジスルフィド結合を使用せずに、タンパク質の立体配座を維持することができる。好ましくは、他のタンパク質又は有用な生物学的治療分子の、親和性結合に有用なタンパク質は、組換えにより生成する、又は天然源から単離される。好ましくは、タンパク質は、得られるタンパク質の立体配置安定性に関与しないジスルフィド結合を含むように、組換え生成されたものであり、このタイプの好ましいタンパク質には、プロテインＡ、プロテインＡ／Ｇ、及びプロテインＧが含まれる。他の好ましいタンパク質には、抗体（モノクローナル及びポリクローナル）、組換えにより、又はインタクトな抗体から断片を開裂するための酵素処理後に、生成することができる、認識断片Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）₂が含まれる（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０２０ Ｊｕｎ； １３１（１）：ｅ１１９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｐｍｂ．１１９）。好ましくは、Ｆ（ａｂ’）₂で還元されるジスルフィド結合は、タンパク質の結合部位の遠位にあり、他のタンパク質に結合する能力を失うことなく、開裂して個々の断片を形成することができ、これはおそらく、タンパク質の立体配置を維持するのを補助するジスルフィド結合が、タンパク質の立体配置を維持し、これらのジスルフィドを還元から保護する、β－シートなどのβ－二次構造内で生じるためである。好ましくは、タンパク質は、５～５０ｍＭの濃度で、水溶液中に存在する。好ましくは、溶液のｐＨは、８～９．５、好ましくは、８．５～９．３、好ましくは、８．７～９．１であり、タンパク質の分子量は、１５０，０００ダルトン以下、好ましくは、１００，０００ダルトン以下、好ましくは、７５，０００ダルトン以下である。

【0015】

好ましくは、液体エアロゾルとして注入された官能化モノマー及びタンパク質を、ナノファイバー基材に結合させるために、誘電体バリア放電大気圧プラズマプロセスが使用される。誘電体バリア放電プラズマプロセスは、好ましくは、均質なグロー放電プロセスである。大気圧の注入ガスから空間的に均一な低温電子を生成するための、均質なグロー放電プラズマプロセスが、当技術分野で知られている。イオンは、注入されたモノマーと衝突し、基材堆積前に、エアロゾル中で自己重合し得る、イオン化種を生成する。プラズマ生成に適した好ましいガスには、二酸化炭素、窒素、アルゴン、及び／又はヘリウムが含まれる。プラズマ形態のガス、及び注入されたモノマーエアロゾルの流れは、画定された断面積を有するノズルを通過する。好ましくは、不織布ロール物品を処理するために、ノズルは、電極間ギャップ、及び不織布の幅よりも大きい幅を有する、矩形形状である。電極間ギャップは、好ましくは、０．５～１０ｍｍ、好ましくは、０．８～２ｍｍである。以下の実施例で用いたノズルの断面積は、４０ｃｍのノズル幅で、５ｃｍ²である。好ましくは、ガス流量は、２～１５０ｓｌｍ／ｃｍ²の範囲であり、ｓｌｍは、毎分標準リットルの単位であり、ガス体積の標準条件は、温度０℃及び圧力１ａｔｍ（１０１ｋＰａ）で、好ましくは、６０～１００ｓｌｍ／ｃｍ²である。プラズマヘッドを通過するガス流量は、プラズマヘッドサイズ、及びモノマーで被覆される基材の幅、並びにガスの環境温度及び圧力に依存する。注入されるモノマー流量は、基材の面積当たりに結合するモノマーの量に依存する。モノマーの高い注入速度は、基板上に堆積する前に自己重合をもたらし得る。好ましくは、エアロゾル化モノマーの注入速度は、０．２ｓｌｍ／ｃｍ²～５ｓｌｍ／ｃｍ²の範囲である。モノマーの希釈は、液体溶液混合の手段、固体モノマーの水又は適切な溶媒への溶解又は懸濁による、及び液体モノマーの純粋な化合物、懸濁液、又は溶媒混合物への、より大きなガス流の導入による、一方又は両方の手段によって達成され得る。好ましい希釈比（溶媒又は担体対モノマー）は、２：１～５０：１、好ましくは、３：１～２０：１の範囲である。好ましくは、交流電力が供給される被覆電極は、０．９～１．１ａｔｍ（９１～１１１ｋＰａ）の大気圧で、狭いギャップを介してプラズマを生成する。好ましくは、プラズマ源電圧は、１～１００ｋＶの範囲であり、好ましくは、５～３０ｋＶの範囲である。好ましくは、初期活性化及びモノマーとの反応のための供給電力は、２～３００Ｗ／ｃｍ²、好ましくは、２０～２００Ｗ／ｃｍ²、好ましくは、３０～１６０Ｗ／ｃｍ²の範囲である。好ましくは、タンパク質の存在下での供給電力は、１～１００Ｗ／ｃｍ²、好ましくは、２～４０Ｗ／ｃｍ²、好ましくは、３～２０Ｗ／ｃｍ²の範囲である。好ましくは、基材とプラズマヘッドとの間の距離は、１～１０ｍｍ、好ましくは、２～５ｍｍである。好ましくは、基材は、モノマーなしの大気圧プラズマプロセスにおいて、二酸化炭素、窒素、アルゴン、及び／又はヘリウムを使用して、前処理される。

【実施例】

【0016】

実施例として使用し、表Ｉに示す、非炭水化物系ポリマーからの不織布ウェブを、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｃｈｅｍｒｅｖ．８ｂ００５９３に記載されるものと同様のエレクトロスピニングプロセスによって、調製した。同様の非炭水化物ウェブは、米国特許第７，６１８，５７９号明細書に記載されている、エレクトロブロープロセスによって、製造することができる。次いで、これらの不織布ウェブを、米国特許第８６９７５８７Ｂ２号明細書に記載されているように、圧密化されていてもよい。紡糸及び圧密化プロセスは、得られたウェブの多孔度が、３５％～９５％の間の範囲となり、平均貫通細孔径が、０．１μｍ～５μｍの間となるように調整した。

【0017】

【表1】

【0018】

例示的な不織布基材をプラズマによって前処理し、次いで、官能化剤（「薬剤」）及びプロセス条件を使用して、プラズマ被覆プロセス（例えば、米国特許第８，６６３，７５１号明細書、米国特許第９，８９０，２６０号明細書、及び米国特許第９，９３８，３８８号明細書を参照）によって処理すると、様々な量の薬剤が、プラズマに注入され、基材に施用された。例示的不織布上へのエポキシド又はメタクリル堆積のための、プラズマプロセス条件を、ビニル官能化実施例番号１及び２として、表ＩＩに示す。各ナノファイバー不織布ウェブは、プラズマ処理装置を通る活性化パスに供され、ウェブの上面及び底面は、８０ｓｌｍ／ｃｍ²及び８ｓｌｍ／ｃｍ²の流量、並びに３００Ｗ／ｍ²の出力レベルで、ＣＯ₂及びＮ₂のプラズマに曝露される。活性化されたナノファイバーウェブは、８０ｓｌｍ／ｃｍ²の流量で、Ｎ₂プラズマを通過する。電極と基材との間の距離は、２ｍｍであった。

【0019】

【表2】

【0020】

官能化実施例１
加水分解した組換えプロテインＡを解凍し、溶液１ｍＬ当たり１１ｍｇのプロテインＡの濃度で、脱イオン水を含むネブライザーバイアルに溶解した。溶液をエアロゾル化し、ＧＭＡとともにアルゴンプラズマに同時注入する前に、還元反応は行わなかった。タンパク質プラズマを、表ＩＩのビニル官能化実施例１の、移動基材に向けた。プラズマプロセス条件は、６０ｓｌｍ／ｃｍ²のＡｒでのＡｒとＮ₂ガスの３：１ブレンド、２ｍｍの基板から電極までの距離、４０Ｗ／ｃｍ²のプラズマへの印加電力、及び５０：５０体積比のプロテインＡ溶液とＧＭＡの同時注入を用いた、大気圧プラズマプロセスを使用した。溶液を、２ｓｌｍ／ｃｍ²の総エアロゾル流量で、３：１の体積比で、追加のＡｒガスで希釈した。プロテインＡを有する得られたタンパク質官能化ナノファイバー基材を、飽和結合容量について、そのまま試験した。

【0021】

官能化実施例２
加水分解した組換えプロテインＡを解凍し、溶液１ｍＬ当たり１１ｍｇのプロテインＡの濃度で、脱イオン水を含むバイアルに溶解した。溶液をエアロゾル化し、ＧＭＡとともにアルゴンプラズマに同時注入する前に、還元反応を行った。プロテインＡ二量体中のジスルフィド結合に対する還元は、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を使用して、水溶液中で、５～５０ｍＭの濃度で、ｐＨ６～８で行った［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｐｒｏｂｅｓ－ｔｈｅ－ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｈｉｏｌ－ｒｅａｃｔｉｖｅ－ｐｒｏｂｅｓ／ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ａｎｄ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ参照］。Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを用いて過剰のＴＣＥＰを溶液から濾過し、続いて、脱イオン水で溶出した。３Ｍ炭酸アンモニウム（ＡＣ）を用いて濾過した溶液のｐＨを調整し、ｐＨ９．５になるまで、各１．５ｍＬの濾過した還元プロテインＡ溶液に０．５ｍＬのＡＣを添加した。ｐＨ調整タンパク質プラズマを、表ＩＩのビニル官能化実施例１の、移動基材に向けた。プラズマプロセス条件は、６０ｓｌｍ／ｃｍ²のＡｒでのＡｒとＮ₂ガスの３：１ブレンド、２ｍｍの基板から電極までの距離、４０Ｗ／ｃｍ²のプラズマへの印加電力、及び５０：５０体積比のプロテインＡ溶液とＧＭＡの同時注入を用いた、大気圧プラズマプロセスを使用した。溶液を、２ｓｌｍ／ｃｍ²の総エアロゾル流量で、３：１の体積比で、追加のＡｒガスで希釈した。プロテインＡを有する得られたタンパク質官能化ナノファイバー基材を、飽和結合容量について、そのまま試験した。

【0022】

官能化実施例３
脱イオン水中の組換えプロテインＡの２０ｍｇ／ｍＬ溶液を、５０ｍＬバイアル中で調製した。０．５ＭのＴＣＥＰを添加して、ジスルフィド結合を還元し、室温で１０分間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘカラムに通して濾過し、１０³当量のＧＭＡと反応させた後、１Ｍギ酸アンモニウムで処理した。得られたＧＭＡ修飾組換えプロテインＡ溶液を再び濾過し、次いで、ビニル官能化実施例２に対する官能化実施例２と同じ条件で、ＨＥＭＡとのコエアロゾルとして、４０Ｗ／ｃｍ²で、Ａｒ／Ｎ₂大気圧プラズマに注入した。プロテインＡを有する得られたタンパク質官能化ナノファイバー基材を、飽和結合容量について、そのまま試験した。

【0023】

官能化実施例４
官能化実施例３で調製したのと同一のＧＭＡ修飾溶液を、官能化実施例２と同一のプラズマプロセスで、ビニル官能化実施例２に導入するが、エアロゾルの希釈は７：１に増加させる。プロテインＡを有する得られたタンパク質官能化ナノファイバー基材を、飽和結合容量について、そのまま試験した。

【0024】

官能化実施例５
表ＩＩのビニル官能化実施例１は、溶液中で、組換えプロテインＡ上の反応性システインとコンジュゲートされる。この反応は、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を使用して、プロテインＡ二量体中のジスルフィド結合を、水溶液中で、５～５０ｍＭの濃度で、ｐＨ６～８で、最初に還元することを含む［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ出願ノート、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｐｒｏｂｅｓ－ｔｈｅ－ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｈｉｏｌ－ｒｅａｃｔｉｖｅ－ｐｒｏｂｅｓ／ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ａｎｄ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ参照］。次いで、遊離反応性チオールを有するプロテインＡを、塩析緩衝液、例えば、硫酸ナトリウムの存在下で、浸漬したエポキシ活性化ナノファイバーマットと反応させて、繊維の表面上のプロテインＡのコーティングを増加させ、その結果、繊維の表面でのプロテインＡの局所濃度を増加させ、ナノファイバーマットにコンジュゲートされたプロテインＡの量を増加させる［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ出願ノート、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ参照］。

【0025】

比較例１
ビニル官能化実施例２を、飽和結合容量についてはそのまま、すなわち、プラズマ又は溶液ベースのプロテインＡとのコンジュゲーションなしで試験する。
飽和結合容量ＳＢＣは、膜の直径２．５ｃｍの円板をＳｗｉｎｎｅｘフィルタホルダに入れ、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（商標）を使用して、ヒトＩｇＧ（０．２ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中１０ｍＬ溶液を、膜を通して０．５ｍｌ／分で溶出することによって、測定することができる。次いで、フィルタを約１０床体積のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いで、ヒトＩｇＧを５床体積の緩衝液（例えば、ｐＨ３の０．１Ｍグリシン）で膜から溶出し、変性を回避するために約ｐＨ７に迅速に中和し、濃度を、以下の式を使用して、又は溶出曲線の積分によって、分光光度法で測定し、検量線と比較する（例えば、Ｈａｈｎ ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．２００５，１０９３，９８）。

【0026】

タンパク質濃度
タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）：吸光度×希釈×（分子量／モル吸光係数）
官能化ナノファイバー表面の飽和結合容量測定の結果を、表ＩＩＩに示し、大気プラズマ又は溶液ベースのプロセスでプロテインＡに曝露した場合の、全構造体の結合能力の性能向上を示す。

【0027】

【表3】

【0028】

官能化実施例６
実施例１のビニル官能化ナノウェブを、マサチューセッツ州ウォルサムのＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給される、プロテインＡとコンジュゲートさせた。このタイプのプロテインＡは、アミン基を介して、ビニル官能化ナノウェブに結合する。表ＩＶの結果によって実証されたように、プロテインＡ官能化ナノウェブへのＩｇＧの結合によって、コンジュゲーションの成功が実証された。容量試験は、比較例１の後の段落で上述したように行った。

【0029】

【表4】

【国際調査報告】