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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】ＦＲＥＴ酵素基質及び肺がんにおけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/37 20060101AFI20241114BHJP
C07K 5/107 20060101ALI20241114BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241114BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241114BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20241114BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20241114BHJP
A61K 51/08 20060101ALN20241114BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/37
C07K5/107 ZNA
A61P11/00
A61P35/00
A61K45/00
G01N33/574 A
G01N33/542 A
A61K51/08 200
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534265
(86)(22)【出願日】2022-12-05
(85)【翻訳文提出日】2024-08-07
(86)【国際出願番号】 PL2022050088
(87)【国際公開番号】W WO2023106945
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】P.439760
(32)【優先日】2021-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521563895
【氏名又は名称】ユルテステ・ソシエテ・アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100106080
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 晶子
(72)【発明者】
【氏名】レスナー，アダム
(72)【発明者】
【氏名】グルバ，ナタリア
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ36
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QR48
4B063QR58
4B063QS36
4B063QX02
4C084AA02
4C084AA17
4C084NA20
4C084ZA59
4C084ZB26
4C085HH11
4C085KA27
4C085KB44
4C085KB82
4C085LL18
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA50
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、医療、さらに詳しくはがんの診断、特に肺がんの診断に使用するための新規化合物、診断マーカーに関する。本発明はまた、対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性を本化合物を用いて検出するためのインビトロ法にも関する。本発明はさらに、本化合物を用いる肺がんのインビトロ診断法、本化合物を含むキット、及び肺がんに特異的な酵素活性を検出するための本化合物の使用、ならびに肺がんの診断のための本化合物の使用にも関する。本発明はまた、肺がんの診断マーカーとして使用するための本化合物、及び本化合物を用いて上記のとおりの肺がんの診断法を実施する手順を含む肺がんの治療法にも関する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１：Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物であって、
式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する
化合物。
【請求項2】
前記化合物が加水分解的切断、好ましくはタンパク質分解的切断を受ける、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記化合物において、分子Ｃ１とＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群から選ばれ、好ましくは、前記Ｃ１とＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡ又はＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
前記化合物が、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項5】
前記化合物が、加水分解的切断を受けて、下記のフラグメント１：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨとフラグメント２：ＡＮＢ－ＮＨ２を生成する、請求項４に記載の化合物。
【請求項6】
対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性を検出するためのインビトロ法であって、ａ）体液サンプルを、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物と接触させ、
［上記式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になる］、そして
ｂ）分子Ｃ１とＣ２の空間的分離によって生成する測定可能な光シグナルを検出する
ことを含むインビトロ法。
【請求項7】
酵素活性が、加水分解活性、好ましくはタンパク質分解活性である、請求項６に記載のインビトロ法。
【請求項8】
前記化合物として、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される、請求項６又は７に記載のインビトロ法。
【請求項9】
前記体液として、尿、好ましくはヒト尿が使用される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
対象における肺がんの有無が検査対象の体液サンプル中の肺がんに特異的な酵素活性を測定することによって検出され、前記酵素活性の不在は肺がんの不在を示すが、前記酵素活性の存在は肺がんの存在を示す、肺がんを診断するためのインビトロ法。
【請求項11】
酵素活性の検出が、請求項６～９のいずれか１項に定義された方法によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記酵素活性の測定が、式１：Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物を用いて実施され、
上記式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記体液サンプルが、中性又はアルカリ性のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨを有する測定緩衝液中で、サンプル対測定緩衝液の比率１：２～１：１０の範囲内、好ましくは１：５で前記化合物とインキュベートされる、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記化合物が、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記化合物として、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される、請求項１０～１４に記載の方法。
【請求項16】
前記サンプルとして、尿サンプル、好ましくはヒト尿が使用される、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記酵素活性の測定が、３００～５００ｎｍ、好ましくは３８０～４３０ｎｍの範囲、特に４０５ｎｍの吸光強度を、４０～６０分間、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃の範囲内の温度で測定することを含む、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～５のいずれか１項に定義の化合物と測定緩衝液とを含むキット。
【請求項19】
前記化合物が、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物である、請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
肺がんに特異的な酵素活性を検出するための、請求項１～５のいずれか１項に定義の化合物の使用。
【請求項21】
肺がんの診断のための、請求項１～５のいずれか１項に定義の化合物の使用。
【請求項22】
肺がんの診断が、原発性肺がんの検出、肺がんの外科的切除後の微小残存病変の検出、及び／又は肺がんの再発の検出を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記化合物が、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物である、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項24】
肺がん検出のための診断マーカーとして使用するための、請求項１～５のいずれか１項に定義された化合物。
【請求項25】
前記化合物が、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物である、請求項２４に記載の使用のための化合物。
【請求項26】
肺がんの治療法であって、ａ）肺がんに特異的な酵素活性の存在を、請求項６～９のいずれか１項に定義の方法によって検査対象の体液サンプル中に検出し、そして
ｂ）前記酵素活性の存在が前記サンプル中に見つかれば、肺がんの治療を対象に適用する
治療法。
【請求項27】
ポイントｂ）に従って治療の終了後、肺がんに特異的な前記酵素活性が所定の時間間隔でモニターされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
サンプルとして、尿サンプル、好ましくはヒト尿が使用されることを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
前記化合物として、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療、さらに詳しくはがんの診断、特に肺がんの診断に使用するための新規化合物、診断マーカーに関する。本発明はまた、対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性を本化合物を用いて検出するためのインビトロ検出法、本化合物を用いる肺がんのインビトロ診断法、本化合物を含むキット、肺がんに特異的な酵素活性を検出するための本化合物の使用、肺がんの診断のための本化合物の使用、肺がんの診断マーカーとして使用するための本化合物にも関する。本発明はさらに、上記のとおりの肺がんの診断法を実施する手順を含む肺がんの治療法にも関する。
【背景技術】
【0002】
肺がんは世界で２番目に多い悪性新生物であり、２０２０年には２２０万人を超える患者が肺がんになった。肺がんは、遅発性の症状、非常に急速な疾患進行、そして高い死亡率を特徴とする。２０２０年には約１８０万人の患者が肺がんで死亡した。肺がんは２０３０年までは最も致死性のがんであり続けるだろう。肺がんの経過において、早期及び前がん病変は症状を引き起こさない。このため、疾患の早期発見は難しく、早期発見が行われることは稀である。罹患者の大多数でこのがんは意図的に又は他の理由で実施されたＸ線検査中に局所病変として偶然見つかる。確定（陽性）診断の場合、５年生存率は２０％未満のレベルである。現在、患者は、治療選択肢が非常に限られる疾患末期で診断されている。早期発見は良好な予後と関連する。肺がんの外科治療は、肺がんの除去につながりうる唯一の効果的な方法である。残念なことに、外科治療の対象になるのは、肺がんと診断された患者の約３０％に過ぎない。根治的外科治療を受けた患者では５年生存率は５０％である。肺がんの早期かつ信頼できる診断を可能にする臨床検査も“がんマーカー”も検査セットも存在しない。Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ又はポジトロン磁気共鳴イメージングといった画像検査法が有効な診断のために使用され、その後腫瘍の生検が行われる。少数の患者集団（５～１０％）では特定遺伝子の発現に変化が見られ、この集団に遺伝子検査を受けさせやすくしている。
【0003】
がん細胞の発生、増殖及び播種のプロセスには、多数の酵素、特に加水分解酵素、とりわけタンパク質分解酵素を含む多数の要因が関与していることが知られている。そうした酵素は、タンパク質やペプチドをその小さなフラグメントに、酵素的（加水分解的又はタンパク質分解的）に切断するプロセスを触媒する。がん細胞は、このプロセスによって新しい組織に定着し、腫瘍への効果的な栄養送達を可能にする血管形成（血管新生）過程を増強することにより、増殖拡大することが可能になる。その上、これらの酵素は、腫瘍増殖プロセスにより健常細胞が死滅した結果として存在する。これらすべてのプロセスは、腫瘍に特徴的な、がん細胞の酵素（タンパク質分解）活性という特徴的で特異的な側面を形成している。
【0004】
当該分野では、酵素分解を受けてより小さなフラグメントになると、検査溶液の色を変化又は増加させる発色性ペプチド分子が知られている。この発色効果は、発色性ペプチド分子から発色団（例えば、４－アニリド又は２－アミノ安息香酸）が放出される結果である。この種の発色性分子及びそれらの使用は、例えば、Ｅｒｌａｎｇｅｒ ＢＦ，Ｋｏｋｏｗｓｋｙ Ｎ，Ｃｏｈｅｎ Ｗ．による“トリプシンの２種の新規発色性基質の調製と性質(The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin)”，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９６１；９５：２７１－８ならびにＨｏｊｏ Ｋ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｉｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｓｍｉｔｈ Ｔ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ．による、アミノ酸とペプチド．ＸＸＸＶ．“固相法によるｐ－ニトロアニリド類似体の簡易調製法”(Amino acids and peptides. XXXV. “Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”），Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ），Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０００；４８（１１）：１７４０－４の出版物により知られている。
【0005】
しかしながら、このクラスの化合物を肺がんの診断に使用することに関する報告はこれまでのところない。
個々の成分を適切な時間及び化学量論条件で結合させて発色性ペプチドを得る方法も先行技術において公知である。結合法は、個々の構成要素（アミノ酸誘導体）を結合させ、残基を洗い流し、保護基を順次除去して再度洗浄するという連続工程からなる。このサイクルをアミノ酸残基ごとに繰り返す。得られたペプチドを酸性条件下での反応により樹脂から分離する。次に、ろ過工程で溶液を樹脂から分離した後、非極性溶媒によって溶液からペプチドを沈殿させる。
個々の成分を適切な時間及び化学量論条件で結合させて発色性ペプチドを得る方法も先行技術において公知である。結合法は、個々の構成要素（アミノ酸誘導体）を結合させ、残基を洗い流し、保護基を順次除去して再度洗浄するという連続工程からなる。このサイクルをアミノ酸残基ごとに繰り返す。得られたペプチドを酸性条件下での反応により樹脂から分離する。次に、ろ過工程で溶液を樹脂から分離した後、非極性溶媒によって溶液からペプチドを沈殿させる。
【0006】
しかしながら、肺がんの特異的かつ早期の診断に適切な発色性ペプチド化合物やそれらを得る方法は先行技術においては知られていない。
従って、当分野においては、肺がんを非侵襲的及び信頼できる様式で、早期に、高感度に、そして特異的に診断することを可能にする肺がんのための“がんマーカー”と、そのような診断マーカーを用いる診断法及び治療法を求める差し迫ったニーズがある。
従って、当分野においては、肺がんを非侵襲的及び信頼できる様式で、早期に、高感度に、そして特異的に診断することを可能にする肺がんのための“がんマーカー”と、そのような診断マーカーを用いる診断法及び治療法を求める差し迫ったニーズがある。
【0007】
本発明の目的は、肺がんのための新規で特異的な診断マーカーと、そのようなマーカーを用いた肺がんの非侵襲的、迅速、高感度、及び特異的な早期発見のための診断法（スクリーニングテストにも適切であろう）、ならびにそのようなマーカーを用いた治療法を提供することである。
【0008】
これらの目的は、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明によって達成された。一方、その好適な変形については従属クレームに定義されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., “The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin”, Arch Biochem Biophys., November 1961; 95:271-8
【非特許文献2】Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. “Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”, Chem Pharm Bull (Tokyo), November 2000; 48(11):1740-4
【発明の概要】
【0010】
本発明は、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物を提供する。
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物を提供する。
【0011】
式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する。
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する。
【0012】
本発明による化合物は、好ましくは加水分解的切断、さらに好ましくはタンパク質分解的切断を受ける。
好ましくは、本発明による化合物において、分子Ｃ１とＣ２の対は、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群から選ばれ、さらに好ましくは、Ｃ１とＣ２の対は、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ又はＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２である。
好ましくは、本発明による化合物において、分子Ｃ１とＣ２の対は、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群から選ばれ、さらに好ましくは、Ｃ１とＣ２の対は、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ又はＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２である。
【0013】
好ましくは、本発明による化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物である。
【0014】
さらに好ましくは、本発明による化合物は、加水分解的切断を受けて、以下のフラグメント１：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨとフラグメント２：ＡＮＢ－ＮＨ２を生成する。
【0015】
本発明はさらに、対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性を検出するためのインビトロ検出法も提供し、該方法は、
ａ）体液サンプルを、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物と接触させ、
［上記式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になる］、そして
ｂ）分子Ｃ１とＣ２の空間的分離によって生成する測定可能な光シグナルを検出する
ことを含む。
ａ）体液サンプルを、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物と接触させ、
［上記式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になる］、そして
ｂ）分子Ｃ１とＣ２の空間的分離によって生成する測定可能な光シグナルを検出する
ことを含む。
【0016】
本発明による酵素活性の検出法において、酵素活性は、好ましくは加水分解活性、さらに好ましくはタンパク質分解活性である。
本発明による酵素活性の検出法において、前記化合物として、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される。
本発明による酵素活性の検出法において、前記化合物として、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される。
【0017】
本発明による酵素活性の検出法において、前記体液として、尿、好ましくはヒト尿が使用される。
本発明はまた、検査対象の体液サンプル中の肺がんに特異的な酵素活性を測定することによって対象における肺がんの有無を検出する、肺がんのインビトロ診断法にも関する。前記酵素活性の不在は肺がんの不在を示すが、前記酵素活性の存在は肺がんの存在を示す。
本発明はまた、検査対象の体液サンプル中の肺がんに特異的な酵素活性を測定することによって対象における肺がんの有無を検出する、肺がんのインビトロ診断法にも関する。前記酵素活性の不在は肺がんの不在を示すが、前記酵素活性の存在は肺がんの存在を示す。
【0018】
本発明による肺がんの検出／診断法において、酵素活性の検出は、上に定義された酵素活性の検出法によって実施される。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記酵素活性の測定は、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物を用いて実施される。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記酵素活性の測定は、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する化合物を用いて実施される。
【0019】
上記式中、Ｘ１は分子Ｃ１を含むか又は分子Ｃ１からなり、Ｘ２は分子Ｃ２を含むか又は分子Ｃ２からなり、
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する。
ここで、分子Ｃ１とＣ２の対（ペア）は、蛍光供与体と蛍光受容体の対であり、
前記化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメントＸ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する。
【0020】
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記体液サンプルは、好ましくは、中性又はアルカリ性のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨを有する測定緩衝液中で、サンプル対測定緩衝液の比率１：２～１：１０の範囲内、好ましくは１：５で、前記化合物とインキュベートされる。
【0021】
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記化合物は、好ましくは、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記化合物として、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記化合物として、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が使用される。
【0022】
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記サンプルとして、好ましくは、尿サンプル、さらに好ましくはヒト尿が使用される。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記酵素活性の測定は、好ましくは、３００～５００ｎｍ、さらに好ましくは３８０～４３０ｎｍの範囲内、特に４０５ｎｍの吸光強度を、４０～６０分間、２５～４０℃、さらに好ましくは３６～３８℃の範囲内の温度で測定することを含む。
本発明による肺がんの検出／診断法において、前記酵素活性の測定は、好ましくは、３００～５００ｎｍ、さらに好ましくは３８０～４３０ｎｍの範囲内、特に４０５ｎｍの吸光強度を、４０～６０分間、２５～４０℃、さらに好ましくは３６～３８℃の範囲内の温度で測定することを含む。
【0023】
本発明はさらに、上に定義された本発明による任意の化合物と測定緩衝液とを含むキットも提供する。
本発明によるキットにおいて、前記化合物は、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
本発明によるキットにおいて、前記化合物は、好ましくは、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
【0024】
本発明はまた、肺がんに特異的な酵素活性を検出するための、上に定義された本発明による任意の化合物の使用も提供する。
本発明はまた、肺がんの診断のための、上に定義された本発明による任意の化合物の使用も提供する。
本発明はまた、肺がんの診断のための、上に定義された本発明による任意の化合物の使用も提供する。
【0025】
好ましくは、そのような使用において、肺がんの診断は、原発性肺がんの検出、肺がんの外科的切除後の微小残存病変の検出、及び／又は肺がんの再発の検出を含む。
好ましくは、本発明による使用における化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
好ましくは、本発明による使用における化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
【0026】
本発明はさらに、肺がん検出のための診断マーカーとして使用するための、上に定義された本発明による任意の化合物を提供する。
好ましくは、本発明に従って診断マーカーとして使用するための化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
好ましくは、本発明に従って診断マーカーとして使用するための化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
【0027】
本発明はさらに、
ａ）肺がんに特異的な酵素活性の存在を、上に定義されたいずれかの方法によって検査対象の体液サンプル中に検出し、そして
ｂ）前記酵素活性の存在が前記サンプル中に見つかれば、肺がんの治療を対象に適用する、
肺がんの治療法も提供する。
ａ）肺がんに特異的な酵素活性の存在を、上に定義されたいずれかの方法によって検査対象の体液サンプル中に検出し、そして
ｂ）前記酵素活性の存在が前記サンプル中に見つかれば、肺がんの治療を対象に適用する、
肺がんの治療法も提供する。
【0028】
好ましくは、本発明による治療法において、ポイントｂ）に従って治療の終了後、肺がんに特異的な前記酵素活性が所定の時間間隔でモニターされる。
好ましくは、本発明による治療法において、尿サンプル、好ましくはヒト尿がサンプルとして使用される。
好ましくは、本発明による治療法において、尿サンプル、好ましくはヒト尿がサンプルとして使用される。
【0029】
好ましくは、本発明による治療法において、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物が前記化合物として使用される。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図2】図２は、肺がんと診断された被験者の尿サンプル（サンプル１～５０）と健常被験者から採取した尿（サンプル１Ｚ～２５Ｚ）における基質ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２の加水分解率を示す。アラビア数字は選択した尿サンプルの番号を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は添付の特許請求の範囲に定義されていることは理解されるべきである。本説明においては、本発明の様々な非制限的態様及び実施例を例示する。本発明は、特に明記されない限り、それを実施するために使用される何らかの特別な方法論、プロトコル又は試薬に限定されない。本明細書中で使用されている用語ならびに科学的及び技術的表現は、本発明の技術分野の当業者に通常知られている及び使用されている意味を有する。しかしながら、明確にするために、本特許において使用されている以下の表現／用語及び頭字語は、下記のように理解されるものとする。
【0032】
発色性化合物又は発色性分子は、発色特性を有する化合物を意味する。発色特性は、有色生成物を形成できる化合物の能力を意味する。
蛍光化合物又は蛍光分子は、蛍光特性を有する化合物を意味する。蛍光特性は、蛍光を発する生成物を形成できる化合物の能力を意味する。
蛍光化合物又は蛍光分子は、蛍光特性を有する化合物を意味する。蛍光特性は、蛍光を発する生成物を形成できる化合物の能力を意味する。
【0033】
ＮＭＰはＮ－メチルピロリドンを表す；ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表す；ＤＣＭは塩化メチレン又はジクロロメタンを表す；ｐＮＡは４－ニトロアニリン又はパラ－ニトロアニリンを表す；ＡＢＺは２－アミノ安息香酸を表し、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸を表す；Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基を表す；Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメトキシカルボニル基を表す；そしてＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表す。
【0034】
本発明の文脈において、肺がんという用語は、肺にある組織から発生する原発性肺がん（悪性新生物）を意味すると理解されるものとする。最も頻度が高い肺がんは非小細胞肺がん（約９０％）であり；それほど頻度が高くないのは小細胞肺がんである。本明細書中で使用されている肺がんという用語は、従って、肺内に位置する組織から発生するすべての悪性肺新生物を含む。
【0035】
本発明の文脈において、肺がんの診断という用語は、この疾患の識別、特に他の診断法が十分高感度でも及び／又は特異的でもない早期の段階での識別を意味すると理解されるものとする。本明細書においては、肺がんの診断は、肺がんの外科的切除後の微小残存病変（ＭＲＤ）の検出、及び以前に完了した肺がん治療後の肺がんの再発の検出も含む。
【0036】
本発明の文脈において、肺がんの治療という用語は、罹患者の生存時間を著しく延長し、生活の質を改善することを可能にする、疾患の進行の早期での治療を意味すると理解されるものとする。
【0037】
本発明の文脈において、モニターするという用語は、微小残存病変（ＭＲＤ）すなわち（治療中又は寛解中に）標準的な診断法では検出できない量で生体内に生き残った少数のがん細胞の存在を診断することを意味すると理解されるものとする。
【0038】
本発明の文脈において、対象（被験者）という用語は、肺がんが疑われるヒト対象又は哺乳動物、あるいは肺がんのリスクが高いグループに属するヒト対象又は哺乳動物、又は肺がんの切除後もしくは肺がんの治療終了後のヒト対象又は哺乳動物を意味すると理解されるものとする。対象は好ましくはヒト対象である。
【0039】
本発明による化合物は、発色団の存在による発色特性、及び蛍光特性を有する。すなわち蛍光供与体及び蛍光受容体の分子を含有する。特に肺がんを有する検査対象のテスト体液サンプルとの接触の結果として、色の増加が３８０～４４０ｎｍの波長範囲で観察されるようにする一方、そのような効果は健常対象又は別のタイプのがんと診断された対象の体液サンプルとの反応では観察されないように開発されたそれらの構造により、これらの化合物は、肺がんに特異的な酵素活性を検出し、特に特異的及び高感度に肺がんをこのがんの進行の早期でも診断することを可能にする。検査対象は好ましくはヒト対象である。体液は好ましくは尿、さらに好ましくはヒト尿である。
【0040】
本発明の第一の側面において、新規化合物を提供する。この化合物は、式１：
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する。式中、Ｘ１は、分子Ｃ１を含むアミノ酸誘導体又はペプチドフラグメントであるか又はＸ１はそのような分子Ｃ１からなり、Ｘ２は、分子Ｃ２を含むアミノ酸誘導体又はペプチドフラグメントであるか又はＸ２はそのような分子Ｃ２からなり、分子Ｃ１とＣ２の対は蛍光供与体と蛍光受容体の対である。上付き文字は、本発明による化合物中の後に続く残基の位置及び合成時の残基の結合順を示す。本発明によれば、本文脈において、化学式１は、代替的に残基の番号付けを示さずに表記することもできる。本発明によるすべての化合物のコアは、示された４個のアミノ酸配列（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ）を有するテトラペプチドである。これは配列表にも配列番号１として示されている。
Ｘ１１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－Ｘ２６（式１）
を有する。式中、Ｘ１は、分子Ｃ１を含むアミノ酸誘導体又はペプチドフラグメントであるか又はＸ１はそのような分子Ｃ１からなり、Ｘ２は、分子Ｃ２を含むアミノ酸誘導体又はペプチドフラグメントであるか又はＸ２はそのような分子Ｃ２からなり、分子Ｃ１とＣ２の対は蛍光供与体と蛍光受容体の対である。上付き文字は、本発明による化合物中の後に続く残基の位置及び合成時の残基の結合順を示す。本発明によれば、本文脈において、化学式１は、代替的に残基の番号付けを示さずに表記することもできる。本発明によるすべての化合物のコアは、示された４個のアミノ酸配列（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ）を有するテトラペプチドである。これは配列表にも配列番号１として示されている。
【0041】
本発明による化合物は、酵素的切断を受けて、フラグメント：Ｘ１－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）とＸ２（フラグメント２）になり、分子Ｃ１とＣ２の空間的分離により測定可能な光シグナルを生成する。測定可能な光シグナルは、化合物の酵素的切断後の吸光度／蛍光の変化を測定するための方法によって測定される。好ましくは、分子Ｃ１とＣ２は、１０個以下のアミノ酸残基によって互いに分離されることにより、蛍光受容体による蛍光供与体の効率的な消光が確保される。当業者には、鍵となる要因は蛍光供与体と受容体間の距離であることは明白である。従って、分子Ｃ１とＣ２を分離しているアミノ酸配列が折り畳まれてねじれた又は短縮した(condensed)二次構造になった結果、一次構造に比べて分子Ｃ１とＣ２が近接する場合、分子Ｃ１とＣ２間の距離は１０個を超えるアミノ酸残基でもよい。
【0042】
本化合物は、その発色特性と、より小さいフラグメントへの酵素的（好ましくはタンパク質分解的）切断を可能にする５位の反応部位の存在により、診断マーカー、特に肺がんの特異的診断バイオマーカーとして、特に肺がんの早期診断に使用するのに特に適している。
【0043】
好適な態様において、本発明による化合物は加水分解的切断、好ましくはタンパク質分解的切断を受ける。
好適な態様において、分子Ｃ１とＣ２の対は、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群から選ばれ、さらに好ましくは、分子Ｃ１とＣ２の対は、ＡＢＺ／ｐＮＡ又はＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２である。
好適な態様において、分子Ｃ１とＣ２の対は、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）、（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群から選ばれ、さらに好ましくは、分子Ｃ１とＣ２の対は、ＡＢＺ／ｐＮＡ又はＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２である。
【0044】
好適な態様において、本発明による化合物は、
式２：
ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２（式２）
を有する化合物であるか、又は
式３：
ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６（式３）
を有する化合物である。式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸を表し、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸を表し、ｐＮＡは４－ニトロアニリンを表す。
式２：
ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２（式２）
を有する化合物であるか、又は
式３：
ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６（式３）
を有する化合物である。式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸を表し、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸を表し、ｐＮＡは４－ニトロアニリンを表す。
【0045】
本化合物は加水分解的切断を受けて、式２を有する化合物の場合、下記のフラグメント１：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨとフラグメント２：ＡＮＢ－ＮＨ２を生成する。一方、式３を有する化合物の場合、下記のフラグメント１：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨとフラグメント２：ｐＮＡを生成する。従って、フラグメント２は遊離発色団である。
【0046】
本発明による化合物の酵素的切断の結果、分子Ｃ１とＣ２が空間的に分離すると、測定可能な光シグナルが生成する。なぜならば、蛍光供与体から放出された蛍光がもはや蛍光受容体によって消光されなくなるからである。そのような測定可能な光シグナルは、好ましくは３００～５００ｎｍ、さらに好ましくは３８０～４３０ｎｍの波長で検出できる。
【0047】
本発明による化合物は公知方法によって得ることができる。例えば、それらは、Ｆｍｏｃ基（反応の過程で除去される）を有する樹脂の形態の固体支持体上でプロセスを実行するという、発色性ペプチドを得るための方法を用いて得ることができる。例えば、それはアミド樹脂でありうる。例えば、Ｔｅｅｎａｇｅ Ｓ ＲＡＭ又はＲｉｎｋＡｍｉｄｅなどであるが、任意のその他の市販樹脂も使用できる。方法を実行するために使用される樹脂は、適切に調製されるべきである。樹脂の調製は、疎水性溶媒で繰り返し洗浄することによりその体積を増加させるというものである。好ましくは、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの付着量を有する樹脂を使用する。Ｆｍｏｃ保護基は、２０％溶媒溶液で洗浄することにより樹脂から除去されねばならない。
【0048】
次に、発色性ペプチドを得るための公知方法は、個々の成分を適切な時間及び化学量論条件で結合させることを含む。結合法は、個々の構成要素（アミノ酸誘導体）を結合させ、残基を洗い流し、保護基を順次除去して再度洗浄するという連続工程からなる。このサイクルをアミノ酸残基ごとに繰り返す。得られたペプチドを酸性条件下での反応により樹脂から分離する。次に、ろ過工程で溶液を樹脂から分離した後、得られた溶液からペプチドを非極性溶媒によって沈殿させる。このようにして得られたペプチド沈殿物を遠心分離する。
【0049】
本発明による化合物の例示的で詳細な、しかし非制限的な合成法を、以下と、以下の実施例１に記載する。
本発明による化合物の合成法は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する樹脂の形態の固体支持体上で方法を実行するというものである。方法を開始する前に、固体支持体を、疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレン又はＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄することによってその体積を増加させ、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレン又はＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄することによって除去することによって調製する。
本発明による化合物の合成法は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する樹脂の形態の固体支持体上で方法を実行するというものである。方法を開始する前に、固体支持体を、疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレン又はＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄することによってその体積を増加させ、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレン又はＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄することによって除去することによって調製する。
【0050】
次に、方法を次の工程で実施する。
ａ）樹脂上への５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）（又は特許請求の範囲に定義されている本発明に従って使用するのに適切な別の発色団）の付着の前に、固体支持体をＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＤＭＦ中３～６％溶液で洗浄し、次いでＤＭＦで洗浄した後、ＡＮＢのＤＭＦ中溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、そして最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を順に、ポリマー付着に対して以下の過剰量すなわち、ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡを３：３：２：６で加える。このようにして調製された混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合する。その後、樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールなどの溶媒で洗浄した後、樹脂へのＡＮＢの結合を、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いて続ける。終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで順に洗浄し、穏やかに乾燥させる。
ａ）樹脂上への５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）（又は特許請求の範囲に定義されている本発明に従って使用するのに適切な別の発色団）の付着の前に、固体支持体をＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）のＤＭＦ中３～６％溶液で洗浄し、次いでＤＭＦで洗浄した後、ＡＮＢのＤＭＦ中溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、そして最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を順に、ポリマー付着に対して以下の過剰量すなわち、ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡを３：３：２：６で加える。このようにして調製された混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合する。その後、樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールなどの溶媒で洗浄した後、樹脂へのＡＮＢの結合を、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いて続ける。終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで順に洗浄し、穏やかに乾燥させる。
【0051】
ｂ）ＡＮＢへのアミノ酸残基の結合は、アミノ酸誘導体すなわちＦｍｏｃ－Ａｒｇ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとの反応によって行われる。ここでは、樹脂に対して少なくとも５倍過剰のアミノ酸誘導体を無水ピリジン中に溶解し、ＡＮＢの付着した樹脂と接触させる。この後、全体を－２０℃を下回らない温度に冷却し、次いでＰＯＣｌ３を、使用されたアミノ酸誘導体の量に対して１：１の比率で添加し、全体を混合し、その後混合工程を室温で実施し、次に高めた温度で実施し、反応が完了したら樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ及びＭｅＯＨで洗浄し、穏やかに乾燥させた後、得られた中間化合物をアシル化工程に付し、引き続きＴｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅのフラグメントを結合させる。
【0052】
ｃ）得られた中間化合物のアシル化は、アミノ酸誘導体、好ましくは、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、続いてＦｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、次いでＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、そして合成の最終段階でＢｏｃ－Ａｂｚ－ＯＨを用いて実施される。アシル化は、カップリング剤としてジイソプロピルカルボジイミドを用い（過剰に使用される）、残基６から１へと段階的に実行される。各段階の終了後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、好ましくは、アミノ酸誘導体の結合をモニターするためのクロラニルテスト（遊離アミノ基の存在を調べるテスト）に付す。
【0053】
ｄ）Ｆｍｏｃ保護基の除去は、ＤＭＦ中１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄し、続いて各溶媒、すなわちＤＭＦ、イソプロパノール及び塩化メチレンで洗浄することによって実施される。
【0054】
ｅ）樹脂からのペプチドの分離は、混合物、すなわちＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳを、それぞれ８８：５：５：２ ｖ／ｖ／ｖ／ｖの比率に維持しながら用いて実施される。混合物を少なくとも１時間、好ましくは３時間撹拌し、得られた沈殿物を減圧下でろ過し、その後ジエチルエーテルで洗浄し、得られたペプチドを遠心分離する。
【0055】
ｆ）最終生成物の調製は、ペプチドを超音波によって水中に溶解し、次いで凍結乾燥に付すことによって実施される。
本発明の第二の側面において、対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性、好ましくはタンパク質分解活性を検出するためのインビトロ検出法を提供し、該方法は、ａ）体液サンプルを本発明による化合物と接触させ、そしてｂ）本発明による化合物中に存在する分子Ｃ１とＣ２の空間的分離によって生成する測定可能な光シグナルを検出することを含む。本側面の好適な態様において、この場合の検査対象はヒト対象である。本側面の別の好適な態様において、体液は尿、特にヒト尿である。
本発明の第二の側面において、対象の体液中に存在する、特に肺がん細胞由来の酵素活性、好ましくはタンパク質分解活性を検出するためのインビトロ検出法を提供し、該方法は、ａ）体液サンプルを本発明による化合物と接触させ、そしてｂ）本発明による化合物中に存在する分子Ｃ１とＣ２の空間的分離によって生成する測定可能な光シグナルを検出することを含む。本側面の好適な態様において、この場合の検査対象はヒト対象である。本側面の別の好適な態様において、体液は尿、特にヒト尿である。
【0056】
本側面の好適な態様において、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物が使用される。
【0057】
本発明の第三の側面において、肺がんのインビトロ診断法を提供する。これは、対象における肺がんの有無を、検査対象の体液サンプル中の肺がんに特異的な酵素活性を測定することによって検出するもので、前記酵素活性の不在は肺がんの不在を示すが、前記酵素活性の存在は肺がんの存在を示す。そのような酵素活性の検出は、好ましくは、上記の酵素活性を検出するための方法を用いて実施される。本側面の好適な態様において、対象はヒト対象である。本側面の好適な態様において、体液は尿、特にヒト尿である。本側面の好適な態様において、肺がんに特異的な酵素活性はタンパク質分解活性である。本側面の好適な態様において、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物が使用される。
【0058】
さらに、本側面の好適な態様において、本発明による方法における前記酵素活性の測定は、３００～５００ｎｍ、好ましくは３８０～４３０ｎｍの範囲内、特に４０５ｎｍの吸光強度を、４０～６０分間、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃の範囲内の温度で測定することを含む。これによって、吸光度又は蛍光の増加に起因する最大限強い測定可能な光シグナルを得ることが可能になる。
【0059】
さらに、本発明による前記方法の好適な態様において、前記酵素活性の測定は、本発明による化合物を、０．１～１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて実施される。本発明による前記方法の好適な態様において、試験サンプルは、中性又はアルカリ性のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨを有する測定緩衝液中で、本発明による化合物とインキュベートされる。体液サンプルは好ましくはヒト尿であり、サンプル（例えば尿サンプル）対測定緩衝液の比率は、１：２～１：１０の範囲、好ましくは１：５である。サンプルは、好ましくは、肺がんの診断を求めて照会された対象から採取する。好ましくは、吸光強度は、３００～５００ｎｍ、好ましくは３８０～４３０ｎｍの範囲内、特に４０５ｎｍで、４０～６０分間、２５～４０℃、好ましくは３６～３８℃の範囲内の温度で測定される。上記条件下で、最大限強い測定可能な光シグナルが、吸光度又は蛍光の増加の結果得られる。
【0060】
第四の側面において、本発明は、本発明によるいずれかの化合物と測定緩衝液とを含むキットを提供する。測定緩衝液は当該技術分野において公知であり、本発明によるキットに使用するのに適切な緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液であるが、これに限定されない。好適な態様において、本発明によるキットにおいては、前記化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
【0061】
第五の側面において、本発明は、肺がんに特異的な酵素活性を検出するための、本発明による化合物の使用を提供する。第六の側面において、本発明は、肺がんの診断のための、本発明による化合物の使用を提供する。好ましくは、肺がんの診断は、本発明に従って、原発性肺がんの検出、肺がんの外科的切除後の微小残存病変の検出、及び／又は以前に完了した肺がん治療後の肺がんの再発の検出を含む。
【0062】
第七の側面において、本発明は、肺がん検出のための診断マーカーとして使用するための、本発明による化合物を提供する。本側面の好適な態様において、前記化合物は、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２を有する化合物であるか、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物である。
【0063】
第八の側面において、本発明は、
ａ）肺がんに特異的な酵素活性の存在を、上に定義された本発明によるいずれかの方法によって検査対象の体液サンプル中に検出し、そして
ｂ）前記酵素活性が前記サンプル中に存在することが見つかった場合、肺がんの治療を対象に適用する、
肺がんの治療法を提供する。
ａ）肺がんに特異的な酵素活性の存在を、上に定義された本発明によるいずれかの方法によって検査対象の体液サンプル中に検出し、そして
ｂ）前記酵素活性が前記サンプル中に存在することが見つかった場合、肺がんの治療を対象に適用する、
肺がんの治療法を提供する。
【0064】
治療法の好適な態様において、ポイントｂ）に従って治療の完了後、肺がんの外科的切除後の微小残存病変又は再発を検出するために、肺がんに特異的な前記酵素活性を当該技術分野で公知のように所定の時間間隔、例えば、毎週、数週間おき、毎月、数ヶ月おき、毎年、又は当業者が適切と考える任意のその他の間隔でモニターする。さらに、本方法の好適な態様において、尿サンプル、好ましくはヒト尿が試験サンプルとして使用される。治療法の好適な態様において、式２：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２（式２）を有する化合物か、又は式３：ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（式３）を有する化合物が前記化合物として使用される。
【0065】
本発明の利点は、肺がんをその進行の早期段階で検出することを可能にしながら、肺がんに特異的な酵素活性の特異的で高感度の検出に使用するため、肺がん検出のための診断バイオマーカーとして使用するため、肺がんの迅速で非侵襲的な診断に使用するために適切な特性を有する新規化合物を提供することにある。別の利点は、本発明による診断法がスクリーニングテストにもうまく使用できることである。このことは、がんの進行の早期段階での完全な診断と、その結果としてより効果的な治療を可能にする。早期診断は患者の生存時間を著しく延長する外科治療を可能にする。また、微小残存病変又は再発があれば検出することが可能なため、適用された肺がんの外科治療及び／又は化学療法の有効性をモニターする場合にも重要である。
【0066】
次に、本発明を以下の図面及び以下の実施例で説明するが、これは特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲をいかなる様式でも制限することを意図したものではない。
【実施例】
【0067】
本発明を以下の非制限的実施例によって例示する。別段の指示がない限り、以下の実施例では、公知及び／又は市販の装置、方法、反応条件、反応物及びセットが使用されているが、これらは本発明が属する分野で一般的に使用されているものであり、また、それぞれの反応物及びキットの製造業者によって推奨されているものである。
【0068】
実施例１：本発明による化合物の合成
本実施例で、本発明による一つの代表的化合物、すなわち化合物：ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２の合成を提供する。本発明による残りのペプチドも同様に合成できる。上付き文字は、本発明による化合物中の後に続く残基の位置及び合成時の残基の結合順を示す。本発明による化合物は、代替的に残基の位置を示さない類似式によって表記することもできる。これによって本発明による化合物中の残基の配列が変更されることはなく、それは不変のままである。
本実施例で、本発明による一つの代表的化合物、すなわち化合物：ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２の合成を提供する。本発明による残りのペプチドも同様に合成できる。上付き文字は、本発明による化合物中の後に続く残基の位置及び合成時の残基の結合順を示す。本発明による化合物は、代替的に残基の位置を示さない類似式によって表記することもできる。これによって本発明による化合物中の残基の配列が変更されることはなく、それは不変のままである。
【0069】
１．発色性ペプチドを得る
ａ）合成の第一段階は発色性ペプチドを得ることであった。これは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用い、すなわち保護を用いて固体支持体上での固相合成により得られた。
ａ）合成の第一段階は発色性ペプチドを得ることであった。これは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用い、すなわち保護を用いて固体支持体上での固相合成により得られた。
【0070】
配列ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２を有する化合物［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－安息香酸のアミドであり、ＡＮＢは５－アミノ－２－安息香酸である］を、下記のアミノ酸誘導体：Ｂｏｃ－ＡＢＺ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢＵ）、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を用い、固相化学合成の方法で得た。
【0071】
本発明による化合物、すなわち肺がん検出のための診断マーカーの合成は、５－アミノ－２－安息香酸からＡＮＢ－ＮＨ２アミドへの変換を可能にする固体支持体、すなわちＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（独）社製アミド樹脂ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（０．２３ｍｍｏｌ／ｇの付着量を有する）上で行われた。しかしながら、任意のその他のアミド樹脂、例えばＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ（独）を使用することも可能である。
【0072】
化合物の合成は、実験室のシェーカーを用いて手動で行われた。大部分の工程で固相合成用の２５ｍＬ焼結シリンジを反応器として使用した。
得られたすべての最終化合物は、それらの配列の第１位すなわちＮ末端に２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）を、第６位すなわちＣ末端に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）分子を含有していた。ＡＢＺはここでは蛍光供与体として作用するが、ＡＮＢ（５－アミノ－２－安息香酸）は蛍光消光剤として、及び同時に発色団として作用する。
得られたすべての最終化合物は、それらの配列の第１位すなわちＮ末端に２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）を、第６位すなわちＣ末端に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸（ＡＮＢ）分子を含有していた。ＡＢＺはここでは蛍光供与体として作用するが、ＡＮＢ（５－アミノ－２－安息香酸）は蛍光消光剤として、及び同時に発色団として作用する。
【0073】
ペプチドは、それらの配列中（アミノ酸残基Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２の間に位置する、すなわち化合物の５位）に少なくとも及び好ましくは一つの反応部位を含有していた。アミノ酸誘導体を結合させる合成は残基６から１へ、すなわちＣ末端からＮ末端へと行われる。
【0074】
ｂ）ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂へのＡＮＢの付着：
ペプチドの合成は、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの付着量を有するＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社製ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上で実施された。第一の工程で樹脂を調製した（洗浄サイクルによって樹脂を緩ませることも含む）。その後、Ｆｍｏｃアミノ基の保護をＮＭＰ中２０％ピペリジン溶液で固体支持体から除去した。次いで溶媒洗浄サイクルを実施した。遊離アミノ基の存在を確認するためにクロラニルテストを実施した。
ペプチドの合成は、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの付着量を有するＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社製ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上で実施された。第一の工程で樹脂を調製した（洗浄サイクルによって樹脂を緩ませることも含む）。その後、Ｆｍｏｃアミノ基の保護をＮＭＰ中２０％ピペリジン溶液で固体支持体から除去した。次いで溶媒洗浄サイクルを実施した。遊離アミノ基の存在を確認するためにクロラニルテストを実施した。
【0075】
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ １ｘ１０分；ＩｓＯＨ １ｘ１０分；ＤＣＭ １ｘ１０分
Ｆｍｏｃ保護基の除去：
ＤＭＦ １ｘ５分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
ｃ）クロラニルテスト：
クロラニルテストは、スパチュラで数粒の樹脂を反応器（シリンジ）からガラスアンプルへ移し、その後、トルエン中ｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬと新鮮アセトアルデヒド５０μＬをそれに加えるというものであった。１０分後、粒子の色の制御を行った。
ＤＭＦ １ｘ１０分；ＩｓＯＨ １ｘ１０分；ＤＣＭ １ｘ１０分
Ｆｍｏｃ保護基の除去：
ＤＭＦ １ｘ５分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
ｃ）クロラニルテスト：
クロラニルテストは、スパチュラで数粒の樹脂を反応器（シリンジ）からガラスアンプルへ移し、その後、トルエン中ｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬと新鮮アセトアルデヒド５０μＬをそれに加えるというものであった。１０分後、粒子の色の制御を行った。
【0076】
この段階で（テストの実施後）、緑色の粒子が得られた。これは遊離アミノ基が存在する証拠である。樹脂から９－フルオレニルメトキシカルボニル保護基の除去を確認後、次の工程すなわちＡＮＢ誘導体（５－アミノ－２－ニトロ安息香酸）の結合に進むことが可能となった。
【0077】
ｄ）固体支持体への５－アミノ－２－ニトロ安息香酸の付着
ペプチドライブラリー（ペプチドの混合物）の合成における第一工程は、１ｇの樹脂上へのＡＮＢの付着であった。発色団の結合の前に、反応に使用される樹脂を下記溶媒、すなわちＤＭＦ、ＤＣＭ、そして再度ＤＭＦで洗浄し、その後Ｆｍｏｃ保護基を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護基除去の１サイクルは下記工程を含んでいた。
ペプチドライブラリー（ペプチドの混合物）の合成における第一工程は、１ｇの樹脂上へのＡＮＢの付着であった。発色団の結合の前に、反応に使用される樹脂を下記溶媒、すなわちＤＭＦ、ＤＣＭ、そして再度ＤＭＦで洗浄し、その後Ｆｍｏｃ保護基を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護基除去の１サイクルは下記工程を含んでいた。
【0078】
Ｆｍｏｃ保護基の除去：
ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
ｅ）洗浄：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
ｆ）クロラニルテスト
遊離アミノ基を有する樹脂を、ＤＭＦ中Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の５％溶液で洗浄し、次いでＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の除去手順と洗浄サイクルはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ容器中で実施した。別のフラスコでＡＮＢをＤＭＦ中に溶解し、続いてＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ及び最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー付着に対して下記の過剰量、すなわち、ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡを３：３：２：６ ｖ／ｖ／ｖ／ｖで加えた。このようにして調製された混合物を樹脂に加え、３時間撹拌した。樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで洗浄し、全アシル化手順を２回繰り返した。樹脂へのＡＮＢの次の結合反応を実施するために、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を使用した。最後の工程で、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで順に洗浄し、風乾した。
ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
ｅ）洗浄：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
ｆ）クロラニルテスト
遊離アミノ基を有する樹脂を、ＤＭＦ中Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の５％溶液で洗浄し、次いでＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の除去手順と洗浄サイクルはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ容器中で実施した。別のフラスコでＡＮＢをＤＭＦ中に溶解し、続いてＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ及び最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー付着に対して下記の過剰量、すなわち、ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡを３：３：２：６ ｖ／ｖ／ｖ／ｖで加えた。このようにして調製された混合物を樹脂に加え、３時間撹拌した。樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで洗浄し、全アシル化手順を２回繰り返した。樹脂へのＡＮＢの次の結合反応を実施するために、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を使用した。最後の工程で、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ及びイソプロパノールで順に洗浄し、風乾した。
【0079】
ｇ）ＡＮＢへのＣ末端アミノ酸残基（Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ＯｔＢｕ））の結合
対応するアミノ酸誘導体（樹脂付着に対して９倍モル過剰）をピリジン中に溶解し、ＡＮＢ付着樹脂を含有するフラスコに移した。温度が－１５℃に達するまで全体を冷却した（氷浴：１重量部のＮＨ４Ｃｌ、１重量部のＮａＮＯ３、１重量部の氷）。所望温度に達したら、ＰＯＣｌ３を加え（アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比率）、全体を磁気撹拌器上で、－１５℃で２０分間、室温で３０分間、そして４０℃（油浴）で６時間撹拌した。反応が完了したら、樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ及びＭｅＯＨで洗浄し、放置乾燥した。
対応するアミノ酸誘導体（樹脂付着に対して９倍モル過剰）をピリジン中に溶解し、ＡＮＢ付着樹脂を含有するフラスコに移した。温度が－１５℃に達するまで全体を冷却した（氷浴：１重量部のＮＨ４Ｃｌ、１重量部のＮａＮＯ３、１重量部の氷）。所望温度に達したら、ＰＯＣｌ３を加え（アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比率）、全体を磁気撹拌器上で、－１５℃で２０分間、室温で３０分間、そして４０℃（油浴）で６時間撹拌した。反応が完了したら、樹脂を減圧下でろ過し、ＤＭＦ及びＭｅＯＨで洗浄し、放置乾燥した。
【0080】
次の段階で、残基をＰ２位に結合させた（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ）。
アミノ酸残基の結合ごとにまず樹脂をＤＭＦで５分間洗浄した。ジイソプロピルカルボジイミドを後続の結合のカップリング剤として使用した。手順を２回繰り返した。
アミノ酸残基の結合ごとにまず樹脂をＤＭＦで５分間洗浄した。ジイソプロピルカルボジイミドを後続の結合のカップリング剤として使用した。手順を２回繰り返した。
【0081】
各アシル化の後、樹脂洗浄サイクルを開始し、次いでクロラニルテストを実施して、樹脂の遊離アミノ酸基へのアミノ酸誘導体の結合をモニターした。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
最初の二つのカップリング手順後、テストを実施した結果、粒子の色は初め緑色、その後灰色であったので、別のアシル化を実施する必要があった。その結果、クロラニルテストで試験した樹脂粒子は無色となった。これは、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂にＡＮＢが結合した証拠であるので、次のペプチド合成工程に進むことが可能となった。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
最初の二つのカップリング手順後、テストを実施した結果、粒子の色は初め緑色、その後灰色であったので、別のアシル化を実施する必要があった。その結果、クロラニルテストで試験した樹脂粒子は無色となった。これは、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂にＡＮＢが結合した証拠であるので、次のペプチド合成工程に進むことが可能となった。
【0082】
ｈ）後続の保護アミノ酸残基の結合：
反応器内の樹脂と結合フラグメントＡＮＢ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を共にＤＭＦで洗浄した後、保護アミノ酸誘導体Ｐｈｅを結合させるために、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護した。
反応器内の樹脂と結合フラグメントＡＮＢ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を共にＤＭＦで洗浄した後、保護アミノ酸誘導体Ｐｈｅを結合させるために、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護した。
【0083】
Ｆｍｏｃ保護基の除去：
ＤＭＦ １ｘ５分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
クロラニルテストは、樹脂粒子の緑色から明らかなように、良好な結果であったため、次の工程、すなわちアミノ酸残基Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨの結合に進むことが可能になった。
ＤＭＦ １ｘ５分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ３分；ＮＭＰ中２０％ピペリジン １ｘ８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
クロラニルテストは、樹脂粒子の緑色から明らかなように、良好な結果であったため、次の工程、すなわちアミノ酸残基Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨの結合に進むことが可能になった。
【0084】
アミノ酸誘導体の結合
カップリング工程の前に樹脂をＤＭＦで洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護セリン残基を結合する場合も不変のままであった。
カップリング工程の前に樹脂をＤＭＦで洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護セリン残基を結合する場合も不変のままであった。
【0085】
各アシル化の終了後、溶媒洗浄サイクルを特定手順に従って実施し、次いで溶液中の遊離アミノ酸基の存在を調べるクロラニルテストを実施した。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
２回目のアシル化後に実施したテスト中、樹脂粒子は無色であったので、合成の次の工程、すなわち別の保護アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ））と２－アミノ安息香酸分子の導入に進むことが可能であった。カップリング工程は先に論じた手順に従って実施した。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３ｘ２分；ＩｓＯＨ ３ｘ２分；ＤＣＭ ３ｘ２分
クロラニルテスト：
２回目のアシル化後に実施したテスト中、樹脂粒子は無色であったので、合成の次の工程、すなわち別の保護アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ））と２－アミノ安息香酸分子の導入に進むことが可能であった。カップリング工程は先に論じた手順に従って実施した。
【0086】
前述の残基の結合後に実施したテストは良好な結果を示した。すなわち樹脂粒子は無色であった。
２．固体支持体からのペプチドの取り出し
合成後、ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ペプチドのアミドを固体支持体から取り出し、同時に側鎖保護基を、磁気撹拌器上の丸底フラスコ内で、混合物、すなわちＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて除去した。
２．固体支持体からのペプチドの取り出し
合成後、ＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ペプチドのアミドを固体支持体から取り出し、同時に側鎖保護基を、磁気撹拌器上の丸底フラスコ内で、混合物、すなわちＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて除去した。
【0087】
３時間後、フラスコの内容物を焼結（Ｓｃｈｏｔｔ）漏斗で減圧ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈降物をＳＩＧＭＡ ２Ｋ３０遠心機（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ）で２０分間遠心分離した。遠心分離後に得られた沈殿物を超音波により水中に溶解し、次いで凍結乾燥に付した。本発明による残りの化合物も同様にして得ることができる。
【0088】
本発明による新規化合物の同定／特徴付けはＨＰＬＣ分析を用いて確認した。ＨＰＬＣ分析の条件は次の通りであった。ＲＰ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８カラム、２５０ｍｍ ４ｍｍ、相系Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ａ中８０％アセトニトリル、流速１ｍＬ／分、ＵＶ検出：２２６ｎｍ。
【0089】
実施された分析により、本発明による化合物が得られたことが確認された。
実施例２：がんマーカーとしての本発明によるペプチドの特性のテスト
本発明による新規化合物の活性を、肺がんと診断された２０人の被験者群で、本発明による代表的化合物を用いて調べた。本発明による化合物（式２を有する代表的化合物を含む）の作用機序は、式２を有する化合物の場合、ＡＮＢ－ＮＨ２（５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミド）又は式３を有する化合物の場合、ｐＮＡ（パラ－ニトロアニリン）という各発色団の遊離分子の放出をもたらす位置で起こる特定の酵素的切断、さらに詳しくは酵素的加水分解であり、これらは３２０～４８０ｎｍ、とりわけ３８０～４３０ｎｍ、特に４０５ｎｍの波長で吸光度を示す。本発明による残りの化合物も同様の作用機序を特徴とする。この目的のために、本発明による代表的化合物、ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２をジメチルスルホキシドに溶解し（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で）、この溶液５０μＬを１２０μＬの緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）及び肺がんを患う被験者の尿８０μＬと混合した。測定は、吸光度の測定用に設計された９６ウェルプレート上で実施され、各サンプルは３７℃の温度で３回分析された。測定時間は６０分であった。測定中、放出される発色団（ＡＮＢ－ＮＨ２）に特徴的な波長を波長４０５ｎｍ（範囲３８０～４３０ｎｍ）でモニターした。
実施例２：がんマーカーとしての本発明によるペプチドの特性のテスト
本発明による新規化合物の活性を、肺がんと診断された２０人の被験者群で、本発明による代表的化合物を用いて調べた。本発明による化合物（式２を有する代表的化合物を含む）の作用機序は、式２を有する化合物の場合、ＡＮＢ－ＮＨ２（５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミド）又は式３を有する化合物の場合、ｐＮＡ（パラ－ニトロアニリン）という各発色団の遊離分子の放出をもたらす位置で起こる特定の酵素的切断、さらに詳しくは酵素的加水分解であり、これらは３２０～４８０ｎｍ、とりわけ３８０～４３０ｎｍ、特に４０５ｎｍの波長で吸光度を示す。本発明による残りの化合物も同様の作用機序を特徴とする。この目的のために、本発明による代表的化合物、ＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２をジメチルスルホキシドに溶解し（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で）、この溶液５０μＬを１２０μＬの緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）及び肺がんを患う被験者の尿８０μＬと混合した。測定は、吸光度の測定用に設計された９６ウェルプレート上で実施され、各サンプルは３７℃の温度で３回分析された。測定時間は６０分であった。測定中、放出される発色団（ＡＮＢ－ＮＨ２）に特徴的な波長を波長４０５ｎｍ（範囲３８０～４３０ｎｍ）でモニターした。
【0090】
図１に示されているように、肺がんと診断された人から採取された尿を含む無作為選択系のＲＰ ＨＰＬＣ分析によれば、本発明による化合物は、ペプチドフラグメントＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＯＨと化合物の発色団基（ＡＮＢ－ＮＨ２）に切断されたことを示している。
【0091】
測定によれば、溶液の色強度は、肺がんと診断された人から採取されたすべての尿サンプルで時間と共に増加したことが示された。観察された、吸光度の経時的増加の規模は、検査サンプルごとに異なる。健常被験者から採取した２０個のサンプルについては、試験した２０個の尿サンプルのいずれにおいても診断範囲内で吸光度の増加が観察されなかったため、異なる結果が得られた。
【0092】
実施された試験によれば、肺がん患者の全サンプル１～５０とも切断を受けたが、サンプル７と１６の場合、基質すなわちＡＢＺ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２の切断はサンプル５０又は４２の場合より効率悪く進行したことが示されている（図２）。このような結果は、酵素的切断（タンパク質分解）を担う酵素の活性ならびに量の差によるものであろう。さらに、以下の表１に示されている結果は、基質溶液（本発明による化合物）を、健常者（がんと診断されていない、順に１Ｚ～２５Ｚのアラビア数字でマーク）から採取した尿サンプルとインキュベートしても吸光度は増加しない、従って試験化合物の加水分解は起こらないことを示している。この結果は、肺がんに特異的／特徴的なタンパク質分解酵素が存在していないことを示すものである。
【0093】
表１．吸光度分析の結果
【0094】
【表1-1】
【0095】
【表1-2】
【0096】
【表1-3】
【0097】
さらに、基質すなわち本発明による化合物の切断選択性が、検査されるがんに依存していることについても調べた。実施された試験の結果を図３に示す。それによれば、下記のがん、すなわち、精巣、腸、腎臓、前立腺、膵臓、胆管、肺、卵巣、及び直腸のがんと診断された患者から採取したサンプルとインキュベートされた試験基質すなわちＡＢＺ１－Ｔｙｒ２－Ｉｌｅ３－Ｐｈｅ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ６－ＮＨ２は切断を受けず、特定範囲内で吸光度の増加も起こさないことが示されている。試験サンプルは、いずれの場合も、調べたそれぞれのがんから得られた２０個のサンプルの混合物であった。このことは、本発明による化合物の切断選択性を示すものであり、当該化合物を肺がんに特異的な酵素活性の特異的検出及び肺がんの特異的診断に適切なものにしている。
【0098】
以下の表２に、各サンプルについて得られた３回の測定結果を示す。
表２．切断選択性の分析結果
表２．切断選択性の分析結果
【0099】
【表2】
【0100】
さらに、本発明による代表的化合物のタンパク質分解活性の、反応ｐＨへの依存性についての測定も実施した。実験によれば、研究材料はアルカリ性ｐＨで最大活性を示す少なくとも一つの酵素を有していることが示された（図４）。
【0101】
実施された分析から、本発明による化合物が、肺がんに特異的な酵素活性の高感度で特異的な検出に適切であること、同様に肺がんの特異的診断にも適切であること、そして肺がんの診断マーカーとしても適切であることが確認された。本発明による化合物の作用機序は、遊離発色団分子の放出をもたらす位置でのそれらの特異的酵素切断にあり、それによって、診断目的、特に本発明による肺がんの診断に使用できる測定可能な光シグナルが発生する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】