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特表2024-543709腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-21
(54)【発明の名称】腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4375 20060101AFI20241114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241114BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20241114BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4375
A61P35/00
A61K31/395
A61P43/00 121
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537031
(86)(22)【出願日】2022-11-21
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 CN2022133165
(87)【国際公開番号】W WO2023116304
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】202111599362.3
(32)【優先日】2021-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523266350
【氏名又は名称】ニューロドーン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジャン、ジェンピン
(72)【発明者】
【氏名】リ、フーロン
(72)【発明者】
【氏名】ワン、レイ
(72)【発明者】
【氏名】チェン、ロン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、ウェイドン
(72)【発明者】
【氏名】ファン、ファン
(72)【発明者】
【氏名】アン、ウェンジー
(72)【発明者】
【氏名】ホア、ヤオ
(72)【発明者】
【氏名】フェン、リン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB05
4C086CB09
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の応用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍を治療するための医薬品の調製における下記の式Ｉで表される１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用。【化1】
（ここで、Ｒ１又はＲ２は、水素、ハロゲン、又はＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ３は、その任意の－ＣＨ２－が１つ又は２つ以上の－Ｏ－で置換されてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ４は、水素、又はハロゲンである。）
【請求項2】
腫瘍を治療するための医薬品の調製における下記の化合物１～６から選択されたいずれか一つの１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用。Ｓ１で示される化合物１：
【化2】
Ｓ２で示される化合物２：
【化3】
Ｓ３で示される化合物３：
【化4】
Ｓ４で示される化合物４：
【化5】
Ｓ５で示される化合物５：
【化6】
Ｓ６で示される化合物６：
【化7】
。
【請求項3】
固形腫瘍の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
神経系腫瘍の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項5】
脳腫瘍の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項6】
神経膠腫の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項7】
膠芽腫の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項8】
肝臓癌、結腸癌、胃癌の治療における前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項9】
神経膠腫を治療するために前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体をテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）と併用することを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項10】
神経膠腫を治療するために前記１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体を放射線療法と併用することを特徴とする、請求項２に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２１年１２月２４日中国特許庁に出願され、出願番号２０２１１１５９９３６２．３、発明の名称「腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は援用により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月２４日中国特許庁に出願され、出願番号２０２１１１５９９３６２．３、発明の名称「腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は援用により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、製薬分野に属し、１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の新たな用途、より具体的には、抗腫瘍薬の製造における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の応用に関する。前記腫瘍は、神経系腫瘍及び非神経系腫瘍を含む固形腫瘍である。前記神経系腫瘍としては膠芽腫、神経芽細胞腫などが挙げられる。前記非神経系腫瘍としては肝臓癌、結腸癌、胃癌などが挙げられる。
【背景技術】
【0003】
膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，ＧＢＭ）は最も一般的な悪性原発性頭蓋内腫瘍であり、神経膠腫の約５７％、原発性中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）悪性腫瘍の４８％（Ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１８．２０：ｐ．ｉｖ１－ｉｖ８６）を占める。膠芽腫による死亡率は非常に高い。米国では２０００年から２０１４年までの膠芽腫患者は１年生存率が４１．４％、５年生存率がわずか５．８％（ＣＡ：ａ ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，２０２０．７０（４）：ｐ．２９９－３１２）であった。膠芽腫の病因に関しては、電離放射線だけが可能な発症原因として分かれ、まだほとんど解明されていないところである。これは、膠芽腫の予防及び治療に一定の困難をもたらす。
【0004】
悪性度によれば、神経膠腫はグレードＩ～IＶに分類される。その中で、グレードＩ、ＩＩは悪性度がより低い神経膠腫であり、グレードＩＩＩ、ＩＶは悪性度がより高い神経膠腫である。膠芽腫の治療法には主に外科的切除、放射線療法、全身療法（化学療法、標的療法）があり、その中で術後のテモゾロミド放射線療法と補助化学療法の同時併用は、新たに診断された膠芽腫の標準治療計画となっている。現在の主な化学療法薬には、テモゾロミドに加えて、ニトロソウレア類、プロカルバジン、プラチナ類、ビンブラスチン類及びカンプトテシン類などが含まれる。しかしながら、従来の化学療法薬の抗腫瘍作用機序は現在の臨床ニーズを満たすことができない。
【0005】
真核細胞において、マクロピノサイトーシスは、細胞外物質が細胞内へ取り込まれ、かつ分子が溶解するための重要な経路である。マクロピノサイトーシスのプロセスは腫瘍細胞に対して二重の影響を及ぼす。栄養が不足した場合には、腫瘍細胞はマクロピノサイトーシス経路を通じて細胞外栄養物質を内部に取り込むことにより腫瘍細胞の増殖が促進されるが、薬剤処理やＲＡＳ遺伝子の異常発現によりマクロピノサイトーシスプロセスが過剰的に活性化された場合には、新しい死様式としてメチューシス（Ｍｅｔｈｕｏｓｉｓ）が誘発される可能性がある。メチューシスは、プロテアーゼ非依存性の新しい細胞死様式であり、細胞質がマクロピノサイトソームに由来する多数の空胞で満たされていることを主に特徴とする。この死様式は膠芽腫細胞で最初に発見された（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９．１８（１３）：ｐ．２２８１－９０）。さらなる研究により、この死様式はクラスリンに依存しないマクロピノサイトソームの変化によって引き起こされ、最終的に多数の空胞を形成し、細胞の破裂及び死を引き起こすことが発見された（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２．５５（５）：ｐ．１９４０－５６）。現在の研究によると、Ｒａｓ、Ｒａｃ１、Ａｒｆ６、Ｒａｂ７などを含む様々な分子がマクロピノサイトソームの形成に関与していることが発見された（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４．１８４（６）：ｐ．１６３０－４２）。Ｒａｃ１はアクチンの集合を調節することでマクロピノサイトソームの形成に影響を及ぼす可能性がある。また、Ｒａｃ１の活性化により、ＧＩＴ－１を介して活性化されたＡｒｆ６が減少し、さらにマクロピノサイトソームの循環が妨げられる可能性がある（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＭＣＲ，２０１０．８（１０）：ｐ．１３５８－７４）。また、近年、メタンフェタミン、インドリルカルコン、バキノール－１、ＭＯＭＩＰＰ、ＣＸ－５０１１などを含むいくつかの小分子化合物が、ＭＫＫ４、ＪＮＫ、Ｒａｃ１などの機序を活性化することによって細胞のメチューシスが誘発されることは続々と発見されていた（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６，７，５５８６３－５５８８９；ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ ２０１９，１９，７７；ＢＢＡ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０２０，１１８８０７）。
【0006】
１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体は、アセチルコリンエステラーゼの活性を阻害できるだけでなく、細胞外カルシウムイオンがカルシウムチャネルを通じて細胞内へ流入することを遮断することもできる化合物である。１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体はコリンエステラーゼの活性を阻害することで、アセチルコリンの加水分解速度が遅くなり、シナプス間隙におけるアセチルコリンレベルが向上し、アルツハイマー病や血管性認知症の治療が図れる（特許番号ＣＮ１０４２０３９４５Ｂ、特開番号ＣＮ１０６６３２３１７Ａ）。また、カルシウムイオンの流入を抑制することにより、虚血への神経細胞の耐性の改善、脳血管の拡張、脳血液供給の改善、ニューロンの保護が図れ、また血管性認知症の患者の認知機能の改善に有効である。
【発明の概要】
【0007】
１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体は、アセチルコリンエステラーゼの活性を阻害できるだけでなく、細胞外カルシウムイオンがカルシウムチャネルを通じて細胞内へ流入することを遮断することもできる化合物であり、アルツハイマー病や血管性認知症の治療に使用できる。これらの化合物は、コリンエステラーゼ阻害やカルシウムチャネル遮断に依存しない新しい作用機序により腫瘍細胞のメチューシスを誘発し、抗腫瘍の作用を発揮することができる。
【0008】
本発明の目的は、新しい機序により腫瘍を治療し、患者の生存期間を効果的に延長できる１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供することである。
【0009】
具体的には、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における、式Ｉで表される１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
ここで、Ｒ１又はＲ２は、水素、ハロゲン又はＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ３は、任意の－ＣＨ２－が１つ又は２つ以上の－Ｏ－で置換されてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ４は、水素又はハロゲンである。
【化1】
ここで、Ｒ１又はＲ２は、水素、ハロゲン又はＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ３は、任意の－ＣＨ２－が１つ又は２つ以上の－Ｏ－で置換されてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
Ｒ４は、水素又はハロゲンである。
【0010】
具体的には、前記誘導体は、以下の化合物１～６から選択される。
Ｓ１で示される化合物１：
Ｓ２で示される化合物２：
Ｓ３で示される化合物３：
Ｓ４で示される化合物４：
Ｓ５で示される化合物５：
Ｓ６で示される化合物６：
。
Ｓ１で示される化合物１：
【化2】
Ｓ２で示される化合物２：
【化3】
Ｓ３で示される化合物３：
【化4】
Ｓ４で示される化合物４：
【化5】
Ｓ５で示される化合物５：
【化6】
Ｓ６で示される化合物６：
【化7】
。
【0011】
上記薬剤は、腫瘍細胞のメチューシスを誘発して空胞化の細胞表現型を現せ、また腫瘍細胞の増殖を阻害して腫瘍の成長を阻害するという役割を果たし、それにより最終的に腫瘍を治療する目的が達成される。
【0012】
そこで、本発明は、抗腫瘍薬の製造における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体又はその薬学的に許容される塩ならびにその医薬組成物の新たな使用を提供する。
【0013】
前記腫瘍は、神経系腫瘍及び非神経系腫瘍を含む固形腫瘍である。前記神経系腫瘍としては膠芽腫、神経芽細胞腫などが挙げられる。前記非神経系腫瘍としては肝臓癌、結腸癌、胃癌などが挙げられる。
【0014】
具体的には、本発明は、固形腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0015】
本発明は、神経系腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0016】
本発明は、脳腫瘍の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0017】
また、本発明は、神経膠腫の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0018】
また、本発明は、膠芽腫の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0019】
また、本発明は、肝臓癌、結腸癌、胃癌の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の使用を提供する。
【0020】
また、本発明は、神経膠腫の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体とテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）との組み合わせの使用を提供する。
【0021】
また、本発明は、神経膠腫の治療における１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体と放射線療法との組み合わせの使用を提供する。
【0022】
本発明の利点及びプラスの効果：
本発明で提供される腫瘍治療のための新規薬剤としての１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体は、腫瘍細胞のメチューシスを特異的に誘発する薬剤であり、正常細胞への影響が少なく、腫瘍治療のための安全かつ効果的な薬剤の開発に有利である。
本発明で提供される腫瘍治療のための新規薬剤としての１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体は、腫瘍細胞のメチューシスを特異的に誘発する薬剤であり、正常細胞への影響が少なく、腫瘍治療のための安全かつ効果的な薬剤の開発に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下の実施例は本発明を例示的に説明するものであり、本発明を限定するものと解釈されないように理解されたい。
【0025】
実施例１ 膠芽腫細胞に対する１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の空胞化誘発作用及び増殖阻害作用に関する研究
１．材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇ細胞は南京科佰生物科技有限公司（ＣＯＢＩＯＥＲ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤ）から購入された。
１．材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇ細胞は南京科佰生物科技有限公司（ＣＯＢＩＯＥＲ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤ）から購入された。
【0026】
１．２ １，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体の番号及び構造
【表1】
【0027】
１．３ 化合物溶液の調製
被験対象化合物を一定量秤量し、ＤＭＳＯで溶解し、最終濃度１００ｍＭの均一溶液を作製した。
被験対象化合物を一定量秤量し、ＤＭＳＯで溶解し、最終濃度１００ｍＭの均一溶液を作製した。
【0028】
１．４ 試薬及び消耗品
【表2】
【0029】
１．５ 細胞培養及び細胞表現型の観察
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を培地に再懸濁し、１２ウェルプレートに各ウェル１ｍＬで一定の密度で接種した。２４時間培養し、上記で調製した化合物溶液を、培養系中の化合物濃度がそれぞれ５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭとなるように、群分けの状況に応じて各ウェルにそれぞれ加えた。対照ウェルとして等体積のＤＭＳＯを加えた。
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を培地に再懸濁し、１２ウェルプレートに各ウェル１ｍＬで一定の密度で接種した。２４時間培養し、上記で調製した化合物溶液を、培養系中の化合物濃度がそれぞれ５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭとなるように、群分けの状況に応じて各ウェルにそれぞれ加えた。対照ウェルとして等体積のＤＭＳＯを加えた。
【0030】
薬剤添加して６時間処理した後、顕微鏡２０×対物レンズで観察し、各ウェルについて５つの視野をランダムに選択して写真を撮影して記録した。観察された視野において、細胞内に境界がはっきりした明るい空胞が現れ、かつ１）直径が３μＭを超えた空胞を少なくとも１つ含むこと、及び２）直径が０．５～３μＭの範囲内である空胞を３つ以上含むことという２つの条件のうちの任意の一つを少なくとも満たした場合は、メチューシス陽性細胞と認められる。
【0031】
空胞化率Ｒ（％）＝ＣＥＬＬ陽性／（ＣＥＬＬ正常＋ＣＥＬＬ陽性）×１００％
ここで、ＣＥＬＬ陽性はメチューシス陽性細胞の数を表し、ＣＥＬＬ正常は正常な形態の細胞の数を表す。
ここで、ＣＥＬＬ陽性はメチューシス陽性細胞の数を表し、ＣＥＬＬ正常は正常な形態の細胞の数を表す。
【0032】
１．６ 細胞増殖阻害の検出
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を再懸濁し、所定の密度で９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養し、培養系の最終濃度が０．４１μＭ、１．２３μＭ、３．７μＭ、１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭになるように７２時間薬剤添加処理を行った後、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットを使用して細胞生存率を検出した。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットの説明書に従って１００μＬ／ウェル試薬を加え、１０分間振盪し、多機能プレートリーダーで化学発光値（ＬＵＭ）を読み取り、細胞の相対生存率を算出した。
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を再懸濁し、所定の密度で９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養し、培養系の最終濃度が０．４１μＭ、１．２３μＭ、３．７μＭ、１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭになるように７２時間薬剤添加処理を行った後、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットを使用して細胞生存率を検出した。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットの説明書に従って１００μＬ／ウェル試薬を加え、１０分間振盪し、多機能プレートリーダーで化学発光値（ＬＵＭ）を読み取り、細胞の相対生存率を算出した。
【0033】
腫瘍細胞の相対生存率Ｖ（％）＝（ＬＵＭ－ＬＵＭバックグラウンド）／（ＬＵＭ正常対照群－ＬＵＭバックグラウンド群）×１００％
ただし、ＬＵＭバックグラウンドは、検出試薬を完全培地ウェルに添加したバックグラウンド読み取り値である。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１統計ソフトウェアを使用して半数阻害濃度（ＩＣ５０）を推算した。
ただし、ＬＵＭバックグラウンドは、検出試薬を完全培地ウェルに添加したバックグラウンド読み取り値である。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１統計ソフトウェアを使用して半数阻害濃度（ＩＣ５０）を推算した。
【0034】
２．実験結果
２．１ １，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体によって誘発されたＴ９８Ｇ細胞の空胞化
Ｓ１、Ｓ２（（＋）－Ｓ２及び（－）－Ｓ２を含む）、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５及びＳ６により、Ｔ９８の空胞化を誘発することができた（図１及び表１）。それらの化合物の中で、Ｓ１は空胞化を誘発する活性が最も弱く、Ｓ２は空胞化を誘発する活性が最も強かった。
２．１ １，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体によって誘発されたＴ９８Ｇ細胞の空胞化
Ｓ１、Ｓ２（（＋）－Ｓ２及び（－）－Ｓ２を含む）、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５及びＳ６により、Ｔ９８の空胞化を誘発することができた（図１及び表１）。それらの化合物の中で、Ｓ１は空胞化を誘発する活性が最も弱く、Ｓ２は空胞化を誘発する活性が最も強かった。
【0035】
【表3】
表中、データは平均値±ＳＤとして表され、「－」は化合物が沈殿析出したから、データが計算されなかったことを表す。
【0036】
２．２ １，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体によってＴ９８Ｇ細胞増殖が阻害されたこと
表２に示す腫瘍増殖阻害活性ＩＣ５０から、１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体により神経腫瘍細胞Ｔ９８Ｇの増殖を阻害することができたことが分かった。それらの化合物の中で、Ｓ１の増殖阻害活性が弱く、空胞化を誘発する活性とほぼ一致した。
表２に示す腫瘍増殖阻害活性ＩＣ５０から、１，４－ジヒドロ－ナフチリジン系誘導体により神経腫瘍細胞Ｔ９８Ｇの増殖を阻害することができたことが分かった。それらの化合物の中で、Ｓ１の増殖阻害活性が弱く、空胞化を誘発する活性とほぼ一致した。
【0037】
【表4】
【0038】
実施例２ Ｓ２のインビトロでの腫瘍細胞増殖に対する阻害活性に関する研究
１． 材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇ及びヒト神経膠腫細胞系Ｕ２５１は南京科佰生物科技有限公司から購入された。ヒト神経膠腫細胞系Ａ１７２、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、ヒト肝臓癌細胞系ＨｅｐＧ２、マウス結腸癌細胞系ＣＴ２６．ＷＴ及びハムスター卵巣細胞亜株ＣＨＯ－Ｋ１は、Ｗｕｈａｎ Ｐｒｉｃｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入された。
１． 材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇ及びヒト神経膠腫細胞系Ｕ２５１は南京科佰生物科技有限公司から購入された。ヒト神経膠腫細胞系Ａ１７２、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、ヒト肝臓癌細胞系ＨｅｐＧ２、マウス結腸癌細胞系ＣＴ２６．ＷＴ及びハムスター卵巣細胞亜株ＣＨＯ－Ｋ１は、Ｗｕｈａｎ Ｐｒｉｃｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入された。
【0039】
１．２ 試薬及び消耗品
【表5】
【0040】
１．３ 投与溶液の調製
Ｓ２粉末を精密に秤量し、ＤＭＳＯで溶解し、母液として濃度１００ｍＭの均一溶液を調製した。
Ｓ２粉末を精密に秤量し、ＤＭＳＯで溶解し、母液として濃度１００ｍＭの均一溶液を調製した。
【0041】
１．４ 細胞培養及び細胞表現型の観察
Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、Ａ－１７２及びＨｅｐＧ２などの細胞をＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。ＣＴ２６．ＷＴをＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。ＣＨＯ－Ｋ１をＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。
Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、Ａ－１７２及びＨｅｐＧ２などの細胞をＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。ＣＴ２６．ＷＴをＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。ＣＨＯ－Ｋ１をＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓ培地に接着培養し、１：３で継代した。
【0042】
上記で使用した細胞を蘇生した後に２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、培地で細胞を再懸濁し、６ウェルプレートに各ウェル２ｍＬで一定の密度で接種し、２４時間培養し、群分けの状況に応じて上記で調製したＳ２溶液（ＤＭＳＯ最終濃度０．１％）を各ウェルにそれぞれ２μＬ加え、細胞培養系内のＳ２濃度が３０μＭに達するようにした。
【0043】
薬剤添加して６時間処理した後、顕微鏡２０×対物レンズで観察し、各ウェルについて５つの視野をランダムに選択して写真を撮影して記録した。観察された視野において、細胞内に境界がはっきりした明るい空胞が現れ、１）直径が３μＭを超えた空胞を少なくとも１つ含むこと、２）直径が０．５～３μＭ範囲内である空胞を３つ以上含むことという２つの条件のうちの任意の一つを少なくとも満たした場合は、メチューシス陽性細胞と認められる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８ ６１（１２），５４２４－５４３４）。
【0044】
空胞化率Ｒ（％）＝ＣＥＬＬ陽性／（ＣＥＬＬ正常＋ＣＥＬＬ陽性）×１００％
ここで、ＣＥＬＬ陽性はメチューシス陽性細胞の数を表し、ＣＥＬＬ正常は正常な形態の細胞の数を表す。
ここで、ＣＥＬＬ陽性はメチューシス陽性細胞の数を表し、ＣＥＬＬ正常は正常な形態の細胞の数を表す。
【0045】
１．５ 細胞生存率の検出
上記の各種類の細胞を蘇生して２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を再懸濁し、所定密度で９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養し、培養系の最終濃度が０．４１μＭ、１．２３μＭ、３．７μＭ、１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭになるように４８時間薬剤添加処理を行った後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットを使用して細胞生存率を検出した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットの説明書に従って１００μＬ／ウェル試薬を加え、１０分間振盪し、多機能プレートリーダーで化学発光値（ＬＵＭ）読み取り、細胞の相対生存率を算出した。
上記の各種類の細胞を蘇生して２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、細胞を再懸濁し、所定密度で９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養し、培養系の最終濃度が０．４１μＭ、１．２３μＭ、３．７μＭ、１１．１μＭ、３３．３μＭ、１００μＭになるように４８時間薬剤添加処理を行った後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットを使用して細胞生存率を検出した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－ＬｉｔｅＴＭ ２．０キットの説明書に従って１００μＬ／ウェル試薬を加え、１０分間振盪し、多機能プレートリーダーで化学発光値（ＬＵＭ）読み取り、細胞の相対生存率を算出した。
【0046】
腫瘍細胞の相対生存率Ｖ（％）＝（ＬＵＭ－ＬＵＭバックグラウンド）／（ＬＵＭ正常対照群－ＬＵＭバックグラウンド群）×１００％
ただし、ＬＵＭバックグラウンドは、この検出試薬を完全培地ウェルに添加したバックグラウンド読み取り値であった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１統計ソフトウェアを使用して半数阻害濃度（ＩＣ５０）を推算した。
ただし、ＬＵＭバックグラウンドは、この検出試薬を完全培地ウェルに添加したバックグラウンド読み取り値であった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１統計ソフトウェアを使用して半数阻害濃度（ＩＣ５０）を推算した。
【0047】
２． 実験結果
２．１ Ｓ２によって誘発された腫瘍細胞の空胞化
Ｓ２により、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１及びＡ１７２、ヒト神経芽腫細胞系ＳＫ－Ｎ－ＳＨなどの神経腫瘍細胞の空胞化（図２のＡ～Ｄ）を誘発することができ、しかもヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２及びマウス結腸癌細胞ＣＴ２６．ＷＴを含む非神経系腫瘍細胞の空胞化（図２のＡ～Ｄ）を誘発することもできた。けれども、Ｓ２は非腫瘍細胞系ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ－Ｋ１の空胞化を誘発しなかった。
２．１ Ｓ２によって誘発された腫瘍細胞の空胞化
Ｓ２により、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１及びＡ１７２、ヒト神経芽腫細胞系ＳＫ－Ｎ－ＳＨなどの神経腫瘍細胞の空胞化（図２のＡ～Ｄ）を誘発することができ、しかもヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２及びマウス結腸癌細胞ＣＴ２６．ＷＴを含む非神経系腫瘍細胞の空胞化（図２のＡ～Ｄ）を誘発することもできた。けれども、Ｓ２は非腫瘍細胞系ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ－Ｋ１の空胞化を誘発しなかった。
【0048】
２．２ Ｓ２によって腫瘍細胞増殖が阻害されたこと
Ｓ２は、神経腫瘍細胞及び非神経腫瘍系の増殖を阻害することができたが（ＩＣ５０は４．７～１４．３μＭの範囲であった）、非腫瘍細胞系の増殖に対しては阻害作用が非常に弱かった（ＩＣ５０＞１００μＭ）ことが分かった（表３を参考）。
Ｓ２は、神経腫瘍細胞及び非神経腫瘍系の増殖を阻害することができたが（ＩＣ５０は４．７～１４．３μＭの範囲であった）、非腫瘍細胞系の増殖に対しては阻害作用が非常に弱かった（ＩＣ５０＞１００μＭ）ことが分かった（表３を参考）。
【0049】
【表6】
【0050】
実施例３ Ｔ９８細胞空胞化表現型に対するＡＣｈＥ阻害剤及びＶＧＣＣ遮断剤の影響
１． 材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８ＧはＣＯＢＩＯＥＲ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤから購入された。
１． 材料及び方法
１．１ 細胞
ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８ＧはＣＯＢＩＯＥＲ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤから購入された。
【0051】
１．２ 試薬及び消耗品
【表7】
【0052】
１．３ 投与溶液の調製
被験対象薬剤には、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、フルナリジン及びドネペジルが含まれた。
被験対象薬剤には、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、フルナリジン及びドネペジルが含まれた。
【0053】
上記被験対象薬剤を精密に秤量し、ＤＭＳＯで溶解し、母液として濃度２０ｍＭの均一溶液をそれぞれ調製した。
【0054】
１．４ 細胞培養及び細胞表現型の観察
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、培地で細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに各ウェル１ｍＬで一定の密度で接種した。２４時間培養し、上記で調製した化合物溶液を、培養系中の化合物濃度がそれぞれ０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるように、群分けの状況に応じて各ウェルにそれぞれ加えた。対照ウェルとして等体積のＤＭＳＯを加えた。
Ｔ９８Ｇ細胞を２回安定に継代し、細胞密度が８５％以上に達したら、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで３分間消化し、培地で細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに各ウェル１ｍＬで一定の密度で接種した。２４時間培養し、上記で調製した化合物溶液を、培養系中の化合物濃度がそれぞれ０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるように、群分けの状況に応じて各ウェルにそれぞれ加えた。対照ウェルとして等体積のＤＭＳＯを加えた。
【0055】
薬剤添加して６時間処理した後、顕微鏡２０×対物レンズで観察した。観察された視野において、細胞内に境界がはっきりした明るい空胞が現れ、かつ１）直径が３μＭを超えた空胞を少なくとも１つを含むこと、２）直径が０．５～３μＭ範囲内である空胞を３つ以上含むことという２つの条件のうちの任意の一つを少なくとも満たした場合は、メチューシス陽性細胞と認められる。
【0056】
２．実験結果
２．１ カルシウムチャネル阻害剤（ＶＧＣＣ）によって腫瘍細胞の空胞化を誘発することができなかったこと
カルシウムチャネル阻害剤であるニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、フルナリジン（最大薬物濃度２０μＭ）のいずれかにより、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図３）。
２．１ カルシウムチャネル阻害剤（ＶＧＣＣ）によって腫瘍細胞の空胞化を誘発することができなかったこと
カルシウムチャネル阻害剤であるニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、フルナリジン（最大薬物濃度２０μＭ）のいずれかにより、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図３）。
【0057】
２．２ コリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤により腫瘍細胞の空胞化を誘発することができなかったこと
コリンエステラーゼ阻害剤であるドネペジル（最大薬物濃度２０μＭ）により、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図４）。
コリンエステラーゼ阻害剤であるドネペジル（最大薬物濃度２０μＭ）により、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図４）。
【0058】
２．３ カルシウムチャネル阻害剤とコリンエステラーゼ阻害剤との併用により腫瘍細胞の空胞化を誘発することができなかったこと
カルシウムチャネル阻害剤であるニフェジピン又はベラパミル（２０μＭ）とコリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（２０μＭ）を併用することにより、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図５）。
カルシウムチャネル阻害剤であるニフェジピン又はベラパミル（２０μＭ）とコリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（２０μＭ）を併用することにより、ヒト神経膠腫細胞系Ｔ９８Ｇの空胞化細胞表現型を誘発することができなかった（図５）。
【0059】
実施例４ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルに対するＳ２の薬効研究試験
１．材料及び方法
１．１実験動物
ＬＩＮＧＣＨＡＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨＢから購入されたＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅヌードマウス、雄、ＳＰＦグレード、体重２０～２２ｇ。
１．材料及び方法
１．１実験動物
ＬＩＮＧＣＨＡＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨＢから購入されたＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅヌードマウス、雄、ＳＰＦグレード、体重２０～２２ｇ。
【0060】
１．２ 試薬及び消耗品
この実験における主な試薬情報は次の通りである。
この実験における主な試薬情報は次の通りである。
【表8】
【0061】
１．３ 実験設備
この実験における主な設備情報は次の通りである。
この実験における主な設備情報は次の通りである。
【表9】
【0062】
１．４ 投与製剤の調製
Ｓ２に対して、溶媒として５％エタノール＋０．８％ソルトール＋５％グルコースを使用した。
調製方法：適量のＳ２を取り、無水エタノールを所定の比例で加えて超音波で溶解し、ソルトールＨＳ－１５を所定の比例で加えて超音波で混合し（痕跡現象がないことを確認）、超音波中、精製水をゆっくりと加えて溶解した後、グルコースを所定の比例で加え、超音波で溶解して溶液を取得し、溶液を４℃で放置して光を避けながら保存した。
Ｓ２に対して、溶媒として５％エタノール＋０．８％ソルトール＋５％グルコースを使用した。
調製方法：適量のＳ２を取り、無水エタノールを所定の比例で加えて超音波で溶解し、ソルトールＨＳ－１５を所定の比例で加えて超音波で混合し（痕跡現象がないことを確認）、超音波中、精製水をゆっくりと加えて溶解した後、グルコースを所定の比例で加え、超音波で溶解して溶液を取得し、溶液を４℃で放置して光を避けながら保存した。
【0063】
１．５ 実験方法
１．５．１ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルの作製
接種前のＵ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞を０．０５％－トリプシン－ＥＤＴＡで消化し、予冷したＰＢＳで４×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬになるように再懸濁し、氷の上に置いておいた。ヌードマウスをイソフルランガスで麻酔し、その後麻酔した動物を定位固定装置に腹臥位で固定し、ヌードマウスの頭皮をヨードフォアで消毒し、ヌードマウスの頭皮をメスで矢状に切開し、ヨードフォアで切開部をきれいにし、頭蓋骨を露出させ、ブレグマの前で１．０ｍＭ拡張し、右側に２．０ｍＭ開き、頭蓋骨ドリルを使用して穴を開けた。１０μＬのフラットヘッドマイクロシリンジを使用して５μＬの細胞懸濁液（２×１０５細胞）を手動で注射した。なお、針の挿入深さは３．５ｍＭ、針の引き抜きは０．５ｍＭ、注射時間は約１０分間であった。５分間針を止めた後、ゆっくりと針を抜き、滅菌して切開部を縫合し、最後に感染を防ぐために５万単位のペニシリンを筋肉注射した。
１．５．１ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルの作製
接種前のＵ８７ＭＧ－Ｌｕｃ細胞を０．０５％－トリプシン－ＥＤＴＡで消化し、予冷したＰＢＳで４×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬになるように再懸濁し、氷の上に置いておいた。ヌードマウスをイソフルランガスで麻酔し、その後麻酔した動物を定位固定装置に腹臥位で固定し、ヌードマウスの頭皮をヨードフォアで消毒し、ヌードマウスの頭皮をメスで矢状に切開し、ヨードフォアで切開部をきれいにし、頭蓋骨を露出させ、ブレグマの前で１．０ｍＭ拡張し、右側に２．０ｍＭ開き、頭蓋骨ドリルを使用して穴を開けた。１０μＬのフラットヘッドマイクロシリンジを使用して５μＬの細胞懸濁液（２×１０５細胞）を手動で注射した。なお、針の挿入深さは３．５ｍＭ、針の引き抜きは０．５ｍＭ、注射時間は約１０分間であった。５分間針を止めた後、ゆっくりと針を抜き、滅菌して切開部を縫合し、最後に感染を防ぐために５万単位のペニシリンを筋肉注射した。
【0064】
１．５．２ 動物の群分け及び投与
今回の実験はモデル群、ＴＭＺ群、Ｓ２投薬群－ＬＤ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ）の５群に分けた。モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で各群に分けた。接種後５日目から、薬剤を１日１回、１５日間静脈内投与した。モデル群には、溶媒を１日１回、１５日間静脈内投与した。
今回の実験はモデル群、ＴＭＺ群、Ｓ２投薬群－ＬＤ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ）の５群に分けた。モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で各群に分けた。接種後５日目から、薬剤を１日１回、１５日間静脈内投与した。モデル群には、溶媒を１日１回、１５日間静脈内投与した。
【0065】
１．５．３ 脳内の腫瘍細胞の生体内イメージング
接種後４、１２、１８、２５日目に、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－フルオレセインカリウム塩溶液（溶液は０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した）２００μＬを腹腔内注射し、１０分後にマウスの生体内イメージングシステム（ＰＥ社ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ）を使用してＩＶＩ化学発光検出（明視野＋生物発光イメージング）を行った。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光強度分析を行い、蛍光強度［ｐ／ｓ］を取得した。蛍光強度のデータにより、実験動物の脳内における腫瘍組織のサイズが反映される。
接種後４、１２、１８、２５日目に、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－フルオレセインカリウム塩溶液（溶液は０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した）２００μＬを腹腔内注射し、１０分後にマウスの生体内イメージングシステム（ＰＥ社ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ）を使用してＩＶＩ化学発光検出（明視野＋生物発光イメージング）を行った。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光強度分析を行い、蛍光強度［ｐ／ｓ］を取得した。蛍光強度のデータにより、実験動物の脳内における腫瘍組織のサイズが反映される。
【0066】
１．５．４ 動物の生存期間記録
実験動物の生存状況を検出し、動物の死亡日をタイムリーに記録した。
実験動物の生存状況を検出し、動物の死亡日をタイムリーに記録した。
【0067】
１．６ データの統計分析
定量的データは、平均値±標準誤差として表される。各薬力学指数については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．１）ソフトウェアにより図を作成し、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置反復分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ｒｅｐｅａｔ ＡＮＯＶＡ）を行い、そしてＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ検定により群間差異を分析し、カプラン・マイヤー法により生存分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合は、有意差があると定義した。
定量的データは、平均値±標準誤差として表される。各薬力学指数については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．１）ソフトウェアにより図を作成し、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置反復分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ｒｅｐｅａｔ ＡＮＯＶＡ）を行い、そしてＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ検定により群間差異を分析し、カプラン・マイヤー法により生存分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合は、有意差があると定義した。
【0068】
２． 実験結果
２．１ Ｓ２によりヌードマウスの脳に同所移植されたＵ８７ＭＧ神経膠腫の成長が阻害されたこと
Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の両方は、溶媒群と比較して脳内のＵ８７ＭＧ上皮内腫瘍の増殖を有意に阻害することができた（図６のＡ及びＢ）。２週間の投与後、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、溶媒群と比較して有意な腫瘍増殖阻害作用を示した。その中で、Ｓ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、腫瘍阻害作用が一番最も強かった（図７のＡ及びＢ）。
２．１ Ｓ２によりヌードマウスの脳に同所移植されたＵ８７ＭＧ神経膠腫の成長が阻害されたこと
Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の両方は、溶媒群と比較して脳内のＵ８７ＭＧ上皮内腫瘍の増殖を有意に阻害することができた（図６のＡ及びＢ）。２週間の投与後、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、溶媒群と比較して有意な腫瘍増殖阻害作用を示した。その中で、Ｓ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、腫瘍阻害作用が一番最も強かった（図７のＡ及びＢ）。
【0069】
２．２ Ｓ２により神経膠腫の脳同所移植ヌードマウスの生存期間が延長されたこと
ログランク検定（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）により生存曲線分析を行った結果、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、溶媒群と比較してＵ８７ＭＧ脳上皮内癌マウスの生存率が有意に延長され（図８）、生存期間中央値及び全生存期間が延長された（表４）。
ログランク検定（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）により生存曲線分析を行った結果、Ｓ２投薬群－ＭＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）及びＳ２投薬群－ＨＤ（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、溶媒群と比較してＵ８７ＭＧ脳上皮内癌マウスの生存率が有意に延長され（図８）、生存期間中央値及び全生存期間が延長された（表４）。
【0070】
【表10】
【0071】
実施例５ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルに対するＳ２とテモゾロミド（ＴＭＺ）との併用の薬効研究試験
１．材料及び方法
１．１ 実験動物
実施例４と同じであった。
１．材料及び方法
１．１ 実験動物
実施例４と同じであった。
【0072】
１．２試薬及び消耗品
実施例４と同じであった。
実施例４と同じであった。
【0073】
１．３ 実験設備
実施例４と同じであった。
実施例４と同じであった。
【0074】
１．４投与製剤の調製
ａ）Ｓ２
溶媒：５％エタノール＋０．８％ソルトール＋５％グルコース
調製方法：適量のＳ２を取り、無水エタノールを所定の比例で加えて超音波で溶解し、ソルトールＨＳ－１５を所定の比例で加えて超音波で混合し（痕跡現象がないことを確認）、超音波中、精製水をゆっくりと加えて溶解した後、グルコースを所定の比例で加え、超音波で溶解して溶液を取得し、溶液を４℃で放置して光を避けながら保存した。
ａ）Ｓ２
溶媒：５％エタノール＋０．８％ソルトール＋５％グルコース
調製方法：適量のＳ２を取り、無水エタノールを所定の比例で加えて超音波で溶解し、ソルトールＨＳ－１５を所定の比例で加えて超音波で混合し（痕跡現象がないことを確認）、超音波中、精製水をゆっくりと加えて溶解した後、グルコースを所定の比例で加え、超音波で溶解して溶液を取得し、溶液を４℃で放置して光を避けながら保存した。
【0075】
ｂ）ＴＭＺ
溶媒：０．９％塩化ナトリウム注射液
調製方法：適量のＴＭＺを秤量し、０．９％塩化ナトリウム注射液を所定の比例で加えて希釈し、均一に混合するまで振盪し、溶液を－２０℃で保存した。
溶媒：０．９％塩化ナトリウム注射液
調製方法：適量のＴＭＺを秤量し、０．９％塩化ナトリウム注射液を所定の比例で加えて希釈し、均一に混合するまで振盪し、溶液を－２０℃で保存した。
【0076】
１．５ 実験方法
１．５．１ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルの作製
実施例４と同じであった。
１．５．１ Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃ膠芽腫細胞をヌードマウスに同所移植した腫瘍モデルの作製
実施例４と同じであった。
【0077】
１．５．２ 動物群分け及び投与
実験には、モデル群、ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ）群、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＬＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ ０．２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＭＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ ０．５ｍｇ／ｋｇ）、及びＳ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＨＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ １ｍｇ／ｋｇ）の４群に分けた。モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で各群に分けた。接種後８日目から、ＴＭＺは８日目及び１５日目に２回腹腔内投与し、Ｓ２は１日１回、１５日間連続して静脈内投与した。
実験には、モデル群、ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ）群、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＬＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ ０．２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＭＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ ０．５ｍｇ／ｋｇ）、及びＳ２＋ＴＭＺ併用投薬群－ＨＤ（ＴＭＺ ３ｍｇ／ｋｇとＳ２ １ｍｇ／ｋｇ）の４群に分けた。モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で各群に分けた。接種後８日目から、ＴＭＺは８日目及び１５日目に２回腹腔内投与し、Ｓ２は１日１回、１５日間連続して静脈内投与した。
【0078】
１．５．３ 脳内の腫瘍細胞の生体内イメージング
接種後７、１４、２１日目に、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－フルオレセインカリウム塩溶液（溶液は０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した）２００μＬを腹腔内注射し、１０分後にマウスの生体内イメージングシステム（ＰＥ社ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ）を使用してＩＶＩ化学発光検出（明視野＋生物発光イメージング）を行った。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光強度分析を行い、蛍光強度［ｐ／ｓ］を取得した。蛍光強度のデータにより、実験動物の脳内における腫瘍組織のサイズが反映された。
接種後７、１４、２１日目に、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－フルオレセインカリウム塩溶液（溶液は０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した）２００μＬを腹腔内注射し、１０分後にマウスの生体内イメージングシステム（ＰＥ社ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲ）を使用してＩＶＩ化学発光検出（明視野＋生物発光イメージング）を行った。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して蛍光強度分析を行い、蛍光強度［ｐ／ｓ］を取得した。蛍光強度のデータにより、実験動物の脳内における腫瘍組織のサイズが反映された。
【0079】
１．５．４ 動物生存期間の記録
実験動物の生存状況を検出し、動物の死亡日をきちんと記録した。
実験動物の生存状況を検出し、動物の死亡日をきちんと記録した。
【0080】
１．６ データ統計分析
定量的データは、平均値±標準誤差として表される。各薬力学指数については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．１）ソフトウェアにより図を作成し、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置反復分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ｒｅｐｅａｔ ＡＮＯＶＡ）を行い、そしてＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ検定により群間差異を分析し、カプラン・マイヤー法により生存分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合は、有意差があると定義した。
定量的データは、平均値±標準誤差として表される。各薬力学指数については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．１）ソフトウェアにより図を作成し、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は二元配置反復分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ｒｅｐｅａｔ ＡＮＯＶＡ）を行い、そしてＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ検定により群間差異を分析し、カプラン・マイヤー法により生存分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合は、有意差があると定義した。
【0081】
２． 実験結果
２．１ ヌードマウス脳内のＵ８７ＭＧ神経膠腫の成長に対するＳ２＋ＴＭＺ併用投与の影響
ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）単独投与及びＴＭＺ＋Ｓ２（０．２５、０．５、及び１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）併用投与は、溶媒群と比較して、いずれも脳内のＵ８７ＭＧ上皮内腫瘍の増殖を有意に阻害することができた（図９のＡ及びＢ）。２週間の投与後（２１日目に）、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群は、ＴＭＺと比較して、腫瘍増殖阻害作用がより強かった。また、Ｓ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺ併用投薬群はＴＭＺ群よりも腫瘍阻害作用が有意に優れた（図１０のＡ及びＢ）。
２．１ ヌードマウス脳内のＵ８７ＭＧ神経膠腫の成長に対するＳ２＋ＴＭＺ併用投与の影響
ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）単独投与及びＴＭＺ＋Ｓ２（０．２５、０．５、及び１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）併用投与は、溶媒群と比較して、いずれも脳内のＵ８７ＭＧ上皮内腫瘍の増殖を有意に阻害することができた（図９のＡ及びＢ）。２週間の投与後（２１日目に）、Ｓ２＋ＴＭＺ併用投薬群は、ＴＭＺと比較して、腫瘍増殖阻害作用がより強かった。また、Ｓ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺ併用投薬群はＴＭＺ群よりも腫瘍阻害作用が有意に優れた（図１０のＡ及びＢ）。
【0082】
２．２ 脳上皮内神経膠腫を有するヌードマウスの生存に対するＳ２＋ＴＭＺ併用投与の影響
ログランク検定（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）により生存曲線分析を行った結果、ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）単独投与及びＴＭＺ＋Ｓ２（０．２５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）併用投薬群は、溶媒群と比較してマウスの生存時間に有意差があった。ＴＭＺ単独投与と比較して、Ｓ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺ併用投与及びＳ２（１ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺにより、Ｕ８７ＭＧ脳上皮内癌を有するマウスの生存率が有意に延長され（図１１）、また生存期間中央値及び全生存期間が延長された（表５）。
ログランク検定（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）により生存曲線分析を行った結果、ＴＭＺ（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）単独投与及びＴＭＺ＋Ｓ２（０．２５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）併用投薬群は、溶媒群と比較してマウスの生存時間に有意差があった。ＴＭＺ単独投与と比較して、Ｓ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺ併用投与及びＳ２（１ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＭＺにより、Ｕ８７ＭＧ脳上皮内癌を有するマウスの生存率が有意に延長され（図１１）、また生存期間中央値及び全生存期間が延長された（表５）。
【0083】
【表11】
【0084】
実施例６ ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス皮下モデルにおけるヒト神経膠腫Ｔ９８Ｇに対するＳ２のインビボ薬力学研究
１．方法及び材料
１．１実験動物
北京維通利華実験動物技術有限公司から購入されたＮＯＤ ＳＣＩＤ、雌、６～８週齢、体重１８～２１グラム。
１．方法及び材料
１．１実験動物
北京維通利華実験動物技術有限公司から購入されたＮＯＤ ＳＣＩＤ、雌、６～８週齢、体重１８～２１グラム。
【0085】
１．２ 被験薬
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたロット番号Ｂ１８２８１３２のテモゾロミド（ＴＭＺ）
Ｊｉａｎｇｓｕ Ｓｉｍｏｖａｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ Ｌｔｄから購入されたロット番号Ｄ１２－２０１６１１０１－７のＳ２
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたロット番号Ｂ１８２８１３２のテモゾロミド（ＴＭＺ）
Ｊｉａｎｇｓｕ Ｓｉｍｏｖａｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ Ｌｔｄから購入されたロット番号Ｄ１２－２０１６１１０１－７のＳ２
【0086】
１．３ 投与製剤の調製
１８ｍｇのテモゾロミドを秤量し、１２ｍＬの１％ＨＰＭＣに溶解することにより、ＴＭＺ（１．５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
実施例４と同様な調製方法により、Ｓ２投与製剤を調製した。
１８ｍｇのテモゾロミドを秤量し、１２ｍＬの１％ＨＰＭＣに溶解することにより、ＴＭＺ（１．５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
実施例４と同様な調製方法により、Ｓ２投与製剤を調製した。
【0087】
１．４ 実験方法
１．４．１ Ｔ９８Ｇ膠芽腫細胞をヌードマウスに皮下移植した腫瘍モデルの作製
ヒト神経膠腫Ｔ９８Ｇ細胞をインビトロで培養した。培養条件として、ＥＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加え、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内で培養することにした。細胞の数が必要な数に達したら、細胞を収集した。Ｔ９８Ｇ腫瘍細胞（ＰＢＳ：マトリゲル＝１：１）０．２ｍＬ（１０×１０６）を各マウスの右背部に皮下接種した。腫瘍平均体積が約１４７ｍＭ３に達した時点で群分けて投与を開始した。
１．４．１ Ｔ９８Ｇ膠芽腫細胞をヌードマウスに皮下移植した腫瘍モデルの作製
ヒト神経膠腫Ｔ９８Ｇ細胞をインビトロで培養した。培養条件として、ＥＭＥＭ培地に１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加え、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内で培養することにした。細胞の数が必要な数に達したら、細胞を収集した。Ｔ９８Ｇ腫瘍細胞（ＰＢＳ：マトリゲル＝１：１）０．２ｍＬ（１０×１０６）を各マウスの右背部に皮下接種した。腫瘍平均体積が約１４７ｍＭ３に達した時点で群分けて投与を開始した。
【0088】
１．４．２ 動物群分け及び投与
第１組の実験には、モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で１０匹ずつに、溶媒群、ＴＭＺ群（１５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）の２群に分けた。
第１組の実験には、モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で１０匹ずつに、溶媒群、ＴＭＺ群（１５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）の２群に分けた。
【0089】
第２組の実験には、モデリングされた動物を等しい確率で一重盲検法で９匹ずつに、溶媒群、Ｓ２群（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の２群に分けた。
【0090】
１．４．３ 腫瘍サイズの測定
腫瘍直径をノギスで週に２回測定し、実験終了後、腫瘍重量を測定して写真を撮影した。
腫瘍直径をノギスで週に２回測定し、実験終了後、腫瘍重量を測定して写真を撮影した。
【0091】
１．５ データ統計
腫瘍体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ただし、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す）
抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）により評価された。
抗腫瘍効果ＴＧＩ（％）は次の式から計算した。
ＴＧＩ％＝［１－（ある処理群における投与終了時の平均腫瘍体積－該処理群における投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群における治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群における治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は次の式から計算した。
Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００
（ただし、ＴＲＴＶは治療群のＲＴＶを表し、ＣＲＴＶは陰性対照群のＲＴＶを表す）
相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）は腫瘍測定結果から下記の計算式により算出された。
ＲＴＶの計算式：
ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０
（ただし、Ｖ０は群投与開始時（即ちｄ０）に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔはある測定時の平均腫瘍体積であり、ＴＲＴＶとＣＲＴＶは同じ日で取得したデータである）。
腫瘍体積の計算式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ただし、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径を表す）
抗腫瘍効果は、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）により評価された。
抗腫瘍効果ＴＧＩ（％）は次の式から計算した。
ＴＧＩ％＝［１－（ある処理群における投与終了時の平均腫瘍体積－該処理群における投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群における治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群における治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００
相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）は次の式から計算した。
Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００
（ただし、ＴＲＴＶは治療群のＲＴＶを表し、ＣＲＴＶは陰性対照群のＲＴＶを表す）
相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）は腫瘍測定結果から下記の計算式により算出された。
ＲＴＶの計算式：
ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０
（ただし、Ｖ０は群投与開始時（即ちｄ０）に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔはある測定時の平均腫瘍体積であり、ＴＲＴＶとＣＲＴＶは同じ日で取得したデータである）。
【0092】
統計分析は、実験終了時の各群の腫瘍体積の平均値及び標準誤差（ＳＥＭ）に基づいて行われた。２つの群間の比較は、Ｔ－ｔｅｓｔを使用して分析された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．１）ですべてのデータ分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合は有意差があると考えられた。
【0093】
２．実験結果
２．１ Ｔ９８腫瘍増殖及び実験終了点の腫瘍重量に対するＴＭＺの影響
溶媒群と比較して、ＴＭＺ １５ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍体積の増殖に対する阻害作用が見られなかった（図１２のＡ～Ｃ）。実験終了点で腫瘍を採取して重量を測定したところ、ＴＭＺ １５ｍｇ／ｋｇ群と対照群との間に腫瘍重量に有意差がなかった（図１２のＤ）。この結果は、上記腫瘍体積への阻害と一致した。
２．１ Ｔ９８腫瘍増殖及び実験終了点の腫瘍重量に対するＴＭＺの影響
溶媒群と比較して、ＴＭＺ １５ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍体積の増殖に対する阻害作用が見られなかった（図１２のＡ～Ｃ）。実験終了点で腫瘍を採取して重量を測定したところ、ＴＭＺ １５ｍｇ／ｋｇ群と対照群との間に腫瘍重量に有意差がなかった（図１２のＤ）。この結果は、上記腫瘍体積への阻害と一致した。
【0094】
２．２ Ｔ９８腫瘍増殖及び実験終了点の腫瘍重量に対するＳ２の影響
溶媒群と比較して、Ｓ２ ３ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍体積の増殖が有意に阻害された（図１３のＡ～Ｃ）。実験終了時に腫瘍を採取して重量を測定したところ、Ｓ２ ３ｍｇ／ｋｇ群は対照群よりも腫瘍重量が有意に低かった（図１３のＤ）。この結果は、上記腫瘍体積への阻害と一致した。
溶媒群と比較して、Ｓ２ ３ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍体積の増殖が有意に阻害された（図１３のＡ～Ｃ）。実験終了時に腫瘍を採取して重量を測定したところ、Ｓ２ ３ｍｇ／ｋｇ群は対照群よりも腫瘍重量が有意に低かった（図１３のＤ）。この結果は、上記腫瘍体積への阻害と一致した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】