特表 2024-543732 高性能細菌株のための固相スクリーニング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-22

(54)【発明の名称】高性能細菌株のための固相スクリーニング

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20241115BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241115BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20241115BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20241115BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20241115BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20241115BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12N15/11 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536389

(86)(22)【出願日】2022-12-16

(85)【翻訳文提出日】2024-06-17

(86)【国際出願番号】 US2022053107

(87)【国際公開番号】W WO2023114452

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】63/291,059

(32)【優先日】2021-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522282793

【氏名又は名称】アブサイ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】チア リウ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QQ07

4B063QQ08

4B063QQ09

4B063QQ13

4B063QQ79

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4B065AB01

4B065AC14

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4B065BB08

4B065BB15

4B065BD29

4B065BD36

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、目的の遺伝子産物を産生する細胞の集団から宿主細胞（単数又は複数）を特定するための組成物及び方法を提供する。本開示は、親和性決定及び高産生株の特定を可能にする固相スクリーニングワークフローを更に提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞を特定する方法であって、
（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、前記宿主細胞を、前記成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｂ）少なくとも１つの複製プレートを調製し、前記複製プレートを、宿主細胞成長及び前記遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）宿主細胞を、前記（ｂ）の少なくとも１つの複製プレートから膜に移動させるステップと、
（ｄ）（ｃ）で前記膜に移動させた前記宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）任意選択で、前記宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）前記宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、前記宿主細胞を、前記宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、
（ｅ）前記透過化した宿主細胞を、前記少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、前記少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物の複合体を形成するステップと、
（ｆ）前記宿主細胞を、前記目的の遺伝子産物を産生する前記宿主細胞を特定することを可能にする条件下で撮像するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

ステップ（ｃ）が、前記少なくとも１つの複製プレート及び膜をマーキングして、前記少なくとも１つの複製プレート及び膜の空間的整列を可能にすることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記宿主細胞が、真核細胞、原核細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記目的の遺伝子産物が、治療用タンパク質、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｔ細胞受容体、及びキメラ抗原受容体、又はそれらの断片からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記目的の遺伝子産物が、細胞内タンパク質である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記宿主細胞の集団が、およそ１，０００～およそ１０億個の宿主細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記宿主細胞の集団が、遺伝子産物を発現構築物から産生するように修飾されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記発現構築物が、２つ以上の誘導性プロモーターを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも１つの誘導性プロモーターが、プロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターが、Ｌ－アラビノース誘導性プロモーターである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記宿主細胞が、（ａ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質のためのトランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の改変、（ｂ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｃ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｄ）宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす遺伝子の改変された遺伝子機能、（ｅ）レダクターゼをコードする遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｆ）少なくとも１つのジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの発現構築物、（ｇ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／又は（ｈ）Ｅｒｖｌｐをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、のうちの１つ以上を含むように遺伝子修飾されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

２、３、４、５つ以上の複製プレートが調製される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記複製プレートが、抗生物質と、目的の遺伝子産物の発現の少なくとも１つの誘導物質とを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記膜が、ニトロセルロース膜及びＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ステップ（ｃ）の前記複製プレート及び膜を、着色された物質と接触させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記着色された物質が、アクリル塗料及び染料からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記着色された物質を、針及びペンからなる群から選択される器具で前記プレート及び膜と接触させる、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

細胞成分の固定化を可能にする前記条件が、前記膜を、グルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドのうちの１つ以上を含む組成物と接触させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記宿主細胞の透過化を可能にする前記条件が、前記膜を、リゾチーム及びＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む組成物と接触させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記少なくとも１つのプローブが、抗体又はその機能的断片、核酸結合タンパク質又はその機能的断片、受容体又はその機能的断片、リガンド又はその機能的断片、及び抗原又はその機能的断片、並びに前記目的の遺伝子産物と結合することができるペプチド又はポリペプチドからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記プローブが、ビオチン、ヒスチジンタグ、Ｆｃタグ、ｓｐｙタグ、Ｓｔｒｐタグ、及びＡｖｉタグからなる群から選択されるレポーター部分を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

２、３、４、５つ以上の複製プレートを調製したときに、前記複製プレートから調製した各膜を、異なる濃度の前記プローブ溶液と接触させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記撮像が、前記膜を、前記レポーター部分の活性化因子を含む組成物と接触させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記膜を、前記レポーター部分の活性化因子を含む組成物と接触させることが、１回、２回、又は３回以上繰り返される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記活性化因子が、アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ、及びストレプトアビジンアルカリホスファターゼデキストランポリマーからなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記撮像が、化学発光、Ｘ線撮影、蛍光、及び比色分析からなる群から選択される方法を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記目的の遺伝子産物を産生することができると特定された１つ以上の宿主細胞を再度プレーティングするステップを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

再度プレーティングされた前記宿主細胞は、前記宿主細胞が前記目的の遺伝子産物を産生する能力、及び／又は宿主細胞株を、前記目的の遺伝子産物を産生することができると特定された他の宿主細胞株から単離する能力を確認するために、請求項１に記載の方法に供される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記プローブ－遺伝子産物複合体の親和性を決定することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

宿主細胞を、目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞の集団からスクリーニングする方法であって、
（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、前記宿主細胞を、前記成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｂ）少なくとも１つの複製プレートを調製し、前記複製プレートを、宿主細胞成長及び前記遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）宿主細胞を、前記（ｂ）の少なくとも１つの複製プレートから膜に移動させるステップと、
（ｄ）（ｃ）で前記膜に移動させた前記宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）前記宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）前記宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、前記宿主細胞を、前記宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、
（ｅ）前記透過化した宿主細胞を、前記少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、前記少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物の複合体を形成するステップと、
（ｆ）前記宿主細胞を、前記目的の遺伝子産物を産生する前記宿主細胞を特定することを可能にする条件下で撮像するステップと、を含む、方法。

【請求項30】

プローブ－目的の遺伝子産物の相対的親和性を決定する方法であって、
（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、前記宿主細胞を、前記成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｂ）少なくとも３つの複製プレートを調製し、前記複製プレートを、宿主細胞成長及び前記遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）宿主細胞を、前記（ｂ）の少なくとも３つの複製プレートから別個の膜に移動させるステップと、
（ｄ）（ｃ）で前記膜に移動させた前記宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）前記宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）前記宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、前記宿主細胞を、前記宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、
（ｅ）前記少なくとも３つの複製膜上の前記透過化した宿主細胞を、前記少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、前記少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物の複合体を形成するステップであって、前記プローブ溶液が、異なるプローブ濃度を含む、ステップと、
（ｆ）前記宿主細胞を、前記プローブ－目的の遺伝子産物の相対的親和性を決定することを可能にする条件下で撮像するステップと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月１７日出願の米国仮特許出願第６３／２９１，０５９号に対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

既知の抗原に対する高親和性抗体を産生することが目標であるデノボ抗体の発見は、ウサギ又はマウスなどの動物を免疫化し、抗原に対する宿主における免疫応答を引き出すことによって歴史的に行われてきた。複数ラウンドの免疫化後、血清を試験して、抗原に対する抗体力価を決定する。モノクローナル抗体については、数ラウンドの免疫化の終了時に、宿主脾臓からのＢ細胞集団を回収し、インビトロでクローン増殖させ、分泌された抗体を特性評価して、親和性を決定する。現代の方法は、動物を使用することなく、デノボ抗体発見のためのワークフローを提供する。こうした方法は、抗原に結合することができる抗体又は抗体断片の大規模で多様なライブラリーを創出し、ライブラリーをスクリーニングし、後続ラウンドのインビトロでの「成熟」のために最も高い親和性のメンバーを特定して、より高い結合親和性のバリアントを得ることに依存する。インビトロのデノボ抗体発見に一般的に使用されるライブラリーフォーマットにより、典型的には、（１）一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）、（２）Ｆａｂ、又は（３）ナノボディなどの抗体断片が産生される。抗体断片は、典型的には、バクテリオファージ表面コート上で発現（提示）されるか、又は抗体断片のサブセットについては、表面提示技術を使用して融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ表面上に発現され得る。ファージ又はＥ．ｃｏｌｉ表面提示ライブラリーは、ファージ又はＥ．ｃｏｌｉの固体支持表面への親和性捕捉のための抗原を使用する複数ラウンドの対抗選択／選択に供される。洗浄して、固体支持表面に固定化された最も高い親和性の抗体断片を有するファージ又はＥ．ｃｏｌｉのサブセットを富化した後、結合したファージ又はＥ．ｃｏｌｉを溶出させ、分析して、結合親和性を決定する。

【0003】

現在の方法論には、以下を含むいくつかの問題がある：（１）抗体断片のライブラリーは、ファージディスプレイ又はＥ．ｃｏｌｉ表面提示のいずれかを使用しなければならない（細胞内／細胞質抗体断片をスクリーニングすることができない）こと、（２）こうした実体をスクリーニングのために提示できないため、選択を完全抗体分子（ｍＡｂ）に対して修正できないこと、（３）配列決定及び結合親和性の測定が各単離されたクローンについて別々に決定される最後のステップまで、最良の結合親和性を有するサブセットを表すライブラリー中のファージ又はＥ．ｃｏｌｉの独立したクローンの数を決定することができないこと、（４）現在の方法論では、回収された各クローンの親和性を独立して測定する最後の最後まで、抗体断片ライブラリーがいずれかの適度から高い結合親和性のクローン（解離定数７０Ｋｄ未満）を含むかどうかを決定することができないこと。

【0004】

本開示は、これらのニーズに対処し、好適プローブによる任意の微生物発現ライブラリーをスクリーニングするために適用することができる。

【発明の概要】

【0005】

一実施形態では、本開示は、目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞を特定する方法を提供し、該方法には、（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、宿主細胞を、成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｂ）少なくとも１つの複製プレートを調製し、該複製プレートを、宿主細胞成長及び遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）宿主細胞を、（ｂ）の少なくとも１つの複製プレートから膜に移動させるステップと、（ｄ）（ｃ）で膜に移動させた宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）任意選択で、宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、宿主細胞を、宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、（ｅ）透過化した宿主細胞を、少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物複合体を形成するステップと、（ｆ）宿主細胞を、目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞を特定することを可能にする条件下で撮像するステップと、が更に含まれる。別の実施形態では、ステップ（ｃ）には、少なくとも１つの複製プレート及び膜をマーキングして、少なくとも１つの複製プレート及び膜の空間的整列を可能にすることが更に含まれる。

【0006】

更に他の実施形態では、宿主細胞が、真核細胞、原核細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞からなる群から選択される、前述の方法が提供される。更に他の実施形態では、目的の遺伝子産物が、治療用タンパク質、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｔ細胞受容体、及びキメラ抗原受容体、又はそれらの断片からなる群から選択される、前述の方法が提供される。一実施形態では、目的の遺伝子産物は、細胞内タンパク質である。

【0007】

なお他の実施形態では、宿主細胞の集団が、およそ１，０００～およそ１０億個の宿主細胞を含む、前述の方法が提供される。他の実施形態では、宿主細胞の集団は、遺伝子産物を発現構築物から産生するように修飾されている。一実施形態では、発現構築物は、２つ以上の誘導性プロモーターを含む。更に別の実施形態では、少なくとも１つの誘導性プロモーターは、プロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターは、Ｌ－アラビノース誘導性プロモーターである。

【0008】

本開示はまた、いくつかの実施形態では、宿主細胞が、（ａ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質のためのトランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の改変、（ｂ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｃ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｄ）宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす遺伝子の改変された遺伝子機能、（ｅ）レダクターゼをコードする遺伝子の遺伝子機能の低減したレベル、（ｆ）少なくとも１つのジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの発現構築物、（ｇ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／又は（ｈ）Ｅｒｖｌｐをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、のうちの１つ以上を含むように遺伝子修飾されている、前述の方法も提供する。

【0009】

更に他の実施形態では、２、３、４、５つ以上の複製プレートが調製される、前述の方法が提供される。一実施形態では、複製プレートは、抗生物質と、目的の遺伝子産物の発現の少なくとも１つの誘導物質とを含む。更に他の実施形態では、膜は、ニトロセルロース膜及びＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜からなる群から選択される。他の実施形態では、ステップ（ｃ）の複製プレート及び膜を、着色された物質と接触させる。一実施形態では、着色された物質は、アクリル塗料及び染料からなる群から選択される。別の実施形態では、着色された物質を、針及びペンからなる群から選択される器具でプレート及び膜と接触させる。

【0010】

他の実施形態では、細胞成分の固定化を可能にする条件が、膜をグルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドのうちの１つ以上を含む組成物と接触させることを含む、前述の方法が提供される。他の実施形態では、宿主細胞の透過化を可能にする条件は、膜をリゾチーム及びＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む組成物と接触させることを含む。

【0011】

更に他の実施形態では、少なくとも１つのプローブが、抗体又はその機能的断片、核酸結合タンパク質又はその機能的断片、受容体又はその機能的断片、リガンド又はその機能的断片、及び抗原又はその機能的断片、並びに目的の遺伝子産物によって結合することができるペプチド又はポリペプチドからなる群から選択される、前述の方法が提供される。一実施形態では、プローブは、ビオチン、ヒスチジンタグ、Ｆｃタグ、ｓｐｙタグ、Ｓｔｒｐタグ、及びＡｖｉタグからなる群から選択されるレポーター部分を含む。

【0012】

本開示はまた、いくつかの実施形態では、２、３、４、５つ以上の複製プレートを調製したときに、複製プレートから調製した各膜を、異なる濃度のプローブ溶液と接触させる、前述の方法も提供する。更に他の実施形態では、撮像が、膜を、レポーター部分の活性化因子を含む組成物と接触させることを含む、前述の方法が提供される。別の実施形態では、膜を、レポーター部分の活性化因子を含む組成物と接触させることは、１回、２回、又は３回以上繰り返される。更に別の実施形態では、活性化因子は、アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ、及びストレプトアビジンアルカリホスファターゼデキストランポリマーからなる群から選択される。

【0013】

更に他の実施形態では、撮像に、化学発光、Ｘ線撮影、蛍光、及び比色分析からなる群から選択される方法が含まれる、前述の方法が提供される。更に他の実施形態では、目的の遺伝子産物を産生することができると特定された１つ以上の宿主細胞を再度プレーティングするステップを更に含む、前述のものが提供される。別の実施形態では、再度プレーティングされた宿主細胞は、宿主細胞が目的の遺伝子産物を産生する能力、及び／又は目的の遺伝子産物を産生することができると特定された他の宿主細胞株から宿主細胞株を単離する能力を確認するために、請求項１に記載の方法に供される。いくつかの実施形態では、本方法は、プローブ－遺伝子産物複合体の親和性を決定することを更に含んでもよい。

【0014】

本開示は、一実施形態では、宿主細胞を、目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞の集団からスクリーニングする方法も提供し、該方法には、（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、宿主細胞を、成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｂ）少なくとも１つの複製プレートを調製し、該複製プレートを、宿主細胞成長及び遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）宿主細胞を、（ｂ）の少なくとも１つの複製プレートから膜に移動させるステップと、（ｄ）（ｃ）で膜に移動させた宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、宿主細胞を、宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、（ｅ）透過化した宿主細胞を、少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物複合体を形成するステップと、（ｆ）宿主細胞を、目的の遺伝子産物を産生する宿主細胞を特定することを可能にする条件下で撮像するステップと、が含まれる。

【0015】

なお別の実施形態では、本開示は、プローブ－目的の遺伝子産物の相対的親和性を決定する方法を提供し、該方法には、（ａ）１つ以上の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む宿主細胞の集団を成長基質上にプレーティングし、宿主細胞を、成長基質上の宿主細胞成長を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｂ）少なくとも３つの複製プレートを調製し、該複製プレートを、宿主細胞成長及び遺伝子産物の産生を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）宿主細胞を、（ｂ）の少なくとも３つの複製プレートから別個の膜に移動させるステップと、（ｄ）（ｃ）で膜に移動させた宿主細胞をプロービングのために調製するステップであって、（ｉ）宿主細胞を、細胞構成要素の固定化を可能にする条件下で固定すること、（ｉｉ）宿主細胞を遮断すること、及び（ｉｉｉ）任意選択で、宿主細胞を、宿主細胞の透過化を可能にする条件下で溶解させること、を含む、調製するステップと、（ｅ）少なくとも３つの複製膜上の透過化した宿主細胞を、少なくとも１つのプローブを含むプローブ溶液と、少なくとも１つのプローブと目的の遺伝子産物との結合を可能にする条件下で接触させ、それによって、プローブ－遺伝子産物複合体を形成するステップであって、プローブ溶液が異なるプローブ濃度を含む、形成するステップと、（ｆ）宿主細胞を、プローブ－目的の遺伝子産物の相対的親和性を決定することを可能にする条件下で撮像するステップと、が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】固相スクリーニングのワークフローを示す。

【図2】正のスポットを正確に重ね合わせることができるため、良好なシグナル忠実度が２つの複製膜で得られたことを示す。左の複製膜を高（５．０ｎＭ）、右の複製膜を低（０．５ｎＭ、右）濃度の抗原（Ｈｅｒ２）でプローブした。元のソースプレート上には約１０，０００個のコロニーがあり、細胞質によって発現されたＶＨＨ抗体断片ライブラリーを表す。

【図3】固相アッセイにより、３つのＦａｂバリアントが、３濃度（５．０、０．５、０．０５ｎＭ）Ｈｅｒ２結合応答を使用して、Ｈｅｒ２結合親和性により正しくランク付けされたことを示す。４つのＥ．ｃｏｌｉ株及びＨｅｒ２結合親和性（Ｋｄ）は、（１）野生型トラスツズマブＦａｂ（ｐＬ０５９７、０．５ｎＭ ｋｄ）、（２）Ｆａｂバリアント＃１（ｐＬ２８３７、６８ｎＭ Ｋｄ）、（３）Ｆａｂバリアント＃２（ｐＬ２９２１、２９８ｎＭ Ｋｄ）、及び（４）陰性対照である。

【図4】固相アッセイにより特定された「ヒット」が効率的に回収され得ることを示す。細胞質により発現されたＶＨＨライブラリーを表す約１０，０００個のＥ ｃｏｌｉコロニーを含む画像化ソースプレート（左）から特定された２４個の推定ヒットのうち、高（５．０ｎＭ、中央）及び低（０．５ｎＭ、右）濃度の抗原（Ｈｅｒ２）でプローブした複製膜からの画像化シグナルによって判断して、２２個のヒットが回収された。回収効率は９２％（２２／２４）である。

【図5】高密度プレーティング（１億個の細胞）での固相アッセイにより特定された「ヒット」が効率的に回収され得ることを示す。左上及び下の膜の２つの画像は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現細胞表面ＶＨＨの高密度（１億個）プレーティングであるソースプレートに由来する。右（線の上）の膜の画像は、１６個のパッチのクラスターを表し、各パッチは、左下ソースプレートの画像から特定された推定ヒット（明るいスポット）に由来する。線の下にある右の膜の画像は、２４個のパッチのクラスターを表し、各パッチは、左上ソースプレートの画像から特定された推定ヒット（明るいスポット）に由来する。高密度プレーティングからの全体的な回収効率は７０％（２８／４０）である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示の実施形態は、目的の遺伝子産物を産生する数十億個の細胞の集団から宿主細胞（単数又は複数）を特定するための組成物及び方法を提供する。同様に、本方法は、細胞の集団、細胞のコロニー、細胞株、及び細胞クローンの特定も提供する。例示的な細胞を本明細書に記載する。

【0018】

本明細書に記載するように、一実施形態では、本開示は、細胞表面上又は細胞内のいずれかに、完全なｍＡｂ又は抗体断片のいずれかを発現するＥ．ｃｏｌｉライブラリーの全メンバーについての結合親和性をランク付けする。記載するワークフローは、単一の１０ｃｍ寒天プレート上の１億個の独立したクローンについての結合親和性をランク付けするために試験した。このようにして、本開示は、単一の１０ｃｍ寒天プレート上で１０億個超のＥ．ｃｏｌｉをランク付けすることができる。このため、本開示により、Ｅ．ｃｏｌｉ抗体又は抗体断片ライブラリーを評価して、第１のステップで合理的な結合親和性のサブセット（解離定数７０ｎＭ Ｋｄ未満）が存在するかどうかを決定することができる。合理的な結合親和性のクローンが特定されると、本ワークフローにより、こうしたクローンを純粋な株として回収することができるようになる。

【0019】

本明細書に提供される方法及びワークフローを使用して、相対的親和性を計算することができる。相対的親和性は、本明細書で使用される場合、プローブの用量応答滴定から得られたシグナルの比較を意味する。

【0020】

本明細書に提供される方法には、例えば成長基質上の、プレーティングステップが含まれる。例えば細菌細胞成長のための成長基質は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、成長基質は、（例えば、１０ｃｍ皿などのペトリ皿中の）寒天である。当該技術分野で日常的に実施されるように、成長条件には、任意選択で抗生物質選択が含まれてもよい。このため、このようにして、本方法は、選択可能なマーカーを含む発現構築物を使用し得る。更に、宿主細胞の成長を可能にする条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、約３７℃又は約３０℃でのインキュベーションを含む。本明細書に記載するように、各（元の）プレートは、数百、数千、数百万、又は数十億の細胞を含んでもよい。

【0021】

本明細書に記載するように、本方法は、１つ以上の複製プレートを使用してもよい。当然のことながら、本方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の複製プレートを使用してもよい。本明細書に記載するように、複数の複製プレートを使用する１つの利点は、細胞によって産生される目的の遺伝子産物についての相対的親和性値又はランク付けを決定する能力である（例えば、本明細書に記載するように、撮像前に様々な濃度のプローブを使用することによる）。複製プレートは、周知の技法に従って調製することができる。一実施形態では、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜などの膜が使用される。

【0022】

非常に高いプレーティング密度（例えば、１億個超の細胞）では、細胞の大部分又は全てが膜の持ち上げによって除去される可能性がある。こうした場合、ヒットは、インタクトであった（膜上に持ち上げられていない）複製から回収され得る。

【0023】

Ｄａｈｌｒｏｔｈ，Ｓ－Ｌ．，ｅｔ ａｌ． （Ｄａｈｌｒｏｔｈ，Ｓ－Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１（１）２５３－２５８（２００６））に記載されているように、産生された可溶性標的タンパク質の量によってＥ．ｃｏｌｉ株を評価及び回収する、膜ベースのスクリーニング方法が概説される。この方法は、大規模な（１億～１０億超の）メンバーの抗体又は抗体断片ライブラリーを評価及び回収し、所与の抗原に結合するサブセットを相対的親和性によってランク付けするには十分に好適ではない。既知の技法とは異なり、本開示は、単一の１０ｃｍ寒天プレート中のソースプレートの（１）高密度（１０億個超の細胞）プレーティング、（２）ソースプレートを複製プレーティングして、同一の娘プレートを生成すること、（３）様々な濃度のプローブの存在下での娘プレートの用量反応、（４）特定されたヒットの回収を可能にするために、正確な位置マーカーを寒天及び膜に埋め込むこと、並びに（５）ヒット株が十分に分離されていないコロニーではない場合、ワークフローの繰り返しサイクルを行って、純粋な株を得ること、を提供する。

【0024】

一実施形態では、元のプレート及び／又は複製プレートと膜とは、空間的整列を可能にし、ヒットの回収に役立つように、マーク付けされる。本方法はまた、ヒットを一切回収せずに、大規模なライブラリーの診断（ヒットの数及び各ヒットの親和性）としても有用である。ヒットの回収が所望されない場合、マーク付けは不要である。マーク付けが所望される場合、アクリル塗料又はインク及びリンクなどの任意の着色された基質が企図される。更に、任意の染料（蛍光、又はオートラジオグラフィーなどによって可視若しくは追跡可能であるもの）を使用して、寒天をマークすることができる。理想的には、染料は、寒天中に拡散せず、経時的に信号を低減させるものであり得る。何らかの細胞が後で持ち上げ中に膜に移され得る蛍光又は着色されたＥ．ｃｏｌｉで寒天をマークすることも、本明細書で企図される。このように、Ｅ ｃｏｌｉは寒天プレート上で成長して元に戻り、目視検査による寒天への膜の整列を可能にする。

【0025】

膜の処理は、目的の遺伝子産物（例えば、組換え抗体又は抗体断片）の細胞位置に左右され得る。表面提示又は細胞壁繋留発現の場合、理論上、溶解も固定化も必要ない。細胞内又は細胞質の発現には、固定化（組換えタンパク質の喪失を防止するため）及び溶解（プローブアクセスを可能にするため）が必要とされ得る。遮断も、本明細書に記載されるワークフローの一部として行われ得る。本明細書に記載の遮断ステップにより、バックグラウンドノイズが低減される。膜とＥ．ｃｏｌｉ自体との両方が、非特異的な様式でプローブに結合することになる。細胞の透過化も、本明細書に記載されるように実施され得る。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物は、表面提示であっても、細胞壁に繋留された分泌された産物であっても、外膜でポーリンを通過することができる小さなプローブに結合することができる分泌された産物であってもよい。こうした実施形態では、透過化は必要ではない場合がある。

【0026】

本開示は、いくつかの実施形態では、細胞成分の固定化を可能にする条件を含み、膜を、例えばグルタルアルデヒド又はパラホルムアルデヒドを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。追加の細胞透過性架橋剤が当該技術分野で周知である（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの架橋剤選択ツールを参照）。本開示はまた、いくつかの実施形態では、膜を、リゾチーム及びＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む組成物と接触させることにより、宿主細胞の透過化を可能にする条件を含む方法も提供する。細胞を溶解させるための他の薬剤は、当該技術分野で周知である。

【0027】

本明細書に記載するように、目的の遺伝子産物を十分に産生する「ヒット」又は細胞又は株を可視化するために、プローブを使用する。いくつかの実施形態では、プローブは、レポーター部分を含む。例えば、Ｆｃタグ、ｓｐｙタグ、Ｓｔｒｐタグ、及びＡｖｉタグが各々既知であり、本明細書で企図される。一実施形態では、化学発光により結合したプローブを検出するために、ビオチン／ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼが使用される。本明細書に記載されるワークフローでは、プローブが発色団又はレポーター酵素で直接標識されることが更に企図される。シグナル増幅も本明細書で企図される。任意の多価部分を増幅に使用することができる。当該技術分野における一例は、共有コンジュゲートしたビオチンの倍数が高いウシ血清アルブミンを使用する。これにより、多くのストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ部分が補充される。あるいは、ビオチン化抗体を使用することができ、これも本明細書で企図される。

【0028】

細胞
本明細書に記載の発現構築物のうちの１つ以上を含む細胞が、本開示の様々な実施形態で企図される。本開示の細胞は、外膜（例えば、タンパク質及び脂質で構成される）を含み、この外膜内で、本明細書に記載の融合タンパク質が、発現されると、相互作用し得るか又は別様に存在し得る。

【0029】

原核生物宿主細胞。本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質を含む遺伝子産物の発現のために設計された発現構築物は、原核生物宿主細胞などの宿主細胞において提供される。原核生物宿主細胞には、古細菌（例えばハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ））、グラム陽性細菌（例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブチネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ））、又はアルファプロテオバクテリア（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚ-ｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、ベータプロテオバクテリア（アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、及びガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ-ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））を含むグラム陰性細菌、が含まれ得る。好ましい宿主細胞は、腸内細菌科ファミリーのガンマプロテオバクテリア、例えばエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌類（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）を含む）、及び赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などが含まれる。

【0030】

真核生物宿主細胞。多くの追加の種類の宿主細胞を本開示の発現系に使用することができ、これらには、真核細胞、例えば酵母（カンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、他のクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏ-ｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）としても公知であるサッカロマイセス パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、デッケラ／ブレタノマイセス（Ｄｅｋｋｅｒａ／Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）など；他の真菌類（アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ））；昆虫細胞株（キイロショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞及びスポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞）；並びに哺乳動物細胞株、不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ，２９３、又はＨＥＫ－２９３）細胞、及びヒト肝細胞がん細胞（Ｈｅｐ Ｇ２））が含まれる。上記の宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。

【0031】

参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１７／１０６５８３に記載されているように、商業的規模及び可溶性形態で治療用タンパク質などの遺伝子産物を産生させることは、発酵培養において高い細胞密度で成長することができ、高度に制御された誘導性遺伝子発現をとおして酸化宿主細胞細胞質中で可溶性遺伝子産物を産生することができる好適な宿主細胞を提供することによって対処される。これら品質を伴う本開示の宿主細胞は、以下の特徴のうちの一部又は全てを組み合わせることにより産生される。（１）宿主細胞は、細胞質中の酸化ポリペプチドの発現若しくは機能を増加させることをとおして、及び／又は細胞質中の還元ポリペプチドの発現若しくは機能を減少させることにより、酸化細胞質を有するように遺伝子修飾される。こうした遺伝子改変の具体的な例が本明細書に提供される。任意選択で、宿主細胞はまた、所望の遺伝子産物の産生を補助するシャペロン及び／若しくは補因子を発現するように、並びに／又はポリペプチド遺伝子産物をグリコシル化するように、遺伝子修飾することができる。（２）宿主細胞は、１つ以上の目的の遺伝子産物の発現のために設計された１つ以上の発現構築物を含み、ある特定の実施形態では、少なくとも１つの発現構築物は、誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターから発現される遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドとを含む。（３）宿主細胞は、発現構築物からの遺伝子産物発現のある特定の態様を改善するように設計された追加の遺伝子修飾を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、（Ａ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導因子についてのトランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の改変を有し、別の例として、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＥ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択され、若しくは特にａｒａＥであり、又はより具体的には、遺伝子機能の改変が、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現であり、並びに／あるいは（Ｂ）少なくとも１つの該誘導性プロモーターの誘導因子を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低下レベルを有し、かつ更なる例として、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導因子を代謝するタンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択され、並びに／あるいは（Ｃ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導因子の生合成において含まれるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低下レベルを有し、該遺伝子は、更なる実施形態では、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択される。

【0032】

酸化細胞質を有する宿主細胞。本開示の発現系は、遺伝子産物を発現するように設計され、本開示のある特定の実施形態では、遺伝子産物は、宿主細胞中で発現される。多量体産物の構成要素を含む遺伝子産物の効率的かつ費用効果の高い発現を可能にする宿主細胞の例が提供される。宿主細胞は、培養中の単離細胞に加えて、多細胞生物の一部である細胞、又は異なる生物若しくは生物系内で成長した細胞を含み得る。本開示のある特定の実施形態では、宿主細胞は、微生物細胞、例えば、酵母（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）など）など、若しくは細菌細胞であるか、又はグラム陽性細菌若しくはグラム陰性細菌であるか、又はＥ．ｃｏｌｉであるか、又はＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株であるか、又はＥ．ｃｏｌｉ（Ｂ株）ＥＢ０００１細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞とも呼ばれる）であるか、又はＥ．ｃｏｌｉ（Ｂ株）ＥＢ０００２細胞である。酸化細胞質を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２８Ｈ）及びＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２９Ｈ）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ株のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２６Ｈ）を用いた成長実験では、酸化細胞質を有するこれらのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株は、最も密接に対応するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ株（ＷＯ／２０１７／１０６５８３）よりもはるかに高い細胞密度まで成長することができる。

【0033】

宿主細胞遺伝子機能に対する改変。誘導性発現構築物を含む宿主細胞の遺伝子機能にある特定の改変を行い、誘導物質による宿主細胞集団の効率的かつ均一な誘導を促進することができる。好ましくは、発現構築物、宿主細胞遺伝子型、及び誘導条件の組み合わせにより、ＷＯ／２０１７／１０６５８３の実施例９に記載されるＫｈｌｅｂｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．の方法によって測定して、誘導されたプロモーター各々に由来する遺伝子産物を発現する培養中の細胞の少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％）が得られる。Ｅ．ｃｏｌｉ以外の宿主細胞については、これらの改変には、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子と構造的に類似した遺伝子の機能、又はＥ．ｃｏｌｉ遺伝子の機能に類似した宿主細胞内での機能を実行する遺伝子が伴い得る。宿主細胞遺伝子機能に対する改変には、遺伝子タンパク質をコードする配列全体を欠失させること、又は遺伝子の十分に大きい部分を欠失させること、遺伝子内に配列を挿入すること、又は別様に、遺伝子配列を、低減されたレベルの機能性遺伝子産物がその遺伝子から作製されるように改変することによって、遺伝子機能を排除する又は低減させることが含まれる。また、宿主細胞遺伝子機能に対する改変には、例えば、天然プロモーターを改変して、遺伝子の転写レベルを上昇させるより強いプロモーターを創出すること、又はより活性の高い遺伝子産物をもたらすタンパク質コード配列にミスセンス変異を導入することによって、遺伝子機能を増加させることを含む。宿主細胞遺伝子機能に対する改変には、例えば、天然誘導性プロモーターを改変して、構成的に活性化されるプロモーターを創出することを含む、任意の方法で遺伝子機能を改変することが含まれる。誘導性プロモーター、及び／又はシャペロンタンパク質の発現の改変に関して本明細書に記載されるように、誘導物質の輸送及び代謝のための遺伝子機能の改変に加えて、宿主細胞の還元酸化環境を改変することも可能である。

【0034】

宿主細胞還元酸化環境。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞では、ジスルフィド結合を必要とするタンパク質は、典型的には、ＤｓｂＡＢＣＤ及びＤｓｂＧを含むＤｓｂ系によってジスルフィド結合形成及び異性化が触媒される、ペリプラズムに輸送される。システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ、又はＤｓｂタンパク質の組み合わせは、通常それらの全てがペリプラズム中に輸送されるが、それらの発現を増加させることは、ジスルフィド結合を要する異種タンパク質の発現に利用されてきた（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。細胞質型ＤｓｂＡ及び／又はＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＡ」又は「ｃＤｓｂＣ」）などであるこれらＤｓｂタンパク質の細胞質形態を発現することも可能であり、これらはシグナルペプチドを欠くため、ペリプラズム中に輸送されない。ｃＤｓｂＡ及び／又はｃＤｓｂＣなどの細胞質Ｄｓｂタンパク質は、宿主細胞の細胞質をより酸化させるのに有用であり、よって、細胞質中で産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成により貢献する。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン酵素系及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接的に改変することにより、還元性を下げ、よって、酸化性を上げることができる。グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）又はグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）に欠損がある変異株が、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）と一緒になって、細胞質を酸化性にする。これらの株はリボヌクレオチドを低減させることができないため、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの外因性還元剤が存在しないと成長することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子ａｈｐＣにおけるサプレッサー変異（ａｈｐＣ＊及びａｈｐＣＡなど、Ｌｏｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１２ Ｍａｙ ８；１１：５６；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５－２８５９－１１－５６）は、それを、還元型グルタチオンを生成するジスルフィドレダクターゼに変換して、酵素リボヌクレオチドレダクターゼ上への電子のチャネリングを可能にし、ｇｏｒ及びｔｒｘＢに欠損がある細胞、又はｇｓｈＢ及びｔｒｘＢに欠損がある細胞が、ＤＴＴの非存在下で成長することを可能にする。異なるクラスの変異型のＡｈｐＣは、ガンマ－グルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性に欠損があり、ｔｒｘＢに欠損がある株が、ＤＴＴの非存在下で成長することを可能にすることができる。これらには、ＡｈｐＣ Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びＡｈｐＣ ｄｕｐ１６２～１６９が含まれる（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８ Ｍａｙ ６；１０５（１８）：６７３５－６７４０，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｙ ２）。酸化性細胞質を有するこうした株では、曝露されたタンパク質システインは、チオレドキシンによって触媒されるプロセスで、その生理学的機能の逆転において、容易に酸化され、ジスルフィド結合の形成をもたらす。酸化性細胞質の宿主細胞における酸化ストレス効果を低減するのに役立ち得る他のタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｋａｔＧによってコードされるＨＰＩ（ヒドロペルオキシダーゼＩ）カタラーゼペルオキシダーゼ、及びＥ．ｃｏｌｉ ｋａｔＥによってコードされるＨＰＩＩ（ヒドロペルオキシダーゼＩＩ）カタラーゼペルオキシダーゼであり、これらは、過酸化物を水及び０２に不均化させる（Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｋｏｇｏｍａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９１ Ｄｅｃ；５５（４）：５６１－５８５；Ｒｅｖｉｅｗ）。誘導された共発現をとおして又は構成的発現のレベルの上昇をとおして宿主細胞中のＫａｔＧ及び／又はＫａｔＥタンパク質のレベルを増加させることは、本開示のいくつかの実施形態の一態様である。

【0035】

宿主細胞に対して行うことができる別の改変は、宿主細胞細胞質中の酵母ミトコンドリアの内膜空間からスルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖｌｐを発現させることであり、これは、ｇｏｒ又はｔｒｘＢにおける変異が存在しなくても、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質における真核生物起源の様々な複合体ジスルフィド結合タンパク質の産生を増加させることが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｊａｎ ７；１０：１）。

【0036】

発現構築物を含む宿主細胞は、好ましくは、ｃＤｓｂＡ及び／又はｃＤｓｂＣ及び／又はＥｒｖｌｐも発現し、ｔｒｘＢ遺伝子機能が欠損しており、ｇｏｒ、ｇｓｈＢ、又はｇｓｈＡのいずれかの遺伝子機能も欠損しており、任意選択で、増加したレベルのｋａｔＧ及び／又はｋａｔＥ遺伝子機能のレベルが増加しており、宿主細胞がＤＴＴの非存在下で成長できるように、ＡｈｐＣの適切な変異体形態を発現する。

【0037】

シャペロン。いくつかの実施形態では、所望の遺伝子産物は、所望の遺伝子産物の産生に有益である、他の遺伝子産物、例えば、シャペロンと共発現される。シャペロンは、他の遺伝子産物のフォールディング若しくはアンフォールディング及び／又はアセンブリ若しくは分解を支援するが、結果として生じる単量体又は多量体遺伝子産物構造中に、その構造がそれらの通常の生物学的機能（フォールディング及び／又はアセンブリのプロセスを完了している）を行っているときには生じないタンパク質である。シャペロンは、発現構築物内の誘導性プロモーター若しくは構成的プロモーターから発現させることができる、又は宿主細胞染色体から発現させることができ、好ましくは、宿主細胞中のシャペロンタンパク質の発現は、所望の産物へと適当にフォールディングされる及び／又は組み立てられる、共発現された遺伝子産物を産生するのに十分に高いレベルにある。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するシャペロンの例は、フォールディング因子ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及びＦｋｐＡがあり、これらは、細胞質タンパク質又はペリプラズムタンパク質のタンパク質凝集を防止するために使用されてきた。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、及びＣｌｐＢは、タンパク質フォールディングを支援する際に相乗的に機能することができるため、組み合わせにおけるこれらのシャペロンの発現は、タンパク質発現のために有益であることが示されている（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。原核生物宿主細胞中で真核生物タンパク質を発現させる場合、同じ若しくは関連する真核生物種からのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）などの真核生物シャペロンタンパク質は、ある特定の実施形態では、所望の遺伝子産物とともに発現されるか、又は誘導により共発現される。

【0038】

宿主細胞中で発現させることができる１つのシャペロンは、土壌線菌綱（軟腐真菌）であるフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである。フミコラ・インソレンスＰＤＩのアミノ酸配列は、ＷＯ／２０１７／１０６５８３の配列番号１として示され、天然タンパク質のシグナルペプチドを欠くことで、宿主細胞質に残る。ＰＤＩをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のために最適化され、ＰＤＩの発現構築物は、ＷＯ／２０１７／１０６５８３の配列番号２として示される。配列番号２は、その５’末端にＧＣＴＡＧＣ Ｎｈｅｌ制限部位、ヌクレオチド７～１２にＡＧＧＡＧＧリボソーム結合部位、ヌクレオチド２１～１４７８にＰＤＩコード配列、及びその３’末端にＧＴＣＧＡＣ Ｓａｉｌ制限部位を含む。配列番号２のヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターなどのプロモーターのすぐ下流に挿入されるように設計した。配列番号２のＮｈｅｌ及びＳａｉｌ制限部位を使用して、これを、ベクター多重クローニング部位、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる公開された米国特許出願２０１５／３５３９４０（Ａ１）号に記載されるｐＳＯＬ発現ベクター（ＷＯ／２０１７／１０６５８３の配列番号３）のものに挿入することができる。他のＰＤＩポリペプチドも宿主細胞中で発現されることができ、これらには、様々な種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＰＩ ７９６７）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０７２３７）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０９１０３）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１７７７０及びＱ１７９６７）、Ａｒａｂｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０４８７７３、Ｑ９ＸＩ０１、Ｑ９Ｓ Ｇ３、Ｑ９ＬＪＵ２、Ｑ９ＭＡＵ６、Ｑ９４Ｆ０９、及びＱ９Ｔ０４２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１２７３０）由来のＰＤＩポリペプチド及びこうしたＰＤＩポリペプチドの修飾形態が含まれる。本開示のある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞中で発現されるＰＤＩポリペプチドは、ＷＯ／２０１７／１０６５８３の配列番号１の長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）にわたって、少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、アミノ酸配列同一性は、ＷＯ／２０１７／１０６５８３の実施例１０に従って決定される。

【0039】

補因子の細胞輸送。本開示の発現系を使用して、機能のために補因子を必要とする酵素を産生させる場合、利用可能な前駆体から補因子を合成すること又はそれを環境から取り込むことができる宿主細胞を使用することが有用である。一般的な補因子には、ＡＴＰ、コエンザイムＡ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、及びヘムが含まれる。補因子輸送ポリペプチド及び／又は補因子合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができ、こうしたポリペプチドは、構成的に発現させることも、本開示の方法によって産生される遺伝子産物とともに誘導的に共発現させることもできる。

【0040】

ポリペプチド遺伝子産物のグリコシル化。宿主細胞は、それらがポリペプチドをグリコシル化する能力に改変を有し得る。例えば、真核宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はオリゴ－サッカリルトランスフェラーゼ遺伝子における遺伝子機能が排除されるか又は低減してもよく、それにより、糖タンパク質を形成するためのポリペプチドの正常な真核性グリコシル化を損なう。通常はポリペプチドをグリコシル化しないＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主細胞を改変して、グリコシル化機能を提供する真核細胞遺伝子と原核細胞遺伝子とのセットを発現させることができる（ＤｅＬｉｓａ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００９０８９１５４Ａ２，２００９ Ｊｕｌ １６）。

【0041】

遺伝子機能が改変された利用可能な宿主細胞株。本開示の発現系及び方法で使用される宿主細胞の好ましい株を創出するために、所望の遺伝子改変を既に含む株から開始することが有用である（表Ａ、ＷＯ／２０１７／１０６５８３）。

【表1】

【0042】

遺伝子産物
本明細書に記載するように、１つ以上の目的の遺伝子産物を産生する細胞、細胞株、及び／又は株が提供される。本明細書に記載される遺伝子修飾された宿主細胞を含む細胞は、１つ以上の目的の遺伝子産物を発現してもよい。遺伝子産物としては、限定されないが、ｍＲＮＡなどの核酸、又はその任意のタンパク質若しくは断片、類似体若しくは誘導体を挙げることができる。本開示はまた、標的分子のための（標識された）結合パートナー（プローブ）が存在し、標的分子が細胞又は膜に固定化され得る（細胞表面上に発現されない場合）限り、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイを任意の標的分子（例えば、任意の組換えタンパク質又は任意の他の生体分子若しくは化学実体）に使用できることも提供する。

【0043】

タンパク質は、生物学的に活性な誘導体又はバリアント又は断片を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な誘導体」又は「生物学的に活性なバリアント」は、結合特性などの該分子の実質的に同じ機能的及び／若しくは生物学的特性、並びに／又はペプチド骨格若しくは塩基性ポリマー単位などの同じ構造的基盤を有する分子の任意の誘導体又はバリアントを含む。

【0044】

「バリアント」又は「誘導体」などの「類似体」は、構造が実質的に類似しており、天然に存在する分子と、ある特定の例では異なる程度ではあるが、同じ生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチドバリアントは、実質的に類似した構造を共有し、参照ポリペプチドと同じ生物学的活性を有するポリペプチドを指す。バリアント又は類似体は、（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端及び／若しくは天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域（例えば、断片）における１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端（典型的には、「付加」又は「融合」）及び／若しくは天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域（典型的には、「挿入」）における１つ以上のアミノ酸の挿入若しくは付加、又は（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列中の他のアミノ酸の１つ以上のアミノ酸の置換、を含む、１つ以上の変異に基づいて、類似体が由来する天然に存在するポリペプチドと比較して、それらのアミノ酸配列の組成物において異なる。一例として、「誘導体」は、類似体の一種であり、例えば、化学的に修飾された参照ポリペプチドと同じ又は実質的に類似した構造を共有するポリペプチドを指す。

【0045】

バリアントポリペプチドは、類似体ポリペプチドの一種であり、挿入バリアントを含み、１つ以上のアミノ酸残基が本開示の生体分子アミノ酸配列に付加される。挿入は、タンパク質のいずれかの末端に位置しても両方の末端に位置してもよく、かつ／又は治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられてもよい。いずれか又は両方の末端に追加の残基を有する挿入バリアントには、例えば、アミノ酸タグ又は他のアミノ酸標識を含む融合タンパク質及びタンパク質が含まれる。一態様では、生体分子は、特に分子がＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞中で組換え発現されるときに、Ｎ末端Ｍｅｔを任意選択で含む。別の態様では、生体分子は、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含む。

【0046】

欠失バリアントでは、本明細書に記載される生体分子ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、タンパク質ポリペプチドの一方又は両方の末端において、及び／又は治療用タンパク質アミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によって生じ得る。したがって、欠失バリアントは、タンパク質ポリペプチド配列の断片を含む。

【0047】

置換バリアントでは、生体分子の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置き換えられる。一態様では、これらの置換は本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は当該技術分野で周知である。代替的に、本開示は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１－７７］に記載されており、直下に示される。

【0048】

本明細書で企図されるタンパク質は、全長タンパク質、全長タンパク質の前駆体、全長タンパク質の生物学的に活性なサブユニット又は断片、並びにこれらの形態の治療用タンパク質のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体及びバリアントを含む。このため、タンパク質には、（１）参照核酸又は本明細書に記載のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドと、少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％超、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが含まれる。本開示によれば、「組換えタンパク質」という用語には、組換えＤＮＡ技術を介して得られたいずれのタンパク質も含まれる。ある特定の実施形態では、本用語は、本明細書に記載されるタンパク質を包含する。

【0049】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、又は他の糖タンパク質、バイオシミラー、Ｆｃ融合物、酵素、ワクチン、ホルモン、サイトカイン、若しくは成長因子である。更に他の実施形態では、遺伝子産物は、抗凝固剤、血液因子、骨形態形成タンパク質、インターロイキン、インターフェロン、血栓溶解剤、又は組換え手段によって産生される任意のタンパク質である。他の実施形態では、本方法は、本方法が、本明細書に記載される細胞によって産生され、結合ステップに使用できるプローブを有する、小分子を含む任意の生体分子又は化学実体とともに使用できることを提供する。

【0050】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、標的抗原上のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）相互作用する全抗体を指す。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖と２つの軽鎖（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。「抗体」という用語には、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、並びに上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであり得る。抗体又はエピトープ結合断片は、多重特異性分子であっても、その構成要素であってもよい。

【0051】

軽鎖と重鎖との両方は、構造的及び機能的相同性の領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は、機能上使用される。これに関して、軽（ＶＬ）鎖部分と重（ＶＨ）鎖部分との両方の可変ドメインにより、抗原認識及び特異性が決定されることが理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）の定常ドメインにより、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性が付与される。慣例により、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、定常領域はＣ末端にある。ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインは、それぞれ、実際には重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。

【0052】

「抗体断片」という語句は、本明細書で使用される場合、標的エピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。結合断片の例としては、限定されないが、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１からなる一価断片であるＦａｂ断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらを、組換え方法を使用して、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることを可能にする合成リンカーによって接合することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。こうした一本鎖抗体はまた、「抗体断片」という用語内にも包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技法を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。

【0053】

本開示は、いくつかの実施形態では、任意選択のリンカー、例えば、可動性リンカー配列を２つのタンパク質成分の間に含む融合タンパク質も提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、５未満、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、又は５０未満のアミノ酸長である。一実施形態では、リンカーは、２３のアミノ酸長である。リンカーは、様々な実施形態では、可動性、剛性、又は切断可能（例えば、ジスルフィド、プロテアーゼ感受性配列）であってもよい（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５（１）：１３５７－１３６９（２０１３））。リンカーは、天然由来のマルチドメインタンパク質に由来しても、経験的であってもよい（長さ、疎水性、アミノ酸残基、及び二次構造など、天然リンカーのいくつかの特性を独立して比較している、Ａｒｇｏｓ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１１：９４３－９５８（１９９０）、及びＨｅｒｉｎｇａ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１５：８７１－８７９（２００２）を参照されたい）。トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リジン（Ｌｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、及びアラニン（Ａｌａ）が、いくつかの実施形態では、アルギニン（Ａｒｇ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）と同様に、好ましいリンカー成分である。概して、好ましいアミノ酸は、極性非荷電残基又は荷電残基である。天然リンカーは、それらの機能を発揮するために、らせん状、β鎖、コイル／屈曲、及び回旋などの様々な二次構造をとる。

【0054】

発現構築物
本開示のいくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、発現構築物とともに使用することが企図される。例示的なプロモーターは、本明細書に記載され、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１６／２０５５７０にも記載されている。本明細書に記載されるように、１つ以上の発現構築物を含む細胞は、任意選択で、目的の遺伝子産物を発現するために１つ以上の誘導性プロモーターを含んでもよい。一実施形態では、遺伝子産物は、本明細書に記載される融合タンパク質である。他の実施形態では、遺伝子産物は、タンパク質、例えば、治療用タンパク質である。

【0055】

発現構築物。発現構築物は、１つ以上の目的の遺伝子産物の発現のために設計されたポリヌクレオチドであるため、天然に存在する分子ではない。発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込むこと、又は宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子、例えば、プラスミド若しくは人工染色体として宿主細胞内に維持することができる。発現構築物の例は、宿主細胞染色体中への１つ以上のポリヌクレオチド配列の挿入から得られるポリヌクレオチドであり、挿入されたポリヌクレオチド配列は、染色体コード配列の発現を改変する。発現ベクターは、１つ以上の遺伝子産物の発現のために特に使用されるプラスミド発現構築物である。１つ以上の発現構築物は、宿主細胞染色体中に組み込むこと、又は染色体外ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド若しくは人工染色体上に維持することができる。以下は、本明細書に記載される融合タンパク質を含む遺伝子産物の発現又は共発現のための発現構築物で使用され得る特定のタイプのポリヌクレオチド配列の説明である。

【0056】

複製起点。発現構築物は、独立して複製するポリヌクレオチドとして宿主細胞内に維持されるために、レプリコンとも呼ばれる複製起点を含む必要がある。同じ複製機序を使用する異なるレプリコンは、繰り返しの細胞分裂をとおして単一の宿主細胞において一緒に維持することはできない。その結果、プラスミドは、ＷＯ／２０１６／２０５５７０の表２に示されるように、それらが含む複製起点に応じて、不適合性群に分類することができる。複製起点は、他の基準のなかでも特に、不適合性群、コピー数、及び／又は宿主範囲に基づいて、発現構築物における使用のために選択され得る。上記のように、２つ以上の異なる発現構築物が、複数の遺伝子産物の共発現のために同じ宿主細胞で使用される場合、異なる発現構築物は、例えば、ある発現構築物中のｐＭＢｌレプリコン及び別の発現構築物中のｐｌ５Ａレプリコンという異なる不適合性群からの複製起点を含むことが最良である。宿主染色体分子の数に対する細胞中の発現構築物の平均コピー数は、その発現構築物中に含まれる複製起点によって決定される。コピー数は、細胞当たりいくつかのコピーから数百まで様々であり得る（ＷＯ／２０１６／２０５５７０の表２）。本開示の一実施形態では、同じ誘導物質によって活性化される誘導性プロモーターを含むが、異なる複製起点を有する、異なる発現構築物が使用される。異なる発現構築物の各々を細胞においてある特定のおよそのコピー数で維持する複製起点を選択することによって、ある発現構築物から発現される遺伝子産物の全体的な産生のレベルを、異なる発現構築物から発現される別の遺伝子産物に対して調整することが可能である。一例として、多量体タンパク質のサブユニットＡ及びＢを共発現させるために、ｃｏｌＥｌレプリコン、ａｍプロモーター、及びａｍプロモーターから発現されるサブユニットＡのコード配列を含む発現構築物「ｃｏｌＥｌ－Ｐａｒａ－Ａ」を創出する。

【0057】

ｐｌ ５Ａレプリコン、ａｍプロモーター、及びサブユニットＢのコード配列を含む別の発現構築物「ｐｌ５Ａ－Ｐａｒａ－Ｂ」を創出する。これらの２つの発現構築物は、同じ宿主細胞中で一緒に維持することができ、サブユニットＡとサブユニットＢとの両方の発現は、１つの誘導物質であるアラビノースを成長培地に加えることによって誘導される。サブユニットＡの発現レベルをサブユニットＢの発現レベルに対して有意に増加させる必要がある場合、２つのサブユニットの発現量の化学量論比を所望の比に近づけるために、例えば、ｐＵＣ９プラスミド（「ｐＵＣ９ｏｒｉ」）の複製起点に見られるように修飾されたｐＭＢ １を有する、サブユニットＡのための新しい発現構築物ｐＵＣ９ｏｒｉ－Ｐａｒａ－Ａを創出し得る。ｐＵＣ９ｏｒｉ－Ｐａｒａ－Ａなどの高コピー数発現構築物からサブユニットＡを発現させることで、産生されるサブユニットＡの量が、ｐｌ５Ａ－Ｐａｒａ－ＢからのサブユニットＢの発現に対して増加するはずである。同様にして、ｐＳＯＯｌ（ＷＯ／２０１６／２０５５７０）などのより低いコピー数で発現構築物を維持する複製起点を使用することで、その構築物から発現される遺伝子産物の全体的なレベルが低減し得る。複製起点の選択により、どの宿主細胞がそのレプリコンを含む発現構築物を維持できるかが決定され得る。例えば、ｃｏｌＥｌ複製起点を含む発現構築物は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科内の種である利用可能な宿主の範囲が比較的狭いが、ＲＫ２レプリコンを含む発現構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中に維持することができ、発現構築物がＲＫ２レプリコン及びＲＫ２プラスミド由来のいくつかの調節因子遺伝子を含む場合、これは、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓほど多様な宿主中に維持することができる（Ｋｉｉｅｓ ａｎｄ Ｓｔａｈｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９８９ Ｄｅｃ；５３（４）：４９１－５１６）。

【0058】

真核細胞における誘導性発現又は共発現のための発現構築物を創出するために、類似の考慮事項を用いることができる。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２ミクロンの環状プラスミドは、ｐＳＲｌ（ＡＴＣＣ寄託番号４８２３３及び６６０６９、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９８５ Ｍａｒ ２０；１８２（２）：１９１－２０３）及びｐＫＤｌ（ＡＴＣＣ寄託番号３７５１９、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８６ Ｊｕｎ １１；１４（１１）：４４７１－４４８１）などの他の酵母株由来のプラスミドと適合性がある。

【0059】

選択可能なマーカー。発現構築物は、選択培養培地中の宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を通常含む。選択遺伝子を含む発現構築物を含まない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質若しくは他の毒素に対する耐性を付与するか、又は宿主細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質をコードする。選択スキームの一例は、抗生物質などの薬物を利用して、宿主細胞の成長を停止させる。選択可能なマーカーを含む発現構築物を含む細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、選択レジメンを生き延びる。選択可能なマーカーの選択に一般的に使用される抗生物質のいくつかの例（及び抗生物質耐性表現型を提供する遺伝子を示す略語）は、アンピシリン（ＡｍｐＲ）、クロラムフェニコール（ＣｍｌＲ又はＣｍＲ）、カナマイシン（ＫａｎＲ）、スペクチノマイシン（ＳｐｃＲ）、ストレプトマイシン（ＳｔｒＲ）、及びテトラサイクリン（ＴｅｔＲ）である。ＷＯ／２０１６／２０５５７０の表２にあるプラスミドの多くは、ｐＢＲ３２２（ＡｍｐＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＭＯＢ４５（ＣｍＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＡＣＹＣｌＷ（ＡｍｐＲ、ＫａｎＲ）、及びｐＧＢＭｌ（ＳｐｃＲ、ＳｔｒＲ）などの選択可能なマーカーを含む。選択遺伝子の天然プロモーター領域が、通常、その遺伝子産物のコード配列とともに、発現構築物の選択可能なマーカー部分の一部として含まれる。あるいは、選択遺伝子のコード配列は、構成的プロモーターから発現され得る。

【0060】

様々な態様において、好適な選択可能なマーカーには、限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ ＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）、ゼオシン、フレオマイシンブレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）の変異型、ブロモキシニルニトリラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）、エノールピルビルシキメート－３－ホスフェート（ＥＰＳＰ）シンターゼ（ａｒｏ Ａ）、筋特異的チロシンキナーゼ受容体分子（ＭｕＳＫ－Ｒ）、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ１）、メタロチオネイン（ｃｕｐ１、ＭＴ１）、ベータ－ラクタマーゼ（ＢＬＡ）、ピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ（ｐａｃ）、ブラストサイジンアセチルトランスフェラーゼ（ｂｌｓ）、ブラストサイジンデアミナーゼ（ｂｓｒ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）、Ｎ－スクシニル－５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンターゼ（ａｄｅ１）、アルギニノコハク酸分解酵素（ａｒｇ４）、ベータ－イソプロピルマレイン酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕ２）、インベルターゼ（ｓｕｃ２）、オロチジン－５’－ホスファターゼ（ＯＭＰ）、デカルボキシラーゼ（ｕｒａ３）、及び前述のうちのいずれかのオルソログが含まれる。

【0061】

誘導性プロモーター。本明細書に記載するように、本開示の誘導性共発現系の一部として発現構築物中に含めることができる異なる誘導性プロモーターはいくつかある。好ましい誘導性プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ゲノム配列を参照してＷＯ／２０１６／２０５５７０の表１に定義されるように、プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも３０（より好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは少なくとも５０）個の連続塩基に対して、少なくとも８０％のポリヌクレオチド配列同一性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性）を共有し、ここで、ポリヌクレオチド配列同一性の率は、ＷＯ／２０１６／２０５５７０の実施例１１の方法を使用して決定される。「標準的な」誘導条件（ＷＯ／２０１６／２０５５７０の実施例５参照）下で、好ましい誘導性プロモーターは、Ｄｅ Ｍｅｙ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ／２０１６／２０５５７０の実施例６）の定量的ＰＣＲ法を使用して決定して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５の対応する「野生型」誘導性プロモーターの少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも１１０％）の強度を有する。発現構築物内で、誘導性プロモーターは、誘導により発現される遺伝子産物のためのコード配列に対して５’（又は「その上流」）に配置され、その結果、誘導性プロモーターの存在により、遺伝子産物コード配列の転写が、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して５’から３’方向に方向付けられることとなる。

【0062】

リボソーム結合部位。ポリペプチド遺伝子産物について、誘導により発現させようとする遺伝子産物のコード配列の転写開始部位と開始コドンとの間の領域のヌクレオチド配列は、ポリペプチド遺伝子産物のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に相当する。好ましくは、５’ＵＴに対応する発現構築物の領域は、宿主細胞の種に見られるコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列とも呼ばれる）と類似したヌクレオチド配列を含む。原核生物（古細菌及び細菌）では、ＲＢＳコンセンサス配列はＧＧＡＧＧ又はＧＧＡＧＧＵであり、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌では、ＲＢＳコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧ又はＡＧＧＡＧＧＵである。ＲＢＳは、典型的には、開始コドンから５～１０個の介在ヌクレオチドだけ分離している。発現構築物では、ＲＢＳ配列は、ＡＧＧＡＧＧＵコンセンサス配列と、好ましくは少なくとも５５％同一、より好ましくは少なくとも７０％同一、最も好ましくは少なくとも８５％同一であり、開始コドンから、５～１０個の介在ヌクレオチド、より好ましくは６～９個の介在ヌクレオチド、最も好ましくは６又は７個の介在ヌクレオチドだけ分離している。所与のＲＢＳが所望の翻訳開始速度を生む能力は、ＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを使用してウェブサイトｓａｌｉｓ．ｐｓｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＲＢＳＬｉｂｒａｒｙＣａｌｃｕｌａｔｏｒＳｅａｒｃｈＭｏｄｅで計算することができ、同じツールを使用して、合成ＲＢＳを、１００，０００倍以上の範囲にわたって翻訳速度について最適化することができる（Ｓａｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０１１；４９８：１９－４２）。

【0063】

複数のクローニング部位。ポリリンカーとも呼ばれる複数のクローニング部位（ＭＣＳ）は、互いに近接又は重複して複数の制限部位を含むポリヌクレオチドである。ＭＣＳの制限部位は、典型的には、ＭＣＳ配列内で一回発生し、好ましくは、プラスミド又は他のポリヌクレオチド構築物の残りの部分内では発生せず、それにより、制限酵素がＭＣＳ内でのみプラスミド又は他のポリヌクレオチド構築物を切断できるようにする。ＭＣＳ配列の例は、ｐＢＡＤ１８、ｐＢＡＤ１８－Ｃｍ、ｐＢＡＤ１８－Ｋａｎ、ｐＢＡＤ２４、ｐＢＡＤ２８、ｐＢＡＤ３０、及びｐＢＡＤ３３を含む、発現ベクターのｐＢＡＤシリーズ中のもの（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９５ Ｊｕｌ；１７７（１４）：４１２１－４１３０）、又はｐＰＲ０１８、ｐＰＲ０１８－Ｃｍ、ｐＰＲ０１８－Ｋａｎ、ｐＰＲ０２４、ｐＰＲＯ３０、及びｐＰＲ０３３などのｐＢＡＤベクターに由来する発現ベクターのｐＰＲＯシリーズ中のもの（米国特許第８１７８３３８ Ｂ２号；２０１２年５月１５日；Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊａｙ）である。複数のクローニング部位を発現構築物の創出に使用することができる。複数のクローニング部位をプロモーター配列の３’（又は下流）に配置することにより、ＭＣＳを使用して、発現又は共発現させる遺伝子産物のコード配列を、構築物中に、コード配列の転写が生じるようにプロモーターに対して適当な場所で挿入することができる。ＭＣＳ内で切断するためにどの制限酵素が使用されるかに応じて、コード配列又は他のポリヌクレオチド配列が発現構築物中に挿入された後で、発現構築物内にＭＣＳ配列の一部が残ることがある。いずれの残りのＭＣＳ配列も、挿入された配列の上流にあることも、下流にあることも、両側にあることもできる。リボソーム結合部位は、ＭＣＳの上流に配置することができ、好ましくは、ＭＣＳにすぐ隣接するか、又はＭＣＳから数ヌクレオチドのみ分離していることができ、その場合、ＲＢＳは、ＭＣＳに挿入される任意のコード配列の上流にある。別の代替は、ＭＣＳ内にリボソーム結合部位を含めることであり、この場合、ＭＣＳ内で切断するために使用される制限酵素の選択により、ＲＢＳが保持されているかどうか、及び挿入された配列に対してどのような関係であるかが決定される。更なる代替は、ＭＣＳで発現構築物に挿入されるポリヌクレオチド配列内に、好ましくは転写メッセンジャーＲＮＡからの翻訳の開始を刺激するためのいずれかのコード配列と適当な関係で、ＲＢＳを含めることである。

【0064】

構成的プロモーターからの発現。本開示の発現構築物は、構成的プロモーターから発現されるコード配列も含むことができる。誘導性プロモーターとは異なり、構成的プロモーターは、ほとんどの成長条件下で連続的な遺伝子産物の産生を開始する。構成的プロモーターの一例は、ベータ－ラクタマーゼをコードし、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３１３４４）、ｐＡＣＹＣｌＷ（ＡＴＣＣ ３７０３１）、及びｐＢＡＤ２４（ＡＴＣＣ ８７３９９）を含む多くのプラスミドによって宿主細胞に付与されるアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）表現型に関与するＴｎ３ ｂｌａ遺伝子の構成的プロモーターである。発現構築物で使用され得る別の構成的プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５の１７５５７３１～１７５５４０６位（プラス鎖）に位置するＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質遺伝子Ｉｐｐのプロモーターである（Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８５ Ｍａｙ １０；１３（９）：３１０１－３１１０）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種遺伝子発現に使用されている構成的プロモーターの更なる例は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５の１３２１１６９～１３２１１３３位（マイナス鎖）に位置するｔｒｐＬＥＤＣＢＡプロモーターである（Ｗｉｎｄａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８２ Ｎｏｖ １１；１０（２１）：６６３９－６６５７）。構成的プロモーターは、本明細書に記載される選択可能なマーカーの発現、及び所望の産物の共発現に有用な他の遺伝子産物の構成的発現のために、発現構築物で使用することができる。例えば、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ、及びＸｙｌＲなどの誘導性プロモーターの転写調節因子は、双方向性誘導性プロモーターから発現されない場合、代替的に、それらが調節する誘導性プロモーターと同じ発現構築物、又は異なる発現構築物のいずれかにおいて、構成的プロモーターから発現され得る。同様に、ＰｒｐＥＣ、ＡｒａＥ、若しくはＲｈａなどの誘導物質の産生又は輸送に有用な遺伝子産物、又は細胞の還元酸化環境を修正するタンパク質は、数例として、発現構築物内の構成的プロモーターから発現され得る。共発現された遺伝子産物、及び結果として得られる所望の産物の産生に有用な遺伝子産物には、シャペロンタンパク質、補因子トランスポーターなども含まれる。

【0065】

シグナルペプチド。本開示の方法によって発現又は共発現されるポリペプチド遺伝子産物は、こうした遺伝子産物が、宿主細胞細胞質からペリプラズム内に輸出されることが望ましいか、細胞質内に保持されることが望ましいかに応じて、それぞれ、シグナルペプチドを含むことも、それらを欠くこともできる。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列、又はリーダーペプチドとも称される）は、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する、およそ５～２０アミノ酸長、多くの場合、約１０～１５アミノ酸長の疎水性アミノ酸の伸長を構造的な特徴とする。この疎水性伸長では、正荷電アミノ酸（特にリジン）に富むより短い伸長が直前に先行することが多い。成熟ポリペプチドから切断されるシグナルペプチドは、典型的には、シグナルペプチダーゼにより認識されて切断されるアミノ酸の伸長で終わる。シグナルペプチドは、ポリペプチドを、翻訳と同時に又は翻訳後のいずれかで、原核生物の細胞膜（又はＥ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌の内膜）をとおして又は真核細胞の小胞体中に輸送することを指揮する能力を機能的な特徴とする。シグナルペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細胞のペリプラズム空間中にポリペプチドを輸送することを可能にする程度は、例えば、ＷＯ／２０１６／２０５５７０の実施例１２に記載されている方法などの方法を使用して、ペリプラズムタンパク質を、細胞質中に保持されるタンパク質から分離させることにより決定することができる。

【0066】

以下は、遺伝子産物の発現又は共発現のための発現構築物で使用することができる誘導性プロモーター、並びにこうした発現構築物を含む宿主細胞に行うことができる遺伝子修飾のうちのいくつかの説明である。これらの誘導性プロモーター及び関連遺伝子の例は、別途指定のない限り、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＡＴＣＣ ７００９２６）に由来するものであり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＡＴＣＣ １０７９８）の亜株である。ＷＯ／２０１６／２０５５７０の表１は、誘導性プロモーター及び関連遺伝子のこれらの例のヌクレオチド配列の、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５におけるゲノム位置を列挙する。ヌクレオチド及び他の遺伝子配列は、ＷＯ／２０１６／２０５５７０の表１中のゲノム位置により参照され、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書に記載されるＥ．ｃｏｌｉプロモーター、遺伝子、及び株に関する追加情報は、ｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔのオンラインＥｃｏｌｉＷｉｋｉリソースを含む、多くの公開リソースにおいて見出すことができる。

【0067】

アラビノースプロモーター。（本明細書中で使用される場合、「アラビノース」はＬ－アラビノースを意味する。）アラビノース利用に関与するいくつかのＥ．ｃｏｌｉオペロンは、アラビノース（ａｒａＢＡＤ、ａｒａＣ、ａｒｃｉＥ、及びａｒａＦＧＨ）により誘導可能であるが、典型的には、「アラビノースプロモーター」及び「ａｒａプロモーター」という用語が、ａｒａＢＡＤプロモーターを指定するために使用される。Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＢＡＤ、及びＰＢＡＤなどのいくつかの追加の用語が、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤプロモーターを示すために使用されている。「ａｒａプロモーター」又は上記の代替用語のうちのいずれかの使用は、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤプロモーターを意味する。別の用語である「ａｒａＣ－ａｒａＢＡＤプロモーター」の使用から分かるように、ａｒａＢＡＤプロモーターは双方向性プロモーターの一部とみなされ、ａｒａＢＡＤプロモーターは、一方の方向にａｒａＢＡＤオペロンの発現を制御するものであり、ａｒａＢＡＤプロモーターに近接しａｒａＢＡＤプロモーターと反対の鎖上にあるａｒａＣプロモーターは、他方の方向にａｒａＣコード配列の発現を制御するものである。ＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーターの正と負との両方の転写調節因子である。アラビノースの非存在下で、ＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの転写を抑制するが、アラビノースの存在下では、アラビノース結合時にその立体構造を改変するＡｒａＣタンパク質は、ＰＢＡＤからの転写を可能にする正の調節要素となる。ａｒａＢＡＤオペロンは、Ｌ－アラビノースを、それを中間体Ｌ－リブロース及びＬ－リブロース－ホスフェートをとおしてＤ－キシルロース－５－ホスフェートに変換することにより代謝するタンパク質をコードする。アラビノース誘導性プロモーターからの発現の誘導を最大化する目的で、Ｌ－リブロースへのＬ－アラビノースの変換を触媒するＡｒａＡの機能を除去する又は低減させること、並びに任意選択で、ＡｒａＢ及びＡｒａＤのうちの少なくとも一方の機能も除去する又は低減させることが有用である。細胞中のアラビノースの有効濃度を減少させる宿主細胞の能力を除去する又は低減させることで、アラビノースを他の糖に変換する細胞の能力を除去する又は低減させることにより、より多くのアラビノースをアラビノース誘導性プロモーターの誘導のために利用可能にすることができるようになる。宿主細胞中にアラビノースを移動させるトランスポーターをコードする遺伝子は、低親和性Ｌ－アラビノースプロトンシンポーターをコードするａｒａＥ、及びＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｌ－アラビノーストランスポーターのサブユニットをコードするａｒａＦＧＨオペロンである。Ｌ－アラビノースを細胞中に輸送することができる他のタンパク質は、ＬａｃＹラクトースパーミアーゼのある特定の変異体：それぞれ位置１７７でアラニンの代わりにシステイン又はバリンアミノ酸を有するＬａｃＹ（ＡｌＷＣ）及びＬａｃＹ（ＡｌＷＶ）タンパク質である（Ｍｏｒｇａｎ－Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２ Ｍａｙ ２８；９９（１１）：７３７３－７３７７）。アラビノース誘導性プロモーターの均一な誘導を達成するために、細胞中へのアラビノースの輸送をアラビノースによる調節とは独立したものにすることが有用である。これは、ＡｒａＦＧＨトランスポータータンパク質の活性を除去するか又は低減させ、ａｒａＥの発現を、それが構成的プロモーターからのみ転写されるように改変することにより達成することができる。ａｒａＥの構成的発現は、天然ａｒａＥ遺伝子の機能を除去するか又は低減させ、構成的プロモーターから発現されたＡｒａＥタンパク質のコード配列を含む発現構築物を細胞中に導入することにより達成することができる。あるいは、ＡｒａＦＧＨ機能を欠く細胞中では、宿主細胞の染色体ａｒａＥ遺伝子の発現を制御するプロモーターを、アラビノース誘導性プロモーターから構成的プロモーターに変化させることができる。類似の様式で、アラビノース誘導性プロモーターの均一な誘導のための更なる代替として、ＡｒａＥ機能を欠く宿主細胞は、構成的プロモーターから発現された細胞中に存在する任意の機能的ＡｒａＦＧＨコード配列を有することができる。別の代替として、天然ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨプロモーターを、宿主染色体中の構成的プロモーターで置換することにより、構成的プロモーターからａｒａＥ遺伝子及びａｒａＦＧＨオペロンの両方を発現させることが可能である。また、ＡｒａＥ及びＡｒａＦＧＨアラビノーストランスポーターの両方の活性を除去するか又は低減させ、その状況において、このタンパク質がアラビノースを輸送することを可能にするＬａｃＹラクトースパーミアーゼ中の変異を使用することも可能である。ｌａｃＹ遺伝子の発現は、通常、アラビノースにより調節されないため、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）又はＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）などのＬａｃＹ変異体を使用しても、アラビノース誘導性プロモーターがアラビノースの存在により誘導される場合、「全か無か」の誘導現象は生じない。ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質は、アラビノースを細胞中に輸送する際により効果的であるように見えるため、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用は、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用よりも好ましい。

【0068】

プロピオネートプロモーター。「プロピオネートプロモーター」又は「ｐｒｐプロモーター」は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｒｐＢＣＤＥオペロンのプロモーターであり、ΡΡΦΒとも呼ばれる。ａｒａプロモーターと同様に、ｐｒｐプロモーターは双方向性プロモーターの一部であり、一方の方向でｐｒｐＢＣＤＥオペロンの発現を制御し、ｐｒｐＲプロモーターが他方の方向でｐｒｐＲコード配列の発現を制御する。ＰｒｐＲタンパク質は、ｐｒｐプロモーターの転写調節因子であって、ＰｒｐＲタンパク質が２－メチルシトレート（「２－ＭＣ」）に結合するとき、ｐｒｐプロモーターからの転写を活性化する。プロピオネート（プロパノエートとも呼ばれる）は、プロピオン酸（又は「プロパン酸」）のイオンＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ－であり、このクラスの分子のある特定の特性を共有する一般式

【化1】

を有する「脂肪」酸のうちで最も小さく、水から塩析されたときに油性層を生み出し、石鹸状のカリウム塩を有する。市販のプロピオネートは、概して、プロピオン酸の一価カチオン塩、例えば、プロピオン酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＮａ）として、又は二価カチオン塩、例えば、プロピオン酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ）２）として販売される。プロピオネートは膜透過性であり、ＰｒｐＥ（プロピオニル－ＣｏＡシンテターゼ）によるプロピオニル－ＣｏＡへのプロピオネートの変換、及びその後のＰｒｐＣ（２－メチルシトレートシンターゼ）による２－ＭＣへのプロピオニル－ＣｏＡの変換により、２－ＭＣに代謝される。ｐｒｐＢＣＤＥオペロンによりコードされる他のタンパク質であるＰｒｐＤ（２－メチルシトレートデヒドラターゼ）及びＰｒｐＢ（２－メチルイソシトレートリアーゼ）は、ピルベート及びサクシネートなどのより小さな産物への２－ＭＣの更なる異化に関与する。したがって、細胞成長培地に加えられたプロピオネートによるプロピオネート誘導性プロモーターの誘導を最大化するために、プロピオネートを２－ＭＣに変換するために、ＰｒｐＣ及びＰｒｐＥ活性を伴うが、２－ＭＣが代謝されることを防ぐために、除去された又は低減したＰｒｐＤ活性、及び任意選択で除去された又は低減したＰｒｐＢ活性も有する宿主細胞を有することが望ましい。２－ＭＣ生合成に関与するタンパク質をコードする別のオペロンは、ｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣオペロンであり、これは、ｓｂｍ－ｙｇ／ＤＧＨオペロンとも呼ばれる。これらの遺伝子は、プロピオニル－ＣｏＡへのサクシネートの変換のために必要とされるタンパク質をコードし、これが次に、ＰｒｐＣにより２－ＭＣに変換され得る。これらのタンパク質の機能の除去又は低減によって、２－ＭＣ誘導物質の産生のための平行経路が除去され、したがって、プロピオネート誘導性プロモーターの発現のバックグラウンドレベルが低減し、外因的に供給されたプロピオネートに対するプロピオネート誘導性プロモーターの感受性が増加し得る。ＪＳＢ株を創出するためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入されたｓｂｍ－ｙｇｆＤ－ｙｇｆＧ－ｙｇｆＨ－ｙｇｆｌの欠失（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，「Ａ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５ Ｎｏｖ；７１（１１）：６８５６－６８６２）が、外因的に供給された誘導物質の非存在下でバックグラウンド発現を低減させることに有用であったが、この欠失によって、ＪＳＢ株におけるｐｒｐプロモーターからの全体的な発現も低減したことが見出された。しかしながら、欠失ｓｂｍ－ｙｇｆＤ－ｙｇｆＧ－ｙｇｆＨ－ｙｇｆｌはまた、機能が分かっていない推定ＬｙｓＲファミリー転写調節因子をコードするｙｇｆｌに影響を及ぼすように見受けられることに留意されたい。遺伝子ｓｂｍ－ｙｇ／ＤＧＨは１つのオペロンとして転写され、ｙｇｆｌは反対の鎖から転写される。ｙｇｆｔｉ及びｙｇｆｌコード配列の３’末端は、少数の塩基対だけ重複するため、ｓｂｍ－ｙｇ／ＤＧＨオペロンの全てを取り除く欠失によって、ｙｇｆｌコード機能も取り除かれるようである。ｙｇｆｌの発現に影響しないようにｙｇｆｌｉ（又はｓｃｐＣ）遺伝子の３’末端を十分に残しながら、ｓｂｍ－ｙｇｆＤＧＨ遺伝子産物のサブセット、例えば、ＹｇｆＧ（ＳｃｐＢ、メチルマロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼとも呼ばれる）の機能を除去する若しくは低減させる、又はｓｂｍ－ｙｇ／ＤＧＨ（又はｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ）オペロンの大部分を欠失させることは、誘導された発現の最大レベルを低減させることなく、プロピオネート誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を十分に低減させるのに十分であり得る。

【0069】

ラムノースプロモーター。（本明細書中で使用される場合、「ラムノース」はＬ－ラムノースを意味する。）「ラムノースプロモーター」又は「ｒｈａプロモーター」又はＰｒｈａＳＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｈａＳＲオペロンのプロモーターである。ａｒａ及びｐｒｐプロモーターと同様に、ｒｈａプロモーターは、双方向性プロモーターの一部であり、一方の方向でｒｈａＳＲオペロンの発現を制御し、ｒｈａＢＡＤプロモーターが他方の方向でｒｈａＢＡＤオペロンの発現を制御する。しかしながら、ｒｈａプロモーターは、発現の調節に関与する２つの転写調節因子 ＲｈａＲ及びＲｈａＳを有する。ＲｈａＲタンパク質は、ラムノースの存在下でｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化させる一方、ＲｈａＳタンパク質は、Ｌ－ラムノースの異化オペロン及び輸送オペロンであるｒｈａＢＡＤ及びｒｈａＴの発現をそれぞれ活性化する（Ｗｉｃｋｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０１０ Ｊａｎ；１９２（１）：２２５－２３２）。ＲｈａＳタンパク質は、ｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化することもできるが、実際には、ＲｈａＳは、環状ＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）がＲｈａＲとともに発現をはるかに高いレベルに共活性化する能力を妨害することによって、この発現を負に自己調節する。ｒｈａＢＡＤオペロンは、Ｌ－ラムノースをＬ－ラムヌロースに変換するラムノース異化タンパク質ＲｈａＡ（Ｌ－ラムノースイソメラーゼ）、Ｌ－ラムヌロースをリン酸化してＬ－ラムヌロース－１－Ｐを形成するＲｈａＢ（ラムヌロキナーゼ）、並びにＬ－ラムヌロース－１－ＰをＬ－ラクトアルデヒド及びＤＨＡＰ（ジヒドロキシアセトンホスフェート）に変換するＲｈａＤ（ラムヌロース－１－ホスフェートアルドラーゼ）をコードする。ラムノース誘導性プロモーターからの発現の誘導に利用可能な細胞中のラムノースの量を最大化するために、ＲｈａＡ、又は任意選択でＲｈａＡ並びにＲｈａＢ及びＲｈａＤの少なくとも一方の機能を排除する又は低減させることにより、触媒により分解されるラムノースの量を低減させることが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞はまた、ｒｍｌＢＤＡＣＸ（又はｒｆｂＢＤＡＣＸ）オペロンによりコードされるタンパク質ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及びＲｍｌＤ（それぞれ、ＲｆｂＡ、ＲｆｂＢ、ＲｆｂＣ、及びＲｆｂＤとも呼ばれる）の活性をとおして、アルファ－Ｄ－グルコース－１－ＰからＬ－ラムノースを合成することができる。ラムノース誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を低減させ、外因性に供給されるラムノースによるラムノース誘導性プロモーターの誘導の感受性を増強するために、ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及び

【0070】

ＲｍｌＤタンパク質のうちの１つ以上の機能を排除する又は低減させることが有用であり得る。Ｌ－ラムノースは、ＲｈａＴ、ラムノース透過酵素、又はＬ－ラムノース：プロトンシンポーターにより、細胞中に輸送される。上記のように、ＲｈａＴの発現は、転写調節因子ＲｈａＳによって活性化される。ＲｈａＴの発現を、ラムノースによる誘導（ＲｈａＳの発現を誘導する）から独立させるために、宿主細胞を、細胞中の全ての機能的ＲｈａＴコード配列が構成的プロモーターから発現されるように改変することができる。加えて、機能的ＲｈａＳが産生されなくなるように、ＲｈａＳのコード配列を欠失させるか又は不活化することができる。細胞中のＲｈａＳの機能を排除する又は低減させることにより、ｒｈａＳＲプロモーターからの発現のレベルが、ＲｈａＳによる負の自己調節の欠如に起因して増加し、ラムノース触媒オペロンｒｈａＢＡＤの発現のレベルが減少し、ｒｈａプロモーターから発現を誘導するラムノースの能力が更に増加する。

【0071】

キシロースプロモーター。（本明細書中で使用される場合、「キシロース」はＤ－キシロースを意味する。）キシロースプロモーター、又は「ｘｙｌプロモーター」、又はＰｘｙｉＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｘｙｌＡＢオペロンのためのプロモーターを意味する。キシロースプロモーター領域は、ｘｙｌＡＢオペロン及びｘｙｌＦＧＨＲオペロンの両方が、隣接するキシロース誘導性プロモーターから、Ｅ．ｃｏｌｉ上の反対方向に発現されるという点で、組織化において他の誘導性プロモーターと類似している（Ｓｏｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９７ Ｎｏｖ；１７９（２２）：７０２５－７０３２）。ＰｘｙｉＡ及びＰｘｙｉＦプロモーターの両方の転写レギュレーターは、キシロースの存在下でこれらのプロモーターの発現を活性化するＸｙｌＲである。ｘｙｌＲ遺伝子は、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンの一部として、又はｘｙｌＨタンパク質コード配列とｘｙｌＲタンパク質コード配列との間に位置するキシロースにより誘導されない、それ自体の弱いプロモーターから、発現される。Ｄ－キシロースは、ＸｙｌＡ（Ｄ－キシロースイソメラーゼ）により異化され、これがＤ－キシロースをＤ－キシルロースに変換し、これが次にＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）によってリン酸化されてＤ－キシルロース－５－Ｐを形成する。キシロース誘導性プロモーターからの発現の誘導に利用可能な細胞中のキシロースの量を最大化するために、少なくともＸｙｌＡの、又は任意選択でＸｙｌＡとＸｙｌＢとの両方の機能を除去する又は低減させることにより、触媒により分解されるキシロースの量を低減させることが望ましい。ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｄ－キシローストランスポーターのサブユニットであるＸｙｌＦ、ＸｙｌＧ、及びＸｙｌＨをコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ低親和性キシロース－プロトンシンポーターをコードするｘｙｌＥ遺伝子は、別個のオペロンを表し、その発現も、キシロースによって誘導可能である。キシローストランスポーターの発現を、キシロースによる誘導と独立したものにするために、全ての機能性キシローストランスポーターが構成的プロモーターから発現されるように、宿主細胞を改変することができる。例えば、ｘｙｌＦＧＨコード配列を欠失させて、ＸｙｌＲを、キシロース誘導性ＰｘｙｉＦプロモーターから発現される唯一の活性タンパク質とし、ｘｙｌＥコード配列を、その天然プロモーターではなく構成的プロモーターから発現させるように、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンを改変し得る。別の例として、ｘｙｌＲコード配列を、発現構築物中のＰｘｙｉＡ又はプロモーターから発現させ、一方でｘｙｌＦＧＨＲオペロンを欠失させ、ｘｙｌＥを構成的に発現させるか、あるいは代替的に、ｘｙｌＦＧＨオペロン（ｘｙｌＲコード配列を欠き、これは、それが発現構築物中に存在するからである）を構成的プロモーターから発現させ、ｘｙｌＥコード配列を欠失させるか又は改変して、活性タンパク質を産生しないようにする。

【0072】

ラクトースプロモーター。「ラクトースプロモーター」という用語は、ｌａｃＺＹＡオペロンについてのラクトース誘導性プロモーターを指し、これはｌａｃＺｐｌとも呼ばれるプロモーターである。このラクトースプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ ０００９１３．２、ｌ ｌ－ＪＡＮ－２０１２）中のおよそ３６５６０３～３６５５６８に位置する（マイナス鎖、ＮＡポリメラーゼ結合（「－３５」）部位がおよそ３６５６０３～３６５５９８にあり、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス（「－１０」）が３６５５７９～３６５５７３にあり、転写開始部位が３６５５６７にある）。いくつかの実施形態では、本開示の誘導性発現系は、ｌａｃＺＹＡプロモーターなどのラクトース誘導性プロモーターを含み得る。他の実施形態では、本開示の誘導性発現系は、ラクトース誘導性プロモーターではない、１つ以上の誘導性プロモーターを含む。

【0073】

アルカリホスファターゼプロモーター。「アルカリホスファターゼプロモーター」及び「ｐｈｏＡプロモーター」という用語は、ｐｈｏＡｐｓｉＦオペロンのプロモーターを指し、これは、ホスファターゼ飢餓条件下で誘導されるプロモーターである。ｐｈｏＡプロモーター領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ ０００９１３．３、１６－ＤＥＣ－２０１４）中のおよそ４０１６４７～４０１７４６（プラス鎖、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス（「－１０」）が４０１６９５～４０１７０１にある（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８１ Ｎｏｖ １１；９（２１）：５６７１－５６７８））に位置する。ｐｈｏＡプロモーターの転写活性化因子は、ＰｈｏＢであり、これは、センサータンパク質ＰｈｏＲとともに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて二成分シグナル伝達系を形成する転写調節物質である。ＰｈｏＢ及びＰｈｏＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ ０００９１３．３、１６－ＤＥＣ－２０１４）中のおよそ４１７０５０～４１９３００（プラス鎖、ＰｈｏＢコード配列が４１７，１４２～４１７，８３１にあり、ＰｈｏＲコード配列が４１７，８８９～４１９，１８４にある）に位置するｐｈｏＢＲオペロンから転写される。ｐｈｏＡプロモーターは、誘導物質を加えることではなく、物質（細胞内ホスフェート）の欠如により誘導されるという点で、上記の誘導性プロモーターとは異なる。この理由から、ｐｈｏＡプロモーターは、概して、宿主細胞がホスフェートについて枯渇する段階、例えば、発酵の後期段階で産生される遺伝子産物の転写を指揮するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示の誘導性共発現系は、ｐｈｏＡプロモーターを含み得る。他の実施形態では、本開示の誘導性共発現系は、ｐｈｏＡプロモーターではない、１つ以上の誘導性プロモーターを含む。

【0074】

本明細書に記載されるように、例えば、発現構築物を保有する細胞株が商業目的で使用される又は使用されることになる場合、本明細書に記載の発現構築物を（例えば、誘導性又は構成的「硬化」機序によって）除去することが有利又は望ましい場合がある。このため、いくつかの実施形態では、発現構築物は、「殺傷スイッチ」を含んでもよい。例えば、実施形態では、発現構築物は、温度感受性の複製起点を含む。追加の硬化方法は、当該技術分野で既知であり、界面活性剤及び挿入剤、薬物、並びに抗生物質の使用を含む（Ｂｕｃｋｎｅｒ，Ｍ．Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｆｕｙ０３１，４２，２０１８，７８１－８０４）。

【0075】

本開示を更に説明する前に、本開示が説明される特定の実施形態に限定されず、よって、当然のことながら変化し得ることが理解される。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解される。

【0076】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈により別途明確に示されない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値が、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれてもよく、また記載の範囲内の任意の具体的に除外された限界次第で、本開示内に包含される。記載の範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

【0077】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等のいずれの方法及び材料も、本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用される関連する方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。

【0078】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意すること。このため、例えば、「立体構造スイッチングプローブ」への言及には、複数のそのような立体構造スイッチングプローブが含まれ、「マイクロ流体デバイス」への言及には、当業者に既知の１つ以上のマイクロ流体デバイス及びその均等物への言及が含まれる（以降同様）。更に、特許請求の範囲は、いずれかの要素、例えば、いずれかの任意選択の要素を除外するように起草され得ることに留意されたい。このため、本記述は、特許請求要素の列挙に関連して「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などといった排他的用語の使用、又は「否定的な」制限の使用についての先行詞としての役割を果たすことを意図している。

【0079】

本開示を読むことで当業者には明らかとなるように、本明細書に説明及び図示される個々の実施形態の各々は、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離させるか、又はそれらと組み合わせることができる、別個の構成要素及び特徴を有する。いずれの列挙された方法も、列挙された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。これは、こうした全ての組み合わせに対する支持を提供することが意図されている。

【実施例】

【0080】

実施例１
高性能細菌株を特定するための高密度プレート上の固相スクリーニング
従来、スクリーニング方法は、目的のＤＮＡ配列を含むクローンのｃＤＮＡ、ゲノム、又は発現ライブラリーを表す１０ｃｍペトリ皿上にプレーティングされたＥ．ｃｏｌｉコロニーを評価する。プレートの複製は、分析のために犠牲にした２つのプレートのうちの一方を用いて作製する。Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを、ＰＶＤＦ又はニトロセルロース膜などの固体支持体上に移し、膜上の細胞を溶解させ、プローブを加えて、所望のクローンを特定する。Ｅ．ｃｏｌｉライブラリーを評価するためのプローブは、標識された核酸（ＤＮＡライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリー用）又は抗体（発現ライブラリー用）のいずれかである。従来、プローブは、オートラジオグラフィーによる特定を可能にするために放射性標識される。しかしながら、ビオチン標識されたプローブは、それぞれの化学発光基質を加水分解することによって、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼに共有結合したストレプトアビジンによる特定を可能にする。プローブに結合したコロニーを、膜を撮像することによって検出する。複製を使用して、所望のクローンを回収する。

【0081】

本開示及び実施例は、現行法の欠点に対処するために、以下の改善を行う：（１）ソースプレートの複数の複製を作製すること（典型的には３つ）、（２）時間ゼロでプレーティングした細胞数が１０ｃｍプレート当たり１０億個を超え得ること、（３）任意選択のシグナル増幅ステップを挿入して、高密度にプレーティングしたときの所望のクローンの特定、又は低親和性（解離定数約７０ｎＭ Ｋｄ）クローンの特定を可能にすること、（４）ワークフローが、特に密集してプレーティングされたライブラリーからの陽性クローンの明確な回復を可能にするために、寒天及び膜に位置上の目印を配置すること、並びに（５）ワークフローは、回収された株が、十分に単離された単一コロニーが存在しない密集してプレーティングされた寒天からのものである場合、追加のラウンドの反復スクリーニングを追加すること。

【0082】

以下に記載する実験を、（１）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ ＰＬ０５９７（Ｋｄ＝０．５ｎＭ）、（２）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＦａｂバリアントＰＬ２８３７（Ｋｄ＝７０ｎＭ）、及び（３）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＦａｂバリアントＰＬ２９２１（Ｋｄ＝２９８ｎＭ）を発現した３つのＥ ｃｏｌｉ株を用いて行った。３つの濃度用量応答は、３つの株の親和性を結合親和性（Ｋｄ）により正しくランク付けした：ＰＬ０５９７（０．５ｎＭ）＜ＰＬ２８３７（６８ｎＭ）＜ＰＬ２９２１（２９８ｎＭ）。加えて、ブランク対照株（ＡｂＳ０８０１９）は、低いバックグラウンドシグナルを示した。

【0083】

スクリーニングワークフロー全体を図１に示す。抗体断片（Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はナノボディなど）又は完全抗体のいずれかに対する多様なＥ．ｃｏｌｉ発現ライブラリーを、所望のプラスミドを維持するために、適切な抗生物質を含む単一の１０ｃｍ寒天プレート上にプレーティング時点で最大数十億個の細胞まで、理論的多様性の５～１０倍の倍数でプレーティングする。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。プレートを、誘導物質（抗体又は抗体断片の発現を誘導するため）と抗生物質との両方を含む寒天プレート上で複製する。複製の数は、ライブラリーのメンバーについての結合親和性を分類するためのビンの数に左右される。典型的には、ライブラリーメンバーを、低親和性、中親和性、及び高親和性の３つのビンに仕分けするために、３つの複製を作製する。ソースプレートの追加の複製を調製して、高親和性バリアントを更に分けてもよい。複製プレートを３０℃で一晩インキュベートする。翌日、ニトロセルロース膜ディスクを寒天プレート表面に適用する。フィルターが寒天プレート表面上にある間に、位置上の目印を、本明細書に記載される膜及び寒天の両方の上に作製する。微細針の先端をアクリル塗料に浸す。塗料でコーティングした針を使用して、膜フィルターを通過して寒天の中へと穿刺する。針を取り除くと、膜内の穿刺の正確な位置で寒天に塗料の堆積がなされ、フィルター内に穿刺マーク及び塗料が（空気に曝露した側に）残る。フィルターの縁の周りに５回以上の穿刺を行い、ヒット回収のために、寒天内の位置合わせのための５つの塗料スポットを残す。膜を寒天表面から持ち上げると、寒天表面上の細胞の大部分が取り除かれる。しかしながら、十分な数の細胞が寒天プレート表面上に残り、ヒットの回収を可能にする。ヒットの回収のための任意選択の方法は、ソースプレートの複製のうちの１つをヒット回収専用に確保することであり得る。膜フィルターを、寒天プレートに接触する側を上に向けてＷｈａｔｍａｎ紙ディスク上に数分間置き、塗料を乾燥させ、余分な塗料をワットマン紙にブロットする。続いて、濾過物を、グルタルアルデヒド及びパラホルムアルデヒドを含む固定溶液に浸漬して、細胞成分を固定化する。固定剤をＰＢＳで洗い流す。膜を遮断溶液（ＢＳＡを含む）に移し、穏やかに揺動させながら４℃で一晩インキュベートする。翌日、膜をリゾチーム／ＥＤＴＡを含む溶液に約５分間移して、細胞を透過化する。透過化した細胞をプローブに曝露させ、一晩インキュベートする。全面的な洗浄の後、膜をアルカリホスファターゼ基質とともに３分間インキュベートし、化学発光撮像装置によって撮像する。

【0084】

２つの複製を、約１０，０００コロニーのソースプレートから、誘導物質を含むプレート上に調製した。２つの複製寒天プレートから調製した膜を、５ｎＭ及び０．５ｎＭのビオチン標識したＨｅｒ２でプローブし、撮像した。２つの膜画像（図２）を比較して、これらの結論を導いた：（１）０．５ｎＭプローブと比較して５ｎＭプローブで処理された膜に、より多くの暗いスポット（ヒット）があり、（２）両方の膜上に現れるヒットは、同一の相対位置を有し、つまり、複製プレーティングは、元のソースプレート上のヒット株の位置を２つの娘複製に忠実に保持する。より低い濃度のプローブで処理した膜上のヒットは、最も高い親和性の抗体断片を産生する株である。３つの複製プレート実験（５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．０５ｎＭプローブにて）のために、ソースプレートの３つの複製を調製して、３つの濃度用量反応を得る。３複製プレート実験の１つのバージョンの結果を図３に提供する。この場合、Ｈｅｒ２結合Ｆａｂバリアントを発現した純粋な株を含むソースプレートを膜上に持ち上げ、これを次いで四分円に分割し、その後、これを異なる濃度のＨｅｒ２プローブで処理する。

【0085】

化学発光画像の透明度プリントアウトを最も高い親和性のヒットの回収に使用する。撮像装置により、加工した膜からの可視光画像及び化学発光画像の両方を捕捉した。膜内の穿刺の位置を、可視光画像により捕捉し、電子的に又は手動でのいずれかでフィルターの化学発光画像に移す。次いで、化学発光画像を、ソース寒天プレートからのヒットの手動回収のために透明材上に印刷する。この実施例で分かるように、２４個のヒットを手でピックアップすることからの回収の精度は９１．７％であった（２４個のヒットのうち２２個がパッチ付きヒットの分析によって確認された（図４）。

【0086】

回収されたヒットが、密集してプレーティングしたソースプレートから単離された場合に、純粋な株であることを確実にするために、十分に単離された単一コロニーを有するソースプレート上で、別のラウンドのスクリーニングを実施する。この実施例では、確認されたヒットをプールし、連続希釈される。各連続希釈のアリコートを個別にプレーティングして、プレーティング時に単一のコロニーを生成する希釈物が確実に覆われるようにする。疎らにプレーティングしたコロニーから特定されたヒットは、純粋な株として供給源から容易に回収することができる（図５）。

【0087】

予期されるシグナルが低い場合、シグナル増幅ステップが、アッセイ感度を改善するために必要となり得る：（１）高密度プレーティング、（２）低親和性抗体又は抗体断片、及び（３）（１）と（２）との両方の組み合わせ。この目的で、いくつかの公開済みプロトコルが文献に記載されている（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのビオチン化ＢＳＡ産物又はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのビオチン化抗ストレプトアビジン産物を参照）。１つのスキームは、単量体ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ又は高分子ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼデキストランのいずれかを有するビオチン化ウシ血清アルブミンを使用する。１又は２ラウンドのシグナル増幅が、超高密度プレーティング（１０ｃｍプレート当たり１０億個超の細胞）における低親和性（Ｋｄ約７０ｎＭ）抗体又は抗体断片を有するヒットの検出に十分であるはずである。

【0088】

本実施例（図５）は、高密度プレーティングした表面提示抗体断片ライブラリーでの固相スクリーニングの性能を示す。約１億個の細胞を単一の１０ｃｍ寒天プレートにプレーティングした。５ｎＭのＨｅｒ２－ビオチンを用い、シグナル増幅ステップなしでプローブした場合、陽性ヒットの撮像されたシグナルは非常に強力であり、陽性ヒットの検出が、単一の１０ｃｍプレート上の１０億個超の細胞のより高いプレーティング密度で可能であることを示す。

【0089】

上記のワークフロー（図１）の追加の例示的な実施形態及び詳細は、以下のとおり提供される。

【0090】

１． プレーティングライブラリー
ライブラリーを、最初に、いずれの誘導物質もなしでプレート上にプレーティングする。プレートは、所望のプラスミド又は遺伝的形質の維持を可能にするのに適切な抗生物質を含むべきである。

【0091】

細胞のライブラリーを室温の寒天プレート上に均等に広げる。３０℃で一晩（１６時間）インキュベートする。

【0092】

２． 複製プレーティング
適切な抗生物質と誘導物質との両方を含むＬＢ寒天プレート上の一晩おいたライブラリーの複製を適切な数で調製する。

【0093】

プレートを３０℃で一晩インキュベートする。

【表2】

【0094】

３． ニトロセルロース膜への細胞の移動
１つのニトロセルロース膜を、誘導された細胞を有する各寒天プレートに適用する。膜が、一切しわがない状態で寒天表面と均等に接触していることを確認する。

【0095】

Ｔピンの先端をアクリル塗料に浸し、縁部の膜／寒天を穿刺する。アクリル塗料を残してＴピンを取り除く。

【0096】

繰り返す。寒天をパラメータの周囲のおよそ５つの位置で穿刺する。

【0097】

４． 細胞の固定化
膜を固定溶液に移し、側部が上向きの寒天表面と接触するようにする。

【0098】

膜を室温で５～１０分間インキュベートする

【0099】

膜を１倍リン酸緩衝液生理食塩水で３回洗浄する。

【表3】

【0100】

５． 膜の遮断
膜を遮断溶液に移し、４Ｃで１６時間インキュベートする。

【表4】

【0101】

６． 溶解
膜を溶解緩衝液に移す。５～１０分間室温でインキュベートする

【0102】

膜を１倍ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ免疫アッセイ緩衝液中で３回洗浄する。

【表5】

【0103】

７． ビオチン遮断
膜をビオチン遮断緩衝液に移す。４Ｃで１～２時間インキュベートする。

【0104】

膜を１倍ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ免疫アッセイ緩衝液で洗浄する

【表6】

【0105】

８． プローブ
プローブ溶液を調製する。４Ｃで３～１６時間揺動させて溶液を混合する。

【0106】

プローブを膜に加える。揺動させながら４Ｃで一晩インキュベートする。

【0107】

プローブ（各膜には、約１５～２０ｍｌのプローブが必要である）

【表7】

【0108】

９． 洗浄
膜を洗浄緩衝液中で５回洗浄する。

【表8】

【0109】

１０． 撮像
フィルターを清潔な１０ｃｍペトリプレートに移す。２．５ｍｌの室温のアルカリホスファターゼ基質溶液を加える。膜全体を覆う。

【0110】

室温で３分間インキュベートする。

【0111】

余分な試薬を滴り落とす。

【0112】

膜を化学発光撮像装置内に置く。

【0113】

２分～５時間画像する。

【表9】

【表10】

【0114】

上記の様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書において言及される、及び／又はＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｈｅｅｔに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を用いて、なお更なる実施形態を提供するために、必要に応じて修正することができる。

【0115】

これら及びその他の変更は、上で詳述した説明を考慮して、実施形態に対して行うことができる。概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、こうした特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】