知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ エルエヌシーティーエーシー カンパニー リミテッドの特許一覧
特表2024-543744ｍｉＲＮＡ－２９１１分子の核酸安定化物質としての使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-25
(54)【発明の名称】ｍｉＲＮＡ－２９１１分子の核酸安定化物質としての使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20241118BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241118BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241118BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241118BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241118BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241118BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20241118BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/11 Z
A61K48/00
A61K31/713
A61K31/711
A61K31/7105
A61K47/56
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535407
(86)(22)【出願日】2022-12-13
(85)【翻訳文提出日】2024-08-06
(86)【国際出願番号】 CN2022138695
(87)【国際公開番号】W WO2023109814
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】202111523686.9
(32)【優先日】2021-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524045286
【氏名又は名称】エルエヌシーティーエーシー カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＮＣＴＡＣ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲暁▼霞
(72)【発明者】
【氏名】▲曾▼ 秒
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF65
4C084AA13
4C084NA03
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA03
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ｍｉＲＮＡ－２９１１分子の核酸安定化物質としての使用に関する。
【解決手段】 具体的には、対象核酸の安定性を向上させるｍｉＲＮＡ－２９１１分子の構造は、以下の式：ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）で示され、このうち、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、ｎは、０または１であり、並びにＬは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す。
【選択図】図１０
【解決手段】 具体的には、対象核酸の安定性を向上させるｍｉＲＮＡ－２９１１分子の構造は、以下の式：ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）で示され、このうち、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、ｎは、０または１であり、並びにＬは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す。
【選択図】図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の核酸配列を含む、対象核酸の安定性を向上させるｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｌは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す
【請求項2】
Ｌは、ＧＧＧＧＧを表す、請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項3】
以下の核酸配列を含む、請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧＸ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：３）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択される
【請求項4】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６は、同一であり、任意には、Ａ、Ｃ、若しくはＵであり、並びに／または、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ８は、同一であり、任意には、Ａ、Ｃ、若しくはＵである、
請求項１から３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項5】
配列番号：２および配列番号：４～１０のうちいずれか一つに示される配列である、請求項１から４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項6】
請求項１から５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子が、対象核酸の５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされている、
または、
対象核酸の内部に挿入されていることで、
安定性が向上された、保護された対象核酸。
【請求項7】
前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上、好ましくは、８～５０００ｎｔであり、好ましくは、前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオアッセイ用の核酸、または核酸医薬であり、
より好ましくは、前記対象核酸は、
（１） アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーを含むが、これらに限定されないオリゴヌクレオチド、
（２） 一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡであり、
前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡを含むが、これらに限定されない、
請求項６記載の保護された対象核酸。
【請求項8】
（１）治療有効量の請求項６または７記載の保護された対象核酸、および、（２）薬学的に受容可能な担体、
を含む医薬組成物。
【請求項9】
請求項１から５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子が、対象核酸の５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされている、
または、
対象核酸の内部に挿入されている、
対象核酸の安定性の向上方法。
【請求項10】
前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上、好ましくは、８～５０００ｎｔであり、好ましくは、前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオエッセイ用の核酸、または核酸医薬であり、
より好ましくは、前記対象核酸は、
（１） アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーを含むが、これらに限定されないオリゴヌクレオチド、
（２） 一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡであり、
前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡを含むが、これらに限定されない、
請求項９記載の対象核酸の安定性の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、生物医学およびバイオテクノロジーの分野、特にｍｉＲＮＡ－２９１１分子の核酸安定化物質としての使用に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸がタンパク質などの標的に結合する能力を利用し、ＡＳＯ医薬、ｍＲＮＡ医薬、ＲＮＡアプタマー、および調節ＲＮＡを含む様々な核酸ツールまたは核酸医薬を、開発することができる。その中でも、ｍＲＮＡは、タンパク質翻訳を基盤としたｍＲＮＡ医薬として開発されている。核酸アプタマーは、標的（タンパク質、小分子、細胞など）に結合して「化学抗体」と同様の役割を果たすことができ、核酸医薬の分野で応用されている。しかし、これらの核酸医薬は、ヌクレアーゼによって分解されやすく、前記標的との親和性が不安定であり、局在化させたり輸送したりすることが難しい。
【0003】
核酸医薬の分解を防ぐため、化学修飾法および非化学修飾法の両方を含む様々な方法が、ヌクレアーゼ分解に対して開発されている。現在、広く用いられている方法は、主に化学修飾法であり、ホスフェート骨格修飾、糖修飾、リン酸修飾および塩基修飾など、核酸医薬の安定性を高めるために使用される方法が含まれる。しかし、化学修飾された核酸医薬は、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化することにより免疫応答を誘導したり、細胞毒性（アポトーシスを誘導することにより生じる蛋白尿など）を引き起こしたり、凝固作用を障害したり、及び血小板減少症を悪化させたりするなど、潜在的な安全性の問題を抱えている可能性がある。
【0004】
現在報告されている非化学修飾法は、極めて少ない。１９８９年に、極めて安定な二次構造を形成できる短鎖オリゴヌクレオチドが、報告された。１９９３年に、Ｃｏｕｌｓｏｎの研究グループは、３’末端エキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解を防ぐことができる熱力学的に安定なヘアピン（ＧＣＧＡＡＡＧＣ）を見出し、前記ヘアピンを最適化してｍｉｎ－ヘアピン（ＧＣＧＡＡＧＣ）を得た。しかし、この方法による保護効果は、わずかである。２００２年に、米国特許第７０２２８３２Ｂ２号公報には、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端をヘアピン構造として設計することによって、１０％非働化血清中で保護的役割を果たし、ナノ材料を使用して動物において遺伝子をノックダウンできることが開示されている。しかし、保護効果が限定的であるため広くは用いられていない。２００２年に、米国特許６１２１４３４Ａ号公報には、連続Ｇ塩基（Ｇの数は０～１０）によってオリゴヌクレオチドを保護できることが開示されている。しかし、この方法は、チオ修飾と併用して通常用いられるため、広くは用いられていない。同様に、ｍＲＮＡも、ヌクレアーゼによって分解されやすい。
【0005】
Ｚｈａｎｇ Ｃｈｅｎｙｕの研究グループは、スイカズラの煎液中に高い安定性を示すｍｉＲＮＡ－２９１１を発見し、ｍｉＲＮＡ－２９１１が抗ウイルス活性を有することを見出した。しかし、ｍｉＲＮＡ－２９１１が核酸を分解から保護できるかどうかは、これまで報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、核酸の安定性を向上させ、および／または核酸を分解から保護する物質および方法に対するアンメットニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は、ｍｉＲＮＡ－２９１１およびその誘導体を用いて核酸を保護し、血清中での核酸の安定性を向上できるという発見に基づく。
【0008】
第１の態様において、本開示は、以下の配列を含むことを特徴とする、対象核酸の安定性を向上させるｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子を提供する：
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｌは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｌは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記リンカー基は、Ｇを含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー基は、１つまたは２つ以上のＧから成る。いくつかの実施形態において、前記リンカー基の長さは、１～５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記リンカー基は、ＧＧＧＧＧである。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、以下の配列を含む：
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧＸ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：３）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択される。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧＸ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：３）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択される。
【0011】
いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６は、同一である。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６は、同一であり、かつ、それぞれＡ、Ｃ、またはＵである。いくつかの実施形態において、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ８は、同一である。いくつかの実施形態において、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ８は、同一であり、かつ、それぞれＡ、Ｃ、またはＵである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、およびＵから独立して選択され、かつ、Ｘ７は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ８のいずれ一つがＵである場合、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ８のうち残りのヌクレオチドは、それぞれＵである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、それぞれＡ、Ｃ、またはＵである。いくつかの実施形態において、Ｘ７がＴである場合、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６は、それぞれＣであり、かつ、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ８は、それぞれＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、それぞれＡである。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、リンカーによって直接的にまたは間接的に連結された１つ以上（例えば、２つ）の配列番号：１または配列番号：３の配列を含む、またはこれから成る。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、１０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、Ｇを含む。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、１つまたは２つ以上のＧから成る。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、１～５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ＧＧＧＧＧである。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、配列番号：４～１０の配列を含む、または、これらから選択される。
【0014】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、修飾または非修飾（例えばチオ非修飾）である。いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、修飾または非修飾（例えばチオ非修飾）である。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸の長さは、８～５０００ｎｔであり、例えば、８～４０００ｎｔ、８～３０００ｎｔ、８～２０００ｎｔ、８～１０００ｎｔ、８～５００ｎｔ、８～２００ｎｔ、８～１５０ｎｔ、８～１００ｎｔ、８～８０ｎｔ、８～５０ｎｔ、８～４０ｎｔ、８～３０ｎｔ、８～２０ｎｔ、８～１０ｎｔ、３０～１８０ｎｔ、２０～１００ｎｔ、および３０～５０ｎｔなどである。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、以下のＲＮＡ分子ではない：
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
【0018】
第２の態様において、本開示は、前記第１の態様の前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子、または、以下の配列を有する核酸分子が、前記対象核酸の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方にコンジュゲートされる、または、前記対象核酸内に挿入されており、かつ、前記対象核酸の安定性が向上されていることを特徴とする、保護された対象核酸を提供する。
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
【0019】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上である。いくつかの実施形態において、前記対象核酸の長さは、８～５０００ｎｔであり、例えば、８～４０００ｎｔ、８～３０００ｎｔ、８～２０００ｎｔ、８～１０００ｎｔ、８～５００ｎｔ、８～２００ｎｔ、８～１５０ｎｔ、８～１００ｎｔ、８～８０ｎｔ、８～５０ｎｔ、８～４０ｎｔ、８～３０ｎｔ、８～２０ｎｔ、８～１０ｎｔ、３０～１８０ｎｔ、２０～１００ｎｔ、および３０～５０ｎｔなどである。
【0020】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオアッセイ用の核酸、または核酸医薬である。
【0021】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）である。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーである。いくつかの実施形態において、前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓａＲＮＡ（低分子活性化ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩタンパク質相互作用ＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖ノンコーディングＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡである。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0024】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、修飾または非修飾である。いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、修飾または非修飾である。いくつかの実施形態において、前記コンジュゲートは、化学共有結合であり、好ましくはホスホジエステル結合による連結である。
【0025】
いくつかの実施形態において、前記保護された対象核酸の構築方法は、化学合成、ＰＣＲの原理に基づく遺伝子工学、または生合成を含む。
【0026】
第３の態様において、本開示は、前記第２の態様の前記保護された対象核酸および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物を提供する。
【0027】
第４の態様において、本開示は、前記第１の態様の前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子、または、以下の配列を有する核酸が、前記対象核酸の５’末端、３’末端、若しくは５’末端および３’末端の両方にコンジュゲートされる、または前記対象核酸内に挿入されることを特徴とする、対象核酸の安定性の向上方法を提供する。
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
【0028】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上であり、例えば８～５０００ｎｔであり、８～４０００ｎｔ、８～３０００ｎｔ、８～２０００ｎｔ、８～１０００ｎｔ、および８～５００ｎｔなどが挙げられ、好ましくは８～２００ｎｔであり、８～１５０ｎｔ、８～１００ｎｔ、８～８０ｎｔ、８～５０ｎｔ、８～４０ｎｔ、８～３０ｎｔ、８～２０ｎｔ、８～１０ｎｔ、３０～１８０ｎｔ、２０～１００ｎｔ、および３０～５０ｎｔなどが挙げられる。
【0029】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオアッセイ用の核酸、または核酸医薬である。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡである。
【0031】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーである。
【0032】
いくつかの実施形態において、前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡである。
【0033】
いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、修飾または非修飾である。いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子は、修飾または非修飾である。
【0034】
いくつかの実施形態において、前記コンジュゲートは、化学共有結合であり、好ましくはホスホジエステル結合による連結である。
【0035】
いくつかの実施形態において、前記保護された対象核酸の構築方法は、化学合成、ＰＣＲの原理に基づく遺伝子工学、または生合成を含む。いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0036】
本開示の実施形態を、以下の明細書および実施例に詳細に示す。ただし、本開示は、本明細書に記載される具体的な実施形態に限定されず、それが故に変更できるものであることを理解されたい。多くの変更または変形が実現可能であり、かつ、当業者により入手可能であり、このような変更または変形の全てが、本開示のスコープの範囲内である。
【0037】
ここまで、本開示の技術的解決の概要のみを、説明した。本開示の技術的手段をより明確に理解できるよう、本開示は、添付の図面および具体的な実施形態を用いて、以下において詳細をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【0039】
本開示におけるいくつかの態様について、説明のために応用例を参照しながら、以下において説明する。多数の具体的な詳細、関係性、および方法は、本開示の完全な理解を提供するために示されることを、理解されたい。しかしながら、関連技術における当業者であれば、本開示が一つ以上の具体的な詳細などがなくても実施可能であることを、容易に理解できるものである。
【0040】
先行技術における核酸医薬を分解から保護する方法には、化学修飾および非化学修飾が含まれるが、いずれも効果が十分でない。本出願の発明者らは、ｍｉＲＮＡ－２９１１およびその誘導体を用いて核酸医薬を保護し、核酸医薬の血清中での安定性を著しく向上させることを編み出した。
【0041】
先行技術と比較して、本開示は以下の有益な効果を有する：
１． 本開示の核酸分子および方法は、修飾を伴わなくても、血清中における核酸医薬の安定性を向上させることができる；
２． 本開示の核酸医薬は、化学修飾および非化学修飾を用いた既存の従来の保護方法と比較して、血清中における高い安定性を有するという利点があることが実証されている；並びに、
３． 本開示の保護方法は、オリゴヌクレオチド医薬に適用できるだけでなく、ｎｃＲＮＡおよびｍＲＮＡの保護にも用いてｎｃＲＮＡおよびｍＲＮＡの安定性を著しく向上させることができ、ｎｃＲＮＡ医薬およびｍＲＮＡ医薬の開発の強い味方となるものである。
１． 本開示の核酸分子および方法は、修飾を伴わなくても、血清中における核酸医薬の安定性を向上させることができる；
２． 本開示の核酸医薬は、化学修飾および非化学修飾を用いた既存の従来の保護方法と比較して、血清中における高い安定性を有するという利点があることが実証されている；並びに、
３． 本開示の保護方法は、オリゴヌクレオチド医薬に適用できるだけでなく、ｎｃＲＮＡおよびｍＲＮＡの保護にも用いてｎｃＲＮＡおよびｍＲＮＡの安定性を著しく向上させることができ、ｎｃＲＮＡ医薬およびｍＲＮＡ医薬の開発の強い味方となるものである。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけに用いられ、本開示を限定することを意図するものではない。本明細書中において、特に定義されない限り、単数形の記載は、複数形も含むことを意図する。さらに、「含む」および「備える」というオープンエンドの表現は、記載されていない構成要素や工程をも含むものとして解釈される。ただし、オープンエンドの表現は、記載されている構成要素および方法工程のみが含まれる場合（すなわち、「から成る」というクローズドエンドの表現を用いる場合）も含むことを、注意されたい。
【0043】
本明細書において、範囲は、範囲内の各値およびすべての値を表すものとして簡略して表記される。範囲内のいずれの値（例えば整数値）も、前記範囲の終点として選択できる。例えば、１０以下のヌクレオチドという表現は、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、および１０以下のヌクレオチド、並びにこれらの値のうちの部分的な範囲である、例えば１～８ｎｔ、２～５ｎｔ、３～７ｎｔなどを意味する。
【0044】
本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有するものとする。矛盾がある場合は、本明細書の定義が優先する。以下にいくつかの用語を説明し、本開示の記述をより理解しやすくする。
【0045】
本開示において、「核酸」、「核酸分子」、および「核酸医薬」という用語は、任意のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを指すものとして互いに読み替え可能に用いられてもよく、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってもよく、並びに非修飾ＲＮＡ若しくは非修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ若しくは修飾ＤＮＡであってもよい。これらの用語には、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、並びに一本鎖若しくは二本鎖であってもよい、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含有するハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。
【0046】
いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の修飾ヌクレオチド、修飾結合などを含んでいてもよい。修飾結合またはヌクレオチド間結合の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチドは、リン誘導体を含む。本開示の修飾ヌクレオチド中の糖部分または糖アナログ部分に付加されるリン誘導体（または修飾ホスフェート基）は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエートなどを含んでもよい。前述のホスフェートアナログを調製する方法、並びにそれらをヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドに組み込む方法は、公知であるため、本明細書に記載される必要はない。
【0047】
本明細書中における「非修飾」または「天然」ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオチドとしては、天然核酸中にまれにまたは一時的にしか存在しないヌクレオチドとして、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジンを含み、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとしても知られ、当該技術分野ではしばしば５－Ｍｅ－Ｃと呼ばれる）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシル化ＨＭＣ、ゲンチオビオシルＨＭＣを含み、並びに合成ヌクレオチドとして、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニンを含み、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニンおよび２，６－ジアミノプリンを含む。当該技術分野で公知の「一般的な」塩基（例えばイノシン）を、含んでもよい。
【0048】
核酸修飾
【0049】
（１） 核酸構造
【0050】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ）は、前記核酸に新たなまたは強化された特性（例えば、安定性の向上）を与えるよう、１つ以上の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾など）を含む。当該技術分野で知られる通り、ヌクレオシドは、塩基と糖が結合したものである。ヌクレオシドの塩基部分は、一般的に複素環塩基である。プリンとピリミジンは、このような複素環塩基で最も一般的な２種類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基をさらに含むヌクレオシドであってもよい。ペントフラノースを含むヌクレオシドについては、前記ホスフェート基を、前記糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結させることができる。オリゴヌクレオチドの形成において、互いに隣接するヌクレオシドは、前記ホスフェート基によって共有結合されて、直鎖状高分子化合物を形成する。そして、前記直鎖状高分子化合物のそれぞれの末端は、さらに連結して環状化合物を形成することができる。しかし、直鎖状化合物が一般的には好ましい。さらに、直鎖状化合物は、内部ヌクレオチド－塩基相補性を有することで、全体または部分的に二本鎖の化合物を生成するように折りたたまれていてもよい。オリゴヌクレオチド内では、前記ホスフェート基は、前記オリゴヌクレオチドを形成するヌクレオシド間骨格と、一般的に呼ばれる。ＲＮＡとＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’と５’のホスホジエステル結合である。
【0051】
（２） 修飾骨格とヌクレオシド間結合
【0052】
修飾を伴う核酸の好ましい例としては、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有する核酸を含む。核酸（修飾骨格を有する核酸）としては、骨格にリン原子を保持するものと、骨格にリン原子を保持しないものが含まれる。
【0053】
リン原子を含む好ましい修飾オリゴヌクレオチドとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスフェートおよび３’－アルキレンホスフェートと５’－アルキレンホスフェートとキラルホスフェートとを含む他のアルキルホスフェート、ホスホネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、ジアミノホスフェート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ボロホスフェート、およびセレノホスフェートが通常の３’－５’結合を有するもの、２’－５’結合したこれらのアナログ、並びに反転極性を有するこれらのものを含み、１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’と３’、５’と５’、または２’と２’の結合である。反転極性を有する好ましい核酸は、３’ヌクレオチド間結合における３’と３’の単独の結合を含み、すなわち、塩基を有さない（ヌクレオ塩基が、欠損している、または水酸基によって置換されている）単独の逆方向ヌクレオシド残基であってもよい。種々の塩（カリウム塩またはナトリウム塩など）、混合塩、および遊離酸形も、含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート結合および／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合を含み、特に、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、および－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－（天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合を－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２－として表す）を含む。
【0055】
他の骨格修飾としては、例えば、モルホリノ骨格構造を有する核酸も含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、リボース環の代わりに六員モルホリノ環を含む。これらのうちいくつかの実施形態では、ホスホジエステル結合は、ジアミノホスフェートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合により、置換される。
【0056】
リン原子を有さない修飾ポリヌクレオチド骨格として好ましいものは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらの骨格には、（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合成分を有する他の骨格が含まれる。
【0057】
他の骨格修飾には、２’－ヒドロキシルが糖環の４’炭素原子に結合して２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン結合を形成し、二環糖部分を形成している、ロック核酸（ＬＮＡ）が含まれる。鎖はメチレン（－ＣＨ２－）（２’酸素原子と４’炭素原子を架橋する基）でもよく、ここで、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９８， ４， ４５５－４５６）。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡによって非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ ＝＋３℃～＋１０℃）、３’核酸エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、並びに良好な溶解性を発揮する。
【0058】
ＬＮＡアデニン、シトシン、グアニン、５－メチルシトシン、チミンおよびウラシルモノマーの合成および調製は、これらのオリゴマー化および核酸認識特性と共に、先行技術（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９８， ５４， ３６０７－３６３０）に記載されている。
【0059】
（３） 修飾糖部分
【0060】
本開示の核酸は、さらに、１つ以上の置換糖部分を含んでいてもよい。好ましいポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択される糖置換基を含み、ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記アルキニルは、置換または非置換の炭素数１～１０のアルキル若しくは炭素数２～１０のアルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に好ましい糖置換基には、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が含まれ、ここで、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の好ましいポリヌクレオチドは、炭素数１～１０の低級アルキル、置換低級のアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、アラルキル、Ｏ－アルキルアリール若しくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、核酸の薬物動態学的特性を改良するための基若しくは核酸の薬力学的特性を改良するための基、および類似の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好ましい修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が含まれる。他の好ましい修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、以下の実施例に記載されている２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【0061】
他の好ましい糖置換基には、メトキシル（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロピロキシル（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’－糖置換基は、アラビノース（上）位またはリボース（下）位にあってもよい。好ましい２’－アラビノ修飾は、２’－Ｆである。同様の修飾は、前記オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシドまたは糖の３’位、および２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の５’末端ヌクレオチドの５’位になされていてもよい。オリゴマー化合物は、前記ペントフラノースの代わりにシクロブチル部分のような糖模倣体も有していてもよい。
【0062】
（４） 塩基の修飾と置換
【0063】
本開示の核酸は、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書中において、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基が含まれ、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルとシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ（特に５－ブロモ）、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれる。他の修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）およびフェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）などの三環式ピリミジン、置換フェナジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）などのＧ－クリップが含まれる。
【0064】
複素環式塩基部分としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環に置換されたものも含まれ、例えば、７－デアザアデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、および２－ピリドンが含まれる。他の核酸塩基としては、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８５８－８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されているもの、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ２８９－３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、前記オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有用である。これらの核酸塩基には、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、０．６℃～１．２℃で核酸二重鎖の安定性を高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ２７６－２７８）、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせる場合に、好ましい塩基置換である。
【0065】
（５） コンジュゲート
【0066】
本開示の核酸の他に実現可能な修飾は、活性を高める一つ以上の部分またはコンジュゲートとの化学結合、ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの細胞分布または細胞への取り込みに関する。前述の部分またはコンジュゲートは、第一級ヒドロキシル基または第二級ヒドロキシル基などの官能基を共有結合するコンジュゲート基を含んでいてもよい。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基を含むが、これらに限定されない。好ましいコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を含むが、これらに限定されない。薬力学的特性を高める基としては、取り込みを改善する基、分解に対する抵抗性を高める基、および／または対象核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを増強する基が含まれる。薬物動態学的特性を高める基としては、本開示の核酸の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。
【0067】
コンジュゲート部分としては、脂質部分を含み、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４， １０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６－３０９； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシルの残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール若しくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７－３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９－９７３）、若しくはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９－２３７）、またはオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３－９３７）を含むが、これらに限定されない
【0068】
いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１または３を含むか、これから成る。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、リンカー（すなわち、配列番号１または３の二量体、三量体など）によって直接的にまたは間接的に連結された配列番号１または３の２つ以上を含むか、これらから成る。
【0069】
本開示において、「リンカー基」および「リンカー」という用語は、互いに読み替えて用いられもよく、塩基配列の異なる部分を連結するために使用されるオリゴヌクレオチド配列を指してもよい。前記オリゴヌクレオチド配列は、非修飾または修飾の天然または非天然ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカー基またはリンカーは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、および／またはＵを含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー基またはリンカーは、Ｇを含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー基またはリンカーは、１つ以上のＧから成る。いくつかの実施形態において、前記リンカー基またはリンカーの長さは、１～１０ヌクレオチドであり、例えば１～５ヌクレオチドであり、例えば３～５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、前記リンカー基またはリンカーは、ＧＧＧＧＧである。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子の保護効果は、前記リンカー基またはリンカーの有無によって影響されない。
【0070】
本開示において、「コンジュゲート」および「連結」という用語は、互いに読み替えて用いられ、化学結合による連結を指す。
【0071】
本明細書中において、血清中における核酸の安定性は、５０％血清など様々な濃度の血清中における核酸の安定性を指す。本明細書中において、安定性の向上とは、前記対象核酸の安定性が、例えば、血清中における安定性が、本開示の核酸分子によって保護されていない対象核酸、または他の方法によって保護された対象核酸と比較して、向上されることを指す。いくつかの実施形態において、前記対象核酸は、本開示の核酸分子によって保護されていない対象核酸、若しくは他の方法によって保護された対象核酸と同等または類似の活性を有するが、安定性が向上されている。いくつかの実施形態において、前記対象核酸の活性は、変化しないままである。
【0072】
本明細書中において、「薬学的に受容可能な担体」という用語は、薬物送達と適合性がある、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤などを含むことを意図する。好ましい担体については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓという当該技術分野における標準的な参照刊行物の最新版に記載されており、参照により本明細書に援用する。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。このような担体および作用剤の使用は、当該技術分野において周知である。本明細書において提供する物質と不適合でない限り、あらゆる従来の担体または作用剤は、組成物において使用されるものとする。
【0073】
以下の具体的な実施例は、本開示の解決策を説明するためだけのものであり、本開示の技術的解決を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本開示はさらなる変更や均等な置換が可能であることを理解するであろう。本開示の意図およびスコープから逸脱しなければ、いかなる変更や部分的な置換も、本開示の保護スコープの範囲内であるとされる。
【実施例】
【0074】
特に明記しない限り、本明細書の実施例に用いられる材料は、すべて市販のものである。本明細書で使用される様々な特定の実験方法は、当該技術分野における従来の実験方法であるか、製造者が提案する工程および条件に沿った実験方法であり、必要に応じて当業者によって適宜決定することができる。また、本明細書の実施例に用いた血清は、Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｅｍｉｕｍウシ胎仔血清である。分解系は、オリゴヌクレオチド医薬、１×ＰＢＳ、５０％血清、および水を含む。電気泳動の使用条件は、１８０Ｖ、２０分、２μｇ～５μｇのローディング量である。本明細書の実施例におけるｍｉＲＮＡ－２９１１配列およびその誘導体は、特に明記しない限り、保護する配列の両末端に付加されている。
【0075】
［実施例１］
ｍｉＲＮＡ－２９１１を含有するＲＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
ｍｉＲＮＡ－２９１１を含有するＲＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
【0076】
保護するＲＮＡ（Ｒ１）の５’末端および３’末端に特定の配列（ｍｉＲＮＡ－２９１１）を付加してｍｉＲＮＡ２９１１－Ｒ１（図１にｍｉ２９１１－Ｒ１として示す）を形成し、ランダム配列ＲＲｓをネガティブコントロールとして選択した（オリゴヌクレオチドは長さが短く分解されやすいため、保護した配列と基本的に同じ長さのランダムな対照配列を選択した。その結果、電気泳動の結果はほぼ直線になり、比較しやすくなった）。上記の配列を血清中で６時間、１２時間、および２４時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図１に示す。ここで、本開示の特定の配列（ｍｉＲＮＡ－２９１１）を付加していないランダム配列ＲＲｓをネガティブコントロール（ＮＣ）として用いたが、これは６時間後に完全に分解された。しかし、ｍｉＲＮＡ－２９１１‐Ｒ１は、１２時間後でも分解されていない完全な配列を有し、つまり、両末端におけるｍｉＲＮＡ－２９１１が、血清中のヌクレアーゼの分解に対するＲ１の能力を大きく改善し、血清中におけるＲ１の安定性を向上させることを示した。
【0077】
実施例１で用いた核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
ｍｉＲＮＡ－２９１１：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
Ｒ１：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：１１）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
ｍｉＲＮＡ－２９１１：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＵＧＧＧＡ（配列番号：２）
Ｒ１：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：１１）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
【0078】
［実施例２］
ｍｉＲＮＡ－２９１１修飾ＲＮＡに基づく、ＲＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
ｍｉＲＮＡ－２９１１修飾ＲＮＡに基づく、ＲＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
【0079】
本発明者らは、前記ｍｉＲＮＡ－２９１１配列に様々な修飾を施した後、修飾配列をＲ１（配列番号：１１）の両末端にそれぞれ付加し、前記修飾配列のＲＮＡ保護能力を評価した。またその中で、ネガティブコントロールとしてランダム配列ＲＲｓを選択した。前述の配列を血清中で６時間、１２時間、および２４時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図２の（１）、（２）、および（３）に示す。様々な修飾核酸医薬の血清中における分解度は異なるが、いずれも分解されていない完全なＲＮＡを示し、つまり、様々な修飾配列が保護能力を有することを示している。また、ｍｉＲＮＡ－２９１１に基づく修飾ＲＮＡを含有するＲＮＡ医薬を血清中で３６時間までインキュベートした結果を、図２の（４）に示す。３６時間後、ｍｉＲＮＡ－２９１１に基づく修飾ＲＮＡを含有するＲＮＡ医薬は、分解されていない完全な配列を示し、つまり、ｍｉＲＮＡ－２９１１に基づく修飾ＲＮＡを含有するＲＮＡ医薬が、血清中でより高い安定性を有することを示した。
【0080】
実施例２で用いた核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｒ２９１１Ａ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：４）
Ｒ２９１１Ｃ：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣ（配列番号：５）
Ｒ２９１１Ｕ：ＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＵＧＧＵＵＵＧＧＧＵ（配列番号：６）
Ｒ２９１１Ａ－５Ｇ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：７）
Ｒ２９１１Ａ－Ｄ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：８）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
Ｒ２９１１Ａ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：４）
Ｒ２９１１Ｃ：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣ（配列番号：５）
Ｒ２９１１Ｕ：ＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＵＧＧＵＵＵＧＧＧＵ（配列番号：６）
Ｒ２９１１Ａ－５Ｇ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：７）
Ｒ２９１１Ａ－Ｄ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：８）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
【0081】
［実施例３］
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、核酸医薬キメラの血清中における安定性の向上
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、核酸医薬キメラの血清中における安定性の向上
【0082】
前記修飾配列のＤＮＡを保護する能力を検証するため、保護するＤＮＡ（Ｄ１）の５’末端および３’末端に特定の配列Ｒ２９１１Ａを付加してＲ２９１１Ａ－Ｄ１を形成し、ネガティブコントロールとしてランダム配列ＲＤｓを選択した。前述の配列を血清中で４時間、６時間、および１２時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図３に示す。Ｒ２９１１Ａ－Ｄ１は１２時間後も分解されていない完全な配列をまだ有しており、つまり、Ｒ２９１１Ａを含有する核酸薬剤キメラが、血清中でより高い安定性を有することを示した。
【0083】
実施例３で用いたＤ１およびＤＲｓの配列情報は、以下の通りである。
Ｄ１：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１３）
ＲＤｓ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：１４）
Ｄ１：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１３）
ＲＤｓ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：１４）
【0084】
［実施例４］
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、ＤＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、ＤＮＡ医薬の血清中における安定性の向上
【0085】
前記ｍｉＲＮＡ－２９１１配列をＤＮＡ（Ｄ２９１１およびＤ２９１１Ａ）に修飾し、Ｄ１の両末端に付加してＤ２９１１‐Ｄ１およびＤ２９１１Ａ‐Ｄ１を各々形成し、前記修飾配列のＤＮＡ保護能力を評価した。一方で、ネガティブコントロールとしては、Ｄ１およびＤＤｓを用いた。前述の配列を血清中で１２時間、２４時間、および３６時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図４の（１）および（２）に示す。Ｄ２９１１－Ｄ１及びＤ２９１１Ａ－Ｄ１の血清中における安定性が、著しく向上した。図４の（２）は、核酸医薬の安定性の向上は、Ｄ１の配列そのものではなく、Ｄ２９１１Ａによることを示している。
【0086】
実施例４で使用した核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｄ１：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１３）
Ｄ２９１１：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡ（配列番号：９）
Ｄ２９１１Ａ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：１０）
ＤＤｓ：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１４）
Ｄ１：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１３）
Ｄ２９１１：ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡ（配列番号：９）
Ｄ２９１１Ａ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：１０）
ＤＤｓ：ＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ（配列番号：１４）
【0087】
［実施例５］
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、核酸医薬の血清中における安定性の向上
ｍｉＲＮＡ－２９１１をＤＮＡに修飾することによる、核酸医薬の血清中における安定性の向上
【0088】
Ｄ２９１１ＡのＲＮＡを保護する能力を検証するため、Ｄ２９１１Ａ配列をＲ１の両末端に付加してＤ２９１１Ａ－Ｒ１を形成した。ランダム配列ＤＲｓを、ネガティブコントロールとして選択した。前述の配列を血清中で１時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図５に示す。Ｄ２９１１Ａを含有する核酸医薬キメラは、血清中で一定の安定性を有していた。
【0089】
実施例５で用いた核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｄ２９１１Ａ－Ｒ１ ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：１５）
ＤＲｓ：ＡＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧ（配列番号：１６）
Ｄ２９１１Ａ－Ｒ１ ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：１５）
ＤＲｓ：ＡＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧ（配列番号：１６）
【0090】
［実施例６］
Ｒ２９１１Ａを含有する様々な配列の核酸医薬の、血清中における安定性の評価
Ｒ２９１１Ａを含有する様々な配列の核酸医薬の、血清中における安定性の評価
【0091】
様々な配列の核酸医薬を保護する能力を、Ｒ２９１１Ａに対して検証した。具体的には、異なる配列の核酸Ｒ２～Ｒ６を選択して、Ｒ２９１１ＡをＲ２～Ｒ６の両末端に付加し、Ｒ２９１１Ａ－Ｒ２、Ｒ２９１１Ａ－Ｒ３、Ｒ２９１１Ａ－Ｒ４、Ｒ２９１１Ａ－Ｒ５、およびＲ２９１１Ａ－Ｒ６を各々形成した。ランダム配列ＲＲｓをネガティブコントロールとして用いたが、これは本開示の方法の使用によって保護されなかったものである。前述の配列を血清中で６時間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図６に示す。Ｒ２９１１Ａを含有する様々な配列の核酸医薬の血清中における分解度は、それぞれ異なっていたが、いずれも分解されていない完全なＤＮＡを示した。実施例１のＲ１に対する保護能力と組み合わせると、Ｒ２９１１Ａを含有する様々な配列の核酸医薬が、それぞれ血清中で安定であることが示され、つまり、本開示の方法が、核酸配列の保護に普遍的に適用可能であることが示された。
【0092】
実施例６で使用した核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｒ２：ＡＣＧＧＧＧＵＣＡＵＵＡＧＵＵＣＡＵＡＧ（配列番号：１７）
Ｒ３：ＵＡＡＧＡＵＡＣＡＣＣＵＧＣＡＡＡＧＧＣ（配列番号：１８）
Ｒ４：ＧＣＵＣＵＣＣＵＣＡＡＧＣＧＵＡＵＵＣＡ（配列番号：１９）
Ｒ５：ＧＵＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＵ（配列番号：２０）
Ｒ６：ＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣ（配列番号：２１）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
Ｒ２：ＡＣＧＧＧＧＵＣＡＵＵＡＧＵＵＣＡＵＡＧ（配列番号：１７）
Ｒ３：ＵＡＡＧＡＵＡＣＡＣＣＵＧＣＡＡＡＧＧＣ（配列番号：１８）
Ｒ４：ＧＣＵＣＵＣＣＵＣＡＡＧＣＧＵＡＵＵＣＡ（配列番号：１９）
Ｒ５：ＧＵＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＵ（配列番号：２０）
Ｒ６：ＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣ（配列番号：２１）
ＲＲｓ：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＵＣＵＡＣＵＣＧＡＣ（配列番号：１２）
【0093】
［実施例７］
Ｒ２９１１Ａを含有する様々な長さの核酸医薬の血清中における安定性の評価
Ｒ２９１１Ａを含有する様々な長さの核酸医薬の血清中における安定性の評価
【0094】
様々な長さの核酸医薬を保護する能力を、Ｒ２９１１Ａに対して検証した。具体的には、ＲＮＡの長さが８０ｎｔ（Ｒ８０）および２０００ｎｔ（Ｒ２Ｋ）である、異なる長さの核酸を選択した。Ｒ２９１１Ａを核酸医薬の両末端に付加し、Ｒ２９１１Ａ－Ｒ８０およびＲ２９１１Ａ－Ｒ１Ｋを各々形成した。保護していないＲＮＡを、ネガティブコントロール（それぞれ、Ｒ８０－ＲＣおよびＲ２Ｋ－ＲＣ）として用いた。２０００ｎｔのＲＮＡを用いて、長鎖ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡを含む）を保護する本開示の方法の能力を検証した。前述の配列を１０％血清中でそれぞれ１時間および２０分間インキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図７の（１）および（２）に示す。Ｒ２９１１Ａを含有する様々な長さの核酸の血清中での分解度は、異なっていたが、いずれも分解されていない完全なＲＮＡを示した。実施例６の２０ｎｔの核酸を保護する能力と組み合わせると、ＲＮＡ Ｒ２９１１Ａを含有する様々な長さの核酸医薬は、いずれも安定していることが示された。さらに、長さが５０００ｎｔのＲＮＡを保護するＲ２９１１Ａの能力も、検証した。その結果、Ｒ２９１１Ａは、この長さのＲＮＡに対する保護能力を有することが示された（図示せず）。
【0095】
実施例７で使用した核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ８０：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＡＣＵＣＣＵＧＣＡＡＡＧＵＧＵＧＧＡＣＡＡＣＵＵＣＣＣＡＣＧＧＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＵＡＵＣＵＡＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＧＵＡＵＣＵＵＧＵＣＵＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２２）
Ｒ８０－ＲＣ：ＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡ（配列番号：２３）
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ２Ｋ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＵＣＵＵＡＡＡＵＡＵＣＡＡＣＣＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣＣＵＵＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＵＵＵＣＡＧＧＡＵＵＧＡＧＡＡＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＧＡＧＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＵＧＵＡＧＧＡＣＵＵＧＵＵＣＣＵＧＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＵＧＡＵＧＧＧＡＵＡＧＵＡＣＡＣＵＵＣＡＣＵＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＧＣＡＵＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＣＵＵＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＧＵＧＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＡＣＵＡＡＧＧＡＡＡＵＵＵＧＵＵＵＡＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＵＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＵＡＵＧＡＡＡＧＧＡＡＵＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣＵＧＵＵＡＧＡＡＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＡＵＧＵＡＡＡＵＵＧＵＧＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＣＡＡＡＡＵＡＡＵＡＡＡＣＵＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＡＵＡＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＣＣＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＡＵＡＧＵＧＵＵＵＧＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＧＵＵＧＧＧＧＣＡＡＵＣＵＵＧＧＧＧＧＧＧＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＡＡＵＣＵＵＵＣＡＧＡＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＵＵＵＡＡＵＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＧＧＡＵＵＵＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＵＧＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＵＵＵＵＡＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡＡＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＡＵＡＡＵＡＡＵＵＣＣＡＧＧＣＡＣＡＵＧＧＣＡＡＵＡＧＡＧＧＣＣＣＵＣＵＡＡＡＵＡＡＧＧＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡＡＡＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＵＵＡＧＡＧＵＡＡＵＡＣＵＵＵＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＧＣＡＵＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧＣＵＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵＧＧＵＡＧＧＣＡＡＵＧＵＵＵＵＡＣＡＣＵＡＵＵＧＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＣＣＵＧＵＧＧＧＧＵＵＵＵＡＡＡＧＡＡＵＵＵＵＣＣＵＵＵＧＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＵＣＣＵＵＣＡＵＧＡＡＧＣＣＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＵＵＧＡＡＵＵＧＣＡＵＡＵＧＡＧＵＧＣＵＵＧＧＣＵＣＵＵＣＣＵＵＣＵＧＵＵＣＵＡＧＵＧＡＧＵＧＵＡＵＧＡＧＡＣＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＧＵＵＵＡＵＣＡＧＣＡＵＡＣＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＵＵＧＧＡＧＧＧＡＵＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＧＧＧＣＵＵＡＣＵＵＧＵＵＧＵＡＧＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＡＧＡＧＡＡＵＧＣＡＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＣＵＵＣＡＧＧＵＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＧＵＵＧＧＣＡＡＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＵＵＣＵＧＡＵＣＣＣＧＣＵＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵＧＣＡＵＵＧＵＧＡＡＡＣＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＵＧＡＵＵＡＡＡＡＧＵＵＧＵＧＵＵＣＣＣＣＡＡＵＧＣＵＵＧＧＡＧＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵＣＣＡＧＣＵＧＡＧＵＧＡＵＡＡＡＧＧＣＵＧＡＧＵＧＵＵＧＡＧＧＡＡＡＵＵＵＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＡＵＵＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＣＵＧＡＧＵＡＣＡＵＵＵＵＧＣＵＧＧＵＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＧＵＡＡＡＡＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＡＵＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＣＵＵＵＡＧＵＣＵＵＵＵＣＣＡＧＡＵＧＣＡＡＣＣＵＵＡＡＡＡＵＣＡＧＵＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＵＣＵＵＣＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＧＧＣＡＡＧＵＧＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＡＡＣＡＧＵＵＣＡＧＵＧＡＵＣＵＵＵＡＧＵＧＣＡＵＵＧＵＵＵＡＵＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＣＵＣＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＵＧＧＵＣＵＵＡＡＵＵＣＵＵＡＣＡＵＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＵＡＵＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＵＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＧＣＣＵＡＵＵＵＡＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＵＵＵＵＡＡＡＵＧＵＧＧＧＧＡＵＵＧＧＧＡＡＣＣＡＣＵＡＧＵＵＣＵＵＵＣＡＧＡＵＧＧＵＡＵＵＣＵＵＣＡＧＡＣＵＡＵＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＣＣＡＧＵＵＧＡＡＵＵＣＡＣＣＡＧＵＧＧＡＣＡＡＡＡＵＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＣＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＡＡＵＡＧＵＡＵＵＧＡＡＵＡＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＵＵＡＵＧＣＵＧＧＡＧＵＡＡＣＵＧＧＣＡＵＧＵＧＡＧＣＡＡＡＣＵＧＵＧＵＵＧＧＣＧＵＧＧＧＧＧＵＧＧＡＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＵＡＡＧＣＣＵＵＵＵＵＵＵＡＡＧＡＵＵＵＵＵＣＡＧＧＵＡＣＣＣＣＵＣＡＣＵＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＵＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２４）
Ｒ２Ｋ－ＲＣ：ＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＵＣＵＵＡＡＡＵＡＵＣＡＡＣＣＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣＣＵＵＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＵＵＵＣＡＧＧＡＵＵＧＡＧＡＡＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＧＡＧＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＵＧＵＡＧＧＡＣＵＵＧＵＵＣＣＵＧＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＵＧＡＵＧＧＧＡＵＡＧＵＡＣＡＣＵＵＣＡＣＵＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＧＣＡＵＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＣＵＵＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＧＵＧＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＡＣＵＡＡＧＧＡＡＡＵＵＵＧＵＵＵＡＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＵＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＵＡＵＧＡＡＡＧＧＡＡＵＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣＵＧＵＵＡＧＡＡＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＡＵＧＵＡＡＡＵＵＧＵＧＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＣＡＡＡＡＵＡＡＵＡＡＡＣＵＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＡＵＡＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＣＣＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＡＵＡＧＵＧＵＵＵＧＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＧＵＵＧＧＧＧＣＡＡＵＣＵＵＧＧＧＧＧＧＧＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＡＡＵＣＵＵＵＣＡＧＡＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＵＵＵＡＡＵＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＧＧＡＵＵＵＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＵＧＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＵＵＵＵＡＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡＡＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＡＵＡＡＵＡＡＵＵＣＣＡＧＧＣＡＣＡＵＧＧＣＡＡＵＡＧＡＧＧＣＣＣＵＣＵＡＡＡＵＡＡＧＧＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡＡＡＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＵＵＡＧＡＧＵＡＡＵＡＣＵＵＵＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＧＣＡＵＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧＣＵＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵＧＧＵＡＧＧＣＡＡＵＧＵＵＵＵＡＣＡＣＵＡＵＵＧＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＣＣＵＧＵＧＧＧＧＵＵＵＵＡＡＡＧＡＡＵＵＵＵＣＣＵＵＵＧＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＵＣＣＵＵＣＡＵＧＡＡＧＣＣＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＵＵＧＡＡＵＵＧＣＡＵＡＵＧＡＧＵＧＣＵＵＧＧＣＵＣＵＵＣＣＵＵＣＵＧＵＵＣＵＡＧＵＧＡＧＵＧＵＡＵＧＡＧＡＣＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＧＵＵＵＡＵＣＡＧＣＡＵＡＣＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＵＵＧＧＡＧＧＧＡＵＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＧＧＧＣＵＵＡＣＵＵＧＵＵＧＵＡＧＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＡＧＡＧＡＡＵＧＣＡＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＣＵＵＣＡＧＧＵＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＧＵＵＧＧＣＡＡＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＵＵＣＵＧＡＵＣＣＣＧＣＵＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵＧＣＡＵＵＧＵＧＡＡＡＣＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＵＧＡＵＵＡＡＡＡＧＵＵＧＵＧＵＵＣＣＣＣＡＡＵＧＣＵＵＧＧＡＧＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵＣＣＡＧＣＵＧＡＧＵＧＡＵＡＡＡＧＧＣＵＧＡＧＵＧＵＵＧＡＧＧＡＡＡＵＵＵＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＡＵＵＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＣＵＧＡＧＵＡＣＡＵＵＵＵＧＣＵＧＧＵＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＧＵＡＡＡＡＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＡＵＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＣＵＵＵＡＧＵＣＵＵＵＵＣＣＡＧＡＵＧＣＡＡＣＣＵＵＡＡＡＡＵＣＡＧＵＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＵＣＵＵＣＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＧＧＣＡＡＧＵＧＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＡＡＣＡＧＵＵＣＡＧＵＧＡＵＣＵＵＵＡＧＵＧＣＡＵＵＧＵＵＵＡＵＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＣＵＣＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＵＧＧＵＣＵＵＡＡＵＵＣＵＵＡＣＡＵＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＵＡＵＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＵＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＧＣＣＵＡＵＵＵＡＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＵＵＵＵＡＡＡＵＧＵＧＧＧＧＡＵＵＧＧＧＡＡＣＣＡＣＵＡＧＵＵＣＵＵＵＣＡＧＡＵＧＧＵＡＵＵＣＵＵＣＡＧＡＣＵＡＵＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＣＣＡＧＵＵＧＡＡＵＵＣＡＣＣＡＧＵＧＧＡＣＡＡＡＡＵＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＣＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＡＡＵＡＧＵＡＵＵＧＡＡＵＡＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＵＵＡＵＧＣＵＧＧＡＧＵＡＡＣＵＧＧＣＡＵＧＵＧＡＧＣＡＡＡＣＵＧＵＧＵＵＧＧＣＧＵＧＧＧＧＧＵＧＧＡＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＵＡＡＧＣＣＵＵＵＵＵＵＵＡＡＧＡＵＵＵＵＵＣＡＧＧＵＡＣＣＣＣＵＣＡＣＵＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＵＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＣＣ（配列番号：２５）
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ８０：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＡＣＵＣＣＵＧＣＡＡＡＧＵＧＵＧＧＡＣＡＡＣＵＵＣＣＣＡＣＧＧＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＵＡＵＣＵＡＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＧＵＡＵＣＵＵＧＵＣＵＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２２）
Ｒ８０－ＲＣ：ＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡ（配列番号：２３）
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ２Ｋ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＵＣＵＵＡＡＡＵＡＵＣＡＡＣＣＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣＣＵＵＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＵＵＵＣＡＧＧＡＵＵＧＡＧＡＡＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＧＡＧＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＵＧＵＡＧＧＡＣＵＵＧＵＵＣＣＵＧＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＵＧＡＵＧＧＧＡＵＡＧＵＡＣＡＣＵＵＣＡＣＵＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＧＣＡＵＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＣＵＵＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＧＵＧＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＡＣＵＡＡＧＧＡＡＡＵＵＵＧＵＵＵＡＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＵＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＵＡＵＧＡＡＡＧＧＡＡＵＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣＵＧＵＵＡＧＡＡＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＡＵＧＵＡＡＡＵＵＧＵＧＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＣＡＡＡＡＵＡＡＵＡＡＡＣＵＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＡＵＡＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＣＣＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＡＵＡＧＵＧＵＵＵＧＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＧＵＵＧＧＧＧＣＡＡＵＣＵＵＧＧＧＧＧＧＧＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＡＡＵＣＵＵＵＣＡＧＡＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＵＵＵＡＡＵＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＧＧＡＵＵＵＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＵＧＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＵＵＵＵＡＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡＡＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＡＵＡＡＵＡＡＵＵＣＣＡＧＧＣＡＣＡＵＧＧＣＡＡＵＡＧＡＧＧＣＣＣＵＣＵＡＡＡＵＡＡＧＧＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡＡＡＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＵＵＡＧＡＧＵＡＡＵＡＣＵＵＵＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＧＣＡＵＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧＣＵＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵＧＧＵＡＧＧＣＡＡＵＧＵＵＵＵＡＣＡＣＵＡＵＵＧＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＣＣＵＧＵＧＧＧＧＵＵＵＵＡＡＡＧＡＡＵＵＵＵＣＣＵＵＵＧＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＵＣＣＵＵＣＡＵＧＡＡＧＣＣＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＵＵＧＡＡＵＵＧＣＡＵＡＵＧＡＧＵＧＣＵＵＧＧＣＵＣＵＵＣＣＵＵＣＵＧＵＵＣＵＡＧＵＧＡＧＵＧＵＡＵＧＡＧＡＣＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＧＵＵＵＡＵＣＡＧＣＡＵＡＣＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＵＵＧＧＡＧＧＧＡＵＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＧＧＧＣＵＵＡＣＵＵＧＵＵＧＵＡＧＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＡＧＡＧＡＡＵＧＣＡＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＣＵＵＣＡＧＧＵＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＧＵＵＧＧＣＡＡＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＵＵＣＵＧＡＵＣＣＣＧＣＵＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵＧＣＡＵＵＧＵＧＡＡＡＣＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＵＧＡＵＵＡＡＡＡＧＵＵＧＵＧＵＵＣＣＣＣＡＡＵＧＣＵＵＧＧＡＧＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵＣＣＡＧＣＵＧＡＧＵＧＡＵＡＡＡＧＧＣＵＧＡＧＵＧＵＵＧＡＧＧＡＡＡＵＵＵＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＡＵＵＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＣＵＧＡＧＵＡＣＡＵＵＵＵＧＣＵＧＧＵＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＧＵＡＡＡＡＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＡＵＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＣＵＵＵＡＧＵＣＵＵＵＵＣＣＡＧＡＵＧＣＡＡＣＣＵＵＡＡＡＡＵＣＡＧＵＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＵＣＵＵＣＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＧＧＣＡＡＧＵＧＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＡＡＣＡＧＵＵＣＡＧＵＧＡＵＣＵＵＵＡＧＵＧＣＡＵＵＧＵＵＵＡＵＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＣＵＣＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＵＧＧＵＣＵＵＡＡＵＵＣＵＵＡＣＡＵＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＵＡＵＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＵＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＧＣＣＵＡＵＵＵＡＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＵＵＵＵＡＡＡＵＧＵＧＧＧＧＡＵＵＧＧＧＡＡＣＣＡＣＵＡＧＵＵＣＵＵＵＣＡＧＡＵＧＧＵＡＵＵＣＵＵＣＡＧＡＣＵＡＵＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＣＣＡＧＵＵＧＡＡＵＵＣＡＣＣＡＧＵＧＧＡＣＡＡＡＡＵＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＣＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＡＡＵＡＧＵＡＵＵＧＡＡＵＡＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＵＵＡＵＧＣＵＧＧＡＧＵＡＡＣＵＧＧＣＡＵＧＵＧＡＧＣＡＡＡＣＵＧＵＧＵＵＧＧＣＧＵＧＧＧＧＧＵＧＧＡＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＵＡＡＧＣＣＵＵＵＵＵＵＵＡＡＧＡＵＵＵＵＵＣＡＧＧＵＡＣＣＣＣＵＣＡＣＵＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＵＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２４）
Ｒ２Ｋ－ＲＣ：ＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＵＣＵＵＡＡＡＵＡＵＣＡＡＣＣＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣＣＵＵＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＵＵＵＣＡＧＧＡＵＵＧＡＧＡＡＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＧＡＧＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＡＵＵＧＵＡＧＧＡＣＵＵＧＵＵＣＣＵＧＵＧＧＧＣＵＵＣＡＧＵＧＡＵＧＧＧＡＵＡＧＵＡＣＡＣＵＵＣＡＣＵＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＧＣＡＵＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＣＵＵＡＡＡＡＧＣＣＵＣＵＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＧＵＧＣＣＵＵＧＡＵＧＣＣＡＡＣＵＡＡＧＧＡＡＡＵＵＵＧＵＵＵＡＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＵＣＵＧＡＡＧＧＣＵＣＵＡＵＧＡＡＡＧＧＡＡＵＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣＵＧＵＵＡＧＡＡＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＡＵＧＵＡＡＡＵＵＧＵＧＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＣＡＡＡＡＵＡＡＵＡＡＡＣＵＡＵＵＵＵＵＡＵＵＡＧＡＧＡＡＵＧＵＡＵＡＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＣＣＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＡＵＡＧＵＧＵＵＵＧＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＧＵＵＧＧＧＧＣＡＡＵＣＵＵＧＧＧＧＧＧＧＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＡＡＵＣＵＵＵＣＡＧＡＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＧＣＧＡＡＣＡＣＵＣＵＵＵＡＡＵＧＧＡＣＣＡＧＡＵＣＡＧＧＡＵＵＵＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＵＧＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＵＵＵＵＡＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡＡＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＡＵＡＡＵＡＡＵＵＣＣＡＧＧＣＡＣＡＵＧＧＣＡＡＵＡＧＡＧＧＣＣＣＵＣＵＡＡＡＵＡＡＧＧＡＡＵＡＡＡＵＡＡＣＣＵＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＡＵＧＡＵＣＡＧＡＧＵＡＡＡＡＧＧＵＡＡＵＵＡＣＡＣＡＵＵＵＵＡＵＵＵＣＣＡＧＡＡＡＧＵＣＡＧＧＧＧＵＣＵＡＵＡＡＡＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＵＵＡＧＡＧＵＡＡＵＡＣＵＵＵＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＣＡＡＡＧＵＵＵＧＣＡＵＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＡＵＧＣＵＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＧＡＧＵＧＧＵＡＧＧＣＡＡＵＧＵＵＵＵＡＣＡＣＵＡＵＵＧＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＣＣＵＧＵＧＧＧＧＵＵＵＵＡＡＡＧＡＡＵＵＵＵＣＣＵＵＵＧＣＡＧＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＵＣＣＵＵＣＡＵＧＡＡＧＣＣＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＵＵＧＡＡＵＵＧＣＡＵＡＵＧＡＧＵＧＣＵＵＧＧＣＵＣＵＵＣＣＵＵＣＵＧＵＵＣＵＡＧＵＧＡＧＵＧＵＡＵＧＡＧＡＣＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＧＵＵＵＡＵＣＡＧＣＡＵＡＣＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＵＵＧＧＡＧＧＧＡＵＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＵＧＧＧＧＣＵＵＡＣＵＵＧＵＵＧＵＡＧＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＧＡＣＵＵＣＡＣＡＧＡＧＡＡＵＧＣＡＧＵＵＧＵＣＵＵＧＡＣＵＵＣＡＧＧＵＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＧＵＵＧＧＣＡＡＧＵＡＡＡＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＵＵＣＵＧＡＵＣＣＣＧＣＵＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵＧＣＡＵＵＧＵＧＡＡＡＣＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＵＧＡＵＵＡＡＡＡＧＵＵＧＵＧＵＵＣＣＣＣＡＡＵＧＣＵＵＧＧＡＧＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵＣＣＡＧＣＵＧＡＧＵＧＡＵＡＡＡＧＧＣＵＧＡＧＵＧＵＵＧＡＧＧＡＡＡＵＵＵＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＡＵＵＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＣＵＧＡＧＵＡＣＡＵＵＵＵＧＣＵＧＧＵＧＵＡＵＵＵＵＵＡＧＧＵＡＡＡＡＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＵＣＡＵＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＣＵＵＵＡＧＵＣＵＵＵＵＣＣＡＧＡＵＧＣＡＡＣＣＵＵＡＡＡＡＵＣＡＧＵＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＵＣＵＵＣＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＧＧＣＡＡＧＵＧＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＡＡＣＡＧＵＵＣＡＧＵＧＡＵＣＵＵＵＡＧＵＧＣＡＵＵＧＵＵＵＡＵＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＣＵＣＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＵＧＧＵＣＵＵＡＡＵＵＣＵＵＡＣＡＵＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＵＡＵＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＵＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＧＣＣＵＡＵＵＵＡＣＵＵＵＡＡＡＵＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＵＵＣＣＡＵＵＵＵＡＡＡＵＧＵＧＧＧＧＡＵＵＧＧＧＡＡＣＣＡＣＵＡＧＵＵＣＵＵＵＣＡＧＡＵＧＧＵＡＵＵＣＵＵＣＡＧＡＣＵＡＵＡＧＡＡＧＧＡＧＣＵＵＣＣＡＧＵＵＧＡＡＵＵＣＡＣＣＡＧＵＧＧＡＣＡＡＡＡＵＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＣＵＧＵＡＵＵＵＡＣＡＵＡＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＡＡＵＡＧＵＡＵＵＧＡＡＵＡＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＵＵＡＵＧＣＵＧＧＡＧＵＡＡＣＵＧＧＣＡＵＧＵＧＡＧＣＡＡＡＣＵＧＵＧＵＵＧＧＣＧＵＧＧＧＧＧＵＧＧＡＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＵＡＡＧＣＣＵＵＵＵＵＵＵＡＡＧＡＵＵＵＵＵＣＡＧＧＵＡＣＣＣＣＵＣＡＣＵＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＵＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＣＣ（配列番号：２５）
【0096】
［実施例８］
Ｒ２９１１Ａを含有する核酸医薬の動物における安定性の評価
Ｒ２９１１Ａを含有する核酸医薬の動物における安定性の評価
【0097】
Ｒ２９１１Ａを含有する核酸医薬（Ｒ１の両末端にＲ２９１１Ａ配列を付加して形成したＲ２９１１Ａ－Ｒ１）をｃｙ５．５で標識し、Ｃｙ５．５－Ｒ２９１１Ａ－Ｒ１を形成した。前記Ｃｙ５．５－Ｒ２９１１Ａ－Ｒ１を、注射前に生理食塩水で希釈した。マウスに対して、計量し、腹部を脱毛し、２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。マウスへの皮下注射は、以下のように行った。マウスを掴んで固定し、２つの後肢の間の皮膚に注射を行った。体重に応じた量の薬剤を注射器で吸引し、針の斜面を上向きにして皮膚にそっと刺し、皮膚に沿って１～２ｃｍほど皮下に針を刺入した後、ゆっくりと注射した。皮下注射が成功するとマウスの注射部位の皮膚が膨らみ、刺入方向と逆方向にスムーズに針を抜くことで、注射が完了した。ｉｎ ｖｉｖｏ撮像を注射後０日目、１日目、２日目、および３日目に行い、皮下注射後のマウスにおけるＣｙ５．５‐Ｒ２９１１Ａ‐Ｒ１の分布と分解を観察した。Ｒ２９１１Ａ－Ｒ１核酸医薬の動物における安定性については予め検証した。その結果を図８に示す。Ｒ２９１１Ａ－Ｒ１核酸医薬を注射したマウスでは、３日目に明らかな蛍光をなお検出できたが、Ｃｙ５．５－ＲＲｓ（図８にＣｙ５．５－ＲＳとして示す、Ｒ２９１１Ａを含まないＣｙ５．５で標識した核酸医薬）を注射したマウスでは、３日後にはほとんど蛍光を検出できなかった。本実施例により、Ｒ２９１１Ａを含有する核酸医薬が、動物において良好な安定性を有することが示された。
【0098】
［実施例９］
５’末端、３’末端、または内部にＲ２９１１Ａを含有する核酸医薬の血清中における安定性の評価
５’末端、３’末端、または内部にＲ２９１１Ａを含有する核酸医薬の血清中における安定性の評価
【0099】
Ｒ２９１１Ａを５’末端、３’末端、または内部に含有する核酸医薬の血清中における安定性を評価するため、Ｒ２９１１Ａを、Ｒ１の５’末端若しくは３’末端、またはＲ１の内部に付加した。一方、保護していないＲＮＡを、ネガティブコントロール（ＲＲｓ”）として用いた。これらの配列を血清中で１２時間、２４時間、および１時間それぞれインキュベートした後、３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図９の（１）および（２）に示す。Ｒ２９１１Ａを内部に付加した場合（図９の（２））、保護効果は不十分であった。Ｒ２９１１Ａを５’末端または３’末端に付加した場合（図９－（１））、２４時間後も分解されていない完全な配列が残存していたことから、５’末端または３’末端のＲ２９１１Ａによって、ＲＮＡの血清中における安定性を向上できることが示された。実施例２のＲ１に対する保護能力と組み合わせると、核酸医薬の血清中における安定性は、本開示の保護核酸分子がＲ１の両末端に存在する場合に、より有意に向上されることが示された。
【0100】
実施例９で使用した核酸フラグメントの配列情報は、以下の通りである。
Ｒ２９１１Ａ－Ｍ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：２６）
Ｒ２９１１Ａ－Ｌ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：２７）
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２８）
ＲＲｓ”：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧ（配列番号：２９）
Ｒ２９１１Ａ－Ｍ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：２６）
Ｒ２９１１Ａ－Ｌ：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧ（配列番号：２７）
Ｒ２９１１Ａ－Ｒ：ＵＧＡＡＵＧＵＡＧＡＧＡＵＧＣＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号：２８）
ＲＲｓ”：ＡＣＣＣＧＡＣＣＵＣＵＵＣＵＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＵＣＵＣＵＵＵＵＵＵＧ（配列番号：２９）
【0101】
［実施例１０］
Ｒ２９１１Ａを含有するｓｉＲＮＡ医薬の、細胞内における標的ＲＮＡに対するノックダウン効果の評価
Ｒ２９１１Ａを含有するｓｉＲＮＡ医薬の、細胞内における標的ＲＮＡに対するノックダウン効果の評価
【0102】
１．ＦＤＡ承認のｉｎｃｌｉｓｉｒａｎを、ポジティブコントロール（ポジティブコントロールは化学修飾ｓｉＲＮＡ）として用いた。また、Ｒ２９１１Ａを含有する非修飾ｓｉＲＮＡ医薬（ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－Ｒ２９１１Ａ）を、ＲＮＡ配列の３’末端にＲ２９１１Ａを付加することにより形成した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションには、リポフェクタミン２０００を以下のように用いた。適量のｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－２９１１Ａを５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、一方で、４．８μＬのリポフェクタミン２０００を５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、緩やかに吹き付けて混合し、室温で５分間放置した。得られたリポフェクタミン２０００希釈液をｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－２９１１Ａ希釈液に加えて混合液とし、室温で２０分間インキュベートした。同時に、１２ウェルプレート中の細胞（細胞密度５０～６０％の９７Ｈ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞）の培地を抗生物質（ペニシリン‐ストレプトマイシン）非含培地（ＤＭＥＭ）で置換し、前記混合物を滴下して緩やかに混合し、５時間～６時間後に血清と抗生物質を含む完全培養培地で置換した。４８時間、７２時間、９６時間のトランスフェクション時間が経過した後、細胞を回収して全ＲＮＡを抽出した。９６時間のトランスフェクション後、１２ウェルプレートで培養を続けるには細胞密度が高すぎたため、６ウェルプレートに細胞を通過させて１２０時間のトランスフェクション後に細胞を回収して全ＲＮＡを抽出する必要があった。
【0103】
２． 全細胞ＲＮＡの抽出
【0104】
（１） 培地を捨て、あらかじめ冷却した１×ＰＢＳで細胞を１回すすぐ。
【0105】
（２） １２ウェルプレートの細胞にトリゾールを０．５ｍＬ加え、６ウェルプレートの細胞にトリゾールを１ｍＬ加え、ピペットで吹き付けて混合させ、細胞を完全に溶解させる。
【0106】
（３） 完全に溶解したトリゾールにクロロホルムを全量の２０％加え、管に蓋をし、激しく振って十分に混ぜ、室温で２分間放置した後、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。
【0107】
（４） 約２００μＬ（１２ウェルプレート）及び４００μＬ（６ウェルプレート）の水相の層を新たなＥＰ管にピペッティングし、同量のイソプロパノールを加えて混合させ、－８０℃の低温冷蔵庫に半時間入れた後、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。
【0108】
（５） 遠心分離後、管の底部に白色の沈殿物（すなわちＲＮＡ）が確認できる。上澄みを除き、７５％エタノールを１ｍＬ加えて沈殿物を再懸濁した後、７５００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。
【0109】
（６） 沈殿物をピペッティングせずに、エタノールを注意深く吸引する。その管を室温に放置する。エタノールが蒸発した後、リボヌクレアーゼ非含有のＨ２Ｏを５０μＬ加え、４２℃で２分間インキュベートし、ＲＮＡを十分に溶解させる。次に少量のＲＮＡを取り出してその濃度を測定し、ＴＢＥ電気泳動を用いてＲＮＡの完全性を検出する。
【0110】
（７） 全ＲＮＡを１μｇ取り出し、２０μＬの逆転写系を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得る。
【0111】
３． リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ
【0112】
（１） －２０℃の冷蔵庫からｃＤＮＡを取り出し、室温で溶解させた後、１８０μＬのｄｄＨ２Ｏで１０倍に希釈する。
【0113】
（２） ｑＰＣＲ反応系は以下の通りであった。
２ｘ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ ２０μｌ
フォワードプライマー（１０ｕＭ） ０．５μｌ
リバースプライマー（１０ｕＭ） ０．５μｌ
ｃＤＮＡテンプレート ４μｌ
ｄｄＨ２Ｏ ５μｌ
２ｘ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ ２０μｌ
フォワードプライマー（１０ｕＭ） ０．５μｌ
リバースプライマー（１０ｕＭ） ０．５μｌ
ｃＤＮＡテンプレート ４μｌ
ｄｄＨ２Ｏ ５μｌ
【0114】
ＰＣＲ条件は以下の通りで行った：９５℃で３分；９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で２０秒（このプログラムを４０サイクル）；９５℃で１５秒；６０℃で６０秒；解離曲線は６０～９５℃で蛍光シグナルを０．５℃上昇毎に吸収；９５℃で１０秒。
【0115】
（３） ＰＣＲはＡＢＩ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ定量機器を用いて行い、実験データは△△Ｃｔアルゴリズムを適用した結果に沿って解析した。
【0116】
本実施例で用いたＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡ（ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎまたは２９１１結合ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ）のノックダウン能力を、９７Ｈ細胞株およびＨｅｐ３Ｂ細胞株を用いて細胞レベルで検証した。一方、同量のＰＢＳをトランスフェクトしてネガティブコントロール（Ｍｏｃｋ）とし、ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎをポジティブコントロールとした。
【0117】
その結果（図１０）によると、Ｒ２９１１Ａを含有するｓｉＲＮＡ医薬（ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－Ｒ２９１１Ａ）は、細胞における標的遺伝子をノックダウンする良好な能力を有していた。
【0118】
本実施例で使用した核酸フラグメントの情報は、以下の通りである。
Ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ（完全に修飾された配列）：
Ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ（完全に修飾された配列）：
【0119】
下線で記されたヌクレオチドは２’位でメトキシ修飾されており、斜字体で記されたヌクレオチドはフルオロ修飾（フルオロは、２’位のヒドロキシル基のフッ素原子による置換である）されており、＊はチオ修飾（ホスフェート結合中の非架橋酸素原子の硫黄原子による置換）を示している。
Ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－Ｒ２９１１Ａ：ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ
Ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ－Ｒ２９１１Ａ：ＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＵＣＵＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ
【0120】
［実施例１１］
Ｒ２９１１Ａを含有するｍＲＮＡの細胞内タンパク質発現の評価
Ｒ２９１１Ａを含有するｍＲＮＡの細胞内タンパク質発現の評価
【0121】
Ｒ２９１１Ａを含有するｍＲＮＡ医薬の細胞内タンパク質発現を評価するため、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｍＲＮＡ１）の両末端にＲ２９１１Ａを付加して、Ｒ‐ｍＲＮＡ１を形成した。保護していないｍＲＮＡ１を、ネガティブコントロール（ｍＲＲｓ）として用いた。
【0122】
これらの配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後に２９３Ｕ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、培養培地と同量の検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＯＮＥ－ＧｌｏＵＭルシフェラーゼ検出系、Ｅ６１１０）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＶＡＲｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ）により発光シグナルを検出した。結果を図１１に示す。ｍＲＮＡ１の両末端にＲ２９１１Ａを付加した場合、Ｒ－ｍＲＮＡ１の細胞内タンパク質発現レベルは、ｍＲＲｓと比べて著しく高く、つまり、Ｒ２９１１Ａを含むことで、ｍＲＮＡ医薬の細胞内タンパク質発現が著しく高まることが示された。
【0123】
ここで用いた配列情報は、以下の通りである。
ｍＲＮＡ１：ＵＵＡＡＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＧＧＧＵＵＧＡＵＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＵＵＧＧＧＣＧＣＵＡＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＡＵＣＡＣＧＧＵＡＣＣＵＵＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＵＵＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＵＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＣＧＵＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＵＵＵＵＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＵＵＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＡＵＡＧＡＣＵＧＣＵＣＡＣＧＣＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＣＧＧＣＣＡＡＣＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＧＣＵＣＡＧＣＡＣＵＡＣＣＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＧＵＣＡＣＣＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＧＣＧＵＵＧＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＵＧＧＧＡＣＧＣＵＣＵＡＡＵＡＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＧＡＡＧＡＧＵＣＵＡＵＵＧＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＡＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＧＧＣＵＡＡＵＣＣＵＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＵＣＧＵＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＵＧＵＣＣＧＵＧＵＵＵＣＡＵＵＵＵＡＵＵＣＣＵＡＵＡＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＣＧＵＵＡＣＣＡＵＡＵＡＧＣＵＡＵＵＧＧＡＵＵＧＧＣＣＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＡＡＵＡＧＡＧＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＧＧＧＵＵＵＡＵＡＣＣＡＣＵＵＡＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＣＡＵＵＡＣＡＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＡＵＡＣＡＧＣＡＡＡＡＵＧＧＣＣＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＵＧＣＵＣＣＣＵＵＣＵＡＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＧＡＵＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＵＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＵＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＡＧＵＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＵＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＵＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＵＣＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＵＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＧＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＣＧＵＧＡＣＡＵＣＵＣＡＵＣＵＧＣＣＵＣＣＵＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＡＧＵＣＵＵＵＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＵＧＧＧＵＣＵＡＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＵＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＵＣＡＵＣＧＣＡＣＣＧＣＣＵＧＵＧＵＧＣＧＣＵＵＣＵＣＵＣＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＵＡＵＵＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＵＣＵＧＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＣＣＵＧＧＧＣＵＡＣＣＵＧＡＵＵＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＣＵＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＵＧＣＣＵＣＵＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＵＧＵＣＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＧＣＧＧＣＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵＧＵＣＣＧＧＣＵＡＣＧＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＵＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＵＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＣＵＡＡＣＡＵＵＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＵＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡ
Ｒ－ｍＲＮＡ１：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＵＡＡＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＧＧＧＵＵＧＡＵＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＵＵＧＧＧＣＧＣＵＡＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＡＵＣＡＣＧＧＵＡＣＣＵＵＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＵＵＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＵＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＣＧＵＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＵＵＵＵＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＵＵＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＡＵＡＧＡＣＵＧＣＵＣＡＣＧＣＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＣＧＧＣＣＡＡＣＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＧＣＵＣＡＧＣＡＣＵＡＣＣＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＧＵＣＡＣＣＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＧＣＧＵＵＧＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＵＧＧＧＡＣＧＣＵＣＵＡＡＵＡＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＧＡＡＧＡＧＵＣＵＡＵＵＧＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＡＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＧＧＣＵＡＡＵＣＣＵＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＵＣＧＵＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＵＧＵＣＣＧＵＧＵＵＵＣＡＵＵＵＵＡＵＵＣＣＵＡＵＡＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＣＧＵＵＡＣＣＡＵＡＵＡＧＣＵＡＵＵＧＧＡＵＵＧＧＣＣＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＡＡＵＡＧＡＧＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＧＧＧＵＵＵＡＵＡＣＣＡＣＵＵＡＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＣＡＵＵＡＣＡＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＡＵＡＣＡＧＣＡＡＡＡＵＧＧＣＣＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＵＧＣＵＣＣＣＵＵＣＵＡＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＧＡＵＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＵＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＵＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＡＧＵＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＵＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＵＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＵＣＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＵＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＧＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＣＧＵＧＡＣＡＵＣＵＣＡＵＣＵＧＣＣＵＣＣＵＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＡＧＵＣＵＵＵＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＵＧＧＧＵＣＵＡＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＵＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＵＣＡＵＣＧＣＡＣＣＧＣＣＵＧＵＧＵＧＣＧＣＵＵＣＵＣＵＣＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＵＡＵＵＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＵＣＵＧＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＣＣＵＧＧＧＣＵＡＣＣＵＧＡＵＵＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＣＵＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＵＧＣＣＵＣＵＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＵＧＵＣＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＧＣＧＧＣＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵＧＵＣＣＧＧＣＵＡＣＧＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＵＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＵＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＣＵＡＡＣＡＵＵＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＵＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ
ｍＲＮＡ１：ＵＵＡＡＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＧＧＧＵＵＧＡＵＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＵＵＧＧＧＣＧＣＵＡＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＡＵＣＡＣＧＧＵＡＣＣＵＵＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＵＵＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＵＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＣＧＵＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＵＵＵＵＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＵＵＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＡＵＡＧＡＣＵＧＣＵＣＡＣＧＣＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＣＧＧＣＣＡＡＣＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＧＣＵＣＡＧＣＡＣＵＡＣＣＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＧＵＣＡＣＣＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＧＣＧＵＵＧＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＵＧＧＧＡＣＧＣＵＣＵＡＡＵＡＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＧＡＡＧＡＧＵＣＵＡＵＵＧＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＡＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＧＧＣＵＡＡＵＣＣＵＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＵＣＧＵＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＵＧＵＣＣＧＵＧＵＵＵＣＡＵＵＵＵＡＵＵＣＣＵＡＵＡＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＣＧＵＵＡＣＣＡＵＡＵＡＧＣＵＡＵＵＧＧＡＵＵＧＧＣＣＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＡＡＵＡＧＡＧＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＧＧＧＵＵＵＡＵＡＣＣＡＣＵＵＡＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＣＡＵＵＡＣＡＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＡＵＡＣＡＧＣＡＡＡＡＵＧＧＣＣＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＵＧＣＵＣＣＣＵＵＣＵＡＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＧＡＵＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＵＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＵＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＡＧＵＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＵＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＵＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＵＣＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＵＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＧＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＣＧＵＧＡＣＡＵＣＵＣＡＵＣＵＧＣＣＵＣＣＵＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＡＧＵＣＵＵＵＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＵＧＧＧＵＣＵＡＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＵＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＵＣＡＵＣＧＣＡＣＣＧＣＣＵＧＵＧＵＧＣＧＣＵＵＣＵＣＵＣＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＵＡＵＵＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＵＣＵＧＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＣＣＵＧＧＧＣＵＡＣＣＵＧＡＵＵＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＣＵＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＵＧＣＣＵＣＵＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＵＧＵＣＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＧＣＧＧＣＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵＧＵＣＣＧＧＣＵＡＣＧＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＵＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＵＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＣＵＡＡＣＡＵＵＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＵＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡ
Ｒ－ｍＲＮＡ１：ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＵＵＡＡＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＧＧＧＵＵＧＡＵＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＵＵＧＧＧＣＧＣＵＡＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＡＵＣＡＣＧＧＵＡＣＣＵＵＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＵＵＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＵＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＣＧＵＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＵＵＵＵＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＵＵＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＡＵＡＧＡＣＵＧＣＵＣＡＣＧＣＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＣＧＧＣＣＡＡＣＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＧＣＵＣＡＧＣＡＣＵＡＣＣＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＧＵＣＡＣＣＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＧＣＧＵＵＧＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＵＧＧＧＡＣＧＣＵＣＵＡＡＵＡＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＧＡＡＧＡＧＵＣＵＡＵＵＧＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＡＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＧＧＣＵＡＡＵＣＣＵＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＵＣＧＵＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＵＧＵＣＣＧＵＧＵＵＵＣＡＵＵＵＵＡＵＵＣＣＵＡＵＡＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＣＧＵＵＡＣＣＡＵＡＵＡＧＣＵＡＵＵＧＧＡＵＵＧＧＣＣＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＡＡＵＡＧＡＧＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＧＧＧＵＵＵＡＵＡＣＣＡＣＵＵＡＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＣＡＵＵＡＣＡＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＡＵＡＣＡＧＣＡＡＡＡＵＧＧＣＣＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＵＧＣＵＣＣＣＵＵＣＵＡＣＣＣＵＣＵＧＧＡＧＧＡＵＧＧＣＡＣＣＧＣＵＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＵＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡＵＵＧＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＵＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＡＣＣＵＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＡＡＧＡＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＡＧＵＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＵＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＵＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＵＣＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＣＵＡＵＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＵＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＧＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＣＧＵＧＡＣＡＵＣＵＣＡＵＣＵＧＣＣＵＣＣＵＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＡＧＵＣＵＵＵＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＵＧＧＧＵＣＵＡＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＵＡＡＧＧＧＣＧＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＵＣＡＵＣＧＣＡＣＣＧＣＣＵＧＵＧＵＧＣＧＣＵＵＣＵＣＵＣＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＵＡＵＵＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＵＣＵＧＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＣＣＵＧＧＧＣＵＡＣＣＵＧＡＵＵＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＣＵＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＵＣＡＧＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＵＣＵＡＡＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＵＧＣＣＵＣＵＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＵＧＵＣＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＣＡＵＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＵＧＵＧＣＧＣＧＧＣＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵＧＵＣＣＧＧＣＵＡＣＧＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＵＣＵＣＵＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＵＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＣＵＡＡＣＡＵＵＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＵＧＣＣＧＣＣＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＡＡＧＧＣＵＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡ
【0124】
以上、本開示の好適な実施形態のみについて説明したが、本開示はいかなる形態にも限定されない。上記に開示した技術的な内容に沿った、当業者による簡単な変更や均等な置換は、本開示の保護スコープの範囲内であるとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の核酸配列を含む、対象核酸の安定性を向上させるｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧ－（Ｌ）ｎ－Ｘ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：１）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｌは、１０ヌクレオチド以下の長さのリンカー基を表す
【請求項2】
Ｌは、ＧＧＧＧＧを表す、請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項3】
以下の核酸配列を含む、請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
ＧＧＸ１Ｘ２ＧＧＧＧＧＸ３Ｘ４ＧＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＧＧＧＸ８（配列番号：３）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、およびＸ８は、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＵから独立して選択される
【請求項4】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６は、同一であり、任意には、Ａ、Ｃ、若しくはＵであり、並びに／または、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ８は、同一であり、任意には、Ａ、Ｃ、またはＵである、
請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項5】
配列番号：２および配列番号：４～１０のうちいずれか一つに示される配列である、請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子。
【請求項6】
請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子が、対象核酸の５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされている、
または、
対象核酸の内部に挿入されていることで、
安定性が向上された、保護された対象核酸。
【請求項7】
前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上、好ましくは、８～５０００ｎｔであり、
前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオアッセイ用の核酸、または核酸医薬である、
請求項６記載の保護された対象核酸。
【請求項8】
前記対象核酸は、
（１） アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーを含むが、これらに限定されないオリゴヌクレオチド、
（２） 一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡであり、
前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡを含むが、これらに限定されない、
請求項６記載の保護された対象核酸。
【請求項9】
（１）治療有効量の請求項６記載の保護された対象核酸、および、（２）薬学的に受容可能な担体、
を含む医薬組成物。
【請求項10】
請求項１記載のｍｉＲＮＡ－２９１１およびそれに由来する核酸分子が、対象核酸の５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされている、
または、
対象核酸の内部に挿入されている、
対象核酸の安定性の向上方法。
【請求項11】
前記対象核酸の長さは、８ｎｔ以上、好ましくは、８～５０００ｎｔであり、
前記対象核酸は、遺伝子ノックダウン用の核酸、遺伝子ノックアウト用の核酸、遺伝子活性化用の核酸、遺伝子改変用の核酸、遺伝子編集用の核酸、遺伝子調節用の核酸、タンパク質調節用の核酸、タンパク質発現用の核酸、バイオエッセイ用の核酸、または核酸医薬である、
請求項１０記載の対象核酸の安定性の向上方法。
【請求項12】
前記対象核酸は、
（１） アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアプタマーを含むが、これらに限定されないオリゴヌクレオチド、
（２） 一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡであり、
前記ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、これらのフラグメント、または他の調節ＲＮＡを含むが、これらに限定されない、
請求項１０記載の対象核酸の安定性の向上方法。
【国際調査報告】