知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-27
(54)【発明の名称】タウリンの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 11/00 20060101AFI20241120BHJP
C12N 9/88 20060101ALN20241120BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241120BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20241120BHJP
【ＦＩ】
C12P11/00 ZNA
C12N9/88
C12N15/31
C12N15/60
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024531729
(86)(22)【出願日】2021-11-29
(85)【翻訳文提出日】2024-07-29
(86)【国際出願番号】 EP2021083369
(87)【国際公開番号】W WO2023094010
(87)【国際公開日】2023-06-01
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】390008969
【氏名又は名称】ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ルーペルト、プファラー
(72)【発明者】
【氏名】ギュンター、ヴィヒ
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AE61
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC03
4B064CC06
4B064CC07
4B064CC10
4B064CC12
4B064CC15
4B064CC24
4B064CD02
4B064CD13
4B064CD20
4B064CD21
4B064CE03
4B064DA01
4B064DA10
(57)【要約】
本発明は、生体内変換によりＯ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からタウリンを製造する方法である。第１方法工程（生体内変換１）において、亜硫酸塩の存在下で、ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）の群から選択される酵素を用いて、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からＬ－システイン酸を生成し、次いで、第２方法工程（生体内変換２）において、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する。このタイプの生体内変換によりタウリンがもたらされる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体内変換によりＯ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からタウリンを製造する方法であって、ｉ）第１工程（生体内変換１）において、亜硫酸塩の存在下で、ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素を用いて、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からＬ－システイン酸を生成し、次いで、
ｉｉ）第２工程（生体内変換２）において、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する、
前記方法。
【請求項2】
前記ＯＡＳスルフィドリラーゼが細菌酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＯＡＳスルフィドリラーゼが発酵生産に由来する、請求項１および２の一方または両方に記載の方法。
【請求項4】
前記亜硫酸塩の濃度が少なくともＯＡＳと等モル濃度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）のクラスの酵素を用いて、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｌ－システインスルフィン酸脱デカルボキシラーゼが配列番号２であるか、該配列と相同な配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｌ－システインスルフィン酸脱デカルボキシラーゼが発酵生産に由来する、請求項５および６の一方または両方に記載の方法。
【請求項8】
ａ）ＯＡＳが発酵によって生産され、ｂ）ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスおよびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）のクラスの酵素が発酵によって生産され、
ｃ）ＯＡＳおよび亜硫酸塩が、ポイントｂのＯＡＳスルフィドリラーゼによる酵素触媒下で反応してＬ－システイン酸を形成し、
ｄ）ポイントｃのＬ－システイン酸が、ポイントｂのＣＳＡＤ酵素によってタウリンに脱炭酸される、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
すべての方法工程が１つの反応バッチで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
生体内変換２におけるＬ－システイン酸の生体内変換からのタウリンのモル収率が好ましくは少なくとも６０％である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体内変換によりＯ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からタウリンを製造する方法に関するものであり、第１方法工程（生体内変換１）において、亜硫酸塩の存在下で、ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素をもちいて、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からＬ－システイン酸を生成し、次いで、第２方法工程（生体内変換２）において、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する。この生体内変換の結果としてタウリンがもたらされる。
【0002】
タウリン（２－アミノエタンスルホン酸、ＣＡＳ番号１０７－３５－７）は、アミノ酸システインおよびメチオニンの分解産物として自然界に存在するアミノスルホン酸である。タウリンはエナジードリンクの成分であり、例えばネコのペットフードや養殖魚にも用いられている（Salze and Davis (2015) Aquaculture 437: 215-229）。しかしながら、タウリンには健康促進効果もあると考えられている（Ripps and Shen (2012), Molecular Vision 18: 2673-2686）。
【0003】
自然界において、タウリンはほぼ動物界にのみ存在し、細菌、藻類または植物に存在する例はわずかしかない。タウリンへの生合成経路は多様であり（概要については、例えばＫＥＧＧ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄａｔａｂａｓｅの“Taurine and hypotaurine metabolism”を参照）、とりわけＬ－システインから開始される。Ｌ－システインからタウリンに至る最も重要な合成工程を、式（１）～（５）に示す。
（１）Ｌ－システイン＋Ｏ２ －＞ Ｌ－システインスルフィン酸
（２）Ｌ－システインスルフィン酸＋１／２Ｏ２ －＞ Ｌ－システイン酸
（３）Ｌ－システインスルフィン酸 －＞ヒポタウリン＋ＣＯ２
（４）ヒポタウリン＋１／２Ｏ２ －＞ タウリン
（５）Ｌ－システイン酸 －＞ タウリン＋ＣＯ２
（１）Ｌ－システイン＋Ｏ２ －＞ Ｌ－システインスルフィン酸
（２）Ｌ－システインスルフィン酸＋１／２Ｏ２ －＞ Ｌ－システイン酸
（３）Ｌ－システインスルフィン酸 －＞ヒポタウリン＋ＣＯ２
（４）ヒポタウリン＋１／２Ｏ２ －＞ タウリン
（５）Ｌ－システイン酸 －＞ タウリン＋ＣＯ２
【0004】
（１）第一工程では、Ｌ－システインが酵素システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ、ＥＣ１．１３．１１．２０）によって酸化され、Ｌ－システインスルフィン酸（３－スルフィノアラニン、ＣＡＳ番号２０７１２１－４８－０）になる。
（２）システインスルフィン酸オキシダーゼ（以前はむしろ仮説的な酵素工程であった）は、Ｌ－システインスルフィン酸がさらに酸化されてＬ－システイン酸（（Ｒ）－２－アミノ－３－スルホプロピオン酸、ＣＡＳ番号２３５３７－２５－９）になる。
（３）システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）により、Ｌ－システインスルフィン酸が脱炭酸されてヒポタウリン（２－アミノエタンスルフィン酸、ＣＡＳ番号３００－８４－５）になる。
（４）ヒポタウリンが酸化されてタウリンになるが、これまで十分に説明されていなかった。
（５）（３）と同様の工程で、Ｌ－システイン酸が適切なＣＳＡＤ酵素によって脱炭酸されてタウリンになる。
（２）システインスルフィン酸オキシダーゼ（以前はむしろ仮説的な酵素工程であった）は、Ｌ－システインスルフィン酸がさらに酸化されてＬ－システイン酸（（Ｒ）－２－アミノ－３－スルホプロピオン酸、ＣＡＳ番号２３５３７－２５－９）になる。
（３）システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）により、Ｌ－システインスルフィン酸が脱炭酸されてヒポタウリン（２－アミノエタンスルフィン酸、ＣＡＳ番号３００－８４－５）になる。
（４）ヒポタウリンが酸化されてタウリンになるが、これまで十分に説明されていなかった。
（５）（３）と同様の工程で、Ｌ－システイン酸が適切なＣＳＡＤ酵素によって脱炭酸されてタウリンになる。
【0005】
現在、商業的に用いられるタウリンは化学的に生産されている。一つの公知の方法は、例えば、Changshu Yudong Chemical Factoryの方法であり、エチレンから開始されてエチレンイミンを経てタウリンに至る。化学的に生産された原料から持続可能な方法で生産された原料への消費者主導の傾向により、タウリン生産のためのバイオテクノロジー方法の研究がますます進んでいる。従来技術は、適切な生合成遺伝子を生産株で異種発現させ、タウリンまたはその生合成前駆体であるヒポタウリンを生産する代謝工学アプローチに依存している。
【0006】
Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 173-1183は、コイ（Cyprinus carpio）のＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子を異種発現する遺伝子組み換え酵母株について説明している。遺伝子組み換え株の増殖にＬ－システインを添加すると、主生成物としてヒポタウリンが生成され、さらに比較的低い割合のタウリンが生成されることが観察された。Ｈ２Ｏ２で処理すると、ヒポタウリンがタウリンに酸化された。S. cerevisiae自体は自身の代謝からシステインを生成することができるが、ヒポタウリンおよびタウリンを生成するには、増殖培地にＬ－システインを外部から添加する必要があった。
【0007】
Tevatia et al.(2019), Algal Research 40:101491も同様に、コイ由来の異種発現ＣＤＯおよびＣＳＡＤ遺伝子を用いて、藻類Chlamydomonas reinhardtiiにおいてタウリンを生産した。細胞内タウリンの収量は、乾燥バイオマス１ｇあたりタウリン０．１４ｍｇであった。
【0008】
Joo et al.(2018), J. Agric. Food Chem. 66:13454-13463は、振盪フラスコで増殖させたときに０．５ｇ／Ｌのタウリンを生産する細菌Corynebacterium glutamicumの遺伝子組み換え株について記載してる。タウリンは細胞内に蓄積され、増殖培地には分泌されないことは明らかであった。タウリンの合成は、Ｌ－システイン酸合成酵素、システインジオキシゲナーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を株内で異種発現させることによって達成された。さらに、メチオニンおよびシステインの生合成に関連するリプレッサー遺伝子が不活性化され、同時に硫黄の吸収が改善された。低収量に加えて、タウリンが細胞内で生産されるという事実は、生産物の分離の観点から基本的な欠点であると考えられる。タウリンを放出してさらに処理するには、細胞の複雑な破壊が必要である。
【0009】
ＷＯ１７２１３１４２Ａ１（味の素）は、システイン生産能力を有する菌株でシステインジオキシゲナーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼを異種発現させることによって得られるタウリン生産菌株について記載している。主な生産物は最大収量が４５０μＭのヒポタウリンであり、その後アルカリ処理することによってのみ、低い収量でのみタウリンに変換できる。
【0010】
ＵＳ９２６７１４８Ｂ２、ＵＳ２０１２／０２２２１４８Ａ１、ＵＳ２０１８／００２８４７４Ａ１、ＵＳ２０１９／００８５３３９、ＷＯ２０１７／１７６２７７Ａ１およびＷＯ２０１９／０９４０５１（Ｐｌａｎｔ Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、システインジオキシゲナーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの異種発現をさまざまな形で含むタウリンを生産する株および生物を記載している。これらの出願の主な焦点は植物におけるタウリンの生産であるが、収量については何も述べられていない。
【0011】
ＵＳ２０１９００６２７５７Ａ１（ＫｎｉｐＢｉｏ）は、タウリンまたはその前駆体を生産するための異種生産株について記載している。
【0012】
従来技術では、異種生産システムにおいてヒポタウリンまたはタウリンを生産するためのさまざまな代謝工学アプローチが開示されている。代謝工学アプローチによる生産量が開示されているが、工業的に用いるには収量が低すぎる。
【0013】
従来技術では、例えば、微生物の直接発酵（ＥＰ１１９１１０６Ｂ１、ワッカー）またはＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフィドリラーゼ（ＯＡＳスルフィドリラーゼ）により触媒されるＯＡＳの生体内変換（ＥＰ１２４７８６９Ｂ１、ワッカー）によって、非タンパク質構成（非天然）アミノ酸を製造する方法も提供されている。これらの方法は、一般式（６）に従って、ＯＡＳと求核剤との反応を触媒して非タンパク質構成アミノ酸を形成する。
（６）ＯＡＳ＋求核剤 －＞ 不飽和アミノ酸＋酢酸
（６）ＯＡＳ＋求核剤 －＞ 不飽和アミノ酸＋酢酸
【0014】
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）においては、セレニド、セレノール、アジド、シアニド、アゾールおよびイソキサゾリノンといったＯＡＳスルフィドリラーゼによって触媒されるＯＡＳとの反応に対する求核剤としての適合性について、多数の異なる求核剤が試験されている。さらに、一般式Ｈ－Ｓ－Ｒのチオ硫酸塩およびチオールの群からの硫黄化合物も用いられ、ラジカルＲは、一価の置換または非置換のアルキル、アルコキシ、アリールまたはヘテロアリールラジカルである。
【0015】
これらの方法は、Ｌ－システイン酸および／またはタウリンの生産には適していない。
【0016】
本発明の目的は、代謝工学によって生成される異種生産株をバイパスして、生体内変換によってタウリンを製造するバイオテクノロジー方法を提供することである。
【0017】
この目的は、生体内変換によりＯ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からタウリンを製造する方法であって、第１方法工程（生体内変換１）において、亜硫酸塩の存在下で、ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素を用いて、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からＬ－システイン酸を生成し、次いで、第２方法工程（生体内変換２）において、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する方法によって達成される。
【0018】
添付の出願Ｃｏ１２１０２および本発明の実施例に開示されているように、驚くべきことに、亜硫酸の塩（以下、亜硫酸塩またはＳＯ３
２－と称する）が反応（６）における求核剤として適しており、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）の拡張として、これまで知られていなかった式（７）の反応において非タンパク質構成アミノ酸であるＬ－システイン酸の合成（生体内変換１）を可能にすることがわかった。
（７）ＯＡＳ＋ＳＯ３ ２－ －＞ Ｌ－システイン酸＋酢酸
（７）ＯＡＳ＋ＳＯ３ ２－ －＞ Ｌ－システイン酸＋酢酸
【0019】
同じく予想外なことに、生体内変換１で生成されたＬ－システイン酸は、組み換えにより生成されたＣＳＡＤ酵素によって、式（５）に従って、さらなる処理なしにタウリンに脱炭酸することができた（生体内変換２）。
【0020】
本発明のタウリンの製造方法の利点は、タウリンを製造するために持続可能であり、技術的に実現可能で経済的に実行可能な生体内変換方法である点にある。環境に有害な化学物質は不要である。化石原料は消費されず、有毒な化学廃棄物および／または廃ガスは生成されない。したがって、本発明の製造方法は環境に優しく、持続可能である。さらに、本発明の方法は極端な反応条件や特別な装置を必要とせず、したがって技術的に実施しやすい。このような方法に対する需要が高まっている。
【0021】
本発明の方法によるタウリンは、さらなる処理工程を経ずに直接用いることもでき、既知の方法によって濃縮することもできる。
【0022】
本発明の文脈において、製造方法は以下のように区別される。
１．化学的方法
２．バイオテクノロジー方法
ａ）代謝工学によるもの
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、遺伝子および調節プロセスの最適化または改変によって生物の代謝経路を変更するバイオテクノロジー方法である。新規または改変された酵素は、酵素の遺伝子をゲノムに補充することによって生物に導入することができ、または内因性酵素の遺伝子を増強または減弱したレベルで発現させることができ、それによって生物に新しい代謝経路を確立するか、または既存の代謝経路を増強または減弱させることができる。代謝工学の目標は、生物において新しい代謝物または細胞内因性代謝物をより高い収率で生成させることである。代謝工学プロセスでは、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝物に特有の出発物質を用いず、代わりに、対象の生物の増殖に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、またはペプトンや酵母エキス等の複合アミノ酸混合物）、および増殖に必要なその他の塩から構成される、増殖培地とも呼ばれる栄養培地のみが用いられる。このような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
ｂ）生体内変換によるもの
生体内変換は、酵素触媒作用下で１種以上の反応物を生成物に変換することと定義され、酵素基質は酵素とともに反応バッチに添加される。反応バッチでは、本発明におけるＯＡＳまたはＬ－システイン酸等の添加された酵素基質が酵素的に変換される。本発明では、これは、ＯＡＳについては式（７）に従って亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって達成され、Ｌ－システイン酸については式（５）に従ってシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）のクラスから選択される酵素によって達成される。反応物は、化学的または生物工学的生産に由来し得る。本発明の方法で用いられるＯＡＳは、例えば、化学合成に由来し得るか、または生産株の発酵による生物工学的生産に由来し得る。本発明の方法で用いられるＬ－システイン酸は、例えば、化学合成またはＯＡＳの生体内変換によるバイオテクノロジーによる生産から得られる。酵素触媒に用いられる酵素は、例えば、発酵による生産株の増殖によるバイオテクノロジーによる製造から得られるか、または酵素を含む生物学的材料（例えば、植物、菌類、藻類、動物の臓器）が用いられる。生産株の増殖からのバイオマスまたは生物学的材料は、そのまま用いることができ、または酵素は、生体内変換の要件に応じてそこから単離される。本発明の方法で用いられる酵素ＣｙｓＭおよびＣＳＡＤｃｃは、生産株の発酵によるバイオテクノロジーによる製造から得ることができる。
１．化学的方法
２．バイオテクノロジー方法
ａ）代謝工学によるもの
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、遺伝子および調節プロセスの最適化または改変によって生物の代謝経路を変更するバイオテクノロジー方法である。新規または改変された酵素は、酵素の遺伝子をゲノムに補充することによって生物に導入することができ、または内因性酵素の遺伝子を増強または減弱したレベルで発現させることができ、それによって生物に新しい代謝経路を確立するか、または既存の代謝経路を増強または減弱させることができる。代謝工学の目標は、生物において新しい代謝物または細胞内因性代謝物をより高い収率で生成させることである。代謝工学プロセスでは、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝物に特有の出発物質を用いず、代わりに、対象の生物の増殖に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、またはペプトンや酵母エキス等の複合アミノ酸混合物）、および増殖に必要なその他の塩から構成される、増殖培地とも呼ばれる栄養培地のみが用いられる。このような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
ｂ）生体内変換によるもの
生体内変換は、酵素触媒作用下で１種以上の反応物を生成物に変換することと定義され、酵素基質は酵素とともに反応バッチに添加される。反応バッチでは、本発明におけるＯＡＳまたはＬ－システイン酸等の添加された酵素基質が酵素的に変換される。本発明では、これは、ＯＡＳについては式（７）に従って亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって達成され、Ｌ－システイン酸については式（５）に従ってシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）のクラスから選択される酵素によって達成される。反応物は、化学的または生物工学的生産に由来し得る。本発明の方法で用いられるＯＡＳは、例えば、化学合成に由来し得るか、または生産株の発酵による生物工学的生産に由来し得る。本発明の方法で用いられるＬ－システイン酸は、例えば、化学合成またはＯＡＳの生体内変換によるバイオテクノロジーによる生産から得られる。酵素触媒に用いられる酵素は、例えば、発酵による生産株の増殖によるバイオテクノロジーによる製造から得られるか、または酵素を含む生物学的材料（例えば、植物、菌類、藻類、動物の臓器）が用いられる。生産株の増殖からのバイオマスまたは生物学的材料は、そのまま用いることができ、または酵素は、生体内変換の要件に応じてそこから単離される。本発明の方法で用いられる酵素ＣｙｓＭおよびＣＳＡＤｃｃは、生産株の発酵によるバイオテクノロジーによる製造から得ることができる。
【0023】
本発明の文脈において、反応バッチは、反応物（出発物質）、酵素、および任意に他の反応物の混合物として定義され、その中で反応物は生成物に変換される。
【0024】
本発明の意味における反応の収率は、反応条件下で生成物に変換される、使用される反応物の量として定義される。収率は、絶対量（ｇまたはｍｍｏｌ）、単位体積あたりの生成物の絶対量（ｍＭまたはｇ／Ｌ）で表される体積収率、または用いられる反応物の割合（反応物および生成物の分子量を考慮）で表される、パーセント収率とも呼ばれる相対収率で表すことができる。
【0025】
発酵は、工業規模で細胞培養物を生産（培養）するための方法工程であり、好ましくは微生物生産株を、培地、温度、ｐＨ、酸素供給、および培地の混合の規定条件下で増殖させる。生産株の構成（遺伝子構成）に応じて、発酵の目的は、タンパク質／酵素または代謝産物を、いずれの場合も、さらなる使用のために可能な限り高い収率で生産することである。本発明の方法の構成であるＯＡＳ、ＯＡＳスルフィドリラーゼおよびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼは、発酵によって生産することができる。発酵の最終生成物は、生産株の細胞のバイオマス（発酵細胞）と、バイオマスから除去され、発酵中に増殖培地および発酵細胞によって分泌される代謝産物から形成される発酵培地（発酵上清）とからなる発酵ブロスである。発酵の目的産物は、発酵細胞または発酵培地に存在し得る。例えば、ＯＡＳは発酵培地に含まれるのに対し、酵素ＯＡＳスルフィドリラーゼおよびＣＳＡＤｃｃは発酵細胞に含まれる。
【0026】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｃｄｓまたはコード配列と同義）は、開始コドンで始まり、停止コドンで終わり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの領域を指す。ＯＲＦはコード領域または構造遺伝子とも呼ばれる。
【0027】
遺伝子とは、生物学的に活性なＲＮＡを生成するためのすべての基本情報を含むＤＮＡセクションを指す。遺伝子には、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが生成されるＤＮＡセクション、およびこのコピープロセスの調節に関与する発現シグナルが含まれる。発現シグナルには、例えば、少なくとも１つのプロモーター、転写開始点、翻訳開始点、およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が含まれる。ターミネーターと１つ以上のオペレーターは、追加の可能な発現シグナルである。
【0028】
ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡとも呼ばれ、タンパク質合成のための遺伝情報を運ぶ一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。ｍＲＮＡは細胞内の特定のタンパク質の組み立て指示を提供する。ｍＲＮＡ分子は、タンパク質合成に必要なメッセージを遺伝情報（ＤＮＡ）からタンパク質合成を司るリボソームに伝達する。細胞内では、ｍＲＮＡ分子は、遺伝子に対応するＤＮＡの部分の転写物として形成される。ＤＮＡに保存されている遺伝情報は、このプロセスによって変更されることはない。
【0029】
真核生物の遺伝子は、主にモザイク遺伝子と呼ばれるもので、原核生物の遺伝子とは異なりイントロン（遺伝子内領域）と呼ばれる非コード領域も含んでいる。エクソン（発現領域）と呼ばれるコード配列は、真核生物遺伝子のＤＮＡの部分で、ＲＮＡに転写された後、リボソームによってタンパク質のアミノ酸配列に翻訳される。ＤＮＡがＲＮＡに転写された後、イントロンは一次転写産物から切り離される。イントロンが除去されたタンパク質コードＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または「成熟」ｍＲＮＡと呼ばれる。これは、キャッピングやポリアデニル化等のさらなる修飾を受ける。次いで、成熟ｍＲＮＡのコード領域はタンパク質配列に翻訳される。エクソン／イントロン構造を含む真核生物遺伝子を原核生物で発現させる場合、原核生物ではエクソン／イントロン構造の処理が行われないため、成熟したｍＲＮＡのタンパク質配列またはコード領域を、イントロンを含まないＤＮＡに逆翻訳する必要がある。本発明の文脈において、タンパク質配列から誘導される遺伝子配列またはｍＲＮＡから誘導される遺伝子配列に言及する場合、意味するのはまさにこの逆翻訳のプロセスである。タンパク質配列またはｍＲＮＡ配列をＤＮＡ配列に逆翻訳すると同時に、配列の最適化、すなわち対応する原核生物のコドン使用法への適応（コドンの最適化）が行われることが好ましい。
【0030】
遺伝子構築物とは、遺伝子が他の遺伝要素（プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、複製起点等）に連結されたＤＮＡ分子を指す。本発明の文脈における遺伝子構築物は、環状ＤＮＡ分子であり、プラスミド、ベクターまたは発現ベクターと呼ばれる。遺伝子構築物の遺伝要素は、細胞の成長中にその染色体外遺伝を引き起こし、遺伝子によってコードされるタンパク質を生成する。
【0031】
略語ＷＴ（Ｗｔ）は野生型を表す。野生型遺伝子とは、進化を通じて自然に発生し、野生型ゲノムに存在する遺伝子の形態を指す。Ｗｔ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ等のデータベースで公開されている。
【0032】
生体内変換１：
本発明のタウリンの製造方法では、ＯＡＳが利用可能であることが必要である。ＯＡＳを生成するための化学的方法は、例えば、Ｌ－セリンのアセチル化によるが、これはＬ－セリンの価格が高いためコストがかかり、あるいは直接用いることができるラセミ体のＯ－アセチル－Ｄ／Ｌ－セリンの生成により、または、例えば溶解によりラセミ体からＯＡＳを予め得ることもできる。直接アセチル化の場合、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリン（ＮＡＳ）が副産物として形成されることがあり、例えばＬ－セリンのヒドロキシル基またはアミノ基の非選択的アセチル化、または中性からアルカリ性のｐＨ値でのＯＡＳからＮＡＳへの既知の転位（Tai et al. (1995), Biochemistry 34: 12311-12322）によるが、これらは収量が低下するか、Ｌ－セリンのアミノ基に保護基を事前に導入する必要がある。したがって、Ｌ－セリンの直接アセチル化は、経済的に実行可能な方法には実用的ではない。
本発明のタウリンの製造方法では、ＯＡＳが利用可能であることが必要である。ＯＡＳを生成するための化学的方法は、例えば、Ｌ－セリンのアセチル化によるが、これはＬ－セリンの価格が高いためコストがかかり、あるいは直接用いることができるラセミ体のＯ－アセチル－Ｄ／Ｌ－セリンの生成により、または、例えば溶解によりラセミ体からＯＡＳを予め得ることもできる。直接アセチル化の場合、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリン（ＮＡＳ）が副産物として形成されることがあり、例えばＬ－セリンのヒドロキシル基またはアミノ基の非選択的アセチル化、または中性からアルカリ性のｐＨ値でのＯＡＳからＮＡＳへの既知の転位（Tai et al. (1995), Biochemistry 34: 12311-12322）によるが、これらは収量が低下するか、Ｌ－セリンのアミノ基に保護基を事前に導入する必要がある。したがって、Ｌ－セリンの直接アセチル化は、経済的に実行可能な方法には実用的ではない。
【0033】
ＯＡＳのバイオテクノロジーによる生産は既知である。これには、システイン代謝の調節が解除され、その結果、高レベルのＯＡＳを提供する生物の使用が含まれる。ＯＡＳを生産するための発酵プロセスは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（ワッカー）に開示されており、本発明の実施例１に記載されている。
【0034】
大腸菌を用いたＯＡＳの生産が好ましく、ブダペスト条約に従ってDSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１３４９５番号で寄託されているEscherichia coli（大腸菌）を用いることが特に好ましい。
【0035】
本発明の利点は、例えばＥＰ１２３３０６７に従って実施される発酵から得られるＯＡＳ含有発酵ブロスを、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿または結晶化を含むさらなる後処理、精製または単離工程なしで、例えば遠心分離によって粒子状バイオマスを除去した後に発酵上清としてＯＡＳ源として本発明の方法に直接用いることができる点にある。この手順は特に経済的であり、不安定な化合物の単離を回避する。
【0036】
当業者であれば、同位体分析を用いて、本発明の方法で用いることを望むＯＡＳやＬ－システイン酸等の物質が化学的生産または発酵生産に由来するかどうかを判断ｓ得ることができる。区別可能な同位体分析方法は、例えばSieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527に記載されており、例えば炭素や窒素の同位体比の測定に基づいており、同位体比は、生成物が化学的（石油ベース）生産によるか発酵生産（植物ベースの原材料から）によるかによって異なる。
【0037】
ＯＡＳスルフィドリラーゼはこれまでさまざまな植物や微生物から単離されてきた。例えば、大腸菌には２種類のＯＡＳスルフィドリラーゼ酵素があり、それぞれＣｙｓＫおよびＣｙｓＭと呼ばれている。関連する遺伝子も同様に知られており、それぞれｃｙｓＫおよびｃｙｓＭと呼ばれている。
【0038】
本発明の意味におけるＯＡＳスルフィドリラーゼは、式（８）に従ってＯＡＳからタンパク質構成アミノ酸Ｌ－システインの合成を触媒できることを特徴とし、この場合に用いられる求核剤は硫化物である。したがって、ＣｙｓＭ関連酵素およびＣｙｓＫ関連酵素の両方が、本発明の意味におけるＯＡＳスルフィドリラーゼである。
（８）ＯＡＳ＋Ｓ２－ －＞ Ｌ－システイン＋酢酸
（８）ＯＡＳ＋Ｓ２－ －＞ Ｌ－システイン＋酢酸
【0039】
両酵素は非常に類似した反応機構を有し、Ｌ－システインの生合成に関与しているが、ＣｙｓＫと異なり、ＣｙｓＭは式（６）に従ってＯＡＳと反応できる求核剤に関して可変の基質スペクトルを有する。例えば、ＣｙｓＫと異なり、ＣｙｓＭはＯＡＳとチオ硫酸塩との反応を触媒してＳ－スルホシステイン（ＣＡＳ番号１６３７－７１－４）を形成できることが知られている。この反応は、チオ硫酸塩を唯一の硫黄源とする細菌の増殖において重要な役割を果たしている。さらに、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）は、非タンパク質性アミノ酸の製造にＣｙｓＭを用いることを開示している。
【0040】
好ましくは、本発明の方法は、ＯＡＳスルフィドリラーゼが細菌酵素であり、特に好ましくはＣｙｓＭであり、特に好ましくは大腸菌株由来のＣｙｓＭであることを特徴とする。
【0041】
ＣｙｓＭを含むＯＡＳスルフィドリラーゼが、発酵生産、特に好ましくは大腸菌株の発酵、特に好ましくは大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵に由来することを特徴とする。
【0042】
実施例２は、大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵バイオテクノロジー生産の手順を開示する。生産株は、この場合、大腸菌ＤＨ５α等の宿主株と、ＯＡＳスルフィドリラーゼを発現するのに適した遺伝子構築物、好ましくは遺伝子構築物ｐＦＬ１４５とからなる。宿主株および遺伝子構築物、ならびに生産株の生産は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に記載されている。生産株は、ブダペスト条約に従って、DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１４０８８の番号で寄託されている。
【0043】
生産株の発酵によって得られる発酵ブロスは、ＯＡＳスルフィドリラーゼを含む発酵細胞と発酵培地（発酵上清）とからなる。本発明の方法では、発酵ブロスをさらに処理せずにそのまま用いることもでき、あるいは、例えば遠心分離または濾過によって発酵ブロスから分離した後に、例えば緩衝液中の発酵槽細胞の懸濁液（再懸濁発酵槽細胞）を使用することもできる。実施例２は、大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の再懸濁ＣｙｓＭ含有発酵細胞の製造について記載している。
【0044】
さらに、ＯＡＳスルフィドリラーゼは、発酵細胞を機械的に破壊した後の細胞ホモジネートの形態、または化学的に透過処理した（例えば、クロロホルムによる）細胞の形態で用いられ、あるいは細胞ホモジネートから粒子成分を除去した後の細胞抽出物として、またはクロマトグラフィー等により精製された酵素として用いられると考えられる。ＯＡＳスルフィドリラーゼは、さらなる処理を行わずに発酵ブロスとして、再懸濁した発酵槽細胞の細胞懸濁液として、あるいは再懸濁した発酵槽細胞を機械的に破壊した後の細胞ホモジネートとして、あるいは化学的に透過処理した（例えば、クロロホルムによる）細胞の形態で用いることが好ましい。ＯＡＳスルフィドリラーゼは、再懸濁した発酵細胞の形態、または細胞ホモジネートとして用いることが特に好ましい。ＯＡＳスルフィドリラーゼ生産株の再懸濁発酵細胞を用いることが特に好ましい。
【0045】
本発明の方法において、ＯＡＳは、式（７）に従って、ＯＡＳスルフィドリラーゼの触媒作用下で亜硫酸塩と反応してＬ－システイン酸を形成する。
【0046】
亜硫酸は、可逆平衡で同時に存在する多数の化学種を形成し、本発明の生体内変換における求核剤としてのそれぞれの適合性は予測できなかった。亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）はガス状ＳＯ２の水溶液であり、二塩基酸として、水溶液のｐＨに応じて異なる平衡で存在し、前記平衡の種も求核剤としての適合性が異なることが知られている。以下の平衡（９）～（１３）が知られている。
（９）ＳＯ２（気体） ＜－＞ ＳＯ２（溶解）
（１０）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ ＜－＞ Ｈ２ＳＯ３
（１１）Ｈ２ＳＯ３ ＜－＞ ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（１２）ＨＳＯ３ － ＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（１３）２ＨＳＯ３ －＜－＞ Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
（９）ＳＯ２（気体） ＜－＞ ＳＯ２（溶解）
（１０）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ ＜－＞ Ｈ２ＳＯ３
（１１）Ｈ２ＳＯ３ ＜－＞ ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（１２）ＨＳＯ３ － ＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（１３）２ＨＳＯ３ －＜－＞ Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
【0047】
亜硫酸およびその塩は抗菌作用を示すため、食品業界では防腐剤として用いられている。これは、亜硫酸およびその塩が微生物を殺す可能性があることを意味し、これは微生物の生存に必要な酵素の不活性化に起因する。したがって、当業者は、亜硫酸またはその塩を用いるとＣｙｓＭ酵素も不活性化され、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示された方法ではＬ－システイン酸を製造できないと予測するであろう。
【0048】
亜硫酸塩およびＯＡＳを生体内変換に用いると、タウリンを製造するバイオテクノロジー方法の出発化合物としてＬ－システイン酸を生成できることは、当業者にとって驚くべきことであった。
【0049】
原則として、考えられる亜硫酸の塩はすべてこの反応に適している。好ましくは、本発明の方法は、用いられる亜硫酸の塩が、Ｎａ２ＳＯ３、Ｋ２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（またはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）またはＫＨＳＯ３であることを特徴とする。特に好ましくは、用いられる亜硫酸の塩は、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（またはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）または（ＮＨ４）２ＳＯ３であり、特に好ましくはＮａ２ＳＯ３またはＮａＨＳＯ３（またはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）である。
【0050】
亜硫酸の無水物であるガス状二酸化硫黄を用いることが考えられ、これを反応バッチに導入すると、亜硫酸Ｈ２ＳＯ３に水和され、ｐＨに応じて、脱プロトン化された形態ＨＳＯ３
－およびＳＯ３
２－と平衡状態になる。
【0051】
好ましくは、本発明の方法は、亜硫酸塩の濃度が少なくともＯＡＳと等モル濃度であることを特徴とする。特に好ましくは、亜硫酸塩は少なくとも１．５倍モル過剰であり、特に好ましくは少なくとも５倍モル過剰である。
【0052】
特に好ましい実施形態において、タウリンを製造する方法は、ＯＡＳスルフィドリラーゼおよびＯＡＳの両方が発酵によって生成されることを特徴とする。
【0053】
本発明による生体内変換プロセスの反応物としてのＯＡＳは、ｐＨ約７からＮ－アセチル－Ｌ－セリン（ＮＡＳ）に異性化し、その後は亜硫酸塩と反応してＬ－システイン酸を形成するのに適さなくなる。反応のメカニズムはTai et al. (1995), Biochemistry 34: 12311-12322において研究されており、アシルラジカルのカルボニル炭素に対する脱プロトン化されたアミノ基による分子内求核攻撃が関与している。この反応はｐＨの低下とともに抑制されるため、化合物は、例えばｐＨ４．０で安定する。
【0054】
したがって、本発明による生体内変換プロセスは、好ましくは、ＯＡＳからＮＡＳへの異性化を最小限に抑えるｐＨ条件下で反応が行われるという点で特徴付けられる。
【0055】
生体内変換１の反応温度は、好ましくは５℃～７０℃の間で選択される。好ましくは１０℃～６０℃の間の反応温度、特に好ましくは１５℃～５０℃の間、特に好ましくは２０℃～４０℃の間の反応温度である。
【0056】
バッチ中のＯＡＳ濃度は、好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも４０ｇ／Ｌである。
【0057】
ＯＡＳの生体内変換において、用いられるＯＡＳのモル量に基づくＬ－システイン酸のモル収率は、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％である。
【0058】
生体内変換プロセス１のさらに好ましい実施形態では、基質ＯＡＳは、いわゆるフィードプロセスで保有宿主（reservoir）からＯＡＳスルフィドリラーゼおよび亜硫酸塩からなる反応バッチに計量供給される（実施例５）。ＯＡＳ含有保有宿主におけるＯＡＳからＮＡＳへの異性化は、好ましくはｐＨを≦６．５、特に好ましくはｐＨを≦６．０、特に好ましくはｐＨを≦５．５に設定することによって回避される。同時に、反応バッチ内のｐＨは、Ｌ－システイン酸を形成する反応を促進するように調整され、好ましくはｐＨ≦７．５、特に好ましくはｐＨ≦７．０、特に好ましくはｐＨ≦６．５である。
【0059】
式（７）によると、ＯＡＳからＬ－システイン酸を形成する反応では、化学量論量の酢酸が放出され、反応が進むにつれてバッチ内のｐＨの低下をもたらす。過度に低いｐＨはＯＡＳスルフィドリラーゼの活性に影響を与えるため、ｐＨの過度に大きな低下を防ぐことを優先する必要がある。これは、バッチ内の適切な高濃度緩衝液によって受動的に行うか、測定および制御ユニットによって能動的に達成することができる。
【0060】
特に好ましくは、実施例５に開示されているように、測定および制御ユニットによる能動的なｐＨ制御であり、これは、ｐＨが目標値から逸脱した場合に、アルカリ溶液または酸を計量して添加することによって所望のｐＨを回復する（いわゆるｐＨスタット法）。
【0061】
生体内変換１は、不連続または連続操作で実行することができる。不連続操作（バッチ操作）では、すべての反応物が反応の途中でバッチに添加され、反応終了後にバッチが処理される。連続操作では、ＯＡＳ、ＣｙｓＭ酵素および亜硫酸塩が反応中に常に計量供給され、生成物Ｌ－システイン酸を含む溶液が同時にバッチから除去される。反応物が、反応容器内の滞留時間中に完全に反応して生成物Ｌ－システイン酸を形成できるように計量供給される定常状態が確立される。非天然アミノ酸の連続製造方法は、例えば、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）に開示されている。生体内変換１は、好ましくは不連続プロセスである。
【0062】
生体内変換２：
本発明のタウリンの製造方法は、生体内変換１でＬ－システイン酸を生成し、次いで生体内変換２でＬ－システイン酸を脱炭酸してタウリンを生成することで構成される。
本発明のタウリンの製造方法は、生体内変換１でＬ－システイン酸を生成し、次いで生体内変換２でＬ－システイン酸を脱炭酸してタウリンを生成することで構成される。
【0063】
システイン酸からタウリンへの脱炭酸は、化学的に、または生体内変換における酵素触媒によって行うことができる。持続可能ではないと考えられている金属触媒による高温での熱脱炭酸は知られているが、エネルギーを大量に消費し、副産物の割合が高いという欠点がある。
【0064】
好ましくは、本発明の方法は、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）、またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）のクラスの酵素を用いてＬ－システイン酸をタウリンに脱炭酸することを特徴とする。
【0065】
Ｌ－システイン酸を酵素触媒で脱炭酸してタウリンにするには、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）クラスの酵素が特に好ましい。ＣＳＡＤ酵素は、式（３）に従ってＬ－システインスルフィン酸を脱炭酸してヒポタウリンにすることが知られている。これらの酵素は、程度の差はあるものの、式（５）に従って基質としてのＬ－システイン酸を脱炭酸してタウリンにすることもできる。実施例７～１１に開示されているように、例えば、Cyprinus carpio（コイ）由来のＣＳＡＤｃｃ酵素は、Ｌ－システイン酸を脱炭酸してタウリンにするのに適している。
【0066】
クラスＥＣ４．１．１．２９の酵素（ＣＳＡＤ）は、主に哺乳類を含む後生動物（多細胞動物）に見出される。ＣＳＡＤ活性を有する酵素は、単細胞生物、例えばSynechoccocus属の藻類、および細菌または真菌にも見出される。好ましくは、本発明のタウリンの製造方法は、ヒト（Homo sapiens）、ウシ（Bos taurus）、ラット（Rattus norvegicus）またはマウス（Mus musculus）から選択される哺乳類、およびコイ（Cyprinus carpio）等の魚類からのクラスＥＣ４．１．１．２９のＣＳＡＤ酵素、特に好ましくはヒト（Homo sapiens）、ラット（Rattus norvegicus）またはコイ（Cyprinus carpio）からの酵素を用いることを特徴とする。
【0067】
コイからのＣＳＡＤ酵素（ＣＳＡＤｃｃ、Cyprinus carpio）が特に好ましい。実施例では、配列番号１のｎｔ３１－１５３０に開示され、ＣＳＡＤｃｃ ｃｄｓと呼ばれるｃｄｓのＤＮＡ配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、ＣＳＡＤｃｃと呼ばれる、Cyprinus carpio由来のＷｔ ＣＳＡＤ酵素のタンパク質配列から誘導されるＣＳＡＤｃｃ酵素が用いられる
【0068】
Ｗｔ ＣＳＡＤｃｃアミノ酸配列の基礎を形成するＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースにおいて、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＩＤ：ＡＢ２２０５８５．１（ｃｄｓ：ｎｔ８２－１５８４）で入手することができる。対応するＷｔ ＣＳＡＤｃｃアミノ酸配列から派生するのは、大腸菌での発言のためにコドンが最適化され、同一のアミノ酸配列をコードするＣＳＡＤｃｃ ｃｄｓ ＤＮＡ配列（配列番号１のｎｔ３１－１５３０）である。コドン最適化には、実施例６で用いたＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア等の公開されているソフトウェアプログラムが利用可能である。配列番号１のＤＮＡは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ等の業者によって提供される既知の方法で合成される。
【0069】
特に好ましくは、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼは、配列番号２またはこの配列と相同な配列である。
【0070】
相同な配列とは、ＤＮＡまたはアミノ酸の配列が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％同一であり、相同配列における各変更が１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、付加、欠失および置換から選択されることを意味するものと理解される。
【0071】
ＤＮＡの同一性の度合いは、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/のｂｌａｓｔｎアルゴリズムに基づく「nucleotide blast」プログラムによって決定される。２つ以上のヌクレオチド配列をアラインメントするために用いられるアルゴリズムパラメータは、デフォルトのパラメータである。デフォルトの一般パラメータは下記のとおりである：Max target sequences＝１００；Short queries＝「Automatically adjust parameters for short input sequences」；Expect Threshold＝１０；Word size＝２８；Automatically adjust parameters for short input sequences＝０。対応するデフォルトのスコアリングパラメータは下記のとおりである：Match/Mismatch Scores＝１、－２、Gap Costs＝Linear。
【0072】
タンパク質配列は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/の「protein blast」プログラムを用いて比較される。このプログラムはｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いる。２つ以上のタンパク質配列をアラインメントするために用いられるアルゴリズムパラメータは、デフォルトのパラメータである。デフォルトの一般パラメータは下記のとおりである：Max target sequences＝１００；Short queries＝「Automatically adjust parameters for short input sequences」；Expect Threshold＝１０；Word size＝３；Automatically adjust parameters for short input sequences＝０。デフォルトのスコアリングパラメータは下記のとおりである：Matrix＝BLOSUM62；Gap Costs＝Existence：11 Extension: 1；Compositional adjustments＝Conditional compositional score template adjustment。
【0073】
好ましくは、本発明の方法は、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼが発酵生産に由来することを特徴とする。大腸菌生産株における対応するＣＳＡＤｃｃ酵素の組み換え生産は、実施例６に開示されている。この目的のために、ＣＳＡＤｃｃ ｃｄｓは、既知の方法で発現ベクター、例えばベクターｐＫＫｊにクローニングされ、遺伝子構築物ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊが生成される（図１）。生産株は、遺伝子構築物ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを大腸菌宿主株、例えば大腸菌ＪＭ１０５株に同様に既知の方法で形質転換し、得られた生産株大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを用いて、同様に既知の方法でＣＳＡＤｃｃ酵素を生産することによって生産される。ＣＳＡＤｃｃ酵素は、実験室目的で振盪フラスコ規模で、または発酵によって生産することができる（実施例６）。
【0074】
ＣＳＡＤ酵素は、補因子としてピリドキサールリン酸（ＰＬＰ、ＣＡＳ番号５４－４７－７）を含む。したがって、Ｌ－システイン酸をタウリンに変換するための増殖培地または生体内変換バッチにＰＬＰを補充することは、プロセス改善を達成する１つの方法である。ＰＬＰはビタミンＢ６ファミリーに属するため、ピリドキシン（ＣＡＳ番号６５－２３－６）、ピリドキサール（ＣＡＳ番号６６－７２－８）またはピリドキサミン（ＣＡＳ番号８５－８７－０）等のビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーを補充することは、プロセス改善に適した代替手段である。好ましくは、Ｌ－システイン酸をタウリンに変換するための生体内変換プロセスは、≧２０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは≧１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは≧４ｍｇ／ＬのＰＬＰの存在下で実行されることを特徴とする。
【0075】
本発明の方法において、振盪フラスコ内での増殖または発酵によって得られるＣＳＡＤ酵素、好ましくはＣＳＡＤｃｃは、さらなる処理を行わずに発酵ブロスとして、または、例えば遠心分離および緩衝液中での発酵細胞の再懸濁（再懸濁された発酵細胞）による細胞の再単離後の細胞懸濁液として用いることができる。さらに、ＣＳＡＤ酵素、好ましくはＣＳＡＤｃｃは、再懸濁された発酵細胞を機械的に破壊した後の細胞ホモジネートの形態、または化学的に透過処理した（例えば、クロロホルムによる）細胞の形態で用いられ、あるいは細胞ホモジネートから粒子成分を除去した後の細胞抽出物として、またはクロマトグラフィー等により精製された酵素として用いることができる。
【0076】
ＣＳＡＤ酵素（ＣＳＡＤｃｃ）は、さらなる処理を行わずに発酵ブロスとして、再懸濁発酵細胞として、または再懸濁発酵細胞の機械的破壊後の細胞ホモジネートとして用いることが好ましい。特に好ましくは、ＣＳＡＤ酵素は、再懸濁発酵細胞として、または再懸濁発酵細胞の機械的破壊後の細胞ホモジネートとして用いることが好ましい。特に好ましくは、ＣＳＡＤ酵素は、再懸濁発酵細胞の形態で用いることが好ましい。
【0077】
ＣＳＡＤ酵素、好ましくはＣＳＡＤｃｃによるＬ－システイン酸のタウリンへの生体内変換は、Ｌ－システイン酸のタウリンへの効率的な脱炭酸を可能にするｐＨおよび温度条件下で行うことが好ましい。
【0078】
生体内変換２が行われる好ましいｐＨ範囲はｐＨ５．０～９．０であり、特に好ましくはｐＨ６．０～８．５、特に好ましくはｐＨ６．５～８．０である。
【0079】
生体内変換２は、好ましくは７０℃未満、好ましくは６０℃未満、特に好ましくは５０℃未満、特に好ましくは４０℃未満の温度で行われる。
【0080】
システイン酸の生体内変換からのタウリンのモル収率は、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％である。
【0081】
システイン酸からタウリンを製造するための生体内変換は、不連続または連続操作で実行することができる。不連続操作（バッチ操作）では、すべての反応物が反応の途中でバッチに添加され、反応終了後にバッチが処理される。連続操作では、ＣＳＡＤ酵素は、例えば膜反応器または支持体上に固定された固定相として投入され、基質Ｌ－システイン酸は移動相として計量供給される。移動相と固定相との接触時間は、基質Ｌ－システイン酸が完全に反応して生成物タウリンを形成できるように設定される。不連続（バッチ）操作が好ましい。
【0082】
生体内変換１および生体内変換２を含むＯＡＳからタウリンを製造するための好ましいプロセスは、以下の工程を含むことを特徴とする。
ａ）ＯＡＳが発酵によって生産され、
ｂ）ＣｙｓＭ等のＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスおよびＣＳＡＤｃｃ等のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）のクラスの酵素が発酵によって生産され、
ｃ）ＯＡＳおよび亜硫酸または亜硫酸塩が、ポイントｂのＯＡＳスルフィドリラーゼによる酵素触媒下で反応してＬ－システイン酸を形成し、
ｄ）ポイントｃのＬ－システイン酸が、ポイントｂのＣＳＡＤ酵素によってタウリンに脱炭酸される。
ａ）ＯＡＳが発酵によって生産され、
ｂ）ＣｙｓＭ等のＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスおよびＣＳＡＤｃｃ等のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）のクラスの酵素が発酵によって生産され、
ｃ）ＯＡＳおよび亜硫酸または亜硫酸塩が、ポイントｂのＯＡＳスルフィドリラーゼによる酵素触媒下で反応してＬ－システイン酸を形成し、
ｄ）ポイントｃのＬ－システイン酸が、ポイントｂのＣＳＡＤ酵素によってタウリンに脱炭酸される。
【0083】
特に好ましくは、工程ａ、ｂ、ｃおよびｄを含む方法は、生体内変換１において、ＯＡＳを、ＣｙｓＭ触媒反応で、Ｎａ２ＳＯ３またはその無水物の塩であるＮａ２Ｓ２Ｏ５と反応させて、Ｌ－システイン酸を形成し、生体内変換２において、生体内変換１からのＬ－システイン酸を、式（５）に従って、ＣＳＡＤ触媒生体内変換で脱炭酸してタウリンにすることを特徴とする。これらの方法工程は、実施例７～１０に開示されている。この目的のために、生体内変換１のＯＡＳは、本発明の実施例１に記載されているように、合成により、または生産株の増殖により生産することができる。生産株の増殖によりＯＡＳを生産することが好ましい。生体内変換１のＣｙｓＭ酵素は、実施例２に記載されるように、生産株の発酵から得ることができる。生体内変換２で用いられるＣＳＡＤ酵素は、生産株の増殖から得ることができ、好ましくは、実施例６に記載されるように、大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株の増殖からのＣＳＡＤｃｃ酵素である。生体内変換１からのＬ－システイン酸は、実施例８～１０に記載されるように、さらなる後処理なしで、または事前の後処理の後に、生体内変換２で用いることができる。当業者は、この目的のために、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、結晶化等のさまざまな方法に精通している。生体内変換２では、さらなる後処理なしで、生体内変換１からのＬ－システイン酸を用いることが好ましい。
【0084】
タウリンを製造する方法は、式（７）（生体内変換１）に従って、ＯＡＳおよび亜硫酸塩（亜硫酸とも呼ばれる）からＬ－システイン酸を酵素的に製造する、これまで説明されていない方法と、式（５）に従って、Ｌ－システイン酸をタウリンに酵素的に脱炭酸する方法（生体内変換２）とを、簡単かつ効率的に組み合わせる。すなわち、本発明は、ＯＡＳからタウリンを製造するための生体内変換１と生体内変換２とを組み合わせた２段階の生体内変換方法である。
【0085】
好ましくは、タウリンの製造のための方法工程（生体内変換１および生体内変換２）は、連続的に、すなわち次々に進行する。方法が、既に説明した好ましい実施形態の工程ａ～ｄを含む場合、代替の好ましい実施形態では、方法工程のすべてが１つの反応バッチで行われることを特徴とする。方法工程のすべてが１つの反応バッチで行われる場合、方法はワンポットプロセスまたはワンポット反応とも呼ばれる。これには、タウリン製造のためのすべての反応物がすでに反応バッチ内に存在するか、または簡単に計量投入できるという利点がある。方法を１つの反応バッチで実行することは、経済的な実行可能性を考慮すると特に重要である。
【0086】
例えば、本発明の実施例１１の開示によれば、方法工程は１バッチ（ワンポットプロセス）で実行することができ、ＯＡＳは酵素ＣｙｓＭおよびＣＳＡＤｃｃの存在下で亜硫酸塩（亜硫酸の塩）と反応する。Ｌ－システイン酸は式（７）に従って最初の反応で生成され、式（５）に従ってＣＳＡＤｃｃによって「ｉｎ ｓｉｔｕ」で脱炭酸されてタウリンになる。
【0087】
ワンポットプロセスにおけるＯＡＳの反応からのＬ－システイン酸およびタウリンの生成物分布は、ＣＳＡＤｃｃに対するＣｙｓＭの活性によって決定される。ＣＳＡＤｃｃを十分に計量添加すると、ＯＡＳから形成されるＬ－システイン酸を定量的にタウリンに変換することができる。用いられるＯＡＳをＬ－システイン酸およびタウリンに変換する方法が好ましい。用いられるＯＡＳのモル量に基づくＬ－システイン酸およびタウリンの合計モル収率は、好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。用いられるＯＡＳのモル量に基づくタウリンのモル収率は、好ましくは２５％以上、特に好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
【0088】
ワンポットプロセスに関しては、ＯＡＳスルフィドリラーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を１つの株で共発現させ、その株の成長からの細胞を亜硫酸塩の存在下でＯＡＳと反応させて生体内変換を行い、最終生成物としてタウリンを生成することが考えられる。
【0089】
本発明の一つの変形例では、代謝工学的アプローチの文脈において、ＯＡＳスルフィドリラーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの遺伝子がＯＡＳ生産株で発現され、亜硫酸塩（亜硫酸の塩）の存在下でのこのような生産株の増殖によってタウリンが生産されることも考えられる。
【0090】
図は実施例で用いたプラスミドを示す。
【図面の簡単な説明】
【0091】
【図1】ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ
【0092】
図面で用いられている略語：
ＡｍｐＲ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）耐性を付与する遺伝子
Ｏｒｉ：複製起点
Ｐｔａｃ：ｔａｃプロモーター
ＥＣｏＲＩ：制限酵素ＥＣｏＲＩの切断部位
ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位
ＣＳＡＤｃｃ：ＣＳＡＤ（システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ） Ｃ．ｃａｒｐｉｏ ｃｄｓ
ＡｍｐＲ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）耐性を付与する遺伝子
Ｏｒｉ：複製起点
Ｐｔａｃ：ｔａｃプロモーター
ＥＣｏＲＩ：制限酵素ＥＣｏＲＩの切断部位
ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位
ＣＳＡＤｃｃ：ＣＳＡＤ（システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ） Ｃ．ｃａｒｐｉｏ ｃｄｓ
【実施例】
【0093】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらに限定されるものではない。
【0094】
実施例１：ＯＡＳの製造
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（ワッカー）に記載され、ブダペスト条約に従ってDSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１３４９５番号で寄託されている大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株を用いた。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成された。発酵の最後に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を用いてｐＨを４．５に設定することにより、ＯＡＳを安定化した。細胞は、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）して除去した。ＨＰＬＣで測定した発酵上清中のＯＡＳ含有量は１５．３ｇ／Ｌであった。
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（ワッカー）に記載され、ブダペスト条約に従ってDSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１３４９５番号で寄託されている大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株を用いた。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成された。発酵の最後に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を用いてｐＨを４．５に設定することにより、ＯＡＳを安定化した。細胞は、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）して除去した。ＨＰＬＣで測定した発酵上清中のＯＡＳ含有量は１５．３ｇ／Ｌであった。
【0095】
システイン酸およびタウリンのＨＰＬＣ分析：
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ、Ｌ－システイン酸およびタウリンについてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を採用した。較正に用いたすべての参照物質は市販品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。アミノ酸の分析で知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドによるプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）用の同じメーカーのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。ＯＰＡ誘導体化生成物であるＯＡＳ、Ｌ－システイン酸およびタウリンを検出するために、ＨＰＬＣシステムには蛍光検出器が装備されていた。検出器は、励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定された。また、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標） ａＱカラムＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒子サイズ２．６μｍ、カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化したものを用いた。
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ、Ｌ－システイン酸およびタウリンについてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を採用した。較正に用いたすべての参照物質は市販品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。アミノ酸の分析で知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドによるプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）用の同じメーカーのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。ＯＰＡ誘導体化生成物であるＯＡＳ、Ｌ－システイン酸およびタウリンを検出するために、ＨＰＬＣシステムには蛍光検出器が装備されていた。検出器は、励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定された。また、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標） ａＱカラムＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒子サイズ２．６μｍ、カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化したものを用いた。
【0096】
溶出液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０。溶出液Ｂ：メタノール。分離はグラジエントモードで実行した。０～２５分かけて１０％溶出液Ｂから６０％溶出液Ｂに移行し、次いで２分かけて６０％溶出液Ｂから１００％溶出液Ｂに移行し、次いで１００％溶出液Ｂをさらに２分間、流速０．５ｍｌ／分で移行した。Ｌ－システイン酸の保持時間：３．２分。タウリンの保持時間：１４．８分。ＯＡＳの保持時間：１７．０分。
【0097】
実施例２：酵素ＣｙｓＭの生産
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）に記載され、ブダペスト条約に従ってＤSMZ-German CollECtion of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１４０８８番号で寄託されている大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いた。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコでの増殖および発酵の両方によって生成された。
Ａ）振盪フラスコでの増殖：大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の前培養をＬｂａｍｐ培地（１０ｇ／ｌトリプトン（ＧＩＢＣＯ（商標））、５ｇ／ｌ酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で調製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩増殖）。２５ｍｌの前培養物を２５０ｍｌのＬＢａｍｐ培地（バッフル付き１Ｌエルレンマイヤーフラスコ）の主培養物の接種物として用いた。主培養物を３０℃、１１０ｒｐｍで振盪した。４時間後、細胞密度ＯＤ６００は１．０／ｍｌに達した（ＯＤ６００：細胞懸濁液１ｍｌあたりの細胞密度を６００ｎｍでの吸光度測定により光度測定；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）のＧｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）。次いで、誘導剤テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度３ｍｇ／Ｌ）を添加し、３０℃、１１０ｒｐｍでさらに２０時間培養を続けた。培養終了時の細胞密度ＯＤ６００は３／ｍｌであった。
Ｂ）大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵生産は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている。発酵物からの細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）して除去し、ＫＰｉ６．５緩衝液（０．１Ｍ Ｋリン酸、ｐＨ６．５）に懸濁して、細胞密度ＯＤ６００が９０／ｍｌになるようにした。
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）に記載され、ブダペスト条約に従ってＤSMZ-German CollECtion of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ブラウンシュヴァイク）にＤＳＭ１４０８８番号で寄託されている大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いた。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコでの増殖および発酵の両方によって生成された。
Ａ）振盪フラスコでの増殖：大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の前培養をＬｂａｍｐ培地（１０ｇ／ｌトリプトン（ＧＩＢＣＯ（商標））、５ｇ／ｌ酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で調製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩増殖）。２５ｍｌの前培養物を２５０ｍｌのＬＢａｍｐ培地（バッフル付き１Ｌエルレンマイヤーフラスコ）の主培養物の接種物として用いた。主培養物を３０℃、１１０ｒｐｍで振盪した。４時間後、細胞密度ＯＤ６００は１．０／ｍｌに達した（ＯＤ６００：細胞懸濁液１ｍｌあたりの細胞密度を６００ｎｍでの吸光度測定により光度測定；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）のＧｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）。次いで、誘導剤テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度３ｍｇ／Ｌ）を添加し、３０℃、１１０ｒｐｍでさらに２０時間培養を続けた。培養終了時の細胞密度ＯＤ６００は３／ｍｌであった。
Ｂ）大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵生産は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている。発酵物からの細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）して除去し、ＫＰｉ６．５緩衝液（０．１Ｍ Ｋリン酸、ｐＨ６．５）に懸濁して、細胞密度ＯＤ６００が９０／ｍｌになるようにした。
【0098】
振盪フラスコで培養または発酵した細胞は、遠心分離（１５０００ｒｐｍで１０分、ＳＳ３４ローターを備えるＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）によって分離され、その後の使用に供された。以下に説明するように、細胞ホモジネートの製造のためにさらに用いるために、細胞ペレットを細胞懸濁液としてＫＰｉ６．５緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液は、細胞密度ＯＤ６００が３０／ｍｌになるのに十分な量のＫＰｉ６．５緩衝液を用いて調製し：例えば、ＯＤ６００が３／ｍｌである振盪フラスコ培養からの５０ｍｌの細胞を遠心分離し、５ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（１０倍濃度）に再懸濁するか、またはＯＤ６００が９０／ｍｌである発酵からの１ｍｌの細胞を３ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（３倍希釈）に再懸濁した。
【0099】
これにより、大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の細胞が生産され、発酵ブロスから分離され、再懸濁され、本発明の方法におけるＯＡＳスルフィドリラーゼＣｙｓＭとして用いられた。
【0100】
細胞ホモジネートを調製するために、ＭＰ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓのＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標） ５Ｇ細胞ホモジナイザーを用いた。細胞密度ＯＤ６００が３０／ｍｌであるＫＰｉ６．５緩衝液中の細胞懸濁液１ｍｌを、ガラスビーズ（「Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ」）を含むメーカー組み立ての１．５ｍｌチューブで破砕した（６０００ｒｐｍの振盪周波数で３×２０秒、各間隔の間に３０秒の休止あり）。得られた細胞ホモジネートを、本発明の方法におけるＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として直接用いるか、または細胞抽出物の調製に用いた。
【0101】
細胞抽出物を調製するために、得られた細胞ホモジネートを遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで１０分間、ＳＳ３４ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）、上清を細胞抽出物と称し、本発明の方法におけるＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として用いるか、またはＣｙｓＭ酵素活性の測定にさらに用いた。
【0102】
「Ｑｕｂｉｔ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＱｕｂｉｔ３．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで細胞抽出物のタンパク質含有量を測定した。振盪フラスコ培養からの細胞抽出物のタンパク質含有量は５．３ｍｇ／ｍｌであった。発酵からの細胞抽出物のタンパク質含有量は４．０ｍｇ／ｍｌであった。
【0103】
ＣｙｓＭ酵素活性は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（ワッカー）に記載のとおりに測定した。このために、ＯＡＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＮａ２Ｓおよび大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の増殖からの細胞抽出物の存在下で３７℃でインキュベートした。ＫＰｉ６．５緩衝液中でのアッセイ（最終容量０．４ｍｌ）には、１０ｍＭのＯＡＳ（ｐＨ５．５の５００ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液中の２００ｍＭストック溶液からの添加）、１０ｍＭの硫化ナトリウムＮａ２Ｓ、および５μｌのＣｙｓＭ含有細胞抽出物が含まれていた。ＣｙｓＭ反応で生成されたシステインは、Gaitonde (1967), Biochem. J. 104: 627-633の方法に従い、ニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて測定した。振盪フラスコで培養した大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５７．１Ｕ／ｍｌであった。振盪フラスコ培養細胞（ＯＤ６００が３／ｍｌ）は細胞抽出物の調製のために１０倍に濃縮されていたため、振盪フラスコ培養細胞の酵素活性は５．７Ｕ／ｍｌであった。大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５８．１Ｕ／ｍｌであった。発酵細胞（ＯＤ６００が９０／ｍｌ）は細胞抽出物の調製のためにＯＤ６００が３０／ｍｌに希釈されていたため、発酵細胞の濃縮（ＯＤ６００が９０／ｍｌ）細胞懸濁液中の酵素活性は１７４．４Ｕ／ｍｌであった。
【0104】
大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の細胞抽出物の特異的ＣｙｓＭ酵素活性は、タンパク質１ｍｇあたり１０．８Ｕであった。特異的ＣｙｓＭ大腸菌ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物の酵素活性は１４．５Ｕ／ｍｇであった。細胞抽出物の調製中にＣｙｓＭ活性が細胞から完全に放出されたと仮定すると、細胞抽出物で測定されたＣｙｓＭ酵素活性は、以下の実施例のＣｙｓＭ細胞懸濁液中に存在する酵素活性と同等であった。
【0105】
１Ｕ／ｍｌＣｙｓＭ酵素活性は、アッセイ条件下で１ｍｌの細胞抽出物中のＯＡＳおよびＮａ２Ｓから１分あたり１μｍｏｌのシステインが生成されることを意味する（体積活性）。タンパク質１ｍｇあたりのＵでの特定のＣｙｓＭ酵素活性は、細胞抽出物の体積活性（Ｕ／ｍｌ）を細胞抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって得られ、細胞抽出物中の１ｍｇのタンパク質に基づくＵでのＣｙｓＭ酵素活性として定義される。
【0106】
実施例３：振盪フラスコ培養で生産されたＣｙｓＭを用いた市販のＯＡＳおよびＮａ
２
ＳＯ
３
からのＬ－システイン酸の生産
２つのバッチを並行して実行した。
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、まず８．２５ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を入れ、ＮａＰｉ６．５緩衝液中の０．２ＭのＮａ２ＳＯ３溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）を有する振盪フラスコ培養からのＣｙｓＭ細胞抽出物（実施例２Ａ）０．４ｍｌ、およびｐＨ５．５、０．５Ｍのコハク酸ナトリウム中の０．２ＭのＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液３５０μｌを順次添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。
バッチ２：バッチ（Ｎａ２ＳＯ３を含まない比較バッチ）はバッチ１と同じ組成であった。バッチ２にはＮａ２ＳＯ３溶液の代わりに１ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液を添加した。
２つのバッチを並行して実行した。
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、まず８．２５ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を入れ、ＮａＰｉ６．５緩衝液中の０．２ＭのＮａ２ＳＯ３溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）を有する振盪フラスコ培養からのＣｙｓＭ細胞抽出物（実施例２Ａ）０．４ｍｌ、およびｐＨ５．５、０．５Ｍのコハク酸ナトリウム中の０．２ＭのＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液３５０μｌを順次添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。
バッチ２：バッチ（Ｎａ２ＳＯ３を含まない比較バッチ）はバッチ１と同じ組成であった。バッチ２にはＮａ２ＳＯ３溶液の代わりに１ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液を添加した。
【0107】
両方のバッチを、チェストシェイカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で、３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。１時間後および３時間後、各バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートして反応を停止し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣで検出されたＬ－システイン酸の量を表１に示す。
【0108】
【表1】
【0109】
実施例４：振盪フラスコ培養で生産されたＣｙｓＭを用いた、発酵からのＯＡＳ含有培養上清およびＮａ
２
ＳＯ
３
からのＬ－システイン酸の生産
１００ｍｌの三角フラスコに、ＯＡＳ含有量が１５．３ｇ／Ｌである大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株の発酵からの細胞培養上清１ｍｌ（実施例１より）を入れ、次いでＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、ＮａＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３溶液１ｍｌ、および振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、細胞密度ＯＤ６００３０／ｍｌ、ＣｙｓＭ酵素活性５７．１Ｕ／ｍｌ）を順次添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析してＯＡＳおよびＬ－システイン酸の含有量を測定した。時間の経過に伴う反応の経過を表２にまとめた。
１００ｍｌの三角フラスコに、ＯＡＳ含有量が１５．３ｇ／Ｌである大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株の発酵からの細胞培養上清１ｍｌ（実施例１より）を入れ、次いでＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、ＮａＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３溶液１ｍｌ、および振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、細胞密度ＯＤ６００３０／ｍｌ、ＣｙｓＭ酵素活性５７．１Ｕ／ｍｌ）を順次添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析してＯＡＳおよびＬ－システイン酸の含有量を測定した。時間の経過に伴う反応の経過を表２にまとめた。
【0110】
【表2】
【0111】
実施例５：一定ｐＨでのＯＡＳの生体内変換によるＬ－システイン酸の予備生産
０．５Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
０．５Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
【0112】
まず、ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株（実施例２Ｂより）の発酵からのＫＰｉ６．５緩衝液中のＣｙｓＭ含有細胞懸濁液５０ｍｌ（ＯＤ６００９０／ｍｌ、ＣｙｓＭ酵素活性８７２０Ｕ）およびＫＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２Ｓ２Ｏ５の４００ｇ／Ｌ溶液６．６ｍｌ（１３．９ｍｍｏｌ、分子量１９０．１ｇ／ｍｏｌ）を入れた。溶解した状態では、これはＮａＨＳＯ３の２７．８ｍｍｏｌに相当した（後で計量投入されるＯＡＳ量１５．６ｍｍｏｌの１．７８倍のモル過剰）。バッチをマグネティックスターラーで撹拌した。バッチにはｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）も備えられており、これはｐＨ制御ユニット（ＴｉｔｒｏＬｉｎｅ α滴定装置、Ｓｃｈｏｔｔ）に接続され、製造元の指示に従ってｐＨスタットモードで操作された。ｐＨスタット条件下では、制御ユニットに接続されたビュレットから２ＭのＮａＯＨを計量して添加することにより、反応容器内のｐＨは、反応の全期間にわたって設定ｐＨ６．５で一定に保たれた。大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有細胞培養上清（ＯＡＳ含有量：１５．３ｇ／Ｌ、２．３ｇ、１５．６４ｍｍｏｌ）１５０ｍｌが、ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ 蠕動ポンプ）を介してリザーバーから０．３５ｍｌ／分の流量でバッチに計量供給された。
【0113】
反応時間は１９時間であった。バッチは開放型反応容器で行われたため、反応終了後のバッチ容量は蒸発により１８５ｍｌであった。反応開始から０．５時間、３時間および１９時間後に、バッチから各１ｍｌのアリコートを取り出し、Ｌ－システイン酸の含有量をＨＰＬＣで分析した。Ｌ－システイン酸の生成の経時変化を表３にまとめる。１９時間の反応時間後、バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１２，９７０ｍｇ／Ｌ（７６．６５ｍＭ）で、これはバッチ容量１８５ｍｌに対してＬ－システイン酸の絶対モル収量１４．１８ｍｍｏｌに相当する。用いたＯＡＳの量１５．６４ｍｍｏｌに基づくと、これは９０．１％の収率に相当する。
【0114】
【表3】
【0115】
実施例６：大腸菌によるCaprinus carpio（コイ）由来のＣＳＡＤｃｃの組換え生産
ベクターｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ：
コイ（Cyprinus carpio）由来のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ）のｃＤＮＡ遺伝子（ｃＤＮＡ：相補ＤＮＡ、逆転写によりｍＲＮＡから単離）は、Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-1183によって単離され、ＤＮＡ配列はＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースでＧｅｎＢａｎｋ配列ＩＤ：ＡＢ２２０５８５．１（ｃｄｓ：ｎｔ８２－１５８４）として公開されている。対応するアミノ酸配列は、大腸菌での発現のためにコドン最適化されたＤＮＡ配列（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）を誘導するために用いられ、合成的に生成された（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。合成されたＤＮＡは、配列番号１に開示された配列を有し、遺伝子のｃｄｓ（以下、ＣＳＡＤｃｃと称する）を含んでいた。ｃｄｓ（配列番号１、ｎｔ３１－１５３０）は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を有し、ＣＳＡＤｃｃと呼ばれるタンパク質をコードする。クローニングの目的で、合成されたＤＮＡは、５’末端にＥＣｏＲＩ切断部位（配列番号１、ｎｔ２５－３０）を、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（配列番号１、ｎｔ１５３２－１５３７）を有していた。
ベクターｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ：
コイ（Cyprinus carpio）由来のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ）のｃＤＮＡ遺伝子（ｃＤＮＡ：相補ＤＮＡ、逆転写によりｍＲＮＡから単離）は、Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-1183によって単離され、ＤＮＡ配列はＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースでＧｅｎＢａｎｋ配列ＩＤ：ＡＢ２２０５８５．１（ｃｄｓ：ｎｔ８２－１５８４）として公開されている。対応するアミノ酸配列は、大腸菌での発現のためにコドン最適化されたＤＮＡ配列（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）を誘導するために用いられ、合成的に生成された（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。合成されたＤＮＡは、配列番号１に開示された配列を有し、遺伝子のｃｄｓ（以下、ＣＳＡＤｃｃと称する）を含んでいた。ｃｄｓ（配列番号１、ｎｔ３１－１５３０）は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を有し、ＣＳＡＤｃｃと呼ばれるタンパク質をコードする。クローニングの目的で、合成されたＤＮＡは、５’末端にＥＣｏＲＩ切断部位（配列番号１、ｎｔ２５－３０）を、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（配列番号１、ｎｔ１５３２－１５３７）を有していた。
【0116】
ＣＳＡＤｃｃの組換え発現に適したベクターｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊｃｄｓ（図１）は、合成ＤＮＡをＥＣｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、既知の方法でＥＣｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＥＣｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＫＫｊにクローニングすることによって生成された。ＥＰ２６７０８３７Ａ１（ワッカー）に開示されている発現ベクターｐＫＫｊは、発現ベクターｐＫＫ２２３－３の誘導体である。ｐＫＫ２２３－３のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースにアクセッション番号Ｍ７７７４９．１で開示されている。４．６ｋｂのプラスミドから約１．７ｋｂ（Ｍ７７７４９．１に開示されているＤＮＡ配列のｂｐ２６２～１９４７）が除去され、２．９ｋｂの発現ベクターｐＫＫｊが得られた。
【0117】
大腸菌ＪＭ１０５ｘｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ生産株：
ＣＳＡＤｃｃｃｄｓは、ベクターｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを既知の方法で大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５株に形質転換することにより大腸菌で発現された。大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５株は、DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbHから株番号ＤＳＭ３９４９で市販されている。
ＣＳＡＤｃｃｃｄｓは、ベクターｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを既知の方法で大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５株に形質転換することにより大腸菌で発現された。大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０５株は、DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbHから株番号ＤＳＭ３９４９で市販されている。
【0118】
形質転換からのクローンは、ＬＢａｍｐプレート上で選択された。ＬＢａｍｐプレートには、１０ｇ／ｌのトリプトン（ＧＩＢＣＯ（商標））、５ｇ／ｌの酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれていた。クローンは振盪フラスコでの増殖と発酵のために選択された。ＣＳＡＤｃｃ産生株は大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊと命名された。ＣＳＡＤｃｃｃｄｓは、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーター（ＩＰＴＧ：イソプロピルβ－チオガラクトシド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の制御下で、既知の方法で大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊで発現され、ＣＳＡＤｃｃ ｃｄｓに機能的に結合した。
【0119】
振盪フラスコ内での増殖：
大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株の前培養をＬＢａｍｐ培地で調製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養、Ｉｎｆｏｒｓのチェストシェーカー）。
大腸菌ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株の前培養をＬＢａｍｐ培地で調製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養、Ｉｎｆｏｒｓのチェストシェーカー）。
【0120】
２ｍｌの前培養物を、１５ｇ／Ｌのグルコース、５ｍｇ／Ｌのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した１００ｍｌのＳＭ３培地（１Ｌの三角フラスコ）の主培養の接種物として用いた。主培養は、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３０℃、１４０ｒｐｍで振盪した。４時間の培養時間後、細胞密度ＯＤ６００２．０に達した。次いで、誘導剤ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度０．４ｍＭ）を添加し、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３０℃、１４０ｒｐｍでさらに２０時間増殖を続けた。
【0121】
ＳＭ３培地の組成：１２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＮａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＮａＣｌ、５ｇ／Ｌのペプトン（Ｏｘｏｉｄ）、２．５ｇ／Ｌの酵母エキス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．００５ｇ／ＬのビタミンＢ１、１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液。
【0122】
微量元素溶液の組成：０．１５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。
【0123】
振盪フラスコ培養物から得られた細胞を、遠心分離により分離した。細胞懸濁液を、振盪フラスコ培養物５０ｍｌの細胞ペレットを２ｍｌの５０ｍｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０（ＮａＰｉ７．０緩衝液）に再懸濁して調製した。細胞懸濁液は、生体内変換試験に直接用いるか、細胞ホモジネートの調製に用いた。
【0124】
細胞ホモジネートを調製するために、ＭＰ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓのＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ ＴＭ ５Ｇ細胞ホモジナイザーを用いた。２×１ｍｌの細胞懸濁液を、ガラスビーズ（「Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ」）を含むメーカー組み立ての１．５ｍｌチューブで破砕した（６０００ｒｐｍの振盪周波数で３×２０秒、各間隔の間に３０秒の休止を挟んで）。
【0125】
得られた細胞ホモジネート（２ｍｌ容量）を、それ以上の処理をすることなく、Ｌ－システイン酸からタウリンへの生体内変換に用いた。
【0126】
発酵による増殖：
発酵には、生産株大腸菌ＪＭ１０５ｘｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを用いた。発酵は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨのＢｉｏｓｔａｔ Ｂ発酵槽（作業容量２Ｌ）で行った。
発酵には、生産株大腸菌ＪＭ１０５ｘｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊを用いた。発酵は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨのＢｉｏｓｔａｔ Ｂ発酵槽（作業容量２Ｌ）で行った。
【0127】
振盪フラスコ前培養：
１Ｌの三角フラスコ中のＬＢａｍｐ培地１００ｍｌに、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株を含む寒天培地から接種し、インキュベーションシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３０℃、速度１２０ｒｐｍで７～８時間培養し、細胞密度ＯＤ６００が２～４／ｍｌになるまで培養した。
１Ｌの三角フラスコ中のＬＢａｍｐ培地１００ｍｌに、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株を含む寒天培地から接種し、インキュベーションシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３０℃、速度１２０ｒｐｍで７～８時間培養し、細胞密度ＯＤ６００が２～４／ｍｌになるまで培養した。
【0128】
発酵槽：
４０ｇ／Ｌグルコースおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを添加した１．５ＬのＦＭ２培地に、振盪フラスコ前培養物２１．３ｍｌを接種した。発酵条件は、温度３０℃、一定ｐＨ７．０（２５％のＮＨ４ＯＨおよび６．８ＮのＨ３ＰＯ４で自動補正）、水中の４％ｖ／ｖのＳｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ ＆ Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）の自動計量添加による泡制御、スターラー速度４５０～１３００ｒｐｍ、滅菌フィルターで滅菌した圧縮空気による１．７ｖｖｍでの一定通気（ｖｖｍ：発酵バッチへの圧縮空気の導入量を、１分間に発酵容量１リットルあたりの圧縮空気のリットル数で表したもの）、ｐＯ２≧５０％であった。酸素分圧ｐＯ２は撹拌速度によって調節され、１６時間の発酵時間後、細胞密度ＯＤ６００は４５／ｍｌに達した。
４０ｇ／Ｌグルコースおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを添加した１．５ＬのＦＭ２培地に、振盪フラスコ前培養物２１．３ｍｌを接種した。発酵条件は、温度３０℃、一定ｐＨ７．０（２５％のＮＨ４ＯＨおよび６．８ＮのＨ３ＰＯ４で自動補正）、水中の４％ｖ／ｖのＳｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ ＆ Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）の自動計量添加による泡制御、スターラー速度４５０～１３００ｒｐｍ、滅菌フィルターで滅菌した圧縮空気による１．７ｖｖｍでの一定通気（ｖｖｍ：発酵バッチへの圧縮空気の導入量を、１分間に発酵容量１リットルあたりの圧縮空気のリットル数で表したもの）、ｐＯ２≧５０％であった。酸素分圧ｐＯ２は撹拌速度によって調節され、１６時間の発酵時間後、細胞密度ＯＤ６００は４５／ｍｌに達した。
【0129】
生産発酵槽：
２０ｇ／Ｌのグルコース、０．３６ｇ／Ｌのピリドキシン（ビタミンＢ６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したｐＨ７．０のＦＭ２培地１．３５Ｌに、予備発酵槽培養液１５０ｍｌを接種した。発酵条件は、温度３０℃、一定ｐＨ７．０（２５％のＮＨ４ＯＨおよび６．８ＮのＨ３ＰＯ４で自動補正）、水中の４％ｖ／ｖのＳｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ ＆ Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）の自動計量添加による泡制御、スターラー速度４５０～１３００ｒｐｍ、一定通気１．７ｖｖｍ、ｐＯ２≧５０％であった。酸素分圧ｐＯ２は、スターラー速度によって調整した。発酵時間は３０時間であった。
２０ｇ／Ｌのグルコース、０．３６ｇ／Ｌのピリドキシン（ビタミンＢ６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したｐＨ７．０のＦＭ２培地１．３５Ｌに、予備発酵槽培養液１５０ｍｌを接種した。発酵条件は、温度３０℃、一定ｐＨ７．０（２５％のＮＨ４ＯＨおよび６．８ＮのＨ３ＰＯ４で自動補正）、水中の４％ｖ／ｖのＳｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ ＆ Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）の自動計量添加による泡制御、スターラー速度４５０～１３００ｒｐｍ、一定通気１．７ｖｖｍ、ｐＯ２≧５０％であった。酸素分圧ｐＯ２は、スターラー速度によって調整した。発酵時間は３０時間であった。
【0130】
ＦＭ２培地：５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５０ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０７５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＮａ３クエン酸塩、０．３０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１．５０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．００５ｇ／ＬのビタミンＢ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５．００ｇ／Ｌのペプトン（Ｏｘｏｉｄ）、２．５０ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、０ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（振盪フラスコ培養に用いたものに相当）。
【0131】
まず、発酵槽内のｐＨを、２５％のＮＨ４ＯＨ溶液を注入して７．０に調整した。発酵中、ｐＨは２５％のＮＨ４ＯＨまたは６．８ＮのＨ３ＰＯ４による自動補正によって７．０の値に維持された。接種のために、１５０ｍｌの予備培養物を発酵槽容器に注入した。したがって、初期容量は１．５Ｌであった。培養物はまず３５０ｒｐｍで撹拌され、１．７ｖｖｍの通気速度で通気された。これらの開始条件下で、酸素プローブは接種前に１００％飽和に較正された。
【0132】
発酵中のＯ２飽和度（ｐＯ２）の目標値を５０％に設定した。Ｏ２飽和度が目標値を下回った後、Ｏ２飽和度を目標値まで戻すために制御カスケードを開始した。これに関連して、撹拌速度は連続的に増加した（最大１３００ｒｐｍまで）。
【0133】
発酵を３０℃の温度で実施した。発酵槽内のグルコース含有量が最初の２０ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌに低下したら、６０％（ｗ／ｗ）のグルコース溶液を連続的に計量投入した。供給速度は、発酵槽内のグルコース濃度がそれ以降２ｇ／Ｌを超えないように調整した。グルコースは、ＹＳＩ（米国オハイオ州イエロースプリングス）のグルコース分析装置を用いて測定した。
【0134】
ＯＤ６００が５０／ｍｌに達すると（発酵時間８時間）、誘導剤ＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍｍ）を１回添加してＣＳＡＤｃｃ遺伝子の発現を開始した。誘導後２２時間、つまり総発酵時間３０時間で発酵を停止した。この時点で、細胞密度ＯＤ６００は１６４／ｍｌであった。発酵ブロス１Ｌを遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで１０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機、ＳＳ３４ローター装備）、発酵上清を捨て、細胞を１ＬのＮａＰｉ７．０緩衝液に再懸濁し、－２０℃で５０ｍｌずつ保存して、さらなる使用に供した。
【0135】
実施例７：市販のＬ－システイン酸からの生体内変換によるタウリンの製造
１２ｍｇのＬ－システイン酸×Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００ｍｌの三角フラスコで量り取り、９．７ｍｌのＮａＰｉ７．０緩衝液に溶解した。反応を、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ（実施例６）の振盪フラスコ増殖からの細胞ホモジネート０．３ｍｌの添加によって開始した。バッチ容量は１０ｍｌであった。Ｌ－システイン酸×Ｈ２Ｏのモル濃度は６．４１ｍＭであった（Ｌ－システイン酸×Ｈ２Ｏの分子量：１８７．２ｇ／ｍｏｌ）。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離して上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。生成されたタウリンの量は７８９．４ｍｇ／Ｌであり、モル含有量６．３１ｍＭ（タウリンの分子量：１２５．１ｇ／ｍｏｌ）に相当する。したがって、６．４１ｍＭのＬ－システイン酸×Ｈ２Ｏから生成されたタウリンのモル収率は９８．４％であった。
１２ｍｇのＬ－システイン酸×Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００ｍｌの三角フラスコで量り取り、９．７ｍｌのＮａＰｉ７．０緩衝液に溶解した。反応を、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ（実施例６）の振盪フラスコ増殖からの細胞ホモジネート０．３ｍｌの添加によって開始した。バッチ容量は１０ｍｌであった。Ｌ－システイン酸×Ｈ２Ｏのモル濃度は６．４１ｍＭであった（Ｌ－システイン酸×Ｈ２Ｏの分子量：１８７．２ｇ／ｍｏｌ）。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離して上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。生成されたタウリンの量は７８９．４ｍｇ／Ｌであり、モル含有量６．３１ｍＭ（タウリンの分子量：１２５．１ｇ／ｍｏｌ）に相当する。したがって、６．４１ｍＭのＬ－システイン酸×Ｈ２Ｏから生成されたタウリンのモル収率は９８．４％であった。
【0136】
実施例８：市販のＯＡＳからの生体内変換によるタウリンの製造
反応１：ＯＡＳからのＬ－システイン酸の生成：
１００ｍｌの三角フラスコに、まず６．６ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液を入れ、次いで、０．５Ｍのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解した０．２ＭのＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液０．４ｍｌ、ＫＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３の１ｍｌ、および振盪フラスコ増殖からのｃｙｓＭ細胞の細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、ＣｙｓＭ酵素活性は５７．１Ｕ／ｍｌ）を続けて添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素の計量量は１１．４Ｕ／ｍｌであった。ＯＡＳ×ＨＣｌのモル濃度は８．００ｍＭ（１．４７ｇ／Ｌ、ＯＡＳｘＨＣｌの分子量：１８３．６ｇ／ｍｏｌ）であった。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＯＡＳは完全に消費された。生成されたＬ－システイン酸の量は１３５０．４ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．９８ｍＭに相当する（Ｌ－システイン酸の分子量：１６９．２ｇ／ｍｏｌ）。８．００ｍＭのＯＡＳ×ＨＣｌから生成されたＬ－システイン酸のモル収率は９９．７％であった。
反応１：ＯＡＳからのＬ－システイン酸の生成：
１００ｍｌの三角フラスコに、まず６．６ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液を入れ、次いで、０．５Ｍのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解した０．２ＭのＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液０．４ｍｌ、ＫＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３の１ｍｌ、および振盪フラスコ増殖からのｃｙｓＭ細胞の細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、ＣｙｓＭ酵素活性は５７．１Ｕ／ｍｌ）を続けて添加した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素の計量量は１１．４Ｕ／ｍｌであった。ＯＡＳ×ＨＣｌのモル濃度は８．００ｍＭ（１．４７ｇ／Ｌ、ＯＡＳｘＨＣｌの分子量：１８３．６ｇ／ｍｏｌ）であった。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＯＡＳは完全に消費された。生成されたＬ－システイン酸の量は１３５０．４ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．９８ｍＭに相当する（Ｌ－システイン酸の分子量：１６９．２ｇ／ｍｏｌ）。８．００ｍＭのＯＡＳ×ＨＣｌから生成されたＬ－システイン酸のモル収率は９９．７％であった。
【0137】
反応２：反応１で合成されたＬ－システイン酸からのタウリンの生成：
１００ｍｌの三角フラスコに反応１のバッチ９ｍｌを入れ、１ＭのＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株の振盪フラスコ増殖からの細胞ホモジネート１ｍｌを添加した（実施例６）。バッチ容量は１０ｍｌであった。反応１からのＬ－システイン酸含有量は１３５０．４ｍｇ／Ｌであり、反応２開始時のＬ－システイン酸含有量は１２１５．４ｍｇ／Ｌ（Ｌ－システイン酸の分子量１６９．２で７．１８ｍＭ）であった。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離して上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。タウリン含有量は８２５．７ｍｇ／Ｌ（タウリンの分子量１２５．１ｇ／ｍｏｌで６．６０ｍＭ）であった。７．１８ｍＭのＬ－システイン酸から生成されたタウリンのモル収率は９１．９％であった。
１００ｍｌの三角フラスコに反応１のバッチ９ｍｌを入れ、１ＭのＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、ＪＭ１０５×ｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株の振盪フラスコ増殖からの細胞ホモジネート１ｍｌを添加した（実施例６）。バッチ容量は１０ｍｌであった。反応１からのＬ－システイン酸含有量は１３５０．４ｍｇ／Ｌであり、反応２開始時のＬ－システイン酸含有量は１２１５．４ｍｇ／Ｌ（Ｌ－システイン酸の分子量１６９．２で７．１８ｍＭ）であった。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。３時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離して上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。タウリン含有量は８２５．７ｍｇ／Ｌ（タウリンの分子量１２５．１ｇ／ｍｏｌで６．６０ｍＭ）であった。７．１８ｍＭのＬ－システイン酸から生成されたタウリンのモル収率は９１．９％であった。
【0138】
実施例９：発酵生産ＯＡＳとＮａＨＳＯ
３
および発酵生産ＣｙｓＭ酵素との反応からのＬ－システイン酸のＣＳＡＤｃｃ触媒変換によるタウリンの生産
１００ｍｌの三角フラスコに、５ｍｇ／ＬＰＬＰを含むＮａＰｉ７．０緩衝液７ｍｌ、Ｌ－システイン酸含有量が１２，９７０ｍｇ／Ｌである実施例５のバッチ１ｍｌ、およびＮａＰｉ７．０緩衝液中のＣＳＡＤｃｃ細胞（実施例６）２ｍｌを混合した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１，２９７ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．６７ｍＭ（Ｌ－システイン酸の分子量：１６９．２ｇ／ｍｏｌ）に相当した。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。４時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。生成されたタウリンの量は９２５．３ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．４０ｍＭに相当する（タウリンの分子量：１２５．１ｇ／ｍｏｌ）。７．６７ｍＭのＬ－システイン酸から生成されたタウリンのモル収率は９６．４％であった。
１００ｍｌの三角フラスコに、５ｍｇ／ＬＰＬＰを含むＮａＰｉ７．０緩衝液７ｍｌ、Ｌ－システイン酸含有量が１２，９７０ｍｇ／Ｌである実施例５のバッチ１ｍｌ、およびＮａＰｉ７．０緩衝液中のＣＳＡＤｃｃ細胞（実施例６）２ｍｌを混合した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１，２９７ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．６７ｍＭ（Ｌ－システイン酸の分子量：１６９．２ｇ／ｍｏｌ）に相当した。バッチを、チェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。４時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。用いたＬ－システイン酸は完全に消費された。生成されたタウリンの量は９２５．３ｍｇ／Ｌであり、モル含有量７．４０ｍＭに相当する（タウリンの分子量：１２５．１ｇ／ｍｏｌ）。７．６７ｍＭのＬ－システイン酸から生成されたタウリンのモル収率は９６．４％であった。
【0139】
実施例１０：タウリンの予備生産
生体内変換１：
０．５Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
生体内変換１：
０．５Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
【0140】
まず、ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株（実施例２）の発酵からのＫＰｉ６．５緩衝液中のＣｙｓＭ含有細胞懸濁液５０ｍｌ（ＯＤ６００が９０／ｍｌ、ＣｙｓＭ酵素活性８７２０Ｕ）およびＫＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２Ｓ２Ｏ５の４００ｇ／Ｌ溶液２０ｍｌ（４２．１ｍｍｏｌ、分子量１９０．１ｇ／ｍｏｌ）を入れた。溶解した状態では、これはＮａＨＳＯ３の８４．２ｍｍｏｌに相当した（後で計量投入するＯＡＳ量５１．７ｍｍｏｌの１．６３倍のモル過剰）。バッチをマグネティックスターラーで撹拌した。バッチにはｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）も備えられており、これはｐＨ制御ユニット（ＴｉｔｒｏＬｉｎｅ α滴定装置、Ｓｃｈｏｔｔ）に接続され、製造元の指示に従ってｐＨスタットモードで操作された。ｐＨスタット条件下では、制御ユニットに接続されたビュレットから２ＭのＮａＯＨを計量して添加することにより、反応容器内のｐＨは、反応の全期間にわたって設定ｐＨ６．５で一定に保たれた。大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有発酵上清（ＯＡＳ含有量：１９．１ｇ／Ｌ、７．６ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）４００ｍｌが、ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ 蠕動ポンプ）を介してリザーバーから０．２ｍｌ／分の流量でバッチに計量添加された。総反応時間は４６時間であった。反応終了後のバッチ容量は５００ｍｌであった。反応開始から１時間、３時間、２０時間、２８時間および４６時間後に、各ケースでバッチから１ｍｌのアリコートを取り出し、８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析してＬ－システイン酸の含有量を測定した。経時的なＬ－システイン酸の形成を表４にまとめる。４６時間の反応時間後、バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１５，３７０ｍｇ／Ｌ（９０．８ｍＭ）であり、これはバッチ容量５００ｍｌに対してＬ－システイン酸の絶対モル収量４５．４ｍｍｏｌに相当する。用いたＯＡＳの量５１．７ｍｍｏｌに基づくと、これは８７．８％の収率に相当する。
【0141】
【表4】
【0142】
生体内変換２：
０．３Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
０．３Ｌのサーモスタット付き二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、温度を３７℃に調整した。
【0143】
Ｌ－システイン酸含有生体内変換１の１００ｍｌを２．５ＭのＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した。さらに、Ｈ２Ｏに溶解した１ＭのＤＴＥ（ジチオエリスリトール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｌ、ＮａＰｉ７．０緩衝液に溶解した５００ｍｇ／ＬＰＬＰ（最終濃度４ｍｇ／Ｌ）１ｍｌ、およびＮａＰｉ７．０緩衝液に再懸濁したＣＳＡＤｃｃ含有発酵細胞２０ｍｌを添加した。バッチはマグネティックスターラーで撹拌した。バッチ容量は１２２ｍｌであった。反応開始時および２時間後、４時間後、６時間後および２４時間後に、各ケースでバッチから１ｍｌのアリコートを取り出し、８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、Ｌ－システインおよびタウリンの含有量について上清をＨＰＬＣで分析した。結果を表５にまとめる。バッチで用いたＬ－システイン酸のモル量７４．４ｍＭに基づいて、タウリン収率（８．８ｇ／Ｌ、７０．２ｍＭ）は９４．３％であった。
【0144】
【表5】
【0145】
実施例１１：「ワンポット反応」によるＯＡＳからのタウリンの生産
反応バッチを、ＫＰｉ６．５緩衝液の３ｍｌ、大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有発酵上清の２ｍｌ、ＫＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３の１ｍｌ、ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株（実施例２Ｂ）の発酵からのＣｙｓＭ含有細胞の細胞懸濁液の２ｍｌ、およびＪＭ１０５ｘｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株（実施例６）の振盪フラスコ増殖からのＣＳＡＤｃｃ含有細胞の細胞懸濁液の２ｍｌから構成した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＯＡＳ濃度は３．１ｇ／Ｌ（２０．８０ｍＭ）であった。バッチ中のＮａ２ＳＯ３濃度は１００ｍＭであった。バッチ内のＣｙｓＭ酵素活性は３４．９Ｕ／ｍｌであった。
反応バッチを、ＫＰｉ６．５緩衝液の３ｍｌ、大腸菌Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６株（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有発酵上清の２ｍｌ、ＫＰｉ６．５緩衝液中の１ＭのＮａ２ＳＯ３の１ｍｌ、ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株（実施例２Ｂ）の発酵からのＣｙｓＭ含有細胞の細胞懸濁液の２ｍｌ、およびＪＭ１０５ｘｐＣＳＡＤｃｃ－ｐＫＫｊ株（実施例６）の振盪フラスコ増殖からのＣＳＡＤｃｃ含有細胞の細胞懸濁液の２ｍｌから構成した。バッチ容量は１０ｍｌであった。バッチ中のＯＡＳ濃度は３．１ｇ／Ｌ（２０．８０ｍＭ）であった。バッチ中のＮａ２ＳＯ３濃度は１００ｍＭであった。バッチ内のＣｙｓＭ酵素活性は３４．９Ｕ／ｍｌであった。
【0146】
反応をｐＨ６．５で行った。バッチはチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）で３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。反応開始から２４時間後、バッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離して上清をＨＰＬＣで分析した。Ｌ－システイン酸の含有量は１．３ｇ／Ｌ（Ｌ－システイン酸の分子量１６９．２ｇ／ｍｏｌで７．６８ｍＭ）であった。タウリンの含有量は７２１ｍｇ／Ｌ（タウリンの分子量１２５．１ｇ／ｍｏｌで５．７６ｍＭ）であった。２０．８０ｍＭのＯＡＳから生成された７．６８ｍＭＬ－システイン酸のモル収率は３６．９％であった。２０．８０ｍＭのＯＡＳから生成された５．７６ｍＭタウリンのモル収率は２７．７％であった。全体として、ＯＡＳから生成されたＬ－システイン酸とタウリンのモル収率は６４．６％であった。
【図1】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体内変換によりＯ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からタウリンを製造する方法であって、ｉ）第１工程（生体内変換１）において、亜硫酸塩の存在下で、ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素を用いて、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）からＬ－システイン酸を生成し、前記生体内変換が能動的なｐＨ制御下で行われ、次いで、
ｉｉ）第２工程（生体内変換２）において、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸し、
バッチ中のＯＡＳ濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌであり、
ＯＡＳスルフィドリラーゼがＣｙｓＭである、
前記方法。
【請求項2】
前記ＯＡＳスルフィドリラーゼが細菌酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＯＡＳスルフィドリラーゼが大腸菌株に由来するＣｙｓＭである、請求項１および２の一方または両方に記載の方法。
【請求項4】
前記ＯＡＳスルフィドリラーゼが発酵生産に由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記亜硫酸塩の濃度が少なくともＯＡＳと等モル濃度である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）のクラスの酵素を用いて、Ｌ－システイン酸をタウリンに脱炭酸する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｌ－システインスルフィン酸脱デカルボキシラーゼが配列番号２であるか、該配列と相同な配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｌ－システインスルフィン酸脱デカルボキシラーゼが発酵生産に由来する、請求項６および７の一方または両方に記載の方法。
【請求項9】
ａ）ＯＡＳが発酵によって生産され、ｂ）ＯＡＳスルフィドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスおよびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２９）のクラスの酵素が発酵によって生産され、
ｃ）ＯＡＳおよび亜硫酸塩が、ポイントｂのＯＡＳスルフィドリラーゼによる酵素触媒下で反応してＬ－システイン酸を形成し、
ｄ）ポイントｃのＬ－システイン酸が、ポイントｂのＣＳＡＤ酵素によってタウリンに脱炭酸される、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
すべての方法工程が１つの反応バッチで行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
生体内変換２におけるＬ－システイン酸の生体内変換からのタウリンのモル収率が好ましくは少なくとも６０％である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】