特表 2024-544231 トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-28

(54)【発明の名称】トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/0275 20240101AFI20241121BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241121BHJP

   A01K 67/02 20060101ALI20241121BHJP

   A01K 61/10 20170101ALI20241121BHJP

【ＦＩ】

A01K67/0275

C12N15/63 Z

A01K67/02

A01K61/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534261

(86)(22)【出願日】2022-11-21

(85)【翻訳文提出日】2024-07-08

(86)【国際出願番号】 US2022080233

(87)【国際公開番号】W WO2023107818

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】63/287,153

(32)【優先日】2021-12-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519351303

【氏名又は名称】グローフィッシュ，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】アイダス ネイスビシウス

【テーマコード（参考）】

2B104

【Ｆターム（参考）】

2B104AA03

2B104CA03

(57)【要約】

本発明は、トランスジェニック観賞魚、及びかかる魚をインビトロ受精技術によって作製する方法に関する。また、かかるトランスジェニック魚の集団を確立する方法、及びマーケティングの目的でそれらを観賞魚産業に提供する方法が開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項2】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項3】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項4】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項5】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項6】

前記魚が、養殖者によって商業的流通業者に流通される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記魚が、養殖者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａと繁殖させて、前記Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、方法。

【請求項10】

前記第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａが、非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む請求項１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫であって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ及び子孫が、蛍光を呈し、前記「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫。

【請求項12】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項13】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項14】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１１に記載の子孫の魚。

【請求項15】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項16】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項20】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項22】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項２１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項23】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項24】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項25】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項２１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項26】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａと繁殖させて、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、方法。

【請求項30】

前記第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａが、非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む請求項２１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫であって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ及び子孫が、蛍光を呈し、前記「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫。

【請求項32】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項33】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項34】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項３１に記載の子孫の魚。

【請求項35】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項３１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項36】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項２１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項40】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項42】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項４１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項43】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項４１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項44】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項４１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項45】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項４１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項46】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａと繁殖させて、前記Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、方法。

【請求項50】

前記第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａが、非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む請求項４１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫であって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ及び子孫が、蛍光を呈し、前記「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫。

【請求項52】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項53】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項54】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項５１に記載の子孫の魚。

【請求項55】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項５１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項56】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項４１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項60】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項62】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項６１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項63】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項64】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項65】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項６１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項66】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法であって、
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、得ることと、
（ｂ）得られた前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａと繁殖させて、前記Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、方法。

【請求項70】

前記第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａが、非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

蛍光タンパク質をコードする染色体組み込み発現カセットを含む請求項６１に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫であって、前記Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ及び子孫が、蛍光を呈し、前記「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫。

【請求項72】

繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａとして更に定義される、請求項７１に記載の子孫の魚。

【請求項73】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してホモ接合性である、請求項７１に記載の子孫の魚。

【請求項74】

前記魚が、前記組み込み発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項７１に記載の子孫の魚。

【請求項75】

トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項７１に記載の子孫の魚を得ることと、前記魚を前記観賞魚市場に流通させることと、を含む、方法。

【請求項76】

前記魚が、養殖者によって商業流通業者に流通される、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記魚が、養殖者又は商業流通業者によって小売業者に流通される、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

トランスジェニック魚を生産する方法であって、
（ａ）請求項６１に記載のトランスジェニック魚を得ることと、
（ｂ）得られた前記魚を第２の魚と繁殖させて、前記Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚を提供することと、を含む、方法。

【請求項80】

前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）としてＡＴＣＣに寄託されている、請求項１、９、又は１１のいずれか一項に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項82】

前記Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）としてＡＴＣＣに寄託されている、請求項２１、２９、又は３１のいずれか一項に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項83】

前記Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）としてＡＴＣＣに寄託されている、請求項４１、４９、又は５１のいずれか一項に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【請求項84】

前記Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）としてＡＴＣＣに寄託されている、請求項６１、６９、及び７１のいずれか一項に記載のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２２年１１月２１日に出願され、２０２１年１２月８日に出願された米国仮出願第６３／２８７，１５３号の優先権及び利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、トランスジェニック魚、特に緑色、オレンジ色、紫色、及び赤色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａに関する。

【背景技術】

【0003】

トランスジェニック技術は、宿主が新しい遺伝的形質を獲得することを可能にする宿主生物への外来遺伝子の移行を伴う。トランスジェニック技術には多くの潜在用途がある。例えば、新しい品種の魚を生成するために、魚に導入遺伝子を導入するために使用することができる。マイクロインジェクション（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、エレクトロポレーション（Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、精子媒介性遺伝子導入（Ｋｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、遺伝子衝突又は遺伝子銃（Ｚｅｌｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、リポソーム媒介性遺伝子導入（Ｓｚｅｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、及び筋肉組織へのＤＮＡの直接注入（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を含む、外来遺伝子を魚に導入する多くの方法が存在する。

【0004】

最初のトランスジェニック魚の報告は、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーター及びヒト成長ホルモン遺伝子からなるキメラ遺伝子構築物を使用してＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）によって公開された。初期のトランスジェニック魚の研究のほとんどは、急速に成長する魚を生成することを目的とした成長ホルモン遺伝子導入に焦点を当ててきた。初期の試みの大部分は、異種成長ホルモン遺伝子及びプロモーターを使用し、これらの魚を生産することができなかったが（例えば、Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、トランスジェニック魚の増強された成長が、タイセイヨウサケ、タイヘイヨウサケのいくつかの種、及びドジョウを含むいくつかの魚種で示されている（例えば、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｄｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９５、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

【0005】

Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ属の２つの種のうちの１つであるＰｒｉｓｔｅｌｌａ ｍａｘｉｌｌａｒｉｓは、その半透明の体のために、一般にＸ線魚又はＸ線テトラとして知られている。アマゾン川及びオリノコ川流域、並びにギアナの沿岸河川の酸性水域及びアルカリ性水域の両方で見られる、広く分布し、適応性のある魚である。他のほとんどのカラシンとは異なり、わずかに塩気のある水に耐性である（時にはその中に見出される）。小さく（長さ最大約５ｃｍ又は２．０インチ）、大きなグループで生活しており、雄は雌よりも小さくて細いことから、雌と区別することができる。他のほとんどのテトラと同様に、主に小さな昆虫及びプランクトン動物を餌とする。

【0006】

住宅用魚市場では、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ ｍａｘｉｌｌａｒｉｓは適応性のある小さな魚である。これは、ある範囲の水の化学値（すなわち、ｐＨ６～８）に耐性である。スクーリング種として、通常、少なくとも６つの標本のグループに保たれ、攻撃的又は捕食的なタンクの仲間から離れているが、そうでなければ簡単にコミュニティタンクで保持される。

【0007】

しかしながら、蛍光タンパク質による遺伝子導入のために修飾された色素沈着を有するそのようなＰｒｉｓｔｅｌｌａの利用可能性は、様々な色のより良好な視覚化に起因して、観賞魚産業のためのより良好な製品をもたらすであろう。

【0008】

多くの蛍光タンパク質が当該技術分野で既知であり、様々な緑色、赤色、ピンク色、黄色、オレンジ色、青色、又は紫色を呈する蛍光タンパク質を含む様々な細胞プロセスを調査するために使用されている。蛍光タンパク質を含むトランスジェニック実験は、遺伝子導入のための新しいマーカー及びレポーターを提供してきたが、そのようなタンパク質を発現するＰｒｉｓｔｅｌｌａの開発及び生産の分野における進歩は限られている。

【0009】

トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ
ある特定の実施形態では、本開示は、トランスジェニック蛍光魚を作製し、そのような魚を観賞魚産業に提供することに関する。

【0010】

いくつかの実施形態では、トランスジェニック魚又はトランスジェニック魚を作製する方法が提供される。ある特定の態様では、トランスジェニック魚は、繁殖力のあるトランスジェニック蛍光魚である。特定の実施形態では、開示される構築物及び方法とともに使用するための魚は、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａである。Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ皮膚色は、メラノソーム（黒色又は褐色）、キサントソーム（黄色）、エリスロソーム（オレンジ色又は赤色）、又はイリドソーム（白色を含む、虹色）と呼ばれる色素顆粒を含む、皮膚における色素細胞によって決定される。色素細胞当たりの色素顆粒の数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響を及ぼす。

【0011】

ある特定の具体的な実施形態では、本明細書において形質転換イベントと称される特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、審美的に好ましい緑色を具現化するため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニックイベントを含むトランスジェニック魚は、形質転換イベントに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。形質転換イベントを欠く魚で繁殖したホモ接合性魚は、ほぼ全てのケースで１００％ヘテロ接合性子孫を生産する。これらの特定のトランスジェニックイベントを含む生殖細胞、卵子、精子、及び胚もまた、本発明の一部として含まれる。

【0012】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する１つのかかる実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含む緑色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供され、、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（ＡＴＣＣ）（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである。そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、導入遺伝子又は組み込み発現カセット（複数可）に対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0013】

また、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫を得ることを含み、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、観賞魚市場に魚を流通している。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0014】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＰｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａで繁殖させ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法が提供される。第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであり得る。

【0015】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ、Ｃｈａｒａｃｉｄａｅ科の種、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0016】

他の実施形態では、本明細書において形質転換イベントと称される特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、それらが審美的に好ましいオレンジ色を具体化するため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニックイベントを含むトランスジェニック魚は、形質転換イベントに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。形質転換イベントを欠く魚で繁殖したホモ接合性魚は、ほぼ全てのケースで１００％ヘテロ接合性子孫を生産する。これらの特定のトランスジェニックイベントを含む生殖細胞、卵子、精子、及び胚もまた、本発明の一部として含まれる。

【0017】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する１つのかかる実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含むオレンジ色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供され、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである。そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、導入遺伝子又は組み込み発現カセット（複数可）に対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0018】

また、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫を得ることを含み、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、観賞魚市場に魚を流通している。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0019】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＰｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａで繁殖させ、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法が提供される。第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであり得る。

【0020】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ、Ｃｈａｒａｃｉｄａｅ科の種、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0021】

代替的な実施形態では、本明細書において形質転換イベントと称される特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、それらが審美的に好ましい紫色を具現化するため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニックイベントを含むトランスジェニック魚は、形質転換イベントに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。形質転換イベントを欠く魚で繁殖したホモ接合性魚は、ほぼ全てのケースで１００％ヘテロ接合性子孫を生産する。これらの特定のトランスジェニックイベントを含む生殖細胞、卵子、精子、及び胚もまた、本発明の一部として含まれる。

【0022】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する１つのかかる実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含む紫色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供され、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである。そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、導入遺伝子又は組み込み発現カセット（複数可）に対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0023】

また、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫を得ることを含み、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、観賞魚市場に魚を流通している。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0024】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＰｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａで繁殖させ、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法が提供される。第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであり得る。

【0025】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ、Ｃｈａｒａｃｉｄａｅ科の種、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0026】

他の例示的な実施形態では、本明細書において形質転換イベントと称される特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、審美的に好ましい赤色を具現化するため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニックイベントを含むトランスジェニック魚は、形質転換イベントに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。形質転換イベントを欠く魚で繁殖したホモ接合性魚は、ほぼ全てのケースで１００％ヘテロ接合性子孫を生産する。これらの特定のトランスジェニックイベントを含む生殖細胞、卵子、精子、及び胚もまた、本発明の一部として含まれる。

【0027】

特定のトランスジェニック組み込みイベントに関する１つのかかる実施形態では、染色体組み込み導入遺伝子を含む赤色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫が提供され、、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。染色体組み込み導入遺伝子は、１つの組み込み発現カセット又は２つ以上の組み込み発現カセット上に存在してもよい。ある特定の態様では、そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、繁殖力のあるトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａである。そのようなトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、導入遺伝子又は組み込み発現カセット（複数可）に対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性を含む）であり得る。

【0028】

また、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態では、方法は、染色体組み込み導入遺伝子を含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ又はその子孫を得ることを含み、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、観賞魚市場に魚を流通している。そのような魚は、養殖者によって商業的流通業者に流通され得るか、又はそのような魚は、養殖者若しくは商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者などの小売業者に流通され得る。

【0029】

いくつかの態様では、（ａ）蛍光を呈し、１つ以上の染色体組み込み導入遺伝子又は発現カセットを含むＰｒｉｓｔｅｌｌａを得ることであって、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」を含み、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む凍結保存された精子が、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている、得ることと、（ｂ）得られたＰｒｉｓｔｅｌｌａを第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａで繁殖させ、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを提供することと、を含む、トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａを生産する方法が提供される。第２のＰｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック又は非トランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａであり得る。

【0030】

更なる実施形態では、トランスジェニック生物を生産する方法もまた提供され、方法は、トランスジェニック子孫を生産するために、生殖細胞移植を使用して、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換を生み出すことを含み、そのような凍結保存された精子は、受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託されている。そのような子孫は、例えば、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ、Ｃｈａｒａｃｉｄａｅ科の種、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａに関連する魚種若しくは属、又は別の魚種若しくは属であり得る。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む」とともに使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は１つ超を意味し得る。

【0032】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」のみを指す定義も支持する。本明細書で使用される場合、「別の」とは、少なくとも第２の、又はそれ以上を意味し得る。

【0033】

本出願全体にわたって、「約」という用語は、値が、デバイス、値を決定するために用いられている方法、又は試験対象間に存在する変動、における誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。

【0034】

本方法、キット、及び組成物のうちのいずれかの任意の実施形態は、記載される特徴及び／又はステップ－を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）／含む（ｃｏｎｔａｉｎ）／有するではなく－からなるか、又は本質的になり得る。したがって、特許請求の範囲のうちのいずれかにおいて、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、所与の特許請求の範囲を、非限定的連結動詞を他の方法で使用するものから変更するために、上記の非限定的連結動詞のいずれかに置き換えられ得る。

【0035】

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明から、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が当業者に明らかになるため、詳細な説明及び好ましい実施例は、本発明の特定の実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることを理解されたい。

【発明を実施するための形態】

【0036】

トランスジェニック魚
いくつかの態様では、本開示は、トランスジェニック魚に関する。トランスジェニック魚を作製する方法は、例えば、米国特許第７，１３５，６１３号、同第７，７００，８２５号、同第７，８３４，２３９号に記載されており、それらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。例えば、トランスジェニック緑色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、ｚｓＧｒｅｅｎ１、ａｆｒａＧＦＰ、ＷａｓＣＦＰ、ＮｏｗＧＦＰ、ｃｅｒＦＰ５０５、ｐｐｏｒＧＦＰ、Ｋｏｈｉｎｏｏｒ、ｅｆａｓＧＦＰ、ｅｅｃｈＧＦＰ１、ＵｎａＧ、ｂｆｌｏＧＦＰａ１、ＬａｎＦＰ１、及びＬａｎＦＰ２などの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする少なくとも１つの発現カセットを使用して生成され得る。代替的に、トランスジェニックオレンジ色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｐｈｉＹＦＰ、ｚＦＰ５３８、ｍＰａｐａｙａ、及びｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする少なくとも１つの発現カセットを使用して生成され得る。代替的に、トランスジェニック紫色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、ＦＰ６３５、Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓ、ｍＫａｔｅ２、ｍＣｈｅｒｒｙ２、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ－Ｓ１５８Ｃ、ｅｑＦＰ６５０、ｍＰｌｕｍ、ｊＲｅｄ、及びｍＲＦＰ１などの紫色蛍光タンパク質（ＰＦＰ）をコードする少なくとも１つの発現カセットを使用して生成され得る。代替的に、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ２、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅｑＦＰ５７８、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＲＲｖＴ、ｃｇｆＴａｇＲＦＰ、ｍＲｕｂｙ３、ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｍｅｆｆＲＦＰ、及びａｍｉｌＦＰ５９３などの赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする少なくとも１つの発現カセットを使用して生成され得る。

【0037】

商業的価値、特に観賞魚産業内で商業的価値のある魚の種及び品種に属する魚が使用されることが好ましい。そのような魚には、これらに限定されないが、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ、ナマズ、ゼブラフィッシュ、及び他のｄａｎｉｏ、メダカ、コイ（ｃａｒｐ）、ティラピア、金魚、テトラ、バーブ、サメ（レインボーシャークなどのｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ科）、エンゼルフィッシュ、ドジョウ、コイ（ｋｏｉ）、グラスフィシュ、ディスカス、ウナギ、ハゼ、グーラミ、グッピー、Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ、ハチェットフィッシュ、モリーフィッシュ、又はｐａｎｇａｓｉｕｓが含まれる。本開示の文脈における使用のための特定の魚は、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａである。Ｐｒｉｓｔｅｌｌａはますます人気のある観賞動物であり、様々な色で商業的価値が付加されるであろう。Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ胚は、容易に利用でき、ほぼ透明である。Ｐｒｉｓｔｅｌｌａの皮膚の色は、皮膚内の色素細胞によって決定され、それは、メラノソームと称される色素顆粒を含む。色素細胞当たりのメラノソームの数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響を及ぼす。

【0038】

商業養殖では、Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは自然に産卵する。簡単に説明すると、テトラの１又は２つの繁殖対を、人工産卵マットを備えた２．５～５ガロンのタンクに配置すべきである。タンクの水位は少なくとも約２～３インチであり、７５～８５°Ｆに維持すべきである。低い塩分（導電率１００～２００ｕＳ／ｃｍ）及びわずかな酸性度（約ｐＨ６．９）は、産卵を促進する。魚は、自然又は人工の光サイクルに曝露され得、明期は、午前８時に始まり、午後１０時に終了し得る。翌日、成体を取り出し、稚魚が孵化して自由に泳ぐようになるまで（すなわち、約４～６日）、華氏７５～８５度でインキュベートする。この時点で、稚魚は安全に扱うことができ、成長水槽又は土の池の外に移すことができる。Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが成熟するまでには約４～６カ月かかる。関連する実施形態では、系統繁殖は、凍結保存された精子によって維持される。

【0039】

凍結精子からの受精
魚精子凍結方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｒｅｉｓｉｎｇｅｒ（１９８３）及びＤｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｍｏｅｎｓ（２００７）を参照されたく、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される遺伝子導入魚を得るために、凍結テトラ精子を使用して卵を受精させ得る。

【0040】

例示的な実施形態では、若い成体雄緑色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが選択される。背中の腹側を上にして保持する必要がある。腹側は乾いたペーパータオルで拭き取る必要がある。腹側のヒレは、肛門開口部から離れて押され得る。乾燥すると、雄の側面を穏やかに押し出す必要があり、放出された精子を採取し、冷たいＬ－１５細胞培養培地に移す必要がある。精子をすすいで流すためにピペットを数回出し入れする。このプロセスは、いくつかの雄で繰り返す必要があり、良好な状態の場合、Ｌ－１５の５０μｌ当たり約１０匹の雄を使用する必要がある。目標は、５０μｌのＬ－１５当たり少なくとも５～７μｌの精子を採取することである。採取後は、できるだけ早く精子を凍結する必要がある。凍結直前に再混合する必要がある。凍結のために、３０μｌの凍結保護剤溶液（Ｌ－１５中の１０％無脂肪乾燥乳、１５％メタノール、及び１５％２－メトキシエタノール）をクライオバイアルに移す必要がある。１５μｌの精子懸濁液を加え、２～３回ピペッティングすることによって混合する。クライオバイアルを閉じ、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、ドライアイスに垂直に埋め込む必要がある。２０分後、クライオバイアルを液体窒素に移す。好都合な場合（全てのクライオバイアルが移された場合、又は移す間に長い隙間がある場合）は、長期保存のために凍結されたクライオチューブを液体窒素を有するデュワーに移す。

【0041】

緑色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ系統を回収する例示的な方法では、テトラの１又は２つの繁殖対を、人工産卵マットを備えた２．５～５ガロンのタンクに配置すべきである。タンクの水位は少なくとも約２～３インチであり、７５～８５°Ｆに維持すべきである。低い塩分（導電率１００～２００ｕＳ／ｃｍ）及びわずかな酸性度（約ｐＨ６．９）は、産卵を促進する。魚は、自然又は人工の光サイクルに曝露され得、明期は、午前８時に始まり、午後１０時に終了し得る。翌朝、排卵中の雌を収集する必要がある（それらは優しく押し出すと容易に卵を放出する）。雌の腹部は、ペーパータオルで拭き取って生乾きにする必要がある。卵は、受精を妨げるため、水に晒すべきではない。腹部の側面に、親指と人差し指で軽く圧力をかけ、指を生殖孔にスライドさせることによって、卵をわずかに凹んだ表面に押し出す必要がある。産卵する準備ができている雌は、卵を極めて簡単に放出し、魚を拭き取っている間に卵が押し出されないように注意すべきである。良質な卵は黄色味がかった半透明であり、雌内に長く残存していた卵は、白く不透明に見える。雌は、１時間ほどの間だけ卵を放出する。何匹かの雌からの卵をプールし得、卵は数分間受精しないままにできる。精子は、３０～３３℃で、水浴中で３０秒間解凍する必要がある。７０μｌの室温のＬ－１５培地溶液をバイアルに添加し、混合する必要がある。次に、精子を直ちに卵子に加え、穏やかに混合する。精子及び卵子は、７５０μｌの魚水を加えて混合することによって活性化される。混合物を室温で５分間インキュベートする必要がある。次いで、卵を小さなタンクに移し、そこで通常のプロトコルを使用して更に培養して、緑色のＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫を得る。

【0042】

例示的な実施形態では、若い成体雄オレンジ色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが選択される。背中の腹側を上にして保持する必要がある。腹側は乾いたペーパータオルで拭き取る必要がある。腹側のヒレは、肛門開口部から離れて押され得る。乾燥すると、雄の側面を穏やかに押し出す必要があり、放出された精子を採取し、冷たいＬ－１５細胞培養培地に移す必要がある。精子をすすいで流すためにピペットを数回出し入れする。このプロセスは、いくつかの雄で繰り返す必要があり、良好な状態の場合、Ｌ－１５の５０μｌ当たり約１０匹の雄を使用する必要がある。目標は、５０μｌのＬ－１５当たり少なくとも５～７μｌの精子を採取することである。採取後は、できるだけ早く精子を凍結する必要がある。凍結直前に再混合する必要がある。凍結のために、３０μｌの凍結保護剤溶液（Ｌ－１５中の１０％無脂肪乾燥乳、１５％メタノール、及び１５％２－メトキシエタノール）をクライオバイアルに移す必要がある。１５μｌの精子懸濁液を加え、２～３回ピペッティングすることによって混合する。クライオバイアルを閉じ、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、ドライアイスに垂直に埋め込む必要がある。２０分後、クライオバイアルを液体窒素に移す。好都合な場合（全てのクライオバイアルが移された場合、又は移す間に長い隙間がある場合）は、長期保存のために凍結されたクライオチューブを液体窒素を有するデュワーに移す。

【0043】

オレンジ色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ系統を回収する例示的な方法では、テトラの１又は２つの繁殖対を、人工産卵マットを備えた２．５～５ガロンのタンクに配置すべきである。タンクの水位は少なくとも約２～３インチであり、７５～８５°Ｆに維持すべきである。低い塩分（導電率１００～２００ｕＳ／ｃｍ）及びわずかな酸性度（約ｐＨ６．９）は、産卵を促進する。魚は、自然又は人工の光サイクルに曝露され得、明期は、午前８時に始まり、午後１０時に終了し得る。翌朝、排卵中の雌を収集する必要がある（それらは優しく押し出すと容易に卵を放出する）。雌の腹部は、ペーパータオルで拭き取って生乾きにする必要がある。卵は、受精を妨げるため、水に晒すべきではない。腹部の側面に、親指と人差し指で軽く圧力をかけ、指を生殖孔にスライドさせることによって、卵をわずかに凹んだ表面に押し出す必要がある。産卵する準備ができている雌は、卵を極めて簡単に放出し、魚を拭き取っている間に卵が押し出されないように注意すべきである。良質な卵は黄色味がかった半透明であり、雌内に長く残存していた卵は、白く不透明に見える。雌は、１時間ほどの間だけ卵を放出する。何匹かの雌からの卵をプールし得、卵は数分間受精しないままにできる。精子は、３０～３３℃で、水浴中で３０秒間解凍する必要がある。７０μｌの室温のＬ－１５培地溶液をバイアルに添加し、混合する必要がある。次に、精子を直ちに卵子に加え、穏やかに混合する。精子及び卵子は、７５０μｌの魚水を加えて混合することによって活性化される。混合物を室温で５分間インキュベートする必要がある。次いで、卵を小さなタンクに移し、そこで通常のプロトコルを使用して更に培養して、オレンジ色のＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫を得る。

【0044】

例示的な実施形態では、若い成体雄紫色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが選択される。背中の腹側を上にして保持する必要がある。腹側は乾いたペーパータオルで拭き取る必要がある。腹側のヒレは、肛門開口部から離れて押され得る。乾燥すると、雄の側面を穏やかに絞る必要があり、放出された精子を採取し、冷たいＬ－１５細胞培養培地に移す必要がある。精子をすすいで流すためにピペットを数回出し入れする。このプロセスは、いくつかの雄で繰り返す必要があり、良好な状態の場合、Ｌ－１５の５０μｌ当たり約１０匹の雄を使用する必要がある。目標は、５０μｌのＬ－１５当たり少なくとも５～７μｌの精子を採取することである。採取後は、できるだけ早く精子を凍結する必要がある。凍結直前に再混合する必要がある。凍結のために、３０μｌの凍結保護剤溶液（Ｌ－１５中の１０％無脂肪乾燥乳、１５％メタノール、及び１５％２－メトキシエタノール）をクライオバイアルに移す必要がある。１５μｌの精子懸濁液を加え、２～３回ピペッティングすることによって混合する。クライオバイアルを閉じ、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、ドライアイスに垂直に埋め込む必要がある。２０分後、クライオバイアルを液体窒素に移す。好都合な場合（全てのクライオバイアルが移された場合、又は移す間に長い隙間がある場合）は、長期保存のために凍結されたクライオチューブを液体窒素を有するデュワーに移す。

【0045】

紫色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ系統を回収する例示的な方法では、テトラの１又は２つの繁殖対を、人工産卵マットを備えた２．５～５ガロンのタンクに配置すべきである。タンクの水位は少なくとも約２～３インチであり、７５～８５°Ｆに維持すべきである。低い塩分（導電率１００～２００ｕＳ／ｃｍ）及びわずかな酸性度（約ｐＨ６．９）は、産卵を促進する。魚は、自然又は人工の光サイクルに曝露され得、明期は、午前８時に始まり、午後１０時に終了し得る。翌朝、排卵中の雌を収集する必要がある（それらは優しく押し出すと容易に卵を放出する）。雌の腹部は、ペーパータオルで拭き取って生乾きにする必要がある。卵は、受精を妨げるため、水に晒すべきではない。腹部の側面に、親指と人差し指で軽く圧力をかけ、指を生殖孔にスライドさせることによって、卵をわずかに凹んだ表面に押し出す必要がある。産卵する準備ができている雌は、卵を極めて簡単に放出し、魚を拭き取っている間に卵が押し出されないように注意すべきである。良質な卵は黄色味がかった半透明であり、雌内に長く残存していた卵は、白く不透明に見える。雌は、１時間ほどの間だけ卵を放出する。何匹かの雌からの卵をプールし得、卵は数分間受精しないままにできる。精子は、３０～３３℃で、水浴中で３０秒間解凍する必要がある。７０μｌの室温のＬ－１５培地溶液をバイアルに添加し、混合する必要がある。次に、精子を直ちに卵子に加え、穏やかに混合する。精子及び卵子は、７５０μｌの魚水を加えて混合することによって活性化される。混合物を室温で５分間インキュベートする必要がある。次いで、卵を小さなタンクに移し、そこで通常のプロトコルを使用して更に培養して、紫色のＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫を得る。

【0046】

例示的な実施形態では、若い成体雄赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａが選択される。背中の腹側を上にして保持する必要がある。腹側は乾いたペーパータオルで拭き取る必要がある。腹側のヒレは、肛門開口部から離れて押され得る。乾燥すると、雄の側面を穏やかに押し出す必要があり、放出された精子を採取し、冷たいＬ－１５細胞培養培地に移す必要がある。精子をすすいで流すためにピペットを数回出し入れする。このプロセスは、いくつかの雄で繰り返す必要があり、良好な状態の場合、Ｌ－１５の５０μｌ当たり約１０匹の雄を使用する必要がある。目標は、５０μｌのＬ－１５当たり少なくとも５～７μｌの精子を採取することである。採取後は、できるだけ早く精子を凍結する必要がある。凍結直前に再混合する必要がある。凍結のために、３０μｌの凍結保護剤溶液（Ｌ－１５中の１０％無脂肪乾燥乳、１５％メタノール、及び１５％２－メトキシエタノール）をクライオバイアルに移す必要がある。１５μｌの精子懸濁液を加え、２～３回ピペッティングすることによって混合する。クライオバイアルを閉じ、１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、ドライアイスに垂直に埋め込む必要がある。２０分後、クライオバイアルを液体窒素に移す。好都合な場合（全てのクライオバイアルが移された場合、又は移す間に長い隙間がある場合）は、長期保存のために凍結されたクライオチューブを液体窒素を有するデュワーに移す。

【0047】

赤いＰｒｉｓｔｅｌｌａ系統を回収する例示的な方法では、テトラの１又は２つの繁殖対を、人工産卵マットを備えた２．５～５ガロンのタンクに配置すべきである。タンクの水位は少なくとも約２～３インチであり、７５～８５°Ｆに維持すべきである。低い塩分（導電率１００～２００ｕＳ／ｃｍ）及びわずかな酸性度（約ｐＨ６．９）は、産卵を促進する。魚は、自然又は人工の光サイクルに曝露され得、明期は、午前８時に始まり、午後１０時に終了し得る。翌朝、排卵中の雌を収集する必要がある（それらは優しく押し出すと容易に卵を放出する）。雌の腹部は、ペーパータオルで拭き取って生乾きにする必要がある。卵は、受精を妨げるため、水に晒すべきではない。腹部の側面に、親指と人差し指で軽く圧力をかけ、指を生殖孔にスライドさせることによって、卵をわずかに凹んだ表面に押し出す必要がある。産卵する準備ができている雌は、卵を極めて簡単に放出し、魚を拭き取っている間に卵が押し出されないように注意すべきである。良質な卵は黄色味がかった半透明であり、雌内に長く残存していた卵は、白く不透明に見える。雌は、１時間ほどの間だけ卵を放出する。何匹かの雌からの卵をプールし得、卵は数分間受精しないままにできる。精子は、３０～３３℃で、水浴中で３０秒間解凍する必要がある。７０μｌの室温のＬ－１５培地溶液をバイアルに添加し、混合する必要がある。次に、精子を直ちに卵子に加え、穏やかに混合する。精子及び卵子は、７５０μｌの魚水を加えて混合することによって活性化される。混合物を室温で５分間インキュベートする必要がある。次いで、卵を小さなタンクに移し、そこで通常のプロトコルを使用して更に培養して、赤色のＰｒｉｓｔｅｌｌａの子孫を得る。

【0048】

Ｐａｒｉｃｈｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，２００１は、その全体が参照により組み込まれるが、インビトロ受精に関する更なる実施例を提供する。

【0049】

本開示は、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0050】

Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚が緑色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【0051】

本開示は、Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0052】

Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚がオレンジ色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【0053】

本開示は、Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0054】

Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚が紫色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。

【0055】

本開示は、Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含むトランスジェニック魚、並びにトランスジェニック魚卵、精子細胞、胚、又は遺伝子組換えトランスジェニック構築物を含む他の細胞に由来するそのようなトランスジェニック魚の子孫を更に包含する。「子孫」は、用語が本明細書で使用される場合、本発明の２匹のトランスジェニック魚を繁殖させること、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に繁殖させることから生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特殊な魚株、変異魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は、同じ種であってもよく、又は異なる種若しくは属であってもよい。これらの交配のハイブリッド子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わせた蛍光のための導入遺伝子の利点を有する。

【0056】

Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベントを含む魚を識別する最も単純な方法は、問題の魚が赤色であり、非トランスジェニック魚と直ちに区別されるため、目視検査によるものである。使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａの生涯にわたって、及び／又は複数世代にわたって維持される色を有し得ることを理解されたい。また、使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａの生涯にわたって色褪せする色を有し得ることも理解されたい。例えば、赤色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、赤色から淡い赤色、又は赤色からピンク色に色が変化し得る。更に、使用される特定のＲＦＰ及び／又は発現カセットの挿入位置に応じて、トランスジェニック赤色Ｐｒｉｓｔｅｌｌａは、世代にわたって色褪せする色を有し得る。例えば、赤色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａは、古い世代が赤色を呈し得るが、若い世代が淡い赤色、又はピンク色に見え得るように、ある世代から次の世代に色が変化し得る。

【実施例】

【0057】

本発明のある特定の実施形態は、以下の実施例を参照して更に説明される。これらの実施例は、本発明の単なる例示を意図するものであり、いかようにも本発明の範囲をいかなる方法でも限定又は制限することを意図するものではなく、本発明の技術を実施するためにのみ利用されなければならない条件、パラメータ、試薬、又は出発材料を提供するものと解釈されるべきではない。

【0058】

実施例１－緑色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ
緑色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化される特定のトランスジェニックイベントは、「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」と指定される。これらの魚からの精子を使用して、テトラ卵を受精させ、それによって、これらの特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックテトラを繁殖させ得る。この系統由来の精子は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号（ＰＴＡ－１２７１６２）として指定された）。

【0059】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の緑色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0060】

実施例２－オレンジ色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ
オレンジ色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化される特定のトランスジェニックイベントは、「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」と指定される。これらの魚からの精子を使用して、テトラ卵を受精させ、それによって、これらの特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックテトラを繁殖させ得る。この系統由来の精子は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号（ＰＴＡ－１２７１６４）として指定された）。

【0061】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚のオレンジ色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0062】

実施例３－紫色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ
紫色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化される特定のトランスジェニックイベントは、「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」と指定される。これらの魚からの精子を使用して、テトラ卵を受精させ、それによって、これらの特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックテトラを繁殖させ得る。この系統由来の精子は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号（ＰＴＡ－１２７１６３）として指定された）。

【0063】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の紫色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0064】

実施例４－赤色のトランスジェニックＰｒｉｓｔｅｌｌａ
赤色を呈するトランスジェニック魚が提供される。これらの魚において具現化される特定のトランスジェニックイベントは、「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １形質転換イベント」と指定される。これらの魚からの精子を使用して、テトラ卵を受精させ、それによって、これらの特定のトランスジェニック組み込みイベントを含むトランスジェニックテトラを繁殖させ得る。この系統由来の精子は、ブダペスト条約の条項に基づいて「Ｒｅｄ Ｐｒｉｓｔｅｌｌａ １」としてＡＴＣＣ（Ｈｉｓｔｏｒｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０）に寄託された（寄託は受託番号（ＰＴＡ－１２７１６５）として指定された）。

【0065】

蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用されている。安定的に発現しているトランスジェニック系統は、トランスジェニック個体を野生型魚、変異魚、又は他のトランスジェニック魚で繁殖させることによって発達させることができる。所望のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚の赤色の可視化を可能にする任意の他の有用な光条件で魚を観察することによって、非トランスジェニック魚と区別することができる。

【0066】

蛍光トランスジェニック魚は、細胞系統及び細胞遊走を追跡するなどの胚研究に使用され得るため、科学研究ツールの市場でも価値があるはずである。更に、これらの魚は、遺伝子モザイク実験及び魚のがんモデルで細胞をマークするために使用され得る。

【0067】

本明細書に開示及び特許請求される全ての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして、過度の実験なしに作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本明細書に記載の組成物及び／又は方法並びにステップ又は方法の一連のステップに、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形例が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、同じ又は同様の結果が達成されるとともに、本明細書に記載の薬剤と置き換えられ得ることが明らかであろう。当業者に明らかである全てのそのような同様の代替物及び修飾は、添付の特許請求項の範囲によって定義されるように、本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。

【0068】

上記の明細書、実施例、及びデータは、本発明の組成物の製造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の多くの実施形態は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得るため、本発明は以下に添付される特許請求の範囲に属する。

【0069】

参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたことを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

【0070】

米国特許第７，１３５，６１３号

【0071】

米国特許第７，７００，８２５号

【0072】

米国特許第７，８３４，２３９号

【0073】

Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，６８：２０９－２１９，１９８８．

【0074】

Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，５１：１４３－１５０，１９８６．

【0075】

Ｄｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７１：２０９－２１０，１９９４．

【0076】

Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１７６－１８１，１９９２．

【0077】

Ｉｎｎｅｓ，Ｗ．Ｔ．，Ｅｘｏｔｉｃ Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｆｉｓｈｅｓ： Ａ ｗｏｒｋ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｉｎｎｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９５０．

【0078】

Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌａｔｕｒｅ，１０３：２５３－２７３，１９９２．

【0079】

Ｋｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１０７：１－１９，１９９２．

【0080】

Ｌａｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（５７５５）：１７８２－１７８６，２００５．

【0081】

Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０（５）：１６４０－１６４５，２０１３．

【0082】

Ｐｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，８５：３５－５０，１９９０．

【0083】

Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：３０１－３０８，１９９２．

【0084】

Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４３１８５，２０１７

【0085】

Ｓｈａｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．（５）：８４１－５０，２００４．

【0086】

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【国際調査報告】