特表 2024-544243 発酵バーベナ飲料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-28

(54)【発明の名称】発酵バーベナ飲料

(51)【国際特許分類】

   A23L 2/38 20210101AFI20241121BHJP

   C12G 3/025 20190101ALI20241121BHJP

   A23L 2/84 20060101ALI20241121BHJP

   A23L 2/00 20060101ALI20241121BHJP

   C12N 1/16 20060101ALN20241121BHJP

【ＦＩ】

A23L2/38 C

C12G3/025 ZNA

A23L2/84

A23L2/00 B

C12N1/16 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534397

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-06-07

(86)【国際出願番号】 EP2022085342

(87)【国際公開番号】W WO2023117527

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】21216397.6

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22151533.1

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(74)【代理人】

【識別番号】100200540

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 祐子

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ジユアン

(72)【発明者】

【氏名】バルコス， マリア， エウジェニア

(72)【発明者】

【氏名】モッカンド， シリル

(72)【発明者】

【氏名】アンドレ， アクセル

【テーマコード（参考）】

4B065

4B115

4B117

【Ｆターム（参考）】

4B065AA77X

4B065BB26

4B065BD10

4B065CA42

4B115AG17

4B117LC03

4B117LE08

4B117LG18

4B117LK06

4B117LK12

4B117LK23

4B117LP01

4B117LP03

4B117LP05

4B117LP17

(57)【要約】

本発明は、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む飲料組成物に関する。本発明の更なる態様は、飲料組成物の調製方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が５０より大きい、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む飲料組成物。

【請求項2】

２－フェニルエチルアセテートと２－フェニルエタノールとの合計の、２－フェニルアセトアルデヒドに対する重量比が５５０より大きい、請求項１に記載の飲料組成物。

【請求項3】

１．２重量％未満のエタノール含量を有する、請求項１又は２に記載の飲料組成物。

【請求項4】

前記飲料組成物が、レディ・トゥ・ドリンク飲料、飲料液濃縮物、可溶性飲料粉末、乾燥させた芳香性植物材料及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の飲料組成物。

【請求項5】

飲料調製装置で使用するための容器であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の飲料組成物を収容する容器。

【請求項6】

飲料組成物の調製方法であって、
ａ．水にバーベナを浸漬して、バーベナ水性抽出物及び浸漬されたバーベナを生成する工程と、
ｂ．前記浸漬されたバーベナの存在下又は非存在下で、前記バーベナ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
前記発酵が、ピキア酵母を含む酵母によって行われる、方法。

【請求項7】

前記ピキア酵母が、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ピキア酵母が、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ピキア酵母が、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記発酵が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非存在下で行われる、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記浸漬されたバーベナから前記バーベナ水性抽出物を発酵後に分離することを含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記バーベナ水性抽出物の前記発酵中に存在する前記浸漬されたバーベナが、発酵後に前記バーベナ水性抽出物と一緒に乾燥される、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記飲料組成物が、請求項１～４のいずれか一項に記載のものである、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

飲料を製造するための、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたバーベナの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む飲料組成物に関する。本発明の更なる態様は、飲料組成物の調製方法である。

【0002】

［背景技術］
バーベナティーは、バーベナの葉、茎又は花から作られたハーブティー浸出液である。バーベナティーは、その味わいから、及び多様な健康問題に対する伝統療法として、長い間飲用されてきた。

【0003】

バーベナティーは、わずかにグラッシーで、ハーブ調で、ウッディな味わいと、消費者からは必ずしも高く評価されない多少の苦味を有する。多くの人々は、飲料に新しい風味と甘味を望むが、香料（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）、特に合成香料が添加された飲料又は砂糖の入った果汁飲料を摂取することを好まないと考えられる。したがって、風味の複雑さが追加され、ハーブノート及びウッディノートがあまり強くないバーベナ飲料を提供することには、商業的価値がある。

【0004】

本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であること、又は当該技術分野で共通の全般的な認識の一部を形成していることを認めるものとみなされるべきではない。本明細書で使用される場合、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる／備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、及び類似の単語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを意図している。

【0005】

［発明の概要］
本発明の課題は、現在の技術水準を高めること、及び上記の不便さを少なくともある程度克服する新規な製品を提供すること、あるいは少なくとも有効な代替案を提供することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開させるものである。

【0006】

したがって、本発明は、第１の態様において、３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が５０より大きい、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む飲料組成物を提供する。

【0007】

本発明の第２の態様は、飲料調製装置で使用するための容器であって、本発明の飲料組成物を収容する容器を提供する。

【0008】

第３の態様では、本発明は、飲料組成物の調製方法を提供し、該方法は、
ａ．水にバーベナを浸漬して、バーベナ水性抽出物及び浸漬されたバーベナを生成する工程と、
ｂ．浸漬されたバーベナの存在下又は非存在下で、バーベナ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
前記発酵は、ピキア酵母を含む酵母によって行われる。

【0009】

本発明のさらなる態様は、飲料を製造するための、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたバーベナの使用を提供する。

【0010】

バーベナは、乾燥した葉、茎又は花を熱水に浸すことによって飲料浸出液にすることができる。これらの飲料は、わずかにグラッシーで、ハーブ調で、ウッディな味わいと、多少の苦味と、わずかな甘味を有する。本発明者らは、驚くべきことに、ピキア酵母による発酵を通して、バーベナ飲料のエタノールは低いままで、発酵がアロマの知覚及び複雑性を増強し、目立ったグラッシーノート、ハーブ調ノート及びウッディノートを減じることを見出した。発酵飲料には、発酵においてオフフレーバーとして知覚され得るバター様及び脂肪様のノートがなかった。

【0011】

［発明を実施するための形態］
したがって、本発明は、一部には３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が５０より大きく、例えば１００より大きく、例えば１５０より大きく、例えば２００より大きく、例えば２５０より大きく、例えば２６０より大きく、更には例えば２７０より大きい、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む（例えば、これらからなる）飲料組成物に関する。この比は、ｐｐｍ単位での重量濃度から次のように計算できる。

【0012】

【数1】

【0013】

化合物２，３－ブタンジオンはジアセチルとしても知られている。２，３－ブタンジオンは、バター様又は脂肪様のノートを提供する。３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する比が高いことは、発酵においてオフフレーバーとして知覚され得るバター様及び脂肪様のノートを伴わない、増強されたフルーティーノート及びフローラルノートに対応する。増強されたフルーティーノート及びフローラルノートは、グラッシーノートをマスクするように作用する。

【0014】

バーベナは、クマツヅラ（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）科に属する草本性顕花植物である。バーベナは、クマツヅラ又はヴェルヴェーヌとしても知られている。一実施形態では、バーベナは、バーベナ・オフィシナリス（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（クマツヅラ）又はアロイシア・シトロドラ（Ａｌｏｙｓｉａ ｃｉｔｒｏｄｏｒａ）（レモンバーベナ）である。

【0015】

本発明の文脈において、「発酵」という用語は、微生物の活性が食品又は飲料に変化（典型的には望ましい変化）をもたらすプロセスを指す。発酵は、酵母及び／又は細菌によるものであり得る。発酵は、嫌気性又は好気性であり得る。発酵は、食品の保存及び強化に最も古くから用いられている手法の１つである。

【0016】

「発酵バーベナ」という用語は、酵母などの微生物の活性によりバーベナの有機成分に化学的変化、典型的には望ましい変化がもたらされるプロセスに供された、バーベナを指す。発酵バーベナは、水性媒質で、例えば酵母により発酵され得る。発酵バーベナは、水性発酵培地に添加して発酵させた後、水性発酵培地から分離して乾燥させた、乾燥バーベナであり得る。発酵バーベナは、例えば酵母のスターター培養物をバーベナ、例えば、新鮮なバーベナの葉、茎及び／又は花に添加する、「固体（ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ）」発酵で発酵されていてもよい。

【0017】

「バーベナ抽出物」という用語は、バーベナから抽出された物質、例えばバーベナの水性抽出物を指す。「発酵バーベナ抽出物」という用語は、バーベナ抽出物を発酵させた後のバーベナ抽出物、例えば酵母などによってバーベナ水性抽出物を発酵させた後のバーベナ水性抽出物を指す。発酵バーベナ抽出物は、乾燥させた発酵バーベナ抽出物であってもよい。

【0018】

一実施形態では、飲料組成物（例えば飲料）は、２－フェニルエチルアセテートと２－フェニルエタノールとの合計の、２－フェニルアセトアルデヒドに対する重量比が、５５０より大きく、例えば６００より大きく、例えば６５０より大きく、例えば７００より大きく、更には例えば８００より大きい。

【0019】

比は、ｐｐｍ単位での重量濃度から次のように計算できる。

【数2】

【0020】

ピキアによる糖の発酵中には、２－フェニルエチルアセテートなどの高級エステルが最初に産生されるが、発酵が進むにつれて、２－フェニルエタノールなどの高級アルコールが産生される。２－フェニルエチルアセテートと２－フェニルエタノールとの合計の、２－フェニルアセトアルデヒドに対する比が高いことは、発酵飲料における心地よいアロマバランスに対応する。

【0021】

一実施形態では、飲料組成物は、乾燥ベースで１０ｇ／ｋｇ未満の酢酸、例えば乾燥ベースで１ｇ／ｋｇ未満の酢酸、更に例えば乾燥ベースで０．５ｇ／ｋｇ未満の酢酸を含む。コンブチャ又はケフィアなどの飲料の風味プロファイルにおけるこの酸による「刺激感（ｂｉｔｅ）」は、より穏やかな風味プロファイルを求める消費者からは必ずしも望まれるわけではない。

【0022】

多くの消費者は、アルコール飲料の代替品として、複雑で清涼な味わいを有する飲料を求めている。一実施形態では、飲料組成物は、１．２重量％未満、例えば０．５重量％未満、例えば０．２重量％未満、更に例えば０．０５重量％未満のエタノール含量を有する。

【0023】

飲料組成物は、レディ・トゥ・ドリンク飲料、飲料液濃縮物、可溶性飲料粉末、乾燥させた芳香性植物材料、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

【0024】

レディ・トゥ・ドリンク飲料は、発酵バーベナ浸出液又は発酵バーベナで風味付けされた水であり得る。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、香味料又は安定剤などの他の成分を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、炭酸飲料であり得る。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、イチゴ、オレンジ、レモン、ライム、モモ、ザクロ、スイカ、ブラックベリー又はクランベリーなどの果実又は果汁を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ミント又はバジルなどのハーブを更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ハイビスカス又はバラなどの花抽出物を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、添加されたビタミン及びミネラルを含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、複製性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）又は非複製性（ｎｏｎ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）の有益な微生物を含んでもよい。有益な微生物は、例えばプロバイオティクスであってもよい。

【0025】

抽出可能な小分けされた原材料を収容する飲料調製装置（例えば、飲料調製マシン）は、飲料を調製する便利な方法を提供する。このような小分けされた原材料は、概して、例えばポッド、パッド、小袋、パウチ、又はカプセルなどとして構成された容器に詰められる。本発明の一態様は、飲料調製装置で使用するための容器であって、本発明の飲料組成物を収容する容器を提供する。容器は、飲料調製装置に挿入されたときに飲料を調製するためのものである。容器は、例えば、様々な構成の中でも特に、飲料カプセルであってもよい。一実施形態では、容器は、本発明の飲料組成物を収容する。例えば、容器は、乾燥させた発酵バーベナ又は乾燥させた発酵バーベナ抽出物を収容し得る。容器は、乾燥させた発酵バーベナ及び／又は乾燥させた発酵バーベナ抽出物を収容でき、これらは、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの他の乾燥原材料と組み合わせてもよい。

【0026】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、
ａ．水にバーベナを浸漬して、バーベナ水性抽出物及び浸漬されたバーベナを生成する工程と、
ｂ．浸漬されたバーベナの存在下又は非存在下で、バーベナ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
発酵は、ピキア酵母を含む酵母によって行われる。

【0027】

酵母は、主にピキア酵母であってもよく、例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超がピキアであってもよい。例えば、酵母コロニー形成単位の５０％超がピキアであってもよく、例えば、酵母コロニー形成単位の６０％、７０％、８０％、９０％超がピキアであってもよい。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキアであってもよく、更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキアであってもよい。

【0028】

本発明の方法によって調製される飲料組成物は、バーベナ飲料、例えば、発酵バーベナ又は発酵バーベナ抽出物を含む飲料であり得る。本発明の方法によって調製される飲料組成物は、１．２重量％未満、例えば０．５重量％未満、例えば０．２重量％未満、更に例えば０．０５重量％未満のエタノール含量であり得る。一実施形態では、本発明の方法によって調製される飲料組成物は、本発明の飲料組成物である。

【0029】

浸漬という用語は、材料を液体に浸して漬けることを指す。バーベナは、少なくとも２分間、例えば少なくとも３分間、例えば少なくとも４分間、例えば少なくとも５分間、例えば少なくとも１０分間、例えば少なくとも１５分間、例えば少なくとも２０分間、例えば少なくとも３０分間、例えば少なくとも６０分間、更に例えば少なくとも１２０分間、水中に浸漬されてもよい。浸漬プロセス中に、バーベナの成分が水に抽出される。浸漬は、４℃～９８℃の間、例えば２０℃～９５℃の間、例えば６０℃～９５℃の間の温度で行ってよい。バーベナは、いくらかの発酵性糖質を含有するが、更なる発酵性糖質、例えばスクロース又はグルコースを、バーベナ水性抽出物に添加してもよい。発酵性糖質は、フルクトース又はグルコースであり得る。発酵性糖質は、ハチミツの形態であり得る。例えば、発酵性糖質を２～１０重量％、例えば３～７重量％のレベルでバーベナ水性抽出物に添加してもよい。バーベナは、浸漬前に乾燥及び／又は粉砕してもよい。

【0030】

浸漬されたバーベナの非存在下で発酵が行われる場合、バーベナは、例えば、連続向流抽出システムを使用して水中に浸漬され得る。更なる選択肢は、バッチプロセスを使用して水中にバーベナを浸漬することであり、浸漬されたバーベナは、濾過システムを使用してバーベナ水性抽出物から分離される。浸漬中の乾燥ベースのバーベナ対水の比は、重量で１：１～１：１００、例えば重量で１：２～１：９５、例えば重量で１：１０～１：９０、例えば重量で１：３０～１：７０、更に例えば１．３～１：６であり得る。

【0031】

浸漬の後、バーベナ水性抽出物の温度を、酵母の増殖に適する温度、例えば２０℃～３７℃、例えば２５℃～３５℃、例えば２８℃～３２℃に調整する。温度は、例えば、層流熱交換器を使用して調節することができる。酵母をバーベナ水性抽出物に添加して発酵を開始させる。バーベナ水性抽出物の発酵は、２５℃～３５℃、例えば２８℃～３２℃の温度で行われてもよい。バーベナ水性抽出物の発酵は、少なくとも２時間、例えば少なくとも６時間、例えば少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間、更に例えば少なくとも４８時間実施してもよい。

【0032】

発酵は、３～８、例えば４～６のｐＨで実施してもよい。

【0033】

発酵は、酵母エキスや酵母ペプトンなどの窒素源の存在下で実施してもよい。発酵は、例えばバーベナ水性抽出物の０．０５重量％～０．１重量％のレベルで添加した、バリン、ロイシン、イソロイシン及び／又はフェニルアラニンなどのアミノ酸の存在下で実施してもよい。

【0034】

発酵は、嫌気性、微好気性又は好気性の条件で実施してもよい。例えば、発酵槽内の酸素分圧は、０～３０％、例えば１～２０％、更に例えば２～１０％であり得る。

【0035】

好ましくはバーベナは、発酵前に加水分解などの化学的処理を受けていない。

【0036】

発酵は、少なくとも１０^３ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^４ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、更に例えば少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇの初期混合酵母レベルで、１種類以上の酵母（例えば、ピキア酵母）を添加することによって実施され得る。

【0037】

発酵は、ケフィア発酵で得られ得るような、風味プロファイルにおける酸による「刺激感」の発生を回避するために、酢酸菌の非存在下で行われてもよい。一実施形態では、発酵は乳酸菌の非存在下で行われる。

【0038】

一実施形態では、発酵は、サッカロミセス亜種の非存在下で行われる。例えば、発酵は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非存在下で実施され得る。Ｓ．セレビシエは、ワイン製造及びビール醸造に使用される。Ｓ．セレビシエは、望ましくない場合があるアルコールを生成することに加えて、新鮮なフルーティーなノートではなく、「発酵した」、ワインのような、酵母のような風味のノートを生成する。

【0039】

一実施形態では、発酵は、ザイゴサッカロミセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トルラスポラ・デルブルッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｅｕｋｉｉ）、ロードトルーラ・ムチラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ブレッタノマイセス・ブルキセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）及びカンジダ・ステラテ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｅ）からなる群から選択される酵母の非存在下で行われる。これらの酵母は、コンブチャ「茶－真菌」培養物中に一般的に存在する。

【0040】

本発明者らは、ピキア・クルイベリによるバーベナの発酵が、特に良好な結果を与えることを見出した。ピキア・クルイベリで発酵させたバーベナ又はバーベナ抽出物を含む飲料組成物は、未発酵飲料と比較して、アロマの知覚及び複雑性が増強された心地よいフルーティーな味わいを有し、顕著なグラッシーノート、ハーブ調ノート及びウッディノートが少ない。

【0041】

ピキア・クルイベリは、世界中で、例えば、オリーブ、ブドウ及びコーヒーに天然に存在する。一実施形態では、ピキア酵母は、主にピキア・クルイベリであり、例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリであり得る。例えば、酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリであってもよく、例えば、酵母コロニー形成単位の６０％、７０％、８０％、９０％超は、ピキア・クルイベリであってもよい。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリであってもよく、更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリであってもよい。

【0042】

ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６（あるいはＣＢＳ１８８と表記される）は、ピキア・クルイベリの基準株である。基準株は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｑｕａｄｒａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国）から公的に入手可能である。

【0043】

一実施形態では、ピキア酵母は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。

【0044】

ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１（あるいはＭａｉｚｅ Ｓｉｌａｇｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ８６と表記される）は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｑｕａｄｒａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国）から公的に入手可能である。

【0045】

一実施形態では、ピキア酵母は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。

【0046】

ピキア・クルイベリは、自然界に広く分布しており、例えばコーヒーチェリー及びオリーブなどの果実に存在する。ニカラグアのコーヒー発酵場で採取・単離されたピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５は、２０２０年６月２３日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ－７５７２４ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ１５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５を得た。

【0047】

一実施形態では、酵母は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。

【0048】

本発明者らは、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５でバーベナを発酵させることによって、特に良好な結果が得られることを見出した。バーベナをピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５で発酵させた結果、３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が高くなり、この比は、発酵においてオフフレーバーとして知覚され得るバター様及び脂肪様のノートを伴わない、増強されたフルーティーノート及びフローラルノートに対応する。

【0049】

発酵は、少なくとも１０^３ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^４ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、更に例えば少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇの初期酵母レベルで、ピキア・クルイベリ、例えばピキア・クルイベリ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）を添加することによって実施され得る。

【0050】

ＰａｃＢｉｏシークエンシング技術を使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）の遺伝子配列を解析した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔキットを使用してＤＮＡ精製を行った。１２個のＤＮＡ断片を同定した。これらの断片は個々の染色体、すなわち１１個の染色体及び１個のミトコンドリアＤＮＡ（配列番号４）であり得る。遺伝子配列を、配列番号１～配列番号１２として電子的形式で提出する。

【0051】

本発明の方法の一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号３に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号５に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号８に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号９に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号１１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、又は配列番号１２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列を含む。

【0052】

本発明の方法の一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号３に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号４に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号５に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号８に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号９に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号１１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、及び配列番号１２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列を含む。

【0053】

一実施形態では、発酵は、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含む酵母によって実施される。「配列番号１～１２の組み合わせ」という用語は、単一の配列に連結されているかのように、全ての個々のＤＮＡ断片に対して配列同一性比較が行われることを意味する。

【0054】

一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号２に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号３に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号５に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号６に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号８に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号９に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１１に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１２に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。

【0055】

酵母を指す名称は、時間が経つにつれて変更され得る。本発明の方法による酵母は、酵母に適用される名称にかかわらず、本発明のピキア酵母について先行段落に記載された遺伝子配列同一性を含み得ることが理解されるべきである。

【0056】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）水にバーベナを浸漬して、バーベナ水性抽出物及び浸漬されたバーベナを生成する工程と、
ｂ）浸漬されたバーベナの存在下又は非存在下で、バーベナ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、発酵は、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含む酵母によって実施される。

【0057】

一実施形態では、浸漬されたバーベナからバーベナ水性抽出物を発酵後に分離する。例えば、浸漬されたバーベナは、濾過システムを使用してバーベナ水性抽出物から分離され得る。発酵後、バーベナ水性抽出物は発酵バーベナ抽出物となる。

【0058】

発酵バーベナ抽出物は、レディ・トゥ・ドリンク飲料としてパッケージングしてもよく、例えばボトル又は缶にパッケージングしてもよい。発酵バーベナ抽出物は、２～６０重量％の総溶解固形分の濃度、例えば、２～２５重量％の総溶解固形分の濃度を有し得る。レディ・トゥ・ドリンク飲料としてパッケージングする前に、発酵バーベナ抽出物に香味料及び保存料などの追加の原材料を添加してもよい。発酵バーベナ抽出物は、パッケージング前に、酵母及び任意の腐敗性生物を不活性化又は死滅させるために熱処理してもよい。発酵バーベナ抽出物は、パッケージング前に、フィルターを通過させて酵母及び腐敗性生物を除去してもよい。

【0059】

一実施形態では、バーベナ水性抽出物は、発酵後に濃縮され、例えば、摂取前に消費者が希釈するのに適した液体濃縮物としてパッケージングされる。バーベナ水性抽出物は、例えば異なる場所でのレディ・トゥ・ドリンク製品の製造のための中間製品として濃縮されてもよい。発酵バーベナ抽出物は、２５～６０重量％の総溶解固形分の濃度、更なる例としては、５０～６０重量％の総溶解固形分の濃度を有し得る。溶解固形分は、例えば、抽出物を微細フィルターに通して非溶解固形分を除去し、濾液を秤量して総重量を確定し、濾液を蒸発させ、次いで残留物を秤量して溶解固形分の重量を得ることによって測定することもできる。

【0060】

発酵後のバーベナ水性抽出物（例えば、発酵バーベナ抽出物）は、可溶性飲料粉末などの粉末を生成するために濃縮されてもよい。例えば、発酵後のバーベナ水性抽出物（発酵バーベナ抽出物）を噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥させて、可溶性飲料粉末を生成してもよい。例えば、発酵後のバーベナ水性抽出物をマルトデキストリンなどの担体と一緒に噴霧乾燥させて可溶性飲料粉末を生成してもよい。可溶性飲料粉末は、パッケージングしてそのまま販売してもよく、又は、例えば異なる場所でのレディ・トゥ・ドリンク製品の製造のための中間製品として使用してもよい。可溶性飲料粉末は、飲料調製装置で使用するための容器に充填されてもよい。可溶性飲料粉末は、他の原材料、例えば、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの乾燥原材料と組み合わせてもよい。例えば、可溶性飲料粉末は、他の原材料と組み合わせて、飲料調製装置で使用するための容器に充填してもよい。可溶性飲料粉末は、飲料ミックスを生成するために、乳粉末又は飲料クリーマー粉末及び任意に糖と組み合わせてもよい。浸漬されたバーベナは、浸漬されたバーベナの存在下でバーベナ水性抽出物を発酵させた後、発酵バーベナになる。一実施形態では、バーベナ水性抽出物の発酵中に存在する浸漬バーベナは、発酵後にバーベナ水性抽出物から分離され、次いで、例えば回転乾燥機を使用して乾燥される。乾燥させた浸漬バーベナは、飲料調製装置で使用するための容器に充填されてもよく、又は「ティーバッグ」などの透液性（ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）バッグに充填されてもよい。乾燥させた浸漬バーベナは、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの他の乾燥原材料と組み合わせてもよい。本発明の文脈において、茶という用語は、植物カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の乾燥葉、葉芽、小枝又は茎を指す。茶は例えばシネンシス系（ｖａｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のＣ．シネンシス、又はアッサミカ系（ｖａｒ．ａｓｓａｍｉｃａ）のＣ．シネンシスであり得る。「ハーブティー」という用語は、カメリア・シネンシス以外の植物の乾燥した花、果物、葉、種子又は根から作られた浸出液を指す。

【0061】

一実施形態では、バーベナ水性抽出物の発酵中に存在する、浸漬されたバーベナは、発酵後にバーベナ水性抽出物と一緒に、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥される。乾燥させた浸漬バーベナ（例えば、乾燥させた発酵バーベナ）は、発酵後の乾燥させたバーベナ水性抽出物（例えば、乾燥させた発酵バーベナ抽出物）と共に、飲料調製装置で使用するための容器に充填されてもよく、又は「ティーバッグ」などの透液性バッグに充填されてもよい。発酵後の乾燥させた浸漬バーベナ及び乾燥させたバーベナ水性抽出物は、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの他の乾燥原材料と組み合わせてもよい。

【0062】

本発明の一態様は、飲料を製造するための、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたバーベナの使用を提供する。

【0063】

本発明による発酵バーベナは、例えば、ピキア酵母のスターター培養物をバーベナ葉、例えば、乾燥されていない新鮮なバーベナ葉、茎及び／又は花に添加する、「固体」発酵において得ることができる。「固体」発酵という用語は、固体材料において行われる発酵を指す。固体発酵には、液体の水が存在するが、この用語は、発酵容器中の水溶液中で生じ得るような液体発酵とは対照的に使用される。

【0064】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、
酵母のスターター培養物をバーベナに添加する工程であって、スターター培養物が、バーベナ１グラム当たり少なくとも１０^４ＣＦＵ（例えば、少なくとも１０^５ＣＦＵ、更に例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ）の酵母を供給する、工程と、
バーベナを発酵させる工程と、
発酵させたバーベナを乾燥させて、発酵バーベナを生成する工程と、
発酵バーベナを水で抽出してレディ・トゥ・ドリンク飲料を生成する工程、又は、
発酵バーベナを容器、例えば飲料調製装置に挿入されたときに飲料を調製するための容器に、充填する工程、のいずれかと、
を含む。

【0065】

酵母のスターター培養物は、液体又は粉末としてバーベナに添加されてもよい。バーベナの葉、茎及び／又は花は、酵母のスターター培養物が添加されるとき、４５～５５重量％の水分含量を有し得る。酵母を添加する前に環境微生物の量を低減させるために、発酵前に葉、茎及び／又は花を蒸気で処理してもよい。発酵は、４０重量％を超える、例えば４５重量％を超える、更に例えば５０重量％を超える固形分含量で生じ得る。

【0066】

発酵がある程度継続している間に、発酵バーベナの乾燥を開始してもよい。例えば、バーベナ葉、茎及び／又は花をタンクなどの容器に入れ、スターター培養物を添加し、次いで発酵を１～４日間進行させた後、発酵バーベナを容器から取り出し、乾燥させてもよい。更なる例として、スターター培養物をバーベナ葉、茎及び／又は花に添加した後、バーベナ葉、茎及び／又は花を、例えば、ラック又は吊り下げトレイにおいて徐々に乾燥させてもよい。発酵を開始したら、発酵を継続しながらバーベナ葉、茎及び／又は花を徐々に乾燥させてもよい。例えば、発酵バーベナ葉、茎及び／又は花は、１～３０日間、例えば４～２０日間の期間にわたって、２０重量％未満（例えば１５重量％未満）の水分含量まで乾燥させてもよい。乾燥温度は、約４０℃未満、例えば約２５℃～３５℃であり得る。ファンを使用して、バーベナ葉、茎及び／又は花が乾燥するまで材料に乾燥空気を吹き付けてもよい。発酵バーベナ葉、茎及び／又は花は、日光で乾燥させてもよい。

【0067】

酵母は、ピキア、例えばピキア・クルイベリ、更には例えばピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５であってもよい。酵母は、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含んでもよい。

【0068】

飲料調製装置に挿入される場合、飲料調製のための容器は、ポッド、パッド、小袋、パウチ、又はカプセルなどの形態であり得る。

【0069】

レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ボトル又は缶に充填されてもよい。発酵バーベナは、水で抽出してレディ・トゥ・ドリンク飲料を生成する前に、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの他の抽出可能な材料と組み合わされてもよい。

【0070】

発酵バーベナは、飲料調製装置に挿入されたときに、飲料の調製のための容器内で茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーと組み合わされてもよい。

【0071】

当業者は、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の製品について記載された特徴を本発明の方法と組み合わせてもよく、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。既知の均等物が特定の特徴について存在する場合、このような均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのごとく組み込まれる。

【0072】

本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び非限定的な実施例から明らかである。

【0073】

［実施例］
実施例１：バーベナの発酵方法
有機バーベナティー（Ｃｏｏｐ Ｎａｔｕｒａｐｌａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を出発原料として使用して、浸出液を調製した。まず、１００℃の水１０００ｍＬ中に２０ｇの乾燥出発原料を添加し、１０分間浸漬することによって、高温浸出液を作製した。その後、温度が３０℃未満に低下するまで、浸出液を氷浴中に置いた。次いで、浸出液を篩に通して濾過して、更に小片を除去した。濾液（バーベナ水性抽出物）を、対照（Ｒｅｆ）として、又は様々な発酵試料に対して、等量分配した。

【0074】

発酵バーベナは、グルコース（２％ｍ／ｍ）と、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６（ピキア・クルイベリの基準株）、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２７８１、市販の醸造酵母サッカロミセス・セレビシエ（ＳａｆＡｌｅ Ｓ－３３、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、並びにコンブチャ茶発酵由来の細菌及び酵母の共生培養（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｙｅａｓｔｓ、ＳＣＯＢＹ）ペリクルを含む様々なスターター培養物と、を用いて浸出液を発酵させることによって、作製した。全ての株（ＳＣＯＢＹを除く）は、グリセロールバイアルから、食用イースト－ペプトン液体培地で増殖させ、光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）０．５で参照バーベナ醸造液に接種した。接種した浸出液は全て、微好気条件下、３０℃で２４時間保存した。インキュベーション後、各発酵浸出液を濾過滅菌（０．２μｍ）した。

【0075】

実施例２：様々な酵母で発酵させたバーベナの官能分析
様々なバリエーションのバーベナ浸出液の官能プロファイルをテイスティングした。対照には、ハーブ調及びグリーン／グラッシーの味わいがあった。サッカロミセス・セレビシエで発酵させたバーベナ浸出液は、ビール様の特徴を有していた。ＳＣＯＢＹで発酵させたバーベナは、非常に強い酸味を有していた。異なる２種類のピキア酵母で発酵させたバーベナ浸出液は、対照と比較して、増強された甘味を有し、よりフルーティーであり、知覚されるグリーンノート及びグラッシーノートが少なく、全体的にバランスがとれていた。ピキア酵母で発酵させたバーベナでは、バター様及び脂肪様のオフノートは識別されなかった。ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５で発酵させたバーベナは、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６で発酵させたバーベナと比較したときに、よりクリーンなアロマプロファイルを有し、フローラルというよりもむしろフルーティーであることが確認された。

【0076】

実施例３：様々な酵母で発酵させたバーベナ中に存在する芳香化合物に着目した風味プロファイルの分析
ガスクロマトグラム及び質量分析と組み合わせたヘッドスペース／固相微量抽出（ＨＳ／ＳＰＭＥ－ＧＣ－ＭＳ）によって、バーベナ浸出液の揮発性物質の定量的プロファイリングを行った。装置は、質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７０１０Ｂ ＴＱ）と連結したガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８８９０ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。

【0077】

最初に１．０ｍＬのバーベナ浸出液試料を、１０ｍＬスクリュートップヘッドスペースバイアル中で３０℃で１０分間インキュベートし、その後、ＳＰＭＥ繊維（ＰＤＭＳ／ＤＶＢ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して３０℃で１０分間抽出した。全てのバイアルは、分析前に６℃に冷却したトレイに入れた。揮発性物質を、２５０℃、スプリットレスモードでＳＰＭＥ繊維から熱的に脱着させ、キャピラリーカラム（ＤＢ－ＷＡＸ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離した。ガスクロマトグラフオーブン温度は、最初に３５℃で５分間、次いで４℃／分で２３０℃に上昇、次いで２３０℃で１０分間となるようにプログラムした。ヘリウムをキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で使用した。標的化合物を純粋な標準物質によって同定し、ＭＳＤ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）で定量した。全ての試料を２回測定した。

【0078】

２４時間後の３－メチルブチルアセテート、２－メチルブチルアセテート、酢酸イソブチル、２－フェニルエチルアセテート、２－フェニルエタノール、２，３－ブタンジオン、２－フェニルアセトアルデヒド、エタノール及び酢酸のレベルをｐｐｍ単位で以下の表に示す。

【0079】

【表1】

【0080】

ＳＣＯＢＹで発酵させた試料は、乾燥ベースで１８２ｇ／ｋｇに相当する高レベルの酢酸を有していた。

【0081】

アロマ成分の重量比Ａ及び重量比Ｂを以下の表に示す。

【0082】

【数3】

【0083】

【表2】

【0084】

ピキア酵母（ＮＹＳＣ５４８５、ＮＹＳＣ２７８１及びＮＣＹＣ２４６）で発酵させた試料は、対照及びＳ．セレビシエ又はＳＣＯＢＹで発酵させた試料よりも高い比Ａ及び比Ｂを示す。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５は、比Ａ及び比Ｂについて、基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６よりも高い値をもたらし、比ＡについてＰ．クルイベリＮＣＹＣ２７８１よりも高い値をもたらす。

【0085】

実施例４：Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５の遺伝子配列と基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列との比較
ＰａｃＢｉｏシークエンシング技術を使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）及びＰ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列を解析した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔキットを使用してＤＮＡ精製を行った。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５について１２のＤＮＡ断片が同定され、基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６については１５の断片が同定された。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５の遺伝子配列を、配列番号１～配列番号１２として電子的形式で提出し、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列については、配列番号１３～配列番号２７として提出した。ミトコンドリアＤＮＡは、Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５については配列番号４であり、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６については配列番号２０である。

【0086】

ソフトウェアＯｒｔｈｏＡＮＩｕを使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）の遺伝子配列を、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６と比較した。全体的な平均ヌクレオチド同一性は、９７．９１％であることがわかった。

【0087】

様々な配列間の対応関係を以下の表に示す。ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５の複数の配列は、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の配列の組み合わせとの対応が最も近く、その逆もまた同様である。

【0088】

【表3】

【0089】

基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６は、配列番号１～１２のそれぞれに対して、以下に示す最大の同一性で遺伝子配列を含んでいた：
配列番号１、９７．８５％；配列番号２、９７．４０％；配列番号３、９７．８６％；配列番号４、９９．０２％；配列番号５、９８．０５％；配列番号６、９７．９３％；配列番号７、９８．１２％；配列番号８、９７．０７％；配列番号９、９７．２０％；配列番号１０、９８．３３％；配列番号１１、９７．５２６％；配列番号１２、９７．７７％。

【配列表】

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【国際調査報告】