特表 2024-544306 発酵レディ・トゥ・ドリンクヘンプ飲料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-28

(54)【発明の名称】発酵レディ・トゥ・ドリンクヘンプ飲料

(51)【国際特許分類】

   A23L 2/00 20060101AFI20241121BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20241121BHJP

   C12N 1/16 20060101ALN20241121BHJP

【ＦＩ】

A23L2/00 B

A23L2/00 F

C12N1/16 G ZNA

C12N1/16 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536068

(86)(22)【出願日】2022-12-12

(85)【翻訳文提出日】2024-06-14

(86)【国際出願番号】 EP2022085345

(87)【国際公開番号】W WO2023117529

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】21216395.0

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22151531.5

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】22178318.6

(32)【優先日】2022-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ジユアン

(72)【発明者】

【氏名】バルコス， マリア エウジェニア

(72)【発明者】

【氏名】モッカンド， シリル

(72)【発明者】

【氏名】アンドレ， アクセル

【テーマコード（参考）】

4B065

4B117

【Ｆターム（参考）】

4B065AA77X

4B065BB26

4B065BD43

4B065CA41

4B117LC03

4B117LG18

4B117LK23

4B117LL09

4B117LP05

(57)【要約】

本発明は、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含むレディ・トゥ・ドリンク飲料組成物に関する。本発明の更なる態様は、レディ・トゥ・ドリンク飲料組成物の調製方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含む飲料組成物であって、３－メチルブチルアセテートと３－メチルブタノールとの合計の、３－メチルブタナールに対する重量比が２０００より大きく、前記飲料組成物がレディ・トゥ・ドリンク飲料である、飲料組成物。

【請求項2】

２－メチルブチルアセテートと２－メチルブタノールとの合計の、２－メチルブタナールに対する重量比が２０００より大きい、請求項１に記載の飲料組成物。

【請求項3】

３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が５０より大きい、請求項１又は２に記載の飲料組成物。

【請求項4】

１．２重量％未満のエタノール含量を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の飲料組成物。

【請求項5】

飲料組成物の調製方法であって、
ａ．水にヘンプを浸漬して、ヘンプ水性抽出物及び浸漬されたヘンプを生成する工程と、
ｂ．前記浸漬されたヘンプの存在下又は非存在下で、前記ヘンプ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
前記発酵がピキア酵母を含む酵母によって行われ、前記飲料組成物がレディ・トゥ・ドリンク飲料である、方法。

【請求項6】

前記ピキア酵母が、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ピキア酵母が、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含む、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記発酵が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非存在下で行われる、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記発酵が、酢酸菌の非存在下で行われる、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

浸漬されたヘンプから前記ヘンプ水性抽出物を発酵後に分離することを含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

レディ・トゥ・ドリンク飲料を製造するための、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたヘンプの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含むレディ・トゥ・ドリンク飲料組成物に関する。本発明の更なる態様は、レディ・トゥ・ドリンク飲料組成物の調製方法である。

【背景技術】

【0002】

ヘンプは、多くの法域（ｊｕｒｉｓｄｉｃｔｉｏｎ）において様々な形態で合法的に摂取され得る。例えばヘンプの葉及び花からの浸出液を醸造することによる合法なヘンプの摂取は、医薬用途だけでなく、健康上の利益が認められる娯楽性飲料（ｅｎｊｏｙａｂｌｅ ｂｅｖｅｒａｇｅ）としてもますます一般的になっている。しかしながら、ヘンプ浸出液は、消費者全般に人気がない、アーシー感及びハーベイシャス（ｈｅｒｂａｃｅｏｕｓ）が強い味わいを有する。多くの人々は、飲料に新しい風味を望むが、香料（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）、特に合成香料が添加された飲料又は砂糖の入った果汁飲料を摂取することを好まない。したがって、新規な風味を有し、アーシー／ヘンプノートが強くないヘンプ飲料の提供には、商業的価値がある。

【0003】

本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であること、又は当該技術分野で共通の全般的な認識の一部を形成していることを認めるものとみなされるべきではない。本明細書で使用される場合、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる／備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、及び類似の単語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを意図している。

【発明の概要】

【0004】

本発明の課題は、現在の技術水準を高めること、及び上記の不便さを少なくともある程度克服する新規な製品を提供すること、あるいは少なくとも有効な代替案を提供することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開させるものである。

【0005】

したがって、本発明は、第１の態様において、３－メチルブチルアセテートと３－メチルブタノールとの合計の、３－メチルブタナールに対する重量比が２０００より大きい、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含む飲料組成物を提供し、当該飲料組成物はレディ・トゥ・ドリンク飲料である。

【0006】

第２の態様において、本発明は、飲料組成物の調製方法を提供し、該方法は、
ａ．水にヘンプを浸漬して、ヘンプ水性抽出物及び浸漬されたヘンプを生成する工程と、
ｂ．浸漬されたヘンプの存在下又は非存在下で、ヘンプ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
発酵はピキア酵母を含む酵母によって行われ、飲料組成物はレディ・トゥ・ドリンク飲料である。

【0007】

本発明のさらなる態様は、レディ・トゥ・ドリンク飲料を製造するための、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたヘンプの使用を提供する。

【0008】

ヘンプ葉は、乾燥した葉を熱水又は冷水のいずれかに浸すことによって飲料にすることができる。これらの飲料は、干し草ノート、ウッディノート、アーシーノート、アニスシードノート、スパイシーノート及びシトラスノートなどの特徴的な風味を有する。本発明者らは、驚くべきことに、ピキア酵母による発酵を通して、ヘンプ飲料のエタノールは低いままで、煮詰めたハーブ（ｓｔｅｗｅｄ ｈｅｒｂ）のノート、アーシーノート及びスパイシーノートを低減させ、増強された清涼なフルーティーなフレーバーが発生することを見出した。一部の消費者が口に合わないと感じる、ヘンプに特徴的な松様、薬様及び草様の風味は、ピキア酵母を用いた発酵によって、特にピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５を用いた発酵によって、低減された。

【発明を実施するための形態】

【0009】

したがって、本発明は、一部には、３－メチルブチルアセテートと３－メチルブタノールとの合計の、３－メチルブタナールに対する重量比が２０００より大きく、例えば４０００より大きく、例えば８０００より大きく、例えば１００００より大きく、例えば１２０００より大きく、例えば１４０００より大きく、更には例えば１６０００より大きい、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含む（例えば、これらからなる）飲料組成物に関する。アルデヒドの３－メチルブタナールは、モルティで溶媒様のノートに寄与する。飲料組成物は、レディ・トゥ・ドリンク飲料であってもよい。

【0010】

比は、ｐｐｍ単位での重量濃度から次のように計算できる。

【数1】

【0011】

ピキアによる糖の発酵中に、３－メチルブチルアセテートなどの高級エステルが最初に産生されるが、発酵が進むにつれて、３－メチルブタノールなどの高級アルコールが産生される。３－メチルブチルアセテートと３－メチルブタノールとの合計の、３－メチルブタナールに対する比が高いことは、発酵飲料におけるモルティノート、ビールノート、及び溶媒ノートが低減されており、ヘンプノートをマスキングする、心地よいアロマバランスに対応する。

【0012】

本発明の文脈において、ヘンプという用語は、植物カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）の花、種子及び葉を指す。ヘンプは、例えばカンナビス・サティバのケモタイプＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶであってもよい。本発明において、ヘンプという用語は、一般にカンナビス（大麻）と呼ばれるカンナビス・サティバのケモタイプＩを指さないことを理解されたい。ヘンプは、低レベルの精神活性成分Δ^９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を有する。例えば、本発明によるヘンプは、乾燥物ベースで０．２％未満のＴＨＣを含有し得る。ヘンプは、治療効果と関連付けられているが精神活性効果を有さないカンナビジオール（ＣＢＤ）を含む。ヘンプはまた、没食子酸、クロロゲン酸、クマリン酸、ケルセチン及びエラグ酸などのポリフェノールの貴重な供給源である。

【0013】

本発明の飲料組成物は、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物によって提供されるものに加えて、カンナビノイドを含んでもよい。カンナビノイドは、カンナビノイドの異性体及び／又は誘導体であってもよい。カンナビノイド誘導体は、カンナビノイド酸であってもよい。本発明の飲料組成物は、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物によって提供されるものに加えて、カンナビジオールを含んでもよい。

【0014】

本発明の文脈において、「発酵」という用語は、微生物の活性が食品又は飲料に変化（典型的には望ましい変化）をもたらすプロセスを指す。発酵は、酵母及び／又は細菌によるものであり得る。発酵は、嫌気性又は好気性であり得る。発酵は、食品の保存及び強化に最も古くから用いられている手法の１つである。

【0015】

「発酵ヘンプ」という用語は、酵母などの微生物の活性によりヘンプの有機成分に化学的変化、典型的には望ましい変化がもたらされるプロセスに供された、ヘンプを指す。発酵ヘンプは、水性媒質中で、例えば酵母により発酵され得る。発酵ヘンプは、水性発酵培地に添加して発酵させた後、水性発酵培地から分離して乾燥させた、乾燥ヘンプであり得る。発酵ヘンプは、例えば酵母のスターター培養物をヘンプ葉、例えば、新鮮なヘンプ葉に添加する、「固体（ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ）」発酵で発酵されていてもよい。

【0016】

「ヘンプ抽出物」という用語は、ヘンプから抽出された物質、例えばヘンプの水性抽出物を指す。ヘンプ抽出物は、例えば、葉及び茎からオイル除去した後のヘンプの葉及び茎からの水性抽出物であってよい。「発酵ヘンプ抽出物」という用語は、ヘンプ抽出物を発酵させた後のヘンプ抽出物、例えば酵母などによってヘンプ水性抽出物を発酵させた後のヘンプ水性抽出物を指す。発酵ヘンプ抽出物は、乾燥させた発酵ヘンプ抽出物であってもよい。

【0017】

一実施形態では、飲料組成物（例えば飲料）は、２－メチルブチルアセテートと２－メチルブタノールとの合計の、２－メチルブタナールに対する重量比が２０００より大きく、例えば３５００より大きい。アルデヒドの２－メチルブタナールは、モルティで溶媒様のノートに寄与する。比は、ｐｐｍ単位での重量濃度から次のように計算できる。

【数2】

【0018】

ピキアによる糖の発酵中には、２－メチルブチルアセテートなどの高級エステルが最初に産生されるが、発酵が進むにつれて、２－メチルブタノールなどの高級アルコールが産生される。２－メチルブチルアセテートと２－メチルブタノールとの合計の、２－メチルブタナールに対する比が高いことは、発酵飲料におけるモルティノート、ビールノート、及び溶媒ノートが低減されており、これらのアロママーカーでヘンプノートをマスキングする、心地よいアロマバランスに対応する。

【0019】

一実施形態では、飲料組成物（例えば飲料）は、３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する重量比が、５０より大きく、例えば２５０より大きく、例えば３００より大きく、例えば３５０より大きく、更には例えば４００より大きい。この比は、ｐｐｍ単位での重量濃度から次のように計算できる。

【数3】

【0020】

化合物２，３－ブタンジオンはジアセチルとしても知られている。２，３－ブタンジオンは、バター様又は脂肪様のノートを提供する。３－メチルブチルアセテートと、２－メチルブチルアセテートと、酢酸イソブチルと、２－フェニルエチルアセテートと、２－フェニルエタノールとの合計の、２，３－ブタンジオンに対する比が高いことは、発酵においてオフフレーバーとして知覚され得るバター様及び脂肪様のノートを伴わない、増強されたフルーティーノート及びフローラルノートに対応する。

【0021】

一実施形態では、飲料組成物は、乾燥ベースで１０ｇ／ｋｇ未満の酢酸、例えば乾燥ベースで１ｇ／ｋｇ未満の酢酸、更に例えば乾燥ベースで０．５ｇ／ｋｇ未満の酢酸を含む。コンブチャ又はケフィアなどの飲料の風味プロファイルにおける酸による「刺激感（ｂｉｔｅ）」は、より穏やかな風味プロファイルを求める消費者からは必ずしも望まれるわけではない。

【0022】

多くの消費者は、アルコール飲料の代替品として、複雑で清涼な味わいを有する飲料を求めている。一実施形態では、飲料組成物は、１．２重量％未満、例えば０．５重量％未満、例えば０．２重量％未満、更に例えば０．０５重量％未満のエタノール含量を有する。

【0023】

レディ・トゥ・ドリンク飲料は、発酵ヘンプ浸出液又は発酵ヘンプで風味付けされた水であり得る。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、２～３０重量％のヘンプ、例えば４～１５重量％のヘンプを含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、香料又は安定剤などの他の成分を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、炭酸飲料であり得る。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、イチゴ、柑橘系果物（例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、カラマンシー、ベルガモット、クレメンタイン、タンジェリン又はユズ）、モモ、ザクロ、スイカ、ブラックベリー、ラズベリー、柿又はクランベリーなどの果物又は果汁を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ミント、バーベナ又はバジルなどのハーブを更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ハイビスカス又はバラなどの花抽出物を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、トマト、キュウリ、ケール及びセロリなどの野菜ジュース又は野菜抽出物を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、植物浸出液を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、イヌリン、小麦デキストリン、難消化性デンプン及びβ－グルカン（例えば、オートムギ又はオオムギ由来）などの食物繊維を更に含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、添加されたビタミン及びミネラルを含んでもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、複製性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）又は非複製性（ｎｏｎ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）の有益な微生物を含んでもよい。有益な微生物は、例えばプロバイオティクスであってもよい。レディ・トゥ・ドリンク飲料は、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物によって提供されるカンナビジオールに加えて、カンナビジオールを含有し得る。本発明のレディ・トゥ・ドリンク飲料は、合計で１リットル当たり１０～１００ｍｇのカンナビジオール、例えば１リットル当たり２０～６０ｍｇのカンナビジオールを含んでもよい。

【0024】

レディ・トゥ・ドリンク飲料は、濃縮された発酵ヘンプ浸出液などの飲料液濃縮物から調製され得る。飲料液濃縮物は、香料又は安定剤などの他の成分を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、４～６０重量％のヘンプ、例えば８～３０重量％のヘンプを含んでもよい。飲料液濃縮物は、イチゴ、柑橘系果物（例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、カラマンシー、ベルガモット、クレメンタイン、タンジェリン又はユズ）、モモ、ザクロ、スイカ、ブラックベリー、ラズベリー、柿又はクランベリーなどの果物又は果汁を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、ミント、バーベナ又はバジルなどのハーブを更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、ハイビスカス又はバラなどの花抽出物を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、トマト、キュウリ、ケール及びセロリなどの野菜ジュース又は野菜抽出物を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、イヌリン、小麦デキストリン、難消化性デンプン及びβ－グルカン（例えば、オートムギ又はオオムギ由来）などの食物繊維を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、植物浸出液を更に含んでもよい。飲料液濃縮物は、添加されたビタミン類及びミネラル類を含んでもよい。飲料液濃縮物は、複製性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）又は非複製性（ｎｏｎ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）の有益な微生物を含んでもよい。有益な微生物は、例えばプロバイオティクスであってもよい。

【0025】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、
ａ．水にヘンプを浸漬して、ヘンプ水性抽出物及び浸漬されたヘンプを生成する工程と、
ｂ．浸漬されたヘンプの存在下又は非存在下で、ヘンプ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、
発酵はピキア酵母を含む酵母によって行われ、飲料組成物はレディ・トゥ・ドリンク飲料である。

【0026】

酵母は、主にピキア酵母であってもよく、例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超がピキアであってもよい。例えば、酵母コロニー形成単位の５０％超がピキアであってもよく、例えば、酵母コロニー形成単位の６０％、７０％、８０％、９０％超がピキアであってもよい。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキアであってもよく、更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキアであってもよい。

【0027】

本発明の方法によって調製される飲料組成物は、ヘンプ飲料、例えば、発酵ヘンプ又は発酵ヘンプ抽出物を含む飲料であり得る。本発明の方法によって調製される飲料組成物は、１．２重量％未満、例えば０．５重量％未満、例えば０．２重量％未満、更に例えば０．０５重量％未満のエタノール含量であり得る。一実施形態では、本発明の方法によって調製される飲料組成物は、本発明の飲料組成物である。

【0028】

浸漬という用語は、材料を液体に浸して漬けることを指す。ヘンプは、少なくとも２分間、例えば少なくとも３分間、例えば少なくとも４分間、例えば少なくとも５分間、例えば少なくとも１０分間、例えば少なくとも１５分間、例えば少なくとも２０分間、例えば少なくとも３０分間、例えば少なくとも６０分間、更に例えば少なくとも１２０分間、水中に浸漬されてもよい。ヘンプの成分は、浸漬プロセス中に水に抽出される。浸漬は、４℃～９８℃の間、例えば２０℃～９５℃の間、例えば６０℃～９５℃の間の温度で行ってよい。ヘンプは、いくらかの発酵性糖質を含有するが、更なる発酵性糖質、例えばスクロース又はグルコースを、ヘンプ水性抽出物に添加してもよい。発酵性糖質は、フルクトース又はグルコースであり得る。発酵性糖質は、ハチミツの形態であり得る。例えば、発酵性糖質を２～１０重量％、例えば３～７重量％のレベルでヘンプ水性抽出物に添加してもよい。ヘンプは、浸漬前に乾燥及び／又は粉砕されてもよい。

【0029】

浸漬されたヘンプの非存在下で発酵が行われる場合、ヘンプは、例えば、連続向流抽出システムを使用して、水中に浸漬され得る。更なる選択肢は、バッチプロセスを使用して水中にヘンプを浸漬することであり、浸漬されたヘンプは、濾過システムを使用してヘンプ水性抽出物から分離される。浸漬中の乾燥ベースのヘンプ対水の比は、重量で１：１～１：１００、例えば重量で１：２～１：９５、例えば重量で１：１０～１：９０、例えば重量で１：３０～１：７０、更に例えば１．３～１：６であり得る。

【0030】

浸漬後、ヘンプ水性抽出物の温度を、酵母の増殖に適する温度、例えば２０℃～３７℃、例えば２５℃～３５℃、例えば２８℃～３２℃に調整する。温度は、例えば層流熱交換器を使用して、調節することができる。酵母をヘンプ水性抽出物に添加して発酵を開始させる。ヘンプ水性抽出物の発酵は、２５℃～３５℃、例えば２８℃～３２℃の温度で実施してもよい。ヘンプ水性抽出物の発酵は、少なくとも２時間、例えば少なくとも６時間、例えば少なくとも１２時間、例えば少なくとも２４時間、更に例えば少なくとも４８時間実施してもよい。

【0031】

発酵は、３～８、例えば４～６のｐＨで実施してもよい。

【0032】

ヘンプ水性抽出物は、香料又は安定剤などの他の成分の存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、果物又は果汁などの他の成分、例えばイチゴ、柑橘系果物（例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、カラマンシー、ベルガモット、クレメンタイン、タンジェリン又はユズ）、モモ、ザクロ、スイカ、ブラックベリー、ラズベリー、柿又はクランベリーの存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、ハーブなどの他の成分、例えばミント、バーベナ又はバジルの存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、花抽出物などの他の成分、例えばハイビスカス又はバラの存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、野菜ジュース又は野菜抽出物などの他の成分、例えばトマト、キュウリ、ケール又はセロリの存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、植物浸出液などの他の成分の存在下で発酵されてもよい。ヘンプ水性抽出物は、添加されたビタミン類及びミネラル類などの他の成分の存在下で発酵されてもよい。

【0033】

発酵は、酵母エキスや酵母ペプトンなどの窒素源の存在下で実施してもよい。発酵は、例えばヘンプ水性抽出物の０．０５重量％～０．１重量％のレベルで添加した、バリン、ロイシン、イソロイシン及び／又はフェニルアラニンなどのアミノ酸の存在下で実施してもよい。

【0034】

発酵は、嫌気性、微好気性又は好気性の条件で実施してもよい。例えば、発酵槽内の酸素分圧は、０～３０％、例えば１～２０％、更に例えば２～１０％であり得る。

【0035】

好ましくは、ヘンプは、発酵前に加水分解などの化学的処理を受けていない。

【0036】

発酵は、少なくとも１０^３ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^４ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、更に例えば少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇの初期混合酵母レベルで、１種類以上の酵母を添加することによって実施され得る。

【0037】

発酵は、コンブチャ又はケフィアに見られるような、風味プロファイルにおける酸による「刺激感」の発生を回避するために、酢酸菌の非存在下で行われてもよい。一実施形態では、発酵は乳酸菌の非存在下で行われる。

【0038】

一実施形態では、発酵は、サッカロミセス亜種の非存在下で行われる。例えば、発酵は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非存在下で実施され得る。Ｓ．セレビシエは、ワイン製造及びビール醸造に使用される。Ｓ．セレビシエは、望ましくない場合があるアルコールを生成することに加えて、新鮮なフルーティーなノートではなく、「発酵した」、ワインのような、酵母のような風味のノートを生成する。

【0039】

一実施形態では、発酵は、ザイゴサッカロミセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トルラスポラ・デルブルッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｅｕｋｉｉ）、ロードトルーラ・ムチラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ブレッタノマイセス・ブルキセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）及びカンジダ・ステラテ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｅ）からなる群から選択される酵母の非存在下で行われる。これらの酵母は、コンブチャ「茶－真菌」培養物中に一般的に存在する。

【0040】

本発明者らは、ピキア・クルイベリによるヘンプの発酵が、特に良好な結果を与えることを見出した。ピキア・クルイベリで発酵させたヘンプ又はヘンプ抽出物を含む飲料組成物は、スモーキーなヘンプノートが未発酵飲料よりも少ない、心地よいフルーティーフレーバーを有していた。ピキア・クルイベリは、世界中で、例えば、オリーブ、ブドウ及びコーヒーに天然に存在する。一実施形態では、ピキア酵母は、主にピキア・クルイベリであり、例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリであり得る。例えば、酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリであってもよく、例えば、酵母コロニー形成単位の６０％、７０％、８０％、９０％超は、ピキア・クルイベリであってもよい。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリであってもよく、更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリであってもよい。

【0041】

ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６（あるいはＣＢＳ１８８と表記される）は、ピキア・クルイベリの基準株である。基準株は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｑｕａｄｒａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国）から公的に入手可能である。

【0042】

一実施形態では、ピキア酵母は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６であり得る。

【0043】

ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１（あるいはＭａｉｚｅ Ｓｉｌａｇｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ８６と表記される）は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｑｕａｄｒａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、英国）から公的に入手可能である。

【0044】

一実施形態では、ピキア酵母は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２７８１であり得る。

【0045】

ピキア・クルイベリは、自然界に広く分布しており、例えばオリーブ、ブドウ及びコーヒーなどの果実に存在する。ニカラグアのコーヒー発酵場で採取・単離されたピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５は、２０２０年６月２３日に、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｆ－７５７２４ＰＡＲＩＳ Ｃｅｄｅｘ１５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５を得た。

【0046】

一実施形態では、酵母は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）である。例えば、発酵中に存在する酵母コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。例えば、発酵中に存在する微生物コロニー形成単位の５０％超は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。例えば、発酵中に存在する本質的に全ての酵母コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。更なる例として、発酵中に存在する本質的に全ての微生物コロニー形成単位は、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）であり得る。

【0047】

本発明者らは、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５でヘンプを発酵させることによって、特に良好な結果が得られることを見出した。ヘンプをピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５で発酵させると、３－メチルブチルアセテートと３－メチルブタノールとの合計の、３－メチルブタナールに対する重量比が高くなり、これはアロマバランスの向上に対応する。

【0048】

発酵は、少なくとも１０^３ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^４ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^５ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ／ｇ、更に例えば少なくとも１０^７ＣＦＵ／ｇの初期酵母レベルで、ピキア・クルイベリ、例えばピキア・クルイベリ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）を添加することによって実施され得る。

【0049】

ＰａｃＢｉｏシークエンシング技術を使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）の遺伝子配列を解析した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔキットを使用してＤＮＡ精製を行った。１２個のＤＮＡ断片を同定した。これらの断片は個々の染色体、すなわち１１個の染色体及び１個のミトコンドリアＤＮＡ（配列番号４）であり得る。遺伝子配列を、配列番号１～配列番号１２として電子的形式で提出する。

【0050】

本発明の方法の一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号３に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号５に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号８に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号９に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号１１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、又は配列番号１２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列を含む。

【0051】

本発明の方法の一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号３に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号４に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号５に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号８に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号９に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列、配列番号１１に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列、及び配列番号１２に対して少なくとも９８％の同一性（例えば少なくとも９９％の同一性）を有する遺伝子配列を含む。

【0052】

一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の全体的なヌクレオチド同一性（ｇｌｏｂａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する遺伝子配列を含む。「配列番号１～１２の組み合わせ」という用語は、単一の配列に連結されているかのように、全ての個々のＤＮＡ断片に対して配列同一性比較が行われることを意味する。

【0053】

一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号２に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号３に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号５に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号６に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号７に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号８に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号９に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１０に対して少なくとも９９％の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１１に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。一実施形態では、ピキア酵母は、配列番号１２に対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の同一性を有する遺伝子配列を含む。

【0054】

酵母を指す名称は、時が経つにつれて変更され得る。本発明の方法による酵母は、酵母に適用される名称にかかわらず、本発明のピキア酵母について先行段落に記載された遺伝子配列同一性を含み得ることが理解されるべきである。

【0055】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）水にヘンプを浸漬して、ヘンプ水性抽出物及び浸漬されたヘンプを生成する工程と、
ｂ）浸漬されたヘンプの存在下又は非存在下で、ヘンプ水性抽出物を発酵させる工程と、を含み、発酵は、配列番号１～１２の組み合わせに対して少なくとも９８％（例えば、少なくとも９９％）の全体的なヌクレオチド同一性を有する遺伝子配列を含む酵母によって実施される。

【0056】

一実施形態では、ヘンプ水性抽出物は、発酵後に、浸漬されたヘンプから分離される。例えば、浸漬されたヘンプは、濾過システムを使用してヘンプ水性抽出物から分離され得る。発酵後、ヘンプ水性抽出物は発酵ヘンプ抽出物となる。

【0057】

発酵ヘンプ抽出物は、レディ・トゥ・ドリンク飲料としてパッケージングしてもよく、例えばボトル又は缶にパッケージングしてもよい。発酵ヘンプ抽出物は、２～６０重量％の総溶解固形分の濃度、例えば、２～２５重量％の総溶解固形分の濃度を有し得る。発酵ヘンプ抽出物に香味料及び保存料などの追加の原材料を添加した後、レディ・トゥ・ドリンク飲料としてパッケージングしてもよい。発酵ヘンプ抽出物は、パッケージング前に、酵母及び任意の腐敗性生物を不活性化又は死滅させるために熱処理してもよい。発酵ヘンプ抽出物は、パッケージング前に、フィルターを通過させて酵母及び腐敗性生物を除去されてもよい。

【0058】

発酵ヘンプ抽出物は、果実又は果汁、ハーブの抽出物、花抽出物、野菜ジュース又は野菜抽出物、植物浸出液、ビタミン類及びミネラル類、並びに有益な微生物などの他の原材料と組み合わせてもよい。カンナビジオールを、発酵ヘンプ抽出物に添加してもよく、例えば、カンナビジオールを、乳化剤を用いて発酵ヘンプ抽出物の水溶液中に乳化してもよい。

【0059】

一実施形態において、ヘンプ水性抽出物は、例えば異なる場所でのレディ・トゥ・ドリンク製品の製造のための中間製品として、発酵の後、濃縮されてもよい。発酵ヘンプ抽出物は、２５～６０重量％の総溶解固形分の濃度、更に例えば、５０～６０重量％の総溶解固形分の濃度を有し得る。溶解固形分は、例えば、抽出物を微細フィルターに通して非溶解固形分を除去し、濾液を秤量して総重量を確定し、濾液を蒸発させ、次いで残留物を秤量して溶解固形分の重量を得ることによって測定することもできる。香味料及び保存料などの追加の原材料を液体濃縮物に添加してもよい。

【0060】

発酵後のヘンプ水性抽出物（例えば、発酵ヘンプ抽出物）は、可溶性飲料粉末などの粉末を生成するために濃縮されてもよい。例えば、発酵後のヘンプ水性抽出物（発酵ヘンプ抽出物）を噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥させて、可溶性飲料粉末を生成してもよい。例えば、発酵後のヘンプ水性抽出物をマルトデキストリンなどの担体と一緒に噴霧乾燥させて可溶性飲料粉末を生成してもよい。

【0061】

発酵後のヘンプ水性抽出物は、果実又は果汁、ハーブの抽出物、花抽出物、野菜ジュース又は野菜抽出物、植物浸出液、ビタミン類及びミネラル類、並びに有益な微生物などの他の原材料と一緒に噴霧乾燥させてもよい。

【0062】

可溶性飲料粉末は、例えば異なる場所でのレディ・トゥ・ドリンク製品の製造のための中間製品として使用してもよい。可溶性飲料粉末は、他の原材料、例えば、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの乾燥原材料と組み合わせてもよい。可溶性飲料粉末は、果実粉末、ハーブ、野菜粉末、ビタミン類、ミネラル類、及び有益な微生物などの他の原材料と組み合わせてもよい。

【0063】

本発明の一態様は、レディ・トゥ・ドリンク飲料を製造するための、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）で発酵させたヘンプの使用を提供する。

【0064】

本発明による発酵ヘンプは、例えば、ピキア酵母のスターター培養物をヘンプ葉、例えば、乾燥されていない新鮮なヘンプ葉に添加する、「固体」発酵において得ることができる。「固体」発酵という用語は、固体材料において行われる発酵を指す。固体発酵には、液体の水が存在するが、この用語は、発酵容器中の水溶液中で生じ得るような液体発酵とは対照的に使用される。

【0065】

本発明の一態様は、飲料組成物を調製する方法を提供し、該方法は、
酵母のスターター培養物をヘンプ葉に添加する工程であって、スターター培養物が、ヘンプ葉１グラム当たり少なくとも１０^４ＣＦＵ（例えば、少なくとも１０^５ＣＦＵ、更に例えば少なくとも１０^６ＣＦＵ）の酵母を供給する、工程と、
ヘンプ葉を発酵させる工程と、
発酵させたヘンプ葉を乾燥させて、発酵ヘンプを生成する工程と、
発酵ヘンプを水で抽出してレディ・トゥ・ドリンク飲料を生成する工程と、
を含む。

【0066】

酵母のスターター培養物は、液体又は粉末としてヘンプ葉に添加されてもよい。ヘンプ葉は、酵母のスターター培養物が添加されるとき、４５～５５重量％の水分含量を有し得る。酵母を添加する前に環境微生物の量を低減させるために、発酵前に葉を蒸気で処理してもよい。発酵は、４０重量％を超える、例えば４５重量％を超える、更に例えば５０重量％を超える固形分含量で生じ得る。

【0067】

発酵をある程度継続させている間に、発酵ヘンプの乾燥を開始してもよい。例えば、ヘンプ葉をタンクなどの容器に入れ、スターター培養物を添加し、次いで発酵を１～４日間進行させた後、発酵ヘンプを容器から取り出し、乾燥させてもよい。更なる例として、スターター培養物をヘンプ葉に添加した後、ヘンプ葉を、例えば、ラック又は吊り下げトレイにおいて徐々に乾燥させてもよい。発酵が始まったら、発酵を継続させながらヘンプ葉を徐々に乾燥させてもよい。例えば、発酵させたヘンプ葉は、１～３０日間、例えば４～２０日間の期間にわたって、２０重量％未満（例えば１５重量％未満）の水分含量まで乾燥させてもよい。乾燥温度は、約４０℃未満、例えば約２５℃～３５℃であり得る。ファンを使用して、ヘンプ葉が乾燥するまで材料に乾燥空気を吹き付けてもよい。発酵ヘンプ葉は、日光で乾燥させてもよい。

【0068】

酵母は、ピキア、例えばピキア・クルイベリ、更には例えばピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５であってもよい。

【0069】

レディ・トゥ・ドリンク飲料は、ボトル又は缶に充填してもよい。発酵ヘンプは、水で抽出してレディ・トゥ・ドリンク飲料を生成する前に、茶、ハーブティー、ドライフルーツ、可溶性コーヒー又は焙煎粉砕コーヒーなどの他の抽出可能な材料と組み合わせてもよい。

【0070】

当業者は、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の製品について記載された特徴を本発明の方法と組み合わせてもよく、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。既知の均等物が特定の特徴について存在する場合、このような均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのごとく組み込まれる。

【0071】

本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び非限定的な実施例から明らかである。

【実施例】

【0072】

実施例１：ヘンプの発酵方法
有機ヘンプ葉（Ｃｏｏｐ Ｎａｔｕｒａｐｌａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を出発原料として使用して、浸出液を調製した。まず、１００℃の水１０００ｍＬ中に２０ｇの乾燥出発原料を添加し、１０分間浸漬することによって、高温浸出液を作製した。その後、温度が３０℃未満に低下するまで、浸出液を氷浴中に置いた。次いで、浸出液を篩に通して濾過して、更に小片及び／又は葉を除去した。濾液（ヘンプ水性抽出物）を、対照（Ｒｅｆ）として、又は様々な発酵試料に対して、等量分配した。

【0073】

発酵ヘンプは、グルコース（２％ｍ／ｍ）と、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６（ピキア・クルイベリの基準株）、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２７８１、市販の醸造酵母サッカロミセス・セレビシエ（ＳａｆＡｌｅ Ｓ－３３、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、並びにコンブチャ茶発酵由来の細菌及び酵母の共生培養（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｙｅａｓｔｓ、ＳＣＯＢＹ）ペリクルを含む様々なスターター培養物と、を用いて浸出液を発酵させることによって作製した。全ての株（ＳＣＯＢＹを除く）は、グリセロールバイアルから、食用イースト－ペプトン液体培地で増殖させ、光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）０．５で参照ヘンプ醸造液に接種した。接種した浸出液は全て、微好気条件下、３０℃で２４時間保存した。インキュベーション後、各発酵浸出液を濾過滅菌（０．２μｍ）した。

【0074】

実施例２：様々な酵母で発酵させたヘンプの官能分析
様々なバリエーションのヘンプ浸出液の官能プロファイルをテーストされた。対照はヘンプの味で、スモーキーノート、ハーベイシャスノート、ウッディノート、及びアーシーノートを有していた。サッカロミセス・セレビシエで発酵させたヘンプ浸出液は、オフノートと共に強いモルティ及び酸味の特徴を有していた。ＳＣＯＢＹで発酵させたヘンプは、非常に強い酸味を有していた。２種類の異なるピキア酵母で発酵させたヘンプ浸出液はフルーティーであり、対照と比較してヘンプ／スモーキーノートが大幅に低減していた。ピキア酵母で発酵させたヘンプでは、バター様、酸味、及び脂肪様のオフノートは識別されなかった。ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５で発酵させたヘンプは、ピキア・クルイベリＮＣＹＣ２４６で発酵させたヘンプよりバランスのとれたアロマプロファイルを有すると考えることができた。

【0075】

実施例３：様々な酵母で発酵させたヘンプ中に存在する芳香化合物に着目した風味プロファイルの分析
ガスクロマトグラム及び質量分析と組み合わせたヘッドスペース／固相微量抽出（ＨＳ／ＳＰＭＥ－ＧＣ－ＭＳ）によって、ヘンプ浸出液の揮発性物質の定量的プロファイリングを行った。装置は、質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７０１０Ｂ ＴＱ）と連結したガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８８９０ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。

【0076】

最初に１．０ｍＬのヘンプ浸出液試料を、１０ｍＬスクリュートップヘッドスペースバイアル中で３０℃で１０分間インキュベートし、その後、ＳＰＭＥ繊維（ＰＤＭＳ／ＤＶＢ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して３０℃で１０分間抽出した。分析前に、全てのバイアルは６℃に冷却したトレイに入れた。揮発性物質を、２５０℃、スプリットレスモードでＳＰＭＥ繊維から熱的に脱着させ、キャピラリーカラム（ＤＢ－ＷＡＸ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離した。ガスクロマトグラフオーブン温度は、最初に３５℃で５分間、次いで４℃／分で２３０℃に上昇、次いで２３０℃で１０分間となるようにプログラムした。ヘリウムをキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で使用した。標的化合物を純粋な標準物質によって同定し、ＭＳＤ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）で定量した。全ての試料を２回測定した。

【0077】

２４時間後の３－メチルブチルアセテート、３－メチルブタノール、３－メチルブタナール、２－メチルブチルアセテート、２－メチルブタノール、２－メチルブタナール、酢酸イソブチル、２－フェニルエチルアセテート、２－フェニルエタノール、２，３－ブタンジオン、エタノール及び酢酸のレベルをｐｐｍ単位で次の表に示す。

【表1】

【0078】

ＳＣＯＢＹで発酵させた試料は、乾燥ベースで１９０ｇ／ｋｇに相当する高レベルの酢酸を有していた。

【0079】

アロマ成分の重量比Ａ、重量比Ｂ、及び重量比Ｃを以下の表に示す。

【数4】

【表2】

【0080】

ピキア酵母（ＮＹＳＣ５４８５、ＮＣＹＣ２７８１及びＮＣＹＣ２４６）で発酵させた試料は、対照及びＳ．セレビシエ又はＳＣＯＢＹで発酵させた試料よりも高い比Ａ、比Ｂ及び比Ｃを示す。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５は、比Ａ、比Ｂ及び比Ｃについて、基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６よりも高い値をもたらし、比Ａ及び比ＢについてＰ．クルイベリＮＣＹＣ２７８１よりも高い値をもたらす。

【0081】

試料中に存在するテルペン及びテルペノイドのレベルを測定した。以下の標的化合物を、ＮＩＳＴライブラリー及び保持指標により同定した。各化合物のピーク面積を試料全体にわたって積分し、発酵試料対非発酵試料の比を以下に示した。これらの化合物の全てが報告されており、ヘンプ抽出物又はヘンプ油中に検出されている［Ｖ．Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８，３２０３－３２１５（２０２０）．ＤＯＩ １０．１０３９／Ｄ０ＯＢ００４６４Ｂ］［Ａ．Ｓ．Ｗａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｏｉｌｓ ｏｆ Ｆｒｅｓｈ ａｎｄ Ａｉｒ－Ｄｒｉｅｄ Ｂｕｄｓ ｏｆ Ｃａｎｎａｂｉｓ ｃｈｅｍｏｖａｒｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｎｄ Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｙ １９，２０２０．ＤＯＩ １０．１１７７／１９３４５７８Ｘ２０９２６７２９］。

【0082】

全ての試料を２回測定した。

【表3】

【0083】

テルペン及びテルペノイドは、「ヘンプ感（ｈｅｍｐｉｎｅｓｓ）」特性の主要な寄与因子であり、ヘンプ感は、松様、薬様及び草様のフレーバーノートの組み合わせとして知覚される。ピキア・クルイベリ酵母による発酵後、ヘンプ感は有意に低減した。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５は、ヘンプ感特性に関連するこれらの化合物を、基準株Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ２４６よりも大きく低減させることが見出された。

【0084】

実施例４：アロマ比による官能への影響のスパイクによる調査
３－メチルブチルアセテート、３－メチルブタノール及び３－メチルブタナールを異なるレベルで添加して、溶液を調製した。一組の溶液では、化合物を水に添加し、他方の組では、化合物を未発酵ヘンプ抽出物対照（Ｒｅｆ）に添加した。

【0085】

試料を、６名の専門味覚パネルが試食し、コメントを集めた。試料及びコメントを以下に示す。

【表4】

【表5】

【0086】

エステル／アルコールとアルデヒドとの間に適切なバランスをもたせることが重要である。ヘンプ浸出液において、エステルが高レベルであり、アルデヒドが低レベルであると、例えば、比Ａが２０００を超えると、「ヘンプ様」ノートをマスクすることができることが観察された。

【0087】

実施例５：Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５の遺伝子配列と基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列との比較
ＰａｃＢｉｏシークエンシング技術を使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）及びＰ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列を解析した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔキットを使用してＤＮＡ精製を行った。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５について１２のＤＮＡ断片が同定され、基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６については１５のＤＮＡ断片が同定された。Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５の遺伝子配列を、配列番号１～配列番号１２として電子的形式で提出し、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の遺伝子配列については、配列番号１３～配列番号２７として提出した。ミトコンドリアＤＮＡは、Ｐ．クルイベリＮＹＳＣ５４８５については配列番号４であり、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６については配列番号２０である。

【0088】

ソフトウェアＯｒｔｈｏＡＮＩｕを使用して、ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５（ＣＮＣＭ Ｉ－５５２５）の遺伝子配列を、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６と比較した。全体的な平均ヌクレオチド同一性は、９７．９１％であることがわかった。

【0089】

様々な配列間の対応関係を以下の表に示す。ピキア・クルイベリＮＹＳＣ５４８５の複数の配列は、Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６の配列の組み合わせとの対応が最も近く、その逆もまた同様である。

【表6】

【0090】

基準株Ｐ．クルイベリＮＣＹＣ２４６は、配列番号１～１２のそれぞれに対して、以下に示す最大の同一性で遺伝子配列を含んでいた：
配列番号１、９７．８５％；配列番号２、９７．４０％；配列番号３、９７．８６％；配列番号４、９９．０２％；配列番号５、９８．０５％；配列番号６、９７．９３％；配列番号７、９８．１２％；配列番号８、９７．０７％；配列番号９、９７．２０％；配列番号１０、９８．３３％；配列番号１１、９７．５２６％；配列番号１２、９７．７７％。

【配列表】

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【国際調査報告】