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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-29
(54)【発明の名称】Ｌ－システイン酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 13/04 20060101AFI20241122BHJP
C12P 13/12 20060101ALI20241122BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20241122BHJP
【ＦＩ】
C12P13/04
C12P13/12 B
C12N1/20 A
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024531637
(86)(22)【出願日】2021-11-29
(85)【翻訳文提出日】2024-07-19
(86)【国際出願番号】 EP2021083372
(87)【国際公開番号】W WO2023094011
(87)【国際公開日】2023-06-01
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】390008969
【氏名又は名称】ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】プファラー，ルーペルト
(72)【発明者】
【氏名】シュレッサー，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ウィッヒ，ギュンター
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE03
4B064AE14
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC07
4B064CD13
4B064DA11
4B064DA20
4B065AA26X
4B065BB02
4B065BB12
4B065BC02
4B065CA17
4B065CA43
4B065CA50
(57)【要約】
本発明は、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）を亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素と反応させる、Ｌ－システイン酸の製造方法に関する。Ｌ－システイン酸を調製するための経済的な本方法は、環境に優しく持続可能であり、技術的に実施が容易である。本方法の別の利点は、ますます需要が高まっている天然のＬ－システイン酸をこのように調製できることである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－システイン酸の製造方法であって、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換される、方法。
【請求項2】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが細菌酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来のＣｙｓＭである、請求項１及び２の一方又は両方に記載の方法。
【請求項4】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが発酵生産に由来する、請求項１～３のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項5】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～４のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項6】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～５のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項7】
ＯＡＳが発酵生産に由来する、請求項１～６のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項8】
ＯＡＳが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～７のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項9】
ＯＡＳが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～８のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項10】
方法が天然産生方法である、請求項１～９のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項11】
使用される亜硫酸の塩がＮａ２ＳＯ３、Ｋ２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ３、なもしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）又はＫＨＳＯ３である、請求項１～１０のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項12】
亜硫酸塩の濃度が、ＯＡＳに対して少なくとも等モル濃度である、請求項１～１１のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項13】
反応が、少なくとも５．５及び７．５未満のｐＨで行われる、請求項１～１２のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項14】
使用されるＯＡＳのモル量に基づくＬ－システイン酸のモル収率が、少なくとも６０％である、請求項１～１３のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項15】
Ｌ－システイン酸が反応バッチから濃縮される、請求項１～１４のうちの一項以上に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｌ－システイン酸の製造方法に関し、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換される、Ｌ－システイン酸は、この生体内変換の結果としてもたらされる。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－システイン酸は、例えば、魚の養殖（Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）８７：３５３－３６３）又は化粧品分野（ＵＳ４０５３６３０）において、例えばスキンケアのためのＲｅｇｕ（Ｒ）－Ｓｌｉｍ（ＤＳＭ）の成分として使用することができる。ペプチド化学では、水溶性保護基としてＬ－システイン酸が使用される。さらに、Ｌ－システイン酸は、脱炭酸によってタウリンに変換することができる。
【0003】
Ｌ－システイン酸（（Ｒ）－２－アミノ－３－スルホプロパン酸、３－スルホ－Ｌ－アラニン、ＣＡＳ ４９８－４０－８）は、化学的に、例えば、アルコール溶液中で塩素によるシステインの酸化によって（Ｔａｏ他、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（２００４）、２７：１４９－１５１）、ＤＭＳＯ中のＨＣｌ若しくはヨウ素ＨＣｌ中で臭素によって、又は過ギ酸によるシスチンの酸化的開裂によって、生成することができる。さらに、Ｌ－システイン酸は、Ｌ－システインスルフィン酸の酸化によっても生成することができる。Ｌ－システイン酸の化学的製造のための既知の方法は、持続可能とはみなされず環境に有害な化学物質を使用し、特に食品、化粧品及び医薬品分野における用途において消費者にあまり受け入れられていない。したがって、より環境に優しく、より持続可能な製造方法が必要であり、その１つの選択肢はバイオテクノロジー法である。
【0004】
Ｌ－システイン酸は、タンパク質性アミノ酸Ｌ－システインの酸化生成物として自然界で、例えばヒツジの羊毛中に検出することができる非タンパク質原性Ｌ－アミノ酸である。システイン酸は、メタン生成古細菌による補酵素Ｍ（ＣｏＭ、２－メルカプトエタンスルホン酸、ＣＡＳ ３３７５－５０－６）生合成の中間体でもある。
【0005】
先行技術は、例えば、システイン代謝が調節解除された微生物の直接発酵によって（ＥＰ１１９１１０６Ｂ１）、又はＯＡＳのＯＡＳスルフヒドリラーゼ触媒生体内変換によって（ＥＰ１２４７８６９Ｂ１）、非タンパク質原性アミノ酸を製造する方法を提供する。これらの方法は、一般式（１）により、ＯＡＳスルフヒドリラーゼがＯＡＳと求核試薬との反応を触媒して、非タンパク質原性アミノ酸を形成することに基づく。
【0006】
（１）ＯＡＳ＋求核試薬－＞非タンパク質原性アミノ酸＋アセテート
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のシステイン代謝において、ＯＡＳはＬ－システインの生合成前駆体として働く。後者は、ベータ位の酢酸基をチオール基で置換することによって形成される。ベータ置換と呼ばれるこの反応は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼのクラスの酵素によって触媒される（ＥＣ４．２．９９．８）。したがって、ＯＡＳはＯＡＳスルフヒドリラーゼ反応の実際の基質（反応物とも呼ばれる）であり、求核剤は可変補助基質である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のシステイン代謝において、ＯＡＳはＬ－システインの生合成前駆体として働く。後者は、ベータ位の酢酸基をチオール基で置換することによって形成される。ベータ置換と呼ばれるこの反応は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼのクラスの酵素によって触媒される（ＥＣ４．２．９９．８）。したがって、ＯＡＳはＯＡＳスルフヒドリラーゼ反応の実際の基質（反応物とも呼ばれる）であり、求核剤は可変補助基質である。
【0007】
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１では、セレニド、セレノール、アジド、シアニド、アゾール及びイソオキサゾリノンを含む多数の異なる求核剤が、ＯＡＳとのＯＡＳスルフヒドリラーゼ触媒（例えば、ＣｙｓＭ触媒）反応の求核剤としての適性について試験された。さらに、一般式Ｈ－Ｓ－Ｒのチオスルフェート及びチオールの群からの硫黄化合物が試験され、式中、基Ｒは一価の置換又は非置換アルキル、アルコキシ、アリール又はヘテロアリール基である。
【0008】
製造されたのは、Ｓ－フェニル－Ｌ－システイン等の非タンパク質原性アミノ酸であり、これらはタンパク質生合成のための構成要素として自然界では使用されていない。開示された求核剤はいずれも、Ｌ－システイン酸の製造を可能にしない。
【0009】
Ｊｏｏ他（２０１８）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３には、細菌コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるタウリン製造のための代謝工学的アプローチが記載されている。タウリンの製造に到達するために、Ｌ－システインシンターゼ、システインジオキシゲナーゼ及びＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの遺伝子をこの株において異種発現させた。Ｊｏｏ他（２０１８）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３の図２には、タウリンへの様々な代謝経路が記載されており、これらは、Ｏ－ホスホ－Ｌ－セリンから始まり、Ｌ－システイン酸を介してタウリンをもたらす経路（「Ｌ－システインスルホン酸経路」）も含み、原則としてＬ－システイン酸の製造にも適している。しかしながら、図はまた、ＯＡＳからＬ－システイン酸、Ｌ－システインのみに至る既知の生合成経路がないことを示す。
【0010】
Ｔｅｖａｔｉａ他、Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６は、微小藻類におけるタウリンの天然産生を記載しており、Ｌ－システイン酸も中間体として検出されている。Ｔｅｖａｔｉａ他、Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６の図１ａ）に記載されているように、生合成経路はＬ－セリンからＬ－システイン酸（図１ａの「システート」）に至る。記載された生合成経路のいずれも、ＯＡＳを介してＬ－システイン酸をもたらさない。微細藻類中に検出されたＬ－システイン酸の細胞内含量は非常に低く、メチオニン、システイン、システインスルフィン酸、ヒポタウリン及びタウリン等の後処理をより困難にする複数の副生成物を伴っていたため、微細藻類の増殖はＬ－システイン酸の製造に適していない。
【0011】
代謝工学的アプローチでは、ＵＳ２０１９／００６２７５７Ａ１（ＫｎｉｐＢｉｏ）は、タウリン製造のための異種産生株を記載しており、この株はＬ－システイン酸の製造にも適していることが意図されている。ＵＳ２０１９／００６２７５７Ａ１の図４～図９及び図１２には、中間体としてＬ－システイン酸を含有するタウリンへの様々な生合成経路が記載されており、したがって原則としてＬ－システイン酸の製造に適している。これらの生合成経路のいずれもＯＡＳから開始しない。さらに、ヒポタウリン及びタウリンの収量のみが報告され、それらは非常に低く、最大４１９ｎｇ／ｍｌであった。Ｌ－システイン酸の製造のための収率には言及されていない。Ｌ－システイン酸については、より高い収率を達成することができないと仮定しなければならない。したがって、この代謝工学的アプローチは、Ｌ－システイン酸の生物工学的製造には適していない。
【0012】
したがって、先行技術は、化学的方法のみを開示しており、工業的使用に適したＬ－システイン酸を製造するための経済的に実行可能なバイオテクノロジー法を開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】米国特許第４０５３６３０号明細書
【特許文献2】欧州特許第１１９１１０６号明細書
【特許文献3】欧州特許第１２４７８６９号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０１９／００６２７５７号明細書
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）８７：３５３－３６３
【非特許文献2】Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（２００４）２７：１４９－１５１
【非特許文献3】Ｊｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３
【非特許文献4】Ｔｅｖａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６
【発明の概要】
【0015】
本発明の目的は、生体内変換によってＬ－システイン酸を製造するためのバイオテクノロジー法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
この目的は、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換される、Ｌ－システイン酸の製造方法によって達成される。この方法は、生体内変換によって製造されるＬ－システイン酸を提供する。
【0017】
本発明による方法の利点は、Ｌ－システイン酸を製造するための持続可能で技術的に実現可能な生体内変換方法であることである。環境に有害な化学物質を省くことができる。化石原料は消費されず、有毒な化学廃棄物及び／又は廃棄ガスは生成されない。したがって、本発明の製造方法は、環境に優しく持続可能である。さらに、この方法は、極端な反応条件又は特別な装置のいずれも必要としないため技術的に実施するのが容易である。この方法の別の利点は、ますます需要が高まっている天然のＬ－システイン酸をこのようにして製造できることである。
【0018】
驚くべきことに、亜硫酸塩（以下、サルファイト又はＳＯ３
２－と呼ぶ）が反応（１）における求核剤として適しており、式（２）によるこれまで知られていない反応においてＬ－システイン酸の合成を可能にすることが見出された。
【0019】
（２）ＯＡＳ＋ＳＯ３
２－－＞Ｌ－システイン酸＋アセテート
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の文脈において、製造方法は以下のように区別される。
【0021】
１．化学的方法
２．生物工学的方法：
ａ）代謝工学による
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、生物の代謝経路が遺伝子及び調節過程の最適化又は改変によって改変されるバイオテクノロジー法である。新規又は改変された酵素は、ゲノムに酵素の遺伝子を補充することによって生物に導入することができ、又は内因性酵素の遺伝子を増強又は弱毒化されたレベルで発現させることができ、それによって生物における新たな代謝経路を確立するか、又は既存の代謝経路を増強若しくは弱毒化する。代謝工学の目標は、生物が新たな代謝産物又は細胞内在性代謝産物のいずれかを高い収率で産生することである。代謝工学方法は、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝産物に特異的な出発物質を使用しない。代わりに、問題の生物の成長に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩又はペプトン若しくは酵母抽出物等の複合アミノ酸混合物）及び成長に必要な他の塩から構成される、成長培地とも呼ばれる栄養培地のみを使用する。そのような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
２．生物工学的方法：
ａ）代謝工学による
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、生物の代謝経路が遺伝子及び調節過程の最適化又は改変によって改変されるバイオテクノロジー法である。新規又は改変された酵素は、ゲノムに酵素の遺伝子を補充することによって生物に導入することができ、又は内因性酵素の遺伝子を増強又は弱毒化されたレベルで発現させることができ、それによって生物における新たな代謝経路を確立するか、又は既存の代謝経路を増強若しくは弱毒化する。代謝工学の目標は、生物が新たな代謝産物又は細胞内在性代謝産物のいずれかを高い収率で産生することである。代謝工学方法は、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝産物に特異的な出発物質を使用しない。代わりに、問題の生物の成長に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩又はペプトン若しくは酵母抽出物等の複合アミノ酸混合物）及び成長に必要な他の塩から構成される、成長培地とも呼ばれる栄養培地のみを使用する。そのような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
【0022】
ｂ）生体内変換による
生体内変換は、酵素触媒下における１つ以上の反応物の生成物への変換として規定され、酵素基質は酵素と共に反応バッチに添加される。反応バッチにおいて、添加された酵素基質、例えば本発明のＯＡＳは、式（２）に従って酵素的に（本発明では、亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって）変換される。反応物は、化学的又は生物工学的製造に由来し得る。本発明による方法で使用されるＯＡＳは、例えば、化学合成又は生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産から得ることができる。酵素触媒に使用される酵素は、生産株の増殖、例えば発酵によるバイオテクノロジー生産に由来するか、又は酵素を含む生物学的材料が使用される（例えば、植物、真菌、藻類、動物の器官）。生産株の増殖からのバイオマス、若しくは生物学的材料を直接使用することができるか、又は生体内変換の要件に応じて酵素をそこから単離する。本発明による方法で使用されるＣｙｓＭ酵素は、生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産に由来する。
生体内変換は、酵素触媒下における１つ以上の反応物の生成物への変換として規定され、酵素基質は酵素と共に反応バッチに添加される。反応バッチにおいて、添加された酵素基質、例えば本発明のＯＡＳは、式（２）に従って酵素的に（本発明では、亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって）変換される。反応物は、化学的又は生物工学的製造に由来し得る。本発明による方法で使用されるＯＡＳは、例えば、化学合成又は生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産から得ることができる。酵素触媒に使用される酵素は、生産株の増殖、例えば発酵によるバイオテクノロジー生産に由来するか、又は酵素を含む生物学的材料が使用される（例えば、植物、真菌、藻類、動物の器官）。生産株の増殖からのバイオマス、若しくは生物学的材料を直接使用することができるか、又は生体内変換の要件に応じて酵素をそこから単離する。本発明による方法で使用されるＣｙｓＭ酵素は、生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産に由来する。
【0023】
天然産生方法は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）又はＧＭＯを使用した生産からの製品（反応物、酵素）を使用しない、バイオテクノロジー生産方法して規定される。本発明において、Ｌ－システイン酸の製造方法は、有機反応物としてのＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼがＧＭＯを用いて製造されておらず、化学的に製造されていない場合の天然産生方法である。式（２）における補助基質としてのサルファイトは無機化合物であり、基本的には式（４）～（８）に従ってＳＯ２を水に溶解した生成物であり、これは（不可逆的な）化学合成には対応しないが、ガスＳＯ２の可逆的水和及び水和物Ｈ２ＳＯ３のｐＨ依存性解離に対応する。
【0024】
Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｋｇｅｓｅｔｚ（ＧｅｎＴＧ、ドイツ遺伝子工学法）の§３の第３文４の意味における自己クローニングは、Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｕｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ（ＺＫＢＳ、ドイツ生物学的安全性中央委員会）によって発行された声明（参考文献：１９９１年の６７９０－１０－０２）によれば、そのウイルス及びプラスミドを含む遺伝的に同一又は異なる形態のただ１つの種のみが、ドナー生物及びレシピエント生物として使用される方法である。
【0025】
本発明の文脈において、反応バッチは、反応物（出発物質）、酵素及び任意選択的に他の反応物の混合物として規定され、反応物は生成物に変換される。
【0026】
本発明の意味における反応の収率は、反応条件下で生成物に変換される使用される反応物の量として規定される。収率は、絶対量として（ｇ又はｍｍｏｌ）、単位体積当たりの生成物の絶対量としての体積収率（濃度）として（ｍＭ又はｇ／Ｌ）、又は収率パーセントとも呼ばれる、使用される反応物のパーセンテージ（反応物及び生成物の分子量を考慮に入れる）としての生成物の相対収率として表すことができる。
【0027】
発酵は、工業規模での細胞培養物の産生（培養）のための方法工程であり、好ましくは微生物産生株を培養培地、温度、ｐＨ、酸素供給及び培地の混合の規定条件下で増殖させる。生産株の構成（遺伝的構成）に応じて、発酵の目的は、タンパク質／酵素又は代謝産物を、いずれの場合もさらなる使用のために可能な限り高い収率で生産することである。本発明によるプロセスの成分、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼは、発酵によって生成することができる。発酵の最終生成物は、生産株の細胞のバイオマス（発酵槽細胞）と、バイオマスから除去され、発酵中に増殖培地及び発酵槽細胞によって分泌された代謝産物から形成された発酵培地（発酵上清）とからなる発酵槽ブロスである。発酵の目標生成物は、発酵槽細胞又は発酵培地中に存在することができる。例えば、ＯＡＳは発酵培地に見出され、酵素ＯＡＳスルフヒドリラーゼは発酵槽細胞に見出される。
【0028】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｃｄｓ又はコード配列と同義）は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの領域を指す。ＯＲＦは、コード領域又は構造遺伝子とも呼ばれる。
【0029】
遺伝子は、生物学的に活性なＲＮＡを産生するための全ての基本情報を含むＤＮＡの部分を指す。遺伝子は、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが生成されるＤＮＡの部分と、このコピー過程の調節に関与する発現シグナルとを含む。発現シグナルは、例えば、少なくとも１つのプロモータ、転写開始、翻訳開始及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。ターミネータ及び１つ以上のオペレータは、追加の可能な発現シグナルである。
【0030】
遺伝子構築物は、遺伝子が他の遺伝要素（例えば、プロモータ、ターミネータ、選択マーカ、複製起点）に連結されているＤＮＡ分子を指す。本発明の文脈における遺伝子構築物は、環状ＤＮＡ分子であり、プラスミド、ベクター又は発現ベクターと呼ばれる。遺伝子構築物の遺伝要素は、細胞成長中にその染色体外遺伝を引き起こし、遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を引き起こす。
【0031】
本発明による亜硫酸塩によるＯＡＳの生体内変換からのＬ－システイン酸は、さらなる後処理工程なしでさらに直接使用するか、又は既知の方法によって濃縮若しくは精製することができる。ここでの濃縮度は、さらなる使用に依存する。そのような方法は、アミノ酸を単離するための方法から当業者に公知である。例としては、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、結晶化が挙げられる。
【0032】
好ましい実施形態において、本方法は、Ｌ－システイン酸が反応バッチから濃縮される。例えば遠心分離による粒子状バイオマスの除去が特に好ましい。
【0033】
さらに好ましい実施形態では、本方法は、本発明による方法で製造されたＬ－システイン酸がさらに直接使用されること、すなわち、Ｌ－システイン酸を含有する反応バッチが、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿及び結晶化を含むさらなる後処理、精製又は単離工程なしにさらに使用される。
【0034】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼは、これまでに多種多様な植物及び微生物から単離されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には、例えば、ＣｙｓＫ及びＣｙｓＭと呼ばれる２つのＯＡＳスルフヒドリラーゼ酵素が存在する。関連する遺伝子も同様に公知であり、それぞれｃｙｓＫ及びｃｙｓＭと呼ばれる。
【0035】
本発明の意味の範囲内のＯＡＳスルフヒドリラーゼは、式（３）によるＯＡＳからのタンパク質原性アミノ酸Ｌ－システインの合成を触媒することができ、この場合に使用される求核剤がスルフィドである。したがって、ＣｙｓＭ関連酵素及びＣｙｓＫ関連酵素の両方が、本発明の意味の範囲内でＯＡＳスルフヒドリラーゼである。
【0036】
（３）ＯＡＳ＋Ｓ２－－＞Ｌ－システイン＋アセテート
両方の酵素は非常に類似した反応機構を有し、Ｌ－システインの生合成に関与するが、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、式（１）に従ってＯＡＳと反応することができる求核剤に関して可変基質スペクトルを有する。
両方の酵素は非常に類似した反応機構を有し、Ｌ－システインの生合成に関与するが、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、式（１）に従ってＯＡＳと反応することができる求核剤に関して可変基質スペクトルを有する。
【0037】
例えば、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、ＯＡＳとチオスルフェートとの反応を触媒してＳ－スルホシステインを形成することができることが知られている（ＣＡＳ番号１６３７－７１－４）。この反応は、唯一の硫黄源としてチオスルフェートを用いた細菌増殖において重要な役割を果たす。
【0038】
さらに、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）は、非タンパク質原性アミノ酸の製造のためのＣｙｓＭの使用を開示している。
【0039】
好ましくは、この方法は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼが細菌酵素、特に好ましくはＣｙｓＭ、特に好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来のＣｙｓＭである。
【0040】
亜硫酸は、可逆的平衡状態で同時に存在する多数の化学種を形成し、本発明による生体内変換における求核剤としてのそのそれぞれの適合性は予測できなかった。したがって、亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）はガス状ＳＯ２の水溶液であり、二塩基酸として、水溶液のｐＨに応じて異なる平衡状態で存在し、この平衡状態の種は求核剤としての適合性も変化することが知られている。以下の平衡論（４）～（８）が知られている。
【0041】
（４）ＳＯ２（ガス状）＜－＞ＳＯ２（溶解）
（５）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ＜－＞Ｈ２ＳＯ３
（６）Ｈ２ＳＯ３＜－＞ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（７）ＨＳＯ３ －＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（８）２ＨＳＯ３ －＜－＞Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
亜硫酸及びその塩は、抗菌効果を示すため、食品産業において防腐剤として使用されている。これは、亜硫酸及びその塩が微生物を死滅させることができることを意味し、これは微生物の生存に必要な酵素の不活性化に起因する。したがって、当業者は、亜硫酸又はその塩を使用する場合にもＣｙｓＭ酵素が不活性化され、Ｌ－システイン酸はＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている方法によって調製できないと予想するであろう。
（５）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ＜－＞Ｈ２ＳＯ３
（６）Ｈ２ＳＯ３＜－＞ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（７）ＨＳＯ３ －＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（８）２ＨＳＯ３ －＜－＞Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
亜硫酸及びその塩は、抗菌効果を示すため、食品産業において防腐剤として使用されている。これは、亜硫酸及びその塩が微生物を死滅させることができることを意味し、これは微生物の生存に必要な酵素の不活性化に起因する。したがって、当業者は、亜硫酸又はその塩を使用する場合にもＣｙｓＭ酵素が不活性化され、Ｌ－システイン酸はＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている方法によって調製できないと予想するであろう。
【0042】
前述の理由から、サルファイト及びＯＡＳを生体内変換に使用すると、Ｌ－システイン酸を製造できることは当業者にとって驚くべきことであった。
【0043】
原則として、考えられる全ての亜硫酸塩が反応に適している。好ましくは、この方法は、使用される亜硫酸の塩がＮａ２ＳＯ３、Ｋ２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）又はＫＨＳＯ３である。特に好ましくは、使用される亜硫酸の塩は、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）及び（ＮＨ４）２ＳＯ３であり、特に好ましくはＮａ２ＳＯ３及びＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）である。
【0044】
ガス状二酸化硫黄、亜硫酸の無水物を使用することが考えられ、これは反応バッチに導入することができ、亜硫酸Ｈ２ＳＯ３に水和され、ｐＨに応じて、脱プロトン化形態ＨＳＯ３
－及びＳＯ３
２－と平衡状態にある。
【0045】
この方法は、ＯＡＳの可用性を必要とする。例えば、Ｌ－セリンの高い価格のために高価であるＬ－セリンのアセチル化によってＯＡＳを生成するための化学的方法、又は直接使用することができるラセミ体Ｏ－アセチル－Ｄ／Ｌ－セリンの生成、又はＯＡＳが例えば分割によってラセミ体から事前に得られることが考えられる。直接アセチル化の場合、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリン（ＮＡＳ）は、例えば、Ｌ－セリンのヒドロキシル基若しくはアミノ基に対する非選択的アセチル化、又は中性からアルカリ性のｐＨ値でのＯＡＳのＮＡＳへの公知の転位によって（Ｔａｉ他（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２３１１－１２３２２）副生成物として形成され得、これにより、収率が低下するか、又はＬ－セリンのアミノ基に保護基を事前に導入する必要がある。したがって、Ｌ－セリンの直接アセチル化は、経済的に実行可能な方法には実用的ではない。
【0046】
例えばＥＰ１２３３０６７Ｂ１に開示されているように、ＯＡＳの生物工学的製造も知られている。これは、調節解除されたシステイン代謝を示し、したがって高レベルのＯＡＳを提供する、生物の使用を含む。結果として、ＯＡＳを製造するための費用対効果の高い製造システムが利用可能である。
【0047】
好ましい実施形態では、本方法は、ＯＡＳが発酵生産から濃縮される。発酵生産は、ＧＭＯを用いて、又はＧＭＯではない生物を用いて行うことができる。
【0048】
特に好ましい実施形態では、本方法は、ＯＡＳが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成されることを特徴とし、その場合、ＯＡＳが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の助けを借りて発酵的に製造されることが特に好ましい。最後に述べた具体的に好ましい実施形態は、実施例１に開示されている。
【0049】
本発明のＬ－システイン酸の製造方法は、天然産生方法であることが好ましい。これは、本方法で使用されるＧＭＯがないだけでなく、反応物ＯＡＳ及び酵素ＯＡＳスルフヒドリラーゼの両方が天然産生に由来する、すなわち、ＧＭＯを使用して製造されず、化学的に製造されないことを意味する。
【0050】
この特に好ましい実施形態は、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼＣｙｓＭの両方が天然に産生される、Ｌ－システイン酸の天然産生方法を記載する本発明による実施例に開示される。ＯＡＳ産生株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６（実施例１）及びＣｙｓＭ産生株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（実施例２）はいずれも自己クローニングに由来し、ＧＭＯとして分類されない。本発明は、供給部門及び化粧品における可能な用途のために大きな関心が寄せられているＬ－システイン酸の天然産生方法を開示しているので、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼの両方をＧＭＯを使用せずに製造することができるという事実は、本発明に特に利点をもたらす。
【0051】
当業者は、同位体分析を使用して、ＯＡＳ等の本方法で反応物質として使用することを望む物質が化学的生産又は発酵生産に由来するかどうかを判断することができる。区別することができる同位体分析方法は、例えば、Ｓｉｅｐｅｒ他、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（２００６）２０：２５２１－２５２７に記載されており、生成物が化学的（石油ベース）生産に由来するか又は発酵生産に由来するか（植物ベースの原料に由来するか）に応じて変化する、例えば炭素又は窒素の同位体比の決定に基づく。
【0052】
本発明の利点は、例えばＥＰ１２３３０６７Ｂ１に従って実施される発酵から得られるようなＯＡＳ含有発酵槽ブロスが、例えば、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿及び結晶化を含むさらなる後処理、精製又は単離工程を伴わない遠心分離によって、粒状バイオマスの除去後にＯＡＳの供給源として本発明による方法で直接使用できることである。この手順は特に経済的であり、不安定な化合物の単離を回避する。
【0053】
ＯＡＳを製造するための発酵方法、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用して、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１及び本発明の実施例１に開示されている。この株は、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ（ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託されている。
【0054】
本方法は、好ましくは、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ（好ましくはＣｙｓＭを含む）が、発酵生産に由来し、特に好ましくは、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生産され、特に好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の助けを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の助けを借りて生成される。
【0055】
実施例２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵バイオテクノロジー生産の手順を開示している。生産株は、宿主株、この場合は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、及びＯＡＳスルフヒドリラーゼの発現に適した遺伝子構築物、好ましくは遺伝子構築物ｐＦＬ１４５からなる。宿主株及び遺伝子構築物、並びに生産株の作製は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に記載されている。この生産株は、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託されている。
【0056】
本発明による方法では、発酵によって得られたＯＡＳスルフヒドリラーゼは、さらなる後処理を行わない発酵槽ブロスとして、又は例えば遠心分離によって発酵槽ブロスから細胞を再単離した後の細胞懸濁液として使用することができる。さらに、ＯＡＳスルフヒドリラーゼは、細胞懸濁液の機械的破壊後の細胞ホモジネートの形態で、又は化学的透過性細胞（例えば、クロロホルムによる）の形態で、又は細胞ホモジネートから粒子成分を除去した後の細胞抽出物として、又は例えばクロマトグラフィーによって精製された酵素として使用することができる。
【0057】
さらなる後処理なしの発酵槽ブロスとしての、発酵槽ブロスからの細胞の再単離後の細胞懸濁液としての、又は細胞懸濁液の機械的破壊後の細胞ホモジネートとしての、又は化学的透過性細胞（例えば、クロロホルムによる）の形態でのＯＡＳスルフヒドリラーゼの使用が好ましい。
【0058】
発酵槽ブロスからの細胞の再単離後の細胞懸濁液又は細胞ホモジネートとしてのＯＡＳスルフヒドリラーゼの使用が特に好ましい。
【0059】
特に好ましい実施形態では、発酵槽ブロスから単離され、再懸濁された生産株の細胞がＯＡＳスルフヒドリラーゼとして使用される。
【0060】
特に好ましい実施形態では、Ｌ－システイン酸の製造方法は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ及びＯＡＳの両方が発酵によって生成される。
【0061】
本発明による生体内変換方法の反応物質としてのＯＡＳは、約ｐＨ７のｐＨからＮ－アセチル－Ｌ－セリンに異性化し、その後サルファイトとの反応にもはや適しておらず、Ｌ－システイン酸を形成する。反応の機序は、Ｔａｉ他（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２３１１－１２３２２で研究され、アシル基のカルボニル炭素上の脱プロトン化アミノ基による分子内求核攻撃を伴う。この反応は、ｐＨが低下すると抑制されるため、化合物は例えばｐＨ４．０で安定である。
【0062】
したがって、本発明による生体内変換方法は、Ｌ－システイン酸を形成するためのＯＡＳの反応が、ＯＡＳのＮ－アセチル－Ｌ－セリンへの異性化を最小限に抑えるｐＨ条件下で行われるという事実によって区別される。
【0063】
好ましくは、本方法は、反応が、少なくとも５．５であり、≦７．５、特に好ましくは≦７．０、特に好ましくは≦６．５であるｐＨ値で行われる。
【0064】
生体内変換方法のさらに好ましい実施形態では、基質ＯＡＳは、いわゆる供給工程においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ及びサルファイトからなる反応バッチに計量供給される（実施例５）。計量供給されるＯＡＳは、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリンへの異性化を抑制するｐＨ、好ましくはｐＨ≦６．５、特に好ましくはｐＨ≦６．０、特に好ましくはｐＨ≦５．５に設定される。同時に、反応バッチ中のｐＨは、反応を促進してＬ－システイン酸を形成するように調整される。
【0065】
式（２）によれば、Ｌ－システイン酸を形成するためのＯＡＳの反応は、化学量論量の酢酸を放出し、反応が進行するにつれてバッチ中のｐＨの低下をもたらし得る。ｐＨが低すぎるとＯＡＳスルフヒドリラーゼの活性に影響を及ぼすため、ｐＨの過度の低下を防ぐ必要がある。これは、バッチ中の適切な高濃度緩衝液によって受動的に行うことができ、又は測定及び制御ユニットによって能動的に達成することができる。
【0066】
実施例５に開示されているように、ｐＨが目標値から逸脱した場合に、アルカリ溶液又は酸の計量添加によって所望のｐＨを回復させる、測定及び制御ユニットによる活性ｐＨ制御が好ましい（いわゆるｐＨスタット法）。
【0067】
反応温度は、好ましくは５～７０℃の間で選択される。１０～６０℃の反応温度が好ましく、１５～５０℃が特に好ましく、２０～４０℃が特に好ましい。
【0068】
Ｌ－システイン酸の製造方法は、好ましくは水性環境で行われ、すなわち、反応に使用される溶媒は好ましくは水である。
【0069】
Ｌ－システイン酸を製造するための本発明による方法は、不連続操作又は連続操作で行うことができる。不連続操作（バッチ操作）では、反応の過程で全ての反応物をバッチに添加し、反応が終了した後にバッチを後処理する。連続操作では、ＯＡＳ、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ及び亜硫酸塩を反応中に絶えず計量投入し、生成物Ｌ－システイン酸を含有する溶液をバッチから同時に除去する。確立されるのは、反応物が反応容器内の滞留時間中に完全に反応して生成物Ｌ－システイン酸を形成することができるように反応物が計量供給される定常状態である。非天然アミノ酸の連続生産のための方法は、例えば、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示されている。
【0070】
Ｌ－システイン酸を製造するための本発明による方法の不連続操作が好ましい。
【0071】
好ましくは、本方法は、亜硫酸塩の濃度が、ＯＡＳに対して少なくとも等モル濃度、特に好ましくは少なくとも１．５倍モル過剰、特に好ましくは少なくとも２倍モル過剰、さらに好ましくは少なくとも５倍モル過剰である。
【0072】
バッチ中のＯＡＳ濃度は、好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも４０ｇ／Ｌである。
【0073】
ＯＡＳの生体内変換において、使用されるＯＡＳのモル量に基づくＬ－システイン酸のモル収率は、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％である。
【0074】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、実施例によって制限されることはない。
【実施例】
【0075】
［実施例１］
ＯＡＳの生成
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用した。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成した。発酵終了時に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を使用してｐＨを４．５に設定することによってＯＡＳを安定化した。４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって細胞を除去した。発酵上清中のＯＡＳのＨＰＬＣ測定含量は１５．３ｇ／Ｌであった。
ＯＡＳの生成
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用した。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成した。発酵終了時に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を使用してｐＨを４．５に設定することによってＯＡＳを安定化した。４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって細胞を除去した。発酵上清中のＯＡＳのＨＰＬＣ測定含量は１５．３ｇ／Ｌであった。
【0076】
ＯＡＳ及びＬ－システイン酸のＨＰＬＣ分析：
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍＭ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍＭ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
【0077】
溶離液Ａ：２５ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．０。溶離液Ｂ：メタノール。分離は、グラジエントモード、１０％溶離液Ｂから６０％溶離液Ｂまで０～２５分間かけて、続いて６０％溶離液Ｂから１００％溶離液Ｂまで２分間かけて、続いて１００％溶離液Ｂまで０．５ｍｌ／分の流速でさらに２分間行った。Ｌ－システイン酸の保持時間：３．２分。ＯＡＳの保持時間：１７．０分。
【0078】
［実施例２］
酵素ＣｙｓＭの製造
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を使用した。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコ内での増殖と発酵の両方によって生成された。
酵素ＣｙｓＭの製造
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を使用した。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコ内での増殖と発酵の両方によって生成された。
【0079】
Ａ）振盪フラスコ内での増殖：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の前培養物をＬＢａｍｐ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン（ＧＩＢＣＯ（商標））、５ｇ／ｌの酵母抽出物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））中で調製した（３７℃及び１２０ｒｐｍで一晩増殖）。２５ｍｌの前培養物を、２５０ｍｌのＬＢａｍｐ培地（バッフル付きの１Ｌ三角フラスコ）の主培養物の接種材料として使用した。主培養物を３０℃及び１１０ｒｐｍで振盪した。４時間後、１．０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００に達した（ＯＤ６００：６００ｎｍでの吸光度の測定による細胞懸濁液１ｍｌ当たりの細胞密度の測光的測定；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＧｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）。次いで、誘導剤テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度３ｍｇ／Ｌ）を添加し、増殖を３０℃及び１１０ｒｐｍでさらに２０時間継続した。増殖終了時、細胞密度ＯＤ６００は３／ｍｌであった。
【0080】
Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵生産は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている。発酵からの細胞を４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって除去し、細胞密度ＯＤ６００が９０／ｍｌになるようにＫＰｉ６．５緩衝液（０．１Ｍ Ｋホスフェート、ｐＨ６．５）に懸濁した。
【0081】
振盪フラスコ増殖又は発酵からの細胞を、さらなる使用のために遠心分離（１５０００ｒｐｍで１０分、ＳＳ３４ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）によって単離した。細胞ホモジネートの製造のためのさらなる使用のために、後述するように、細胞ペレットを細胞懸濁液としてＫＰｉ６．５緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液は、細胞密度ＯＤ６００が３０／ｍｌになるのに十分な量のＫＰｉ６．５緩衝液を使用することによって調製した。例えば、３／ｍｌのＯＤ６００を有する振盪フラスコ増殖からの細胞５０ｍｌを遠心分離し、５ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（１０倍濃度）に再懸濁するか、又は９０／ｍｌのＯＤ６００を有する発酵からの細胞１ｍｌを３ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（３倍希釈）に再懸濁した。
【0082】
これにより、発酵槽ブロスから単離され、再懸濁された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の細胞が生成され、これを本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼＣｙｓＭとして以下で使用した。
【0083】
細胞ホモジネートを調製するために、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製のＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇ細胞ホモジナイザを使用した。３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００を有するＫＰｉ６．５緩衝液中の１ｍｌの細胞懸濁液を、ガラスビーズ（「溶解マトリックスＢ」）を含有する製造業者によって組み立てられた１．５ｍｌチューブ内で破壊した（間隔の間に毎回３０秒の休止を設けて６０００ｒｐｍの振盪周波数で３×２０秒）。得られた細胞ホモジネートを、本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として直接使用するか、又は細胞抽出物の調製に使用した。
【0084】
細胞抽出物を調製するために、得られた細胞ホモジネートを遠心分離し（１５０００ｒｐｍで１０分間、ＳＳ３４ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）、上清を細胞抽出物と称し、本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として使用するか、又はＣｙｓＭ酵素活性の測定にさらに使用した。
【0085】
細胞抽出物のタンパク質含有量は、「Ｑｕｂｉｔ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」を製造業者の説明書に従って使用し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＱｕｂｉｔ ３．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによって決定した。振盪フラスコ増殖からの細胞抽出物のタンパク質含有量は５．３ｍｇ／ｍｌであった。発酵からの細胞抽出物のタンパク質含有量は４．０ｍｇ／ｍｌであった。
【0086】
ＣｙｓＭ酵素活性は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に記載されているように決定した。この目的のために、ＯＡＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｎａ２Ｓ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株増殖からの細胞抽出物の存在下、３７℃でインキュベートした。ＫＰｉ６．５緩衝液中のアッセイ（最終体積０．４ｍｌ）は、１０ｍＭのＯＡＳ（５００ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の２００ｍＭ原液からの添加）、１０ｍＭ硫化ナトリウムＮａ２Ｓ及び５μｌのＣｙｓＭ含有細胞抽出物を含有していた。ＣｙｓＭ反応で生成されたシステインを、ニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、Ｇａｉｔｏｎｄｅ（１９６７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０４：６２７－６３３による方法に従って測定した。振盪フラスコ内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の増殖からの細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５７．１Ｕ／ｍｌであった。振盪フラスコ増殖からの細胞（３／ｍｌのＯＤ６００）は細胞抽出物の調製のために１０倍濃縮されていたので、振盪フラスコ増殖からの細胞における酵素活性は５．７Ｕ／ｍｌであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５８．１Ｕ／ｍｌであった。発酵からの細胞（９０／ｍｌのＯＤ６００）は、細胞抽出物の調製のために３０／ｍｌのＯＤ６００に希釈されていたので、発酵槽細胞の濃縮（９０／ｍｌのＯＤ６００）細胞懸濁液中の酵素活性は１７４．４Ｕ／ｍｌであった。
【0087】
振盪フラスコ内の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株増殖からの細胞抽出物の比ＣｙｓＭ酵素活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１０．８Ｕであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物の比ＣｙｓＭ酵素活性は１４．５Ｕ／ｍｇであった。細胞抽出物の調製中にＣｙｓＭ活性が細胞から完全に放出されたと仮定すると、細胞抽出物で測定されたＣｙｓＭ酵素活性は、以下の実施例でＣｙｓＭ細胞懸濁液に存在する酵素活性と同等であった。
【0088】
１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性は、１ｍｌの細胞抽出物中のアッセイ条件下でのＯＡＳ及びＮａ２Ｓからの１μｍｏｌ／分のシステイン生成（体積活性）と規定される。タンパク質１ｍｇ当たりのＵでの比ＣｙｓＭ酵素活性は、細胞抽出物の体積活性（Ｕ／ｍｌ）を細胞抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって得られ、細胞抽出物中のタンパク質１ｍｇに基づくＵでのＣｙｓＭ酵素活性と規定される。
【0089】
［実施例３］
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
２つのバッチを並行して行った：
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、最初にＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５）８．２５ｍｌを装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２ＳＯ３の０．２Ｍ溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性を有する（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）（実施例２Ａからの）振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞抽出物０．４ｍｌ、及び０．５Ｍコハク酸Ｎａ、ｐＨ５．５中のＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液３５０μｌを連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
２つのバッチを並行して行った：
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、最初にＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５）８．２５ｍｌを装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２ＳＯ３の０．２Ｍ溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性を有する（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）（実施例２Ａからの）振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞抽出物０．４ｍｌ、及び０．５Ｍコハク酸Ｎａ、ｐＨ５．５中のＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液３５０μｌを連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。
【0090】
バッチ２：バッチ（Ｎａ２ＳＯ３を含まない比較バッチ）はバッチ１と同じ組成を有していた。Ｎａ２ＳＯ３溶液の代わりに、バッチ２には１ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液を加えた。
【0091】
両方のバッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。１時間及び３時間後、各場合のバッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートして反応を停止させ、遠心分離し、上清をＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣにより検出されたＬ－システイン酸の量を表１に示す。
【0092】
表１：市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３並びにＣｙｓＭ含有細胞抽出物を使用した、反応時間によるＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸。
【0093】
【表1】
【0094】
［実施例４］
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた、発酵からのＯＡＳ含有培養上清及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
１００ｍｌの三角フラスコに、（実施例１からの）ＯＡＳ含有量１５．３ｇ／Ｌを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の発酵からの細胞培養上清１ｍｌを最初に装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、Ｎａ２ＳＯ３のＮａＰｉ６．５緩衝液中１Ｍ溶液１ｍｌ、及び振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００；５７．１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性）を連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、１ｍｌのバッチを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＯＡＳ及びＬ－システイン酸の含有量についてＨＰＬＣで分析した。経時的な反応の経過を表２に要約する。
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた、発酵からのＯＡＳ含有培養上清及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
１００ｍｌの三角フラスコに、（実施例１からの）ＯＡＳ含有量１５．３ｇ／Ｌを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の発酵からの細胞培養上清１ｍｌを最初に装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、Ｎａ２ＳＯ３のＮａＰｉ６．５緩衝液中１Ｍ溶液１ｍｌ、及び振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００；５７．１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性）を連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、１ｍｌのバッチを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＯＡＳ及びＬ－システイン酸の含有量についてＨＰＬＣで分析した。経時的な反応の経過を表２に要約する。
【0095】
表２：ＯＡＳ含有細胞培養上清、Ｎａ２ＳＯ３及びＣｙｓＭ含有細胞懸濁液を使用したＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸及びＯＡＳ。
【0096】
【表2】
【0097】
［実施例５］
一定ｐＨでのＯＡＳの生体内変換によるＬ－システイン酸の調製製造
０．５Ｌのサーモスタット式二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、３７℃の温度に調整した。
一定ｐＨでのＯＡＳの生体内変換によるＬ－システイン酸の調製製造
０．５Ｌのサーモスタット式二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、３７℃の温度に調整した。
【0098】
（実施例２Ｂからの）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵からのＫＰｉ６．５緩衝液中のＣｙｓＭ含有細胞懸濁液５０ｍｌ（９０／ｍｌのＯＤ６００、ＣｙｓＭ酵素活性８７２０Ｕ）、及びＫＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２Ｓ２Ｏ５の４００ｇ／Ｌ溶液６．６ｍｌ（１３．９ｍｍｏｌ、分子量１９０．１ｇ／ｍｏｌ）を最初に装入した。溶解形態では、これは２７．８ｍｍｏｌのＮａＨＳＯ３に相当した（後に計量される１５．６ｍｍｏｌのＯＡＳ量に対して１．７８倍モル過剰）。バッチをマグネチックスターラーで撹拌した。バッチにはｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）も装備し、これをｐＨ制御ユニット（ＴｉｔｒｏＬｉｎｅ ａｌｐｈａ滴定装置、Ｓｃｈｏｔｔ）に接続し、これを製造業者の指示に従ってｐＨ－ｓｔａｔモードで操作した。ｐＨ－ｓｔａｔ条件下で、制御ユニットに接続したビュレットから２Ｍ ＮａＯＨを計量添加することによって、反応容器内のｐＨを反応の全期間にわたって設定ｐＨ６．５で一定に保った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有細胞培養上清（ＯＡＳ含有量：１５．３ｇ／Ｌ、２．３ｇ；１５．６４ｍｍｏｌ）１５０ｍｌを、リザーバーからポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ蠕動ポンプ）を介して流速０．３５ｍｌ／分でバッチに計量供給した。
【0099】
反応時間は１９時間であった。バッチは開放反応容器内で実施されたため、バッチ体積は、蒸発による反応完了後に１８５ｍｌであった。反応開始後０．５時間、３時間及び１９時間で、バッチの１ｍｌアリコートをそれぞれ除去し、Ｌ－システイン酸の含有量をＨＰＬＣによって分析した。経時的なＬ－システイン酸の形成を表３に要約する。１９時間の反応時間後、バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１２９７０ｍｇ／Ｌ（７６．６５ｍＭ）であり、これは１８５ｍｌのバッチ体積に対する１４．１８ｍｍｏｌのＬ－システイン酸の絶対モル収率に相当した。１５．６４ｍｍｏｌのＯＡＳの使用量に基づいて、これは収率９０．１％に相当した。
【0100】
表３：ＯＡＳ含有発酵上清、ＮａＨＳＯ３及びＣｙｓＭ含有発酵槽細胞の細胞懸濁液を使用した、反応時間によるＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸
【0101】
【表3】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｌ－システイン酸の製造方法に関し、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換される、Ｌ－システイン酸は、この生体内変換の結果としてもたらされる。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－システイン酸は、例えば、魚の養殖（Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）８７：３５３－３６３）又は化粧品分野（ＵＳ４０５３６３０）において、例えばスキンケアのためのＲｅｇｕ（Ｒ）－Ｓｌｉｍ（ＤＳＭ）の成分として使用することができる。ペプチド化学では、水溶性保護基としてＬ－システイン酸が使用される。さらに、Ｌ－システイン酸は、脱炭酸によってタウリンに変換することができる。
【0003】
Ｌ－システイン酸（（Ｒ）－２－アミノ－３－スルホプロパン酸、３－スルホ－Ｌ－アラニン、ＣＡＳ ４９８－４０－８）は、化学的に、例えば、アルコール溶液中で塩素によるシステインの酸化によって（Ｔａｏ他、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（２００４）、２７：１４９－１５１）、ＤＭＳＯ中のＨＣｌ若しくはヨウ素ＨＣｌ中で臭素によって、又は過ギ酸によるシスチンの酸化的開裂によって、生成することができる。さらに、Ｌ－システイン酸は、Ｌ－システインスルフィン酸の酸化によっても生成することができる。Ｌ－システイン酸の化学的製造のための既知の方法は、持続可能とはみなされず環境に有害な化学物質を使用し、特に食品、化粧品及び医薬品分野における用途において消費者にあまり受け入れられていない。したがって、より環境に優しく、より持続可能な製造方法が必要であり、その１つの選択肢はバイオテクノロジー法である。
【0004】
Ｌ－システイン酸は、タンパク質性アミノ酸Ｌ－システインの酸化生成物として自然界で、例えばヒツジの羊毛中に検出することができる非タンパク質原性Ｌ－アミノ酸である。システイン酸は、メタン生成古細菌による補酵素Ｍ（ＣｏＭ、２－メルカプトエタンスルホン酸、ＣＡＳ ３３７５－５０－６）生合成の中間体でもある。
【0005】
先行技術は、例えば、システイン代謝が調節解除された微生物の直接発酵によって（ＥＰ１１９１１０６Ｂ１）、又はＯＡＳのＯＡＳスルフヒドリラーゼ触媒生体内変換によって（ＥＰ１２４７８６９Ｂ１）、非タンパク質原性アミノ酸を製造する方法を提供する。これらの方法は、一般式（１）により、ＯＡＳスルフヒドリラーゼがＯＡＳと求核試薬との反応を触媒して、非タンパク質原性アミノ酸を形成することに基づく。
【0006】
（１）ＯＡＳ＋求核試薬－＞非タンパク質原性アミノ酸＋アセテート
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のシステイン代謝において、ＯＡＳはＬ－システインの生合成前駆体として働く。後者は、ベータ位の酢酸基をチオール基で置換することによって形成される。ベータ置換と呼ばれるこの反応は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼのクラスの酵素によって触媒される（ＥＣ４．２．９９．８）。したがって、ＯＡＳはＯＡＳスルフヒドリラーゼ反応の実際の基質（反応物とも呼ばれる）であり、求核剤は可変補助基質である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のシステイン代謝において、ＯＡＳはＬ－システインの生合成前駆体として働く。後者は、ベータ位の酢酸基をチオール基で置換することによって形成される。ベータ置換と呼ばれるこの反応は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼのクラスの酵素によって触媒される（ＥＣ４．２．９９．８）。したがって、ＯＡＳはＯＡＳスルフヒドリラーゼ反応の実際の基質（反応物とも呼ばれる）であり、求核剤は可変補助基質である。
【0007】
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１では、セレニド、セレノール、アジド、シアニド、アゾール及びイソオキサゾリノンを含む多数の異なる求核剤が、ＯＡＳとのＯＡＳスルフヒドリラーゼ触媒（例えば、ＣｙｓＭ触媒）反応の求核剤としての適性について試験された。さらに、一般式Ｈ－Ｓ－Ｒのチオスルフェート及びチオールの群からの硫黄化合物が試験され、式中、基Ｒは一価の置換又は非置換アルキル、アルコキシ、アリール又はヘテロアリール基である。
【0008】
製造されたのは、Ｓ－フェニル－Ｌ－システイン等の非タンパク質原性アミノ酸であり、これらはタンパク質生合成のための構成要素として自然界では使用されていない。開示された求核剤はいずれも、Ｌ－システイン酸の製造を可能にしない。
【0009】
Ｊｏｏ他（２０１８）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３には、細菌コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるタウリン製造のための代謝工学的アプローチが記載されている。タウリンの製造に到達するために、Ｌ－システインシンターゼ、システインジオキシゲナーゼ及びＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの遺伝子をこの株において異種発現させた。Ｊｏｏ他（２０１８）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３の図２には、タウリンへの様々な代謝経路が記載されており、これらは、Ｏ－ホスホ－Ｌ－セリンから始まり、Ｌ－システイン酸を介してタウリンをもたらす経路（「Ｌ－システインスルホン酸経路」）も含み、原則としてＬ－システイン酸の製造にも適している。しかしながら、図はまた、ＯＡＳからＬ－システイン酸、Ｌ－システインのみに至る既知の生合成経路がないことを示す。
【0010】
Ｔｅｖａｔｉａ他、Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６は、微小藻類におけるタウリンの天然産生を記載しており、Ｌ－システイン酸も中間体として検出されている。Ｔｅｖａｔｉａ他、Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６の図１ａ）に記載されているように、生合成経路はＬ－セリンからＬ－システイン酸（図１ａの「システート」）に至る。記載された生合成経路のいずれも、ＯＡＳを介してＬ－システイン酸をもたらさない。微細藻類中に検出されたＬ－システイン酸の細胞内含量は非常に低く、メチオニン、システイン、システインスルフィン酸、ヒポタウリン及びタウリン等の後処理をより困難にする複数の副生成物を伴っていたため、微細藻類の増殖はＬ－システイン酸の製造に適していない。
【0011】
代謝工学的アプローチでは、ＵＳ２０１９／００６２７５７Ａ１（ＫｎｉｐＢｉｏ）は、タウリン製造のための異種産生株を記載しており、この株はＬ－システイン酸の製造にも適していることが意図されている。ＵＳ２０１９／００６２７５７Ａ１の図４～図９及び図１２には、中間体としてＬ－システイン酸を含有するタウリンへの様々な生合成経路が記載されており、したがって原則としてＬ－システイン酸の製造に適している。これらの生合成経路のいずれもＯＡＳから開始しない。さらに、ヒポタウリン及びタウリンの収量のみが報告され、それらは非常に低く、最大４１９ｎｇ／ｍｌであった。Ｌ－システイン酸の製造のための収率には言及されていない。Ｌ－システイン酸については、より高い収率を達成することができないと仮定しなければならない。したがって、この代謝工学的アプローチは、Ｌ－システイン酸の生物工学的製造には適していない。
【0012】
Ｏｎｏ他（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０６、６９－７９ページ、２０１７）は、サルモネラ エンテリカム ＬＴ２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃｕｍ ＬＴ２）由来のＯＡＳスルフヒドリラーゼＣｙｓＭ及びＣｙｓＫが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の酵素（Ｍａｉｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１、４２２－４２７ページ、２００３、表１を参照）と同様に、基質ＯＡＳ及び硫化物から７０％を超える高収率でシステインを形成できることを開示している。Ｏｎｏは、さらに、サルモネラ エンテリカム ＬＴ２由来のＣｙｓＭ及びＣｙｓＫが、Ｎａ
２
ＳＯ
３
の存在下で、その他は同一の反応条件下でＯＡＳからシステイン誘導体Ｌ－システイン酸（システインスルホン酸塩、システイン酸塩）を低量で、すなわち０．２％未満のモル収率でさらに形成できることを開示している。
【0013】
したがって、先行技術は、化学的方法のみを開示しており、工業的使用に適したＬ－システイン酸を製造するための経済的に実行可能なバイオテクノロジー法を開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】米国特許第４０５３６３０号明細書
【特許文献2】欧州特許第１１９１１０６号明細書
【特許文献3】欧州特許第１２４７８６９号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０１９／００６２７５７号明細書
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）８７：３５３－３６３
【非特許文献2】Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（２００４）２７：１４９－１５１
【非特許文献3】Ｊｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．６６：１３４５４－１３４６３
【非特許文献4】Ｔｅｖａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｇａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）９：２１－２６
【非特許文献5】Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１７） １０６， ６９－７９
【非特許文献6】Ｍａｉｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２００３） ２１， ４２２－４２７
【発明の概要】
【0016】
本発明の目的は、生体内変換によってＬ－システイン酸を製造するためのバイオテクノロジー法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0017】
この目的は、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換される、Ｌ－システイン酸の製造方法によって達成される。この方法は、生体内変換によって製造されるＬ－システイン酸を提供する。
【0018】
本発明による方法の利点は、Ｌ－システイン酸を製造するための持続可能で技術的に実現可能な生体内変換方法であることである。環境に有害な化学物質を省くことができる。化石原料は消費されず、有毒な化学廃棄物及び／又は廃棄ガスは生成されない。したがって、本発明の製造方法は、環境に優しく持続可能である。さらに、この方法は、極端な反応条件又は特別な装置のいずれも必要としないため技術的に実施するのが容易である。この方法の別の利点は、ますます需要が高まっている天然のＬ－システイン酸をこのようにして製造できることである。
【0019】
驚くべきことに、亜硫酸塩（以下、サルファイト又はＳＯ３
２－と呼ぶ）が反応（１）における求核剤として適しており、式（２）によるこれまで知られていない反応においてＬ－システイン酸の合成を可能にすることが見出された。
【0020】
（２）ＯＡＳ＋ＳＯ３
２－－＞Ｌ－システイン酸＋アセテート
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の文脈において、製造方法は以下のように区別される。
【0022】
１．化学的方法
２．生物工学的方法：
ａ）代謝工学による
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、生物の代謝経路が遺伝子及び調節過程の最適化又は改変によって改変されるバイオテクノロジー法である。新規又は改変された酵素は、ゲノムに酵素の遺伝子を補充することによって生物に導入することができ、又は内因性酵素の遺伝子を増強又は弱毒化されたレベルで発現させることができ、それによって生物における新たな代謝経路を確立するか、又は既存の代謝経路を増強若しくは弱毒化する。代謝工学の目標は、生物が新たな代謝産物又は細胞内在性代謝産物のいずれかを高い収率で産生することである。代謝工学方法は、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝産物に特異的な出発物質を使用しない。代わりに、問題の生物の成長に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩又はペプトン若しくは酵母抽出物等の複合アミノ酸混合物）及び成長に必要な他の塩から構成される、成長培地とも呼ばれる栄養培地のみを使用する。そのような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
２．生物工学的方法：
ａ）代謝工学による
代謝工学（「経路設計」とも呼ばれる）は、生体内変換とは対照的に、生物の代謝経路が遺伝子及び調節過程の最適化又は改変によって改変されるバイオテクノロジー法である。新規又は改変された酵素は、ゲノムに酵素の遺伝子を補充することによって生物に導入することができ、又は内因性酵素の遺伝子を増強又は弱毒化されたレベルで発現させることができ、それによって生物における新たな代謝経路を確立するか、又は既存の代謝経路を増強若しくは弱毒化する。代謝工学の目標は、生物が新たな代謝産物又は細胞内在性代謝産物のいずれかを高い収率で産生することである。代謝工学方法は、酵素基質、例えば本発明におけるＯＡＳ等の代謝産物に特異的な出発物質を使用しない。代わりに、問題の生物の成長に必要であり、炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アンモニウム塩又はペプトン若しくは酵母抽出物等の複合アミノ酸混合物）及び成長に必要な他の塩から構成される、成長培地とも呼ばれる栄養培地のみを使用する。そのような栄養培地は、微生物学的実践から当業者に知られている。
【0023】
ｂ）生体内変換による
生体内変換は、酵素触媒下における１つ以上の反応物の生成物への変換として規定され、酵素基質は酵素と共に反応バッチに添加される。反応バッチにおいて、添加された酵素基質、例えば本発明のＯＡＳは、式（２）に従って酵素的に（本発明では、亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって）変換される。反応物は、化学的又は生物工学的製造に由来し得る。本発明による方法で使用されるＯＡＳは、例えば、化学合成又は生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産から得ることができる。酵素触媒に使用される酵素は、生産株の増殖、例えば発酵によるバイオテクノロジー生産に由来するか、又は酵素を含む生物学的材料が使用される（例えば、植物、真菌、藻類、動物の器官）。生産株の増殖からのバイオマス、若しくは生物学的材料を直接使用することができるか、又は生体内変換の要件に応じて酵素をそこから単離する。本発明による方法で使用されるＣｙｓＭ酵素は、生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産に由来する。
生体内変換は、酵素触媒下における１つ以上の反応物の生成物への変換として規定され、酵素基質は酵素と共に反応バッチに添加される。反応バッチにおいて、添加された酵素基質、例えば本発明のＯＡＳは、式（２）に従って酵素的に（本発明では、亜硫酸塩の存在下でＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される酵素によって）変換される。反応物は、化学的又は生物工学的製造に由来し得る。本発明による方法で使用されるＯＡＳは、例えば、化学合成又は生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産から得ることができる。酵素触媒に使用される酵素は、生産株の増殖、例えば発酵によるバイオテクノロジー生産に由来するか、又は酵素を含む生物学的材料が使用される（例えば、植物、真菌、藻類、動物の器官）。生産株の増殖からのバイオマス、若しくは生物学的材料を直接使用することができるか、又は生体内変換の要件に応じて酵素をそこから単離する。本発明による方法で使用されるＣｙｓＭ酵素は、生産株の発酵によるバイオテクノロジー生産に由来する。
【0024】
天然産生方法は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）又はＧＭＯを使用した生産からの製品（反応物、酵素）を使用しない、バイオテクノロジー生産方法して規定される。本発明において、Ｌ－システイン酸の製造方法は、有機反応物としてのＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼがＧＭＯを用いて製造されておらず、化学的に製造されていない場合の天然産生方法である。式（２）における補助基質としてのサルファイトは無機化合物であり、基本的には式（４）～（８）に従ってＳＯ２を水に溶解した生成物であり、これは（不可逆的な）化学合成には対応しないが、ガスＳＯ２の可逆的水和及び水和物Ｈ２ＳＯ３のｐＨ依存性解離に対応する。
【0025】
Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｋｇｅｓｅｔｚ（ＧｅｎＴＧ、ドイツ遺伝子工学法）の§３の第３文４の意味における自己クローニングは、Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｕｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ（ＺＫＢＳ、ドイツ生物学的安全性中央委員会）によって発行された声明（参考文献：１９９１年の６７９０－１０－０２）によれば、そのウイルス及びプラスミドを含む遺伝的に同一又は異なる形態のただ１つの種のみが、ドナー生物及びレシピエント生物として使用される方法である。
【0026】
本発明の文脈において、反応バッチは、反応物（出発物質）、酵素及び任意選択的に他の反応物の混合物として規定され、反応物は生成物に変換される。
【0027】
本発明の意味における反応の収率は、反応条件下で生成物に変換される使用される反応物の量として規定される。収率は、絶対量として（ｇ又はｍｍｏｌ）、単位体積当たりの生成物の絶対量としての体積収率（濃度）として（ｍＭ又はｇ／Ｌ）、又は収率パーセントとも呼ばれる、使用される反応物のパーセンテージ（反応物及び生成物の分子量を考慮に入れる）としての生成物の相対収率として表すことができる。
【0028】
発酵は、工業規模での細胞培養物の産生（培養）のための方法工程であり、好ましくは微生物産生株を培養培地、温度、ｐＨ、酸素供給及び培地の混合の規定条件下で増殖させる。生産株の構成（遺伝的構成）に応じて、発酵の目的は、タンパク質／酵素又は代謝産物を、いずれの場合もさらなる使用のために可能な限り高い収率で生産することである。本発明によるプロセスの成分、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼは、発酵によって生成することができる。発酵の最終生成物は、生産株の細胞のバイオマス（発酵槽細胞）と、バイオマスから除去され、発酵中に増殖培地及び発酵槽細胞によって分泌された代謝産物から形成された発酵培地（発酵上清）とからなる発酵槽ブロスである。発酵の目標生成物は、発酵槽細胞又は発酵培地中に存在することができる。例えば、ＯＡＳは発酵培地に見出され、酵素ＯＡＳスルフヒドリラーゼは発酵槽細胞に見出される。
【0029】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｃｄｓ又はコード配列と同義）は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの領域を指す。ＯＲＦは、コード領域又は構造遺伝子とも呼ばれる。
【0030】
遺伝子は、生物学的に活性なＲＮＡを産生するための全ての基本情報を含むＤＮＡの部分を指す。遺伝子は、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが生成されるＤＮＡの部分と、このコピー過程の調節に関与する発現シグナルとを含む。発現シグナルは、例えば、少なくとも１つのプロモータ、転写開始、翻訳開始及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。ターミネータ及び１つ以上のオペレータは、追加の可能な発現シグナルである。
【0031】
遺伝子構築物は、遺伝子が他の遺伝要素（例えば、プロモータ、ターミネータ、選択マーカ、複製起点）に連結されているＤＮＡ分子を指す。本発明の文脈における遺伝子構築物は、環状ＤＮＡ分子であり、プラスミド、ベクター又は発現ベクターと呼ばれる。遺伝子構築物の遺伝要素は、細胞成長中にその染色体外遺伝を引き起こし、遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を引き起こす。
【0032】
本発明による亜硫酸塩によるＯＡＳの生体内変換からのＬ－システイン酸は、さらなる後処理工程なしでさらに直接使用するか、又は既知の方法によって濃縮若しくは精製することができる。ここでの濃縮度は、さらなる使用に依存する。そのような方法は、アミノ酸を単離するための方法から当業者に公知である。例としては、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、結晶化が挙げられる。
【0033】
好ましい実施形態において、本方法は、Ｌ－システイン酸が反応バッチから濃縮される。例えば遠心分離による粒子状バイオマスの除去が特に好ましい。
【0034】
さらに好ましい実施形態では、本方法は、本発明による方法で製造されたＬ－システイン酸がさらに直接使用されること、すなわち、Ｌ－システイン酸を含有する反応バッチが、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿及び結晶化を含むさらなる後処理、精製又は単離工程なしにさらに使用される。
【0035】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼは、これまでに多種多様な植物及び微生物から単離されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には、例えば、ＣｙｓＫ及びＣｙｓＭと呼ばれる２つのＯＡＳスルフヒドリラーゼ酵素が存在する。関連する遺伝子も同様に公知であり、それぞれｃｙｓＫ及びｃｙｓＭと呼ばれる。
【0036】
本発明の意味の範囲内のＯＡＳスルフヒドリラーゼは、式（３）によるＯＡＳからのタンパク質原性アミノ酸Ｌ－システインの合成を触媒することができ、この場合に使用される求核剤がスルフィドである。したがって、ＣｙｓＭ関連酵素及びＣｙｓＫ関連酵素の両方が、本発明の意味の範囲内でＯＡＳスルフヒドリラーゼである。
【0037】
（３）ＯＡＳ＋Ｓ２－－＞Ｌ－システイン＋アセテート
両方の酵素は非常に類似した反応機構を有し、Ｌ－システインの生合成に関与するが、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、式（１）に従ってＯＡＳと反応することができる求核剤に関して可変基質スペクトルを有する。
両方の酵素は非常に類似した反応機構を有し、Ｌ－システインの生合成に関与するが、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、式（１）に従ってＯＡＳと反応することができる求核剤に関して可変基質スペクトルを有する。
【0038】
例えば、ＣｙｓＭは、ＣｙｓＫとは異なり、ＯＡＳとチオスルフェートとの反応を触媒してＳ－スルホシステインを形成することができることが知られている（ＣＡＳ番号１６３７－７１－４）。この反応は、唯一の硫黄源としてチオスルフェートを用いた細菌増殖において重要な役割を果たす。
【0039】
さらに、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）は、非タンパク質原性アミノ酸の製造のためのＣｙｓＭの使用を開示している。
【0040】
好ましくは、この方法は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼが細菌酵素、特に好ましくはＣｙｓＭ、特に好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来のＣｙｓＭである。
【0041】
亜硫酸は、可逆的平衡状態で同時に存在する多数の化学種を形成し、本発明による生体内変換における求核剤としてのそのそれぞれの適合性は予測できなかった。したがって、亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）はガス状ＳＯ２の水溶液であり、二塩基酸として、水溶液のｐＨに応じて異なる平衡状態で存在し、この平衡状態の種は求核剤としての適合性も変化することが知られている。以下の平衡論（４）～（８）が知られている。
【0042】
（４）ＳＯ２（ガス状）＜－＞ＳＯ２（溶解）
（５）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ＜－＞Ｈ２ＳＯ３
（６）Ｈ２ＳＯ３＜－＞ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（７）ＨＳＯ３ －＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（８）２ＨＳＯ３ －＜－＞Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
亜硫酸及びその塩は、抗菌効果を示すため、食品産業において防腐剤として使用されている。これは、亜硫酸及びその塩が微生物を死滅させることができることを意味し、これは微生物の生存に必要な酵素の不活性化に起因する。したがって、当業者は、亜硫酸又はその塩を使用する場合にもＣｙｓＭ酵素が不活性化され、Ｌ－システイン酸はＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている方法によって調製できないと予想するであろう。
（５）ＳＯ２（溶解）＋Ｈ２Ｏ＜－＞Ｈ２ＳＯ３
（６）Ｈ２ＳＯ３＜－＞ＨＳＯ３ －＋Ｈ＋
（７）ＨＳＯ３ －＜－＞ＳＯ３ ２－＋Ｈ＋
（８）２ＨＳＯ３ －＜－＞Ｓ２Ｏ５ ２－＋Ｈ２Ｏ
亜硫酸及びその塩は、抗菌効果を示すため、食品産業において防腐剤として使用されている。これは、亜硫酸及びその塩が微生物を死滅させることができることを意味し、これは微生物の生存に必要な酵素の不活性化に起因する。したがって、当業者は、亜硫酸又はその塩を使用する場合にもＣｙｓＭ酵素が不活性化され、Ｌ－システイン酸はＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている方法によって調製できないと予想するであろう。
【0043】
前述の理由から、サルファイト及びＯＡＳを生体内変換に使用すると、Ｌ－システイン酸を製造できることは当業者にとって驚くべきことであった。
【0044】
原則として、考えられる全ての亜硫酸塩が反応に適している。好ましくは、この方法は、使用される亜硫酸の塩がＮａ２ＳＯ３、Ｋ２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）又はＫＨＳＯ３である。特に好ましくは、使用される亜硫酸の塩は、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）及び（ＮＨ４）２ＳＯ３であり、特に好ましくはＮａ２ＳＯ３及びＮａＨＳＯ３（もしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）である。
【0045】
ガス状二酸化硫黄、亜硫酸の無水物を使用することが考えられ、これは反応バッチに導入することができ、亜硫酸Ｈ２ＳＯ３に水和され、ｐＨに応じて、脱プロトン化形態ＨＳＯ３
－及びＳＯ３
２－と平衡状態にある。
【0046】
この方法は、ＯＡＳの可用性を必要とする。例えば、Ｌ－セリンの高い価格のために高価であるＬ－セリンのアセチル化によってＯＡＳを生成するための化学的方法、又は直接使用することができるラセミ体Ｏ－アセチル－Ｄ／Ｌ－セリンの生成、又はＯＡＳが例えば分割によってラセミ体から事前に得られることが考えられる。直接アセチル化の場合、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリン（ＮＡＳ）は、例えば、Ｌ－セリンのヒドロキシル基若しくはアミノ基に対する非選択的アセチル化、又は中性からアルカリ性のｐＨ値でのＯＡＳのＮＡＳへの公知の転位によって（Ｔａｉ他（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２３１１－１２３２２）副生成物として形成され得、これにより、収率が低下するか、又はＬ－セリンのアミノ基に保護基を事前に導入する必要がある。したがって、Ｌ－セリンの直接アセチル化は、経済的に実行可能な方法には実用的ではない。
【0047】
例えばＥＰ１２３３０６７Ｂ１に開示されているように、ＯＡＳの生物工学的製造も知られている。これは、調節解除されたシステイン代謝を示し、したがって高レベルのＯＡＳを提供する、生物の使用を含む。結果として、ＯＡＳを製造するための費用対効果の高い製造システムが利用可能である。
【0048】
好ましい実施形態では、本方法は、ＯＡＳが発酵生産から濃縮される。発酵生産は、ＧＭＯを用いて、又はＧＭＯではない生物を用いて行うことができる。
【0049】
特に好ましい実施形態では、本方法は、ＯＡＳが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成されることを特徴とし、その場合、ＯＡＳが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の助けを借りて発酵的に製造されることが特に好ましい。最後に述べた具体的に好ましい実施形態は、実施例１に開示されている。
【0050】
本発明のＬ－システイン酸の製造方法は、天然産生方法であることが好ましい。これは、本方法で使用されるＧＭＯがないだけでなく、反応物ＯＡＳ及び酵素ＯＡＳスルフヒドリラーゼの両方が天然産生に由来する、すなわち、ＧＭＯを使用して製造されず、化学的に製造されないことを意味する。
【0051】
この特に好ましい実施形態は、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼＣｙｓＭの両方が天然に産生される、Ｌ－システイン酸の天然産生方法を記載する本発明による実施例に開示される。ＯＡＳ産生株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６（実施例１）及びＣｙｓＭ産生株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（実施例２）はいずれも自己クローニングに由来し、ＧＭＯとして分類されない。本発明は、供給部門及び化粧品における可能な用途のために大きな関心が寄せられているＬ－システイン酸の天然産生方法を開示しているので、ＯＡＳ及びＯＡＳスルフヒドリラーゼの両方をＧＭＯを使用せずに製造することができるという事実は、本発明に特に利点をもたらす。
【0052】
当業者は、同位体分析を使用して、ＯＡＳ等の本方法で反応物質として使用することを望む物質が化学的生産又は発酵生産に由来するかどうかを判断することができる。区別することができる同位体分析方法は、例えば、Ｓｉｅｐｅｒ他、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（２００６）２０：２５２１－２５２７に記載されており、生成物が化学的（石油ベース）生産に由来するか又は発酵生産に由来するか（植物ベースの原料に由来するか）に応じて変化する、例えば炭素又は窒素の同位体比の決定に基づく。
【0053】
本発明の利点は、例えばＥＰ１２３３０６７Ｂ１に従って実施される発酵から得られるようなＯＡＳ含有発酵槽ブロスが、例えば、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿及び結晶化を含むさらなる後処理、精製又は単離工程を伴わない遠心分離によって、粒状バイオマスの除去後にＯＡＳの供給源として本発明による方法で直接使用できることである。この手順は特に経済的であり、不安定な化合物の単離を回避する。
【0054】
ＯＡＳを製造するための発酵方法、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用して、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１及び本発明の実施例１に開示されている。この株は、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ（ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託されている。
【0055】
本方法は、好ましくは、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ（好ましくはＣｙｓＭを含む）が、発酵生産に由来し、特に好ましくは、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生産され、特に好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の助けを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の助けを借りて生成される。
【0056】
実施例２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵バイオテクノロジー生産の手順を開示している。生産株は、宿主株、この場合は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、及びＯＡＳスルフヒドリラーゼの発現に適した遺伝子構築物、好ましくは遺伝子構築物ｐＦＬ１４５からなる。宿主株及び遺伝子構築物、並びに生産株の作製は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に記載されている。この生産株は、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託されている。
【0057】
本発明による方法では、発酵によって得られたＯＡＳスルフヒドリラーゼは、さらなる後処理を行わない発酵槽ブロスとして、又は例えば遠心分離によって発酵槽ブロスから細胞を再単離した後の細胞懸濁液として使用することができる。さらに、ＯＡＳスルフヒドリラーゼは、細胞懸濁液の機械的破壊後の細胞ホモジネートの形態で、又は化学的透過性細胞（例えば、クロロホルムによる）の形態で、又は細胞ホモジネートから粒子成分を除去した後の細胞抽出物として、又は例えばクロマトグラフィーによって精製された酵素として使用することができる。
【0058】
さらなる後処理なしの発酵槽ブロスとしての、発酵槽ブロスからの細胞の再単離後の細胞懸濁液としての、又は細胞懸濁液の機械的破壊後の細胞ホモジネートとしての、又は化学的透過性細胞（例えば、クロロホルムによる）の形態でのＯＡＳスルフヒドリラーゼの使用が好ましい。
【0059】
発酵槽ブロスからの細胞の再単離後の細胞懸濁液又は細胞ホモジネートとしてのＯＡＳスルフヒドリラーゼの使用が特に好ましい。
【0060】
特に好ましい実施形態では、発酵槽ブロスから単離され、再懸濁された生産株の細胞がＯＡＳスルフヒドリラーゼとして使用される。
【0061】
特に好ましい実施形態では、Ｌ－システイン酸の製造方法は、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ及びＯＡＳの両方が発酵によって生成される。
【0062】
本発明による生体内変換方法の反応物質としてのＯＡＳは、約ｐＨ７のｐＨからＮ－アセチル－Ｌ－セリンに異性化し、その後サルファイトとの反応にもはや適しておらず、Ｌ－システイン酸を形成する。反応の機序は、Ｔａｉ他（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２３１１－１２３２２で研究され、アシル基のカルボニル炭素上の脱プロトン化アミノ基による分子内求核攻撃を伴う。この反応は、ｐＨが低下すると抑制されるため、化合物は例えばｐＨ４．０で安定である。
【0063】
したがって、本発明による生体内変換方法は、Ｌ－システイン酸を形成するためのＯＡＳの反応が、ＯＡＳのＮ－アセチル－Ｌ－セリンへの異性化を最小限に抑えるｐＨ条件下で行われるという事実によって区別される。
【0064】
好ましくは、本方法は、反応が、少なくとも５．５であり、≦７．５、特に好ましくは≦７．０、特に好ましくは≦６．５であるｐＨ値で行われる。
【0065】
生体内変換方法のさらに好ましい実施形態では、基質ＯＡＳは、いわゆる供給工程においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ及びサルファイトからなる反応バッチに計量供給される（実施例５）。計量供給されるＯＡＳは、Ｎ－アセチル－Ｌ－セリンへの異性化を抑制するｐＨ、好ましくはｐＨ≦６．５、特に好ましくはｐＨ≦６．０、特に好ましくはｐＨ≦５．５に設定される。同時に、反応バッチ中のｐＨは、反応を促進してＬ－システイン酸を形成するように調整される。
【0066】
式（２）によれば、Ｌ－システイン酸を形成するためのＯＡＳの反応は、化学量論量の酢酸を放出し、反応が進行するにつれてバッチ中のｐＨの低下をもたらし得る。ｐＨが低すぎるとＯＡＳスルフヒドリラーゼの活性に影響を及ぼすため、ｐＨの過度の低下を防ぐ必要がある。これは、バッチ中の適切な高濃度緩衝液によって受動的に行うことができ、又は測定及び制御ユニットによって能動的に達成することができる。
【0067】
実施例５に開示されているように、ｐＨが目標値から逸脱した場合に、アルカリ溶液又は酸の計量添加によって所望のｐＨを回復させる、測定及び制御ユニットによる活性ｐＨ制御が好ましい（いわゆるｐＨスタット法）。
【0068】
反応温度は、好ましくは５～７０℃の間で選択される。１０～６０℃の反応温度が好ましく、１５～５０℃が特に好ましく、２０～４０℃が特に好ましい。
【0069】
Ｌ－システイン酸の製造方法は、好ましくは水性環境で行われ、すなわち、反応に使用される溶媒は好ましくは水である。
【0070】
Ｌ－システイン酸を製造するための本発明による方法は、不連続操作又は連続操作で行うことができる。不連続操作（バッチ操作）では、反応の過程で全ての反応物をバッチに添加し、反応が終了した後にバッチを後処理する。連続操作では、ＯＡＳ、ＯＡＳスルフヒドリラーゼ及び亜硫酸塩を反応中に絶えず計量投入し、生成物Ｌ－システイン酸を含有する溶液をバッチから同時に除去する。確立されるのは、反応物が反応容器内の滞留時間中に完全に反応して生成物Ｌ－システイン酸を形成することができるように反応物が計量供給される定常状態である。非天然アミノ酸の連続生産のための方法は、例えば、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示されている。
【0071】
Ｌ－システイン酸を製造するための本発明による方法の不連続操作が好ましい。
【0072】
好ましくは、本方法は、亜硫酸塩の濃度が、ＯＡＳに対して少なくとも等モル濃度、特に好ましくは少なくとも１．５倍モル過剰、特に好ましくは少なくとも２倍モル過剰、さらに好ましくは少なくとも５倍モル過剰である。
【0073】
バッチ中のＯＡＳ濃度は、好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは少なくとも４０ｇ／Ｌである。
【0074】
ＯＡＳの生体内変換において、使用されるＯＡＳのモル量に基づくＬ－システイン酸のモル収率は、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％である。
【0075】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、実施例によって制限されることはない。
【実施例】
【0076】
［実施例１］
ＯＡＳの生成
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用した。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成した。発酵終了時に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を使用してｐＨを４．５に設定することによってＯＡＳを安定化した。４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって細胞を除去した。発酵上清中のＯＡＳのＨＰＬＣ測定含量は１５．３ｇ／Ｌであった。
ＯＡＳの生成
ＥＰ１２３３０６７Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １３４９５の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６を使用した。ＯＡＳは、ＥＰ１２３３０６７Ｂ１に記載されているように発酵によって生成した。発酵終了時に、２１％（ｖ／ｖ）リン酸を使用してｐＨを４．５に設定することによってＯＡＳを安定化した。４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって細胞を除去した。発酵上清中のＯＡＳのＨＰＬＣ測定含量は１５．３ｇ／Ｌであった。
【0077】
ＯＡＳ及びＬ－システイン酸のＨＰＬＣ分析：
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍＭ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍＭ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
【0078】
溶離液Ａ：２５ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．０。溶離液Ｂ：メタノール。分離は、グラジエントモード、１０％溶離液Ｂから６０％溶離液Ｂまで０～２５分間かけて、続いて６０％溶離液Ｂから１００％溶離液Ｂまで２分間かけて、続いて１００％溶離液Ｂまで０．５ｍｌ／分の流速でさらに２分間行った。Ｌ－システイン酸の保持時間：３．２分。ＯＡＳの保持時間：１７．０分。
【0079】
［実施例２］
酵素ＣｙｓＭの製造
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を使用した。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコ内での増殖と発酵の両方によって生成された。
酵素ＣｙｓＭの製造
ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に開示され、ブダペスト条約に従ってＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にＤＳＭ １４０８８の番号で寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を使用した。ＣｙｓＭ酵素は、振盪フラスコ内での増殖と発酵の両方によって生成された。
【0080】
Ａ）振盪フラスコ内での増殖：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の前培養物をＬＢａｍｐ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン（ＧＩＢＣＯ（商標））、５ｇ／ｌの酵母抽出物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））中で調製した（３７℃及び１２０ｒｐｍで一晩増殖）。２５ｍｌの前培養物を、２５０ｍｌのＬＢａｍｐ培地（バッフル付きの１Ｌ三角フラスコ）の主培養物の接種材料として使用した。主培養物を３０℃及び１１０ｒｐｍで振盪した。４時間後、１．０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００に達した（ＯＤ６００：６００ｎｍでの吸光度の測定による細胞懸濁液１ｍｌ当たりの細胞密度の測光的測定；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＧｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）。次いで、誘導剤テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度３ｍｇ／Ｌ）を添加し、増殖を３０℃及び１１０ｒｐｍでさらに２０時間継続した。増殖終了時、細胞密度ＯＤ６００は３／ｍｌであった。
【0081】
Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株を用いたＣｙｓＭの発酵生産は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１に開示されている。発酵からの細胞を４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）によって除去し、細胞密度ＯＤ６００が９０／ｍｌになるようにＫＰｉ６．５緩衝液（０．１Ｍ Ｋホスフェート、ｐＨ６．５）に懸濁した。
【0082】
振盪フラスコ増殖又は発酵からの細胞を、さらなる使用のために遠心分離（１５０００ｒｐｍで１０分、ＳＳ３４ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）によって単離した。細胞ホモジネートの製造のためのさらなる使用のために、後述するように、細胞ペレットを細胞懸濁液としてＫＰｉ６．５緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液は、細胞密度ＯＤ６００が３０／ｍｌになるのに十分な量のＫＰｉ６．５緩衝液を使用することによって調製した。例えば、３／ｍｌのＯＤ６００を有する振盪フラスコ増殖からの細胞５０ｍｌを遠心分離し、５ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（１０倍濃度）に再懸濁するか、又は９０／ｍｌのＯＤ６００を有する発酵からの細胞１ｍｌを３ｍｌのＫＰｉ６．５緩衝液（３倍希釈）に再懸濁した。
【0083】
これにより、発酵槽ブロスから単離され、再懸濁された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の細胞が生成され、これを本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼＣｙｓＭとして以下で使用した。
【0084】
細胞ホモジネートを調製するために、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製のＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（商標）５Ｇ細胞ホモジナイザを使用した。３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００を有するＫＰｉ６．５緩衝液中の１ｍｌの細胞懸濁液を、ガラスビーズ（「溶解マトリックスＢ」）を含有する製造業者によって組み立てられた１．５ｍｌチューブ内で破壊した（間隔の間に毎回３０秒の休止を設けて６０００ｒｐｍの振盪周波数で３×２０秒）。得られた細胞ホモジネートを、本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として直接使用するか、又は細胞抽出物の調製に使用した。
【0085】
細胞抽出物を調製するために、得られた細胞ホモジネートを遠心分離し（１５０００ｒｐｍで１０分間、ＳＳ３４ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心分離機）、上清を細胞抽出物と称し、本発明による方法においてＯＡＳスルフヒドリラーゼ（ＣｙｓＭ酵素）として使用するか、又はＣｙｓＭ酵素活性の測定にさらに使用した。
【0086】
細胞抽出物のタンパク質含有量は、「Ｑｕｂｉｔ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」を製造業者の説明書に従って使用し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＱｕｂｉｔ ３．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによって決定した。振盪フラスコ増殖からの細胞抽出物のタンパク質含有量は５．３ｍｇ／ｍｌであった。発酵からの細胞抽出物のタンパク質含有量は４．０ｍｇ／ｍｌであった。
【0087】
ＣｙｓＭ酵素活性は、ＥＰ１２４７８６９Ｂ１（Ｗａｃｋｅｒ）に記載されているように決定した。この目的のために、ＯＡＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｎａ２Ｓ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株増殖からの細胞抽出物の存在下、３７℃でインキュベートした。ＫＰｉ６．５緩衝液中のアッセイ（最終体積０．４ｍｌ）は、１０ｍＭのＯＡＳ（５００ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の２００ｍＭ原液からの添加）、１０ｍＭ硫化ナトリウムＮａ２Ｓ及び５μｌのＣｙｓＭ含有細胞抽出物を含有していた。ＣｙｓＭ反応で生成されたシステインを、ニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、Ｇａｉｔｏｎｄｅ（１９６７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０４：６２７－６３３による方法に従って測定した。振盪フラスコ内での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の増殖からの細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５７．１Ｕ／ｍｌであった。振盪フラスコ増殖からの細胞（３／ｍｌのＯＤ６００）は細胞抽出物の調製のために１０倍濃縮されていたので、振盪フラスコ増殖からの細胞における酵素活性は５．７Ｕ／ｍｌであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物中のＣｙｓＭ酵素活性は５８．１Ｕ／ｍｌであった。発酵からの細胞（９０／ｍｌのＯＤ６００）は、細胞抽出物の調製のために３０／ｍｌのＯＤ６００に希釈されていたので、発酵槽細胞の濃縮（９０／ｍｌのＯＤ６００）細胞懸濁液中の酵素活性は１７４．４Ｕ／ｍｌであった。
【0088】
振盪フラスコ内の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株増殖からの細胞抽出物の比ＣｙｓＭ酵素活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１０．８Ｕであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵後の細胞抽出物の比ＣｙｓＭ酵素活性は１４．５Ｕ／ｍｇであった。細胞抽出物の調製中にＣｙｓＭ活性が細胞から完全に放出されたと仮定すると、細胞抽出物で測定されたＣｙｓＭ酵素活性は、以下の実施例でＣｙｓＭ細胞懸濁液に存在する酵素活性と同等であった。
【0089】
１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性は、１ｍｌの細胞抽出物中のアッセイ条件下でのＯＡＳ及びＮａ２Ｓからの１μｍｏｌ／分のシステイン生成（体積活性）と規定される。タンパク質１ｍｇ当たりのＵでの比ＣｙｓＭ酵素活性は、細胞抽出物の体積活性（Ｕ／ｍｌ）を細胞抽出物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって得られ、細胞抽出物中のタンパク質１ｍｇに基づくＵでのＣｙｓＭ酵素活性と規定される。
【0090】
［実施例３］
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
２つのバッチを並行して行った：
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、最初にＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５）８．２５ｍｌを装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２ＳＯ３の０．２Ｍ溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性を有する（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）（実施例２Ａからの）振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞抽出物０．４ｍｌ、及び０．５Ｍコハク酸Ｎａ、ｐＨ５．５中のＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液３５０μｌを連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
２つのバッチを並行して行った：
バッチ１：１００ｍｌの三角フラスコに、最初にＮａＰｉ６．５緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５）８．２５ｍｌを装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２ＳＯ３の０．２Ｍ溶液１ｍｌ、５７．１Ｕ／ｍｌの活性を有する（バッチ中の最終濃度２．３Ｕ／ｍｌ）（実施例２Ａからの）振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞抽出物０．４ｍｌ、及び０．５Ｍコハク酸Ｎａ、ｐＨ５．５中のＯＡＳ×ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液３５０μｌを連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。
【0091】
バッチ２：バッチ（Ｎａ２ＳＯ３を含まない比較バッチ）はバッチ１と同じ組成を有していた。Ｎａ２ＳＯ３溶液の代わりに、バッチ２には１ｍｌのＮａＰｉ６．５緩衝液を加えた。
【0092】
両方のバッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。１時間及び３時間後、各場合のバッチ１ｍｌを８０℃で５分間インキュベートして反応を停止させ、遠心分離し、上清をＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣにより検出されたＬ－システイン酸の量を表１に示す。
【0093】
表１：市販のＯＡＳ及びＮａ２ＳＯ３並びにＣｙｓＭ含有細胞抽出物を使用した、反応時間によるＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸。
【0094】
【表1】
【0095】
［実施例４］
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた、発酵からのＯＡＳ含有培養上清及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
１００ｍｌの三角フラスコに、（実施例１からの）ＯＡＳ含有量１５．３ｇ／Ｌを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の発酵からの細胞培養上清１ｍｌを最初に装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、Ｎａ２ＳＯ３のＮａＰｉ６．５緩衝液中１Ｍ溶液１ｍｌ、及び振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００；５７．１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性）を連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、１ｍｌのバッチを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＯＡＳ及びＬ－システイン酸の含有量についてＨＰＬＣで分析した。経時的な反応の経過を表２に要約する。
振盪フラスコ培養で生成したＣｙｓＭを用いた、発酵からのＯＡＳ含有培養上清及びＮａ２ＳＯ３からのＬ－システイン酸の製造
１００ｍｌの三角フラスコに、（実施例１からの）ＯＡＳ含有量１５．３ｇ／Ｌを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の発酵からの細胞培養上清１ｍｌを最初に装入し、ＮａＰｉ６．５緩衝液６ｍｌ、Ｎａ２ＳＯ３のＮａＰｉ６．５緩衝液中１Ｍ溶液１ｍｌ、及び振盪フラスコ増殖からのＣｙｓＭ細胞懸濁液２ｍｌ（実施例２Ａより、３０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００；５７．１Ｕ／ｍｌのＣｙｓＭ酵素活性）を連続して添加した。バッチ体積は１０ｍｌであった。バッチ中のＣｙｓＭ酵素活性は１１．４Ｕ／ｍｌであった。バッチをチェストシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中３７℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、１ｍｌのバッチを８０℃で５分間インキュベートし、遠心分離し、上清をＯＡＳ及びＬ－システイン酸の含有量についてＨＰＬＣで分析した。経時的な反応の経過を表２に要約する。
【0096】
表２：ＯＡＳ含有細胞培養上清、Ｎａ２ＳＯ３及びＣｙｓＭ含有細胞懸濁液を使用したＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸及びＯＡＳ。
【0097】
【表2】
【0098】
［実施例５］
一定ｐＨでのＯＡＳの生体内変換によるＬ－システイン酸の調製製造
０．５Ｌのサーモスタット式二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、３７℃の温度に調整した。
一定ｐＨでのＯＡＳの生体内変換によるＬ－システイン酸の調製製造
０．５Ｌのサーモスタット式二重壁ガラス容器（Ｄｉｅｈｍ）を、ホース接続を介してサーモスタット（Ｌａｕｄａ）に接続し、３７℃の温度に調整した。
【0099】
（実施例２Ｂからの）ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５株の発酵からのＫＰｉ６．５緩衝液中のＣｙｓＭ含有細胞懸濁液５０ｍｌ（９０／ｍｌのＯＤ６００、ＣｙｓＭ酵素活性８７２０Ｕ）、及びＫＰｉ６．５緩衝液中のＮａ２Ｓ２Ｏ５の４００ｇ／Ｌ溶液６．６ｍｌ（１３．９ｍｍｏｌ、分子量１９０．１ｇ／ｍｏｌ）を最初に装入した。溶解形態では、これは２７．８ｍｍｏｌのＮａＨＳＯ３に相当した（後に計量される１５．６ｍｍｏｌのＯＡＳ量に対して１．７８倍モル過剰）。バッチをマグネチックスターラーで撹拌した。バッチにはｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）も装備し、これをｐＨ制御ユニット（ＴｉｔｒｏＬｉｎｅ ａｌｐｈａ滴定装置、Ｓｃｈｏｔｔ）に接続し、これを製造業者の指示に従ってｐＨ－ｓｔａｔモードで操作した。ｐＨ－ｓｔａｔ条件下で、制御ユニットに接続したビュレットから２Ｍ ＮａＯＨを計量添加することによって、反応容器内のｐＨを反応の全期間にわたって設定ｐＨ６．５で一定に保った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６（実施例１）の発酵からのＯＡＳ含有細胞培養上清（ＯＡＳ含有量：１５．３ｇ／Ｌ、２．３ｇ；１５．６４ｍｍｏｌ）１５０ｍｌを、リザーバーからポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ蠕動ポンプ）を介して流速０．３５ｍｌ／分でバッチに計量供給した。
【0100】
反応時間は１９時間であった。バッチは開放反応容器内で実施されたため、バッチ体積は、蒸発による反応完了後に１８５ｍｌであった。反応開始後０．５時間、３時間及び１９時間で、バッチの１ｍｌアリコートをそれぞれ除去し、Ｌ－システイン酸の含有量をＨＰＬＣによって分析した。経時的なＬ－システイン酸の形成を表３に要約する。１９時間の反応時間後、バッチ中のＬ－システイン酸含有量は１２９７０ｍｇ／Ｌ（７６．６５ｍＭ）であり、これは１８５ｍｌのバッチ体積に対する１４．１８ｍｍｏｌのＬ－システイン酸の絶対モル収率に相当した。１５．６４ｍｍｏｌのＯＡＳの使用量に基づいて、これは収率９０．１％に相当した。
【0101】
表３：ＯＡＳ含有発酵上清、ＮａＨＳＯ３及びＣｙｓＭ含有発酵槽細胞の細胞懸濁液を使用した、反応時間によるＨＰＬＣ検出量のＬ－システイン酸
【0102】
【表3】
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－システイン酸の製造方法であって、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン（ＯＡＳ）が、亜硫酸塩の存在下でＯ－アセチル－Ｌ－セリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳスルフヒドリラーゼ、ＥＣ４．２．９９．８）のクラスから選択される少なくとも１つの酵素を使用して変換され、ＯＡＳスルフヒドリラーゼがＣｙｓＭであり、生体内変換が活性ｐＨ制御下で行われ、バッチ中のＯＡＳ濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌである、方法。
【請求項2】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが細菌酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来のＣｙｓＭである、請求項１及び２の一方又は両方に記載の方法。
【請求項4】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが発酵生産に由来する、請求項１～３のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項5】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～４のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項6】
ＯＡＳスルフヒドリラーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～５のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項7】
ＯＡＳが発酵生産に由来する、請求項１～６のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項8】
ＯＡＳが、ＧＭＯではない微生物の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～７のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項9】
ＯＡＳが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の助けを借りて発酵的に生成される、請求項１～８のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項10】
方法が天然産生方法であり、天然産生方法は、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）が方法において使用されておらず、反応物ＯＡＳ及び酵素ＯＡＳスルフヒドリラーゼが天然産生に由来する、すなわち、ＧＭＯを使用して製造されず、化学的に製造されないという事実によって定義される、請求項１～９のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項11】
使用される亜硫酸の塩がＮａ２ＳＯ３、Ｋ２ＳＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ３、なもしくはその無水物Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）又はＫＨＳＯ３である、請求項１～１０のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項12】
亜硫酸塩の濃度が、ＯＡＳに対して少なくとも等モル濃度である、請求項１～１１のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項13】
反応が、少なくとも５．５及び７．５未満のｐＨで行われる、請求項１～１２のうちの一項以上に記載の方法。
【請求項14】
Ｌ－システイン酸が反応バッチから濃縮される、請求項１～１３のうちの一項以上に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】2024-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0077】
ＯＡＳ及びＬ－システイン酸のＨＰＬＣ分析：
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
実施例で分析した化合物の定量には、ＯＡＳ及びＬ－システイン酸についてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用いた。較正に使用した全ての参照物質は市販されていた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から知られているように、ｏ－フタルジアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のために、同じ製造業者からのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを使用した。ＯＰＡ誘導体化生成物ＯＡＳ及びＬ－システイン酸の検出のために、ＨＰＬＣシステムは蛍光検出器を備えていた。検出器は励起波長３３０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍに設定した。カラムオーブン内で４０℃で熱平衡化した、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラム（長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍ）も使用した。
【国際調査報告】