特表 2024-544419 弁尖インプラントの製造及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-29

(54)【発明の名称】弁尖インプラントの製造及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/36 20060101AFI20241122BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20241122BHJP

【ＦＩ】

A61L27/36 130

A61L27/36 320

A61L27/38 100

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537927

(86)(22)【出願日】2022-12-21

(85)【翻訳文提出日】2024-07-22

(86)【国際出願番号】 FR2022052464

(87)【国際公開番号】W WO2023118748

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】2114305

(32)【優先日】2021-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506424209

【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ ボルドー

(71)【出願人】

【識別番号】523405465

【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】516324917

【氏名又は名称】サントル・オスピタリエ・ユニベルシテール・ドゥ・ボルドー

(71)【出願人】

【識別番号】523375467

【氏名又は名称】フォンダシオン ボルドー ユニベルシテ

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カウェッキ，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】ウルー，ニコラ

(72)【発明者】

【氏名】タンボ，ジャン－ブノワ

(72)【発明者】

【氏名】ルベルティ，フランソワ

【テーマコード（参考）】

4C081

【Ｆターム（参考）】

4C081AB13

4C081AB17

4C081BA12

4C081BA14

4C081BA17

4C081CD34

4C081DA02

4C081EA02

(57)【要約】

本発明は、弁尖インプラントの製造、ならびに先天性心疾患、心臓、静脈及びリンパの弁膜症、特にファロー四徴症の治療におけるその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポケット型弁尖インプラントであって、
培養中の細胞、好ましくはヒトによって分泌される細胞外マトリックスと、任意選択で、ポケット領域を形成するようにそれ自体の上に折り畳まれた細胞自体とからなる組織シート片を含み、前記折り畳まれた片の対向する縁部の全て又は一部が互いに接合されており、前記細胞が、遺伝子修飾されているか又は遺伝子修飾されていないヒト胚性幹細胞ではないことを理解する、ポケット型弁尖インプラント。

【請求項2】

前記折り畳まれた片の対向する縁部の全て又はいくつかが、生物学的に修飾された、合成及び／又は組織シート由来の糸又はリボンを用いた縫合によって互いに接合されている、請求項１に記載の弁尖インプラント。

【請求項3】

前記インプラントは、前記ポケット領域内に生体試料及び／又は活性成分を含み、前記生体試料は、遺伝子修飾された又は遺伝子修飾されていないヒト胚性幹細胞ではないことを理解する、請求項１又は２に記載の弁尖インプラント。

【請求項4】

前記生体試料が、対象の弁の少なくとも１つの弁尖に由来する、請求項３に記載の弁尖インプラント。

【請求項5】

方法であって、
ａ）請求項１に記載の組織のシートを培養する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組織の前記シートの片を切断する工程と、
ｃ）工程ｂ）からの前記片をそれ自体の上に１回折り畳んで、ポケット領域を形成する工程と、
ｄ）工程ｃ）からの前記折り畳まれた片の対向する縁部の全て又は一部を接合する工程と、を含む、請求項１に記載の弁尖インプラントを製造するための方法。

【請求項6】

工程ｄ）における前記接合が、修飾された、合成の、及び／又は組織シート由来の生物学的糸又はリボンで縫合することによって行われる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記方法が、工程ｄ）の完全な完了の前に、前記ポケット領域を以前に収集された生体試料及び／又は有効成分で充填する工程ｄ’）を更に含む、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

以前に採取された前記生物学的組織試料が、対象の少なくとも１つの弁尖に由来する、請求項７に記載の方法。S2b$SCa%jl/W

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、弁尖インプラントの製造、ならびに先天性心疾患、心臓、静脈及びリンパの弁膜症、特にファロー四徴症の治療におけるその使用に関する。

【0002】

以下の説明では、括弧［］の間の参照は、本文書の終わりに提示された参考文献のリストを指す。

【背景技術】

【0003】

先天性心疾患は、出生時に存在する心臓の奇形である。その重篤度は、決して心臓機能障がいを引き起こさない非常に軽微な形態から、処置を必要とする非常に重篤な形態まで変化し得る。先天性心疾患は、心臓の室、壁又は弁尖－又は心臓付近の血管－が出生前に正常に発達しない場合に起こる。先天性心疾患の大部分は、２つの広いカテゴリー：シアン発生及び非シアン発生に分類され得る（シアン発生という語は、罹患した患者の皮膚の青みがかった色に由来する）。損傷の重症度は症例ごとに異なる。

【0004】

非シアン発生性先天性心疾患は、様々な奇形から生じ得る。心臓の穴又は中隔欠損（心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、心室中隔欠損症（ＶＳＤ））及び血流の閉塞（狭窄、閉鎖、欠損）。場合によっては、薬剤は患者を治療するのに十分であり得るが、多くの場合、欠陥のある心臓弁は修復される必要がある。ヒト心臓弁の利用可能性は非常に限られている（死体から供給される）か、又は大きさの理由で小児には存在しないので、修復は一般に、生物学的材料、特に動物心膜（特にウシ）から作製され、拒絶及び急速な分解を回避するために通常化学的に処理された（例えばグルタルアルデヒド固定）弁の使用を含む。この戦略は、現在市販されている全てのいわゆる生物学的弁の設計を支持するものであり、その理由は、生物学的弁が動物起源であり、合成支持構造に取り付けられており、多くの場合、一種のステントを含むからである［２０］。しかしながら、この固定は、合成生体材料が移植された場合に観察されるものと同様の「異物反応」（ＦＢＲ）として知られる慢性の非特異的炎症反応を引き起こし、移植合併症の主な原因となる。しかしながら、ＦＢＲは、無傷の動物組織に向けられた特異的拒絶よりもはるかに弱く、したがって固定の利点である。更に、タンパク質を変性させることによって、結合は、通常それらを迅速に分解することができる宿主酵素に対してそれらを非感受性にする。患者の心膜から得られ、したがって化学的固定を必要としないヒト組織の使用は、調査されてきた可能性である［２１］。これは非常に有望であるように思われるが、利用可能性、品質変動性及び品質自体、脆弱性、追加の手術時間、ならびにドナー部位への移植の結果は全て、このアプローチを複雑にし得る変数である。これらの合併症は全て、本発明で提案されたような組織工学による生体膜を使用することによって排除される。

【0005】

生分解性ポリマー材料から、又は精製され、次いでマトリックスとして再構成されたタンパク質から得られると想定される「生物工学フィルム」の使用もまた、［２０］の場合に喚起されている。まず、「フィルム」という用語の使用は、当業者に非常に薄い被覆を示唆する（Ｌｅ Ｐｅｔｉｔ Ｒｏｂｅｒｔ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ：「Ｖｅｒｙ ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ（ｏｆ ａ ｍａｔｅｒｉａｌ）」）。ＰｕｂＭｅｄの文献レビューは、この用語の使用が一般に材料の非常に小さい層を指すことを確認している。そのようなフィルムは、十分な穿刺抵抗を提供するために組織のシートと比較してはるかに薄いので、適切ではないようである。更に、このタイプの材料は、材料分解の現象と新しい組織の生成との間の微妙なバランスに基づくアプローチにおいて使用される。このバランスは、これらの現象が個人ごとに大きく異なることを考えると、制御するのが非常に困難である。しかし、より重要なことは、当業者が、化学的に処理された動物（又は死体）組織から作製された構造、又は動物／ヒト組織細胞外マトリックスから可溶化／精製され、次いで様々な物理的／化学的プロセスによって再構築されたタンパク質から作製された構造のいずれかを意味する「生物工学による」と理解するという事実である。この認識は、著者らが細胞外マトリックスタンパク質（主にコラーゲン）から作製されたマトリックスを１）天然組織又は２）「合成」コラーゲンベースのマトリックスに分けている特許出願ＵＳ２００３０２２９３９４Ａ１［２２］を読むことで確認される。ここで、「合成」とは、「合成組織マトリックス」が記載されている段落７９に記載されているように、よくある「ポリマーから作られる」という意味ではなく、「天然組織から抽出されたタンパク質から作られる」という意味である。

【0006】

ファロー四徴症は、シアン発生先天性心疾患の最も一般的な形態の１つである。それは、先天性心疾患を有する新生児の７～１０％を占め［１、２］、肺動脈弁狭窄症、右室肥大、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、及びオーバーライド大動脈内を合わせ持つ。これらの異常は、拍動心臓の構造及び能力に影響を及ぼし、右室流出路の狭窄（ＲＶＯＴ）をもたらし、究極的には動脈血中の酸素飽和度低下をもたらす。外科的修復は、約６ヶ月齢でＶＳＤを閉鎖し、ＲＶＯＴ狭窄を除去することを含む。７０％を超える症例において、ＲＶＯＴ狭窄は、経弁輪パッチの配置によって矯正され、これは、残念ながら、肺動脈弁漏出をもたらす［３、４］。治療せずに放置すると、この肺動脈弁漏出は、右心室拡張及び機能不全をもたらし、これは、心室性不整脈及び成人期における突然死のリスクの増加に関連する。この乳児集団におけるステント装着生物学的弁又は産業供給機械弁の使用は、完全に不可能なままである［５］。肺動脈弁漏出を制限するために、単尖弁の使用などの技術が開発されている［６］。この弁は、生物学的材料から、特に拒絶を防止するために化学的に処理されたウシ心膜［５］又は合成ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜［６］を使用することによって作製することができる。しかしながら、これらの材料には制限がある。グルタルアルデヒド処理したウシ心膜及び合成膜は、比較的柔軟で、非常に強く、取り扱いが容易であるが、血栓塞栓合併症及び／又は感染性心内膜炎を伴う［７～９］。更に、これらの物質は、慢性炎症反応を引き起こす異物として認識されている。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜も、全ての合成材料と同様に、深刻な感染の原因である。最後に、現在の選択肢は、肺動脈弁漏出を制限する効果のない短期的及び中期的な結果を示している。

【0007】

したがって、記載された悪影響なしに心臓弁などの弁を修復するための新しい材料を開発する真の臨床的必要性が存在する。

【0008】

本発明者らは、ヒト皮膚線維芽細胞によって分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から構成される完全に生物学的な生体材料を使用することを提案し、これは真に生体適合性である［１０～１３］。その顕著な生物学的適合性は、ＥＣＭの構造に由来し、これは、それが構成されるタンパク質の生物学的又はヒューマン・ネイチャーの利点に加えて異なる利点を示す。移植中、身体の免疫系は、その「適応」免疫系のおかげでタンパク質の外来起源を認識することができるが、その「自然」免疫系のおかげで異常な（又は「変性した」）ＥＣＭ構造も認識することができる。結果として、ＥＣＭが物理的、熱的、又は感染性外傷によって損傷を受けた場合、身体は、マクロファージ型細胞を使用して損傷を受けたＥＣＭを迅速に消化して、特殊化した線維芽細胞型細胞がＥＣＭを再構築することを可能にすることができる。これは、物理的／化学的方法によって製造されたコラーゲンマトリックスが生体に移植されるときに働く機構である。それは、「生理学的」構造ではなく、むしろ変性構造を有するので、自然免疫系によって急速に分解される［２３～２５］。ＥＣＭが実験室において培養細胞によって産生され、その後化学的に処理されないという事実は、ＥＣＭの構造が、宿主によってそれが「受容」されることを可能にするために、又は言い換えれば、それを破壊するであろう先天性免疫応答を誘発しないために、生理学的構造に十分に近いことを意味する。それは、組織（ヒト又は動物）から抽出されたタンパク質から物理的／化学的方法によって生成された全ての他のマトリックスからそれを区別するこの構造的特徴である。更に、培養フラスコの表面上にシート形態で産生されるこのＥＣＭは、取り扱いが容易であり、６～８週間の培養後に機械的に強固である［１３、１４］。化学的処理（例えば、架橋など）なしで達成されるこの堅牢性は、多数の他のマトリックスタンパク質と組み合わされた密に組織化されたコラーゲン原線維のマトリックスを産生する培養細胞によって形成されるＥＣＭにも起因する［２６～２７］。最後に、実験室で細胞によって産生されるこのＥＣＭの構造も、哺乳動物から直接採取された組織から得られるＥＣＭの構造とは異なることに留意すべきである。これは、ｉｎ ｓｉｔｕで採取された組織が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭシートには存在しない多数の構造体（毛、神経、血管及びリンパ管、腺、膜、リミッターなど）を含むためである。更に、これらの採取された組織は多数の細胞型を含有するが、インビトロで産生されたＥＣＭシートは単一の細胞型（典型的には線維芽細胞）のみを含有する。結果として、生成された弁尖インビトロは、構造及び組成に関して、回収された組織インビボよりもはるかに均質である。これは、機械的利点及び生物学的利点の両方を有し得る。更に、弁尖は、そのインビトロ調製様式のために、より大きな再現性を提供し、これは、商業的生産状況における品質管理の観点から有利であり得る。その結果、この材料の構造は非常に特殊であり、弁尖を製造するために使用される他の材料と区別される。

【0009】

この生体材料は、ヒトにおける血管用途において既に使用されている［１５～１８］。これに関連して、ＥＣＭのシートを巻き上げ、融合させて血管を形成し、次いでこれを末期腎不全に罹患している患者に移植した［１７、１８］。移植結果は、高い割合の経腔的開存性（３年まで）を示した［１７、１８］。更に、この研究は、合成成分なしで構築されたＥＣＭシートが、天然組織と実際に一体化し得、宿主細胞によって再構築され得、そして感染に対して耐性であり得ることを実証した。その生物学的構造、ヒト起源及び化学的処理（例えば、グルタルアルデヒド固定）の非存在は、この生体材料が、動物組織由来のＥＣＭとは異なり、拒絶、迅速な分解又は慢性炎症の危険性なしに患者によって受容されることを可能にし、このＥＣＭは、それらの異種起源をマスクするために常に化学的に処理され、変性マトリックスを破壊するために分泌される宿主酵素の分解作用を遅くする。更に、データは、同種異系線維芽細胞（レシピエントとは異なるドナー由来）によって産生される生体材料が、特異的な適応免疫応答を誘導しないことを示している［１５］。更に、ＥＣＭのシートを複数のリボンに切断することによって、新世代の生物学的糸が製造されている。これらのリボンは、リボンとは異なる機械的特性を有するより高密度の糸を形成するために撚られ得る［１４］。最近の研究は、これらのＥＣＭ糸又はリボンを皮膚創傷閉鎖のための縫合糸として使用することの実現可能性を実証している［１４］。

【0010】

最大２～６ｋｇｆの穿刺抵抗を有するこの生体材料［２６］は、管状構造と、前記構造に接続された少なくとも２片のＥＣＭシート（カスプ又は弁尖）とを含む弁インプラントの構築にも使用されている。シートは、上で定義した通りである（国際出願ＷＯ ２０１２３／１４２８７９からの「単層組織シート」を参照）［１９］。この生物学的インプラントは、先天性心疾患、特にファロー四徴症の小児における弁尖修復のために提案されたことはない。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、培養中の細胞、好ましくはヒト細胞によって分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及びおそらく細胞自体から構成される組織のシート（以下、ＥＣＭシートとも呼ばれる）と、合成及び／又は同じ生物学的材料に由来する修飾された生物学的糸又はリボンとの組合せを含むか又はそれからなる生物学的インプラントを提案することによって、この必要性に正確に対処する。この生物学的インプラントは、組織再生を最適化するために、移植前に生物学的試料及び／又は有効成分が挿入され得るポケット型弁尖インプラントを作製するために使用される。

【0012】

この目的のために、本発明者らは、上記で定義したＥＣＭシートから完全に生物学的な弁尖インプラント（図１）を製造するための方法を開発し、そこから、ポケット型弁尖を形成するためにそれ自体の上に１回折り畳まれた片を切断した。並行して、ＥＣＭシートもリボンに切断して生物学的ＥＣＭ糸を製造した。片及びＥＣＭ糸又はリボンが得られたら、任意選択で、生細胞を含有する天然の肺動脈弁の弁尖又は弁尖を抽出し、微粒子化し、ポケット形状の弁尖内に配置した。次いで、ポケットを閉じ、生物学的又は合成縫合糸又はテープを使用して肺流出路で構造体を縫合した。ポケットクロージャによって形成された２つのシート層間の空間は、細胞、組織断片又は有効成分で充填されることを可能にするために封止／融合されていない。この革新的な組合せは、宿主によって容易に受け入れられることができ、宿主細胞によってコロニー形成されることができ、移植後に再構築されることができ（例えば、ファロー四徴症のために治療された成長中の小児によって）、かつ患者内で変化することができる完全に生物学的な弁尖インプラントの製造を可能にした。言い換えれば、この弁尖インプラントは、成長する可能性を有し、これは、高い死亡率を伴う開心術による除去及び置換を必要とする従来技術のインプラント（例えば、ステント、固定動物心膜、ポリマーフィルム、又は単離及び再構成されたタンパク質から作製された生物工学フィルムを有する）とは異なる。したがって、本発明による弁尖インプラントは、小児用途の可能性を有する。

【0013】

このＥＣＭのヒューマン・ネイチャー及び準天然構造は、その分解を防止するため又はそれを補強するための固定の必要性を取り除き、本発明による弁尖インプラントが、拒絶又は２週間で目に見える血管新生を伴う慢性的炎症なしに、レシピエント患者によって受け入れられることを可能にする。これは、動物又は合成起源の材料から作製された弁又は弁尖よりも優れた有効性及び耐久性を約束する。再構成されたＥＣＭを使用することは、数週間以内に完全な分解及び装置の故障をもたらすか、又はそれを、弁尖装置の合併症及び故障の原因である慢性炎症の原因にする化学的処置を必要とする。

【0014】

細胞によって分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のシートの製造
細胞は、培養培地を有する基材上に播種され、長い培養期間後にＥＣＭシートを生成する。ＥＣＭシートは、保存のために任意に処理される。ＥＣＭシートは、固定装置を使用して基材から分離されてもされなくてもよい。この装置は、保存のための培養及び処理中の組織収縮を防止する。最後に、ＥＣＭシートを片のＥＣＭシートに切断する。

【0015】

細胞はヒト起源であり得る。細胞は、自己由来又は同種異系であり得る。細胞型は、例えば、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、初代成体間葉系細胞（皮膚線維芽細胞など）、不死化細胞、又はそれらの混合物であってよい。

【0016】

播種濃度は細胞型に依存し、１０００細胞／ｃｍ２～１０万細胞／ｃｍ２の範囲であり得る。

【0017】

基材は、標準的なプラスチック培養フラスコ、感熱性培養フラスコ、異なる又は類似のＥＣＭ（例えば、自己ヒト、同種異系ヒト、異種ＥＣＭなど）、処理された生体膜（例えば、様々な起源の化学的に処理された心膜、羊膜など）、合成膜（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ダクロン、シリコーンなど）、ヒドロゲル（例えば、コラーゲン、アルギン酸塩、フィブリンなど）、上記基材のハイブリッドから選択することができる。基材は、細胞接着を促進するために、接着タンパク質（例えば、ＲＧＤペプチド、フィブリンなど）又はゼラチンでコーティングすることができる。基材は、所望のＥＣＭシートフォーマットを得るために、異なる形状（例えば、カスタマイズされた、円形、長方形、正方形、三角形、八角形、五角形など）を有することができる。

【0018】

培養培地は、ＥＣＭ産生及び組み立てのためのアスコルビン酸化合物及び血清を含有するが、これらに限定されない。その組成は細胞型に依存し、典型的には週に３回変更される。培養期間は４～２４週間、好ましくは１６～２０週間、より好ましくは６～８週間で変化する。

【0019】

貯蔵のために、ＥＣＭは、未処理、脱水、失活（ＥＣＭシートを－８０℃で凍結し、それを室温で解凍し、それを好ましくはヒュームフードの無菌流下で室温で一晩脱水し、最後にそれを使用前に室温で再水和することからなる方法）、脱細胞化、グルタルアルデヒド溶液で処理、又はそれらの組合せであり得る。脱細胞化ＥＣＭは、上記の細胞で再細胞化され得るか、又は自己細胞もしくは同種異系細胞（例えば、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪組織由来間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、微小血管細胞など）を使用して内皮化され得る。処置に応じて、ＥＣＭは、－８０℃、－２０℃、４℃又は室温で保存することができる。固定装置は、滅菌ステンレス鋼ホルダー、滅菌プラスチックホルダー、滅菌紙ホルダーであってよく、培養フラスコに依存する。

【0020】

このＥＣＭシートは、天然組織ではなく、天然組織から抽出されたタンパク質から生成され、組織生物工学に由来する組織に再構成された合成組織でもない。このＥＣＭシートは、培養中の細胞によって組み立てられる。結果は、生理学的構造を有するヒトＥＣＭの非固定シートである。これらの理由により、ＥＣＭシートは、有意な機械的強度を有し、免疫／炎症反応を引き起こさず、レシピエント細胞と正常に相互作用して、分解プロセスではなくゆっくりとしたリモデリングを可能にすることができる。

【0021】

ＥＣＭから糸又はリボンを製造する
ＥＣＭシートは、ワイヤを形成するために撚られ得る（例えば、０～１０回／ｃｍ）リボンに切断される。ＥＣＭシートは、離間した円形刃を有する機械、レーザーシステム、超音波システム、電気アークシステム、外科用メスの刃、又はハサミを用いて切断することができる。リボンは、０．１～１０ｍｍ幅であってよく、長さは使用される基材に依存する。リボンは、所望の形式で培養フラスコ上に直接形成することができる。リボンは、それらの特性を変更するために撚られ得る。少なくとも２つのリボンは、それらの機械的特性を改善するために、撚り方法、生物学的接着剤、培養ＥＣＭ堆積、又はそれらの組合せを使用して互いに接合され得る。次いで、糸又はリボンを外科用針に取り付けることができる（例えば、眼に結ぶ；目は、糸又はリボンを針に固定するために圧着され得る）。

【0022】

貯蔵のために、糸又はリボンは、未処理、脱水、失活、脱細胞化、グルタルアルデヒド処理、又はそれらの組合せであり得る。脱細胞化糸又はリボンは、上記の細胞で再細胞化され得るか、又は自己細胞もしくは同種異系細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ、血液の血管間質画分由来の細胞、微小血管細胞など）を使用して内皮化され得る。処理に応じて、糸又はリボンは、－８０℃、－２０℃、４℃又は室温で保存することができる。

【0023】

これらの糸又はリボンは、炎症反応を引き起こす可能性が低く、再成形することができる。これは、一般に永久プラスチック（例えば、ポリプロピレン）から作製される従来の縫合糸とは異なり、合併症を回避するのに役立ち、合併症が小児と共に成長することを可能にすることができる。

【0024】

粒子の生成及び挿入
生細胞を含有する粒子を微粒子化し、ポケット形弁尖インプラントの内側に配置することができる。

【0025】

例えば、粒子は以下のものに由来し得る。天然肺動脈弁尖、天然真皮（自己、同種異系又は異種）、組織工学的ＥＣＭ、任意の組織工学的マトリックス、細胞懸濁液（初代細胞
、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）など）、細胞凝集体（例えば、スフェロイド、オルガノイド）、細胞外小胞もしくは活性成分（例えば、薬物）、又はそれらの組合せ。

【0026】

粒子は、離間した円形ブレードを有する機械、レーザーシステム、超音波システム、電気アークシステム、外科用メスの刃、ハサミ、又はグラインダーを用いて得ることができる。

【0027】

粒子は、スプーン（外科用器具）、ピペット、又は注射器を使用してバッグ内に配置することができる。

【0028】

したがって、一態様によれば、本発明は、ポケット型弁尖インプラントに関し、
培養中の細胞、好ましくはヒトによって分泌される細胞外マトリックスと、任意選択で、ポケット領域を形成するように一回それ自体の上に折り畳まれた細胞自体とからなる組織シート片であって、前記折り畳まれた片の対向する縁部の全て又は一部が互いに接合されている、組織シートの片を含む。

【0029】

本発明の目的のために、「弁尖」は、流体（好ましくは血液）とともに移動して、流体が一方向に流れることを可能にし、流体が他方向に流れることを防止する組織のシートからなる弁の部分を意味する。弁には、１つであってもよいが、より一般的には２つもしくは３つ、又は更に多くの弁尖が存在してもよい。

【0030】

本発明の目的のために、「ポケット型弁尖」は、その中に配置され得る１つ以上の物体（例えば、細胞、組織の小片、生体材料粒子など）を保持するための中空構造を含む弁尖である。

【0031】

本発明の目的のために、「培養中の細胞（好ましくはヒト）によって分泌される細胞外マトリックスからなる組織シート」は、容器の底壁の内表面上に蓄積する不溶性タンパク質の堆積物を意味し、この容器中で、この堆積物に有利な条件下で細胞が培養される。より具体的には、この堆積物が表面から分離されるとき、それは組織シートである。

【0032】

本発明の目的のために、「ポケット領域」は、片のＥＣＭシートを折り畳み、前記片の対向する縁部の全て又は一部を閉じることによって生成される空の空間（中空構造）を意味する。

【0033】

本発明の目的のために、「対向する縁部」は、隣接する平坦部分が本質的に平行であり、それらが接合され得るような方法で互いに寄りかかるＥＣＭシート片の縁部として定義される。

【0034】

本発明の特定の実施形態によれば、前記折り畳まれた片の対向する縁部の全部又は一部は、本明細書で定義されるような生物学的に修飾された（絹、キトサン、コラーゲン、動物腸壁など）、合成及び／又は組織シート由来の糸又はリボンを用いた縫合によって一緒に接合される。

【0035】

本発明の目的のために、「（合成）糸又はリボン」は、外科手術又は医療装置の調製のために使用される化学的に合成された材料から作製された糸又はリボンを意味する。

【0036】

本発明の特定の実施形態によれば、前記インプラントは、ポケット領域内に生体試料及び／又は有効成分を含む。

【0037】

本発明の意味における「生体試料」は、好ましくは、手術室において一般的な手術道具（例えば、ハサミ）を使用して取り出され、小片に切断された患者の機能不全の弁尖の一部である。片のサイズは変化してもよい。これらの片は、組織に再定着する細胞集団を提供するために弁ポケット領域に配置される生体試料である。他の組織（例えば、真皮、結合組織、骨髄、血管、血液、脂肪組織など）が使用され得る。他の細胞供給源（例えば、同じ患者由来であるが、インビトロで培養され、異なる処理（例えば、分化又は脱分化）を受け得る細胞）が想定される。これらの細胞は、身体の異なる部分に由来し得る。それらは、より大きな又はより小さなクラスター（オルガノイド）に組み立てることができる。いくつかの細胞型を組み合わせることができる。細胞はまた、広範な送達戦略に従って、それらの生存又は機能を増強するために、１つ以上の生体材料（生物学的又は合成）と組み合わせられ得る。細胞はまた、別の個体（同種異系）又は種（異種）に由来し得る。上記の選択肢は組み合わせることができる。

【0038】

本発明の目的のために、「有効成分」は、例えば、患者自身の細胞の移動又は増殖を促進して、より迅速又はより効果的な組織再定着を達成することによって、弁尖機能に対して正の効果を有する薬理学的（非生物）薬剤を意味する。薬理学的薬剤はまた、抗血栓効果を有し得る。

【0039】

本発明の特定の実施形態によれば、生体試料は、対象の弁の少なくとも１つの弁尖に由来する。

【0040】

本発明の意味における「弁」は、その管腔内に、流体が一方向に流れることを可能にするが他方向には流れない１つ以上の弁尖を有する管状構造である。

【0041】

別の態様によれば、本発明は、本発明による弁尖インプラントを製造するための方法に関し、前記方法は、
ａ）上記で定義したような組織のシートを培養する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組織の前記シートの片を切断する工程と、
ｃ）工程ｂ）からの前記片をそれ自体の上に１回折り畳んで、ポケット領域を形成する工程と、
ｄ）工程ｃ）からの前記折り畳まれた片の対向する縁部の全て又は一部を接合する工程と、を含む。

【0042】

本発明の方法の特定の実施形態によれば、工程ｄ）の接合は、本発明において定義されるような生物学的に修飾された、合成の、及び／又は組織シート由来の糸又はリボンで縫合することによって達成される。

【0043】

本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記方法は、工程ｄ）の完全な接合の前に、ポケット領域を生体試料及び／又は有効成分で充填する工程ｄ’）を更に含む。

【0044】

本発明の方法の特定の実施形態によれば、生体組織試料は、対象の弁の少なくとも１つの弁尖に由来する。

【0045】

本発明の更に別の態様によれば、本発明による弁尖インプラントは、薬剤として使用するためのものである。

【0046】

本発明の更に別の態様によれば、本発明による弁尖インプラントは、先天性心疾患、心臓、静脈及びリンパ弁膜症から選択される病態の治療に使用するためのものである。

【0047】

本発明の特定の実施形態によれば、先天性心疾患はファロー四徴症である。

【0048】

本出願に開示されるものに対する他の利点もまた、例示のために与えられる以下の実施例を読むことによって当業者に明らかであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】本発明による弁尖インプラントを製造する方法を示す。

【図2】長さ２．４ｍ、幅５ｍｍの生物学的リボンを切断するために使用されるパターンを示す。

【図3】生物学的縫合糸の圧着に関与する工程を示す。水和した生物学的リボンを、一端で約２ｃｍの長さにわたって５回転／ｃｍで撚り、糸を形成する。この段階の間、撚られた領域を、完全に乾燥するまで穏やかにマッサージして、撚りを分散させ、均一な直径を有する乾燥糸を得る。次いで、この均質なゾーンは、圧着される外科用針の目に挿入される。

【図4】すぐに使える水和した生物学的縫合糸を示す。

【図5】ポケット形弁尖を製造するのに必要な工程を示す。（Ａ）楕円形（縦８ｃｍ、横３ｃｍ）のパターン（黒実線）を含む切断面に、培養細胞が分泌したＥＣＭ（水和）からなるシート状の組織を載せて乾燥させる。（Ｂ）乾燥したら、組織のシートをパターンに切断する。（Ｃ）組織を滅菌水溶液で再水和する。（Ｄ－Ｅ）いったん再水和されると、組織のシートの片は、切断支持体から分離され、黒色点線に沿ってそれ自体の上に折り畳まれ、ポケット形状弁尖を形成することができる。

【図6】図４に示される生物学的縫合糸を使用してオーバーロックステッチで閉じられたポケット形弁尖を示す。

【実施例】

【0050】

実施例１：完全に生物学的な弁尖インプラントを製造するための方法及びその特徴
この実施例は、完全に生物学的な弁尖インプラントを製造するためのアプローチを記載する。この例では、結果として得られる弁尖は、生きていない（失活した）組織から構成され、無菌状態で製造され、これにより、最終滅菌又は固定工程の使用が排除される。全ての組み立て工程は、無菌流体及び器具を使用して無菌環境で行われる。この説明は、弁尖の製造方法、細胞型、細胞源、細胞齢、細胞株、培養条件、シートもしくはシート片の形状、シートもしくはシート片の数、縫合材料、縫合方法、又は弁尖の使用目的に関して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本方法に対して様々な修正を行うことができることを容易に理解するであろう。

【0051】

この実施例では、Ｔ－２２５ｃｍ２フラスコ中で正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養することによって組織シートを得た。各フラスコについて、細胞を１万細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ウシ血清（２０％）及びアスコルビン酸ナトリウム（５００ｍＭ）からなる培養培地で増殖させた。セット全体を、５％ＣＯ２及び９５％空気から構成される３７℃雰囲気のインキュベーターに入れた。培養培地を週に３回交換した。約３日後、３０４ステンレス鋼製のＬ字型ロッドが製造された。１６週間の培養期間の後、培養フラスコを熱線で長さ方向に半分に切断し、シートを、生物学的糸及びポケット形状弁尖の製造に使用される内部フレーム（シートを取り扱う役割も果たす固定システム）を使用してフラスコから取り出した。機械的な研究は、このシートが約２３００グラム重の穿孔力に耐えることができることを確立した。

【0052】

生物学的縫合糸を製造するために、湿った組織のシートを、二重らせんパターンを含む切断表面上に配置して、幅５ｍｍ及び長さ２．４ｍのリボンを製造した（図２）。次いで、組織のシートを、層流フード内で少なくとも２時間、切断面上で乾燥させた。乾燥したら、次にリボンを外科用湾曲ハサミを用いて手動で切断し、次に再水和して切断面から分離した。次いで、リボンの一端を、２ｃｍの長さにわたって１ｃｍ当たり５回転の速度で回転モーターを用いてそれ自体の上に撚り、糸を形成した（図３）。この撚られた領域を、撚る間、及び端部が完全に乾燥するまで穏やかにマッサージし、糸の直径を可能な限り減少させた（図４）。次いで、この乾燥した薄い領域を外科用針の目に挿入し、空気圧クリンパを使用してマウントを圧着した（図４）。圧着されたバイオ糸は、次いで、シリコーンチューブの周りに乾燥状態で巻き付けられ、エッペンドルフチューブに配置されて、使用まで－８０℃で保存された。使用のために、生物学的縫合糸を水で少なくとも１０分間再水和した（図５）。

【0053】

生細胞を含有する粒子を得るために、患者の生来の肺動脈弁尖を外科的に切除し、次いで外科用メスの刃を使用して分離した。次いで、粒子を、ポケット形弁尖への送達のために注射器に引き込んだ。

【0054】

ポケット形弁尖を形成するために、湿った組織のシートを楕円形パターン（長さ：８ｃｍ、幅：３ｃｍ）を含む切断表面に置き、層流フード内で少なくとも２時間乾燥させた。次いで、乾燥したシートを、湾曲したハサミを使用してパターンに切断した。切断したら、組織を水で少なくとも３０分間再水和し、生細胞を含有する粒子を、注射器を使用してポケット形弁尖を形成するシート片の表面の半分に配置した。最後に、シート片を楕円形の短軸（３ｃｍ）に沿って折り畳んで、高さ４ｃｍ、幅３ｃｍの寸法のポケット型弁尖を得た。次いで、生物学的縫合糸を使用して、「オーバーロック」縫合法を使用してポケット型弁尖の自由縁を閉じた（図６）。ファロー四徴症の外科的矯正中の肺流出路の拡大の結果として生じる患者の肺漏出を防止するために、弁尖は、ポケットを閉鎖するために使用されるものと同様の生物学的縫合糸もしくはテープ、又は合成縫合糸もしくはテープを使用して、肺動脈輪の約１ｃｍ上で最終的に縫合される。

【0055】

参考文献のリスト
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】