特表 2024-544515 ペイロード送達システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】ペイロード送達システム

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/60 20170101AFI20241126BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20241126BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20241126BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241126BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241126BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20241126BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

A61K47/60

A61K9/50

A61K45/00

A61K31/7088

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/18

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/34

A61K45/06

A61K47/68

A61K47/64

A61K47/61

A61K47/26

A61P37/04

A61K39/00 H

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527332

(86)(22)【出願日】2022-11-10

(85)【翻訳文提出日】2024-07-04

(86)【国際出願番号】 GB2022052847

(87)【国際公開番号】W WO2023084217

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】2116125.2

(32)【優先日】2021-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519340400

【氏名又は名称】インペリアル・カレッジ・イノベーションズ・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＰＥＲＩＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ロンジュン

(72)【発明者】

【氏名】バムラ，アパンプリート ケー．

(72)【発明者】

【氏名】シャトック，ロビン

(72)【発明者】

【氏名】ブラクニー，アンナ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA61

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC41

4C076DD49

4C076DD63

4C076DD66

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE30

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA17

4C084AA19

4C084AA20

4C084MA02

4C084MA24

4C084MA37

4C084NA13

4C085AA03

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086NA13

(57)【要約】

本開示は、第１のペイロード分子と、脂質構造と、脂質構造を取り囲む複数の両親媒性ポリマー鎖とを含むサブミクロン粒子を提供する。第１のペイロード分子は高分子、場合により核酸である。さらに、両親媒性ポリマー鎖の疎水性は外部刺激に応じて変化する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のペイロード分子と、脂質構造と、前記脂質構造を取り囲む複数の両親媒性ポリマー鎖とを含むサブミクロン粒子であって、前記第１のペイロード分子は高分子、場合により核酸であり、前記両親媒性ポリマー鎖の親水性は外部刺激に応じて変化する、サブミクロン粒子。

【請求項2】

前記第１のペイロード分子が前記脂質構造に封入されており、代替的にまたは追加的に、前記脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着している、請求項１に記載のサブミクロン粒子。

【請求項3】

前記第１のペイロード分子が、核酸、ペプチド、アフィマー、タンパク質、抗体もしくはそのフラグメント、糖タンパク質、リポ多糖、炭水化物、脂質または大環状分子である、請求項１または２に記載のサブミクロン粒子。

【請求項4】

前記第１のペイロード分子が核酸であり、前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項5】

前記ＲＮＡが自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項４に記載のサブミクロン粒子。

【請求項6】

前記脂質構造が脂質ナノ粒子またはリポソームであり、好ましくは脂質ナノ粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項7】

前記脂質構造が複数の脂質を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項8】

前記複数の脂質の少なくとも１つがカチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含む、請求項７に記載のサブミクロン粒子。

【請求項9】

前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質が、
（ｉ）多価カチオン性脂質であるか、もしくはｐＨ感受性脂質である；
（ｉｉ）正に帯電した窒素原子もしくはイオン化可能窒素原子を含む；および／または
（ｉｉｉ）酸性溶液中で正電荷を示す、
請求項８に記載のサブミクロン粒子。

【請求項10】

前記カチオン性またはイオン化可能脂質が、ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、エチルホスファチジルコリン（エチルＰＣ）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、またはヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である、請求項８または９に記載のサブミクロン粒子。

【請求項11】

前記複数の脂質が１種または複数のヘルパー脂質を含み、場合により、
（ｉ）前記ヘルパー脂質が、双性イオン性、好ましくはＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ、およびＬ－α－ホスファチジルコリンから選択されるホスファチジルコリン；もしくはＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、およびＤＳＰＥから選択されるホスファチジルエタノールアミンである；または
（ｉｉ）前記ヘルパー脂質が、非双性イオン性、好ましくはＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、およびＰＯＰＧから選択されるホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳを含む）もしくはＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、およびＤＳＰＡから選択されるホスファチジン酸である、
請求項７～１０のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項12】

双性イオン性脂質を含有せず、含みもしない、請求項７～１１のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項13】

前記複数の脂質の少なくとも１つが双性イオン性脂質を含む、請求項７～１１のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項14】

前記双性イオン性脂質が正に帯電した窒素原子および／または負に帯電した酸素原子を含む、請求項１３に記載のサブミクロン粒子。

【請求項15】

前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質の前記ヘルパー脂質に対する重量比が、２０：１～１：２０の間、１０：１～１：１０の間、５：１～１：５の間、４：１～１：４の間、３：１～１：３の間、２：１～１：２の間、１．５：１～１：１．５の間または１．８：１～１：１．８の間、好ましくは約１：１である、請求項８～１４のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項16】

前記複数の脂質が、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％または少なくとも４０重量％のステロールを含む、請求項７～１４のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項17】

前記ステロールが、Ｃ_１～２４アルキルフィトステロール、スチグマステロールもしくはスチグマスタノールであるかまたはこれを含み、好ましくはコレステロールである、請求項１６に記載のサブミクロン粒子。

【請求項18】

前記複数の脂質の少なくとも１つがＰＥＧ化脂質を含み、場合により、前記ＰＥＧ化脂質が、前記複数の脂質の０．１～５０重量％の間、０．５～４０重量％の間、１～３０重量％の間、２～２０重量％の間、３～１０重量％の間、４～８重量％の間または５～７重量％の間を構成する、請求項７～１７のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項19】

１：１００～１００：１の間、１：５０～８０：１の間、１：１０～６０：１の間、１：５～５０：１の間、１：３～４０：１の間、１：２～３０：１の間、１：１～２５：１の間、２：１～２０：１の間、５：１～１５：１の間、または８：１～１２：１の間のＮ／Ｐ比を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項20】

前記外部刺激が、
（ｉ）ｐＨ変化、特定の酸化還元電位、特定のイオンもしくは特定のガスから選択される化学的刺激；
（ｉｉ）温度変化、光もしくは電磁場の変化から選択される物理的変化；または
（ｉｉｉ）タンパク質、ペプチド、酵素、グルコースもしくは核酸、例えばＤＮＡから選択される生化学的刺激
である、請求項１～１９のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項21】

前記両親媒性ポリマー鎖が、２０℃で少なくとも４、２０℃で少なくとも５、２０℃で少なくとも６、２０℃で少なくとも６．５または２０℃で少なくとも７のｐＨで負に帯電している、請求項１～２０のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項22】

前記両親媒性ポリマー鎖が、１つまたは複数の式Ｉのマー：
－Ｌ^１－ＣＨ（Ｌ^３－ＣＯＲ^１）－Ｌ^２－
［Ｉ］
（式中、Ｌ^１は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み；
Ｌ^２およびＬ^３は独立して、非存在であるか、または置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つもしくは複数のリンカー要素を含み；
各Ｒ^１は独立して、ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＲ^１０またはＯＨであり；
Ｒ^４は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
Ｒ^６およびＲ^７はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
Ｒ^１０は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルである）
を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項23】

前記式Ｉのマーの少なくとも１つにおいて、Ｒ^１がＯＨである、請求項２２に記載のサブミクロン粒子。

【請求項24】

前記両親媒性ポリマー鎖が、１つまたは複数の式ＩＩのマー：
－Ｌ^４－
［ＩＩ］
（式中、Ｌ^４は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含む）
を含む、請求項２２または２３に記載のサブミクロン粒子。

【請求項25】

前記両親媒性ポリマー鎖が、複数の式ＩＩＩのポリマー：

【化1】

（式中、
Ｘ^１は、非存在であるか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^５であり；
Ｒ^２は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環であり；
Ｒ^３およびＲ^５はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
ｎは整数であり、少なくとも１であり；
ｍは０であるか、または少なくとも１である整数である）
であるか、またはこれを含む、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項26】

（ｉ）互いに同じであっても異なっていてもよい、１つもしくは複数の－Ｌ^４－ブロックが存在する；
（ｉｉ）互いに同じであっても異なっていてもよい、１つもしくは複数の－Ｌ^１－ＣＨ（Ｌ^３－ＣＯＲ^１）－Ｌ^２－ブロックが存在する；および／または
（ｉｉｉ）ポリマーがランダム配列もしくは制御された配列を有する、
請求項２５に記載のサブミクロン粒子。

【請求項27】

前記両親媒性ポリマー鎖が、複数の式ＩＶのポリマー：

【化2】

であるか、またはこれを含む、請求項２５に記載のサブミクロン粒子。

【請求項28】

前記式ＩＶのポリマーが式ＩＶａ：

【化3】

を有する、請求項２６に記載のサブミクロン粒子。

【請求項29】

前記ポリマー中の前記Ｒ^１基の１～９９％の間、５～８５％の間、１０～６０％の間または１５～４０％の間がＯＨであり、前記ポリマー中の前記Ｒ^１基の１～９９％の間、１５～９５％の間がＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である、請求項２２～２８のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項30】

前記ポリマー中の前記Ｒ^１基の１～９９％の間、１５～９５％の間、４０～９０％の間または６０～８５％の間がＮＲ^６Ｒ^７であり、Ｒ^６がＨであり、Ｒ^７が

【化4】

である、請求項２９に記載のサブミクロン粒子。

【請求項31】

前記ポリマー中の前記Ｒ^１基の１～９９％の間、５～９０％の間、１０～８０％の間、１２．５～７０％の間または１５～６５％の間がＮＲ^６Ｒ^７であり、Ｒ^６がＨであり、Ｒ^７が－（ＣＨ_２）_６ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_１１ＣＯＯＨである、請求項２９に記載のサブミクロン粒子。

【請求項32】

前記両親媒性ポリマー鎖が、少なくとも１ｋＤａ、少なくとも２ｋＤａ、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１５ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも２２ｋＤａ、少なくとも２４ｋＤａ、少なくとも２４．５ｋＤａもしくは少なくとも２４．８ｋＤａ、または２５０ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、７５ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２８ｋＤａ未満、２６ｋＤａ未満、２５．５ｋＤａ未満もしくは２５ｋＤａ未満の数平均分子量を有する、請求項１～３１のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項33】

（ｉ）ｎが、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７もしくは少なくとも８の整数である；
（ｉｉ）ｎが、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満もしくは１０未満の整数である；
（ｉｉｉ）ｎが、１～５０の間、２～４０の間、３～３０の間、４～２５の間、５～２０の間、６～１５の間、７～１２の間もしくは８～１０の間の整数である；
（ｉｖ）ｎが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも９０もしくは少なくとも９５の整数であり；ｎが、５，０００未満、１，０００未満、５００未満、２５０未満、１５０未満、１２５未満、１１０未満もしくは１０５未満の整数であり得；ｎが、５～５，０００の間、１０～１，０００の間、１５～５００の間、２５～２５０の間、５０～１５０の間、７５～１２５の間、９０～１１０の間もしくは９５～１０５の間の整数であり得る；
（ｖ）ｎが、１０～１，０００の間、１５～７５０の間、２５～５００の間、４０～２５０の間、６０～２００の間、９０～１７０の間、１１０～１５０の間、もしくは１２０～１４０の間の整数である；
（ｖｉ）ｎが、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０もしくは少なくとも１，５００の整数である；
（ｖｉｉ）ｍが、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０もしくは少なくとも４５の整数である；
（ｖｉｉｉ）ｍが、１，０００未満、５００未満、２５０未満、１５０未満、１００未満、８０未満、７０未満、６０未満もしくは５５未満の整数である；または
（ｉｘ）ｍが、５～１，０００の間、１０～５００の間、１５～２５０の間、２０～１５０の間、２５～１００の間、３０～８０の間、３５～７０の間、４０～６０の間もしくは４５～５５の間の整数である、
請求項２５～３２のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項34】

前記ポリマーが、構造：

【化5】

を有するポリマーＬ_１００Ｆ_５０である、請求項１～３３のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項35】

第２のペイロード分子を含み、場合により、前記第２のペイロード分子が前記脂質構造に封入されており、代替的にまたは追加的に、前記脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着している、請求項１～３４のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項36】

前記第２のペイロード分子が、医薬品有効成分（ＡＰＩ）、またはその構成成分、またはそのファシリテーターもしくはイネイブラー、あるいは高分子または小分子であり、場合により、前記第２のペイロード分子が、９００ダルトン未満、８００ダルトン未満、７００ダルトン未満、６００ダルトン未満、５００ダルトン未満または４００ダルトン未満の分子量を有する、請求項３４に記載のサブミクロン粒子。

【請求項37】

少なくとも１つの安定化分子を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項38】

前記または各安定化分子が炭水化物および／またはポリオールであり得る、請求項３７に記載のサブミクロン粒子。

【請求項39】

（ｉ）前記炭水化物が、グルコース；ガラクトース；フルクトース；マンノース；およびキシロースからなる群から選択される単糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型である；
（ｉｉ）前記炭水化物が、トレハロース；スクロース；ラクトース；マルトース；イソマルトース；ラクチトール；ラクツロース；マンノビオース；およびイソマルトからなる群から選択される二糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る；
（ｉｉｉ）前記炭水化物が、ニゲロトリオース；マルトトリオース；メレジトース；マルトトリウロース（ｍａｌｔｏｔｒｉｕｌｏｓｅ）；ラフィノース；およびケストースからなる群から選択される三糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型である；あるいは
（ｉｖ）前記炭水化物が、デキストラン；アミロース；アミロペクチン；グリコーゲン；ガラクトゲン；イヌリン；カロース；セルロース；キトサン；およびキチンからなる群から選択される多糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型である、
請求項３８に記載のサブミクロン粒子。

【請求項40】

前記炭水化物が、トレハロース、またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型である、請求項３８に記載のサブミクロン粒子。

【請求項41】

少なくとも１つの標的化リガンドまたは部分を含み、ペプチド、タンパク質、アプタマー、炭水化物、オリゴ糖、葉酸もしくは葉酸塩、および抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ビタミンもしくはその誘導体のうちの少なくとも１つであるか、またはこれを含む、請求項１から４０のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子。

【請求項42】

サブミクロン粒子を製造する方法であって、第１のペイロード分子、脂質構造および複数の両親媒性ポリマー鎖を合わせて前記サブミクロン粒子を生成することを含み、前記第１のペイロード分子は高分子、場合により核酸であり、前記両親媒性ポリマー鎖の親水性は外部刺激に応じて変化する、方法。

【請求項43】

前記第１のペイロード分子と複数の脂質とを接触させて、前記第１のペイロード分子を封入しているか、またはその外面上で、前記第１のペイロード分子と共有結合によりコンジュゲートおよび／もしくは物理的に付着している脂質構造を生成することと、その後、前記脂質構造と前記複数の両親媒性ポリマー鎖とを接触させて、前記サブミクロン粒子を生成することとを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記第１のペイロード分子、第２のペイロード分子および複数の脂質を接触させて、前記第１および第２のペイロード分子を封入しているか、またはその外面上で、前記第１および第２のペイロード分子と共有結合によりコンジュゲートおよび／もしくは物理的に付着している脂質構造を生成することと；その後、前記脂質構造と前記複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させて、前記サブミクロン粒子を生成することとを含む、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

脂質ナノ粒子およびリポソーム系を含む、既存の脂質構造を修飾するために使用される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法によって得られたまたは得られうる、サブミクロン粒子。

【請求項47】

好ましくは、医薬組成物であり、薬学的に許容されるビヒクルを含む、複数の請求項１～４１または請求項４６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子を含む、組成物。

【請求項48】

医薬組成物を調製する方法であって、複数の請求項１～４１または請求項４６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子を薬学的に許容、されるビヒクルと接触させることを含む、方法。

【請求項49】

医薬として使用するための、請求項１～４１もしくは請求項４６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子、または請求項４７に記載の組成物。

【請求項50】

請求項１～４１もしくは請求項４６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子、または請求項４７に記載の組成物を含むワクチン組成物。

【請求項51】

対象において免疫応答を刺激するのに使用するための、請求項１～４１もしくは請求項４６のいずれか１項に記載のサブミクロン粒子、または請求項４７に記載の組成物または請求項５０に記載のワクチン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サブミクロン粒子などのペイロード送達システム、特に、高分子、例えば核酸などのペイロード分子を含むサブミクロン粒子自体に関する。本発明は、サブミクロン粒子、サブミクロン粒子を含む医薬組成物およびワクチンを製造する方法、ならびにそれらの医学的使用に及ぶ。

【背景技術】

【0002】

核酸、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）に基づくワクチンおよびバイオ医薬品の研究は、過去１０年間でますます普及している。ｍＲＮＡベースのワクチンおよびバイオ医薬品は、それらの高い効力、急速な開発の能力、低コスト製造の可能性、大規模展開、および安全な投与のために、従来のアプローチに対する有望な代替物となる。ｍＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品分野は極めて急速に発展している。Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈおよびＭｏｄｅｒｎａ ｍＲＮＡ ＣＯＶＩＤワクチンの承認は、インビトロで転写されたｍＲＮＡがヒトで使用するために承認された初めてのものであり、ｍＲＮＡを主要な製薬およびバイオテクノロジーパイプラインの重要な資産にする。この新たなプラットフォームは、様々な感染性疾患に対するワクチンプラットフォームとしてだけでなく、がん、遺伝性疾患、および他の疾患に対するバイオ医薬品としても使用するための途方もない革新の可能性を有する。ｓａＲＮＡは、抗原コードｓａＲＮＡの細胞内複製量の増加に起因して、ｍＲＮＡと比較して極めて少ない用量から１０～１００倍多い量の抗原を産生する能力のおかげで、別の人気のある選択肢である^１。動物モデルにおける多くの研究は、ｓａＲＮＡウイルスベクターによって発現される外来抗原が強力な免疫応答を生成し、腫瘍細胞および感染因子に対する免疫化動物における長期の保護を提供することを示すことを示している^２。

【0003】

しかしながら、ＲＮＡ系の臨床解釈および商業化は、それらの非効率的なインビボ送達、高い自然免疫原性および不安定性によって制限される。ＲＮＡ系、特にｍＲＮＡおよびｓａＲＮＡは、それらの大きな分子量および高い負電荷のために不十分なエンドサイトーシスを有する。さらに、それらのエンドソーム捕捉および触媒加水分解により、限られた細胞内タンパク質発現が課題である。さらに、ＲＮＡは非常に壊れやすく、曝露環境で容易に分解する可能性があり、したがって、非常に困難なウルトラコールドチェーンまたはコールドチェーンでの貯蔵および分配を必要とする。

【0004】

これらの課題に対処するために、新たな送達システムが緊急に必要とされている。大きな技術的進歩にもかかわらず、ＲＮＡを含む核酸の標的化細胞内送達は依然として課題である。ウイルスベクターは、高いトランスフェクション効率を有することが知られているが、このような送達システムの臨床的使用は、安全性の懸念、大規模生産およびより迅速な開発の必要性における課題のために制限されている。したがって、カチオン性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの非ウイルスベクターが有望な代替物である。それにもかかわらず、従来のナノ粒子は、不十分な安定性、高い免疫原性および好ましくない生体内分布を有し、臨床用途を制限する。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、先行技術に関連する問題を克服しようとする発明者の努力によるものである。

【0006】

本発明の第１の態様によると、第１のペイロード分子と、脂質構造と、脂質構造を取り囲む複数の両親媒性ポリマー鎖とを含むサブミクロン粒子であって、第１のペイロード分子は高分子、場合により核酸であり、両親媒性ポリマー鎖の親水性は外部刺激に応じて変化する、サブミクロン粒子が提供される。

【0007】

本発明者らは、第１の態様のサブミクロン粒子が、官能性ポリマーおよび標的化リガンドを使用してより制御され、標的化された送達をもたらすことによって、先行技術に関連する課題に対処することができることを見出した。実施例で論じられるように、本発明者らによって開発されたサブミクロン粒子は、ｓａＲＮＡなどの機能性高分子ペイロードの有効な細胞質送達ならびにｓａＲＮＡとルキソリチニブなどの小分子ペイロードの同時送達を示した。本発明者らはまた、サブミクロン粒子が、核酸などの高分子ペイロードを安定化し、室温および熱帯温度での凍結乾燥と水溶液中の両方の製剤の長期の安定な貯蔵を可能にすることができることを見出した。したがって、これにより、超低温または低温貯蔵の必要性が排除される。

【0008】

「サブミクロン」という用語は、本発明の粒子が１μｍ未満の最大の最大寸法を有することを意味すると理解され得る。より好ましくは、粒子の最大寸法は、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満または６００ｎｍ未満、最も好ましくは５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満または２００ｎｍ未満である。サブミクロン粒子は、１０～９００ｎｍの間、２０～８００ｎｍの間、３０～７００ｎｍの間または４０～６００ｎｍの間、より好ましくは５０～５００ｎｍの間または６０～４００ｎｍの間、最も好ましくは８０～３００ｎｍの間または１００～２００ｎｍの間の最大の最大寸法を有し得る。サブミクロン粒子の最大の最大寸法は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ μＶ機器を使用して決定されるＺ平均サイズに相当し得る。

【0009】

第１のペイロード分子は、好ましくは脂質構造に封入されている。代替的にまたは追加的に、第１のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。本明細書のどこかに記載される物理的付着は、静電相互作用および／または疎水性相互作用によるものであり得る。

【0010】

第１のペイロード分子として使用され得る適切な高分子は、好ましくは、少なくとも９００ダルトン、少なくとも１０００ダルトンまたは少なくとも１２００ダルトンの分子量を有する。

【0011】

高分子は、核酸、ペプチド、アフィマー、タンパク質、抗体もしくはそのフラグメント、糖タンパク質、リポ多糖または炭水化物であり得る。高分子は脂質または大環状分子であり得る。

【0012】

しかしながら、好ましくは、第１のペイロード分子は核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列であり得る。好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。

【0013】

最も好ましくは、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）；自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）；アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）；ＲＮＡアプタマー；干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；および小分子ＲＮＡからなる群から選択され得る。

【0014】

好ましくは、ＲＮＡは自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である。好ましくは、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当業者であれば、自己増幅ＲＮＡが、ｍＲＮＡの基本要素（キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および可変長のポリ（Ａ）テール）を含有し得るが、かなり長く（例えば、９～１２ｋｂ）なり得ることを認識するだろう。

【0015】

核酸配列、好ましくは、ＲＮＡは、少なくとも１０塩基長、少なくとも２０塩基長、少なくとも５０塩基長、少なくとも１００塩基長、少なくとも２００塩基長、少なくとも３００塩基長、少なくとも４００塩基長、少なくとも５００塩基長、少なくとも６００塩基長、少なくとも７００塩基長、少なくとも８００塩基長または少なくとも９００塩基長であり得る。

【0016】

１つの好ましい実施形態では、ＲＮＡはｓａＲＮＡまたはｍＲＮＡである。

【0017】

核酸配列、好ましくは、ＲＮＡ、最も好ましくは、ｓａＲＮＡまたはｍＲＮＡは、少なくとも１０００塩基長、少なくとも２０００塩基長、少なくとも３０００塩基長、少なくとも４０００塩基長、少なくとも５０００塩基長、少なくとも６０００塩基長、少なくとも７０００塩基長、少なくとも８０００塩基長、少なくとも９０００塩基長、少なくとも１００００塩基長、少なくとも１１０００塩基長または少なくとも１２０００塩基長であり得る。

【0018】

一実施形態では、核酸配列は少なくとも６０００塩基長である。一実施形態では、ＲＮＡは少なくとも６０００塩基長である。好ましい実施形態では、ｓａＲＮＡは少なくとも６０００塩基長である。

【0019】

代替実施形態では、核酸配列は少なくとも９００塩基長である。一実施形態では、ＲＮＡは少なくとも９００塩基長である。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは少なくとも９００塩基長である。

【0020】

核酸配列、好ましくは、ＲＮＡ、最も好ましくは、ｓａＲＮＡは、５０００～２００００塩基長の間、５５００～１５０００塩基長の間、６０００～１４０００塩基長の間、６５００～１３０００塩基長の間、７０００～１２０００塩基長の間、８０００～１１０００塩基長の間、９０００～１００００塩基長の間であり得る。

【0021】

あるいは、核酸配列、好ましくは、ＲＮＡ、最も好ましくは、ｍＲＮＡは、５０～１００００塩基長の間、１００～９０００塩基長の間、２００～８０００塩基長の間、３００～７０００塩基長の間、４００～６０００塩基長の間、５００～６０００塩基長の間、６００～５０００塩基長の間、７００～４０００塩基長の間、８００～３０００塩基長の間または９００～２０００塩基長の間であり得る。

【0022】

一実施形態では、核酸配列は６０００～１５０００塩基長の間である。核酸配列は８０００～１２０００塩基長の間であり得る。ＲＮＡは６０００～１５０００塩基長の間であり得る。ＲＮＡは８０００～１２０００塩基長の間であり得る。好ましくは、ｓａＲＮＡは６０００～１５０００塩基長の間である。好ましくは、ｓａＲＮＡは８０００～１２０００塩基長の間である。

【0023】

代替実施形態では、核酸配列は、４００～１４０００塩基長の間、５００～１００００塩基長の間、６００～７５００塩基長の間、７００～５０００塩基長の間、８００～４０００塩基長の間または９００～２０００塩基長の間である。ＲＮＡは、４００～１４０００塩基長の間、５００～１００００塩基長の間、６００～７５００塩基長の間、７００～５０００塩基長の間、８００～４０００塩基長の間または９００～２０００塩基長の間であり得る。好ましくは、ｍＲＮＡは、４００～１４０００塩基長の間、５００～１００００塩基長の間、６００～７５００塩基長の間、７００～５０００塩基長の間、８００～４０００塩基長の間または９００～２０００塩基長の間である。

【0024】

当業者であれば、核酸が二本鎖、例えば、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである場合、「塩基長」が塩基対の長さを指すことを認識するだろう。

【0025】

脂質構造は脂質ナノ粒子またはリポソームであり得る。好ましくは、該または各脂質構造は脂質ナノ粒子である。

【0026】

一部の実施形態では、脂質構造が複数の脂質を含み得る。

【0027】

複数の脂質の少なくとも１つは、カチオン性またはイオン化可能脂質を含み得る。カチオン性またはイオン化可能脂質は多価カチオン性脂質であり得る。カチオン性またはイオン化可能脂質はｐＨ感受性脂質であり得る。カチオン性またはイオン化可能脂質は、正に帯電したまたはイオン化可能窒素原子を含み得る。カチオン性またはイオン化可能脂質は、酸性溶液中で正電荷を示し得る。溶液は、２０℃で７未満、より好ましくは２０℃で６．５未満のｐＨを有する場合に酸性であると理解され得る。溶液は、２０℃で３．５～７の間、または２０℃で４～７の間、より好ましくは２０℃で４．５～６．５の間のｐＨを有する場合に酸性であると理解され得る。

【0028】

カチオン性またはイオン化可能脂質は、ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、エチルホスファチジルコリン（エチルＰＣ）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、またはヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）であり得る。一部の実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質はジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である、一部の実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質はＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。一部の実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質はＤＯＤＡＰである。

【0029】

カチオン性またはイオン化可能脂質は、複数の脂質の少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％または少なくとも５５重量％を構成し得る。カチオン性またはイオン化可能脂質は、複数の脂質の５～８０重量％の間または１０～６０重量％の間を構成し得る。一部の実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質は、複数の脂質の２０～５０重量％の間または２５～３５重量％の間を構成し得る。代替実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質は、複数の脂質の３０～７０重量％の間、４０～６５重量％の間または５０～６０重量％の間を構成し得る。

【0030】

脂質構造および／または複数の脂質は、１種または複数のヘルパー脂質を含み得る。一実施形態では、ヘルパー脂質は、双性イオン性、例えばホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ、Ｌ－α－ホスファチジルコリンを含む）またはホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥを含む）であり得る。

【0031】

あるいは、別の実施形態では、ヘルパー脂質は、非双性イオン性、例えばホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＰＯＰＧを含む）、ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳを含む）およびホスファチジン酸（ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡを含む）であり得る。よって、一部の実施形態では、複数の脂質の少なくとも１つが双性イオン性脂質を含まなくてもよい。したがって、換言すれば、本発明のサブミクロン粒子は、双性イオン性脂質を含有せず、含みもしなくてもよい。しかしながら、他の実施形態では、複数の脂質の少なくとも１つが双性イオン性脂質を含んでもよい。双性イオン性脂質は、等しい数の正に帯電した官能基と負に帯電した官能基を含有し、双性イオン性ｐＨでゼロの正味電荷を示し得る。双性イオン性ｐＨは、双性イオン性脂質に応じて変化し得る。一部の実施形態では、双性イオン性ｐＨが、酸性ｐＨであることが理解され得る。したがって、双性イオン性ｐＨは、２０℃で１～８の間、２０℃で２～７の間、２０℃で３～６の間、２０℃で４～５の間または２０℃で４．３～４．５の間のｐＨであることが理解され得る。

【0032】

双性イオン性脂質は、正に帯電した窒素原子を含み得る。双性イオン性脂質は、負に帯電した酸素原子を含み得る。酸素原子は、Ｐ（Ｏ）基またはＣ（Ｏ）基に結合し得る。双性イオン性脂質は、ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ、Ｌ－α－ホスファチジルコリンを含む）またはホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥを含む）であり得る。双性イオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはＬ－α－ホスファチジルコリン（ＰＣ）であり得る。一部の実施形態では、双性イオン性脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。非双性イオン性脂質は、ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＰＯＰＧを含む）、ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳを含む）およびホスファチジン酸（ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡを含む）であり得る。

【0033】

カチオン性またはイオン化可能脂質のヘルパー脂質に対する重量比は、２０：１～１：２０の間、１０：１～１：１０の間または５：１～１：５の間であり得る。一部の実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質のヘルパー脂質に対する重量比が、４：１～１：４の間、３：１～１：３の間、２：１～１：２の間、１．５：１～１：１．５の間または１．８：１～１：１．８の間であり得る。代替実施形態では、カチオン性またはイオン化可能脂質のヘルパー脂質に対する重量比が、１：１～１：１０の間、１：２～１：８の間または１：４～１：５の間であり得る。一部の実施形態では。カチオン性またはイオン化可能脂質のヘルパー脂質に対する重量比が約１：１である。

【0034】

ヘルパー脂質は、複数の脂質の少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％または少なくとも３０重量％を構成し得る。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、複数の脂質の少なくとも４０重量％または少なくとも５０重量％を構成し得る。ヘルパー脂質は、複数の脂質の５～８０重量％の間または１０～７０重量％の間を構成し得る。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は、複数の脂質の２０～５０重量％の間または２５～３５重量％の間を構成し得る。代替実施形態では、ヘルパー脂質は、複数の脂質の３０～６０重量％の間または５０～６０重量％の間を構成し得る。さらなる代替実施形態では、ヘルパー脂質は、複数の脂質の２～４０重量％の間、４～３０重量％の間、６～２５重量％の間、８～２０重量％の間または１０～１５重量％の間を構成し得る。

【0035】

複数の脂質の少なくとも１つはステロールを含み得る。ステロールは、Ｃ_１～２４アルキルフィトステロール、スチグマステロールもしくはスチグマスタノールであり得るか、またはこれを含み得る。好ましくは、ステロールはコレステロールである。

【0036】

ステロールは、複数の脂質の少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％または少なくとも４０重量％を構成し得る。ステロールは、複数の脂質の１～８０重量％の間、２～７０重量％の間または５～６０重量％の間を構成し得る。一部の実施形態では、ステロールは、複数の脂質の１０～５５重量％の間、２０～５０重量％の間、３０～４５重量％の間または３５～４５重量％の間を構成し得る。代替実施形態では、ステロールは、複数の脂質の２～４０重量％の間、４～３０重量％の間、５～２０重量％の間、６～１５重量％の間または７～１０重量％の間を構成し得る。代替実施形態では、ステロールは、複数の脂質の１０～５０重量％の間、２０～４０重量％の間または２５～３０重量％の間を構成し得る。

【0037】

複数の脂質の少なくとも１つはＰＥＧ化脂質を含み得る。ＰＥＧ化脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基またはその誘導体を含むように修飾された脂質であると理解され得る。ＰＥＧの誘導体は、マルチアームＰＥＧ、官能化ＰＥＧ等であると理解され得る。一部の実施形態では、シールド脂質は、ＰＥＧ基またはその誘導体を含むように修飾されたＤＭＧ、ＤＳＰＥまたはＤＰＰＣ脂質であり得る。したがって、ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥまたはＰＥＧ－ＤＰＰＣであり得る。ＰＥＧ基は、１００～２０，０００Ｄａの間、２００～１５，０００Ｄａの間、３００～１０，０００Ｄａの間、４００～７，５００Ｄａの間または５００～５，０００Ｄａの間の平均分子量を有し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ基が、１，０００～３，０００Ｄａの間、１，２５０～１，７５０Ｄａの間、１，５００～２，５００Ｄａの間、１，７５０～２，２５０Ｄａの間または１，９００～２，１００Ｄａの間の平均分子量を有し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ基が、２，０００～８，０００Ｄａの間、３，０００～７，０００Ｄａの間、４，０００～６，０００Ｄａの間、４，５００～５，５００Ｄａの間または４，７５０～５，２５０Ｄａの間の平均分子量を有し得る。平均分子量は数平均分子量または重量平均分子量であり得る。

【0038】

ＰＥＧ化脂質は、複数の脂質の少なくとも０．１重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも３重量％、少なくとも４重量％または少なくとも５重量％を構成し得る。ＰＥＧ化脂質は、複数の脂質の０．１～５０重量％の間、０．５～４０重量％の間、１～３０重量％の間、２～２０重量％の間、３～１０重量％の間、４～８重量％の間または５～７重量％の間を構成し得る。

【0039】

サブミクロン粒子は、少なくとも１：１００、少なくとも１：５０、少なくとも１：１０または少なくとも１：５、より好ましくは少なくとも１：３、少なくとも１：２または少なくとも１：１、最も好ましくは少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１または少なくとも９：１のＮ／Ｐ比を有し得る。サブミクロン粒子は、１００：１未満、５０：１未満、４０：１未満、３０：１未満、２８：１未満、２６：１未満、２４：１未満、２２：１未満、２１：１未満または２０：１未満のＮ／Ｐ比を有し得る。サブミクロン粒子は、１：１００～１００：１の間、１：５０～８０：１の間、１：１０～６０：１の間、１：５～５０：１の間、１：３～４０：１の間、１：２～３０：１の間、１：１～２５：１の間、２：１～２０：１の間、５：１～１５：１の間、または８：１～１２：１の間のＮ／Ｐ比を有し得る。好ましい実施形態では、サブミクロン粒子が、９：１～１１：１の間のＮ／Ｐ比を有する。Ｎ／Ｐ比は、脂質構造中のカチオン性アミンとペイロード分子中のアニオン性ホスフェートとの間の比であると理解され得る。

【0040】

第１のペイロード分子（好ましくは、核酸、より好ましくはＲＮＡ）の脂質に対する比は２．５×１０^－９：１～０．２５：１の間であり得る。

【0041】

外部刺激は、ｐＨ変化、温度変化および／または光への曝露であり得る。したがって、両親媒性ポリマー鎖の親水性は、ｐＨ低下に応じて低下し得る。したがって、両親媒性ポリマー鎖の親水性は、温度上昇または光への曝露に応じて低下し得る。

【0042】

好ましくは、ポリマー鎖は、外部刺激に応じて脂質膜を透過化する。外部刺激は、ｐＨ変化、特定の酸化還元電位、特定のイオンまたは特定のガスから選択され得る、化学的刺激であり得る。あるいは、刺激は、温度変化、光または電磁場の変化から選択され得る、物理的刺激であり得る。あるいは、刺激は、タンパク質、ペプチド、酵素、グルコースまたは核酸、例えばＤＮＡから選択され得る、生化学的刺激であり得る。

【0043】

一部の実施形態では、外部刺激がｐＨ変化である。

【0044】

有利には、ｐＨ応答性ポリマーが、特に、膜不安定化において役割を果たすウイルスの表面上のアニオン性ペプチドを模倣して、ペイロードの細胞質へのエンドソーム脱出を可能にすることができる。実施例で論じられるように、本発明者らは、ｐＨ応答性ポリマーがエンドソーム溶解活性を有することができ、本発明のサブミクロン粒子の一部として使用すると、ペイロードの細胞質送達を促進することができることを示した。

【0045】

複数の両親媒性ポリマー鎖は、国際公開第２０１８／０１１５８０号、国際公開第２０２１／２６０３９２号および／またはＣｈｅｎら^４に記載されるポリマーであり得るか、またはこれを含み得る。両親媒性ポリマーは外部刺激に応答性であり得る。外部刺激はｐＨであり得る。

【0046】

国際公開第２０２１／２６０３９２号は、新たな重合方法ならびにポリエステル、ポリエーテル、およびポリエステル－エーテルを含む新規なポリマーを合成するためのこの方法の使用に関する。これらのタイプのポリマーは温度応答性であり得ることが報告されている。他の温度応答性ポリマーは、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－コ－メタクリル酸）を包含し得るかまたは含み得る。

【0047】

さらに、ポリマーは、適切な場合または必要な場合、光、熱、酵素などの刺激に応答するリンカーを通してある他の構成成分とコンジュゲートされていてもよい。一例は、膜透過化ポリマーが「シールド」構成成分を通したコンジュゲーションによって膜不活性にされ得るものである。標的部位に到達すると、リンカーが特定の刺激で切断され得、ポリマーが膜透過化状態に変換される。あるいは、これらのポリマーが、ｐＨ、光、熱、酵素などの刺激に応答性の１種または複数の構成成分とコンジュゲートされていてもよい。

【0048】

両親媒性ポリマー鎖は、２０℃で少なくとも４、２０℃で少なくとも５、２０℃で少なくとも６、２０℃で少なくとも６．５または２０℃で少なくとも７のｐＨで負に帯電していてもよい。両親媒性ポリマー鎖は、２０℃で４～１０の間、２０℃で５～９の間、２０℃で６～８の間または２０℃で６．５～７．５の間のｐＨで負に帯電していてもよい。

【0049】

両親媒性ポリマー鎖は、少なくとも１つのＣＯＯＨ基を含み得る。ＣＯＯＨ基はそのｐＫａより上のｐＨで脱プロトン化され得る、すなわち、ＣＯＯ^－であり、したがって、両親媒性ポリマーは比較的親水性であることが認識され得る。しかしながら、そのｐＫａより下のｐＨでは、ＣＯＯ^－基はプロトン化され得る、すなわち、ＣＯＯＨであり、したがって、両親媒性ポリマーはより疎水性である。したがって、基の親水性は低いｐＨで低下する。

【0050】

両親媒性ポリマー鎖は、１つまたは複数の式Ｉのマー：
－Ｌ^１－ＣＨ（Ｌ^３－ＣＯＲ^１）－Ｌ^２－
［Ｉ］
（式中、Ｌ^１は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み；
Ｌ^２およびＬ^３は独立して、非存在であるか、または置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つもしくは複数のリンカー要素を含み；
各Ｒ^１は独立して、ＮＲ^６Ｒ^７、ＯＲ^１０またはＯＨであり；
Ｒ^４は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
Ｒ^６およびＲ^７はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
Ｒ^１０は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルである）
を含み得る。

【0051】

一部の実施形態では、両親媒性ポリマー鎖は、互いに同じであっても異なっていてもよい２つ以上の式Ｉのマーを含み得る。

【0052】

好ましくは、式Ｉのマーの少なくとも１つにおいて、Ｒ^１はＯＨである。

【0053】

一部の実施形態では、両親媒性ポリマー鎖は、１つまたは複数の式ＩＩのマー：
－Ｌ^４－
［ＩＩ］
（式中、Ｌ^４は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニレン、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニレン、置換されていてもよいＣ_３～１２ヘテロシクリレン、置換されていてもよいＣ_６～２０アリーレン、置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロアリーレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み；
Ｒ^４は上に定義される通りである）
を含み得る。

【0054】

一部の実施形態では、両親媒性ポリマー鎖は、互いに同じであっても異なっていてもよい２つ以上の式ＩＩのマーを含み得る。

【0055】

両親媒性ポリマー鎖はランダム配列を有し得る。あるいは、両親媒性ポリマー鎖は制御された配列を有し得る。例えば、両親媒性ポリマー鎖はブロックコポリマーであり得る。

【0056】

一部の実施形態では、両親媒性ポリマー鎖は、複数の式ＩＩＩのポリマー：

【0057】

【化1】

【0058】

（式中、
Ｌ^１～Ｌ^４、Ｒ^１、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７は上に定義される通りであり；
Ｘ^１は、非存在であるか、またはＯ、ＳもしくはＮＲ^５であり；
Ｒ^２は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環であり；
Ｒ^３およびＲ^５はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニルであり；
ｎは整数であり、少なくとも１であり；
ｍは０であるか、または少なくとも１である整数である）
であるか、またはこれを含む。

【0059】

１つまたは複数の－Ｌ^４－ブロック（互いに同じであっても異なっていてもよい）が存在し得る。

【0060】

１つまたは複数の－Ｌ^１－ＣＨ（Ｌ^３－ＣＯＲ^１）－Ｌ^２－ブロック（互いに同じであっても異なっていてもよい）が存在し得る。

【0061】

ポリマーはランダム配列または制御された配列を有し得る。

【0062】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、特に指定しない限り、飽和の直鎖または分岐炭化水素を指す。アルキルは、第一級、第二級または第三級炭化水素であり得る。Ｃ_１～３０アルキルは、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル（１－プロピル）、イソプロニル（２－プロピル、１－メチルエチル）、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシルを含む。該または各アルキルは、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_１～２０アルキル、置換されていてもよいＣ_１～１２アルキル、置換されていてもよいＣ_１～６アルキルまたは置換されていてもよいＣ_１～３アルキルであり得る。アルキル基は非置換であっても置換されていてもよい。置換されたアルキルは、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＯＯＲ^８、ＮＲ^８Ｒ^９、ＯＲ^８、ＳＲ^８、ＳＳＲ^８、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、Ｎ_３、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ^８Ｒ^９、ＰＲ^８Ｒ^９、オキソ、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環からなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよく、Ｒ^８およびＲ^９はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環である。

【0063】

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、特に指定しない限り、二価の飽和の直鎖または分岐炭化水素を指す。置換されていてもよいアルキレンは、上に定義される置換されていてもよいアルキルに類似しているが、水素原子がそこから除去されてアルキル基を二価にしている。

【0064】

「アルケニル」という用語は、非分岐であっても分岐であってもよいオレフィン性不飽和炭化水素基を指す。したがって、アルケニルは、隣接炭素原子間の１つまたは複数の二重結合を含有し得る。Ｃ_２～Ｃ_３０アルケニルは、例えばビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニルを含む。該または各アルケニルは、置換されていてもよいＣ_２～２０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～１２アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～６アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３アルケニルであり得る。アルケニル基は、非置換であっても、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＯＯＲ^８、ＮＲ^８Ｒ^９、ＯＲ^８、ＳＲ^８、ＳＳＲ^８、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、Ｎ_３、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ^８Ｒ^９、ＰＲ^８Ｒ^９、オキソ、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールもしくは置換されていてもよい３～２０員複素環からなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく、Ｒ^８およびＲ^９はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環である。

【0065】

本明細書で使用される「アルケニレン」という用語は、特に指定しない限り、二価のオレフィン性不飽和の直鎖または分岐炭化水素を指す。置換されていてもよいアルケニレンは、上に定義される置換されていてもよいアルケニルに類似しているが、水素原子がそこから除去されてアルキル基を二価にしている。

【0066】

「アルキニル」という用語は、非分岐であっても分岐であってもよいアセチレン性不飽和炭化水素基を指す。したがって、アルキニルは、隣接炭素原子間の１つまたは複数の三重結合を含有し得る。アルキニル基は、隣接炭素原子間の１つまたは複数の二重結合をさらに含有し得る。Ｃ_２～Ｃ_３０アルキニルは、例えばプロパルギル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルを含む。該または各アルキニルは、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_２～２０アルキニル、置換されていてもよいＣ_２～１２アルキニル、置換されていてもよいＣ_２～６アルキニルまたは置換されていてもよいＣ_２～３アルキニルであり得る。アルキニル基は非置換であっても、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＯＯＲ^８、ＮＲ^８Ｒ^９、ＯＲ^８、ＳＲ^８、ＳＳＲ^８、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、Ｎ_３、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ^８Ｒ^９、ＰＲ^８Ｒ^９、オキソ、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールもしくは置換されていてもよい３～２０員複素環からなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく、Ｒ^８およびＲ^９はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環である。

【0067】

本明細書で使用される「アルキニレン」という用語は、特に指定しない限り、二価のアセチレン性不飽和の直鎖または分岐炭化水素を指す。置換されていてもよいアルキニレンは、上に定義される置換されていてもよいアルキニルに類似しているが、水素原子がそこから除去されてアルキル基を二価にしている。

【0068】

「アリール」は、芳香族の６～２０員炭化水素基を指す。Ｃ_６～Ｃ_２０アリール基の例としては、それだけに限らないが、フェニル、α－ナフチル、β－ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチルおよびインダニルが挙げられる。該または各アリールは置換されていてもよいＣ_６～１２アリールであり得る。

【0069】

「シクロアルキル」は、非芳香族の、飽和の、単環式、二環式または多環式炭化水素３～２０員環系を指す。該または各シクロアルキルは、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～１２シクロアルキルまたは置換されていてもよいＣ_３～６シクロアルキルであり得る。シクロアルキルの代表的な例としては、それだけに限らないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。

【0070】

「シクロアルケニル」は、非芳香族のオレフィン性不飽和の単環式、二環式または多環式炭化水素３～２０員環系を指す。したがって、シクロアルケニルは、環内の隣接炭素原子間の１つまたは複数の二重結合を含有し得る。該または各シクロアルケニルは、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～１２シクロアルケニルまたは置換されていてもよいＣ_３～６シクロアルケニルであり得る。

【0071】

「シクロアルキニル」は、非芳香族の、アセチレン性不飽和の、単環式、二環式または多環式炭化水素３～２０員環系を指す。したがって、シクロアルキニルは、環内の隣接炭素原子間の１つまたは複数の三重結合を含有し得る。シクロアルケニルは、環内の隣接炭素原子間の１つまたは複数の二重結合も含有し得る。該または各シクロアルキニルは、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよいＣ_３～１２シクロアルキニルまたは置換されていてもよいＣ_３～６シクロアルキニルであり得る。

【0072】

「ヘテロアリール」は、少なくとも１個の環原子がヘテロ原子である、単環式または二環式の芳香族５～２０員環系を指す。該または各ヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素およびリンからなる群から独立して選択され得る。ヘテロアリールは、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリールであり得る。５～２０員ヘテロアリール基の例としては、フラン、チオフェン、インドール、アザインドール、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、イミダゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、Ｎ－メチルピロール、ピラゾール、Ｎ－メチルピラゾール、１，３，４－オキサジアゾール、１，２，４－トリアゾール、１－メチル－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－テトラゾール、１－メチルテトラゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾフラン、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾイミダゾール、Ｎ－メチルベンゾイミダゾール、アザベンゾイミダゾール、インダゾール、キナゾリン、キノリン、およびイソキノリンが挙げられる。二環式ヘテロアリール基は、例えばフェニル、ピリジン、ピリミジン、ピラジンまたはピリダジン環が５員または６員単環式ヘテロアリール環に縮合しているものを含む。

【0073】

「複素環」または「ヘテロシクリル」は、少なくとも１個の環原子がヘテロ原子である、３～２０員の単環式、二環式、多環式または架橋分子を指す。該または各ヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素およびリンからなる群から独立して選択され得る。複素環は飽和または部分飽和であり得る。複素環式基は、置換されていてもよい３～２０員複素環または置換されていてもよい３～１２員複素環であり得る。例示的な３～２０員複素環基は、それだけに限らないが、アジリジン、オキシラン、オキシレン、チイラン、ピロリン、ピロリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、ジヒドロチオフェン、テトラヒドロチオフェン、ジチオラン、ピペリジン、１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－１－イル、テトラヒドロピラン、ピラン、モルホリン、ピペラジン、チアン、チイン、ピペラジン、アゼパン、ジアゼパン、およびオキサジンを含む。

【0074】

アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基は非置換であっても、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＯＯＲ^８、ＮＲ^８Ｒ^９、ＯＲ^８、ＳＲ^８、ＳＳＲ^８、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、Ｎ_３、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ^８Ｒ^９、ＰＲ^８Ｒ^９、オキソ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールもしくは置換されていてもよい３～２０員複素環からなる群から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく、Ｒ^８およびＲ^９はそれぞれ独立して、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニル、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールまたは置換されていてもよい３～２０員複素環である。

【0075】

同様に、アリーレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、ヘテロアリーレンおよびヘテロシクリレン（ｈｅｔｒｏｃｙｃｙｌｅｎｅ）基は、二価であることを除いて、上に定義されるアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロアリールおよびヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌ）基に類似している。

【0076】

一部の実施形態では、ｍは０である。

【0077】

一部の実施形態では、Ｌ^３は非存在である。

【0078】

Ｒ^２およびＲ^３は独立して、Ｈまたは置換されていてもよいＣ_１～１２アルキルであり得る。より好ましくは、Ｒ^２およびＲ^３はＨまたはＣ_１～６アルキルであり、さらにより好ましくは、Ｒ^２およびＲ^３はＨまたはＣ_１～３アルキルである。

【0079】

Ｘ^１は非存在であり得る。

【0080】

したがって、一部の実施形態では、両親媒性ポリマー鎖は、複数の式ＩＶのポリマー：

【0081】

【化2】

【0082】

であるか、またはこれを含む。

【0083】

一部の実施形態では、Ｌ^１は以下の構造：
－ＣＯ－Ｌ^５－ＣＯ－ＮＲ^４－Ｌ^６－
（式中、Ｌ^５は置換されていてもよいＣ_６～１２アリーレンまたは置換されていてもよいＣ_５～１０ヘテロシクリレンであり；
Ｌ^６は置換されていてもよいＣ_１～１２アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～１２アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～１２アルキニレンである）
を有する。

【0084】

Ｌ^５は置換されていてもよいフェニレンであり得、好ましくは非置換フェニレンである。

【0085】

Ｌ^６は、置換されていてもよいＣ_１～１２アルキレン、好ましくは置換されていてもよいＣ_２～６アルキレン、より好ましくは－（ＣＨ_２）_４－であり得る。

【0086】

Ｒ^４は、好ましくはＨである。

【0087】

Ｌ^２はＮＲ^４であり得る。Ｒ^４は、好ましくはＨである。

【0088】

したがって、一部の実施形態では、式ＩＶのポリマーは式ＩＶａ：

【0089】

【化3】

【0090】

を有する。

【0091】

両親媒性ポリマー鎖は、少なくとも１ｋＤａ、少なくとも２ｋＤａ、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１５ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも２２ｋＤａ、少なくとも２４ｋＤａ、少なくとも２４．５ｋＤａまたは少なくとも２４．８ｋＤａの数平均分子量を有し得る。両親媒性ポリマー鎖は、２５０ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、７５ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２８ｋＤａ未満、２６ｋＤａ未満、２５．５ｋＤａ未満または２５ｋＤａ未満の数平均分子量を有し得る。両親媒性ポリマー鎖は、１～２５０ｋＤａの間、２～１００ｋＤａの間、５～７５ｋＤａの間、１０～５０ｋＤａの間または１５～４０ｋＤａの間、より好ましくは２０～３０ｋＤａの間、２２～２８ｋＤａの間、２４～２６ｋＤａの間または２４．５～２５．５ｋＤａの間、最も好ましくは２４．８～２５ｋＤａの間の数平均分子量を有し得る。

【0092】

ｎは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８の整数であり得る。ｎは、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満または１０未満の整数であり得る。ｎは、１～５０の間、２～４０の間、３～３０の間、４～２５の間、５～２０の間、６～１５の間、７～１２の間または８～１０の間の整数であり得る。

【0093】

あるいは、ｎは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも９０または少なくとも９５の整数であり得る。ｎは、５，０００未満、１，０００未満、５００未満、２５０未満、１５０未満、１２５未満、１１０未満または１０５未満の整数であり得る。ｎは、５～５，０００の間、１０～１，０００の間、１５～５００の間、２５～２５０の間、５０～１５０の間、７５～１２５の間、９０～１１０の間または９５～１０５の間の整数であり得る。典型的には、ｎは、１０～１，０００の間、１５～７５０の間、２５～５００の間、４０～２５０の間、６０～２００の間、９０～１７０の間、１１０～１５０の間、または１２０～１４０の間の整数であり得る。

【0094】

さらなる代替実施形態では、ｎは、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０または少なくとも１，５００の整数であり得る。

【0095】

一部の実施形態では、ｍは少なくとも１である整数であり得る。したがって、ｍは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０または少なくとも４５の整数であり得る。ｍは、１，０００未満、５００未満、２５０未満、１５０未満、１００未満、８０未満、７０未満、６０未満または５５未満の整数であり得る。ｍは、５～１，０００の間、１０～５００の間、１５～２５０の間、２０～１５０の間、２５～１００の間、３０～８０の間、３５～７０の間、４０～６０の間または４５～５５の間の整数であり得る。

【0096】

ｍが少なくとも１である整数である実施形態では、ｎのｍに対する比は、１：２５～５０：１の間、１：１０～３０：１の間、１：５～１５：１の間、１：２～１０：１の間、１：１～５：１の間または１．５：１～３：１の間であり得る。一部の実施形態では、ｎのｍに対する比は２：１である。

【0097】

ｎのｍに対する比の制御により両親媒性ポリマーの親水性が制御され得ることが認識され得る。

【0098】

Ｌ^１は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレンであり得る。より好ましくは、Ｌ^１は、置換されていてもよいＣ_１～６アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～６アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～６アルキニレンであり、最も好ましくは、Ｌ^１は、Ｃ_１～３アルキレン、Ｃ_２～３アルケニレンまたはＣ_２～３アルキニレンである。したがって、Ｌ^１は－ＣＨ_２－であり得る。

【0099】

Ｌ^２は、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み得る。一部の実施形態では、Ｌ^２は、ＣＯおよびＮＲ^４から選択される１つもしくは２つのリンカー要素を含み得るか、またはこれらであり得る。代替実施形態では、Ｌ^２は、ＣＯ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つもしくは複数のリンカー要素を含み得るか、またはこれらであり得、より好ましくは、Ｌ^２は、ＣＯおよびＯの１つまたは２つのリンカー要素を含み得る。したがって、Ｌ^２はＯ、ＣＯまたはＣＯＯであり得る。

【0100】

Ｌ^３は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み得る。

【0101】

一部の実施形態では、Ｌ^３は－Ｌ^７－Ｌ^８－Ｌ^９－であり得、Ｌ^７およびＬ^９が独立して、非存在であるか、または置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレンもしくは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレンであり；Ｌ^８は独立して、非存在であり得るか、またはＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つもしくは複数のリンカー要素を含み得、Ｌ^７～Ｌ^８の少なくとも１つが存在する。

【0102】

Ｌ^７およびＬ^９は独立して、置換されていてもよいＣ_１～１５アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～１５アルキニレンであり得、より好ましくは、Ｌ^７およびＬ^９は独立して、置換されていてもよいＣ_１～６アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～６アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～６アルキニレンであり、最も好ましくは、Ｌ^７およびＬ^９は独立して、Ｃ_１～３アルキレン、Ｃ_２～３アルケニレンまたはＣ_２～３アルキニレンである。したがって、Ｌ^７およびＬ^９はそれぞれ－ＣＨ_２ＣＨ_２－であり得る。

【0103】

Ｌ^８はＣＯ、ＣＯＯ、ＯまたはＳであり得、好ましくはＯまたはＳであり、より好ましくはＳである。

【0104】

Ｌ^４は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレン、ＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つまたは複数のリンカー要素を含み得る。

【0105】

一部の実施形態では、Ｌ^４は－Ｌ^１０－Ｌ^１１－であり得、Ｌ^１０は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレンであり；Ｌ^１１は非存在であり得るか、またはＣＯ、Ｏ、ＳおよびＮＲ^４からなる群から選択される１つもしくは複数のリンカー要素を含み得る。

【0106】

Ｌ^１０は、置換されていてもよいＣ_１～３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～３０アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～３０アルキニレンであり得、より好ましくは、Ｌ^１０は、置換されていてもよいＣ_{１０～１５}アルキレン、置換されていてもよいＣ_{１０～１５}アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_{１０～１５}アルキニレンであり、最も好ましくは、Ｌ^１０は、分岐Ｃ_{１０～１５}アルキレン、分岐Ｃ_{１０～１５}アルケニレンまたは分岐Ｃ_{１０～１５}アルキニレンである。したがって、Ｌ^１０は－ＣＨ_２ＣＨ（（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３）－であり得る。

【0107】

Ｌ^１１はＯまたはＳであり得、好ましくはＯである。

【0108】

Ｒ^２はＨまたは置換されていてもよいＣ_１～１２アルキルであり得る。より好ましくは、Ｒ^２はＨまたは置換されていてもよいＣ_１～６アルキルであり、さらにより好ましくは、Ｒ^２は置換されていてもよいＣ_１～３アルキルである。したがって、Ｒ^２は、置換されていてもよいメチル、置換されていてもよいエチルまたは置換されていてもよいプロピルであり得る。アルキルは、Ｃ_６～２０アリールまたは５～２０員ヘテロアリールで置換されていてもよい。アルキルはフェニルで置換されていてもよい。したがって、一部の実施形態では、Ｒ^２は－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５である。

【0109】

Ｒ^３はＨまたは置換されていてもよいＣ_１～１２アルキルであり得る。より好ましくは、Ｒ^３はＨまたは置換されていてもよいＣ_１～６アルキルであり、さらにより好ましくは、Ｒ^３はＨまたは置換されていてもよいＣ_１～３アルキルである。

【0110】

Ｘ^１はＯ、ＳまたはＮＲ^５であり得る。Ｘ^１は、好ましくはＯである。

【0111】

したがって、一部の実施形態では、ポリマーは、国際公開第２０２１／２６０３９２号に記載される、ポリマーＬ_１００Ｆ_５０であり得る。Ｌ_１００Ｆ_５０の構造は以下に提供される。

【0112】

【化4】

【0113】

式Ｉの範囲に入る代替多官能性、膜透過化マルチブロックポリマーも国際公開第２０２１／２６０３９２号に記載される方法を使用して調製され得ることが認識されるだろう。

【0114】

一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも１％はＯＨであり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも５％、少なくとも１０％または少なくとも１５％はＯＨであり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも２０％、少なくとも２２％または少なくとも２４％はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３５％はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の９９％未満、９５％未満または９０％未満はＯＨであり、より好ましくはポリマー中のＲ^１基の８５％未満はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の７５％未満、６０％未満、５０％未満または４５％未満はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の４０％未満、３５％未満、３０％未満、２８％未満または２６％未満はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の１～９９％の間はＯＨであり、より好ましくはポリマー中のＲ^１基の５～８５％の間はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の１０～６０％の間または１５～４０％の間、２０～３５％の間、２２～３０％の間または２４～２６％の間はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の１０～８０％の間または１５～７０％の間、２０～６０％の間、３０～５０％の間または３５～４５％の間はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の５０～９２％の間または６０～９０％の間、７０～８８％の間、７５～８６％の間または８０～８４％の間はＯＨである。

【0115】

一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも１％、少なくとも５％または少なくとも１０％はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０であり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも１５％はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも６０％はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７２％または少なくとも７４％はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の９９％未満はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０であり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の９５％未満、９０％未満または８５％未満はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０であり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の８０％未満、７８％未満または７６％未満はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の７０％未満または６５％未満はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の６０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満または２０％未満はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の１～９９％の間、５～９８％の間または１０～９７％の間はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０であり、より好ましくは、ポリマー中のＲ^１基の１５～９５％の間はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の４０～９０％の間、６０～８５％の間、６５～８０％の間、７０～７８％の間または７４～７６％の間はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の２０～８０％の間、３０～７５％の間、４０～７０％の間、５０～６７．５％の間、５５～６５％の間または５７．５～６２．５％の間はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の２．５～６０％の間、５～５０％の間、７．５～４０％の間、１０～３０％の間、１２．５～２５％の間または１５～２０％の間はＮＲ^６Ｒ^７またはＯＲ^１０である。

【0116】

代替実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも３０％はＯＨであり、ポリマー中のＲ^１基の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％はＯＨである。一部の実施形態では、ポリマー中のＲ^１基の１００％はＯＨであり得る。ｍが少なくとも１の整数である場合に、この実施形態が好ましい。

【0117】

ＯＨであるＲ^１基のパーセンテージを制御することにより、ポリマーの親水性が制御され得ることが認識され得る。

【0118】

一部の実施形態では、ポリマーは式ＩＶａのポリマーであり、ポリマー中のＲ^１基の１００％はＯＨである。

【0119】

Ｒ^６およびＲ^７は独立して、それぞれＨ、置換されていてもよいＣ_１～２０アルキル、置換されていてもよいＣ_２～２０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～２０アルキニルであり得る。より好ましくは、Ｒ^６およびＲ^７は独立して、それぞれＨ、置換されていてもよいＣ_１～１２アルキル、置換されていてもよいＣ_２～１２アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～１２アルキニルであり得る。

【0120】

Ｒ^６はＨであり得る。

【0121】

一実施形態では、Ｒ^７は、置換されていてもよいＣ_１～６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～６アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_２～６アルキニルであり得る。アルキル、アルケニルまたはアルキニルは非置換であっても、１つまたは複数の上に定義される置換基で置換されていてもよい。一部の実施形態では、アルキル、アルケニルまたはアルキニルが非置換であるか、またはハロゲン、ＣＯＯＨ、オキソ、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールもしくは置換されていてもよい３～２０員複素環のうちの１つもしくは複数で置換されている。好ましくは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルは、ハロゲン、ＣＯＯＨ、オキソ、Ｃ_６～２０アリール、Ｃ_３～２０シクロアルキル、Ｃ_３～２０シクロアルケニル、Ｃ_３～２０シクロアルキニル、５～２０員ヘテロアリールまたは３～２０員複素環のうちの１つまたは複数で置換されている。一部の実施形態では、アルキルは、ＣＯＯＨで置換されており、場合によりフェニルまたは１Ｈ－インドリルでさらに置換されている。

【0122】

したがって、Ｒ^７は

【0123】

【化5】

【0124】

であり得る。より好ましくは、Ｒ^７は

【0125】

【化6】

【0126】

である。一部の実施形態では、Ｒ^７は

【0127】

【化7】

【0128】

であり、より好ましくは

【0129】

【化8】

【0130】

である。したがって、ポリマーはフェニルアラニン側鎖を含み得る。

【0131】

一部の実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つのＲ^１基がＮＲ^６Ｒ^７であり、Ｒ^６がＨであり、Ｒ^７が

【0132】

【化9】

【0133】

である、式ＩＶａのポリマーである。

【0134】

より好ましくは、Ｒ^７は

【0135】

【化10】

【0136】

である。最も好ましい実施形態では、Ｒ^７は

【0137】

【化11】

【0138】

である。

【0139】

代替実施形態では、Ｒ^７は、置換されていてもよいＣ_３～２５アルキル、置換されていてもよいＣ_３～２５アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_３～２５アルキニルである。より好ましくは、Ｒ^７は、置換されていてもよいＣ_５～２０アルキル、置換されていてもよいＣ_５～２０アルケニルまたは置換されていてもよいＣ_５～２０アルキニルである。アルキル、アルケニルまたはアルキニルは非置換であっても、１つもしくは複数の上に定義される置換基で置換されていてもよい。一部の実施形態では、アルキル、アルケニルまたはアルキニルが非置換であるか、またはハロゲン、ＣＯＯＨ、オキソ、置換されていてもよいＣ_６～２０アリール、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ_３～２０シクロアルキニル、置換されていてもよい５～２０員ヘテロアリールもしくは置換されていてもよい３～２０員複素環のうちの１つもしくは複数で置換されている。一部の実施形態では、Ｒ^７はＣ_５～２０非置換アルキルである。代替実施形態では、Ｒ^７はＣ_５～２０置換アルキルである。アルキルはＣＯＯＨで置換されていてもよい。

【0140】

したがって、Ｒ^７は、－（ＣＨ_２）_６ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_１１ＣＯＯＨであり得る。

【0141】

一部の実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つのＲ^１基がＮＲ^６Ｒ^７であり、Ｒ^６がＨであり、Ｒ^７が－（ＣＨ_２）_６ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_１１ＣＯＯＨである、式ＩＶａのポリマーである。

【0142】

これらのポリマーは、疎水性ペンダント鎖およびイオン化可能カルボン酸基を含有するアニオン性両親媒性ポリカルボン酸塩である。これらは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンスパイク中のアニオン性融合ペプチドの構造およびｐＨ応答性膜透過化活性を模倣するように設計される。これらのバイオミメティックポリマーは、合成が簡単であり、ｐＨがそれらのｐＫａより下に低下すると、コイル状から球状にコンフォメーションが変化する能力により、ｐＨ応答性膜活性を示す。

【0143】

複数のポリマー鎖は脂質構造にコンジュゲートしていてもよいし、脂質構造にコンジュゲートしていなくてもよい。好ましい実施形態では、複数のポリマー鎖は脂質構造にコンジュゲートしていない。複数のポリマー鎖は、静電力および／または疎水力により脂質構造と相互作用し得る。

【0144】

サブミクロン粒子は、少なくとも１００個または少なくとも５００個のポリマー鎖、より好ましくは少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも４，０００個、少なくとも６，０００個、少なくとも８，０００個または少なくとも１０，０００個のポリマー鎖を含み得る。サブミクロン粒子は、５０～１，０００，０００個の間のポリマー鎖、または１００～１００，０００個の間または５００～５０，０００個の間のポリマー鎖、より好ましくは１，０００～４０，０００個の間、２，０００～３０，０００個の間、４，０００～２５，０００個の間、６，０００～２０，０００個の間、８，０００～１５，０００個の間または１０，０００～１３，０００個の間のポリマー鎖を含み得る。

【0145】

サブミクロン粒子は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度でポリマー鎖を含み得る。サブミクロン粒子は、０．０１～２５ｍｇ／ｍｌの間、０．０５～１０ｍｇ／ｍｌの間、０．１～５ｍｇ／ｍｌの間、０．２～２．５ｍｇ／ｍｌの間、０．２５～２ｍｇ／ｍｌの間、０．３～１．５ｍｇ／ｍｌの間または０．５～１ｍｇ／ｍｌの間の濃度でポリマー鎖を含み得る。

【0146】

一部の実施形態では、脂質構造の外面が、複数のポリマー鎖で完全に飽和している。

【0147】

サブミクロン粒子は１つまたは複数の脂質構造を含み得ることが認識され得る。より好ましくは、サブミクロン粒子は単一脂質構造を含み得る。したがって、上に示されるポリマー鎖の数は、脂質構造１つ当たりのポリマー鎖の数、好ましくは脂質ナノ粒子１個当たりのポリマー鎖の数と見なされ得る。

【0148】

サブミクロン粒子は、２０℃で少なくとも５、２０℃で少なくとも６、２０℃で少なくとも６．５または２０℃で少なくとも７のｐＨで負に帯電し得る。サブミクロン粒子は、２０℃で５～９の間、２０℃で６～８の間または２０℃で６．５～７．５の間のｐＨで負に帯電し得る。

【0149】

サブミクロン粒子は、第２のペイロード分子を含み得る。第２のペイロード分子は、好ましくは脂質構造に封入されている。代替的にまたは追加的に、第２のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。第１のペイロード分子および第２のペイロード分子は異なるタイプ、種または構造であってもよい。

【0150】

第２のペイロード分子は、好ましくは医薬品有効成分（ＡＰＩ）またはその構成成分、またはそのファシリテーターもしくはイネイブラー、例えば酵素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等）であり得る。第２のペイロード分子は疎水性または親水性の第２のペイロード分子であり得る。第２のペイロード分子は高分子または小分子であり得る。

【0151】

小分子が、９００ダルトン未満の分子量を有する分子であると考えられ得ることが認識され得る。一部の実施形態では、小分子が、８００ダルトン未満、７００ダルトン未満、６００ダルトン未満、５００ダルトン未満または４００ダルトン未満の分子量を有し得る。

【0152】

低分子量の化学実体として定義されるいずれの小分子薬物も第２のペイロード分子として使用され得る。例えば、抗がん薬および抗炎症薬、例えばステロイドが使用され得る。追加の例としては、ルキソリチニブおよび他のヤヌスキナーゼ阻害剤、ドキソルビシン、トファシチニブ、クルクミン、パクリタキセル、シスプラチン、ブプレノルフィン、アスピリン、イブプロフェン、またはナプロキセン等が挙げられ得る。

【0153】

有利なことに、本発明者らは、サブミクロン粒子が核酸などの高分子と第２のペイロード分子を同時送達することができることを示した。

【0154】

サブミクロン粒子は、少なくとも１つの安定化分子をさらに含み得る。少なくとも１つの安定化分子は脂質構造に封入されていてもよい。代替的にまたは追加的に、少なくとも１つの安定化分子は脂質構造の外側に配置されていてもよい。一部の実施形態では、脂質構造の外側の少なくとも１つの安定化分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。

【0155】

該または各安定化分子は炭水化物および／またはポリオールであり得る。

【0156】

炭水化物は糖と呼ばれ得る。炭水化物は、グルコース；ガラクトース；フルクトース；マンノース；およびキシロースからなる群から選択され得る単糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。あるいは、炭水化物は、トレハロース；スクロース；ラクトース；マルトース；イソマルトース；ラクチトール；ラクツロース；マンノビオース；およびイソマルトからなる群から選択され得る二糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。さらなる代替では、炭水化物は、ニゲロトリオース；マルトトリオース；メレジトース；マルトトリウロース（ｍａｌｔｏｔｒｉｕｌｏｓｅ）；ラフィノース；およびケストースからなる群から選択され得る三糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。さらなる代替では、炭水化物は、デキストラン；アミロース；アミロペクチン；グリコーゲン；ガラクトゲン；イヌリン；カロース；セルロース；キトサン；およびキチンからなる群から選択され得る多糖またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。

【0157】

炭水化物は、ソルビトール；マンニトール；グリセロール；アルファ－Ｄ－グルコピラノシル－１－６－ソルビトール；アルファ－Ｄ－グルコピラノシル－１－６－マンニトール；マルト－オリゴ糖；水素化マルトオリゴ糖、デンプンおよびセルロースからなる群から選択され得るポリオールまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。

【0158】

代替的にまたは追加的に、ポリオールは、複数のヒドロキシル基を含むオリゴマー；複数のヒドロキシル基を含むポリマーまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型であり得る。

【0159】

少なくとも１つの安定化分子は、少なくとも２つの異なる安定化分子を含み得る。各安定化分子は炭水化物であり得る。一実施形態では、第１の安定化分子が二糖（例えば、トレハロース）であり得、第２の安定化分子が多糖（例えば、デキストラン）であり得る。

【0160】

一部の実施形態では、炭水化物は二糖、最も好ましくはトレハロース、またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形型である。トレハロースは合成トレハロースであっても天然トレハロースであってもよい。

【0161】

有利なことに、本発明者らは、驚くべきことに、サブミクロン粒子がトレハロースを含む場合、凍結乾燥と水溶液中の両方の核酸などの高分子を室温で長期間にわたって安定化することができることを実証した。さらに、４０℃での貯蔵も強化される。これは全く予想外であった。

【0162】

好ましくは、第１の態様のサブミクロン粒子は熱的に安定化されている。

【0163】

「熱安定化」または「熱的に安定化されている」という表現は、サブミクロン粒子が、ある特定の温度で一定期間貯蔵された場合に、その生物学的活性を実質的に保持する（例えば、それを投与された対象において免疫応答および／またはタンパク質発現を誘発する）ことを意味することができることが認識されよう。本発明者らは、いかなる仮説によっても拘束されることを望まないが、例えばその凝集を防止もしくは低減することによって；ペイロードの漏出を最小化することによって；ペイロード分子（好ましくはＲＮＡ）自体を安定化することによって；および／またはサブミクロン粒子を安定化してコロイド安定性を改善することによって、製剤中の脂質構造を安定化することによって、熱安定化効果が実現され得ると考えている。ペイロード分子（好ましくはＲＮＡ）の機能的活性が保持されているかどうか、またはその程度は、例えばＲＮＡ構築物によってコードされている目的の抗原に対する免疫特異抗体（例えば、ＩｇＧ）の存在を検出するおよび／または目的のタンパク質の発現を検出することによって決定することができる。

【0164】

好ましくは、サブミクロン粒子は、－１００℃以上、－８０℃以上、－６０℃以上、－４０℃以上または－２０℃以上、より好ましくは－１５℃以上、最も好ましくは－１０℃以上の温度での貯蔵後に熱的に安定化されている。好ましくは、サブミクロン粒子は、－５℃以上、より好ましくは０℃以上、最も好ましくは１℃以上の温度での貯蔵後に熱的に安定化されている。最も好ましくは、サブミクロン粒子は、２℃以上、より好ましくは３℃以上、最も好ましくは４℃以上の温度での貯蔵後に熱的に安定化されている。さらにより好ましくは、サブミクロン粒子は、５℃以上、より好ましくは６℃以上、最も好ましくは７℃以上の温度での貯蔵後に熱的に安定化されている。

【0165】

サブミクロン粒子は、１００℃未満、８０℃未満、６０℃未満、５０℃未満、４０℃未満、３５℃未満、または３０℃未満の温度での貯蔵後に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、２５℃未満、２０℃未満、または１５℃未満の温度での貯蔵後に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、１０℃未満、８℃未満、または７℃未満の温度での貯蔵後に熱的に安定化され得る。

【0166】

サブミクロン粒子は、－１００℃～１００℃の間、－８０℃～９０℃の間、－６０℃～８０℃の間、－４０℃～７０℃の間、－２０℃～６０℃の間、－２０℃～５０℃の間、－２０℃～４０℃の間、－２０℃～３５℃の間、－２０℃～３０℃の間、－１５℃～２５℃の間、または－１０℃～２０℃の間の温度での貯蔵後に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、－５℃～１５℃の間、０℃～１０℃の間、１℃～９℃の間、または２℃～８℃の間の温度での貯蔵後に熱的に安定化され得る。

【0167】

サブミクロン粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドまたは部分を含み得る。少なくとも１つの標的化リガンドまたは部分は、サブミクロン粒子の外面上に配置され得る。したがって、少なくとも１つの標的化リガンドまたは部分は、脂質構造の外面上および／または両親媒性ポリマー鎖上に配置され得る。

【0168】

少なくとも１つの標的化リガンドまたは部分は、ペプチド、タンパク質、アプタマー、炭水化物、オリゴ糖、葉酸もしくは葉酸塩、および抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ビタミンもしくはその誘導体のうちの少なくとも１つであり得るか、またはこれを含み得る。ペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＣＲ）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）、またはその誘導体であり得る。タンパク質は、レクチン、トランスフェリン、またはその誘導体であり得る。アプタマーは、ＨＩＶ糖タンパク質に対するＲＮＡアプタマー、またはその誘導体であり得る。炭水化物は上に定義される通りであり得る。特に、炭水化物は、マンノース、グルコース、ガラクトース、またはその誘導体であり得る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、またはその誘導体であり得る。ビタミンはビタミンＤであり得る。

【0169】

本発明者らは、本発明のペイロード送達システムおよびサブミクロン粒子を製造する新規な方法を考案した。

【0170】

よって、第２の態様によると、サブミクロン粒子を製造する方法であって、第１のペイロード分子、脂質構造および複数の両親媒性ポリマー鎖を合わせてサブミクロン粒子を生成することを含み、第１のペイロード分子は高分子、場合により核酸であり、両親媒性ポリマー鎖の親水性は外部刺激に応じて変化する、方法が提供される。

【0171】

好ましくは、第２の態様の方法は、第１の態様のサブミクロン粒子を製造する。

【0172】

有利には、および好ましくは、第２の態様の方法は、脂質ナノ粒子およびリポソーム系を含む既存の脂質構造を修飾するために使用され得る。

【0173】

第１のペイロード分子、脂質構造（複数の脂質を含む）および複数の両親媒性ポリマー鎖は、第１の態様に関して定義される通りであり得る。

【0174】

第１のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。好ましくは、第１のペイロード分子は脂質構造に封入されている。

【0175】

したがって、本方法は、第１のペイロード分子と複数の脂質を接触させて、第１のペイロード分子を封入している脂質構造を生成することを含み得る。本方法は、その後、脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させて、サブミクロン粒子を生成することを含み得る。

【0176】

一部の実施形態では、本方法は、第１のペイロード分子、第２のペイロード分子および複数の脂質を接触させて、第１および第２のペイロード分子を封入しているか、またはその外面上で、第１および第２のペイロード分子と共有結合によりコンジュゲートおよび／もしくは物理的に付着している脂質構造を生成することと；その後、脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させて、サブミクロン粒子を生成することとを含み得る。

【0177】

第２のペイロード分子は、好ましくは脂質構造に封入されている。あるいは、第２のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。第２のペイロード分子は、好ましくは第１のペイロード分子とは異なる、すなわち、異なるタイプ、種または化学構造であることに関して異なる。

【0178】

一部の実施形態では、本方法は、第１のペイロード分子、少なくとも１つの安定化分子および複数の脂質を接触させて、第１のペイロード分子および少なくとも１つの安定化分子を含有する脂質構造を生成することと；その後、脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させて、サブミクロン粒子を生成することとを含み得る。第１のペイロード分子は、好ましくは脂質構造に封入されている。あるいは、第１のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。少なくとも１つの安定化分子は脂質構造に封入されていてもよい。代替的に、または追加的に、少なくとも１つの安定化分子は脂質構造の外側に配置されていてもよい。

【0179】

一部の実施形態では、本方法は、第１のペイロード分子、第２のペイロード分子、少なくとも１つの安定化分子および複数の脂質を接触させて、第１および第２のペイロード分子ならびに少なくとも１つの安定化分子を含有する脂質構造を生成することと；その後、脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させて、サブミクロン粒子を生成することとを含み得る。第１のペイロード分子および第２のペイロード分子は、好ましくは脂質構造に封入されている。あるいは、第１および／または第２のペイロード分子は、脂質構造の外面に共有結合によりコンジュゲートおよび／または物理的に付着していてもよい。少なくとも１つの安定化分子は脂質構造に封入されていてもよい。代替的に、または追加的に、少なくとも１つの安定化分子は脂質構造の外側に配置されていてもよい。

【0180】

第１のペイロード分子と複数の脂質を接触させて、脂質構造を形成することは、溶液中で第１のペイロード分子と複数の脂質を含む脂質膜を接触させることと、溶液を押し出して、第１のペイロード分子を封入している脂質構造を生成することとを含み得る。それらが存在する実施形態では、第２のペイロード分子および該／または少なくとも１つの安定化分子は溶液中で第１のペイロードおよび脂質膜と接触し、その後、脂質構造に封入され得ることが認識されよう。溶液は水を含み得る。溶液は緩衝液を含み得る。好ましくは、溶液は実質的にＲＮＡｓｅを含まない。溶液は、リン酸水素二ナトリウムおよび／または塩化ナトリウムを含み得る。一部の実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、より好ましくはダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）が使用される。

【0181】

本方法は、溶液を、膜を通して押し出すことを含み得る。膜は、０．００５～５０μｍの間、０．０１～１０μｍの間、０．０５～５μｍの間、０．１～３μｍの間、または０．１５～０．２５μｍの間のサイズを有し得る。本方法は、溶液を１～１０，０００回の間、５～１，０００回の間、１０～５００回の間、１５～２５０回の間、２０～１００回の間、２５～５０回の間または２８～３５回の間押し出すことを含み得る。

【0182】

本方法は、溶液中で脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を接触させることを含み得る。溶液は水を含み得る。溶液は緩衝液を含み得る。好ましくは、溶液は実質的にＲＮＡｓｅを含まない。溶液は、リン酸水素二ナトリウムおよび／または塩化ナトリウムを含み得る。一部の実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、より好ましくはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）が使用される。

【0183】

本方法は、脂質構造と複数の両親媒性ポリマー鎖を少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間または少なくとも１２時間接触させることを含み得る。

【0184】

本方法は、過剰のポリマー鎖を除去することを含み得る。過剰のポリマー鎖は、透析、遠心分離または超遠心分離を使用して除去され得る。

【0185】

本発明者らは、本発明のサブミクロン粒子がそれ自体新規であると考えている。

【0186】

よって、第３の態様によると、第２の態様の方法によって得られたまたは得ることができるサブミクロン粒子が提供される。

【0187】

第４の態様によると、複数の第１または第３の態様のサブミクロン粒子を含む組成物が提供される。

【0188】

一部の実施形態では、組成物が医薬組成物であり、薬学的に許容されるビヒクルを含む。

【0189】

組成物は溶媒を含み得る。溶媒は緩衝液を含み得る。好ましくは、溶媒は実質的にＲＮＡｓｅを含まない。緩衝液または生理食塩水溶液、例えばダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水または他のこのような細胞培養適合緩衝液を使用することが好ましい。これは、イオンが組成物に追加の安定性を提供するためである。

【0190】

サブミクロン粒子は、１×１０^３～１×１０^２０粒子／ｍｌの間、１×１０^５～１×１０^１５粒子／ｍｌの間、１×１０^７～１×１０^１１粒子／ｍｌの間、１×１０^８～１×１０^１０粒子／ｍｌの間、１×１０^９～５×１０^９粒子／ｍｌの間、２×１０^９～４×１０^９粒子／ｍｌの間、２．５×１０^９～３．５×１０^９粒子／ｍｌの間または２．８×１０^９～３×１０^９粒子／ｍｌの間の濃度で存在し得る。

【0191】

サブミクロン粒子が少なくとも１つの安定化分子を含む実施形態では、少なくとも１つの安定化分子が、１～５０００ｍｇ／ｍｌの間、１０～４０００ｍｇ／ｍｌの間、２０～３０００ｍｇ／ｍｌの間、３０～２０００ｍｇ／ｍｌの間、４０～１０００ｍｇ／ｍｌの間、５０～７５０ｍｇ／ｍｌの間、６０～５００ｍｇ／ｍｌの間、８０～４００ｍｇ／ｍｌの間、１００～３５０ｍｇ／ｍｌの間または２００～３００ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。

【0192】

サブミクロン粒子が少なくとも１つの安定化分子を含む実施形態では、少なくとも１つの安定化分子が、１０～９００ｍｇ／ｍｌの間、２０～８００ｍｇ／ｍｌの間、３０～７００ｍｇ／ｍｌの間、４０～６００ｍｇ／ｍｌの間、５０～５００ｍｇ／ｍｌの間、６０～４５０ｍｇ／ｍｌの間、８０～４００ｍｇ／ｍｌの間、１００～３５０ｍｇ／ｍｌの間または２００～３００ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。

【0193】

あるいは、第４の態様の組成物は溶媒を含まなくてもよい。したがって、組成物は凍結乾燥、真空乾燥、空気乾燥または噴霧乾燥され得る。より好ましくは、組成物は凍結乾燥され得る。

【0194】

第５の態様では、医薬組成物を調製する方法であって、複数の第１または第３の態様のサブミクロン粒子を薬学的に許容されるビヒクルと接触させることを含む方法が提供される。

【0195】

第６の態様では、医薬として使用するための、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、または第４の態様の組成物が提供される。

【0196】

第７の態様では、処置方法であって、治療量の第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、または第４の態様の組成物を、それを必要とする対象に投与するか、または投与したことを含む方法が提供される。

【0197】

第８の態様では、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、または第４の態様の組成物を含むワクチン組成物が提供される。

【0198】

ワクチンは適切なアジュバントを含み得る。

【0199】

第９の態様では、対象において免疫応答を刺激するのに使用するための、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、第４の態様の組成物または第８の態様のワクチンが提供される。

【0200】

免疫応答は、原生動物、細菌、ウイルス、真菌またはがんに対して刺激され得る。

【0201】

本発明の第１０の態様では、対象にワクチン接種する方法であって、治療量の第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、第４の態様の組成物または第８の態様のワクチンを、それを必要とする対象に投与するか、または投与したことを含む方法が提供される。

【0202】

本発明のサブミクロン粒子、組成物またはワクチンは、特に、組成物が使用される方法に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物に組み合わされ得る。よって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル剤、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態または処置を必要とする人もしくは動物に投与され得る任意の他の適切な形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる対象による忍容性が良好であるものであるべきであることが認識されよう。

【0203】

本発明のサブミクロン粒子、組成物またはワクチンはまた、持続または遅延放出デバイス内に組み込まれ得る。このようなデバイスは、例えば、皮膚上または下に挿入され得、医薬は数週間またはさらには数か月間にわたって放出され得る。デバイスは、処置部位に少なくとも隣接して配置され得る。

【0204】

しかしながら、好ましい実施形態では、本発明による医薬が、血流、筋肉、皮膚への注射によってまたは処置を必要とする部位へ直接の注射によって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスもしくは注入）、皮下（ボーラスもしくは注入）、皮内（ボーラスもしくは注入）、筋肉内（ボーラスもしくは注入）、髄腔内（ボーラスもしくは注入）、硬膜外（ボーラスもしくは注入）または腹腔内（ボーラスもしくは注入）であり得る。

【0205】

必要とされるサブミクロン粒子、組成物またはワクチンの量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、これは投与様式、サブミクロン粒子、組成物またはワクチンの生理化学的特性および単剤療法として使用されるか併用療法で使用されるかに依存することが認識されよう。

【0206】

投与頻度は、処置される対象内の活性剤の半減期によっても影響される。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中のサブミクロン粒子、組成物またはワクチン、組成物の強度、投与様式、および処置の種類により変化する。処置される特定の対象に応じた追加の因子は、対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む投薬を調整する必要性をもたらす。

【0207】

必要な用量は、それだけに限らないが、投与される活性剤、処置および／またはワクチン接種される疾患、処置される対象等を含むいくつかの因子に依存し得る。

【0208】

一般的に、使用される活性剤に応じて、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の間または０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量の本発明のサブミクロン粒子、組成物またはワクチンが使用され得る。用量は、送達されるペイロード分子の量に関連していることが理解され得る。

【0209】

用量は、単回投与（例えば、単回注射）として与えられ得る。あるいは、サブミクロン粒子、組成物またはワクチンは、２回以上の投与を必要とし得る。例として、サブミクロン粒子、組成物またはワクチンは、０．０７μｇ～７００ｍｇの間（すなわち、７０ｋｇの体重を仮定）の２つ以上の用量として投与され得る。あるいは、持続放出デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なく、患者に最適用量の本発明によるサブミクロン粒子、組成物またはワクチンを提供することができる。投与経路は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、髄腔内、硬膜外または腹腔内注射経路を組み込み得る。

【0210】

製薬業界によって慣用的に採用されている手順（例えば、インビボ実験、臨床試験等）などの既知の手順を使用して、本発明によるサブミクロン粒子、組成物またはワクチンの特定の製剤、および正確な治療レジーム（薬剤の用量および投与頻度など）を形成することができる。

【0211】

「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または飼育動物であり得る。したがって、本発明による組成物および医薬は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを処置するために使用され得るか、または他の獣医学的用途で使用され得る。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。

【0212】

サブミクロン粒子、組成物またはワクチンの「治療有効量」は、対象に投与された場合に、治療効果をもたらすために必要な上述の量である任意の量である。

【0213】

例えば、本発明のサブミクロン粒子、組成物およびワクチンの治療有効量は、約０．００１ｍｇ～約８００ｍｇのペイロード分子、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇのペイロード分子を含み得る。

【0214】

本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組合せである。

【0215】

一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であり得、組成物は粉末、カプセル剤または錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、保存剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１種または複数の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であり得る。粉末においては、ビヒクルは、本発明による微細活性剤と混和した微細固体である。錠剤においては、活性剤（例えば、本発明のサブミクロン粒子）を、適切な割合で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合し、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。医薬ビヒクルはゲルであり得、組成物はクリームなどの形態であり得る。

【0216】

あるいは、医薬ビヒクルは液体であり得、組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物の調製に使用される。本発明によるサブミクロン粒子は、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調整剤などの他の適切な医薬添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記のような添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えば、グリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画ヤシ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態組成物に有用である。加圧組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。

【0217】

滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および皮下注射によって利用することができる。本発明のサブミクロン粒子は、任意の適切な滅菌注射可能媒体として調製され得る。

【0218】

サブミクロン粒子は、吸入によって投与され得る。例えば、サブミクロン粒子は、エアロゾルの形態で提供され得る。

【0219】

本発明のサブミクロン粒子および／または組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）、ポリソルベート８０（ソルビトールとエチレンオキシドと共重合したその無水物のオレイン酸エステル）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明のサブミクロン粒子および／または本発明による組成物はまた、液体または固体組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒、錠剤、および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル、および懸濁液などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。

【0220】

本明細書に記載される全ての特徴（任意の添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）、および／またはこのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、このような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わされ得る。

【0221】

本発明のより良い理解のために、およびその実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0222】

【図1】ポリマー官能化脂質ナノ粒子（ＰＦ－ＬＮＰ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を含むＲＮＡのＰＦ－ＬＮＰ媒介細胞内送達の概略図である。

【図2】様々な濃度のアニオン性、ウイルスペプチド模倣、膜透過化擬似ペプチドポリマーであるＰＰ７５をＬＮＰに添加した場合（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ重量比＝１：１、４０重量％コレステロール）の、過剰なポリマーを除去するための透析後のＰＰ７５のコーティング密度［Ａ］、ＬＮＰの表面上の密度に基づくＰＰ７５のコーティング効率［Ｂ］を示すグラフである。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図3】ｐＨ７．４でのＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５ポリマーコーティング密度）の生理化学的特性評価：平均流体力学的直径［Ａ］、サイズ分布、粒子濃度およびＰＤＩ値のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）測定［Ｂ］、ならびにゼータ電位測定［Ｃ］を示す図である。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図4】ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１）へのｓａＲＮＡ封入効率に対する、コレステロール含有量（１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子の固定ＰＰ７５密度で）［Ａ］およびポリマーコーティング密度（４０重量％固定コレステロール含有量で）［Ｂ］の効果を示す図である。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図5】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって決定される、ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５コーティング密度）との、それぞれ４、８、２４および４８時間のインキュベーション後の相対Ｈｅｌａ細胞生存率［Ａ］を示す図である。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって決定される、封入ｓａＲＮＡを含むおよび含まないＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５コーティング密度）との２４時間のインキュベーション後の相対ＨｅＬａ細胞生存率［Ｂ］。ＬＤＨアッセイによって決定される、ｓａＲＮＡを封入するおよび封入しないＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５コーティング密度）との２４時間のインキュベーション後の相対ＨｅＬａ細胞生存率［Ｃ］。Ｎ／Ｐ比＝１。平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。

【図6】ｓａＲＮを含む［Ａ］およびｓａＲＮＡを含まない［Ｂ］、様々なｐＨ値でのＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５コーティング密度）との１時間のインキュベーション後の赤血球（ＲＢＣ）の相対溶血を示す図である。Ｎ／Ｐ比＝１。平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。

【図7】ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、１：１［Ａ］、１：２［Ｂ］および１：４［Ｃ］の重量比のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、様々なパーセンテージのコレステロール、ならびに様々なコーティング密度のＰＰ７５からなるＰＦ－ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ比＝１、対照としてのＰＥＩ）との４時間のインキュベーション後のＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを示す図である。ルシフェラーゼ発現を、トランスフェクションの２４時間後に評価し、相対光単位（ＲＬＵ）として表した。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図8】ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、それぞれ０．１、１および１０のＮ／Ｐ比のＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび様々なＰＰ７５コーティング密度）との３時間のインキュベーション後のＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを示す図である。ルシフェラーゼ発現を、トランスフェクションの２４時間後に評価し、相対光単位（ＲＬＵ）として表した。平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図9】ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、様々な濃度のｓａＲＮＡでのＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子）との３時間のインキュベーション後のＨｅｌａ細胞トランスフェクションを示す図である。ルシフェラーゼ発現を、トランスフェクションの２４時間後に評価し、相対光単位（ＲＬＵ）として表した。Ｎ／Ｐ比＝１。平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。

【図10】１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされた、高感度緑色蛍光タンパク質をコードするｓａＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ）を封入したＰＦ－ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ比＝１）および様々な経路阻害剤とインキュベートした場合のＨＥＫ－２９３細胞のレーザー走査型共焦点顕微鏡画像［Ａ］を提供する図である。定量的表示［Ｂ］。

【図11】脚１本当たり５μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡを筋肉内注射した後７日目のＢａｌｂ／Ｃ雌マウスにおけるｆＬｕｃ生物発光のインビボ可視化を提供する図である。画像は、（左から右に）ｓａＲＮＡのみ、ｓａＲＮＡ／ＰＥＩ複合体、ＰＰ７５官能化のないｓａＲＮＡ封入ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロール）、ならびにＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１）、４０重量％コレステロールとそれぞれ１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５密度からなるｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰを示す［Ａ］。１群当たりｎ＝５匹のマウス（ｎ＝１０本の脚）についての平均±標準偏差での線によるルシフェラーゼ発現の定量化［Ｂ］。Ｎ／Ｐ比＝１。＊ｐ＜０．０５。

【図12-1】６週間にわたるＢａｌｂ／Ｃ雌マウスにおける、ヘマグルチニンインフルエンザウイルスコードｓａＲＮＡ（ＨＡ－ｓａＲＮＡ）を封入したＰＦ－ＬＮＰの免疫原性のインビボ評価を示す図である。各時点でのｎ＝５匹のマウスについての、ＥＬＩＳＡによって決定される、ｊｅｔＰＥＩと複合体化されたおよびナイーブのＰＦ－ＬＮＰに封入されたＨＡ－ｓａＲＮＡによる免疫化後の抗体価［Ａ］、マウスの生存率［Ｂ］、および試験期間中のマウスのパーセンテージ体重［Ｃ］。

【図12-2】６週間にわたるＢａｌｂ／Ｃ雌マウスにおける、ヘマグルチニンインフルエンザウイルスコードｓａＲＮＡ（ＨＡ－ｓａＲＮＡ）を封入したＰＦ－ＬＮＰの免疫原性のインビボ評価を示す図である。各時点でのｎ＝５匹のマウスについての、ＥＬＩＳＡによって決定される、ｊｅｔＰＥＩと複合体化されたおよびナイーブのＰＦ－ＬＮＰに封入されたＨＡ－ｓａＲＮＡによる免疫化後の抗体価［Ａ］、マウスの生存率［Ｂ］、および試験期間中のマウスのパーセンテージ体重［Ｃ］。

【図13】ＥＧＦＰをコードするｓａＲＮＡのみ［Ａ］、１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子Ｃｙ５－ＰＰ７５にコーティングされたＰＦ－ＬＮＰに封入されたＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ［Ｂ］および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子Ｃｙ５－ＰＰ７５にコーティングされたＰＦ－ＬＮＰに封入されたＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ［Ｃ］を投与した１時間後のマウスリンパ節のリンパ管を示す図である。蛍光画像はＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ発現を示す。

【図14】ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、ｓａＲＮＡ封入効率に対する、ポリマー官能化なしのＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロール）およびＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子）と同時送達されるルキソリチニブ濃度の効果を示す図である。（Ｎ／Ｐ比＝１、対照としてのＰＥＩ）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図15】ＭＲＣ－５細胞トランスフェクションに対する、ポリマー官能化なしのＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ１：１、４０重量％コレステロール）およびＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子）と同時送達されるルキソリチニブ濃度の効果を示す図である（Ｎ／Ｐ比＝１、対照としてのＰＥＩ）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図16】ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の評価を提供する図である。製剤の流体力学的サイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）［Ａ］、ゼータ電位［Ｂ］ならびにホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定されるｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション［Ｃ］。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図17】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって決定される、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロールおよび１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子）の水溶液中［Ａ］および凍結乾燥［Ｂ］の製剤とのそれぞれ２４時間および４８時間のインキュベーション後の相対ＨＥＫ－２９３細胞生存率を示す図である。Ｎ／Ｐ比＝１。

【図18】溶液中および凍結乾燥後のトレハロースとＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの相互作用を示す概略図である。

【図19】ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で５２週間の貯蔵にわたる製剤の流体力学的サイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図20】ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で５２週間の貯蔵にわたる製剤のゼータ電位。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図21】ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で５２週間の貯蔵にわたるｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図22】ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で５２週間の貯蔵にわたる製剤による４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図23】ｐＨ７．４でのＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロールおよび様々なＰＰ７５ポリマーコーティング密度）の生理化学的特性評価：水溶液および凍結乾燥形態の製剤の平均流体力学的直径およびＰＤＩ値［Ａ］ならびにゼータ電位［Ｂ］を示す図である。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図24】ＰＥＧ化ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロール）へのカルセインおよびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ＝１５０ｋＤａ）封入効率［Ａ］ならびにＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって決定される、ｆＬｕｃ－ｓａＲＮＡ封入効率［Ｂ］を示す図である。

【図25】ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロール＋１ｍｇ／ｍＬ ＰＰ７５）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵にわたる製剤の流体力学的サイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図26】ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロール＋１ｍｇ／ｍＬ ＰＰ７５）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵にわたる製剤のゼータ電位。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図27】ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロール＋１ｍｇ／ｍＬ ＰＰ７５）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵にわたるｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図28】ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、ｓａＲＮＡ封入ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００／コレステロール＋１ｍｇ／ｍＬ ＰＰ７５）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵にわたる製剤による４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図29】ｓａＲＮＡを含まない、ｐＨ７．４での、様々な濃度のＰＰ７５［Ａ］、ＰＬＰ－ＮＤＡ［Ｂ］およびＰＬＰ－ＡＤＡ［Ｃ］ポリマーを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の生理化学的特性評価（平均流体力学的直径、ＰＤＩ値およびゼータ電位）を示す図である：平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図30】ｓａＲＮＡを含む、ｐＨ７．４での、様々な濃度のＰＰ７５［Ａ］、ＰＬＰ－ＮＤＡ［Ｂ］およびＰＬＰ－ＡＤＡ［Ｃ］ポリマーを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の生理化学的特性評価（平均流体力学的直径、ＰＤＩ値およびゼータ電位）を示す図である：平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図31】ＭＣ３ ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）へのカルセインおよびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ＝１５０ｋＤａ）封入効率［Ａ］ならびにＲｉｂｏＧｒｅｅｅｎアッセイによって決定されるｆＬｕｃ－ｓａＲＮＡ封入効率［Ｂ］を示す図である。

【図32】ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、様々な濃度のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡポリマーを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）に封入されたｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを示す図である。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図33】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、様々な濃度のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡポリマーを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）に封入されたｓａＲＮＡによる４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率を示す図である。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図34】ｓａＲＮＡを含まない、様々なｐＨ値でのＭＣ３ ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の生理化学的特性評価（平均流体力学的直径およびＰＤＩ値［Ａ］ならびにゼータ電位［Ｂ］）を示す図である：平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図35】ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤の流体力学的サイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図36】ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃、および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤のゼータ電位。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図37】ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、それぞれ－２０℃、４℃、および２０℃で１１週間の貯蔵にわたるｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図38】ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、それぞれ－２０℃、４℃、および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤による４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図39】ｓａＲＮＡを含まない、ｐＨ７．４での様々な濃度のＰＰ７５［Ａ］、ＰＬＰ－ＮＤＡ［Ｂ］およびＰＬＰ－ＡＤＡ［Ｃ］ポリマーを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の生理化学的特性評価（平均流体力学的直径、ＰＤＩ値およびゼータ電位）を示す図である：平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図40】ｓａＲＮＡを含む、ｐＨ７．４での様々な濃度のＰＰ７５［Ａ］、ＰＬＰ－ＮＤＡ［Ｂ］およびＰＬＰ－ＡＤＡ［Ｃ］ポリマーを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の生理化学的特性評価（平均流体力学的直径、ＰＤＩ値およびゼータ電位）を示す図である：平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図41】ＤＯＤＡＰ ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）へのカルセインおよびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ＝１５０ｋＤａ）封入効率［Ａ］ならびにＲｉｂｏＧｒｅｅｅｎアッセイによって決定されるｆＬｕｃ－ｓａＲＮＡ封入効率［Ｂ］を示す図である。

【図42】ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、様々な濃度のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡポリマーを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）に封入されたｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを示す図である。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図43】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、様々な濃度のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡポリマーを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）に封入されたｓａＲＮＡによる４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率を示す図である。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図44】ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤の流体力学的サイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図45】ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬを含むｓａＲＮＡ封入ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。それぞれ－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤のゼータ電位。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図46】ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定される、それぞれ－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵にわたるｓａＲＮＡのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【図47】ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存する、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むｓａＲＮＡ封入ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ／ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の水溶液中および凍結乾燥の製剤の貯蔵安定性の評価を提供する図である。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して測定される、それぞれ－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵にわたる製剤による４８時間の処理後のＨＥＫ－２９３細胞の相対細胞生存率。（Ｎ／Ｐ比＝１）。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0223】

実施例
実施例１ － ＰＦ－ＬＮＰの調製および特性評価、高い生体適合性および低い細胞傷害性、ならびに効率的な細胞内ＲＮＡ送達を介した高いインビトロトランスフェクション効率
本発明者らは、以下の材料および方法の節で説明されるように、ポリマー官能化脂質ナノ粒子（ＰＦ－ＬＮＰ）を合成した。ＰＦ－ＬＮＰを、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンスパイク中のアニオン性融合ペプチドを模倣する、ＰＰ７５と呼ばれる生体適合性、ｐＨ応答性、エンドソーム溶解性擬似ペプチドポリマーでコーティングした。

【0224】

ＰＰ７５は、７５％の化学量論的置換度で、代謝産物由来の直鎖ポリアミドであるポリ（Ｌ－リジンイソ－フタルアミド）（ＰＬＰ）の骨格にペンダントしたカルボン酸に疎水性アミノ酸Ｌ－フェニルアラニンをグラフトすることによって調製される擬似ペプチドである。バイオミメティックアニオン性両親媒性ポリマーは、インフルエンザウイルスの融合ペプチドに見られる疎水性ペンダント基およびイオン化可能カルボン酸基を含有する。本発明者らは、図１に示されるように、ＰＰ７５が、ウイルススパイクを模倣し、それによって、エンドソーム脱出を介してＰＦ－ＬＮＰを細胞質に送達する、粒子の表面上の擬似ペプチドとして機能し得ることを予想した。

【0225】

ポリマーコーティング効率
図２Ａに示されるように、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５の使用により、ｓａＲＮＡを封入した場合に、ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ重量比＝１：１、４０重量％コレステロール）の表面上に１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５ポリマー密度が得られることが分かった。図２Ｂは、最大１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子がＰＦ－ＬＮＰの表面上に完全にコーティングされたことを示す。１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子では、ＰＰ７５コーティング効率はわずか５０．３±０．４％に低下し、粒子表面がＰＰ７５で飽和していたことを示唆している。全てのインビボ試験について、負の表面電荷およびエンドソーム溶解能力を最大化する目的で飽和粒子のみが使用されることを確実にするために、１．０×１０^４～１．３×１０^４の間のポリマー鎖／粒子を含むＰＦ－ＬＮＰに焦点を当てることが決定された。

【0226】

ＰＦ－ＬＮＰの生理化学的特性評価
図３Ａは、ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的直径に対するポリマー密度の効果を示す。平均粒径は、０．５×１０^４、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰについて、１１０．０±５．６ｎｍで同様であることが見出され、ＰＦ－ＬＮＰのサイズは、以前の研究^９によって予想されるように、ＰＰ７５コーティングのないＬＮＰよりもわずかに大きかった。２００ｎｍ以下のサイズの粒子が、細胞膜内のクラスリンでコーティングされた穴を介して細胞に進入することができることが実証されている^１０。図３Ｂは、粒子の濃度およびサイズ分布を示す。４０重量％のコレステロールを含むＰＦ－ＬＮＰの濃度は、２．９×１０^９±０．７×１０^９粒子／ｍＬであった。粒子が濃縮されるほど、より高いｓａＲＮＡ用量をより少ない体積で投与することができる。粒子は、１０～４０重量％のコレステロール濃度でＰＤＩ＜０．６の狭いサイズ分布を有した。図３Ｃのゼータ電位データによって示される、粒子の電荷は、ＰＰ７５コーティングのないＰＦ－ＬＮＰについての＋１２．０±５．８６ｍＶから１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子を含むＰＦ－ＬＮＰについての－４１．７±３．７１ｍＶまで変化した。正電荷から負電荷への切り替えは、０．５×１０^４～１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子の間で生じた。負電荷は、リンパ節への排出がより効率的であり（以下に記載される実施例４で証明される）、高レベルの抗体産生を誘因するため^１１、ワクチン用途に有益である。核酸送達に広く使用されている、正の表面電荷を有するカチオン性またはイオン化可能ＬＮＰは、リンパ節への排出効率を損なうおそれがあるため、これはこの送達システムの大きな利点の１つである。

【0227】

ＰＦ－ＬＮＰへのｓａＲＮＡのインサイチュ担持
ＰＦ－ＬＮＰへのｓａＲＮＡのインサイチュ担持も調査した。ｓａＲＮＡ（約９５００ｎｔ）は大きく、ｍＲＮＡなどの他の核酸と比較して高度に負に帯電している。したがって、送達システムを最適化して最大封入効率を可能にすることが重要である。図４Ａは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰのｓａＲＮＡ封入効率が、コレステロール含有量に依存していたことを示す。コレステロール含有量が増加するにつれて、封入効率が増加した。４０重量％コレステロールのＰＦ－ＬＮＰＳが、最も高いｓａＲＮＡ封入をもたらした。これは、コレステロールが、ポリマーと粒子が相互作用する機序を変化させ；これが系の剛性に影響を及ぼし得る可能性のためである^９。コレステロールなしでは、図４Ａは、比較的低いｓａＲＮＡ封入効率を示す。これは、脂質膜の無極性領域に埋め込まれている、水溶液中のＰＰ７５の不安定な疎水性側鎖に起因する可能性があり^１２、コレステロールが系に導入されると、脂質パッキングがより凝縮され^１３、膜をより剛性にする^１４。これにより、系の透過性が低下し^１５、ｐＨ７．４でより高い封入効率および漏出減少を達成することが可能になる。

【0228】

図４Ｂは、０．５×１０^４、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰ（４０重量％の固定コレステロール含有量）のｓａＲＮＡ封入効率を示す。封入効率は、０．５×１０^４鎖／粒子のＰＰ７５密度で８７．２±９．８％のピークになり、次いで、１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５密度で５１．３±２．４％まで低下した。全てのｓａＲＮＡが膜の内側に封入されているわけではない可能性がある；一部は表面に付着している可能性があり、このｓａＲＮＡの相互作用は考慮する価値がある。ポリマー密度の増加に伴う封入効率の低下の理由は、脂質膜上の疎水性を高め、ＰＰ７５と粒子の疎水性相互作用を、脂質膜を通した転位によるのではなく、主に表面にさせる、４０重量％コレステロールの存在に起因し得る^１３。表面でのこの増加した電荷密度は、粒子の表面上の静電反発を介して高度に負に帯電したｓａＲＮＡと衝突し、一部のｓａＲＮＡが表面に結合するのを防ぎ得る。

【0229】

したがって、１：１のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ比、４０重量％コレステロール、および０．５×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子を使用すると、ＰＦ－ＬＮＰにおいて約９０％の最大封入効率が得られることが分かった。

【0230】

ＰＦ－ＬＮＰの細胞傷害性
Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して、ＨｅＬａ子宮頸がん細胞の代謝活性に対するｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの効果を調査した。図５Ａは、０．５×１０^４、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ＝１：１、４０重量％コレステロール）、ならびにｓａＲＮＡのみおよびＰＰ７５コーティングなしのｓａＲＮＡ封入ＬＮＰとインキュベートした場合の４８時間にわたるＨｅＬａ細胞生存率を示す。概して、相対細胞生存率は、６６．１±０．３％～９８．２±０．２％の間のままであり、全ての試料について時間の経過と共に徐々に低下した。ｓａＲＮＡについての相対細胞生存率は、９５．８±１．０％超のままであった。

【0231】

図５Ｂに示されるように、２４時間で、ｓａＲＮＡを含まないＰＦ－ＬＮＰの相対細胞生存率は、概して、ｓａＲＮＡを含むＰＦ－ＬＮＰよりもわずかに高かった。さらに、試験した範囲内のＰＰ７５コーティング密度を有するＰＦ－ＬＮＰでＨｅＬａ細胞を処理した場合、相対細胞生存率の有意な変化は観察されず、ｓａＲＮＡのみと同等の８０％超の高い細胞生存率を維持した。これは、ＰＦ－ＬＮＰが低いかまたは無視できる細胞傷害性を有し、アニオン性エンドソーム溶解性両親媒性ポリマーによる表面コーティングが明らかな細胞傷害性を誘導しなかったことを示唆している。

【0232】

形質膜の完全性の損傷は、細胞死前の著しい損傷の優れた指標であり得、これは、細胞外培地中の安定な細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を測定することによって決定することができる。図５Ｃは、ＬＤＨアッセイを使用して決定される、ＨｅＬａ細胞膜の完全性に対する、ｓａＲＮＡを含むおよび含まないＰＦ－ＬＮＰの効果を示す。ＨｅＬａ細胞をｓａＲＮＡのみとインキュベートした場合、９１．４±４．５％という高い相対細胞生存率があり、著しい膜損傷を引き起こさないことを示した。ポリマーコーティング密度が増加するにつれて、ｓａＲＮＡを含むおよび含まないＰＦ－ＬＮＰの両方の場合で、相対細胞生存率は徐々に低下した。これにもかかわらず、ＨｅＬａ細胞は、概してＰＦ－ＬＮＰを良好に忍容し、最低細胞生存率は、それぞれｓａＲＮＡ封入を有するおよび有さない、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰについて７８．６±５．５１％および７１．３±２．２％であった。これは、２４時間のインキュベーション後、ＰＦ－ＬＮＰ表面上にコーティングされたポリマーが、より高いポリマーコーティング密度であっても、限られた膜損傷にしか寄与し得ないことを示唆している。

【0233】

ＰＦ－ＬＮＰのｐＨ応答性膜不安定化活性
溶血アッセイをＲＢＣ膜上で実施してエンドソーム膜をモデル化し^７、ＰＦ－ＬＮＰがエンドソーム脱出を誘因する能力を調べた。図６は、１．０×１０^４および１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰのｐＨ応答性細胞膜不安定化活性を示す。生理的ｐＨから初期エンドソームｐＨ（７．０～６．０）までの低下に伴い、相対溶血が著しく増加したことが明らかである。これらの結果がまさに示すように、有効な細胞質送達システムは、生理的ｐＨで低い溶血を有し、エンドソーム区画で酸性化が起こると、エンドソーム、好ましくは初期エンドソームの膜を効率的に不安定化する能力を有するべきである^９。

【0234】

さらに、図６Ａに示されるように、ポリマーコーティング密度が増加するにつれて、相対溶血が増加し、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰが最も高く、初期エンドソームｐＨ６．０で７７．９±６．６％に達した。これらの結果は、図６Ｂに示される、ｓａＲＮＡを含まないＰＦ－ＬＮＰの溶血と同等であった。これは、ＰＦ－ＬＮＰ表面上にコーティングされたＰＰ７５が、初期エンドソームｐＨでエンドソーム溶解活性を誘因する能力を有し、ＰＦ－ＬＮＰを、ＲＮＡを含む高分子ペイロードの効率的な細胞内送達のための適切な候補にすることを示唆している。

【0235】

ＰＦ－ＬＮＰによるインビトロＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションに対する脂質組成およびポリマーコーティング密度の効果
ｆＬｕｃをコードするｓａＲＮＡを、０．５×１０^４、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰに封入した。１：１（図７Ａ）、１：２（図７Ｂ）および１：４（図７Ｃ）の重量比のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを含むＰＦ－ＬＮＰを、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞にトランスフェクトして、細胞トランスフェクション効率を決定した。

【0236】

図７Ａは、１：１の重量比のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥおよび４０重量％コレステロールを含むＰＦ－ＬＮＰの全ての製剤のトランスフェクション効率が、市販のゴールドスタンダートであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）よりも少なくとも０．５桁高かったことを示す。最高のトランスフェクション効率は、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰによって達成され、ＰＥＩと比較して１．５桁高い１０^８ＲＬＵに達した。全体として、１：１のＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ重量比を使用することにより、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：２）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：４）ベースのＰＦ－ＬＮＰと比較して、最高のトランスフェクション効率が得られた。

【0237】

ＰＦ－ＬＮＰによるインビトロＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションに対するＮ／Ｐ比の効果
さらに、異なるＰＰ７５コーティング密度を有するＰＦ－ＬＮＰのトランスフェクション効率に対する脂質とｓａＲＮＡのＮ／Ｐ比の効果を調査することが重要であった。図８は、０．１、１および１０のＮ／Ｐ比を比較する。Ｎ／Ｐ比が増加するにつれて、トランスフェクション効率が増加することが分かった。トランスフェクション効率は、Ｎ／Ｐ比が１０の製剤で最も高く、１．０×１０^４および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子を含むＰＦ－ＬＮＰが最も高かった。Ｎ／Ｐ比１と１０のトランスフェクション効率の差は統計学的に有意であったが、インビボ試験のためにＮ／Ｐ比１を選択した。

【0238】

実施例２ － ＰＦ－ＬＮＰによるインターフェロンコンピテントＨｅＬａ細胞におけるインビトロトランスフェクション
非効率的なタンパク質発現に加えて、ＲＮＡ系の臨床用途は、それらの高い自然免疫原性によって制限される。正の表面電荷を有する従来のカチオン性またはイオン化可能ＬＮＰを使用するＲＮＡ送達は、防御免疫応答を誘導し得る。したがって、タンパク質発現と自然免疫応答との間の良好なバランスを達成することが重要である。図９は、インターフェロンコンピテントＨｅＬａ細胞におけるＰＦ－ＬＮＰの細胞トランスフェクション力価を示す。ＳａＲＮＡの用量が増加するにつれて、トランスフェクション効率は、１００ｎｇ／ウェルで実質的に最大約１０^７ＲＬＵまで増加した。しかしながら、１０００ｎｇ／ウェルでは、トランスフェクション効率が約１０^４．５ＲＬＵに低下し、これは、高ｓａＲＮＡ用量での防御免疫応答の誘導に起因し得る。同じＰＦ－ＬＮＰ製剤を使用した１００ｎｇ／ウェルの同じｓａＲＮＡ用量の送達が、インターフェロンコンピテントＨｅＬａ細胞（図９）において、ＨＥＫ－２３９細胞（図８）と同等の高いトランスフェクション効率をもたらし得ることは注目に値する。これらの結果は、ＰＦ－ＬＮＰが、タンパク質発現と自然免疫原性の両基準で良好に機能し得ることを示唆している。これは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンスパイク中のアニオン性融合ペプチドを模倣するアニオン性ｐＨ応答性エンドソーム溶解性擬似ペプチドによる正に帯電したＬＮＰ表面の官能化に起因し、ＰＦ－ＬＮＰの負の表面電荷をもたらし（図３Ｃ）、カチオン性／イオン化可能脂質と細胞の直接相互作用を防止し、インターフェロンコンピテント細胞における高いトランスフェクション効率をもたらし得る。

【0239】

これらの結果はまた、がん細胞を含む様々な細胞型への効率的な送達を実証し、ワクチンおよび遺伝子治療用途および他の治療薬に対するＰＦ－ＬＮＰの汎用性を示している。

【0240】

発明者らは、トランスフェクション効率が細胞内ＲＮＡ送達の市販のゴールドスタンダードよりもはるかに高いことを考慮すると、全体的に、ＰＦ－ＬＮＰがインビボ試験でうまく機能する大きな可能性を有することに注目した。

【0241】

実施例３ － ＰＦ－ＬＮＰのエンドサイトーシス機序の解明
エンドサイトーシスされた生物学的分子を、分解のためにリソソームに輸送される前に、エンドソーム脱出によって細胞質に放出することができるナノ担体を設計することが重要である（図１）。細胞への送達の時点で経路阻害剤を使用することによって、ＰＦ－ＬＮＰの細胞内送達のエンドサイトーシス機序を調査した。それぞれが特定の細胞輸送経路を阻害する６つの異なる経路阻害剤を使用した。高感度緑色蛍光タンパク質をコードするｓａＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ）を封入したＰＦ－ＬＮＰの細胞取り込みを共焦点画像に可視化し（図１０Ａ）、フローサイトメトリーによって定量化した（図１０Ｂ）。予想通り、ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰのみで処理されたＨＥＫ－２９３細胞では、強い緑色蛍光が観察され、細胞内での効率的なタンパク質発現をさらに裏付けた。ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰと組み合わせてメチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）を使用した場合、緑色蛍光強度が約８０％低下し、細胞内でのＥＧＦＰ発現が最も低かったことが明らかである。これは、阻害剤ＭβＣＤによる細胞の処理の結果として、ＰＦ－ＬＮＰの細胞取り込みが極めて少なかったことを意味し、脂質ラフト媒介エンドサイトーシスがＰＦ－ＬＮＰの主要な細胞取り込み経路であることを示唆している。

【0242】

この所見は、ＰＦ－ＬＮＰが細胞に進入するために取る機構的経路を示す。これを知ることで、どのペイロードがＰＦ－ＬＮＰを使用した送達に最も適しているかを決定するために、送達システムがどのように機能するかをよりよく理解することができる。また、ある特定の条件下でのＰＦ－ＬＮＰの挙動を予測することも可能になる。

【0243】

この試験の結果は、最も一般的な細胞内送達経路であるクラスリン依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に進入する必要があるいずれのペイロードも、本発明者らの送達システムでうまく進入することができることを示している。

【0244】

実施例４ － マウスモデルにおける効率的なタンパク質発現および優れた免疫原性効果、ならびにＰＦ－ＬＮＰの好ましい表面化学のおかげで改善されたリンパ節排出を示すインビボ試験
ＨＥＫ－２９３（図７および図８）およびインターフェロンコンピテントＨｅＬａ細胞（図９）においてインビトロで達成された高いトランスフェクション効率、ならびにインビトロの結果がインビボに必ずしも結びつかない^１６という事実を考慮して、実施例１で開発されたＰＦ－ＬＮＰがインビボでｓａＲＮＡを送達することができるかどうかを決定することが重要である。

【0245】

図１１は、ＰＦ－ＬＮＰ上のポリマーコーティング密度が、マウスにおいてより高いルシフェラーゼ発現をもたらすことにおいて重要な役割を果たしたことを示す。ＰＰ７５コーティング密度が増加するにつれて、ルシフェラーゼ発現は著しく増加し、比較的より分散していた。これらの画像は、ＰＦ－ＬＮＰがインビボでの核酸のより効率的な細胞内送達において主要な役割を果たすことをさらに強調する。

【0246】

効率的なインビボルシフェラーゼ発現は、様々なＰＦ－ＬＮＰ製剤のインビボ免疫原性試験につながり、この送達システムがＲＮＡワクチンに使用される可能性を実証した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１．０×１０^４および１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子を含むＰＦ－ＬＮＰに封入された、ヘマグルチニンインフルエンザウイルスコードｓａＲＮＡ（ＨＡ－ｓａＲＮＡ）を注射した。ナイーブ、ｊｅｔＰＥＩと複合体化されたＨＡ－ｓａＲＮＡ、およびＰＰ７５コーティングのないＨＡ－ｓａＲＮＡ封入ＬＮＰも、対照として試験した。０．１μｇ用量を追加的に使用した、１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰ製剤を除いて、各製剤に１μｇのＨＡ－ｓａＲＮＡを封入した。マウスは第１の注射、引き続いて４週間後に第２の投与を受けた。ＨＡ ＩｇＧ抗体価を、第２の投与の投与前の４週目、および第２の投与の２週間後の６週目に定量化した（図１２Ｂ）。生存率（図１２Ａ）および体重（図１２Ｃ）も、試験の各週の終わりに記録した。

【0247】

図１２Ｂに示されるように、ナイーブＨＡ－ｓａＲＮＡで処置されたマウスは、おそらく、ＲＮＡａｓｅによるｓａＲＮＡの分解^１７による、図１２Ｃで観察された突然の体重減少の結果として、インフルエンザ負荷が導入された後、５日目を過ぎて生存しなかった。ＰＰ７５コーティングのないＨＡ－ｓａＲＮＡ封入ＬＮＰで処置されたマウスは、６日目までに４０％の生存を有するにすぎず、５日目までに突然の体重減少が観察された。これは、抗体価に反映され（図１２Ａ）、比較的低い抗体発現を示す。ＰＦ－ＬＮＰの負の表面電荷（図３Ｂ）がこれを説明することができるだろう；負電荷は、送達システムがより容易にリンパ節に排出することを可能にし、より高い免疫応答をもたらす^１１。

【0248】

ＰＰ７５コーティングなしでは、ＰＦ－ＬＮＰの全体的な電荷は正であり（図３Ｂ）、結果として抗体発現が低下する。興味深いことに、マウスの残りの４０％は、５日目後に体重の増加を経験し、４週目の第２の投与が残りのマウスに対する治療効果を有する可能性があることを示唆している。他の全ての群は１００％生存率を有し、健康的な体重変化を維持した。抗体価をより詳細に見ると（図１２Ａ）、ＰＦ－ＬＮＰが、４週目までに、ゴールドスタンダードであるｊｅｔＰＥＩと同等の高い抗体レベルをもたらした（約１０^４ｎｇ／ｍＬ）ことが明らかである。さらに、１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰに製剤化された低用量の０．１μｇのＨＡ－ｓａＲＮＡを与えられた群もまた、有望な結果をもたらした。抗体発現は、１μｇのＨＡ－ｓａＲＮＡと複合体化されたｊｅｔＰＥＩと同等であったが、わずかに低い体重パーセンテージが観察された。これは、ＰＦ－ＬＮＰが低用量のＨＡ－ｓａＲＮＡで同様の免疫応答を誘因する能力を有し、全体として、ＰＦ－ＬＮＰ表面上にコーティングされたアニオン性、ウイルス－ペプチド模倣、エンドソーム溶解性ポリマーが、これを実現する上で重要な役割を果たすことを示唆しており、これはＲＮＡ送達の分野における大きな利点である。

【0249】

次の論理的なステップは、アニオン性、バイオミメティック、両親媒性ポリマーによるＬＮＰの表面官能化が、リンパ節へのＲＮＡの排出を強化し、より高いタンパク質発現をもたらすという仮説を確認することであった。ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡのみ（図１３Ａ）を１．０×１０^４ポリマー鎖／粒子（図１３Ｂ）および１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子（図１３Ｃ）のＣｙ５－ＰＰ７５でコーティングされたＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰと比較することによって、マウスモデルにおけるリンパ節排出を調査した。広視野顕微鏡画像のピンク色の領域は、リンパ節の脂肪組織を表し、青色の領域は核を表す。重要なことに、蛍光画像は、ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡのみと比較して、ＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰについて実質的に強い緑色蛍光を示し、ＰＰ７５コーティング密度を増加させると、緑色蛍光の有意な増加を示す。これは、アニオン性両親媒性ポリマーによるナノ粒子の表面官能化が、タンパク質発現の誘因が不可欠であるワクチン用途にとって極めて有利なリンパ節へのＰＦ－ＬＮＰの排出を強化することを示唆している。

【0250】

実施例５ － ＰＦ－ＬＮＰを使用したＲＮＡと低分子の同時送達
ｓａＲＮＡとルキソリチニブのＭＲＣ－５細胞への同時送達
１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰを使用した、サブタイプＪＡＫ１およびＪＡＫ２に対する選択性を有するヤヌス関連キナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤である標的治療薬ルキソリチニブとのｓａＲＮＡの同時送達を調査して、核酸などの高分子の封入効率および細胞トランスフェクション効率に対する小分子薬物の導入の効果を調査した。図１４は、ルキソリチニブ濃度がゼロから０．０２μｇ／ｍＬまで増加するにつれて、ｓａＲＮＡ封入効率が６９．０±３．９１％から７３．５±１１．６％まで増加したことを示す。しかしながら、ルキソリチニブ濃度のさらなる増加は、ｓａＲＮＡと共に空隙を充填する小分子薬物の量が多いため、封入に利用可能な空間が限られる可能性があるため、ｓａＲＮＡ封入効率の低下をもたらした。本発明者らの知る限り、ｓａＲＮＡの極めて負電荷の結果としての安定性の問題のために、低分子薬物とｓａＲＮＡの同時送達はまだ達成されていない。これは、汎用性の高いＰＦ－ＬＮＰの安定性および堅牢性をさらに支持する。

【0251】

ｆＬｕｃアッセイを使用して、ヒト胎児肺線維芽細胞であるＭＲＣ－５細胞への細胞トランスフェクション効率を調査した。図１５に示されるように、ルキソリチニブの濃度が増加するにつれて、ｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰのトランスフェクション効率も増加した。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１）、４０重量％コレステロール、１．３×１０^４ ＰＰ７５ポリマー鎖／粒子および１μｇ／ｍＬルキソリチニブを含むＰＦ－ＬＮＰは、市販のＰＥＩよりも約２桁高い最大トランスフェクション効率をもたらした。これは、ルキソリチニブをシステムに導入することで、システムの安定性を損なうことなく、ゴールドスタンダードであるＰＥＩよりもかなり高いｓａＲＮＡのトランスフェクション効率を強化することができることを示している。

【0252】

ｓａＲＮＡとトレハロースのＨＥＫ－２９３細胞への同時送達
凍結および乾燥中に生体分子を安定化させることができる保護剤であるトレハロースの同時送達を調査して、ペイロードの脂質構造または機能性の完全性を損なうことなく、室温および熱帯温度で、凍結乾燥と水溶液中の両方のＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの安定な貯蔵の可能性を評価した。

【0253】

図１６は、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存している、１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中と凍結乾燥の両方の製剤の特性評価および成功したＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを実証する。図１６Ａは、６３ｍｇ／ｍＬ以上のトレハロース濃度を使用することにより、粒径が２００ｎｍ未満のままであり、ＰＤＩ値が全てのＰＦ－ＬＮＰ製剤について０．６未満であったことを示す。図１６Ｂは、より高濃度のトレハロースが使用されるにつれて、ゼータ電位がより負になり、５００ｍｇ／ｍＬトレハロースを含有する凍結乾燥ＰＦ－ＬＮＰについて－５７．３±３．６ｍＶが最低であったことを示す。さらに、凍結乾燥製剤は、水溶液中のそれぞれの製剤と比較して、より負のゼータ電位を有した。図１６Ｃに示されるＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションは、細胞トランスフェクション効率に対するトレハロースの相乗効果を実証した。トレハロース濃度が増加するにつれて、トランスフェクション効率は増加し、２５０および５００ｍｇ／ｍＬのトレハロースで１０^８ＲＬＵにも達した。これは、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方のトレハロースの共存が、水溶液中およびさらには凍結乾燥後の、ｓａＲＮＡの高い有効性を維持することができたことを示唆している。

【0254】

しかしながら、どれほど多くのトレハロースをＰＦ－ＬＮＰ製剤に包含させることができるかについては閾値が存在する。５００ｍｇ／ｍＬものトレハロース濃度は、様々な濃度のトレハロースを含有する水溶液中（図１７Ａ）および凍結乾燥（図１７Ｂ）のＰＦ－ＬＮＰ製剤で処理した場合のＨＥＫ－２９３細胞の生存率を比較した図１８に実証されるように、このような送達システムに関する何らかの細胞傷害効果を及ぼすおそれがある。５００ｍｇ／ｍＬトレハロースを含む凍結乾燥製剤は、４８時間のインキュベーション後に５３．３±８．０％で最も低い相対細胞生存率をもたらした（図１７Ｂ）。したがって、２５０ｍｇ／ｍＬの濃度を、それを使用することによって生じた高い負の表面電荷および高いトランスフェクション効率のために、長期貯蔵試験に使用した。

【0255】

実施例６ － 周囲温度でのＲＮＡの長期安定貯蔵のための、水溶液中と凍結乾燥の両方のＰＦ－ＬＮＰ製剤への安定化分子の共封入
トレハロース共封入を用いてＰＦ－ＬＮＰを最適化した後、長期貯蔵試験を行って、様々な温度で経時的に、ｓａＲＮＡとトレハロースを共封入されたＰＦ－ＬＮＰの粒径、表面電荷、ＨＥＫ－２９３細胞生存率およびＨＥ－２９３細胞トランスフェクションを測定した。－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の４つの貯蔵温度を使用して、冷凍庫、冷蔵庫、室内および熱帯条件を模倣した。図１８は、トレハロースと、水溶液中と凍結乾燥の両方のＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの相互作用を実証する。トレハロースは、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に存在し、両側からの保護を提供し、製造および貯蔵中のナノ粒子の望ましい物理的安定性（例えば、粒子凝集およびペイロード漏出の防止）および化学的安定性（例えば、ＲＮＡなどの生体分子の保護）を保証し、したがって、ｓａＲＮＡの機能性を維持および延長する。

【0256】

図１９は、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に２５０ｍｇ／ｍＬのトレハロースが共存する（ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ）、１．３×１０^４ポリマー鎖／粒子のＰＰ７５でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の特性評価を示す。新鮮な場合、粒径は２００ｎｍ未満のままであり、ＰＤＩは０．５未満であった。これは、ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅと非コーティングＬＮＰ（ＬＮＰ／ｔｒｅ）の両方に当てはまった。－２０℃で５２週間の貯蔵後、ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＬＮＰ－ｔｒｅの両方が、新鮮な製剤と比較して同様の流体力学的サイズを維持したが、それらのＰＤＩ値は１６週目で増加し、ＬＮＰ／ｔｒｅについてより有意な変化があり、その後、５２週目で約１．０までさらに増加した。４℃で５２週間にわたり、ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、サイズが２００ｎｍ未満、ＰＤＩが約０．８未満のままであった。しかしながら、ＬＮＰ／ｔｒｅは、長期貯蔵後にサイズが２００～３００ｎｍおよびＰＤＩが１まで増加し、粒子が凝集したかもしれないことを示唆している。５２週間にわたって、流体力学的サイズおよびＰＤＩが、ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＬＮＰ／ｔｒｅの両方について、２０℃で増加し、４０℃でより有意に増加した。全体として、ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、５２週間にわたってＬＮＰ／ｔｒｅよりも流体力学的サイズおよびＰＤＩの安定性を示す。

【0257】

図２０は、５２週間にわたる、水溶液中および凍結乾燥のＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位を示す。溶液中の新鮮なＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ－５７．８±１．５ｍＶおよび＋１０．４±４．５ｍＶのゼータ電位を有した。新たに凍結乾燥されたＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位は、それぞれ－４８．３±１．８ｍＶおよび＋１８．８±３．８ｍＶであった。－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度でのゼータ電位は、水溶液中と凍結乾燥の両方のＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅについて５２週間の貯蔵を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが非常に小さかった。しかしながら、ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位は、全ての温度で時間の経過と共に正から負に変化した。これは、時間の経過と共に高度に負に帯電したｓａＲＮＡの漏出が原因である可能性が最も高い。これは、ＰＦ－ＬＮＰが、アニオン性、ウイルスペプチド模倣、両親媒性ポリマーによる表面官能化により、ＬＮＰと比較して高い安定性を示したことを示唆している。

【0258】

図２１は、５２週間の貯蔵にわたり、水溶液中および凍結乾燥のＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション効率を示す。溶液中および凍結乾燥の新鮮なＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ約１０^７ＲＬＵおよび約１０^６ＲＬＵのトランスフェクション効率を示した。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度で５２週間の貯蔵後の凍結乾燥ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅのトランスフェクション効率は、５２週間の期間を通して、高レベル、概してＬＮＰ／ｔｒｅより１桁高いレベルで一貫したままであった。これは、ポリマー官能化およびナノ粒子の内側と外側の両方のトレハロースの共存が、ｓａＲＮＡの機能性を首尾よく保存することができることを検証した。ＲＮＡ分子は非常に壊れやすく、曝露環境で容易に分解され得るため、非常に困難なウルトラコールドチェーンまたはコールドチェーンでの貯蔵および分配を必要とする。例えば、世界初の承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンであるＰｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｍＲＮＡワクチンは、－７０℃での貯蔵を必要とする大きなハードルに悩まされており、２～８℃の冷蔵温度では、わずか５日間しか安定であることができない（Ｐｆｉｚｅｒ．ｃｏｍ、２０２０年１１月２０日）。同様に、ＣＯＶＩＤ－１９に対する承認されたＭｏｄｅｒｎａ ｍＲＮＡワクチンは、－２０℃で貯蔵する必要がある。発明者らが実証した、ＰＦ－ＬＮＰ製剤についての室温（２０℃）および熱帯温度（４０℃）で１年間にわたるＲＮＡの優れた熱安定性および高いトランスフェクション効率は、ＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の製造、貯蔵および分配における重要な技術的ブレークスルーを表し、巨大な商業的可能性および社会経済的影響を有する。

【0259】

図２１にも示されるように、－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で５２週間の貯蔵中の水溶液中のＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、凍結乾燥ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅと比較しておよそ１桁低いが、良好なトランスフェクション効率を保持した。５２週目に、水溶液中のＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅのトランスフェクション効率は、－２０℃、４℃、２０℃での貯蔵については１０^４ＲＬＵ超、４０℃での貯蔵については１０^３ＲＬＵ超のままであった。ＲＮＡ分子は加水分解によって容易に分解され得るため、水溶液中にＲＮＡを貯蔵することが大きな課題であることを考慮すると、これは重要な知見である。ＰＦ－ＬＮＰへの製剤化を通した周囲温度での水溶液中のＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の好ましい熱安定性は、ウルトラコールドチェーンもコールドチェーンも必要としない安定なＲＮＡ貯蔵のために、凍結乾燥製剤に代わる別の魅力的な戦略を提供する。さらに、（ｉ）この予備貯蔵作業ではＮ／Ｐ比１を使用したが、より高いＮ／Ｐ比を使用すると、（図８に示されるように）トランスフェクション効率が向上し；（ｉｉ）ＰＦ－ＬＮＰ組成物および製剤をさらに最適化することができることを指摘する価値がある。本発明者らは、周囲温度での長期貯蔵後のＰＦ－ＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの熱安定性が、最適化後にさらに強化され得ると考えている。

【0260】

図２２は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ－２９３の相対生存率が、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度で５２週間の貯蔵期間にわたって、水溶液中と凍結乾燥の両方のＰＦ－ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後に約７０％超のままであったことを示す。ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅのこれらのＨＥＫ－２９３細胞生存率は、ｓａＲＮＡとトレハロースの混合物である陰性対照ｓａＲＮＡ／ｔｒｅ、と同等であり、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することをさらに確認した。

【0261】

実施例７ － ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの調製および特性評価、高い生体適合性および低い細胞傷害性、ならびに効率的な細胞内ＲＮＡ送達を介した高いインビトロトランスフェクション効率
本発明者らは、以下の材料および方法の節で説明されるように、ＰＥＧ化ポリマー官能化脂質ナノ粒子（ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ）を合成した。ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰを、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンスパイク中のアニオン性融合ペプチドを模倣する生体適合性、ｐＨ応答性、エンドソーム溶解性擬似ペプチドポリマー、ＰＰ７５でコーティングした。

【0262】

ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの生理化学的特性評価
図２３は、水溶液および凍結乾燥形態のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的直径、ＰＤＩおよびゼータ電位に対するポリマー密度の効果を示す。水溶液中では、図２３Ａに示される平均粒径が、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰについて、１１２．０±６９．０ｎｍで同様であることが見出された。ＰＤＩも約０．２で同様であり、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。比較して、凍結乾燥製剤は、１２８±２３．０ｎｍでわずかに高い平均流体力学的直径およびＰＤＩ約０．４を示した。しかしながら、これらの単分散粒子は、有効な細胞内送達のために依然として２００ｎｍ未満であった。図２３Ｂにおいてゼータ電位によって示される、粒子の電荷は、ＰＰ７５コーティングのないＰＥＧ化ＬＮＰについての＋１５．９±０．５ｍＶから、１ｍｇ／ｍＬ ＰＰ７５を含むＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰについての－５５．４±０．３ｍＶまで変化した。水溶液と凍結乾燥製剤の両方が同じ傾向に従った。正電荷と負電荷の間の切り替えは、０．２５ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの間で生じた。前述のように、負電荷は、リンパ節への排出がより効率的であり（実施例４で証明される）、高レベルの抗体産生を誘因するので^１１、ワクチン用途に有益である。これは、これらの送達システムの大きな利点の１つである。

【0263】

カルセイン、ＦＩＴＣ－デキストランおよびｓａＲＮＡのＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰへのインサイチュ担持
１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたＰＦ－ＬＮＰへのモデルペイロードであるカルセイン（Ｍｗ約６２２．５５Ｄａ）およびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ約１５０ｋＤａ）のインサイチュ担持を調査して、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰが広範囲のペイロードを封入する能力を実証した。図２４Ａは、ＰＥＧ化ＬＮＰへのカルセインおよびＦＩＴＣ－デキストラン封入効率がそれぞれ８０．９±１．８％および７６．９±２．４％であったことを示す。図２４Ｂは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰのｓａＲＮＡ封入効率が８４．９１±２．３２％であったことを示す。これは、受動的担持ペイロードについて予想される通りである。

【0264】

実施例８ － 周囲温度でのＲＮＡの長期安定貯蔵のための、水溶液中と凍結乾燥の両方のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ製剤への安定化分子の共封入
トレハロース共封入を用いてＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰを最適化した後、長期貯蔵試験を行って、様々な温度で経時的に、ｓａＲＮＡとトレハロースが共封入されたＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの粒径、表面電荷、ＨＥＫ２９３細胞生存率およびＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを測定した。－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の４つの貯蔵温度を使用して、冷凍庫、冷蔵庫、室内および熱帯条件を模倣した。トレハロースは、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に存在し、両側からの保護を提供し、製造および貯蔵中のナノ粒子の望ましい物理的安定性（例えば、粒子凝集およびペイロード漏出の防止）および化学的安定性（例えば、ＲＮＡなどの生体分子の保護）を保証し、したがって、ｓａＲＮＡの機能性を維持および延長する。

【0265】

図２５は、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に２５０ｍｇ／ｍＬのトレハロースが共存する（ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ）、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中［Ａ］および凍結乾燥［Ｂ］の製剤の特性評価を示す。新鮮な場合、粒径は１５０ｎｍ未満のままであり、ＰＤＩは０．４未満であった。これは、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅと非コーティングＰＥＧ化ＬＮＰ（ＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅ）の両方に当てはまった。－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵後、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅの両方が、新鮮な製剤と比較して同様の流体力学的サイズおよびＰＤＩを維持した。全体として、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅの両方が、水溶液および凍結乾燥形態で、９週間にわたって流体力学的サイズおよびＰＤＩの安定性を示した。

【0266】

図２６は、９週間にわたる、水溶液中［Ａ］および凍結乾燥［Ｂ］のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位を示す。溶液中の新鮮なＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ－５５．４±０．３ｍＶおよび＋１５．９±０．５ｍＶのゼータ電位を有した。新たに凍結乾燥されたＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位は、それぞれ－５２．１±１．６ｍＶおよび＋１０．５±５．２ｍＶであった。－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度でのゼータ電位は、水溶液および凍結乾燥形態のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅの両方について９週間の貯蔵を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが非常に小さかった。

【0267】

図２７は、９週間の貯蔵にわたる、水溶液中および凍結乾燥のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション効率を示す。溶液中および凍結乾燥の新鮮なＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ約１０^７ＲＬＵおよび約１０^６ＲＬＵのトランスフェクション効率を示した。それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度で９週間の貯蔵後の凍結乾燥ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅのトランスフェクション効率は、全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが小さかったが、ＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、９週間の期間を通して、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅよりも１桁低いままであった。これは、ポリマー官能化を有するＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰとポリマーを含まないＰＥＧ化ＬＮＰの両方について、ナノ粒子の内側と外側の両方のトレハロースの共存が、ｓａＲＮＡの機能性を首尾よく維持することができることを検証した。発明者らが実証した、特にＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ製剤についての室温（２０℃）および熱帯温度（４０℃）でのＲＮＡの優れた熱安定性および高いトランスフェクション効率は、ＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の製造、貯蔵および分配における別の重要な技術的ブレークスルーを表し、巨大な商業的可能性および社会経済的影響を有する。

【0268】

図２７にも示されるように、－２０℃、４℃、２０℃および４０℃で９週間の貯蔵後の水溶液中のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３トランスフェクション効率は、全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが小さかった。ＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、試験した全てのこれらの温度で、水溶液中での９週間の貯蔵を通して、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅより１桁低いまであった。ＲＮＡ分子が加水分解によって容易に分解され得るため、水溶液中でＲＮＡを貯蔵することが大きな課題であることを考慮すると、これらは重要な知見である。さらに、（ｉ）この予備貯蔵作業ではＮ／Ｐ比１を使用したが、より高いＮ／Ｐ比を使用すると、（ＰＦ－ＬＮＰで図８に示されるように）トランスフェクション効率が向上し；（ｉｉ）ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ組成物および製剤をさらに最適化することができることを指摘する価値がある。本発明者らは、周囲温度での長期貯蔵後のＰＦ－ＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの熱安定性が、最適化後にさらに強化され得ると考えている。

【0269】

図２８は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ２９３の相対生存率が、それぞれ－２０℃、４℃、２０℃および４０℃の全ての温度で９週間の貯蔵期間を通して、水溶液中と凍結乾燥の両方のＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰおよびＰＥＧ化ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後、約９０％超のままであったことを示す。ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰおよびＰＥＧ化ＬＮＰのこれらのＨＥＫ２９３細胞生存率は、ｓａＲＮＡとトレハロースの混合物である陰性対照ｓａＲＮＡ＋ｔｒｅと同等であり、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することをさらに確認した。

【0270】

実施例９ － ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの調製および特性評価、高い生体適合性および低い細胞傷害性、ならびに効率的な細胞内ＲＮＡ送達を介した高いインビトロトランスフェクション効率
本発明者らは、以下の材料および方法の節で説明されるように、Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化可能脂質（ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ）に基づいてポリマー官能化脂質ナノ粒子を合成した。ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰを、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンスパイク中のアニオン性融合ペプチドを模倣する３つの異なる生体適合性、ｐＨ応答性、エンドソーム溶解性擬似ペプチドポリマーであるＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングした。

【0271】

ＰＰ７５は、７５％の化学量論的置換度で、代謝産物由来の直鎖ポリアミドであるポリ（Ｌ－リジンイソ－フタルアミド）（ＰＬＰ）の骨格にペンダントしたカルボン酸に疎水性アミノ酸Ｌ－フェニルアラニンをグラフトすることによって調製される擬似ペプチドである。バイオミメティックアニオン性両親媒性ポリマーは、インフルエンザウイルスの融合ペプチドに見られる疎水性ペンダント基およびイオン化可能カルボン酸基を含有する。

【0272】

ＰＬＰ－ＮＤＡは、ＰＬＰと比較して優れた膜固定および破壊能力を示す、ｐＨ応答性の櫛状ポリマーである。本研究で使用されるＰＬＰ－ＮＤＡポリマーは、約１８％のグラフト率で、膜アンカーとして作用する疎水性デシルアミン（ＮＤＡ）を、ＰＬＰのペンダントカルボン酸基上にグラフトすることによって合成される。このポリマーは、エンドソームｐＨで優れた膜破壊能力を示すことが示されており、ＰＰ７５のように、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）で膜破壊が起こらない。

【0273】

【化12】

【0274】

ＰＬＰ－ＡＤＡは、最適な細胞内送達のために、ＰＬＰ骨格上に疎水性側鎖として１２－アミノドデカン酸（ＡＤＡ）がグラフトされたｐＨ応答性の櫛状ポリマーである。本研究で使用されるＰＬＰ－ＡＤＡポリマーは、ＡＤＡによる６０％のグラフト率を含む。

【0275】

【化13】

【0276】

ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの生理化学的特性評価
図２９は、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的直径、ＰＤＩおよびゼータ電位に対するＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡ、およびＰＬＰ－ＡＤＡポリマー密度の効果を示す。図２９Ａに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで同様であることが見出された。ＰＰ７５コーティング製剤のＰＤＩもまた、約０．３で同様であり、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。非コーティングＭＣ３ ＬＮＰは、０．５３±０．２のＰＤＩを有したので、ポリマー官能化製剤よりも多分散であった。同様に、図２９Ｂに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＮＤＡでコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで同様であることが見出された。ＰＬＰ－ＮＤＡコーティング製剤のＰＤＩもまた、約０．４で同様であり、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。比較すると、図２９Ｃに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで他の２つのポリマーコーティングＰＦ－ＬＮＰと同様であり、１ｍｇ／ｍＬで約２００ｎｍまで増加した。ＰＬＰ－ＡＤＡコーティング製剤のＰＤＩは、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡについて約０．５および約０．３であった。これは、ＰＬＰ－ＡＤＡコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。また、これらの単分散粒子は全て２００ｎｍ未満であり、粒子を有効な細胞内送達に適したものとした。図２９Ａ、ＢおよびＣのゼータ電位によって示される、粒子の電荷は、ポリマーコーティングのないＭＣ３ ＬＮＰについての－１．６±０．５ｍＶから、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５を含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについての－８．８±０．６ｍＶ、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＮＤＡを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについての－２２．３±０．２ｍＶおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについての－１８．９±０．９ｍＶまで変化した。全ての製剤が同じ傾向に従った；ポリマー濃度が増加するにつれて、ゼータ電位が低下した。前述のように、負電荷は、高い抗体産生につながる^１１、リンパ節への排出の強化（実施例４で証明される）のために、ワクチン用途に有益である。図３０に示されるように、ｓａＲＮＡを封入した場合、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的サイズおよびゼータ電位は、ポリマーコーティングの種類にかかわらず、有意に影響を受けなかった。

【0277】

カルセイン、ＦＩＴＣ－デキストランおよびｓａＲＮＡのＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰへのインサイチュ担持
モデルペイロードであるカルセイン（Ｍｗ約６２２．５５Ｄａ）およびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ約１５０ｋＤａ）のＭＣ３ ＬＮＰへのインサイチュ担持を調査して、ＭＣ３ ＬＮＰが広範囲のペイロードを封入する能力を実証した。図３１Ａは、カルセインおよびＦＩＴＣ－デキストランの封入効率がそれぞれ６５．８±３．５％および６０．２±４．８％であったことを示す。図３１Ｂは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰへのｓａＲＮＡ封入効率が６６．８２±１．５４％であったことを示す。これは、受動的担持ペイロードについて予想される通りである。

【0278】

図３２は、ＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＭＣ３ ＬＮＰのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション効率を示す。示されるように、ポリマー官能化は、ｓａＲＮＡのトランスフェクション効率の強化において重要な役割を果たす；ポリマー濃度が増加するにつれて、トランスフェクション効率が少なくとも１桁増加した。ＰＰ７５コーティングは、他のポリマーと比較して最良の性能を発揮し、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でのトランスフェクション効率は約１０^７．５ＲＬＵであった。

【0279】

図３３は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ－２９３の相対生存率が、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＭＣ３ ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後に約８０％超のままであったことを示す。これにより、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することが確認された。

【0280】

図３４は、ＭＣ３ ＬＮＰのｐＨ依存性のサイズおよび表面電荷の変化を示す。ｐＨが増加するにつれて、ＭＣ３ ＬＮＰの流体力学的サイズが減少し、図３４Ａに示されるように、ｐＨ７．４で８８．１３±６．９ｎｍが最低であった。より低いｐＨでより高い流体力学的サイズにもかかわらず、サイズは２００ｎｍ未満のままであり、細胞取り込みに適したものとなった。製剤のＰＤＩは、ＰＤＩ０．２～ＰＤＩ１．０の範囲で可変であり、多分散性を示唆しているが、ポリマー官能化がナノ粒子に安定性を与えるであろう。図３４Ｂは、ｐＨが増加するにつれて、ＭＣ３ ＬＮＰのゼータ電位が徐々に低下することを示した。これはイオン化可能脂質の典型的な挙動であるので、これは予想通りである。

【0281】

実施例１０ － 周囲温度でのＲＮＡの長期安定貯蔵のための、水溶液中と凍結乾燥の両方のＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ製剤への安定化分子の共封入
トレハロース共封入を用いてＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰを最適化した後、長期貯蔵試験を行って、様々な温度で経時的に、ｓａＲＮＡとトレハロースが共封入されたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの粒径、表面電荷、ＨＥＫ－２９３細胞生存率およびＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを測定した。－２０℃、４℃および２０℃の３つの貯蔵温度を使用して、冷凍庫、冷蔵庫および周囲条件を模倣した。トレハロースは、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に存在し、両側からの保護を提供し、製造および貯蔵中のナノ粒子の望ましい物理的安定性（例えば、粒子凝集およびペイロード漏出の防止）および化学的安定性（例えば、ＲＮＡなどの生体分子の保護）を保証し、したがって、ｓａＲＮＡの機能性を維持および延長する。

【0282】

図３５は、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に２５０ｍｇ／ｍＬのトレハロースが共存する（ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ）、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰの水溶液中および凍結乾燥の製剤の特性評価を示す。新鮮な場合、３種全てのポリマーコーティングＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについて、粒径は１５０ｎｍ未満のままであり、ＰＤＩは約０．４未満であった。これは、０週目の新鮮なＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅと新鮮な非コーティングＭＣ３ ＬＮＰ（ＰＥＧ化ＬＮＰ／ｔｒｅ）の両方に当てはまった。－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵後、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、新鮮な製剤と比較して同様の流体力学的サイズおよびＰＤＩを維持した。非コーティングＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、試験された全ての温度で、流体力学的サイズが約２５０ｎｍにも達し、ＰＤＩが０．６であり最も不安定性を示した。凍結乾燥形態のＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅは、様々な温度で水溶液中の製剤と同様の傾向に従った。全体として、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、水溶液および凍結乾燥形態で、１１週間にわたって流体力学的サイズおよびＰＤＩの安定性を示した。

【0283】

図３６は、１１週間にわたる、水溶液および凍結乾燥形態の、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電子を示す。溶液中のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含む新鮮なＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ－１４．６±０．４ｍＶ、－２５．５±０．７ｍＶ、－２４．７±０．６ｍＶおよび－７．５±０．８ｍＶのゼータ電位を有した。ＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含む新たに凍結乾燥されたＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位は、それぞれ－１５．２±０．３ｍＶ、－２３．５±０．２ｍＶ、－２８．０±０．３ｍＶおよび－８．４±０．７ｍＶであった。－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度でのゼータ電位は、水溶液および凍結乾燥形態のＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅの両方について、１１週間の貯蔵を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが非常に小さかった。

【0284】

図３７は、１１週間の貯蔵にわたる、水溶液および凍結乾燥形態の、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション効率を示す。溶液および凍結乾燥形態の新鮮なＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ約１０^７．５ＲＬＵおよび約１０^６ＲＬＵのトランスフェクション効率を示した。それぞれ－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度で１１週間の貯蔵後の凍結乾燥ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅのトランスフェクション効率は、全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきは小さかったが、ＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、１１週間の期間を通してＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅより１～３桁低いままであった（図３７Ｂ）。これは、ポリマー官能化を有するＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰとポリマーを含まないＭＣ３ ＬＮＰの両方について、ナノ粒子の内側と外側の両方のトレハロースの共存が、ｓａＲＮＡの機能性を首尾よく維持することができることを検証した。発明者らが実証した、特にＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ製剤についての室温（２０℃）でのＲＮＡの優れた熱安定性および高いトランスフェクション効率は、ＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の製造、貯蔵および分配における別の重要な技術的ブレークスルーを表し、巨大な商業的可能性および社会経済的影響を有する。

【0285】

図３７Ａにも示されるように、－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵後の水溶液中のＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３トランスフェクション効率は、全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが小さかった。ＭＣ３ ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、試験したこれら全ての温度で、水溶液中での１１週間の貯蔵を通して、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅよりも１～３桁低いままであった。水溶液中にＲＮＡを貯蔵することが大きな課題であることを考慮すると、これらもまた重要な知見である。さらに、以前の製剤と同様に、（ｉ）この予備貯蔵作業ではＮ／Ｐ比１を使用したが、より高いＮ／Ｐ比を使用すると、（ＰＦ－ＬＮＰで図８に示されるように）トランスフェクション効率が向上し；（ｉｉ）ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰ組成物および製剤をさらに最適化することができることを指摘する価値がある。本発明者らは、周囲温度での長期貯蔵後のＰＦ－ＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの熱安定性が、最適化後にさらに強化され得ると考えている。

【0286】

図３８は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ－２９３の相対生存率が、それぞれ－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度で１１週間の貯蔵期間にわたって、水溶液と凍結乾燥形態の両方のＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＭＣ３ ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後に約８０％超のままであったことを示す。ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＭＣ３ ＬＮＰのこれらのＨＥＫ－２９３細胞生存率は、ｓａＲＮＡとトレハロースの混合物である陰性対照ｓａＲＮＡ＋ｔｒｅと同等であり、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することをさらに確認した。

【0287】

実施例１１ － ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの調製および特性評価、高い生体適合性および低い細胞傷害性、ならびに効率的な細胞内ＲＮＡ送達を介した高いインビトロトランスフェクション効率
本発明者らは、以下の材料および方法の節で説明されるように、（１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン）イオン化可能脂質（ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ）に基づいてポリマー官能化脂質ナノ粒子を合成した。ＤＯＴＡＰ ＰＦ－ＬＮＰを、３種の異なる擬似ペプチドポリマーであるＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングした。

【0288】

ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの生理化学的特性評価
図３９は、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的直径、ＰＤＩおよびゼータ電位に対するＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡ、およびＰＬＰ－ＡＤＡポリマー密度の効果を示す。図３９Ａに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５でコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで同様であることが見出された。ＰＰ７５でコーティングされた製剤のＰＤＩも、約０．２～０．４で同様であり、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。非コーティングＤＯＤＡＰ ＬＮＰは、０．２２±０．１のＰＤＩを有したので、ポリマー官能化製剤と同様に単分散であった。同様に、図３９Ｂに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＮＤＡでコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで同様であることが見出された。ＰＬＰ－ＮＤＡでコーティングされた製剤のＰＤＩもまた、約０．３で同様であり、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。比較すると、図３９Ｃに示される平均粒径は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについて、約１５０ｎｍで他の２つのポリマーコーティングＰＦ－ＬＮＰと同様であった。ＰＬＰ－ＡＤＡコーティング製剤のＰＤＩは、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡについて約０．４であった。これは、ＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰが単分散であったことを示唆している。また、これらの単分散粒子は全て２００ｎｍ未満であり、有効な細胞内送達に適したものとなった。図３９Ａ、ＢおよびＣのゼータ電位によって示される、粒子の電荷は、ポリマーコーティングのないＤＯＤＡＰ ＬＮＰについての－７．３±０．４ｍＶから、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５を含むＤＯＴＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについての－１５．７±０．２ｍＶ、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＮＤＡを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについての－２６．９±１．６ｍＶ、および１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ－ＡＤＡを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについての－２７．９±０．３ｍＶまで変化した。全ての製剤が同じ傾向に従った；ポリマー濃度が増加するにつれて、ゼータ電位が低下した。前述のように、負電荷は、高い抗体産生につながる^１１、リンパ節への排出の強化（実施例４で証明される）のために、ワクチン用途に有益である。図４０に示されるように、ｓａＲＮＡを封入した場合、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的サイズおよびゼータ電位は、ポリマーコーティングの種類にかかわらず、有意に影響を受けなかった。

【0289】

カルセイン、ＦＩＴＣ－デキストランおよびｓａＲＮＡのＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰへのインサイチュ担持
モデルペイロードであるカルセイン（Ｍｗ約６２２．５５Ｄａ）およびＦＩＴＣ－デキストラン（Ｍｗ約１５０ｋＤａ）のＤＯＤＡＰ ＬＮＰへのインサイチュ担持を調査して、ＤＯＤＡＰ ＬＮＰが広範囲のペイロードを封入する能力を実証した。図４１Ａは、カルセインおよびＦＩＴＣ－デキストランの封入効率がそれぞれ６１．９±０．２％および５８．６±１．７％であったことを示す。図４１Ｂは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによって決定される、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰのｓａＲＮＡ封入効率が６２．５９±０．２５％であったことを示す。これは、受動的担持ペイロードについて予想される通りである。

【0290】

図４２は、ＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰおよびＭＣ３ ＬＮＰのＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。示されるように、ポリマー官能化は、ｓａＲＮＡのトランスフェクション効率の強化において重要な役割を果たす；ポリマー濃度が増加するにつれて、トランスフェクション効率が少なくとも１桁増加した。ＰＰ７５およびＰＬＰ－ＡＤＡコーティングは、ＰＬＰ－ＮＤＡと比較して最良の性能を示し、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５またはＰＬＰ－ＡＤＡでのトランスフェクション効率は約１０^７．５ＲＬＵであった。

【0291】

図４３は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ２９３の相対生存率が、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後に約８０％超のままであったことを示す。これにより、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することが確認された。

【0292】

実施例１２ － 周囲温度でのＲＮＡの長期安定貯蔵のための、水溶液中と凍結乾燥の両方のＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ製剤への安定化分子の共封入
トレハロース共封入を用いてＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰを最適化した後、長期貯蔵試験を行って、様々な温度で経時的に、ｓａＲＮＡとトレハロースが共封入されたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの粒径、表面電荷、ＨＥＫ－２９３細胞生存率およびＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクションを測定した。－２０℃、４℃および２０℃の３つの貯蔵温度を使用して、冷凍庫、冷蔵庫および周囲条件を模倣した。トレハロースは、ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に存在し、両側からの保護を提供し、製造および貯蔵中のナノ粒子の望ましい物理的安定性（例えば、粒子凝集およびペイロード漏出の防止）および化学的安定性（例えば、ＲＮＡなどの生体分子の保護）を保証し、したがって、ｓａＲＮＡの機能性を維持および延長する。

【0293】

図４４は、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方に２５０ｍｇ／ｍＬのトレハロースが共存する（ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ）、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたｓａＲＮＡ封入ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの水溶液および凍結乾燥形態の製剤の特性評価を示す。新鮮な場合、３種全てのポリマーコーティングＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについて、粒径は２００ｎｍ未満のままであり、ＰＤＩは約０．４未満であった。０週目の新鮮な非コーティングＤＯＤＡＰ ＬＮＰ（ＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅ）の流体力学的サイズは２００ｎｍ超であり、水溶液および凍結乾燥形態についてそれぞれＰＤＩが０．３および０．４であった。－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵後、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、新鮮な製剤と比較して同様の流体力学的サイズおよびＰＤＩを維持した。非コーティングＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、試験された全ての温度で、流体力学的サイズが約２５０ｎｍにも達し、ＰＤＩが０．６であり最も不安定性を示した。凍結乾燥形態のＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅは、全ての温度で８週間にわたって、ＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのＰＤＩが０．４未満であったことを除いて、様々な温度で水溶液中の製剤と同様の傾向に従い、水溶液中の場合と比較して単分散粒子を示唆している。全体として、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅは、水溶液および凍結乾燥形態で、１１週間にわたって流体力学的サイズおよびＰＤＩの安定性を示した。

【0294】

図４５は、１１週間にわたる、水溶液および凍結乾燥形態の、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡでコーティングされたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位を示す。溶液中のＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含む新鮮なＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ－１５．２±０．３ｍＶ、－２６６．３±０．８ｍＶ、－２３．９±０．５ｍＶおよび－７．７±０．９ｍＶのゼータ電位を有した。ＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含む新たに凍結乾燥されたＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのゼータ電位は、それぞれ－１６．１±０．２ｍＶ、－２４．６５±０．４ｍＶ、－２９．０±０．２ｍＶおよび－８．３±０．８ｍＶであった。－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度でのゼータ電位は、水溶液および凍結乾燥形態のＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅとＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅの両方について、１１週間の貯蔵を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが非常に小さかった。

【0295】

図４６は、１１週間の貯蔵にわたる、水溶液および凍結乾燥形態の、１ｍｇ／ｍＬのＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡまたはＰＬＰ－ＡＤＡを含むＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅ、およびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３細胞トランスフェクション効率を示す。溶液および凍結乾燥形態の新鮮なＤＯＴＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅは、それぞれ約１０^７．５ＲＬＵおよび約１０^４ＲＬＵのトランスフェクション効率を示した。それぞれ－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度で１１週間の貯蔵後の凍結乾燥ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのトランスフェクション効率は全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが小さかったが、ＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、１１週間の期間を通してＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅより１～３桁低いままであった（図４６Ｂ）。これは、ポリマー官能化を有するＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰとポリマーを含まないＤＯＤＡＰ ＬＮＰの両方について、ナノ粒子の内側と外側の両方のトレハロースの共存が、ｓａＲＮＡの機能性を首尾よく維持することができることを検証した。発明者らが実証した、特にＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ製剤についての室温（２０℃）でのＲＮＡの優れた熱安定性および高いトランスフェクション効率は、ＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の製造、貯蔵および分配における別の重要な技術的ブレークスルーを表し、巨大な商業的可能性および社会経済的影響を有する。

【0296】

図４６Ａにも示されように、－２０℃、４℃および２０℃で１１週間の貯蔵後の水溶液中のＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅのＨＥＫ－２９３トランスフェクション効率は、全体を通して一貫したままであり、新鮮な製剤と比較してばらつきが小さかった。ＤＯＤＡＰ ＬＮＰ／ｔｒｅトランスフェクション効率は、概して、試験したこれら全ての温度で、水溶液中での１１週間の貯蔵を通して、ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ／ｔｒｅより１～３桁低いままであった。水溶液中にＲＮＡを貯蔵することが大きな課題であることを考慮すると、これらもまた重要な知見である。さらに、以前の製剤と同様に、（ｉ）この予備貯蔵作業ではＮ／Ｐ比１を使用したが、より高いＮ／Ｐ比を使用すると、（ＰＦ－ＬＮＰで図８に示されるように）トランスフェクション効率が向上し；（ｉｉ）ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ組成物および製剤をさらに最適化することができることを指摘する価値がある。本発明者らは、周囲温度での長期貯蔵後のＰＦ－ＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの熱安定性が、最適化後にさらに強化され得ると考えている。

【0297】

図４７は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して決定される、ＨＥＫ －２９３の相対生存率が、それぞれ－２０℃、４℃および２０℃の全ての温度で１１週間の貯蔵期間を通して、水溶液および凍結乾燥形態のＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰの全ての製剤による４８時間の処理後、約８０％超のままであったことを示す。ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＬＮＰのこれらのＨＥＫ－２９３細胞生存率は、ｓａＲＮＡとトレハロースの混合物である陰性対照ｓａＲＮＡ＋ｔｒｅと同等であり、ＰＦ－ＬＮＰ製剤が無視できるかまたは低い細胞傷害性を有することをさらに確認した。

【0298】

全体として、アニオン性、ウイルスペプチド模倣、エンドソーム溶解性ポリマーであるＰＰ７５、ＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡによる表面官能化が、トレハロースの同時送達と組み合わせて、冷凍庫温度（－２０℃）、冷蔵庫温度（４℃）、室温（２０℃）および熱帯温度（４０℃）で少なくとも５２週間、水溶液中と凍結乾燥の両方の、カチオン性脂質およびイオン可能脂質から構成されるＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ製剤を安定化するために重要な役割を果たし、ＲＮＡ送達ナノ製剤の物理的および化学的安定性ならびに優れたトランスフェクション効率を確実にすることが実証されている。

【0299】

結論
本発明は、ＲＮＡを含む核酸の効率的なインビトロおよびインビボ細胞内送達、ならびにウルトラコールドチェーンもコールドチェーンも必要としない室温および熱帯温度での安定な貯蔵のためのＰＦ－ＬＮＰの調製、特性評価および適用を実証する。ＰＦ－ＬＮＰ、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ、ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰの生理化学的特性評価は、このシステムをＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品の細胞内送達に理想的なものにする、－４１．７±３．７ｍＶと低いゼータ電位での２００ｎｍ未満の平均粒径を示した。さらに、８７．２±９．８％という高いｓａＲＮＡ封入効率が達成され、これは、より少ない体積で高用量を送達するのに理想的である。市販のゴールドスタンダードであるＰＥＩよりも１．５桁高いトランスフェクション効率が達成された。ＰＦ－ＬＮＰは、タンパク質発現と自然応答との間の良好なバランスを維持することができ、インターフェロンコンピテント細胞において優れたトランスフェクション効率を示す。本発明者らは、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ、ＭＣ３－ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについても同じことが当てはまると想定している。アニオン性、エンドソーム溶解性、非細胞傷害性ＰＦ－ＬＮＰは、改善されたリンパ節排出、効率的なタンパク質発現およびインビボでの優れた免疫原性を示した。本発明者らは、ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰ、ＭＣ３－ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについても同じことが当てはまると想定している。ＰＦ－ＬＮＰプラットフォームは、高分子と共に小分子薬物を同時送達する能力が実証されており、極めて汎用性が高い。本技術の独自の構造特性関係により、本発明者らが、イオン化可能脂質（ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰおよびＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰ）を含むように脂質組成を変更すること、または（ＰＥＧ化またはＰＬＰ－ＮＤＡおよびＰＬＰ－ＡＤＡによる）ポリマーコーティングを変更することにより、元のＰＦ－ＬＮＰ対応物よりも化学的、物理的、および生物学的に安定なＬＮＰを製造することができることを実証することが可能になった。ＲＮＡを共封入された様々なＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方のトレハロースなどの安定化分子の存在により、ウルトラコールドチェーンもコールドチェーンも必要とせずに、室温および熱帯温度で少なくとも５２週間、水溶液中と凍結乾燥の両方の製剤の安定な貯蔵を可能にすることができる。全体として、ＰＦ－ＬＮＰは、大規模製造に適した有望な送達プラットフォームであり、標的化された効率的な細胞内ＲＮＡ送達のための堅牢な熱安定性製剤を提供することによって、ＲＮＡワクチンおよびバイオ医薬品などの核酸の臨床解釈および商業化の問題に対して解決策を提供することができる。

【0300】

材料および方法
材料
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、（１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン）（ＤＯＤＡＰ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）脂質、コレステロール、イソ－フタロイルクロリド、６－アミノフルオレセイン、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（英国、ドーセット）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリエチルアミン、塩化ナトリウム、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＤＨ細胞傷害性アッセイキットおよびＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイキットは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（英国、ラフバラー）から購入した。無水エタノール、アセトン、ｄ_６－ＤＭＳＯ、塩酸、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、メタノール、ジエチルエーテルおよびクロロホルムは、ＶＷＲ（英国、ラターワース）から入手した。Ｌ－リジンメチルエステル二塩酸塩、Ｌ－フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩およびＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（英国、ヘイシャム）から購入した。脱線維ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）は、ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ（英国、バッキンガム）から購入した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ（英国、サウサンプトン）から購入した。ポリマーであるポリ（Ｌ－リジンイソフタルアミド）（ＰＬＰ）およびＰＰ７５は、確立されたプロトコル^４に従って社内で合成した。ホタルルシフェラーゼをコードするｓａＲＮＡ（ｆＬｕｃ－ｓａＲＮＡ）およびヘマグルチニンインフルエンザウイルスをコードするｓａＲＮＡ（ＨＡ－ｓａＲＮＡ）は共に、聖メアリー病院およびインペリアル・カレッジ・ロンドンの感染症科のＲｏｂｉｎ Ｓｈａｔｔｏｃｋ教授のグループによって親切にも提供された。

【0301】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）合成
脂質膜は、Ｇｕｏら、（２０１５）^１８によって使用された方法に従って調製した。具体的には、特定の濃度の脂質をクロロホルム（２５％（ｖ／ｖ）メタノール）に溶解した。溶媒を３時間にわたる回転蒸発によって除去した。これにより、丸底フラスコ内側に薄い脂質膜が形成された。膜を３０℃の水浴中で１時間水和させた。

【0302】

ミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、米国）を使用して、押出を行って粒子を合成した。脂質溶液を、ｓａＲＮＡ（または他の小分子との共封入）を用いてまたは用いないで、０．２μｍポリカーボネート膜に３１回通して、安定な粒子を形成した。製剤中の総脂質濃度：
・ＰＦ－ＬＮＰについて：ＤＯＴＡＰ：１．２ｍｇ／ｍＬ、ＤＯＰＥ：１．２ｍｇ／ｍＬ、コレステロール：１．６ｍｇ／ｍＬ；
・ＰＥＧ化ＰＦ－ＬＮＰについて：ＤＯＴＡＰ：１１．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＯＰＥ：１８．６ｍｇ／ｍＬ、コレステロール：２．７６ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：１．８８ｍｇ／ｍＬ；
・ＭＣ３ ＰＦ－ＬＮＰについて：ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ：１６．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＳＰＣ：３．６７ｍｇ／ｍＬ、コレステロール：７．４４ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：１．８８ｍｇ／ｍＬ；
・ＤＯＤＡＰ ＰＦ－ＬＮＰについて：ＤＯＤＡＰ：１１．１ｍｇ／ｍＬ、ＤＯＰＥ：１８．６ｍｇ／ｍＬ、コレステロール：２．７６ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：１．８８ｍｇ／ｍＬ。

【0303】

ポリマー官能化脂質ナノ粒子（ＰＦ－ＬＮＰ）の形成
ポリマーコーティング効率を決定するために、ＦＩＴＣ－ＰＰ７５を使用して、既知の濃度で粒子をコーティングした。ｐＨ７．４のＤ－ＰＢＳを使用して１０ｍｇ ｍＬ^－１ストック溶液を作製し、これを所望の濃度に希釈した。これを粒子溶液と混合し、一晩吸着させた。透析装置（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭＷＣＯ３００ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ、米国）を使用して過剰なＰＰ７５を除去した。４９０ｎｍの励起波長および５１０～５７０ｎｍの発光波長を用いて、分光蛍光計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して蛍光を測定した。ｐＨ７．４で既知の濃度のＦＩＴＣ－ＰＰ７５を使用して較正曲線をプロットして、蛍光読み取り値を濃度と相関させた。

【0304】

ＰＦ－ＬＮＰの特性評価
動的光散乱（ＤＬＳ）
動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して、ＰＦ－ＬＮＰの流体力学的サイズの変化を調査した。ＤＬＳのために試料を調製するために、ＰＦ－ＬＮＰ溶液をｐＨ７．４のＤ－ＰＢＳで希釈し、５分間平衡化して、適切なカウントレートを得た。試料を、１３７°の角度で、直径１０ｍｍのセルにおいて１３回の反復を用いて２５℃で測定した。

【0305】

ゼータ電位
ＰＡＬＳゼータ電位分析装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．、英国）を使用して、ＰＦ－ＬＮＰのゼータ電位を測定した。試料を調製するために、ＰＦ－ＬＮＰ溶液をｐＨ７．４のＤ－ＰＢＳで希釈し、５分間平衡化して、適切なカウントレートを得た。試料を、６５９ｎｍで９０°の固定散乱角で、６回の反復（１回の実行当たり２０サイクル）を用いて２０℃で測定した。

【0306】

細胞および培養物
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）、ＨＥＫ－２９３細胞（ヒト胎児腎細胞）およびＭＲＣ－５細胞（肺組織由来線維芽細胞）を培養し、完全ダルベッコ改変イーグル培地（ｃＤＭＥＭ）（特に指定しない限り、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００ＵｍＬ^－１ペニシリンを補充）中で維持した。ＨＥＫ－２９３細胞の場合、５ｍｇ／ｍＬのＬ－グルタミンも培養培地に添加した。細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡを使用してトリプシン処理し、３７℃で５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内に維持した。

【0307】

Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイ
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイを使用して、ｓａＲＮＡの封入効率を測定した。ｓａＲＮＡを封入したＰＦ－ＬＮＰ溶液を、９６ウェルプレート中で、希釈緩衝液を用いて５０ｎｇ ｍＬ^－１に希釈した。１００μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）（１：１０００に希釈）を各ウェルに添加し、光から保護しながら、５分間インキュベートした後、分光蛍光計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して蛍光強度を測定した。試料を４８０ｎｍで励起し、５２０ｎｍで発光を測定した。ｐＨ７．４で較正曲線を決定して、蛍光読み取り値を濃度と相関させた。

【0308】

インビトロトランスフェクション
ＨＥＫ－２９３およびＭＲＣ５細胞において、細胞トランスフェクション試験を行った。トランスフェクションの４８時間前に、１ウェル当たり５０，０００個の細胞を透明な９６ウェルプレートに蒔いた。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）をコードする１００ｎｇのｓａＲＮＡを含有する１００μＬのＰＦ－ＬＮＰ製剤を、５０μＬのトランスフェクション培地（５ｍｇ／ｍＬのＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ）を含有する各ウェルに添加した。細胞を４時間インキュベートして、トランスフェクションを行うことを可能にした。次いで、培地を１００μＬの新鮮な完全ＤＭＥＭで置き換え、２４時間インキュベートさせた。２４時間後、５０μＬの培地を除去し、５０μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）Ｄ－ルシフェリン基質で置き換え、よく混合した。１００μＬの全培地を白色９６ウェルプレートに入れ、分光蛍光計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して分析した。培地対照からのバックグラウンドを差し引いた。

【0309】

Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ
ｓａＲＮＡを含むおよび含まないＰＦ－ＬＮＰの細胞傷害性を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって評価した。様々な細胞株を、１ウェル当たり１００μＬの完全ＤＭＥＭを含有する９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に、１ウェル当たり１００個の細胞の密度で播種し、一晩培養した。使用済み培地を、無血清ＤＭＥＭ（０．２２μｍｍフィルターで滅菌）中の、ｓａＲＮＡを含むおよび含まない、１００μＬのＰＦ－ＬＮＰ溶液で置き換えた。一定の時間間隔でインキュベートした後、培地を除去し、細胞をＤ－ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを含有する補充完全ＤＭＥＭと４時間インキュベートした。各ウェルの蛍光を、５８０～６４０ｎｍの発光波長および５２５ｎｍの励起波長で、分光蛍光計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）によって測定した。蛍光読み取り値を使用して細胞傷害性を評価した。５０％阻害を引き起こす濃度、ＩＣ５０を、濃度依存性細胞生存率曲線から計算した。

【0310】

乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイ
細胞膜完全性に対するＰＦ－ＬＮＰの効果を、ＬＤＨアッセイによって決定した。様々な細胞株を、１ウェル当たり１００個の細胞の密度で、完全ＤＭＥＭ（１ウェル当たり１００μＬ）を含有する９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に播種し、２４時間培養した。使用済み培地を、無血清ＤＭＥＭ（０．２２μｍｍフィルターで滅菌）中の、ｓａＲＮＡを含むおよび含まない、ＰＦ－ＬＮＰを含有する１００μＬの無血清ＤＭＥＭで置き換えた。２４時間のインキュベーション後、上清中の放出されたＬＤＨをＬＤＨアッセイで定量化した。手短に言えば、各ウェル中の５０μＬの上清を新たなプレートに移し、キットからのＬＤＨ反応混合物と混合した。プレートを３０分間インキュベートし、停止溶液を使用して反応を停止した。分光蛍光計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して、４９０ｎｍおよび６８０ｎｍ（参照用）で吸光度を測定した。

【0311】

溶血アッセイ
溶血アッセイを使用して膜破壊挙動を測定することによって、ＰＦ－ＬＮＰのエンドソーム溶解挙動を決定した。試験する試料を、Ｄ－ＰＢＳ中、ｐＨ７．４およびｐＨ６．５で調製した。脱線維ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）をＤ－ＰＢＳで３回洗浄して、ＲＢＣのペレットを得た。ＲＢＣを試料中に混合し、全ての試料にわたっておよそ２×１０^８個ＲＢＣ ｍＬ^－１の濃度を確保した。これは較正曲線によって決定された。試料を、穏やかに攪拌しながら、水浴中、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、試料を３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、５４１ｎｍでＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＧＥＮＥＳＹＳ（商標）１０Ｓ ＵＶ－Ｖｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、各試料からの上清の吸光度を測定し、相対溶血率を決定した。

【0312】

共焦点顕微鏡法
エンドサイトーシス機序試験
ＨＥＫ－２９３細胞を、コラーゲンコーティングされたガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）に１皿当たり１×１０^５個の細胞で播種し、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。ＤＭＥＭ中の経路阻害剤を各皿に添加し１時間おいた後、阻害剤を含有するＰＦ－ＬＮＰ試料を添加した。細胞を１時間インキュベートし、次いで、試料を取り出し、細胞を３回洗浄した。次いで、トリプシン－ＥＤＴＡを使用して細胞を剥離し、阻害剤を含有するＤＭＥＭを使用して中和した。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。特異的阻害剤を含有する新鮮なＤＭＥＭを添加し、共焦点顕微鏡法を使用して細胞を画像化した。

【0313】

動物試験
インビボタンパク質発現
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、英国）の両後肢大腿四頭筋にｆＬｕｃ－ｓａＲＮＡが封入された５０μＬのＰＦ－ＬＮＰ製剤を注射した。次いで、ＶＥＥＶレプリコンについてピークルシフェラーゼ発現であると以前に決定されたように^２０、ルシフェラーゼ発現を７日目に画像化した。

【0314】

免疫原性
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、英国）を、ｎ＝５の群に入れた。群サイズを計算して、４０ｎｇ／ｍＬの標準偏差、０．９の検定力およびα＝０．０５で２００ｎｇ／ｍＬの差を検出した。マウスの１つの後肢大腿四頭筋に、５０μＬのＰＦ－ＬＮＰ製剤中５μｇのインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）コードｓａＲＮＡを注射し、４週間後に同じ製剤でブーストした。各注射前およびブースター注射の２週間後に尾部出血を採取した。血液を採取し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清を収穫し、－２０℃で保存した。インフルエンザ負荷を７週目に導入し、その時点で体重減少および生存率を監視した。

【0315】

ＨＡ ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡ
以前記載されたプロトコル^２１を使用して、半定量的免疫グロブリンＩｇＧ ＥＬＩＳＡを行った。手短に言えば、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの組換えＨＡをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＰＢＳ中ラムダ（１：１０００）軽鎖および抗マウスカッパ（１：１０００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）でＥＬＩＳＡプレートウェルをコーティングすることによって、標準を調製した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を使用してプレートをブロッキングした。洗浄ステップ後、１０００ｎｇ／ｍＬで開始し、５倍希釈系列でプレートを滴定して、希釈試料および精製ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）をプレートに添加し、引き続いて１時間インキュベートし、洗浄ステップを行った。抗マウスＨＡ－ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）の１：２０００希釈を検出に使用し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｉｄｉｎｅ））を使用してプレートを展開した。５分後、反応を停止溶液（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）で停止した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ ｖ５ソフトウェアを用いて分光光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で吸光度を読み取った。

【0316】

リンパ節組織学試験
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、英国）を、ｎ＝３の群に入れた。マウスの１つの後肢大腿四頭筋に、Ｃｙ５－ＰＰ７５でコーティングされた５０μＬのＰＦ－ＬＮＰ製剤中の５μｇのＥＧＦＰ－ｓａＲＮＡを注射した。製剤をリンパ節に１時間排出させた後、収穫し、１５％、次いで３０％のスクロース溶液中に固定した。次いで、リンパ節を－２０℃で最適切断温度（ＯＣＴ）に凍結包埋し、回転式ミクロトーム（ＣｒｙｏＳｔａｒ ＮＸ７０ Ｃｒｙｏｓｔａｔ、英国）を使用して５μｍスライスした。試料をＰＯＬＹＳＩＮＥ（商標）顕微鏡ガラススライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）上で回収し、１時間放置して空気乾燥させた。次に、試料スライドを水道水ですすぎ、オイルレッドＯ濾過溶液で２０分間染色させて、蒸留水で洗浄した。次いで、ギル１ヘマトキシリン中で１～２分間対比染色し、引き続いて水道水で洗浄した。次に、試料スライドを、１％酸性アルコール中で数秒間区別し、流水中で洗浄し、青色にした。最後に、試料を蒸留水ですすぎ、スライドの上部に封入剤として、水性アパチ培体中のカバースリップを適用した。試料を一晩乾燥させ、倒立広視野顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、英国）を使用してリンパ節試料を画像化した。

【0317】

凍結乾燥
ＰＦ－ＬＮＰの内側と外側の両方にトレハロースが共存するｓａＲＮＡ封入ＰＦ－ＬＮＰ製剤を、上に概説されるプロトコルに従って合成した。次いで、製剤を－８０℃まで凍結し、一晩凍結乾燥した。脱水試料を、ＰＢＳを使用して再水和させ、ボルテックスミキサー（Ｖｅｌｐ Ｆ２０２Ａ０１７５ Ｗｉｚａｒｄ Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ、英国）を使用して混合した。

【0318】

統計分析
全てのデータポイントを３連で繰り返した（ｎ＝３）。結果は、少なくとも９５％の信頼区間を包含する標準偏差を含む平均値として提示される。スチューデントのｔ検定を実施して、統計学的有意性を評価した；Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。

【0319】

参考文献
1.Fleeton, M. N. et al. Self-Replicative RNA Vaccines Elicit Protection against Influenza A Virus , Respiratory Syncytial Virus , and a Tickborne Encephalitis Virus. J. Infect. Dis. 183, 1395-1398 (2001).
2.Lundstrom, K. Self-replicating RNA viruses for RNA therapeutics. Molecules (2018) doi:10.3390/molecules23123310.
3.Chen, R., Khormaee, S., Eccleston, M. E. & Slater, N. K. H. The role of hydrophobic amino acid grafts in the enhancement of membrane-disruptive activity of pH-responsive pseudo-peptides. Biomaterials 30, 1954-1961 (2009).
4.Chen, R., Eccleston, M. E., Yue, Z. & Slater, N. K. H. Synthesis and pH-responsive properties of pseudo-peptides containing hydrophobic amino acid grafts. J. Mater. Chem. (2009) doi:10.1039/b902822f.
5.Eccleston, M. E., Slater, N. K. H. & Tighe, B. J. Synthetic routes to responsive polymers; co-polycondensation of tri-functional amino acids with diacylchlorides. React. Funct. Polym. 42, 147-161 (1999).
6.Eccleston, M. E., Kuiper, M., Gilchrist, F. M. & Slater, N. K. H. pH-responsive pseudo-peptides for cell membrane disruption. J. Control. Release 69, 297-307 (2000).
7.Chen, R., Yue, Z., Eccleston, M. E., Williams, S. & Slater, N. K. H. Modulation of cell membrane disruption by pH-responsive pseudo-peptides through grafting with hydrophilic side chains. J. Control. Release (2005) doi:10.1016/j.jconrel.2005.07.011.
8.Ho, V. H. B., Slater, N. K. H. & Chen, R. PH-responsive endosomolytic pseudo-peptides for drug delivery to multicellular spheroids tumour models. Biomaterials 32, 2953-2958 (2011).
9.Chen, S. & Chen, R. A Virus-Mimicking, Endosomolytic Liposomal System for Efficient, pH-Triggered Intracellular Drug Delivery. ACS Appl. Mater. Interfaces 8, 22457-22467 (2016).
10.Rejman, J., Oberle, V., Zuhorn, I. S. & Hoekstra, D. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin-and caveolae-mediated endocytosis. Biochem. J. (2004) doi:10.1042/BJ20031253.
11.Nakamura, T. et al. The Effect of Size and Charge of Lipid Nanoparticles Prepared by Microfluidic Mixing on Their Lymph Node Transitivity and Distribution. Mol. Pharm. 17, 944-953 (2020).
12.Tribet, C. & Vial, F. Flexible macromolecules attached to lipid bilayers: Impact on fluidity, curvature, permeability and stability of the membranes. Soft Matter (2007) doi:10.1039/b708431p.
13.Gutierrez De Rubalcava, C. et al. Interactions between liposomes and hydroxypropylmethylcellulose. Int. J. Pharm. (2000) doi:10.1016/S0378-5173(00)00433-6.
14.Liu, D. Z., Chen, W. Y., Tasi, L. M. & Yang, S. P. Microcalorimetric and shear studies on the effects of cholesterol on the physical stability of lipid vesicles. Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp. 172, 57-67 (2000).
15.Wu, G. & Lee, K. Y. C. Effects of poloxamer 188 on phospholipid monolayer morphology: An atomic force microscopy study. Langmuir (2009) doi:10.1021/la802908x.
16.Guan, S. & Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Ther. 24, 133-143 (2017).
17.Geall, A. J. et al. Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 14604-14609 (2012).
18.Guo, F., Yu, M., Wang, J., Tan, F. & Li, N. Smart IR780 Theranostic Nanocarrier for Tumor-Specific Therapy: Hyperthermia-Mediated Bubble-Generating and Folate-Targeted Liposomes. ACS Appl. Mater. Interfaces 7, 20556-20567 (2015).
19.Blakney, A. K., McKay, P. F. & Shattock, R. J. Structural Components for Amplification of Positive and Negative Strand VEEV Splitzicons. Front. Mol. Biosci. (2018) doi:10.3389/fmolb.2018.00071.
20.Vogel, A. B. et al. Self-Amplifying RNA Vaccines Give Equivalent Protection against Influenza to mRNA Vaccines but at Much Lower Doses. Mol. Ther. 26, 446-455 (2018).
21.Badamchi-Zadeh, A. et al. Intramuscular immunisation with chlamydial proteins induces chlamydia trachomatis specific ocular antibodies. PLoS One (2015) doi:10.1371/journal.pone.0141209.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【国際調査報告】