特表 2024-544534 ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241126BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241126BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241126BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K14/705

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12Q1/02

C12Q1/66

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61P37/02

A61P3/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527569

(86)(22)【出願日】2022-11-09

(85)【翻訳文提出日】2024-06-21

(86)【国際出願番号】 US2022079530

(87)【国際公開番号】W WO2023086812

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/278,374

(32)【優先日】2021-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/278,454

(32)【優先日】2021-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】シェン、ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ベイ

(72)【発明者】

【氏名】アヴァル、ナガ スハシニ

(72)【発明者】

【氏名】リン、チャ－ヤン

(72)【発明者】

【氏名】マーフィー、アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ヘルマン、アイヌル

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジ エイチ．

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ23

4B063QR57

4B063QR80

4B063QS28

4B063QX02

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA03

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB12

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA50

4H045DA76

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＣＤ２０及びＰＤ１の両方に結合することができる分子、並びにそのような分子を含む薬学的組成物及びその使用方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質であって、
（ａ）少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分と、
（ｂ）少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分と、
（ｃ）少なくとも１つの二量体化部分と、
（ｄ）任意選択で、前記タンパク質中の１つ以上の部分を分離する１つ以上のリンカー部分と、を含み、
ここで、
（ｉ）前記タンパク質の部分は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ２０標的化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－二量体化部分の順に配置されているか、
（ｉｉ）前記ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン若しくはそのＰＤ１結合部分であり、前記二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、前記Ｆａｂの軽鎖は、前記ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分に融合していないか、
（ｉｉｉ）前記ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、前記ＰＤＬ１のエクトドメイン若しくはそのＰＤ１結合部分であり、前記二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、前記抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にないか、
（ｉｖ）前記ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、前記ＰＤＬ１のエクトドメイン若しくはそのＰＤ１結合部分であり、前記二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、前記ＦｃドメインのＣ末端にないか、
（ｖ）前記ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、前記ＰＤ１アゴニスト部分は、前記ＰＤＬ１のエクトドメイン若しくはそのＰＤ１結合部分であり、前記二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、前記タンパク質は、前記ＣＤ２０標的化部分及び／若しくは前記ＰＤ１アゴニスト部分に対して一価であるか、
（ｖｉ）又は前述の（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせである、タンパク質。

【請求項2】

前記少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片である、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記抗ＣＤ２０抗体の前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖの形態にある、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項4】

前記抗ＣＤ２０抗体が、
（ａ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｉｔｕｘｅｔａｎ）、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブから選択されるか、又は
（ｂ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブから選択される抗ＣＤ２０抗体とＣＤ２０との結合に関して競合し、かつ／若しくは抗ＣＤ２０抗体と同じエピトープに結合する、請求項２又は３に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項6】

前記ＰＤ１アゴニスト部分が、前記ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分の前記アミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、請求項５に記載のタンパク質。

【請求項7】

前記ＰＤＬ１の細胞外ドメインの前記ＰＤ１結合部分が、ヒトＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４又はマウスＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４を含む、請求項５又は６に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記ＰＤＬ１の細胞外ドメインの前記ＰＤ１結合部分が、ＰＤＬ１エクトドメインを含むか、又はそれからなり、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、請求項５又は６に記載のタンパク質。

【請求項9】

前記少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記ＰＤ１アゴニスト部分が、前記ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分のアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、請求項９に記載のタンパク質。

【請求項11】

前記ＰＤＬ２の細胞外ドメインの前記ＰＤ１結合部分が、ヒトＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１又はマウスＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１を含む、請求項９又は１０に記載のタンパク質。

【請求項12】

前記ＰＤＬ２の細胞外ドメインの前記ＰＤ１結合部分が、前記ＰＤＬ２エクトドメインを含むか、又はそれからなり、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、請求項９又は１０に記載のタンパク質。

【請求項13】

１つ以上のリンカー部分を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項14】

１）少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、リンカー部分によって分離され、２）少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも少なくとも１つの二量体化部分が、リンカー部分によって分離される、請求項１３に記載のタンパク質。

【請求項15】

各リンカー部分が、（ａ）少なくとも５若しくは少なくとも１０アミノ酸長であり、（ｂ）最大２０、最大２５若しくは最大３０アミノ酸長であり、かつ／又は（ｃ）５～１５アミノ酸若しくは５～２０アミノ酸長である、請求項１３又は１４に記載のタンパク質。

【請求項16】

少なくとも１つのリンカー部分が、グリシン－セリンリンカーを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項17】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項18】

図１Ａに示される構成を有する、請求項１７に記載のタンパク質。

【請求項19】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項20】

図１Ｂに示される構成を有する、請求項１９に記載のタンパク質。

【請求項21】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項22】

図１Ｃに示される構成を有する、請求項２１に記載のタンパク質。

【請求項23】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項24】

図１Ｄに示される構成を有する、請求項２３に記載のタンパク質。

【請求項25】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項26】

前記第２のモノマーが、単一のポリペプチド鎖又は２つのポリペプチド鎖で構成される、請求項２５に記載のタンパク質。

【請求項27】

図１Ｅに示される構成を有する、請求項２５又は２６に記載のタンパク質。

【請求項28】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項29】

図１Ｆに示される構成を有する、請求項２８に記載のタンパク質。

【請求項30】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項31】

図１Ｇに示される構成を有する、請求項３０に記載のタンパク質。

【請求項32】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項33】

図１Ｈに示される構成を有する、請求項３２に記載のタンパク質。

【請求項34】

各々が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、２つのモノマーを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項35】

図１Ｉに示される構成を有する、請求項３４に記載のタンパク質。

【請求項36】

各々が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を含むか、又はそれらからなる、２つのモノマーを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項37】

図１Ｊに示される構成を有する、請求項３６に記載のタンパク質。

【請求項38】

（１）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、任意選択的リンカー部分、及びＣＤ２０標的化部分を含むか又はそれらからなる第１のモノマーと、（２）Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分を含むか又はそれらからなる第２のモノマーと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項39】

図１Ｋに示される構成を有する、請求項３８に記載のタンパク質。

【請求項40】

各々が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分を含むか、又はそれらからなる、２つのモノマーを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項41】

図１Ｌに示される構成を有する、請求項４０に記載のタンパク質。

【請求項42】

前記ＣＤ２０標的化部分が、ヒトＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、請求項１～４１のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項43】

前記ＰＤ１アゴニスト部分が、ヒトＰＤ１を刺激する、請求項１～４２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項44】

前記ＣＤ２０標的化部分が、マウスＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、請求項１～４１のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項45】

前記ＰＤ１アゴニスト部分が、マウスＰＤ１を刺激する、請求項１～４１及び４４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項46】

前記少なくとも１つの二量体化部分が、Ｆｃドメインであるか、又はＦｃドメインを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項47】

請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、核酸又は複数の核酸。

【請求項48】

請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項４７に記載の核酸（複数可）を発現するように操作された、宿主細胞。

【請求項49】

請求項４８に記載の宿主細胞を培養し、それによって発現された前記タンパク質を回収することを含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質を産生する、方法。

【請求項50】

請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質及び賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項51】

Ｔ細胞調節不全に関連する免疫障害又は状態に罹患している対象を治療する方法であって、有効量の、請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項５０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項52】

前記免疫障害又は状態が、１型糖尿病である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

対象における細胞性自己免疫応答を抑制する方法であって、有効量の、請求項１～４６のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項５０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項54】

前記方法が、前記対象におけるＴ細胞機能、Ｂ細胞機能、又はＴ細胞応答性を減少させる、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

ＰＤ１を刺激する分子Ｉ型の能力を特徴付ける方法であって、
（ａ）ＣＤ３を安定的に発現し、ＡＰ１－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現し、かつＰＤ１を安定的に発現する細胞Ｉ型を、ＣＤ２２を安定的に発現しＣＤ２０を安定的に発現する細胞ＩＩ型とともに培養することと、
（ｂ）前記分子Ｉ型及び分子ＩＩ型の存在下又は非存在下で、ステップａ）の培養細胞をインキュベートすることと、
（ｃ）ステップｂ）の後、前記培養細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することと、を含み、
前記分子Ｉ型が、ｉ）ＣＤ２０のエクトドメインに結合する第１の結合特異性、及びｉｉ）ＰＤ１に結合する第２の結合特異性を含む、多重特異性抗原結合分子であり、
前記分子ＩＩ型が、ｉ）ＣＤ３のエクトドメインに結合する第１の結合特異性、及びｉｉ）ＣＤ２２のエクトドメインに結合する第２の結合特異性、を含む、多重特異性抗原結合分子であり、
前記分子ＩＩ型の前記存在は、ルシフェラーゼ活性の増加を引き起こし、前記分子Ｉ型の前記存在は、前記分子ＩＩ型によって引き起こされた前記ルシフェラーゼ活性の低減を引き起こし、前記ルシフェラーゼ活性の低減の量は、前記分子Ｉ型のＰＤ１を刺激する能力を示す、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１１日に出願された米国仮出願第６３／２７８，４５４号及び２０２１年１１月１１日に出願された米国仮出願第６３／２７８，３７４号の優先権の利益を主張し、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

２．配列表
本出願は、電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１１月８日に作成された当該コピーは、ＲＧＮ－０１２ＷＯ＿ＳＬ．ｘｍｌという名称であり、サイズは６３，９２８バイトである。

【背景技術】

【0003】

３．背景
自己免疫疾患は、生物が自身の細胞及び組織に対して異常な免疫応答を有する場合に生じる。自己免疫を理解するための努力は、何十年にもわたって行われてきた。この間、免疫系が自己反応性を制御するための複数のメカニズムを進化させたことが明らかになった。これらのメカニズムの１つ以上の欠陥は、耐性の崩壊につながり得、自己免疫疾患をもたらし得る。

【0004】

全身性も臓器特異的自己免疫疾患も、最初の引き金は、先天性センサーによる自己又は外来分子の認識に関係している可能性が高い。この認識は、以前に静止していた自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の炎症応答及び関与を引き起こす。Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ，Ｋｏｎｏ，ａｎｄ Ｂａｃｃａｌａ，２０１７，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８（１７）：７１６－７２４。自己反応性は、リンパ球の選択及び免疫系の恒常性に不可欠な低い「生理学的」レベルの自己反応性から、臨床的帰結を伴わない循環自己抗体及び軽微な組織浸潤として現れる中間レベルの自己免疫性へ、免疫介在性臓器傷害に関連する病原性自己免疫へと多岐にわたる。Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ，Ｋｏｎｏ，ａｎｄ Ｂａｃｃａｌａ，２０１７，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８（１７）：７１６－７２４。自己免疫疾患は、臓器特異的（例えば、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、重症筋無力症）及び全身性（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群）に分けられ、自己抗体又は細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介され得るが、全ての例でヘルパーＴ細胞が必要である。Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ，Ｋｏｎｏ，ａｎｄ Ｂａｃｃａｌａ，２０１７，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８（１７）：７１６－７２４。

【0005】

ほとんどの自己免疫疾患は、臨床的不均一性、多遺伝子性、並びにしばしば遺伝的及び環境的要因の両方を必要とする多要因の寄与を示す。自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞のエスケープの制御には以下の４つのメカニズムが寄与している：阻害分子、アネルギー、無視、及び能動的抑制。Ｋｏｎｏ ａｎｄ Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ，Ｋｏｎｏ，ａｎｄ Ｂａｃｃａｌａ，２０１７，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８（１７）：７１６－７２４。いくつかの阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＦｃγＲＩＩｂ、特定のシグレック（Ｓｉｇｌｅｃ））をＴ細胞及びＢ細胞の表面上に発現させて、正常及び抗自己の両方の過剰な免疫応答を抑制する。これらの分子の一部の欠乏は、自己免疫をもたらし、自己反応性リンパ球が末梢レパートリーに存在するが、通常は制御下にあるという強力な証拠を提供する。Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ，２０１０，Ｎａｔ Ｕｍｍｕｎｏｌ，１１：１０９－１１１、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４：１２１２－１２１８、Ｐｉｎｃｅｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５：７０７－７１６、Ｍａｃａｕｌｅｙ，Ｃｒｏｃｋｅｒ，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，２９１４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４：６５３－６６６、Ｃｅｅｒａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ６９（４）：８１４－８２５、及びＳｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２１３：１６２７－１６４４を参照されたい。チェックされていない自己反応性に起因する広範囲にわたる免疫関連有害事象が頻繁に発生する。Ｍｉｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，５４：１３９－１４８。

【0006】

自己免疫疾患のための既存の治療法は、限られた成果しか得られなかった。例えば、代謝制御を通じて臓器特異的自己免疫疾患を矯正することはしばしば可能である。機能が失われ、回復することができない場合、機械的代替物又は組織移植片が適切であり得る。このアプローチを使用して症状のいくつかを緩和できる場合があるが、最も障害を引き起こす自己免疫疾患のいくつかについては、効果的な長期根治的治療は存在しない。インスリン、コルチコステロイド及び改変型ベータインターフェロンを含む多くの化合物は、自己免疫疾患のいくつかの症状を改善することができるが、それらは重篤な副作用を有する可能性があり、かつ／又は長期使用を必要とする可能性がある。シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６及びラパマイシンによる慢性治療などの一般的な免疫抑制薬物療法も、これらの疾患の治療を提供することができず、それらの使用は、多くの有害な副作用を伴う。当該作用には、腎毒性、感染症の素因の増加、及び新生物の発生率の増加が含まれる。

【0007】

したがって、自己免疫疾患を治療するために使用することができる新規の治療組成物及びプロトコルが求められる。

【発明の概要】

【0008】

４．概要
本開示は、新規のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、典型的には、１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び／又は１つ以上のＰＤ１アゴニスト部分を含むＣＤ２０－ＰＤ１モノマーを含むか、又はそれからなる。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、タンパク質を含み、タンパク質は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分と、少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分と、少なくとも１つの二量体化部分と、任意選択で、タンパク質中の１つ以上の部分を分離する１つ以上のリンカー部分と、を含む。ＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分が、Ｆｃドメインであるいくつかの実施形態では、任意選択で、ｉ）Ｆａｂの軽鎖が、ＰＤＬ１のエクトドメイン若しくはそのＰＤ１結合部分に融合していないか、ｉｉ）ＰＤ１アゴニスト部分が抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にないか、ｉｉｉ）ＰＤ１アゴニスト部分がＦｃドメインのＣ末端にないか、ｉｖ）タンパク質がＣＤ２０標的化部分及び／若しくはＰＤ１アゴニスト部分に対して一価であるか、ｉｖ）タンパク質が非対称であるか、ｖ）タンパク質がＦｃヘテロ二量体を含むか、又は前述の（ｉ）～（ｖｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせである。

【0009】

例示的なＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、セクション６．２及び番号付けされた実施形態１～１４２に開示されている。例示的なＣＤ２０標的化部分は、セクション６．２．１及び番号付けされた実施形態２～６に開示されている。例示的なＰＤ１アゴニスト部分は、セクション６．４及び番号付けされた実施形態７～２２に開示されている。

【0010】

本開示は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、及びＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分をコードする核酸を更に提供する。２つ以上のポリペプチド鎖から構成されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子及びＣＤ２０－ＰＤ１モノマーをコードする核酸は、単一の核酸（例えば、全てのポリペプチド鎖をコードするベクター）又は複数の核酸（例えば、異なるポリペプチド鎖をコードする２つ以上のベクター）であり得る。本開示は、本開示の核酸及びＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、ＣＤ２０標的化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を発現するように操作された宿主細胞及び細胞株を更に提供する。本開示は、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、ＣＤ２０標的化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を産生する方法を更に提供する。例示的な核酸、宿主細胞、細胞株、及びＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、ＣＤ２０標的化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を産生する方法は、以下のセクション６．８及び番号付けされた実施形態１５０～１５２に記載されている。

【0011】

本開示は、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、ＣＤ２０標的化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分を含む薬学的組成物を更に提供する。例示的な薬学的組成物は、以下のセクション６．９及び番号付きの実施形態１５３に記載されている。

【0012】

本明細書では、例えば、自己免疫疾患の治療、細胞性自己免疫応答の抑制、又は対象の免疫系の抑制のために、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー、ＣＤ２０標的化部分、ＰＤ１アゴニスト部分、及び薬学的組成物を使用する方法が更に提供される。例示的な方法は、以下のセクション６．１０及び番号付きの実施形態１５４～１６５に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0013】

５．図面の簡単な説明

【図1】図１Ａ～図１Ｌは、ある特定の実施形態による、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の様々なフォーマットを表す一連の漫画である。ＣＤ２０標的化部分の重鎖可変ドメインは、ストライプパターンで示され、軽鎖可変ドメインは、点線パターンで示され、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、ＰＤＬ１又はＰＤＬ２のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分）は、破線を有する円として示される。

【図2A】試験したマウスＣＤ２０－ＰＤ１結合分子ＰＤ１（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１）（分子Ａ～Ｌ、図２Ａ）及び対照（分子Ｍ～Ｓ、図２Ｂ）を表す一連の漫画を提示する。

【図2B】試験したマウスＣＤ２０－ＰＤ１結合分子ＰＤ１（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１）（分子Ａ～Ｌ、図２Ａ）及び対照（分子Ｍ～Ｓ、図２Ｂ）を表す一連の漫画を提示する。

【図3A】ｈＰＤＬ１（左）及びｍＰＤＬ１（右）の３次元モデルを示し、ｍＰＤＬ１の表面における不対のシステイン残基（Ｃ１１３）を強調している。

【図3B】ｍＰＤＬ１（上部配列）及びｈＰＤＬ１（下部配列）の部分配列アラインメント（７８～１３７ａａ）を示す。図は、配列番号５４～５５を出現順に、それぞれ開示する。

【図4A】フロー結合研究からのトレースを示し、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ／ｍＰＤ１及びＭＣ３８／ｍＣＤ２０又はＨＥＫ２９３／ｍＣＤ２０細胞上での、示されたＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）による、ｍＰＤＬ１結合（上部パネル）又は抗ｍＣＤ２０結合（下部パネル）を表す。

【図4B】フロー結合研究からのトレースを示し、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ／ｍＰＤ１及びＭＣ３８／ｍＣＤ２０又はＨＥＫ２９３／ｍＣＤ２０細胞上での、示されたＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）による、ｍＰＤＬ１結合（上部パネル）又は抗ｍＣＤ２０結合（下部パネル）を表す。

【図5A】ルシフェラーゼアッセイプロトコルを示す。図５Ａは、ルシフェラーゼレポーターアッセイの概略説明であり、図５Ｂは、図５Ａに記載の主要なプレイヤー間の相互作用を示す漫画表現である。

【図5B】ルシフェラーゼアッセイプロトコルを示す。図５Ａは、ルシフェラーゼレポーターアッセイの概略説明であり、図５Ｂは、図５Ａに記載の主要なプレイヤー間の相互作用を示す漫画表現である。

【図6】試験分子（図６Ａ）及びそれを使用した一連のトレースを示す（図６Ｂ～６Ｅ）。トレースは、図５に示されるバイオアッセイを利用して測定されるｍＰＤ１アゴニズムを示す。各個々のトレースに示されるように使用された、細胞及び分子。

【図7】糖尿病前の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおける用量漸増効力試験の実験計画を示す。

【図8A】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8B】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8C】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8D】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8E】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8F】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8G】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8H】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図8I】示された対照又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）の存在下での自然発生的な糖尿病の発症を実証する個々の動物データを示す一連のトレースを提示する。

【図9A】ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を調節するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）（上：図２Ａの分子Ｌ、下：図２Ｂの分子Ｇ）の能力を実証するグラフを示す。

【図9B】ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を調節するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）（上：図２Ａの分子Ｌ、下：図２Ｂの分子Ｇ）の能力を実証するグラフを示す。

【図10A】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）による処理後の、ＮＯＤマウス膵臓への活性化された自己反応性膵島特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５。

【図10B】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）による処理後の、ＮＯＤマウス膵臓への活性化された自己反応性膵島特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５。

【図10C】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）による処理後の、ＮＯＤマウス膵臓への活性化された自己反応性膵島特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５。

【図11A】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）処理による処理後のＥＡＥ－ＭＳマウスの脊髄への活性化された自己反応性ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図11B】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）処理による処理後のＥＡＥ－ＭＳマウスの脊髄への活性化された自己反応性ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図11C】ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン）処理による処理後のＥＡＥ－ＭＳマウスの脊髄への活性化された自己反応性ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低減を示すボックスプロットである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0014】

６．詳細な説明
６．１．定義
約、およそ：「約」、「およそ」などの用語は、明細書全体を通して数値の前に使用され、（例えば、端数、測定精度及び／又は精度の変動、タイミングなどを考慮するために）数値が必ずしも正確ではないことを示す。Ｘがある数値である、「約Ｘ」又は「およそＸ」の開示は、「Ｘ」の開示でもあることを理解されたい。したがって、例えば、ある配列が別の配列に対して「約Ｘ％の配列同一性」を有する実施形態の開示は、その配列が他の配列に対して「Ｘ％の配列同一性」を有する実施形態の開示でもある。

【0015】

及び（Ａｎｄ）及び又は（Ｏｒ）：別段に示されない限り、接続詞「又は」は、選択肢における特徴の選択（Ａの選択はＢから相互に排他的である、Ａ又はＢ）と、結合した特徴の選択（Ａ及びＢの両方が選択される、Ａ又はＢ）の両方を包含する、ブール論理演算子としてのその正しい意味で使用されることが意図される。本文のいくつかの箇所では、「及び／又は」という用語は同じ目的で使用され、「又は」が相互に排他的な選択肢を参照して使用されることを意味すると解釈されるべきではない。

【0016】

抗原結合ドメイン又はＡＢＤ、及び抗原結合断片：本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」又は「ＡＢＤ」、及び「抗原結合断片」という用語は、標的分子に特異的、非共有結合的、及び可逆的に結合することができる標的化部分の部分を指す。

【0017】

会合した：ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又はその構成要素（例えば、ＣＤ２０標的化部分、ＰＤ１アゴニスト部分、二量体化部分）に関連する「会合した」という用語は、２つ以上のポリペプチド鎖又はポリペプチド鎖の一部の間の機能的関係を指す。特に、「会合した」という用語は、２つ以上のポリペプチドが、機能的なＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を生成するように、例えば、分子相互作用を通して非共有結合的に、又は１つ以上のジスルフィド架橋若しくは化学的架橋を通して共有結合的に、互いに会合していることを意味する。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に存在し得る会合の例としては、Ｆｃ領域内のホモ二量体又はヘテロ二量体Ｆｃドメイン間の会合、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ内のＶＨ領域とＶＬ領域との会合、Ｆａｂ内のＣＨ１とＣＬとの会合、及びドメイン置換Ｆａｂ内のＣＨ３とＣＨ３との会合が挙げられるが、これらに限定されない。

【0018】

二価：ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に関するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に関して本明細書で使用される「二価」という用語は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、それぞれ、２つのＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０抗体の２つの抗原結合断片）及び／又は２つのＰＤ１アゴニスト部分（例えば、２つのＰＤＬ１アゴニスト部分、２つのＰＤＬ２アゴニスト部分、若しくはそれらの組み合わせ）を有することを意味する。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、あるタイプの部分（例えば、ＣＤ２０標的化部分）については二価であり、別のタイプの部分（例えば、ＰＤ１アゴニスト部分）については一価であってもよい。

【0019】

ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子：「ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子」という用語は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分を含む分子を指す。概して、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分を一緒に含む１つ以上のポリペプチド鎖（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つのポリペプチド鎖）から構成される分子である。

【0020】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子との関連で、「ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子」という用語は、分子のコア構成要素、すなわち、ＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分を指すこともあり、Ｆｃドメイン及び任意の／又は関連するリンカー部分などの二量体化部分も指すこともある。「ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子」という用語は、文脈で別段指示されない限り、追加の特徴、例えば、１つ以上の安定化部分、１つ以上の二量体化部分、１つ以上のリンカー部分、及び前述のものの任意の組み合わせを含む分子にも及ぶことが理解されるべきである。

【0021】

ＣＤ２０標的化部分：「ＣＤ２０標的化部分」という用語は、ＣＤ２０に結合することができる任意の分子又はその結合部分（例えば、免疫グロブリン又はその抗原結合断片）を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片を含む。抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖの形態にあり得る。「ＣＤ２０標的化部分」という用語は、トポロジカルドメイン又は膜貫通ドメインを含む、ＣＤ２０の任意のドメイン又は領域に結合することができる分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、細胞の表面（例えば、Ｂ細胞）上の細胞外に表示されたＣＤ２０の領域に結合することができる分子である。ＣＤ２０標的化部分は、セクション６．２に更に記載される。

【0022】

相補性決定領域又はＣＤＲ：「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）があり、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡＢＭ定義、及びＩＭＧＴ定義が含まれる。例えば、Ｋａｂａｔ，１９９１，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２（ＡＢＭ番号付けスキーム）、及びＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７（ＩＭＧＴ番号付けスキーム）。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を特定するために利用可能である。

【0023】

二量体化部分：「二量体化部分」という用語は、２つのポリペプチド鎖間の会合を促進して二量体を形成することができるポリペプチド鎖又はアミノ酸配列を指す。第１の二量体化部分は、同一の第２の二量体化部分と会合することができ、又は第１の二量体化部分とは異なる第２の二量体化部分と会合することができる。いくつかの実施形態では、二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、２つのＦｃドメインの会合がＦｃ領域を形成する。したがって、Ｆｃ領域は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。

【0024】

ＥＣ５０：「ＥＣ５０」という用語は、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子などの分子の半数効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を指す。ＥＣ５０は基本的に、その最大効果の５０％が観察される抗体又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の濃度を表す。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０値は、セクション７．１．３．３に記載のアッセイにおいて最大半量の活性化を与えるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の濃度に等しい。

【0025】

エピトープ：エピトープ、又は抗原決定基は、本明細書に記載の抗体又は他の抗原結合部分によって認識される抗原（例えば、ＣＤ２０）の一部である。エピトープは、線状又は立体構造的であり得る。

【0026】

Ｆａｂ：本開示のＣＤ２０標的化部分との関連における「Ｆａｂ」という用語は、一対のポリペプチド鎖を指し、第１のポリペプチド鎖は、抗体Ｎ末端の可変重鎖（ＶＨ）ドメインから第１の定常ドメイン（本明細書ではＣ１と称される）までを含み、第２のポリペプチド鎖は、抗体Ｎ末端の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから、第１の定常ドメインと対合することができる第２の定常ドメイン（本明細書ではＣ２と称される）までを含む。天然抗体では、ＶＨは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）のＮ末端にあり、ＶＬは、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）のＮ末端にある。本開示のＦａｂは、天然配向に従って配置することができるか、又は正しいＶＨ及びＶＬの対合を促進するドメイン置換若しくはスワップを含むことができる。例えば、ヘテロ二量体分子における正しい改変Ｆａｂ－鎖対合を促進するために、ＦａｂにおけるＣＨ１及びＣＬドメイン対をＣＨ３ドメイン対に置き換えることが可能である。ＣＨ１をＶＬに付着させ、ＣＬをＶＨに付着させるように、ＣＨ１及びＣＬを逆にすることも可能であり、一般に、「ドメイン交換」の一種であるＣｒｏｓｓｍａｂとして知られる構成である。

【0027】

Ｆｃドメイン及びＦｃ領域：「Ｆｃドメイン」という用語は、別の重鎖の対応する部分と対合する重鎖の部分を指す。「Ｆｃ領域」という用語は、２つの重鎖Ｆｃドメインの会合によって形成された抗体ベースの結合分子の領域を指す。Ｆｃ領域内の２つのＦｃドメインは、互いに同一又は異なってもよい。天然抗体では、Ｆｃドメインは典型的には同一であるが、一方又は両方のＦｃドメインは、有利には、ヘテロ二量体化を可能にするように、例えば、ノブ・イン・ホール相互作用を介して、かつ／又は精製を可能にするように、例えば、スター変異（ｓｔａｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を介して改変され得る。

【0028】

宿主細胞又は組換え宿主細胞：「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、異種核酸の導入によって遺伝子操作された細胞を指す。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫も指すよう意図されていることを理解されたい。変異又は環境の影響のいずれかにより特定の改変が後続世代で生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は異種核酸を、例えば、染色体外異種発現ベクター上に一時的に、又は、例えば、異種核酸を宿主細胞ゲノムに組み込むことによって安定的に、保有することができる。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を発現する目的で、宿主細胞は、哺乳類起源の又は哺乳類様特性の細胞株、例えば、サル腎臓細胞（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７）、ＨＥＫ２９３、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ、例えば、ＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６、ＢＳＣ－１、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、骨髄腫及びリンパ腫細胞、又はそれらの誘導体及び／又は操作されたバリアントであり得る。操作されたバリアントには、例えば、グリカンプロファイル改変及び／又は部位特異的組み込み部位誘導体が含まれる。

【0029】

モノマー及びＣＤ２０－ＰＤ１モノマー：本明細書で使用される「モノマー」及び「ＣＤ２０－ＰＤ１モノマー」という用語は、（ａ）少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分を含み、第２のポリペプチド鎖と会合することができるか、（ｂ）少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分を含み、第２のポリペプチド鎖と会合することができるか、（ｃ）二量体化部分（例えば、Ｆｃドメイン）を含み、第２のポリペプチド鎖上の対応する二量体化部分（例えば、別のＦｃドメイン）と会合することができるか、又は（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の任意の組み合わせを含む、第１のポリペプチド鎖を含む分子を指す。モノマーは、二量体化部分（例えば、Ｆｃドメイン）の対を介して他のモノマーと会合することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のモノマー間の会合が、ヒンジ配列又はＦｃドメインの他の部分を通して安定化される。したがって、本開示のモノマーは、別のモノマーと会合して、二量体を形成することができる。二量体は、各構成モノマーが同一であるホモ二量体、又は各構成モノマーが異なるヘテロ二量体であり得る。本明細書で使用される場合、「モノマー」への言及は便宜上のものであり、１つ以上の追加のポリペプチド鎖、例えば、１つ以上のＦａｂドメインの１つ以上の軽鎖の存在を排除するものではない。したがって、２つのモノマーの「二量体」は、２つを超えるポリペプチド鎖を含み得、例えば、３つ、４つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を含み得、モノマー又は二量体への言及は、ポリペプチド鎖間の会合の時間的順序を意味することを意図しない。

【0030】

一価：ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に関するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に関して本明細書で使用される「一価」という用語は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、それぞれ、１つのＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０抗体の１つの抗原結合ドメイン）及び／又は１つのＰＤ１アゴニスト部分（例えば、１つのＰＤＬ１アゴニスト部分又は１つのＰＤＬ２アゴニスト部分）を有することを意味する。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、あるタイプの部分（例えば、ＰＤ１アゴニスト部分）に対して一価であってもよく、別のタイプの部分（例えば、ＣＤ２０標的化部分）に対して二価であってもよい。

【0031】

多価：ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に関するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に関して本明細書で使用される「多価」という用語は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、それぞれ、２つ以上のＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０抗体の２つの抗原結合断片）及び／又は２つ以上のＰＤ１アゴニスト部分（例えば、２つのＰＤＬ１アゴニスト部分、２つのＰＤＬ２アゴニスト部分、若しくはそれらの組み合わせ）を有することを意味する。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、あるタイプの部分（例えば、ＣＤ２０標的化部分）に対して多価であってもよく、別のタイプの部分（例えば、ＰＤ１アゴニスト部分）に対して一価であってもよい。

【0032】

作動可能に連結：本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、ポリペプチド鎖の２つ以上の領域間の機能的関係を指し、機能的ポリペプチド又は２つ以上の核酸配列を産生するように、例えば、２つのポリペプチド構成要素のフレーム内融合を産生するように若しくは調節配列をコード配列に連結するように、その２つ以上の領域が連結されている。

【0033】

ＰＤ１アゴニスト部分：「ＰＤ１アゴニスト部分」という用語は、ＰＤ１に結合し、ＰＤ１を刺激することができる任意の分子又はその部分を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）の細胞外ドメイン又はそのＰＤ１結合部分、好ましくは哺乳類ＰＤＬ１（例えば、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、プログラム死リガンド（ＰＤＬ２）の細胞外ドメイン、又はそのＰＤ１結合部分、好ましくは哺乳類ＰＤＬ２（例えば、ヒト若しくはマウスＰＤＬ２）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＰＤＬ１及びＰＤＬ２の細胞外ドメインは、それぞれ、「ＰＤＬ１エクトドメイン」及び「ＰＤＬ２エクトドメイン」として知られることがある。用語「ＰＤＬ１エクトドメイン」及び「ＰＤＬ２エクトドメイン」は、ＰＤＬ１及びＰＤＬ２エクトドメインだけでなく、追加的にＰＤ１結合活性を有する断片及びバリアント配列も指すために本明細書において便宜的に使用される。したがって、本明細書における用語「ＰＤＬ１エクトドメイン」及び「ＰＤＬ２エクトドメイン」への言及は、ＰＤＬ１及びＰＤＬ２エクトドメインのＰＤ１結合部分、並びにＰＤ１結合機能を有するそれらのバリアント、例えば、ＰＤ１又はＰＤ２に対して少なくとも７０％以上の配列同一性及びＰＤＬ１結合の保持を有するアミノ酸配列を包含することを意図している。

【0034】

ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、対応する野生型配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するＰＤ１アゴニスト部分を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、Ｃ１１３Ｓ置換を含むマウスＰＤＬ１エクトドメインである。

【0035】

ＰＤ１アゴニスト部分は、６．２．１節に更に記載されている。
一本鎖Ｆｖ又はｓｃＦｖ：本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むポリペプチド鎖を指し、これらのドメインは、一本鎖ポリペプチドに存在する。

【0036】

対象：「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類（非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類など）が含まれる。記載されている場合を除き、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0037】

治療する、治療、治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、分子又は組成物（例えば、本開示の１つ以上のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子）の投与から生じる、本明細書に記載される障害の進行、重症度及び／又は罹病期間の低減又は改善、本明細書に記載される状態又は障害の１つ以上の症状（好ましくは、１つ以上の識別可能な症状）の改善、又は本明細書に記載される状態又は障害、例えば自己免疫又は炎症性の状態又は障害の予防を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、患者によって必ずしも認識できるわけではない、障害（例えば自己免疫障害）の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。他の実施形態では、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化によって）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化によって）、又はその両方によって、障害の進行又は発症を阻害することを指す。

【0038】

ユニバーサル軽鎖：標的化部分との関連で本明細書で使用される「ユニバーサル軽鎖」という用語は、標的化部分の重鎖領域と対合することができ、他の重鎖領域と対合することもできる軽鎖ポリペプチドを指す。ユニバーサル軽鎖は、「共通の軽鎖」としても知られている。

【0039】

ＶＨ：「ＶＨ」という用語は、ｓｃＦｖ又はＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。
ＶＬ：「ＶＬ」という用語は、ｓｃＦｖ又はＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。

【0040】

６．２．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子
本開示は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、二量体化部分を更に含む。

【0041】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、典型的には、１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び／又は１つ以上のＰＤ１アゴニスト部分を含むＣＤ２０－ＰＤ１モノマーを含むか、又はそれからなる。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、タンパク質を含み、タンパク質は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分と、少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分と、少なくとも１つの二量体化部分と、任意選択で、タンパク質中の１つ以上の部分を分離する１つ以上のリンカー部分とを含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＣＤ２０標的化部分と、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーの二量体化部分との間に位置する。そのような実施形態では、ＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分の両方が二量体化部分のＮ末端にある場合、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーは、したがって、ＣＤ２０標的化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－二量体化部分のＮ末端からＣ末端への配向を有する。そのような実施形態では、ＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分の両方が二量体化部分のＣ末端にある場合、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーは、したがって、二量体化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－ＣＤ２０標的化部分のＮ末端からＣ末端への配向を有する。

【0043】

いくつかの実施形態では、例えば、ＣＤ２０標的化部分が抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分がＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分がＦｃドメインである実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、任意選択で、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。ｉ）Ｆａｂの軽鎖が、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分に融合されていないか、ｉｉ）ＰＤ１アゴニスト部分が、抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にないか、ｉｉｉ）ＰＤ１アゴニスト部分が、ＦｃドメインのＣ末端にないか、ｉｖ）タンパク質が、ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に対して一価であるか、ｖ）タンパク質が、非対称であるか、ｖｉ）タンパク質が、Ｆｃヘテロ二量体を含むか、又は前述の（ｉ）～（ｖｉ）の２つ以上の任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴を有するｉ）（すなわち、Ｆａｂの軽鎖は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分に融合されていない）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｉｉ）を有する（すなわち、ＰＤ１アゴニスト部分は、抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にない）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｉｉｉ）を有する（すなわち、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＦｃドメインのＣ末端にない）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｉｖ）を有する（すなわち、タンパク質は、ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に対して一価である）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｖ）を有する（すなわち、タンパク質は非対称である）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｖｉ）を有する（すなわち、タンパク質は、Ｆｃヘテロ二量体を含む）。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、前述の特徴の２つ、３つ、４つ、５つ、又は全ての任意の組み合わせを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特徴ｉｉ）（すなわち、ＰＤ１アゴニスト部分は、抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にない）及び特徴ｉｉｉ）（すなわち、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＦｃドメインのＣ末端にない）を有する。

【0044】

例示的な二量体化部分は、セクション６．５に記載され、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子にホモ二量体化又はヘテロ二量体化能力を付与するＦｃドメインを含む。
ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、１つ以上のポリペプチドで構成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び／又は少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分を含む複数の（例えば、２つの）モノマーから構成され、いくつかの実施形態では、二量体化部分も含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、任意選択で、１つ以上の追加のポリペプチド鎖（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ部分の軽鎖を含むポリペプチド鎖）と会合した２つのモノマーから構成される。モノマーは、同一であってもよく、それによってホモ二量体を形成するか、又は異なるものであってもよく、それによってヘテロ二量体を形成する。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の各モノマーの二量体化部分は、一緒に二量体化するように構成され得る。例示的な二量体化部分は、セクション６．５に記載される。

【0045】

１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び１つ以上のＰＤ１アゴニスト部分は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の同じアームに含めることができ（例えば、ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂを含み、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分を含む場合、抗ＣＤ２０Ｆａｂの可変重鎖若しくは可変軽鎖及びＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、同じポリペプチド鎖上にある）、又は二重特異性ＣＤ２０－ＰＤ１アゴニストの異なるアームに含めることができる（例えば、ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂを含み、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分を含む場合、抗ＣＤ２０Ｆａｂの可変重鎖若しくは可変軽鎖及びＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、異なるポリペプチド鎖上にある）。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の例示的な構成は、とりわけ、図１Ａ～１Ｌ、及び番号付きの実施形態３１～１０６に開示されている。

【0046】

ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ＣＤ２０標的化部分に関して一価であり得る（すなわち、単一のＣＤ２０標的化部分を有する）か、又はＣＤ２０標的化部分については多価であり得る（すなわち、複数のＣＤ２０標的化部分を有する）。同様に、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ＰＤ１アゴニスト部分に関して一価であり得る（すなわち、単一のＰＤ１アゴニスト部分を有する）か、又はＰＤ１アゴニスト部分に関して多価であり得る（すなわち、複数のＰＤ１アゴニスト部分を有する）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ＣＤ２０標的化部分に関して二価である（すなわち、２つのＣＤ２０標的化部分を有する）。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に関して多価である場合、複数のＣＤ２０標的化部分は、互いに同じか若しくは異なることができ、かつ／又は複数のＰＤ１アゴニスト部分は、互いに同じか若しくは異なることができる。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、その１つ以上のポリペプチド鎖の様々な構成要素、例えば、（１）同じポリペプチド鎖上に存在する場合のＣＤ２０標的化部分若しくはその一部（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂの重鎖若しくは軽鎖）及びＰＤ１アゴニスト部分若しくはその一部（例えば、ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２）、（２）ＣＤ２０標的化部分及び二量体化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）、（３）ＰＤ１アゴニスト部分及び二量体化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）、又は（４）前述の任意の組み合わせ、を接続する１つ以上のリンカー配列を含むことができる。例示的なリンカーは、セクション６．７に記載されている。

【0048】

ほとんどのＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、互いに会合するように構成された二量体化部分（例えば、Ｆｃドメイン）の会合によって多量体である。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のポリペプチド鎖を含み得、そのいくつかは、二量体化部分を介して会合し、その他は、ＶＨ－ＶＬ相互作用を介して会合する。便宜上及び説明のみを目的として、本開示は、一般に、それぞれ「モノマー」として、ＣＤ２０標的化部分、ＰＤ１アゴニスト部分及び／又は対応する二量体化部分（例えば、第２のＦｃドメイン）を含む別のポリペプチド鎖と会合することができるＣＤ２０標的化部分、ＰＤ１アゴニスト部分及び／又は二量体化部分（例えば、第１のＦｃドメイン）を含むポリペプチドを指す。モノマーは、１つ、２つ、３つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る。例えば、一実施形態では、モノマーは、（ａ）抗ＣＤ２０ＶＨ、ＰＤ１アゴニスト部分、及びＦｃドメインを含有する第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）抗ＣＤ２０ＶＨと対合することができるＶＬを含有する第２のポリペプチド鎖と、から構成されてもよい。別の実施形態では、モノマーは、（ａ）第１の抗ＣＤ２０ＶＨ、第２の抗ＣＤ２０ＶＨ、及びＦｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）第１の抗ＣＤ２０ＶＨと対合することができる第１のＶＬを含む第２のポリペプチド鎖と、（ｃ）第２の抗ＣＤ２０ＶＨと対合することができる第２のＶＬを含む第３のポリペプチド鎖と、から構成されてもよい。

【0049】

以下は、Ｎ末端からＣ末端配向で記載された、本開示のモノマーのいくつかの例示的な例である。各モノマーの個々の要素を、例えば、以下のサブセクション及び番号付けされた実施形態において、本明細書に詳細に記載する。

【0050】

（１）例示的なモノマー１：ＣＤ２０標的化部分－任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、の図１Ａ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、及び図１Ｈ、左側モノマーを参照されたい）。

【0051】

（２）例示的なモノマー２：ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、図１Ａ、右側モノマーを参照されたい）。
（３）例示的なモノマー３：任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄ、左側モノマーを参照されたい）。

【0052】

（４）例示的なモノマー４：ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－ＣＤ２０標的化部分－任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、図１Ｂ及び図１Ｅの右側モノマー、図１Ｉの両方のモノマーを参照されたい）。

【0053】

（５）例示的なモノマー５：ＣＤ２０標的化部分－任意選択的リンカー－二量体化部分－ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、図１Ｃ及び図１Ｆ、右側モノマー、図１Ｊ、両方のモノマーを参照されたい）。

【0054】

（６）例示的なモノマー６：ＣＤ２０標的化部分－任意選択的リンカー－ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、図１Ｄ及び図１Ｇ、右側モノマー、図１Ｌ、両方のモノマーを参照されたい）。

【0055】

（７）例示的なモノマー７：ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－二量体化部分（例えば、図１Ｈ、右側モノマーを参照されたい）。

【0056】

（８）例示的なモノマー８：ＣＤ２０標的化部分－任意選択的リンカー－二量体化部分－任意選択的リンカー－ＣＤ２０標的化部分（例えば、図１Ｋ、左側モノマーを参照されたい）。

【0057】

（９）例示的なモノマー９：ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－二量体化部分－任意選択的リンカー－ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、図１Ｋ、右側モノマーを参照されたい）。

【0058】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー１及び例示的なモノマー２を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ａを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー３及び例示的なモノマー４を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｂを参照されたい）。

【0059】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー３及び例示的なモノマー５を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｃを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー３及び例示的なモノマー６を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｄを参照されたい）。

【0060】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー１及び例示的なモノマー４を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｅを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー１及び例示的なモノマー５を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｆを参照されたい）。

【0061】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー１及び例示的なモノマー６を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｇを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー１及び例示的なモノマー７を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｈを参照されたい）。

【0062】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー４による２つのモノマーを含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｉを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー５による２つのモノマーを含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｊを参照されたい）。

【0063】

いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー８及び例示的なモノマー９を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｋを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例示的なモノマー６による２つのモノマーを含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する（例えば、図１Ｌを参照されたい）。

【0064】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子では、ＣＤ２０標的化部分が抗体の抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）である場合、各モノマーは、２つ以上のポリペプチド鎖から構成され得、重鎖可変領域を有する１つのポリペプチド鎖、及び軽鎖可変領域を有する他のポリペプチド鎖（複数可）から構成され得る。ＣＤ２０標的化部分は、別個のポリペプチド鎖上に重鎖及び軽鎖可変ドメインを含むことができる。例えば、モノマーは、ポリペプチドＡ及びポリペプチドＢで構成することができる。ポリペプチドＡは、例えば、Ｎ末端からＣ末端へ、ＣＤ２０標的化部分の重鎖可変ドメイン－任意選択的リンカー－ＰＤ１アゴニスト部分－任意選択的リンカー－二量体化部分を含み得、ポリペプチドＢは、ＣＤ２０標的化部分の軽鎖可変ドメインを含み得る。モノマーがＣＤ２０標的化部分に対して二価である場合、モノマーは、ＣＤ２０標的化部分の別の軽鎖可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖（ポリペプチドＣ）を含むことができる。

【0065】

あるいは、ＣＤ２０標的化部分は、ＣＤ２０標的化部分の重鎖及び軽鎖可変領域は、単一のポリペプチドにおいて互いに融合されている、ｓｃＦｖの形態にあり得る。
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の構成要素の更なる詳細を以下に示す。

【0066】

６．２．１．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の生化学的特性
インビボでは、抗体の大きな複合体は、食作用によって迅速に除去され、抗体の有効性の低下をもたらす可能性がある。大きな複合体はまた、治療用抗体の免疫原性を増加させる可能性もある。例えば、ＷＯ２０２００４７０６７Ａ１を参照されたい。製造中、凝集は、抗体の品質、安全性、及び有効性を損なう一般的な問題である。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、例えば、ＣＤ２０標的化部分が由来した親抗体と比較して、かつ／又はＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分を含む他の抗体フォーマットと比較して、インビボ又はエクスビボでの凝集しにくい可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、哺乳類細胞株における組換え産生中の凝集が、親抗体より少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％少ない。セクション７．１．４に記載されるように、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のオリゴマー化状態は、例えば、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーによって決定され得る。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の大部分は、追加のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）なしで８５％を超えるモノマー種を示した（セクション７．２．２を参照されたい）。次いで、カラム精製を用いて、モノマー種を更に精製することができる。例えば、２＋２ｍ２０＿ｍＰＬ＿４（図２Ａの分子Ｌ）のモノマーパーセンテージは、ＳＥＣステップを含む２回のカラム精製後に９９％に増加した（セクション７．２．２を参照されたい）。

【0067】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子はまた、良好な熱安定性を示す。高い熱安定性及び低い凝集傾向は、抗体の製造及び保存を容易にし、長い血清半減期を促進する。Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｃｈａｎｔ，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８（４）：４４９－４５４。熱安定性は、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を含む、当該技術分野で知られている方法によって測定され得る（例えば、セクション７．１．５を参照されたい）。試験した全ての試験ＣＤ２０－ＰＤ１分子は、ＤＳＦによって測定されるのと同様の熱安定性を有し、融解温度１（Ｔｍ１）（これは、タンパク質の最初のアンフォールディング中点を表す）は、約６０℃であった（セクション７．２．２を参照されたい）。

【0068】

６．３．ＣＤ２０標的化部分
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子中のＣＤ２０標的化部分の組み込みは、いくつかの実施形態では、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、及びクローン病を含むがこれらに限定されない自己免疫障害の治療、並びに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療のための高濃度の局所的ＰＤ１アゴニスト部分の送達を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分の局所的な送達を促進することに加えて、抗ＣＤ２０部分は、そのような自己免疫疾患に対する追加の治療経路を提供する。

【0069】

本開示のある特定の実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の各ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、単一のＣＤ２０標的化部分（例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子がＣＤ２０標的化部分に対して一価である実施形態では、第１のモノマー上又は第２のモノマー上のＣＤ２０標的化部分）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、２つのＣＤ２０標的化部分（例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子がＣＤ２０標的化部分に対して二価である実施形態では、第１のモノマー上に第１のＣＤ２０標的化部分及び第２のモノマー上に第２のＣＤ２０標的化部分、又は第１及び第２のＣＤ２０標的化部分の両方が第１のモノマー若しくは第２のモノマーのいずれかの上にあることができる）を含む。このような実施形態では、２つのＣＤ２０標的化部分は、同一であってもよく、異なるものであってもよい。異なる場合、２つのＣＤ２０標的化部分は、直交性であってもよく、ＣＤ２０の別個のエピトープに結合してもよく、かつ／又は非競合であってもよい。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、公知の抗ＣＤ２０抗体の抗原結合ドメインを含む。既知の抗ＣＤ２０抗体の例には、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｉｔｕｘｅｔａｎ）、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブ（それぞれ「参照ＣＤ２０抗体」）が含まれるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＣＤＲ配列を有するＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体の６つのＣＤＲ配列全てを含む。他の実施形態では、標的化部分は、少なくとも参照ＣＤ２０抗体の重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）と、ユニバーサル軽鎖の軽鎖ＣＤＲ配列とを含む。更なる態様では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＶＨのアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＶＬのアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。他の実施形態では、標的化部分は、ユニバーサル軽鎖ＶＬ配列を更に含む。

【0071】

他の実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブと同じＣＤ２０エピトープに結合する、かつ／又はＣＤ２０との結合に関してこれらと競合する抗原結合ドメインを含む。抗体競合を測定するためのアッセイは、当技術分野で知られている。例えば、ＣＤ２０の試料は、固体支持体に結合させることができる。次に、第１の抗体及び第２の抗体を添加する。２つの抗体のうちの１つは、標識される。標識抗体及び非標識抗体がＣＤ２０上の離れた別個の部位に結合する場合、非標識抗体が存在するかどうかにかかわらず、標識抗体は同じレベルで結合するであろう。しかしながら、相互作用部位が同一又は重複している場合、非標識抗体が競合し、抗原に結合する標識抗体の量が低下するであろう。非標識抗体が過剰に存在する場合、標識された抗体は結合したとしてもごく僅かしか結合しないことになる。いくつかの実施形態では、競合抗体は、ＣＤ２０に対する別の抗体の結合を約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％減少させる抗体である。そのような競合アッセイを実施するための手順の詳細は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４に見出すことができる。そのようなアッセイは、精製された抗体を使用することによって定量的に行うことができる。１つの抗体をそれ自体に対して滴定することによって、すなわち、同じ抗体を標識及び競合物の両方に使用することによって、標準曲線を確立することができる。非標識競合抗体の、標識抗体のプレートへの結合を阻害する能力を滴定する。結果をプロットし、所望の程度の結合阻害を達成するために必要な濃度を比較することができる。いくつかの実施形態では、標的分子への結合に関する競合は、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）でのリアルタイム、ラベルフリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定することができる。

【0072】

好適なＣＤ２０標的化部分のフォーマットは、セクション６．３．１に記載されている。ＣＤ２０標的化部分は、好ましくは、抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０結合断片、例えば、セクション６．３．１．１に記載されるようなＦａｂ、Ｆｖ断片、又はセクション６．３．１．２に記載されるようなｓｃＦｖである。

【0073】

ＣＤ２０標的化部分は、本明細書に記載される構成のいずれかを有するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に組み込むことができる。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、典型的には、例えば、セクション６．２に記載される例示的なモノマーによって表されるように、複数のポリペプチド鎖から構成される。セクション６．２に記載されるように、ＣＤ２０標的化部分は、例示的なモノマー１、４、５、６、及び８のうちのいずれか１つに組み込むことができる。例示的なモノマー１、４、５、６、及び８のうちの１つ以上を組み込む例示的なＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、セクション６．２に詳述されている。

【0074】

６．３．１．ＣＤ２０標的化部分のフォーマット
ある特定の態様では、ＣＤ２０標的化部分は、ＣＤ２０への特異的結合を保持する任意の種類の抗体又はその断片であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子、より具体的には、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の免疫グロブリン分子である。抗体断片としては、ＶＨ（又はＶ_Ｈ）断片、ＶＬ（又はＶ_Ｌ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディが挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

６．３．１．１．Ｆａｂ
Ｆａｂドメインは、伝統的に、パパイン等の酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生された。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子では、Ｆａｂドメインは、典型的には、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の一部として組換えで発現される。

【0076】

Ｆａｂドメインは、任意の好適な種由来の定常ドメイン配列及び可変領域配列を含むことができ、したがって、マウス、キメラ、ヒト、又はヒト化されたものであってよい。いくつかの実施形態では、可変領域配列及び／又は定常ドメイン領域配列は、既知の抗ＣＤ２０抗体に由来する。既知の抗ＣＤ２０抗体の例には、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブが含まれるが、これらに限定されない。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブ（それぞれ「参照ＣＤ２０抗体」）のＦａｂと同じＣＤ２０エピトープに結合する、かつ／又はＣＤ２０との結合に関してこれらのＦａｂと競合するＦａｂを含む。更なる実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＣＤＲ配列を有するＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体の６つのＣＤＲ配列全てを含む。他の実施形態では、標的化部分は、少なくとも参照ＣＤ２０抗体の重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）と、ユニバーサル軽鎖の軽鎖ＣＤＲ配列とを含む。更なる態様では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＶＨのアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、参照ＣＤ２０抗体のＶＬのアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。他の実施形態では、標的化部分は、ユニバーサル軽鎖ＶＬ配列を更に含む。

【0078】

Ｆａｂドメインは、典型的には、ＶＨドメインに付着したＣＨ１ドメインを含み、これは、ＶＬドメインに付着したＣＬドメインと対合する。野生型免疫グロブリンにおいて、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対合してＦｖ領域を構成し、ＣＨ１ドメインは、ＣＬドメインと対合して結合モジュールを更に安定化する。２つの定常ドメイン間のジスルフィド結合は、Ｆａｂドメインを更に安定化することができる。

【0079】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子について、特に軽鎖が共通又はユニバーサル軽鎖ではない場合、同じＡＢＤに属するＦａｂドメインの正確な会合を可能にし、異なるＡＢＤに属するＦａｂドメインの異常な対合を最小限にするために、Ｆａｂヘテロ二量体化戦略を使用することが有利である。例えば、以下の表１に示されるＦａｂヘテロ二量体化戦略を使用することができる：

【0080】

【表1】

【0081】

したがって、ある特定の実施形態では、Ｆａｂの２つのポリペプチド間の正しい会合は、例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１に記載されるように、ＦａｂのＶＬドメイン及びＶＨドメインを互いに交換するか、又はＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを互いに交換することによって促進される。

【0082】

正しいＦａｂ対合はまた、ＦａｂのＣＨ１ドメインに１つ以上のアミノ酸改変及びＣＬドメインに１つ以上のアミノ酸改変を導入することによって、並びに／又はＶＨドメインに１つ以上のアミノ酸改変及びＶＬドメインに１つ以上のアミノ酸改変を導入することによって促進することができる。改変されるアミノ酸は、典型的には、ＶＨ：ＶＬ及びＣＨ１：ＣＬ界面の一部であり、Ｆａｂ構成要素が、他のＦａｂの成分よりもむしろ互いと優先的に対合するようになっている。

【0083】

一実施形態では、１つ以上のアミノ酸改変は、残基のＫａｂａｔ番号付けによって示されるように、可変（ＶＨ、ＶＬ）及び定常（ＣＨ１、ＣＬ）ドメインの保存されたフレームワーク残基に限定される。Ａｌｍａｇｒｏ，２００８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１６１９－１６３３は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴの番号付けスキームに基づくフレームワーク残基の定義を提供する。

【0084】

一実施形態では、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン並びに／又はＶＬドメイン及びＣＬドメインにおいて導入される改変は、互いに相補的である。重鎖及び軽鎖界面における相補性は、立体接触及び疎水性接触、静電／電荷相互作用、又は様々な相互作用の組み合わせに基づいて達成され得る。タンパク質表面間の相補性は、ロック及びキー適合（ｌｏｃｋ ａｎｄ ｋｅｙ ｆｉｔ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）、突起及び空洞（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｃａｖｉｔｙ）、ドナー及びアクセプターなどの観点から、文献において広く記載されており、これらは全て、２つの相互作用する表面間の構造的及び化学的一致の性質を示唆している。

【0085】

一実施形態では、１つ以上の導入された改変は、Ｆａｂ構成要素の界面にわたって新しい水素結合を導入する。一実施形態では、１つ以上の導入された改変は、Ｆａｂ構成要素の界面にわたって新しい塩橋を導入する。例示的な置換は、ＷＯ２０１４／１５０９７３及びＷＯ２０１４／０８２１７９に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、ＣＨ１ドメインに１９２Ｅ置換、及びＣＬドメインに１１４Ａ及び１３７Ｋ置換を含み、これにより、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に塩橋が導入される（例えば、Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３１９９－２１１を参照されたい）。

【0087】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、ＣＨ１ドメイン内の１４３Ｑ及び１８８Ｖ置換、並びにＣＬドメイン内の１１３Ｔ及び１７６Ｖ置換を含み、これは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の疎水性及び極性接触領域を交換するのに役立つ（例えば、Ｇｏｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３１９９－２１１を参照されたい）。

【0088】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインは、Ｆａｂドメインの正しいアセンブリを促進する直交性Ｆａｂ界面を導入するための、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬドメインの一部又は全部における改変を含むことができる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１９１－１９８）。実施形態では、３９Ｋ、６２Ｅの改変がＶＨドメインに導入され、Ｈ１７２Ａ、Ｆ１７４Ｇの改変がＣＨ１ドメインに導入され、１Ｒ、３８Ｄ、（３６Ｆ）の改変がＶＬドメインに導入され、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１７６Ｗの改変がＣＬドメインに導入される。別の実施形態では、３９Ｙ改変がＶＨドメインに導入され、３８Ｒ改変がＶＬドメインに導入される。

【0089】

Ｆａｂドメインはまた、天然のＣＨ１：ＣＬジスルフィド結合を、操作されたジスルフィド結合で置き換えるように改変することができ、それによって、Ｆａｂ構成要素の対合の効率を増加させる。例えば、操作されたジスルフィド結合は、ＣＨ１ドメインに１２６Ｃを導入し、ＣＬドメインに１２１Ｃを導入することによって導入することができる（例えば、Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：３７７－８９を参照されたい）。

【0090】

Ｆａｂドメインは、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインを、正しいアセンブリを促進する代替ドメインで置き換えることによっても改変され得る。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＭＡｂｓ ７：３６４－７６では、ＣＨ１ドメインをＴ細胞受容体の定常ドメインで置換し、ＣＬドメインをＴ細胞受容体のｂドメインで置換し、これらのドメイン置換を、ＶＬドメインに３８Ｄ改変を導入し、ＶＨドメインに３９Ｋ改変を導入することによって、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間の追加の電荷－電荷相互作用と対合することについて説明している。

【0091】

正しいＶＨ－ＶＬ対合を促進するためのＦａｂヘテロ二量体化戦略の使用の代わりに、又はそれに加えて、共通の軽鎖（ユニバーサル軽鎖とも称される）のＶＬを、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の各ＦａｂＶＬ領域に使用することができる。様々な実施形態では、本明細書に記載の共通軽鎖を用いることは、元の同族ＶＬを用いることと比較して、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の不適切な種の数を減少させる。様々な実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のＶＬドメインは、共通の軽鎖を含む単一特異性抗体から同定される。様々な実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のＶＨ領域は、限定されたヒト軽鎖レパートリー、又は単一のヒト軽鎖を発現するように事前に操作されたマウスＢ細胞内でインビボで再編成されているヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含み、ヒト重鎖と同族であり、目的の抗原への曝露に応答して、２つの可能なヒトＶＬのうちの１つ又は１つと同族である複数のヒトＶＨを含む抗体レパートリーを生成し、この抗体レパートリーは、目的の抗原に特異的である。共通の軽鎖は、再構成されたヒトＶκ１－３９Ｊκ５配列又は再構成されたヒトＶκ３－２０Ｊκ１配列に由来するものであり、体細胞変異型（例えば、親和性成熟型）を含む。例えば、米国特許第１０，４１２，９４０号を参照されたい。

【0092】

６．３．１．２．ｓｃＦｖ
一本鎖Ｆｖ又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一のポリペプチド鎖内の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、それらが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが標的結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖのＶＨ鎖及びＶＬ鎖を連結するのに好適なリンカーの例は、セクション６．７で特定されるリンカーである。

【0093】

本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ可変領域及びＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。

【0094】

ｓｃＦｖは、マウス、ヒト、又はヒト化のＶＨ配列及びＶＬ配列などの任意の好適な種由来のＶＨ配列及びＶＬ配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、既知の抗ＣＤ２０抗体からのＶＨ配列及びＶＬ配列を含むことができる。既知の抗ＣＤ２０抗体の例には、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブが含まれるが、これらに限定されない。

【0095】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０標的化部分は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルトゥズマブに由来するｓｃＦｖと同じＣＤ２０エピトープに結合する、かつ／又はＣＤ２０への結合に関して競合するｓｃＦｖを含む。

【0096】

ｓｃＦｖをコードする核酸を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片を、リンカーをコードする別の断片、例えば、セクション６．７に記載されるリンカー（典型的には、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４～Ｓｅｒ）_３（配列番号：１）などのアミノ酸グリシン及びセリンを含む配列の反復）のいずれかをコードする断片に作動可能に連結させ、ＶＨ配列及びＶＬ配列を、柔軟なリンカーによって結合されたＶＬ領域及びＶＨ領域として発現させることができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

【0097】

６．４．ＰＤ１アゴニスト部分
本開示のある特定の実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のＰＤ１アゴニスト部分は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）又はプログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）の野生型又はバリアントＰＤ１結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、単一のＰＤ１アゴニスト部分（例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子がＰＤ１アゴニスト部分に対して一価である実施形態では、第１のモノマー上又は第２のモノマー上のＰＤ１アゴニスト部分）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、２つのＰＤ１アゴニスト部分（例えば、第１のモノマー上の第１のＰＤ１アゴニスト部分及び第２のモノマー上の第２のＰＤ１アゴニスト部分、又は第１のモノマー若しくは第２のモノマーのいずれか上の第１のＰＤ１アゴニスト部分及び第２のＰＤ１アゴニスト部分の両方）を含む。このような実施形態では、２つのＰＤ１アゴニスト部分は、同一であってもよく、異なるものであってもよい。異なる場合、２つのＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤ１とは異なって（例えば、異なる親和性で）相互作用することができる。

【0098】

ＰＤ１アゴニスト部分は、本明細書に記載される構成のいずれかを有するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に組み込むことができる。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、典型的には、例えば、セクション６．２に記載される例示的なモノマーによって表されるように、複数のポリペプチド鎖から構成される。セクション６．２に記載されるように、ＰＤ１アゴニスト部分は、例示的なモノマー２、４、５、６、７、及び９のいずれか１つに組み込むことができる。例示的なモノマー２、４、５、６、７、及び９のうちの１つ以上を組み込む例示的なＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、セクション６．２に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１ベースのアゴニスト部分である。他の実施形態では、湿ったＰＤ１アゴニストは、ＰＤＬ２ベースのアゴニスト部分である。

【0099】

６．４．１．ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分
ＰＤＬ１は、自己に対する免疫寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。阻害剤受容体ＰＤ１のためのリガンドとして、ＰＤＬ１は、Ｔ細胞の活性化閾値を調節し、Ｔ細胞エフェクター応答を制限する。本開示は、少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、本明細書に記載のＰＤＬ１アミノ酸配列を含むか、又はそれと相同であるアミノ酸配列を含む、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。このようなＰＤ１アゴニスト部分は、本明細書において「ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分」又は同様の用語で呼ばれる。

【0100】

ヒトＰＤＬ１タンパク質は、２９０アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから１８アミノ酸が除去されて成熟ｈＰＤＬ１が生成され、アミノ酸１９～２３８（前駆体タンパク質に基づく番号付け）がｈＰＤＬ１細胞外ドメイン、又はエクトドメインを形成する。ヒトＰＤＬ１の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ９ＮＺＱ７（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＺＱ７）を有する。マウスＰＤＬ１の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ９ＥＰ７３（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＥＰ７３）を有する。

【0101】

前駆体ヒトＰＤＬ１ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（シグナル配列＝下線付き；細胞外ドメイン＝太字）を有する：

【0102】

【化1】

【0103】

マウスＰＤＬ１ポリペプチドは、２９０アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから１８アミノ酸が除去され、成熟ｍＰＤＬ１が生成される。アミノ酸１９～２３９（前駆体タンパク質に基づく番号付け）が、ｍＰＤＬ１細胞外ドメイン、又はエクトドメインを形成する。前駆体マウスＰＤＬ１ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（シグナル配列＝下線付き；細胞外ドメイン＝太字）を有する：

【0104】

【化2】

【0105】

いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、哺乳類（例えばヒト若しくはマウス）ＰＤＬ１のＰＤ１結合部分と、又は哺乳類（例えばヒト又はマウス）ＰＤＬ１のエクトドメイン全体と、少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むＰＤＬ１ベースのアゴニスト部分である。ある特定の態様では、ＰＤＬ１のＰＤ１結合部分は、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１のＩｇＶドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤＬ１のＰＤ１結合部分は、ヒトＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４又はマウスＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４を含む。

【0106】

ある特定の実施形態では、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分と少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、野生型ＰＤＬ１と比較して１つ以上のアミノ酸置換とを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分の安定性を増加させる。例えば、いくつかの実施形態では、ｍＰＤＬ１は、アミノ酸置換Ｃ１１３Ｓ（前駆体タンパク質に基づく番号付け）を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、任意選択でリンカーを介して（例えば、セクション６．７に記載されるように）、直接的又は間接的に、ＣＤ２０標的化部分に融合される。同じモノマー上に存在する場合、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、ＣＤ２０標的化部分のＮ末端又はＣ末端にあり得る。ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分がＣＤ２０標的化部分に「直接」融合される場合、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分及びＣＤ２０標的化部分は、同じモノマー上に隣接して配置され、存在する場合、リンカーによってのみ分離される。ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分がＣＤ２０標的化部分に「間接的に」融合される場合、ＰＤＬ１ベースのＰＤ１アゴニスト部分及びＣＤ２０標的化部分は、同じモノマー上の１つ以上の他のドメイン（例えば、二量体化部分）によって分離されるか、又は別個のモノマー上に位置する。

【0108】

６．４．２．ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分
ＰＤＬ２とＰＤ１との相互作用は、細胞周期の進行及びサイトカイン産生をブロックすることによってＴ細胞増殖を阻害する。本開示は、少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、本明細書に記載のＰＤＬ２アミノ酸配列を含むか、又はそれと相同であるアミノ酸配列を含む、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。このようなＰＤ１アゴニスト部分は、本明細書では「ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分」又は同様の用語で呼ばれる。

【0109】

ヒトＰＤＬ２タンパク質は、２７３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから１９アミノ酸が除去されて成熟ｈＰＤＬ２が生成され、アミノ酸２０～２２０（前駆体タンパク質に基づく番号付け）がｈＰＤＬ２細胞外ドメイン、又はエクトドメインを形成する。ヒトＰＤＬ２の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ９ＢＱ５１（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＢＱ５１）を有する。マウスＰＤＬ２の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ９ＷＵＬ５（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＷＵＬ５）を有する。

【0110】

前駆体ヒトＰＤＬ２ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（シグナル配列＝下線付き；細胞外ドメイン＝太字）を有する：

【0111】

【化3】

【0112】

マウスＰＤＬ２ポリペプチドは、２４７アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから１９アミノ酸が除去され、成熟ｍＰＤＬ２が生成される。アミノ酸２０～２２１（前駆体タンパク質に基づく番号付け）が、ｍＰＤＬ２細胞外ドメイン、又はエクトドメインを形成する。前駆体マウスＰＤＬ２ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（シグナル配列＝下線付き；細胞外ドメイン＝太字）を有する：

【0113】

【化4】

【0114】

いくつかの実施形態では、ＰＤ１アゴニスト部分は、哺乳類（例えばヒト若しくはマウス）ＰＤＬ２のＰＤ１結合部分と、又は哺乳類（例えばヒト又はマウス）ＰＤＬ１のエクトドメイン全体と、少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むＰＤＬ２ベースのアゴニスト部分である。ある特定の態様では、ＰＤＬ２のＰＤ１結合部分は、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２のＩｇＶドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤＬ２のＰＤ１結合部分は、ヒトＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１又はマウスＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１を含む。

【0115】

ある特定の実施形態では、ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ２のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分と少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列と、野生型ＰＤＬ２と比較して１つ以上のアミノ酸置換とを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、任意選択でリンカーを介して（例えば、セクション６．７に記載されるように）、直接的又は間接的に、ＣＤ２０標的化部分に融合される。同じモノマー上に存在する場合、ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分は、ＣＤ２０標的化部分のＮ末端又はＣ末端にあり得る。ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分がＣＤ２０標的化部分に「直接」融合される場合、ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分及びＣＤ２０標的化部分は、同じモノマー上に隣接して配置され、存在する場合、リンカーによってのみ分離される。ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分がＣＤ２０標的化部分に「間接的に」融合される場合、ＰＤＬ２ベースのＰＤ１アゴニスト部分及びＣＤ２０標的化部分は、同じモノマー上の１つ以上の他のドメイン（例えば、二量体化部分）によって分離されるか、又は別個のモノマー上に位置する。

【0117】

６．５．二量体化部分
６．５．１．Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子及びＣＤ２０－ＰＤ１モノマーは、１つ以上の二量体化部分、例えば、Ｆｃドメインであるか、又はそれを含む１つ以上の二量体化部分を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１モノマーは、単一の二量体化部分（例えば、単一のＦｃドメイン）を含む、及び／又は本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、２つの二量体化部分（例えば、会合してＦｃ領域を形成することができる２つのＦｃドメイン）を含む。

【0118】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子及びＣＤ２０－ＰＤ１モノマーは、任意の好適な種に由来し、ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に作動可能に連結された、Ｆｃドメイン、又は会合してＦｃ領域を形成する一対のＦｃドメインを含むことができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインに由来する。好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧＦｃドメインに由来する。

【0119】

ＣＤ２０標的部位及び／又はＰＤ１アゴニスト部位は、ＩｇＧＦｃドメインのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。
本開示の一実施形態は、Ｆｃドメインに、１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分を融合させることによって、例えば、発現時にホモ二量体化することができるＣＤ２０－ＰＤ１モノマーを形成することができるＦｃドメインに、ＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分の両方を融合させることによって、又は発現時にヘテロ二量体化することができる２つの異なるＣＤ２０－ＰＤ１モノマーを形成する、１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び／若しくは１つ以上のＰＤ１アゴニスト部分を第１のＦｃドメインに、１つ以上のＣＤ２０標的化部分及び／若しくは１つ以上のＰＤ１アゴニスト部分を第２のＦｃドメインに融合させることによって、作成される２つのＦｃ融合ポリペプチドを含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質（複数可）をコードする遺伝子融合物を適切な発現ベクターに挿入し、遺伝子融合物（複数可）を組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞内で発現させ、発現された融合タンパク質（複数可）を抗体分子と同様に集合させることによってすぐに、Ｆｃ部分間に鎖間結合が形成され、二量体を生成するように作製できる。

【0120】

ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーに組み込まれることができるＦｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、及びＩｇＭを含む、任意の好適なクラスの抗体に由来することができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４に由来する。

【0121】

Ｆｃ領域内の２つのＦｃドメインは、互いに同一又は異なってもよい。天然抗体では、Ｆｃドメインは典型的には同一であるが、多重特異性結合分子、例えば、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を産生する目的では、Ｆｃドメインは、以下の６．５．１セクションに記載されるように、ヘテロ二量体化を可能にするために有利に異なっていてもよい。

【0122】

天然抗体では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの重鎖Ｆｃドメインは、２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）から構成され、ＩｇＥ及びＩｇＭのドメインは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）から構成される。これらは二量体化して、Ｆｃ領域を作成する。

【0123】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子では、Ｆｃ領域、及び／又はその中のＦｃドメインは、１つ以上の異なるクラスの抗体、例えば、１つ、２つ、又は３つの異なるクラスに由来する重鎖定常ドメインを含むことができる。

【0124】

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ３に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。

【0125】

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＭ ＣＨ４ドメインは、典型的には、ＣＨ３ドメインのＣ末端に位置する。

【0126】

一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、並びにＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のＦｃ領域の産生において使用するための重鎖定常ドメインは、上述の天然に存在する定常ドメインのバリアントが含まれ得ることが理解されるであろう。そのようなバリアントは、野生型定常ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。一例では、本開示のＦｃ領域は、野生型定常ドメインとは配列が異なる少なくとも１つの定常ドメインを含む。バリアント定常ドメインは、野生型定常ドメインよりも長くても短くてもよいことが理解されるであろう。好ましくは、バリアント定常ドメインは、野生型定常ドメインと少なくとも６０％同一又は類似である。別の例では、バリアント定常ドメインは、少なくとも７０％同一又は類似である。別の例では、バリアント定常ドメインは、少なくとも８０％同一又は類似である。別の例では、バリアント定常ドメインは、少なくとも９０％同一又は類似である。別の例では、バリアント定常ドメインは、少なくとも９５％同一又は類似である。

【0127】

ＩｇＭ及びＩｇＡは、共通のＨ２Ｌ２抗体単位の共有結合性多量体としてヒトに天然に存在する。ＩｇＭは、Ｊ鎖が組み込まれている場合には五量体として存在し、Ｊ鎖を欠く場合には六量体として存在する。ＩｇＡは、モノマー及び二量体形態として存在する。ＩｇＭ及びＩｇＡの重鎖は、尾部として既知であるＣ末端定常ドメインへの１８アミノ酸の延長部分を有する。尾部は、ポリマー内の重鎖間にジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、重合において重要な役割を果たしていると考えられる。尾部はまた、グリコシル化部位を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、尾部を含まない。

【0128】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に組み込まれるＦｃドメインは、タンパク質の機能的特性を変化させる１つ以上の改変、例えば、ＦｃＲｎ又は白血球受容体などのＦｃ受容体への結合、補体への結合、改変されたジスルフィド結合構造、又は変化したグリコシル化パターンを含んでもよい。エフェクター機能を変化させる例示的なＦｃ改変は、セクション６．５．１．１に記載されている。

【0129】

Ｆｃドメインはまた、例えば、同一のＦｃドメインよりも非同一のＦｃドメインの優先的な対合であるヘテロ二量体化を可能にすることによって、非対称のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の製造可能性を改善する改変を含むように変更することもできる。ヘテロ二量体化は、配列が異なるＦｃドメインを含有するＦｃ領域によって異なるポリペプチド構成要素が互いに接続しているＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の産生を可能にする。ヘテロ二量体化戦略の例は、セクション６．５．１．２に例示される。

【0130】

上記の改変のうちのいずれかが、任意の好適方法で組み合わせて所望の機能的特性を達成でき、かつ／又は他の改変と組み合わせてＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の特性を変更できることが理解されるであろう。

【0131】

６．５．１．１．エフェクター機能が変化したＦｃドメイン
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能への結合を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0132】

特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。

【0133】

一実施形態では、Ｆｃドメイン（例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーのＦｃドメイン）又はＦｃ領域（例えば、会合してＦｃ領域を形成することができるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の一方又は両方のＦｃドメイン）は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３３０、Ｐ３３１、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのような一実施形態では、Ｆｃドメイン又は領域は、Ｉｇｄ Ｆｃドメイン又は領域、特に、ヒトＩｇｄ Ｆｃドメイン又は領域である。一実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。一実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、Ｐ３２９位、Ｌ２３４位、及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はＦｃ領域は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位、Ｇ２３７位、Ａ３３０位、及びＰ３３１位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。

【0135】

典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸置換が、Ｆｃ領域の２つのＦｃドメインのそれぞれに存在する。したがって、特定の実施形態では、Ｆｃ領域の各Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み、すなわち、Ｆｃ領域の第１及び第２のＦｃドメインの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置換される（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の特定の実施形態では、Ｆｃ領域の各Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、すなわち、Ｆｃ領域の第１及び第２のＦｃドメインの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置換され（Ｌ２３５Ａ）、２３７位のグリシン残基がアラニン残基で置換され（Ｇ２３７Ａ）、３３０位のアラニン残基がセリン残基で置換され（Ａ３３０Ｓ）、３３１位のプロリン残基がセリン残基で置換される（Ｐ３３１Ｓ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0136】

一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低減するためのＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含むバリアントＩｇＧ１である。他の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ変異（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含むバリアントＩｇＧ１であり、エフェクターヌルＩｇＧ１（ＩｇＧ１ＥＮ）を提供する。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及びＧ２３７Ａは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩへの結合を低減させるが、置換Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓは、Ｃ１ｑ媒介性補体結合を低減させる。

【0137】

別の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合が低減したＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。Ｆｃ受容体への結合が低減した例示的なＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、以下の表２から選択されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、以下に示される配列の太字部分のみを含む：

【0138】

【表2-1】

【0139】

【表2-2】

【0140】

【表2-3】

【0141】

特定の実施形態では、低減されたエフェクター機能を有するＩｇＧ４は、ＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号３１のアミノ酸配列の太字部分を含み、本明細書ではＩｇＧ４ｓ又はｈＩｇＧ４ｓと呼ばれることもある。

【0142】

ヘテロ二量体Ｆｃ領域について、上述のバリアントＩｇＧ４ Ｆｃ配列の組み合わせ、例えば、ＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号３０のアミノ酸配列（又はその太字部分）を含むＦｃドメイン及びＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号３７のアミノ酸配列（又はその太字部分）を含むＦｃドメインを含むＦｃ領域、又はＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号３１のアミノ酸配列（又はその太字部分）を含むＦｃドメイン及びＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号３８のアミノ酸配列（又はその太字部分）を含むＦｃドメインを含むＦｃ領域、を組み込むことが可能である。

【0143】

６．５．１．２．Ｆｃヘテロ二量体化バリアント
特定のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、天然免疫グロブリンとは異なり、非同一のＮ末端領域に作動可能に連結されている２つのＦｃドメイン（例えば、一方のＦｃドメインはＦａｂに接続され、及び他方のＦｃドメインはＰＤ１アゴニスト部分に接続されている）間の二量体化を伴う。Ｆｃ領域を形成するための２つのＦｃドメインの不十分なヘテロ二量体化は、所望のヘテロ二量体分子の収量を増加させるための障害となる可能性があり、精製の課題となる。例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１；米国特許第５，５８２，９９６号；米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第５，９１０，５７３号；米国特許第５，９３２，４４８号；米国特許第６，８３３，４４１号；米国特許第７，１８３，０７６号；米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１号に開示されているように、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に存在し得るＦｃドメインの二量体化を増強するために当該技術分野で利用可能な様々なアプローチを使用することができる。

【0144】

本開示は、Ｆｃヘテロ二量体、すなわち、異種の、非同一のＦｃドメインを含むＦｃ領域を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。典型的には、Ｆｃヘテロ二量体中の各Ｆｃドメインは、抗体のＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、前述のセクションに記載されるように、任意のアイソタイプ、クラス、又はサブクラス、好ましくはＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）クラスの抗体の定常領域に由来する。

【0145】

ＣＨ３ドメインにおける２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化は、所望のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を生じさせるが、同一の重鎖のホモ二量体化では、所望のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の収量を低下させるであろう。したがって、好ましい実施形態では、会合して本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を形成するポリペプチドは、非改変のＦｃドメインと比較してヘテロ二量体会合を有利にする改変を有するＣＨ３ドメインを含有するであろう。

【0146】

具体的な実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進する当該改変は、Ｆｃドメインの一方に「ノブ」改変を含み、他方のＦｃドメインに「ホール」改変を含む、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」又は「ノブ・イン・ホール」改変である。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、ＵＳ７，６９５，９３６、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９：６１７－６２１、及びＣａｒｔｅｒ，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８：７－１５に記載されている。一般に、この方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるために、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を導入して、突起を空洞内に配置できるようにすることを含む。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同じ又は類似のサイズの補償空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作製される。

【0147】

したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生じさせ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生じさせ、その中に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である。好ましくは、より大きな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さい側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変化させることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。例示的な置換は、Ｙ４７０Ｔである。

【0148】

具体的なそのような実施形態では、第１のＦｃドメインでは、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換され（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択で、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。更なる実施形態では、第１のＦｃドメインでは、追加的に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）。第２のＦｃドメインでは、追加的に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施形態では、第１のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）（例えば、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（２５）：１９６３７－４６に記載）を使用して、Ｆｃ領域の第１及び第２のＦｃドメインの会合を促進することができる。

【0150】

ヘテロ二量体化を促進するように改変されたＦｃドメインの使用の代替として、又はそれに加えて、Ｆｃドメインは、Ｆｃヘテロ二量体の選択を可能にする精製戦略を可能にするように改変され得る。そのような一実施形態では、１つのポリペプチドは、プロテインＡへのその結合を抑止する改変Ｆｃドメインを含み、したがって、ヘテロ二量体タンパク質をもたらす精製方法を可能にする。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。そのような、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣＨ３ドメインを含み、第１及び第２のＩｇＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く対応するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子と比較して、プロテインＡへのＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＣＨ３ドメインは、プロテインＡ結合を減少又は消失させる変異／改変、例えばＨ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴ エクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）を含有する。第２のＣＨ３は更に、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＹ４３６Ｆ）を含んでいてもよい。このクラスの改変は、本明細書において「スター」変異と称される。

【0151】

いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヘテロ二量体化を促進するための１つ以上の変異（例えば、ノブ及びホール変異）、並びに精製を促進するためのスター変異を含み得る。
６．６．安定化部分
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、インビボでの分子の血清半減期を延長することができる安定化部分を含むことができる。血清半減期は、しばしばアルファ相とベータ相に分けられる。いずれか又は両方の相は、適切な安定化部分の追加によって大幅に改善する可能性がある。例えば、安定化部分は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の血清半減期を、安定化部分を含有しない対応するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子と比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％又はそれ以上増加させることができる。本開示の目的のために、血清半減期は、ヒト又は他の哺乳類（例えば、マウス又は非ヒト霊長類）における半減期を指すことができる。

【0152】

安定化部分としては、ポリオキシアルキレン部分（例えば、ポリエチレングリコール）、糖（例えば、シアル酸）、及び耐容性の高いタンパク質部分（例えば、Ｆｃ及びその断片及びバリアント、トランスフェリン、又は血清アルブミン）が挙げられる。

【0153】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に使用され得る他の安定化部分としては、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：８６８－７６に記載されるものが挙げられる。そのような安定化部分としては、ヒト血清アルブミン融合物、ヒト血清アルブミンコンジュゲート、ヒト血清アルブミンバインダー（例えば、アドネクチンＰＫＥ、ＡｌｂｕｄＡｂ、ＡＢＤ）、ＸＴＥＮ融合物、ＰＡＳ融合物（すなわち、３つのアミノ酸のプロリン、アラニン、及びセリンに基づく組換えＰＥＧ模倣物）、炭水化物コンジュゲート（例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ））、グリコシル化、ポリシアル酸コンジュゲート、及び脂肪酸コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。

【0154】

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、高分子糖である安定化部分を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。
血清アルブミンはまた、アルブミンと非共有結合的に相互作用する能力を有するモジュールを介して半減期延長に関与することができる。したがって、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、安定化部分として、アルブミン結合タンパク質を含むことができる。アルブミン結合タンパク質は、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の１つ以上の他の構成要素にコンジュゲート又は遺伝的に融合してもよい。アルブミン結合活性を有するタンパク質は、特定の細菌から知られている。例えば、連鎖球菌プロテインＧは、約５０個のアミノ酸残基（６ｋＤａ）で構成されるいくつかの小さなアルブミン結合ドメインを含有する。米国公開第２００７／０１７８０８２及び第２００７／０２６９４２２号に記載されているようなものなどの、血清アルブミン結合タンパク質の追加の例。タンパク質へのアルブミン結合ドメインの融合は、大幅に延長された半減期をもたらす（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：８６８－７６を参照されたい）。

【0155】

他の実施形態では、安定化部分は、ヒト血清アルブミンである。他の実施形態では、安定化部分は、トランスフェリンである。
いくつかの実施形態では、安定化部分は、Ｆｃドメイン、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、セクション６．５．１及びそのサブセクションに記載されているＦｃドメインのいずれかである。セクション６．５．１に記載のＦｃドメインは一般に、二量体化することができる。しかしながら、安定化の目的のために、Ｆｃドメインは、自己会合する能力が低下した可溶性モノマーＦｃドメインであり得る。例えば、Ｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７４９４－７５００及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７（２３）：１９３９９－１９４０８を参照されたい。可溶性モノマーＦｃドメインの例は、米国特許公開第２０１９／０３６７６１１号に記載されるように、ＣＨ３におけるＴ３６６及び／又はＹ４０７に対応する位置にアミノ酸置換を含む。モノマーＦｃドメインは、任意のＩｇサブタイプであってもよく、セクション６．５．１及びそのサブセクションに記載されるように、エフェクター機能を低減する追加の置換を含むことができる。

【0156】

更に他の実施形態では、安定化部分は、以下のセクション６．６．１に記載されるように、ポリエチレングリコール部分又は別のポリマーである。
安定化部分は、例えば、以下のセクション６．７に記載されるように、リンカーを介して、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の１つ以上の他の構成要素に接続することができる。

【0157】

６．６．１．ポリエチレングリコール
いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、安定化部分としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は別の親水性ポリマー、例えば、エチレングリコール／プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、デキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物のコポリマーを含む。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状又は非分枝状であり得る。

【0158】

ＰＥＧは、市販されているか、又は当該技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８－１６１）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズ又はＰＥＧの末端での改変に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、以下の式で表すことができる：Ｘ－－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－１ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ（式中、ｎは、２０～２３００であり、Ｘは、Ｈ又は末端改変、例えば、Ｃ_１－４アルキルである）。ＰＥＧは、分子の化学合成から生じる結合反応に必要な、又は分子の部分の最適な距離のためのスペーサーとして機能する更なる化学基を含有することができる。加えて、そのようなＰＥＧは、一緒に連結された１つ以上のＰＥＧ側鎖からなることができる。複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアーム型又は分岐型ＰＥＧと呼ばれる。分岐型ＰＥＧは、例えば、欧州出願第４７３０８４Ａ号及び米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。

【0159】

１つ以上のＰＥＧ分子は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子上の異なる位置で付着され得、そのような付着は、アミン、チオール、又は他の適切な反応性基との反応によって達成され得る。アミン部分は、例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子（又はその構成要素）のＮ末端に見出される一級アミン、又はリジン若しくはアルギニンなどのアミノ酸中に存在するアミン基であり得る。

【0160】

ＰＥＧ化は、部位特異的ＰＥＧ化によって達成され得、好適な反応性基がタンパク質に導入され、ＰＥＧ化が優先的に生じる部位が作成される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、所望の位置にシステイン残基を導入するように改変され、システイン上の部位特異的ＰＥＧ化を可能にする。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子のコード配列に変異を導入して、システイン残基を生成することができる。これは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基をシステインに変異させることによって達成され得る。システイン残基に変異するための好ましいアミノ酸としては、セリン、スレオニン、アラニン、及び他の親水性残基が挙げられる。好ましくは、システインに変異させる残基は、表面曝露された残基である。一次配列又は三次元構造に基づいて残基の表面アクセス可能性を予測するためのアルゴリズムは、当技術分野で周知である。システイン残基のＰＥＧ化は、例えば、ＰＥＧ－マレイミド、ＰＥＧ－ビニルスルホン、ＰＥＧ－ヨードアセトアミド、又はＰＥＧ－オルトピリジルジスルフィドを使用して実施され得る。

【0161】

ＰＥＧは、典型的には、ポリペプチド上の所望の部位にカップリングするのに適切な好適な活性化基で活性化される。ＰＥＧ化方法は、当該技術分野で周知であり、更に、Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ） ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ” ｉｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：１５７－１８２に記載されている。

【0162】

ＰＥＧ部分は、分子量が大きく異なり得、分岐状又は線状であり得る。典型的には、ＰＥＧの重量平均分子量は、約１００ダルトン～約１５０，０００ダルトンである。ＰＥＧの例示的な重量平均分子量には、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、及び約８０，０００ダルトンが含まれる。ある特定の実施形態では、ＰＥＧの分子量は４０，０００ダルトンである。前述のいずれかの総分子量を有する分岐型のＰＥＧも使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、２つの分岐を有する。他の実施形態では、ＰＥＧは、４つの分岐を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは、ビス－ＰＥＧ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＤＥ－２００ＭＡ）である。

【0163】

当技術分野で既知の従来の分離及び精製技術を使用して、サイズ排除（例えば、ゲル濾過）及びイオン交換クロマトグラフィーなどのＰＥＧ化ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を精製することができる。生成物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離することもできる。分離することができる生成物としては、モノ、ジ、トリ、ポリ、及び非ＰＥＧ化ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、並びに遊離ＰＥＧが挙げられる。モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、溶出ピークの付近のより広い画分をプールして、組成物中のモノＰＥＧのパーセンテージを増加させることによって制御することができる。約９０％のモノＰＥＧコンジュゲートは、収量及び活性の良好なバランスを表す。

【0164】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、好ましくは、非改変ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に関連する生物学的活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％を保持するであろう。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、又はｋ_ｏｆｆによって評価される、ＣＤ２０、ＰＤ１、又はＣＤ２０及びＰＤ１の両方に結合するその能力を指す。

【0165】

６．７．リンカー
ある特定の態様では、本開示は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の２つ以上の構成要素がペプチドリンカーによって互いに接続されているＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。限定ではなく例として、リンカーを使用して、（ａ）ＣＤ２０標的化部分及び二量体化部分、（ｂ）ＣＤ２０標的化部分及びＰＤ１アゴニスト部分、（ｃ）ＰＤ１アゴニスト部分及び二量体化部分、又は（ｄ）ＣＤ２０標的化部分内の異なるドメイン（例えば、ｓｃＦｖ内のＶＨドメイン及びＶＬドメイン）を接続することができる。

【0166】

ペプチドリンカーは、２アミノ酸～６０アミノ酸以上の範囲とすることができ、ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、３アミノ酸～５０アミノ酸、４～３０アミノ酸、５～２５アミノ酸、１０～２５アミノ酸、１０アミノ酸～６０アミノ酸、１２アミノ酸～２０アミノ酸、２０アミノ酸～５０アミノ酸、又は２５アミノ酸～３５アミノ酸長の範囲とすることができる。

【0167】

特定の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、又は少なくとも７アミノ酸長であり、任意選択で、最大３０アミノ酸、最大４０アミノ酸、最大５０アミノ酸、又は最大６０アミノ酸長である。

【0168】

前述のいくつかの実施形態では、リンカーは、５アミノ酸～５０アミノ酸長の範囲、例えば、５～５０、５～４５、５～４０、５～３５、５～３０、５～２５、又は５～２０アミノ酸長の範囲である。前述の他の実施形態では、リンカーは、６アミノ酸～５０アミノ酸長の範囲、例えば、６～５０、６～４５、６～４０、６～３５、６～３０、６～２５、又は６～２０アミノ酸長の範囲である。前述の更に他の実施形態では、リンカーは、７アミノ酸～５０アミノ酸長の範囲、例えば、７～５０、７～４５、７～４０、７～３５、７～３０、７～２５、又は７～２０アミノ酸長の範囲である。

【0169】

荷電（例えば、荷電親水性リンカー）及び／又は柔軟なリンカーが特に好ましい。
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に使用され得る柔軟なリンカーの例としては、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２７（１０）：３２５－３３０に開示されるものが挙げられる。特に有用な柔軟なリンカーは、グリシン及びセリンの反復、例えば、Ｇ_ｎＳ（配列番号１２）又はＳＧ_ｎ（配列番号１３）のモノマー又は多量体であるか、又はそれらを含み、式中、ｎは、１～１０の整数、例えば、１ ２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。一実施形態では、リンカーは、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１４）などのＧ_４Ｓの反復のモノマー又は多量体であるか、又はそれを含む。

【0170】

ポリグリシンリンカーは、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に好適に使用することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２つの連続したグリシン（２Ｇｌｙ）、３つの連続したグリシン（３Ｇｌｙ）、４つの連続したグリシン（４Ｇｌｙ）（配列番号１５）、５つの連続したグリシン（５Ｇｌｙ）（配列番号１６）、６つの連続したグリシン（６Ｇｌｙ）（配列番号１７）、７つの連続したグリシン（７Ｇｌｙ）（配列番号１８）、８つの連続したグリシン（８Ｇｌｙ）（配列番号１９）又は９つの連続したグリシン（９Ｇｌｙ）（配列番号２０）を含む。

【0171】

６．７．１．ヒンジ配列
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ヒンジ領域であるリンカーを含む。特に、ヒンジを使用して、ＣＤ２０標的化部分、例えば、Ｆａｂドメインを二量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインに接続することができる。ヒンジ領域は、天然のヒンジ領域又は改変されたヒンジ領域であり得る。ヒンジ領域は、典型的には、Ｆｃ領域のＮ末端に見出される。「ヒンジ領域」という用語は、別段の文脈で指示されない限り、単一又はモノマーポリペプチド鎖に関してはモノマーヒンジドメインであり、二量体ポリペプチド（例えば、２つのＦｃドメインの会合によって形成されるホモ二量体又はヘテロ二量体ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子）に関しては、別個のポリペプチド鎖上の２つの会合したヒンジ配列を含むことができる天然又は非天然に存在するヒンジ配列を指す。

【0172】

天然のヒンジ領域は、通常、天然に存在する抗体におけるＦａｂドメインとＦｃドメインとの間に見出されるヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域は、天然のヒンジ領域とは、長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サメ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、又はヤギのヒンジ領域などの他の種からのヒンジ領域を含むことができる。他の改変されたヒンジ領域は、重鎖Ｆｃドメイン又はＦｃ領域のものとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含み得る。あるいは、改変されたヒンジ領域は、天然ヒンジの一部又は繰り返しユニットを含み得、繰り返しの各ユニットは、天然ヒンジ領域に由来する。更なる別の方法では、天然ヒンジ領域は、１つ以上のシステイン又は他の残基をセリン又はアラニンなどの中性残基に変換することによって、又は好適に配置された残基をシステイン残基に変換することによって変更され得る。そのような手段によって、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を増加又は減少させることができる。他の改変されたヒンジ領域は、完全に合成であってもよく、長さ、システイン組成、及び柔軟性などの所望の特性を有するように設計されてもよい。

【0173】

いくつかの改変されたヒンジ領域は、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号、ＷＯ９９／１５５４９、ＷＯ２００５／００３１７０、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、ＷＯ９８／２５９７１、及びＷＯ２００５／００３１７１に既に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0174】

一実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、一方又は両方のＦｃドメインがそのＮ末端に無傷のヒンジ領域を有するＦｃ領域を含む。
様々な実施形態では、ヒンジ領域内の位置２３３～２３６は、Ｇ、Ｇ、Ｇ、及び空き；Ｇ、Ｇ、空き、及び空き；Ｇ、空き、空き、及び空き；又は全てが空きであり得、位置はＥＵ番号付けによって番号付けされている。

【0175】

いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、同じアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４）の野生型ヒンジ領域と比較してＦｃγ受容体に対する結合親和性を低減する改変ヒンジ領域を含む。

【0176】

一実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、各Ｆｃドメインが、そのＮ末端に無傷のヒンジ領域を有するＦｃ領域を含み、各Ｆｃドメイン及びヒンジ領域は、ＩｇＧ４に由来し、各ヒンジ領域は、改変された配列ＣＰＰＣ（配列番号２１）を含む。ヒトＩｇＧ４のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣ（配列番号２９）を含有するＩｇＧ１と比較して、配列ＣＰＳＣ（配列番号２２）を含有する。ＩｇＧ４配列に存在するセリン残基は、この領域における柔軟性の増加をもたらし、したがって、ある割合の分子は、ＩｇＧ分子内の他の重鎖に架橋して鎖間ジスルフィドを形成するのではなく、同じタンパク質鎖内にジスルフィド結合（鎖内ジスルフィド）を形成する。（Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０（１）：１０５－１０８）。セリン残基をプロリンに変更して、ＩｇＧ１と同じコア配列を得ることで、ＩｇＧ４ヒンジ領域内に鎖間ジスルフィドが完全な形成が可能になり、したがって、精製生成物中の不均一性が低減する。この変化したアイソタイプは、ＩｇＧ４Ｐと呼ばれる。

【0177】

６．７．１．１．キメラヒンジ配列
ヒンジ領域は、キメラヒンジ領域であり得る。
例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせられたヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含み得る。

【0178】

特定の実施形態では、キメラヒンジ領域は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号２３）（ＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号８として以前に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号２４）（ＷＯ２０１４／１２１０８７の配列番号９として以前に開示されている）を含む。このようなキメラヒンジ配列は、ＩｇＧ４ＣＨ２領域に好適に連結することができる（例えば、ＩｇＧ４Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＦｃドメイン又はマウスＦｃドメインに組み込むことによって、例えば、セクション６．５．１．１に記載されるように、エフェクター機能を低減するためにＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインで更に改変することができる）。

【0179】

６．７．１．２．エフェクター機能が低減したヒンジ配列
更なる実施形態では、ヒンジ領域は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６１６１０１０Ａ２号に記載されるように、エフェクター機能を低減するように改変することができる。様々な実施形態では、改変されたヒンジ領域の位置２３３～２３６は、Ｇ、Ｇ、Ｇ、及び空き；Ｇ、Ｇ、空き、及び空き；Ｇ、空き、空き、及び空き；又は全てが空きであり得、位置はＥＵ番号付けによって番号付けされている（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の図１に示される）。これらのセグメントは、ＧＧＧ－、ＧＧ－－、Ｇ－－－、又は－－－－として表すことができ、「－」は、空きの位置を表す。

【0180】

位置２３６は、カノニカルヒトＩｇＧ２では空きであるが、他のカノニカルヒトＩｇＧアイソタイプでは占有されている。位置２３３～２３５は、（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の図１に示されるように）４つのヒトアイソタイプ全てにおいて、Ｇ以外の残基によって占有される。

【0181】

位置２３３～２３６内のヒンジ改変は、Ｐによって占有される位置２２８と組み合わせることができる。位置２２８は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２では本来Ｐによって占有されるが、ヒトＩｇＧ４ではＳによって、ヒトＩｇＧ３ではＲによって占有される。ＩｇＧ４抗体におけるＳ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４抗体を安定化し、外因性抗体と内因性抗体との間の重鎖軽鎖対の交換を低減するのに有利である。好ましくは、位置２２６～２２９は、それぞれ、Ｃ、Ｐ、Ｐ、及びＣによって占有される（「ＣＰＰＣ」は、配列番号２１として開示される）。

【0182】

例示的なヒンジ領域は、中間（又はコア）及び下部ヒンジと称されることもある残基２２６－２３６を有し、ＧＧＧ－（２３３～２３６）、ＧＧ－－（２３３～２３６）、Ｇ－－－（２３３～２３６）及びＧなし（２３３－２３６）、と呼ばれる改変されたヒンジ配列によって占有される。任意選択で、ヒンジドメインアミノ酸配列は、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧＧ－ＧＰＳＶＦ（配列番号２５）（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の配列番号１として以前に開示されている）、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ－－ＧＰＳＶＦ（配列番号２６）（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の配列番号２として以前に開示されている）、ＣＰＰＣＰＡＰＧ－－－ＧＰＳＶＦ（配列番号２７）（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の配列番号３として以前に開示されている）又はＣＰＰＣＰＡＰ－－－－ＧＰＳＶＦ（配列番号２８）（ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の配列番号４として以前に開示されている）を含む。

【0183】

上記の改変されたヒンジ領域は、典型的にはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、指定された領域に隣接する追加のヒンジセグメント（例えば、上部ヒンジ）を有し得る、重鎖定常領域に組み込むことができる。存在するそのような追加の定常領域セグメントは、典型的には同じアイソタイプ、好ましくはヒトアイソタイプのものであるが、異なるアイソタイプのハイブリッドであってもよい。このような追加のヒト定常領域セグメントのアイソタイプは、好ましくはヒトＩｇＧ４であるが、ドメインが異なるアイソタイプであるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ３又はそのハイブリッドであってもよい。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４の例示的な配列は、ＷＯ２０１６１６１０１０Ａ２の図２～４に示されている。

【0184】

特定の実施形態では、改変されたヒンジ配列は、ＩｇＧ４ＣＨ２領域に連結され得る（例えば、ＩｇＧ４Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＦｃドメイン又はマウスＦｃドメインに組み込むことによって、例えば、セクション６．５．１．１に記載されるように、エフェクター機能を低減するためにＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインで更に改変され得る）。

【0185】

６．８．核酸及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、単一の核酸によってコードされる。他の実施形態では、例えば、ヘテロ二量体分子又は２つ以上のポリペプチド鎖から構成されるＣＤ２０標的化部分を含む分子の場合、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の）核酸によってコードすることができる。

【0186】

単一の核酸は、単一のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、２つ以上のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、又は３つ以上のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の一部を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子をコードすることができる（例えば、単一の核酸は、３つ、４つ若しくはそれ以上のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の２つのポリペプチド鎖、又は４つ若しくはそれ以上のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の３つのポリペプチド鎖をコードすることができる）。発現を別々に制御するために、２つ以上のポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレームは、別々の転写調節エレメント（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）の制御下におくことができる。２つ以上のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、同じ転写調節エレメントによって制御され、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって分離され、別々のポリペプチドへの翻訳を可能にすることもできる。

【0187】

いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチド鎖を含むＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、２つ以上の核酸によってコードされる。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子をコードする核酸の数は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子中のポリペプチド鎖の数以下であり得る（例えば、２つ以上のポリペプチド鎖が単一の核酸によってコードされる場合）。

【0188】

本開示の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含有する宿主細胞及びベクターを提供する。核酸は、本明細書において以下により詳細に記載されるように、単一のベクター中に存在してもよいし、同じ宿主細胞又は別個の宿主細胞中に存在する別個のベクター中に存在してもよい。

【0189】

６．８．１．ベクター
本開示は、本明細書に記載されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又はＣＤ２０－ＰＤ１結合分子構成要素、例えば、ＣＤ２０－ＰＤ１モノマーのポリペプチド鎖のうちの１つ又は２つをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。

【0190】

多数のベクター系を使用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ若しくはＭＯＭＬＶ）、又はＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。別のクラスのベクターは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、及びフラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡエレメントを利用する。

【0191】

追加的に、ＤＮＡを染色体に安定的に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対するプロトトロピー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、又は銅などの重金属に対する耐性などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されるか、又は共形質転換によって同じ細胞内に導入されるかのいずれかであり得る。ｍＲＮＡの最適な合成のために、追加のエレメントも必要とされ得る。これらのエレメントは、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。

【0192】

発現ベクター又は構築物を含有するＤＮＡ配列が発現のために調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトするか、又は導入することができる。これを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、又は他の従来の技法などの様々な技法が使用され得る。得られたトランスフェクトされた細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収するための方法及び条件は、当業者に既知であり、本明細書に基づいて、使用される特異的発現ベクター及び哺乳類宿主細胞に応じて変化又は最適化され得る。

【0193】

６．８．２．細胞
本開示はまた、本開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。
一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上の核酸を含むように遺伝子操作される。

【0194】

一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用することによって遺伝子操作される。「発現カセット」という語句は、そのような配列と互換性のある宿主における遺伝子の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を指す。そのようなカセットには、プロモーター、イントロンを有する又は有しないオープンリーディングフレーム、及び終結シグナルが含まれ得る。発現にもたらすのに必要な、又は役立つ追加の因子、例えば、誘導性プロモーターも使用されてもよい。

【0195】

本開示はまた、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
細胞は、限定されないが、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞であり得る。好適な真核細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、及びＭＤＣＫＩＩ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞としては、限定されないが、Ｓｆ９細胞が挙げられる。

【0196】

６．９．薬学的組成物
６．９．１．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を含む薬学的組成物
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子と、１つ以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤とを含む組成物の形態にあり得る。組成物は、獣医学的使用又はヒトにおける薬学的使用などの特定の使用のために製剤化され得る。組成物の形態（例えば、乾燥粉末、液体製剤など）と、使用される賦形剤、希釈剤及び／又は担体は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の意図される用途、及び治療的用途場合、投与様式に依存するであろう。

【0197】

治療用途の場合、組成物は、薬学的に許容される担体を含む滅菌の薬学的組成物の一部として供給され得る。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、局部、又は局所などの様々な経路によって患者に投与され得る。いずれかの所与の場合における投与のための最も好適な経路は、特定の抗体、対象、並びに疾患の性質及び重症度、並びに対象の身体状態に依存するであろう。典型的には、薬学的組成物は、静脈内又は皮下に投与されるであろう。

【0198】

薬学的組成物は、用量当たり所定量の本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を含有する単位剤形で都合よく提示することができる。単位用量に含まれるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の量は、当該技術分野において周知である他の因子と同様に、治療される疾患に依存するであろう。そのような単位投薬量は、単回投与に適した量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を含有する凍結乾燥された乾燥粉末の形態、又は液体の形態にあり得る。乾燥粉末単位剤形は、シリンジ、適切な量の希釈剤、及び／又は投与に有用な他の構成要素とともにキットに包装することができる。液体形態の単位投薬量は、単回投与に適した量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を予め充填したシリンジの形態で都合よく供給してもよい。

【0199】

薬学的組成物はまた、複数回の投与に好適な量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を含有することからバルクで供給されてもよい。
薬学的組成物は、所望の純度を有するＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を、当技術分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤（これらの全てを本明細書では「担体」と称する）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の様々な添加剤と混合することによって、凍結乾燥された製剤又は水溶液として保存するために調製され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｄｅｊａｒｅ，ｅｄ．２０２０）を参照されたい。そのような添加剤は、用いられる投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であるべきである。

【0200】

緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲でｐＨを維持するのに役立つ。それらは、多種多様な濃度で存在し得るが、典型的には、約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在するであろう。本開示で使用するための好適な緩衝剤としては、有機酸及び無機酸の両方並びにその塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸－水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸－グリコン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－グリコン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など）、及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。追加的に、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及びトリメチルアミン塩（例えば、Ｔｒｉｓ）が使用され得る。

【0201】

保存剤は、微生物の増殖を遅延させるために添加されてもよく、約０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加され得る。本開示で使用するのに好適な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（ｂｅｎｚａｌｃｏｎｉｕｍ ｈａｌｉｄｅ）（例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３－ペンタノールが挙げられる。時に「安定剤」として知られている等張化剤は、本開示の液体組成物の等張性を確保するために添加され得、多価糖アルコール、例えば、三価以上の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなど）を含む。安定剤とは、機能において、増量剤から添加剤までの範囲であり得る幅広いカテゴリーの賦形剤を指し、治療薬を可溶化するか、変性若しくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上で列挙した）、アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールなど、イノシトールなどのシクリトールを含む）、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、含硫還元剤（例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドンなど）、単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど）、二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース及びトレハロースなど）、三糖類（例えば、ラフィノースなど）、及び多糖類（例えば、デキストランなど）であり得る。安定剤は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の重量当たり０．５～１０重量％の範囲の量で存在してもよい。

【0202】

非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても知られる）を添加して、糖タンパク質の可溶化を助けるとともに、撹拌誘導性凝集から糖タンパク質を保護することができ、これにより、タンパク質の変性を引き起こすことなく、製剤を負荷のかかる剪断面に曝露することも可能になる。好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８等）、及びプルロニックポリオールが挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬ）の範囲で存在し得る。

【0203】

追加の種々の賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。

【0204】

６．９．２．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子をコードする核酸送達のための薬学的組成物
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、遺伝子治療に有用な任意の方法によって、例えば、ｍＲＮＡとして、又は好適なプロモーターの制御下で、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子をコードするウイルスベクターを介して送達され得る。

【0205】

例示的な遺伝子治療ベクターとしては、アデノウイルス又はＡＡＶベースの治療薬が挙げられる。本明細書における方法、使用又は組成物において使用するためのアデノウイルスベース又はＡＡＶベースの治療薬の非限定的な例としては、例えば、がんの治療における使用のための、野生型ヒト腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードする組換えアデノウイルスベクターであるｒＡｄ－ｐ５３（Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ（登録商標）、Ｇｅｎｋａｘｉｎ（登録商標）としても知られている、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｄｅｒｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４：１２９５－１２９７）；宿主ｐ５３を不活性化するためのＥ１Ｂ遺伝子を欠くアデノウイルスであるＡｄ５＿ｄ１１５２０（Ｈ１０１又はＯＮＹＸ－０１５とも呼ばれる；例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０：６５８－６７０を参照されたい）；例えば、がんの治療における使用のための、サイトカインＧＭ－ＣＳＦを含有するアデノウイルスであるＡＤ５－Ｄ２４－ＧＭ－ＣＳＦ（Ｃｅｒｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：４２９７）；例えば、がんの治療における使用のための、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を有する複製欠損性アデノウイルスであるｒＡｄ－ＨＳＶｔｋ（Ｃｅｒｅｐｒｏ（登録商標）、Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓとして開発、例えば、米国特許第６，５７９，８５５号を参照；ＡｄｖａｎｔａｇｅｎｅによりＰｒｏｓｔＡｔａｋ（商標）として開発；国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２００５／０４９０９４号）；例えばがんの治療のために、化学放射線誘導性ＥＧＲ－１プロモーターの制御下でヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を発現する複製欠損性アデノウイルスベクターであるｒＡｄ－ＴＮＦα（ＴＮＦｅｒａｄｅ（商標）、ＧｅｎＶｅｃ；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：９５１－７；例えば、がんを治療するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターの指示下でヒトインターフェロンベータ遺伝子を発現するＥ１及びＥ３遺伝子が欠失しているアデノウイルス血清型５ベクターである、Ａｄ－ＩＦＮβ（ＢＧ００００１及びＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ－β，Ｂｉｏｇｅｎ；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：８５２－８６０が挙げられるが、これらに限定されない。

【0206】

核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）又はウイルスは、薬学的組成物中の唯一の薬学的活性成分として製剤化され得るか、又は治療される特定の疾患のための他の活性剤と組み合わせられ得る。任意選択で、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤を、本明細書で提供される組成物中に含めることができる。例えば、湿潤剤、乳化剤及びラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味料及び芳香剤、保存剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスのうちのいずれか１つ以上もまた、組成物中に存在し得る。組成物に含まれ得る例示的な他の薬剤及び賦形剤としては、例えば、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど、及び金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸及びリン酸等が挙げられる。

【0207】

養子細胞移植療法、例えば、セクション６．１１．１に記載されるようなＣＡＲ発現細胞療法のための補助療法として使用される場合、細胞療法、例えば、ＣＡＲ発現細胞を、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を発現するように操作され得る。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、特定のゲノム遺伝子座、例えば、活性化リンパ球又は機能不全リンパ球において活性である遺伝子座、例えば、ＰＤ－１遺伝子座を標的とすることができ、又は非特異的ゲノム遺伝子座に挿入することができる。特定のゲノム遺伝子座を標的化することは、例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などを使用する遺伝子編集によって達成することができる。

【0208】

６．１０．治療指標及び治療方法
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、宿主の免疫系の調節が有益である疾患状態、特に細胞免疫応答の抑制が望ましい状態を治療するのに有用である。したがって、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、様々な用途で免疫応答を抑制するために使用することができる。

【0209】

細胞免疫応答の抑制が望ましい状態としては、自己免疫応答に起因する疾患状態が挙げられ得る。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を投与することができる疾患状態は、例えば、細胞性自己免疫応答の抑制が重要なメカニズムである自己免疫疾患を含む。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を使用することができる特定の疾患状態には、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス、クローン病、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれる。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、それ自体又は任意の好適な薬学的組成物中で投与されてもよい。

【0210】

一態様では、医薬として使用するための本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用するための、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が提供される。ある特定の実施形態では、治療方法において使用するための本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が提供される。一実施形態では、本開示は、疾患の治療を必要とする対象における疾患の治療において使用するための、本明細書に記載のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法において使用するためのＣＤ２０－ＰＤ１結合分子であって、個体に、治療有効量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を投与することを含む、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、治療される疾患は、自己免疫疾患である。特定の実施形態では、疾患は、Ｔ１Ｄである。他の実施形態では、疾患は、全身性エリテマトーデスである。他の実施形態では、疾患はクローン病である。更に他の実施形態では、疾患は、ＧＶＨＤである。ある特定の実施形態では、方法は、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施形態では、本開示は、免疫系の抑制において使用するためのＣＤ２０－ＰＤ１結合分子アゴニストを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象における免疫系を抑制する方法において使用するためのＣＤ２０－ＰＤ１結合分子であって、免疫系を抑制するための有効量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を個体に投与することを含む、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を提供する。上記の実施形態のうちのいずれかによる「個体」は、哺乳類、例えばヒトである。上記の実施形態のうちのいずれかによる「免疫系の抑制」は、免疫機能の全般的な減少、Ｔ細胞機能の減少、Ｂ細胞機能の減少、Ｔ細胞応答性の減少などのうちのいずれか１つ以上を含み得る。上記の実施形態のうちのいずれかによる「細胞性自己免疫応答の抑制」には、例えば、免疫シグナル（例えば、免疫活性化サイトカインの分泌）の減少、自己抗原を標的とする免疫細胞の機能の減少などが含まれ得る。

【0211】

本開示は、本明細書に記載されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又は薬学的組成物を対象に投与することを含む、局所的ＰＤ１アゴニズムの方法を更に提供する。本明細書で使用される場合、「局所的送達される」という用語は、局所投与を必要とせず、むしろ、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、免疫調節の意図された部位、例えば、自己免疫活性の部位、及び／又は意図された細胞型、例えば、Ｂ細胞で選択的又は優先的に局在することを示す。

【0212】

本開示は、低減された全身曝露及び／又は低減された全身毒性を伴う対象にＰＤ１アゴニスト療法を施す方法であって、例えば、ＣＤ２０が、ＰＤ１アゴニスト療法が望ましい、及び／又は意図される組織によって発現される場合、本明細書に記載のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又は薬学的組成物の形態で、ＰＤ１アゴニスト療法を対象に施すことを含む、方法を更に提供する。

【0213】

したがって、前述の方法は、ＰＤ１アゴニスト治療を意図した部位にＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を優先的に送達することによって、オフターゲット副作用を低減したＰＤ１アゴニスト治療を可能にする。

【0214】

本開示は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又は本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、ＣＤ２０を発現する標的組織における免疫応答を局所的に調節する（例えば、阻害する）方法を更に提供する。

【0215】

いくつかの実施形態では、投与は、組織に対して局所的ではない。
更なる態様では、本開示は、疾患の治療を必要とする対象における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、疾患を有する対象に、治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。ある特定の実施形態では、治療される疾患は、自己免疫疾患である。特定の実施形態では、疾患は、Ｔ１Ｄである。他の実施形態では、疾患は、全身性エリテマトーデスである。他の実施形態では、疾患はクローン病である。更に他の実施形態では、疾患は、ＧＶＨＤである。ある特定の実施形態では、方法は、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施形態では、医薬は、免疫系を抑制するためのものである。更なる実施形態では、医薬は、対象における免疫系を抑制する方法であって、免疫系を抑制するのに有効な量の薬剤を個体に投与することを含む、方法において使用するためのものである。上記の実施形態のうちのいずれかによる「個体」は、哺乳類、例えばヒトであってもよい。上記の実施形態のうちのいずれかによる「免疫系の抑制」は、免疫機能の全般的な減少、Ｔ細胞機能の減少、Ｂ細胞機能の減少、Ｔ細胞応答性の減少などのうちのいずれか１つ以上を含み得る。

【0216】

更なる態様では、本開示は、有効量の本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を当該対象に投与することを含む、対象におけるＰＤ１をクラスター化し、かつ／又はＰＤ１活性を増強する方法を提供する。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、ＣＤ２０提示細胞及びＴ細胞の界面でのＰＤ１クラスター化を誘導することができる。これにより、標的免疫抑制をもたらし、ＣＤ２０を提示する細胞及び周囲の細胞及び組織は、Ｔ細胞死滅から保護される。高レベルのＣＤ２０は、流入領域リンパ節及び自己免疫組織（例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）における膵臓）に豊富に存在するＢ細胞上に見られる。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、細胞及び／又は組織特異的様式でＰＤ１を刺激し、自己反応性Ｔ細胞活性化を阻害することができる。Ｔ１Ｄでは、豊富なＣＤ２０＋Ｂ細胞によって、自己反応性Ｔ細胞上のＰＤ１のクラスター化をもたらし、自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞が膵島細胞を殺傷することを阻害する。一実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物が、当該対象に投与される。

【0217】

更なる態様では、本開示は、対象における自己免疫疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を当該個体に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、薬学的に許容可能な形態で本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を含む組成物は、当該個体に投与される。ある特定の実施形態では、治療される疾患は、自己免疫疾患である。本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子によって治療可能な自己免疫疾患としては、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、グッドパスチャー症候群、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜腎炎、抗尿細管基底膜腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、ベーチェット病、クローン病、デビック病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ドレスラー症候群、線維化性肺胞炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、多発ニューロパチー、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性症候群（ＰＯＥＭＳ）、結節性多発性動脈炎、関節リウマチ、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子又は精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、潰瘍性大腸炎、及び血管炎を挙げることができる。

【0218】

特定の実施形態では、疾患は、Ｔ１Ｄである。他の実施形態では、疾患は、全身性エリテマトーデスである。他の実施形態では、疾患はクローン病である。更に他の実施形態では、疾患は、ＧＶＨＤである。ある特定の実施形態では、方法は、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる態様では、本開示は、対象における免疫系を抑制するための方法であって、免疫系を抑制するための有効量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子を個体に投与することを含む、方法を提供する。上記の実施形態のうちのいずれかによる「個体」は、哺乳類、例えばヒトであってもよい。上記の実施形態のうちのいずれかによる「免疫系の抑制」は、免疫機能の全般的な減少、Ｔ細胞機能の減少、Ｂ細胞機能の減少、Ｔ細胞応答性の減少などのうちのいずれか１つ以上を含み得る。

【0219】

ある特定の実施形態では、治療される疾患は、自己免疫疾患である。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、免疫細胞媒介性障害、自己免疫、移植拒絶反応、及び移植片対宿主病に関与する細胞の除去に使用され得る。当業者は、多くの場合、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が治癒を提供せず、部分的な利益のみを提供し得ることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、何らかの利益を有する生理学的変化もまた、治療上有益であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、生理学的変化をもたらすＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の量は、「有効量」又は「治療有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳類、より具体的にはヒトである。

【0220】

疾患の予防又は治療のために、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の適切な投薬量（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、特定のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるか、以前又は同時の治療介入、患者の臨床歴及びＣＤ２０－ＰＤ１結合分子に対する応答、並びに主治医の判断に依存するであろう。いずれにせよ、投与の責任を担う医療者は、組成物中の活性成分（複数可）の濃度、及び個々の対象に対する適切な用量（複数可）を決定するであろう。様々な時点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが本明細書で企図される。

【0221】

ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、一度に又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。例えば、疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続注入によるかを問わず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、患者に投与するための最初の候補投薬量であり得る。典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲になる。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、病状に応じて、一般に、病徴の所望の抑制が生じるまで治療は継続されるであろう。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重又はそれ以上まで、及びそこから誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数値からの誘導可能な範囲の非限定的な例では、上記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量が患者に投与され得る。このような用量は、例えば、毎週又は３週間ごとに断続的に投与されてもよい（例えば、患者が約２回～約２０回、又は例えば約６回の用量のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の投与を受けるように）。最初に高い負荷用量を投与し、続いて１回以上のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

【0222】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するために使用するために、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子又はその薬学的組成物は、治療有効量で投与又は適用される。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0223】

全身投与のために、治療有効量は、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから最初に推定され得る。次いで、細胞培養で決定されるＥＣ_５０を含む循環濃度範囲を達成するために、用量が動物モデルで策定される。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用できる。

【0224】

初期用量はまた、当該技術分野で既知の技法を使用して、例えば、動物モデルなどのインビボデータから推定され得る。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるであろう。

【0225】

投薬量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の血漿レベルを提供するため個別に調節され得る。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療上有効な血漿レベルは、毎日複数回投与することによって達成され得る。血漿中のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ ＨＰＬＣによって測定され得る。

【0226】

局所投与又は選択的取り込みの場合、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しない場合がある。当業者は、過度の実験を行わずに、治療上有効な局所的投薬量を最適化することが可能であろう。

【0227】

本明細書に記載されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の治療有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供するであろう。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。細胞培養アッセイ及び動物試験を使用して、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死する用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％における治療上有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。大きい治療指標を示すＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が好ましい。一実施形態では、本開示によるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するのに好適な投薬量の範囲を策定する際に使用できる。投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く有しないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要因、例えば、用いられる剤形、利用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎ:Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0228】

本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子で治療された患者の主治医は、毒性、臓器機能障害などのために投与を終了、中断、又は調整する方法及び時期を承知しているであろう。逆に、臨床応答が適切でない場合（毒性を除く）、主治医は、治療をより高いレベルに調整する方法も知っているだろう。目的の障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度及び投与経路などによって変化するであろう。状態の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価され得る。更に、用量及びおそらく投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変化するであろう。

【0229】

６．１０．１．１型糖尿病
いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、１型糖尿病の発症又は進行を予防又は遅延させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、核酸、及び／又は薬学的組成物は、Ｔ１Ｄを有するか、又はＴ１Ｄを発症するリスクがある対象に投与することができる。Ｔ１Ｄを発症するための危険因子としては、遺伝的マーカー（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｐｏｃｉｏｔ，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ，３８７（１００３５）：２３３１－２３３９を参照）、ウイルス感染（例えば、風疹、コクサッキーウイルス、及びムンプス）、人種／民族性（例えば、米国では、白人は１型糖尿病によりかかりやすい）、家族歴、初期の食事、及びその他の自己免疫状態（例えば、グレーブス病、多発性硬化症、悪性貧血）の存在が挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤療法を受けているがん患者も、同様にＴ１Ｄを発症するリスクがある。ｄｅ Ｆｉｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１８１（３）：３６３－３７４を参照されたい。Ｔ１Ｄを発症するリスクのあるそれらの個体を特定し及び選択することは、当業者の範囲内である。

【0230】

いくつかの実施形態では、Ｔ１Ｄを発症する危険性のある患者は、本開示の方法に従って、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子、核酸、及び／又は薬学的組成物で治療される。
６．１１．組み合わせ療法
本開示によるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、治療において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする対象における症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又は細胞のアポトーシス誘導物質に対する感受性を増加させる薬剤である。

【0231】

このような活性成分は、好適には、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の量、障害又は治療のタイプ、及び上で論じた他の要因に依存する。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、一般に、本明細書に記載される同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約１～９９％で、又は経験的に／臨床的に適切であると判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0232】

上述のこのような組み合わせ療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に行われ得る。

【0233】

６．１１．１．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子療法及び免疫療法を使用した組み合わせ療法
本開示のＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、自己免疫疾患の治療において、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ（「ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ」）細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇと組み合わせて有利に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子中のＣＤ２０標的化部分によって認識される。ＣＤ２０標的化部分は、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞上のＴｒｅｇ細胞受容体又は別の細胞表面分子を認識することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子中のＣＤ２０標的化部分は、ＣＡＲの細胞外ドメイン、例えば、抗原結合ドメインに結合することができる。ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｒｉｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３８（１０）：１０９９－１１１２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：２３５９、及びＭｏｈｓｅｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１：１６０８に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0234】

６．１２．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の評価
本開示の態様は、ＨＥＫ２９３細胞上に提示されるＣＤ２０の存在下で、本明細書に開示されるＣＤ２０－ＰＤ１結合分子が、Ｊｕｒｋａｔ細胞上でＰＤ１を刺激する能力を評価するためのルシフェラーゼベースのレポーターバイオアッセイに関する。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＤ２２及びＣＤ２０で形質導入される。

【0235】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバイオアッセイは、レンチウイルスを使用したＡＰ１（アクチベーター－タンパク質１）－ルシフェラーゼレポーター、ＣＤ３及びＰＤ１で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株からの免疫応答を誘発するために、ＨＥＫ２９３細胞の存在下で二重特異性抗体（ＣＤ３×ＣＤ２２など）の使用することを含む。ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子は、Ｊｕｒｋａｔ及びＨＥＫ２９３細胞並びに抗ＣＤ３×ＣＤ２２二重特異性抗体の存在下でウェルに添加される。ＰＤ１を最適に刺激する分子は、ＡＰ１駆動ルシフェラーゼ活性によって測定した場合、抗ＣＤ３×ＣＤ２２二重特異性抗体によって刺激される免疫応答の量を低減する能力を有している。
７．実施例
７．１．材料及び方法
７．１．１．ＣＤ２０－ＰＤ１結合分子の設計及び産生
以下の表１及び２に示される二重特異性ＣＤ２０－ＰＤ１アゴニスト及び対照をコードする構築物を生成した。二重特異性ＣＤ２０－ＰＤ１アゴニストは、マウス抗ＣＤ２０の異なる構成及び改変マウスＰＤＬ１エクトドメイン、ＩｇＧ１エフェクターヌル（ＥＮ）（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ、ＥＵ番号付け）ドメイン、並びにＧ_４Ｓの異なる反復からの異なる長さのリンカー（配列番号１４）を含んでいた。マウス不活性チロシン－タンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ｍＲＯＲ１）からの２９－アミノ酸シグナル配列を、構築物のＮ末端に付加した。全ての二重特異性ＣＤ２０－ＰＤ１アゴニストを、シグナル配列を含有するプレタンパク質として発現させた。シグナル配列を細胞内プロセッシングによって切断して、成熟タンパク質を生成した。

【0236】

ノブ形成変異：Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）。
ホール形成変異：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）。
スター変異：Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）。

【0237】

【表3】

【0238】

構築物を、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞内で発現させた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ上清中のタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃカラム（Ｃｙｔｉｖａ）のいずれかを備えた、ＰｒｏｔｅｉｎＭａｋｅｒシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して精製した。単一ステップの溶出後、抗体を中和し、５％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の最終緩衝液に透析し、等分し、－８０℃で保存した。一部の構築物については、ＨｉＰｒｅｐ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーの追加のステップを使用した。

【0239】

ｍＰＤＬ１におけるアラインメント及び選択された変異位置を図３Ｂに示す。ｍＰＤＬ１とｈＰＤＬ１との間のアラインメントは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒを使用して生成した。図３Ａは、収量及び安定性を改善するためにｍＰＤＬ１において変更された残基を含む、ｍＰＤＬ１及びｈＰＤＬ１の三次元構造を示す。

【0240】

【表4-1】

【0241】

【表4-2】

【0242】

【表4-3】

【0243】

【表4-4】

【0244】

【表4-5】

【0245】

【表4-6】

【0246】

【表4-7】

【0247】

７．１．２．フローサイトメトリー
細胞（ＨＥＫ２９３、ｍＣＤ２０を過剰発現するＭＣ３８又はｍＰＤ１を過剰発現するＪｕｒｋａｔ）を、１×１０^６細胞／ｍＬでＦＡＣＳ洗浄液（１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。染色は、１ウェル当たり１×１０^５細胞で行った。抗体を１．３×１０^－０７Ｍの開始濃度から１：５の比で希釈した。次いで、希釈した抗体を細胞を含有するウェルに添加した。細胞を２～８℃で３０分間染色し、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した。ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－６０７－００３、１：４００）を添加し、２～８℃で３０分間細胞を染色した。洗浄後、細胞を２％のパラホルムアルデヒド中で２～８℃で３０分間固定した。２回洗浄した後、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）ＦＡＣＳ機器を使用して、染色細胞を分析した。結果をＦｌｏｗＪｏによって分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲートを使用して、単核細胞を選択した。

【0248】

脊髄Ｔ細胞浸潤フローサイトメトリー分析では、最初にコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ，１１０８８８８２００１）消化及びＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０８９１－０２）勾配分離によって、脊髄の単一細胞懸濁液を調製した。細胞をＦＡＣＳ洗浄液に再懸濁し、上記のプロトコルに従って、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３４９６２）、抗マウスＣＤ４５－ＢＶ７５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１０３１５７、１：２００希釈）、抗マウスＣＤ４－ＢＵＶ５６３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，６１２９２３、１：２００希釈）、及び抗マウスＣＤ８ａ－ＢＵＶ８０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５６４９２０、１：１００希釈）で染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒによって分析した。結果をＯＭＩＱサイトメトリーソフトウェアによって分析した。

【0249】

７．１．３．ルシフェラーゼレポーターアッセイ： 抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子
ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを使用して、ＨＥＫ２９３細胞上に提示されたマウスＣＤ２０（ｍＣＤ２０）の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ細胞上でマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を刺激する抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の能力を評価した。レポーターアッセイの全体的な設計を図５Ａ及びＢに示した。ＡＰ１は、Ｔ細胞活性化中の遺伝子発現の制御に関与する転写因子である（Ｓａｍｅｌｓｏｎ ２００２，ＰＭＩＤ：１１８６１６０７）。ヒトＣＤ３及びＣＤ２２に結合する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、ＣＤ３ ｂｓＡｂ（ＲＥＧＮ１０５５１）は、前述のＣＤ３×ＣＤ２０ ｂｓＡｂと同様に、標的細胞上の抗原とＴ細胞上の受容体の結合を介してＴ細胞の活性化を刺激するために使用される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＰＭＩＤ：２６６５９２７３）。ｍＣＤ２０アンカ型ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１を介したＪｕｒｋａｔ細胞上のｍＰＤ１の係合は、ＰＤ１アゴニズム駆動型のルシフェラーゼシグナルの阻害をもたらす。

【0250】

７．１．３．１．Ｊｕｒｋａｔ／ＡＰ１－ｌｕｃ／ｍＰＤ１細胞の操作
ＡＰ１（活性化タンパク質１）－ルシフェラーゼレポーターレンチウイルス（ＱＩＡＧＥＮ ＣＬＳ－０１１Ｌ）、続いてｍＰＤ１ＯＲＦ含有レンチウイルス（ｍＰＤ１ＮＭ＿００８７９８）を、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ－１５２）に連続形質導入することによって、Ｊｕｒｋａｔ／ＡＰ１－ｌｕｃ／ｍＰＤ１細胞を生成した。

【0251】

７．１．３．２．ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２２／ｍＣＤ２０細胞の操作
ヒトＣＤ２２ＯＲＦコードレンチウイルス（ＮＰ＿００１７６２．２）、続いてｍＣＤ２０ＯＲＦコードレンチウイルス（ＮＰ＿０３１６６７．１）を使用した連続レンチウイルス形質導入によってＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２２／ｍＣＤ２０細胞を生成した。

【0252】

７．１．３．３．ルシフェラーゼアッセイのセットアップ
バイオアッセイのために、ＨＥＫ２９３／ＣＤ２２／ｍＣＤ２０標的細胞をアッセイ培地（１０％ウシ胎児血清及びＬ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０）中の９６ウェルプレートに１０，０００又は２０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２中３７℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｊｕｒｋａｔ／ＡＰ１－ｌｕｃ／ｍＰＤ１レポーター細胞を、培養した標的細胞を含有するウェルに、３０，０００又は５０，０００細胞／ウェルで添加した。次いで、本開示又は対照抗体の分子を、１００ｎＭ～１ｐＭの範囲の最終濃度までアッセイ培地１：３で段階希釈し（試験分子を含まない追加の条件あり）、１ｎＭ又は２．５ｎＭのＣＤ３ｂｓＡｂとともに細胞に添加した。活性化の範囲を得るために、ＣＤ３ｂｓＡｂを、１００ｎＭ～１．６９ｐＭの範囲の最終濃度まで１：３で段階希釈し（二重特異性ｍＡｂを含まない追加の条件あり）、細胞に添加した。３７℃／５％ＣＯ^２で５時間のインキュベーション後、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬の添加の後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でルシフェラーゼ活性を検出した。全ての条件を、２連で試験した。

【0253】

非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアでＥＣ５０／ＩＣ５０値を決定した。阻害のパーセンテージは、次式を使用して相対発光単位（ＲＬＵ）値に基づいて計算した。

【0254】

【数1】

【0255】

この式では、「ＲＬＵベースライン」は、試験分子なしで一定量のＣＤ３ｂｓＡｂで処理された細胞からの発光値であり、「ＲＬＵ阻害」は、一定量のＣＤ３ｂｓＡｂを有する試験分子の最高濃度での発光値であり、「ＲＬＵバックグラウンド」は、ＣＤ３ｂｓＡｂ又は試験分子のない細胞からの発光値である。

【0256】

７．１．４．サイズ排除クロマトグラフィーによる抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子のオリゴマー化状態の決定
サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）を使用して、抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子のサイズの不均一性を評価した。ＳＥ－ＵＰＬＣ分析をＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステムで行い、各タンパク質試料１０μｇをＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍ）に注入し、流量を０．３ｍＬ／分に設定した。移動相緩衝液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含有した。溶出試料を、フォトダイオードアレイモジュールを使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。

【0257】

７．１．５．熱安定性
示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を用いて、抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の熱安定性を評価した。ＤＳＦ分析は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５システムで実施した。各試料のストック溶液を、１×ＰＢＳ－グリセロール、ｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに移した。タンパク質がアンフォールディングするときに、埋め込まれた疎水性残基に優先的に結合する過剰な（８×）Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（商標）蛍光色素を各ウェルに添加し、続いて、２０分間にわたって２５℃から９５℃までの直線的な温度上昇で熱安定性プロファイルを決定した。

【0258】

７．１．６．アセンブリのパーセント
二官能性融合分子のアセンブリは、製造業者のプロトコルに従い、Ｃｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でのハイスループット分析によってアッセイした。簡潔に述べると、試料緩衝液は、７ｍｌのＨＴタンパク質発現試料緩衝液を、２４０μｌのＢＭＥ（還元）又は２５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ、非還元アッセイ用）のいずれかと混合することによって調製した。試料を、試料緩衝液を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに正規化し、次いで７０℃で１０分間加熱した。７０μｌの水を各試料に添加してから、機器に装填した。チップは、製造業者の指示に従って調製した。試料の電気泳動図は、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアを使用して分析した。非還元電気泳動図からのピークは、無傷な抗体の％を示す。

【0259】

７．１．７．前糖尿病ＮＯＤマウスにおける抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の活性
生後１０週齢の前糖尿病非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、実験の期間中（例えば、マウス２８週齢まで）、１、０．１、又は０．０１ｍｇ／ｋｇの選択された抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子で週に２回腹腔内処理した。血糖を隔週でモニタリングし、体重を毎週モニタリングした。全体の実験計画を図７に示す。

【0260】

７．１．８．実験的自己免疫性脳脊髄炎／多発性硬化症マウスモデルにおける抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の活性
マウスへのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ_{３５－５５}）の免疫優性３５－５５エピトープの投与は、脱髄及び多発性硬化症（ＭＳ）の一般的に使用される動物モデルである慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を引き起こす抗ＭＯＧ抗体を産生する。

【0261】

ＥＡＥは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０～１２週、雄、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において、１日目にＣＦＡ中の２００ｍｇのＭＯＧ_{３５－５５}の皮下注射送達によって誘導された。百日咳毒素の投与が血液脳関門を弱めることによって中枢神経系へのＴ細胞の移動を促進することを考慮して、マウスにも、１日目及び２日目に２００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内注射した。体重とＥＡＥの発生を１日目、２日目、７日目、１０日目、１４日目、１８日目、２０日目にモニタリングした。ＥＡＥモニタリングスコアを次のように０～５のスケールで記録した：０：健康、１：尾の跛行、２：異常な歩行及び／又は正向反射欠陥、３：部分的な後肢麻痺、４：完全な後肢麻痺、５：完全な後肢及び部分的な前肢麻痺又は瀕死。

【0262】

２日目から開始して、マウスに、選択された抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子又は適切な対照分子の腹腔内注射を週に２回投与した。エンドポイント組織採取は、２０日目の疾患のピーク時に実施された。脊髄浸潤物をフローサイトメトリーに使用し、脾臓ＭＯＧ特異的Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴで評価した。

【0263】

７．２．実施例１：二重特異性抗ｍＣＤ２０－ｍＰＤＬ１エクトドメインアゴニストの産生と安定性
７．２．１．概要
個々の重鎖及び軽鎖のための哺乳類発現ベクターは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのｐｃＤＮＡ３．４Ｔｏｐｏ発現系におけるすぐに使用可能な構築物でのＤＮＡ合成及びクローニングによって作製した。分子を発現させるために、重鎖及びユニバーサル軽鎖のＤＮＡを製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に同時トランスフェクトした。５０ｍｌの細胞培養培地を採取し、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＦＦ又はＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して精製のために処理した。機能確認のために、選択されたＭＢＭを２Ｌまでスケールアップし、最終ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを含む一連の精製手順にかけた。

【0264】

７．２．２．結果
様々な抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子（図２Ａ）を発現させ、ワンステップＭａｂ－Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを介してＥｘｐｉ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（表４）から精製し、総収量は２．７～７．７ｍｇの範囲であった。一般に、１：１の原子価比（抗ｍＣＤ２０：ｍＰＤＬ１エクト）を有する分子は、２：１又は２：２のものよりも高い収量（４．１～７．７ｍｇ）を示した（表４）。

【0265】

【表5】

【0266】

１ステップの親和性精製後、高分子量（ＨＭＷ）％及びモノマー％をＳＥ－ＵＰＬＣによって検査し、熱安定性を示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）によってモニタリングした（表５）。抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン融合分子の大部分は、追加のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）なしで８５％を超えるモノマー種を示した（表３、図１の分子Ａ－Ｌ）。２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４（Ｌ）では、ＳＥＣステップを含む２つのカラム精製後、モノマーの割合は９９％に増加した（表５）。全ての抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン融合物は、約６０℃でＴｍ１を用いたＤＳＦによって測定された同様の熱安定性を有していた（表３）。更に、全ての二官能性融合物は、キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（ＣＥ－ＳＤＳ）によって決定された重鎖間の優れたアセンブリを有した（表５）。

【0267】

【表6】

【0268】

７．３．実施例２：抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の結合特性評価
細胞表面上の２つの標的に結合する抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の能力を、フロー結合アッセイで評価した。

【0269】

７．３．１．結果
結合曲線を図４Ａ及び図４Ｂに示す。ｍＰＤ１及びｍＣＤ２０結合の両方について、類似のフォーマットの一価分子と比較して、結合におけるより高い効力及び最大ＭＦＩが二価分子で観察された。特に、２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４（Ｌ）は、ＨＥＫ２９３／ｍＣＤ２０細胞に対して２＋１ ｍ２０＿ｍＰＬ＿３（Ｇ）（図４Ａ及び４Ｂ、表６）と同様の結合を共有したが、２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４（Ｌ）は、ｍＰＤ１結合に対する価数の増加の結果として、２＋１ ｍ２０＿ｍＰＬ＿３（Ｇ）よりもＪｕｒｋａｔ／ｍＰＤ１細胞に対する強い結合を示した。二価及び一価分子の両方にわたって、結合シグナルは配向依存的であるように見え、Ｆｃドメインに対してＮ末端抗ｍＣＤ２０及びｈＰＤＬ１エクトドメインの配向は、一般的により高い効力及び最大ＭＦＩを有する。抗ｍＣＤ２０又はｍＰＤＬ１エクトドメインは、Ｎ末端部分とＦｃの前のヒンジ領域との間に配置された場合、低減された結合を示した（図４Ａ及び４Ｂ、表６）。

【0270】

７．４．実施例３：抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子によるｍＰＤＬ１アゴニズム
図５に示され、セクション７．１．３に記載したバイオアッセイを利用して、抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子によるｍＰＤ１アゴニズムを研究した。

【0271】

７．４．１．結果
ルシフェラーゼアッセイの結果を図６及び表６に示す。本開示の１９個の分子を、ＣＤ３ ｂｓＡｂを有するＨＥＫ２９３／ＣＤ２２／ｍＣＤ２０及びＪｕｒｋａｔ／ＡＰ１－ｌｕｃ／ｍＰＤ１レポーター細胞を使用して、ＰＤ１アゴニズム及びそのＴ細胞シグナル伝達の調節について試験した。表６に示すように、本開示の１９個の分子のうち４つは、６５～７７０ｐＭの範囲のＩＣ５０値でＴ細胞シグナル伝達の阻害を示し、最大阻害は２７～８４％の範囲であった。分子２＋２ ｍ２０＿ＭＰＬ＿４及び２＋１ ｍ２０＿ＭＰＬ＿３（それぞれＧ及びＬ、表６）は、７４％～８４％の最大阻害で最も強いＰＤ１アゴニズムを示した（図６Ｃ及び６Ｅ）。１９個の分子のうち１５個が弱い阻害を示したか、又は阻害を示さず、最大阻害は－１０～４０％の範囲であった。アイソフォーム対照抗体は、シグナル伝達の阻害を示さなかった。ＣＤ３ ｂｓＡｂは、６２７ｐＭ及び１．１５ｎＭのＥＣ５０値でＴ細胞シグナル伝達の活性化を示した。

【0272】

７．５．実施例４：抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子を用いたインビトロアッセイのデータ概要
表６は、細胞ベースのフロー結合及びインビトロバイオアッセイ結果を含む様々な抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子で収集されたインビトロデータの概要を提供する。ルシフェラーゼアッセイからの結果を、図６Ａ～６Ｅに示す。分子２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４及び２＋１ ｍ２０＿ｍＰＬ＿３（表６中のそれぞれＧ及びＬ）は、最も強いＰＤ１アゴニズムを示した。細胞ベースのフロー分析によって、２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４は、ｍＰＤ１及びｍＣＤ２０への最強の結合を明らかにしたが、２＋１ ｍ２０＿ｍＰＬ＿３は、ｍＰＤ１発現細胞への中程度の結合のみを明らかにし、これはＡＰＣ及びエフェクター細胞の両方の存在下でのｍＣＤ２０の二価結合を介したｍＰＤ１のクラスター化が必要であることを示唆している。全体として、類似の細胞結合親和性（ｍＰＤ１又はｍＣＤ２０）は、類似のＰＤ１アゴニズム、例えば、Ｆ対Ｇ及びＫ対Ｌ（図６Ａ及び表６）、には変換されず、ＣＤ２０及びｍＰＤＬ１エクトドメインアームの原子価及び構造配置の両方が活性を付与するために重要であることを示した。

【0273】

【表7-1】

【0274】

【表7-2】

【0275】

７．６．実施例５：抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子のインビボ有効性
選択された２＋２及び２＋１ 抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子の、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症を予防する能力を、前糖尿病ＮＯＤマウスにおいて評価した。実験計画を図７に示し、セクション７．１．７で説明する。

【0276】

７．６．１．結果
個々の動物のデータを図８Ａ～８Ｉに示す。図９Ａ及び図９Ｂは、示された各時点での糖尿病のないマウスのパーセントを示す。通常、ＮＯＤマウスの８０～９０％が、２５週齢前後に糖尿病を発症する。しかし、この実験では、２７週までに約３０％のマウスのみが糖尿病を発症した。対照ＮＯＤマウスではより低い糖尿病発生率であったが、より高い用量の（２＋２）抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子、２＋２ｍ ２０＿ｍＰＬ＿４（図２Ａの分子Ｌ）では明確な保護する傾向があったが、（２＋１ 抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子、２＋１ ｍ２０＿ｍＰＬ＿３（図２Ａの分子Ｇ）ではそうではなかった（図９Ａ及び９Ｂ）。

【0277】

７．７．実施例６：抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子誘導による自己免疫Ｔ細胞浸潤の低減
Ｔ細胞の浸潤は、多発性硬化症（Ｋａｓｋｏｗ ａｎｄ Ｂａｅｃｈｅｒ－Ａｌｌａｎ，２０１８．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．８（４）：ａ０２９０２５）及び糖尿病の自己免疫モデル（Ｂｅｔｔｉｎｉ ａｎｄ Ｖｉｇｎａｌｉ，２０１１．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３（６）：７５４－７６０）などの自己免疫疾患の発症と関連している。Ｔ細胞浸潤に対する（２＋２）抗ｍＣＤ２０×ｍＰＤＬ１エクトドメイン分子、２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４の保護的役割を、セクション７．１．２に記載されるようにフローサイトメトリーによって評価した［マウスモデル由来の細胞を使用した実験に関連するフローサイトメトリー情報でセクション７．１．２を補足されたい］。

【0278】

７．７．１．結果
１つの評価では、０．１又は１ｍｇ／ｋｇの２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４又は対照分子を投与したセクション７．１．７に記載のＮＯＤマウスにおいて、増殖する（活性化された）及び活性化されていない膵島特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を分析した。１ｍｇ／ｋｇの２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４での処理は、活性化が低いＣＤ８＋Ｔ細胞クラスターの顕著なパーセントの増加と関連付けられた（図１０Ａ）。増殖している細胞のクラスターのパーセンテージは、条件全体で違いがなかったが（図１０Ｂ）、活性化が低く及び増殖の少ない細胞のクラスターの割合は、１ｍｇ／ｋｇの２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４（図１０Ｃ）で処理したＮＯＤマウスから単離された膵臓組織においてより高く、この処理が活性化された自己免疫Ｔ細胞の膵臓浸潤を低減することができたことを示した。

【0279】

別の評価では、Ｔ細胞の脊髄浸潤が、セクション７．１．８に記載されている多発性硬化症のマウスモデルで評価された。１ｍｇ／ｋｇの２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４で処理したマウスの脊髄では、同じ投薬量で対照処理を受けたマウスの脊髄と比較して、ＣＤ３＋（図１１Ａ）、ＣＤ４＋（図１１Ｂ）、及びＣＤ８＋（図１１Ｃ）Ｔ細胞はかなり少なかった。したがって、２＋２ ｍ２０＿ｍＰＬ＿４での処理は、多発性硬化症モデルにおいてＴ細胞の脊髄浸潤を低減することができた。

【0280】

８．具体的な実施形態、参考文献の引用
様々な具体的な実施形態を例示し、記載してきたが、本開示（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。本開示は、以下に記載される番号付き実施形態によって例示される。

【0281】

１．タンパク質であって、
（ａ）少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分と、
（ｂ）少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分と、
（ｃ）少なくとも１つの二量体化部分と、
（ｄ）任意選択で、タンパク質中の１つ以上の部分を分離する１つ以上のリンカー部分と、を含み、
任意選択で、ここで、
（ｉ）タンパク質の部分は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ２０標的化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－二量体化部分の順に配置されているか、
（ｉｉ）タンパク質の部分は、Ｎ末端からＣ末端に、二量体化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－ＣＤ２０標的化部分の順に配置されているか、
（ｉｉｉ）ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分であり、二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、Ｆａｂの軽鎖は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分に融合していないか、
（ｉｖ）ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分であり、二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にないか、
（ｖ）ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分であり、二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＦｃドメインのＣ末端にないか、
（ｖｉ）ＣＤ２０標的化部分は、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分は、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分であり、二量体化部分は、Ｆｃドメインであり、タンパク質は、ＣＤ２０標的化部分及び／若しくはＰＤ１アゴニスト部分に対して一価であるか、
（ｖｉｉ）タンパク質が、非対称であるか、
（ｖｉｉｉ）タンパク質が、Ｆｃヘテロ二量体を含むか、又は
（ｉｘ）前述の（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせである、タンパク質。

【0282】

２．少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片である、実施形態１に記載のタンパク質。
３．抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖの形態にある、実施形態２に記載のタンパク質。

【0283】

４．抗ＣＤ２０抗体が、
（ａ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブのＣＤＲ配列を有する相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、
（ｂ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブの６つ全てのＣＤＲ配列、
（ｃ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブの少なくとも重鎖ＣＤＲ配列（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、及びユニバーサル軽鎖の軽鎖ＣＤＲ配列、
（ｄ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブのＶＨのアミノ酸配列を含むＶＨ、及び同じ抗体のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、若しくはベルツズマブのＶＨのアミノ酸配列を含むＶＨ、及びユニバーサル軽鎖ＶＬ配列を含むＶＬ、を含む、実施形態２又は実施形態３のタンパク質。

【0284】

５．抗ＣＤ２０抗体が、
（ａ）ＣＤ２０のトポロジカルドメイン、
（ｂ）ＣＤ２０の膜貫通ドメイン、又は
（ｃ）細胞（例えば、Ｂ細胞）の表面上の細胞外に表示されたＣＤ２０の領域、に結合する、実施形態２又は実施形態３のタンパク質。

【0285】

６．抗ＣＤ２０抗体が、
（ａ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブから選択され
（ｂ）リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブイツキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＴＲＵ－０１５、及びベルツズマブから選択される抗ＣＤ２０抗体とＣＤ２０との結合に関して競合し、かつ／若しくは抗ＣＤ２０抗体と同じエピトープに結合する、実施形態２又は実施形態３のタンパク質。

【0286】

７．少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態１～６のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0287】

８．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７に記載のタンパク質。

【0288】

９．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７に記載のタンパク質。

【0289】

１０．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７に記載のタンパク質。

【0290】

１１．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７に記載のタンパク質。

【0291】

１２．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分のアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７に記載のタンパク質。

【0292】

１３．ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分が、ヒトＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４又はマウスＰＤＬ１のアミノ酸１９～１３４を含む、実施形態７～１２のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0293】

１４．ＰＤＬ１の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分が、ＰＤＬ１エクトドメインを含むか、又はそれからなり、任意選択で、ＰＤＬ１が、ヒトＰＤＬ１又はマウスＰＤＬ１である、実施形態７～１２のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0294】

１５．少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１～６のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0295】

１６．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５に記載のタンパク質。

【0296】

１７．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５に記載のタンパク質。

【0297】

１８．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ１がヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５に記載のタンパク質。

【0298】

１９．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５に記載のタンパク質。

【0299】

２０．ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分のアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５に記載のタンパク質。

【0300】

２１．ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分が、ヒトＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１又はマウスＰＤＬ２のアミノ酸２０～１２１を含む、実施形態１５～２０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0301】

２２．ＰＤＬ２の細胞外ドメインのＰＤ１結合部分が、ＰＤＬ２エクトドメインを含むか、又はそれからなり、任意選択で、ＰＤＬ２が、ヒトＰＤＬ２又はマウスＰＤＬ２である、実施形態１５～２０のいずれか１つのタンパク質。

【0302】

２３．１つ以上のリンカー部分を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のタンパク質。
２４．少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分が、リンカー部分によって分離される、実施形態２３に記載のタンパク質。

【0303】

２５．少なくとも１つのＣＤ２０標的化部分及び少なくとも少なくとも１つの二量体化部分が、リンカー部分によって分離される、実施形態２３又は実施形態２４に記載のタンパク質。

【0304】

２６．少なくとも１つのＰＤ１アゴニスト部分及び少なくとも少なくとも１つの二量体化部分が、リンカー部分によって分離される、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0305】

２７．各リンカー部分が、（ａ）少なくとも５若しくは少なくとも１０アミノ酸長であり、（ｂ）最大２０、最大２５若しくは最大３０アミノ酸長であり、かつ／又は（ｃ）５～１５アミノ酸若しくは５～２０アミノ酸長である、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0306】

２８．少なくとも１つのリンカー部分が、グリシン－セリンリンカーを含む、実施形態２１～２７のいずれか１つに記載のタンパク質。
２９．グリシン－セリンリンカーが、配列Ｇ_４Ｓ（配列番号１４）又はその多量体を含む、実施形態２８のタンパク質。

【0307】

３０．多量体が、アミノ酸配列Ｇ_４Ｓの２、３、４、５、又はそれ以上の反復（配列番号５６）を含む、実施形態２９に記載のタンパク質。
３１．例示的なモノマー１によるモノマー及び例示的なモノマー２によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0308】

３２．例示的なモノマー１が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態３１に記載のタンパク質。

【0309】

３３．例示的なモノマー１が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態３０に記載のタンパク質。
３４．例示的なモノマー１が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態３０に記載のタンパク質。

【0310】

３５．例示的なモノマー２が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態２９～３４のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0311】

３６．図１Ａに示される構成を有する、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載のタンパク質。
３７．例示的なモノマー３によるモノマー及び例示的なモノマー４によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0312】

３８．例示的なモノマー３が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態３７に記載のタンパク質。
３９．例示的なモノマー４が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態３７又は実施形態３８に記載のタンパク質。

【0313】

４０．例示的なモノマー４が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態３９に記載のタンパク質。
４１．例示的なモノマー４が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態３９に記載のタンパク質。

【0314】

４２．図１Ｂに示される構成を有する、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載のタンパク質。
４３．例示的なモノマー３によるモノマー及び例示的なモノマー５によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0315】

４４．例示的なモノマー３が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態４３に記載のタンパク質。
４５．例示的なモノマー５が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）を含むか、又はそれらからなる、実施形態４３又は実施形態４４に記載のタンパク質。

【0316】

４６．例示的なモノマー５が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態４５に記載のタンパク質。
４７．例示的なモノマー５が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態４５に記載のタンパク質。

【0317】

４８．図１Ｃに示される構成を有する、実施形態４３～４７のいずれか１つに記載のタンパク質。
４９．例示的なモノマー３によるモノマー及び例示的なモノマー６によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0318】

５０．例示的なモノマー３が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態４９に記載のタンパク質。
５１．例示的なモノマー６が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態４９又は実施形態５０に記載のタンパク質。

【0319】

５２．例示的なモノマー６が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載のタンパク質。
５３．例示的なモノマー６が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0320】

５４．図１Ｄに示される構成を有する、実施形態４９～５３のいずれか１つに記載のタンパク質。
５５．例示的なモノマー１によるモノマー及び例示的なモノマー４によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0321】

５６．例示的なモノマー１が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態５５に記載のタンパク質。

【0322】

５７．例示的なモノマー１が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態５６に記載のタンパク質。
５８．例示的なモノマー１が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態５６に記載のタンパク質。

【0323】

５９．例示的なモノマー４が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態５５～５８のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0324】

６０．例示的なモノマー４が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態５９に記載のタンパク質。
６１．例示的なモノマー４が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態５９に記載のタンパク質。

【0325】

６２．図１Ｅに示される構成を有する、実施形態５５～６１のいずれか１つに記載のタンパク質。
６３．例示的なモノマー１によるモノマー及び例示的なモノマー５によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0326】

６４．例示的なモノマー１が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態６３に記載のタンパク質。

【0327】

６５．例示的なモノマー１が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態６４に記載のタンパク質。
６６．例示的なモノマー１が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態６４に記載のタンパク質。

【0328】

６７．例示的なモノマー５が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）を含むか、又はそれらからなる、実施形態６３～６６のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0329】

６８．例示的なモノマー５が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態６７に記載のタンパク質。
６９．例示的なモノマー５が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態６７に記載のタンパク質。

【0330】

７０．図１Ｆに示される構成を有する、実施形態６３～６９のいずれか１つに記載のタンパク質。
７１．例示的なモノマー１によるモノマー及び例示的なモノマー６によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0331】

７２．例示的なモノマー１が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態７１に記載のタンパク質。

【0332】

７３．例示的なモノマー１が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態７２に記載のタンパク質。
７４．例示的なモノマー１が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態７２に記載のタンパク質。

【0333】

７５．例示的なモノマー６が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0334】

７６．例示的なモノマー６が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態７５に記載のタンパク質。
７７．例示的なモノマー６が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態７５に記載のタンパク質。

【0335】

７８．図１Ｇに示される構成を有する、実施形態７１～７７のいずれか１つに記載のタンパク質。
７９．例示的なモノマー１によるモノマー及び例示的なモノマー７によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0336】

８０．例示的なモノマー１が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態７９に記載のタンパク質。

【0337】

８１．例示的なモノマー１が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態８０に記載のタンパク質。
８２．例示的なモノマー１が、２つのポリペプチド鎖から構成される、実施形態８０に記載のタンパク質。

【0338】

８３．例示的なモノマー７が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態７９～８２のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0339】

８４．図１Ｈに示される構成を有する、実施形態７９～８３のいずれか１つに記載のタンパク質。
８５．例示的なモノマー４による２つのモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0340】

８６．各例示的なモノマー４が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態８５に記載のタンパク質。

【0341】

８７．各例示的なモノマー４が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態８６に記載のタンパク質。
８８．各例示的なモノマー４が、２つのポリペプチド鎖で構成される、実施形態８６に記載のタンパク質。

【0342】

８９．図１Ｉに示される構成を有する、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載のタンパク質。
９０．例示的なモノマー５による２つのモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0343】

９１．各例示的なモノマー５が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、及びＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）を含むか、又はそれらからなる、実施形態９０に記載のタンパク質。

【0344】

９２．各例示的なモノマー５が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態９１に記載のタンパク質。
９３．各例示的なモノマー５が、２つのポリペプチド鎖で構成される、実施形態９１に記載のタンパク質。

【0345】

９４．図１Ｊに示される構成を有する、実施形態９０～９３のいずれか１つに記載のタンパク質。
９５．例示的なモノマー８によるモノマー及び例示的なモノマー９によるモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0346】

９６．例示的なモノマー８が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、任意選択的リンカー部分、及びＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）を含むか、又はそれらからなる、実施形態９５に記載のタンパク質。

【0347】

９７．各例示的なモノマー８が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態９６に記載のタンパク質。
９８．各例示的なモノマー８が、２つのポリペプチド鎖で構成される、実施形態９６に記載のタンパク質。

【0348】

９９．各例示的なモノマー８が、３つのポリペプチド鎖で構成される、実施形態９６に記載のタンパク質。
１００．例示的なモノマー９が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、二量体化部分、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）を含むか、又はそれらからなる、実施形態９５～９９のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0349】

１０１．図１Ｋに示される構成を有する、実施形態９５～１００のいずれか１つに記載のタンパク質。
１０２．例示的なモノマー６による２つのモノマーを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0350】

１０３．例示的なモノマー６が、Ｎ末端からＣ末端の配向で、ＣＤ２０標的化部分（例えば、抗ＣＤ２０Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶ）、任意選択的リンカー部分、ＰＤ１アゴニスト部分（例えば、（ｉ）ＰＤＬ１若しくはＰＤＬ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列、（ｉｉ）ＰＤ１に結合可能な（ｉ）の断片、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む部分）、任意選択的リンカー部分、及び二量体化部分を含むか、又はそれらからなる、実施形態１０２に記載のタンパク質。

【0351】

１０４．各例示的なモノマー６が、単一のポリペプチド鎖から構成される、実施形態１０３に記載のタンパク質。
１０５．各例示的なモノマー６が、２つのポリペプチド鎖で構成される、実施形態１０３に記載のタンパク質。

【0352】

１０６．図１Ｌに示される構成を有する、実施形態１０２～１０４のいずれか１つに記載のタンパク質。
１０７．１つのＣＤ２０標的化部分を含む、実施形態１～５４及び７９～８４のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0353】

１０８．１つのＰＤ１アゴニスト部分を含む、実施形態１０７に記載のタンパク質。
１０９．図１Ａに示される構成を有する、実施形態１０８に記載のタンパク質。
１１０．図１Ｂに示される構成を有する、実施形態１０８に記載のタンパク質。

【0354】

１１１．図１Ｃに示される構成を有する、実施形態１０８に記載のタンパク質。
１１２．図１Ｄに示される構成を有する、実施形態１０８に記載のタンパク質。
１１３．２つのＰＤ１アゴニスト部分を含む、実施形態１０７に記載のタンパク質。

【0355】

１１４．２つのＰＤ１アゴニスト部分が同一である、実施形態１１３に記載のタンパク質。
１１５．図１Ｈに示される構成を有する、実施形態１１３又は実施形態１１４に記載のタンパク質。

【0356】

１１６．２つのＣＤ２０標的化部分を含む、実施形態１～１０６のいずれか１つに記載のタンパク質。
１１７．２つのＣＤ２０標的化部分が同一である、実施形態１１６に記載のタンパク質。

【0357】

１１８．１つのＰＤ１アゴニスト部分を含む、実施形態１１６又は実施形態１１７に記載のタンパク質。
１１９．図１Ｅに示される構成を有する、実施形態１１８に記載のタンパク質。

【0358】

１２０．図１Ｆに示される構成を有する、実施形態１１８に記載のタンパク質。
１２１．図１Ｇに示される構成を有する、実施形態１１８に記載のタンパク質。
１２２．２つのＰＤ１アゴニスト部分を含む、実施形態１１６又は実施形態１１７に記載のタンパク質。

【0359】

１２３．２つのＰＤ１アゴニスト部分が同一である、実施形態１２２に記載のタンパク質。
１２４．図１Ｉに示される構成を有する、実施形態１２２又は実施形態１２３に記載のタンパク質。

【0360】

１２５．図１Ｊに示される構成を有する、実施形態１２２又は実施形態１２３に記載のタンパク質。
１２６．図１Ｋに示される構成を有する、実施形態１２２又は実施形態１２３に記載のタンパク質。

【0361】

１２７．図１Ｌに示される構成を有する、実施形態１２２又は実施形態１２３に記載のタンパク質。
１２８．ＣＤ２０標的化部分が、ヒトＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、実施形態１～１２７のいずれか１つに記載の分子。

【0362】

１２９．ＰＤ１アゴニスト部分が、ヒトＰＤ１を刺激する、実施形態１～１２８のいずれか１つに記載の分子。
１３０．ＣＤ２０標的化部分が、マウスＣＤ２０の細胞外ドメインに結合する、実施形態１～１２７のいずれか１つに記載の分子。

【0363】

１３１．ＰＤ１アゴニスト部分が、マウスＰＤ１を刺激する、実施形態１～１２７及び１３０のいずれか１つに記載の分子。
１３２．少なくとも１つの二量体化部分が、Ｆｃドメインであるか、又はそれを含む、実施形態１～１３１のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0364】

１３３．Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、実施形態１３２に記載のタンパク質。
１３４．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、実施形態１３２又は実施形態１３３に記載のタンパク質。

【0365】

１３５．Ｆｃドメインが、低減されたエフェクター機能を有する、実施形態１３２～１３４のいずれか１つに記載のタンパク質。
１３６．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４Ｆｃドメインである、実施形態１３２～１３５のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0366】

１３７．Ｆｃドメインが、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３２）又はその一部を含む、実施形態１３２～１３６のいずれか１つに記載のタンパク質。

【0367】

１３８．Ｆｃ二量体を含む、実施形態１３２～１３７のいずれか１つに記載のタンパク質。
１３９．Ｆｃ二量体が、Ｆｃホモ二量体である、実施形態１３８に記載のタンパク質。

【0368】

１４０．Ｆｃ二量体が、Ｆｃヘテロ二量体である、実施形態１３８に記載のタンパク質。
１４１．Ｆｃヘテロ二量体が、ノブ・イン・ホール変異を含む、実施形態１４０に記載のタンパク質。

【0369】

１４２．Ｆｃヘテロ二量体が、スター変異を含む、実施形態１４０又は実施形態１４１に記載のタンパク質。
１４３．タンパク質の部分が、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ２０標的化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－二量体化部分の順に配置されている、実施形態１に記載のタンパク質。

【0370】

１４４．タンパク質の部分が、Ｎ末端からＣ末端に、二量体化部分－ＰＤ１アゴニスト部分－ＣＤ２０標的化部分の順に配置されている、実施形態１に記載のタンパク質。
１４５．ＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分が、Ｆｃドメインであり、Ｆａｂの軽鎖が、ＰＤＬ１のエクトドメイン又はそのＰＤ１結合部分に融合されていない、実施形態１に記載のタンパク質。

【0371】

１４６．ＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分がＦｃドメインであり、ＰＤ１アゴニスト部分が抗ＣＤ２０ＦａｂのＶＨのＮ末端にない、実施形態１に記載のタンパク質。

【0372】

１４７．ＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分が、Ｆｃドメインであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＦｃドメインのＣ末端にない、実施形態１に記載のタンパク質。

【0373】

１４８．ＣＤ２０標的化部分が、抗ＣＤ２０Ｆａｂであり、ＰＤ１アゴニスト部分が、ＰＤＬ１のエクトドメインであり、二量体化部分が、Ｆｃドメインであり、タンパク質が、ＣＤ２０標的化部分及び／又はＰＤ１アゴニスト部分に対して一価である、実施形態１に記載のタンパク質。

【0374】

１４９．タンパク質が、非対称である、実施形態１に記載のタンパク質。
１５０．実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする、核酸又は複数の核酸。

【0375】

１５１．実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５０に記載の核酸（複数可）を発現するように操作された、宿主細胞。
１５２．実施形態１５１の宿主細胞を培養し、それによって発現されたタンパク質を回収することを含む、実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質を産生する、方法。

【0376】

１５３．実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質及び賦形剤を含む、薬学的組成物。
１５４．Ｔ細胞調節不全に関連する免疫障害又は状態に罹患している対象を治療する方法であって、対象に、有効量の実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。

【0377】

１５５．免疫障害又は状態が、１型糖尿病、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、グッドパスチャー症候群、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜腎炎、抗尿細管基底膜腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、ベーチェット病、クローン病、デビック病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ドレスラー症候群、線維化性肺胞炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、多発ニューロパチー、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性症候群（ＰＯＥＭＳ）、結節性多発性動脈炎、関節リウマチ、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子又は精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、又は血管炎である、実施形態１５４に記載の方法。

【0378】

１５６．免疫障害又は状態が、１型糖尿病である、実施形態１５４に記載の方法。
１５７．１型糖尿病が、小児発症１型糖尿病である、実施形態１５６に記載の方法。
１５８．１型糖尿病が、成人発症１型糖尿病である、実施形態１５６に記載の方法。

【0379】

１５９．対象が、小児患者である、実施形態１５６に記載の方法。
１６０．対象が、成人患者である、実施形態１５６～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【0380】

１６１．免疫障害又は状態が、全身性エリテマトーデスである、実施形態１５４に記載の方法。
１６２．免疫障害又は状態が、クローン病である、実施形態１５４に記載の方法。

【0381】

１６３．免疫障害又は状態が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、実施形態１５４に記載の方法。
１６４．実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３に記載の薬学的組成物が、単回用量として投与される、実施形態１５４～１６３のいずれか１つに記載の方法。

【0382】

１６５．実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３に記載の薬学的組成物の投与が、繰り返されない、実施形態１５４～１６４のいずれか１つに記載の方法。

【0383】

１６６．方法が、対象における細胞免疫応答を抑制する、実施形態１５４～１６５のいずれか１つに記載の方法。
１６７．方法が、対象の免疫系を抑制する、実施形態１６６に記載の方法。

【0384】

１６８．方法が、対象におけるＴ細胞機能を減少させる、実施形態１６７に記載の方法。
１６９．方法が、対象におけるＢ細胞機能を減少させる、実施形態１６７に記載の方法。

【0385】

１７０．方法が、対象におけるＴ細胞応答性を減少させる、実施形態１６７に記載の方法。
１７１．対象における細胞性自己免疫応答を抑制する方法であって、有効量の、実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。

【0386】

１７２．方法が、対象におけるＴ細胞機能を減少させる、実施形態１７１に記載の方法。
１７３．方法が、対象におけるＢ細胞機能を減少させる、実施形態１７１に記載の方法。

【0387】

１７４．方法が、対象におけるＴ細胞応答性を減少させる、実施形態１７１に記載の方法。
１７５．追加の治療剤を対象に投与することを更に含む、実施形態１５４～１７４のいずれか１つに記載の方法。

【0388】

１７６．追加の治療剤が、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又は細胞のアポトーシス誘導剤に対する感受性を増加させる薬剤であるか、又はそれらを含む、実施形態１７５に記載の方法。

【0389】

１７７．追加の治療剤が、ＣＡＲ発現細胞であるか、又はそれを含む、実施形態１７５に記載の方法。
１７８．ＣＡＲ発現細胞が、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ細胞である、実施形態１７７に記載の方法。

【0390】

１７９．有効量の実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３の薬学的組成物を対象に投与することを含む、局所的なＰＤ１アゴニズムの方法。
１８０．タンパク質又は薬学的組成物を投与することが、対象のＢ細胞にＰＤ１アゴニズムを局在させる、実施形態１７９に記載の方法。

【0391】

１８１．ＣＤ２０を発現する標的組織又は細胞における免疫応答を局所的に調節する方法であって、有効量の実施形態１～１４９のいずれか１つに記載のタンパク質又は実施形態１５３に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。

【0392】

１８２．タンパク質又は薬学的組成物を投与することが、対象のＢ細胞における免疫応答を調節する、実施形態１８１に記載の方法。
１８３．ＰＤ１を刺激する分子Ｉ型の能力を特徴付ける方法であって、
（ａ）ＣＤ３を安定的に発現し、ＡＰ１－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現し、かつＰＤ１を安定的に発現する細胞Ｉ型を、ＣＤ２２を安定的に発現し、ＣＤ２０を安定的に発現する細胞ＩＩ型とともに培養することと、
（ｂ）分子Ｉ型及び分子ＩＩ型の存在下又は非存在下で、ステップａ）の培養細胞をインキュベートすることと、
（ｃ）ステップｂ）の後、培養細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することと、を含み、分子Ｉ型が、ｉ）ＣＤ２０のエクトドメインに結合する第１の結合特異性、及びｉｉ）ＰＤ１に結合する第２の結合特異性を含む、多重特異性抗原結合分子であり、分子ＩＩ型が、ｉ）ＣＤ３のエクトドメインに結合する第１の結合特異性、及びｉｉ）ＣＤ２２のエクトドメインに結合する第２の結合特異性を含む、多重特異性抗原結合分子であり、分子ＩＩ型の存在は、ルシフェラーゼ活性の増加を引き起こし、分子Ｉ型の存在は、分子ＩＩ型によって引き起こされたルシフェラーゼ活性の低減を引き起こし、ルシフェラーゼ活性の低減の量は、分子Ｉ型が、ＰＤ１を刺激する能力を示す、方法。

【0393】

１８４．ＰＤ１が、ｍＰＤ１である、実施形態１８３に記載の方法。
１８５．細胞Ｉ型が、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞である、実施形態１８３に記載の方法。

【0394】

１８６．細胞Ｉ型が、ＡＰ１－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように形質導入される、実施形態１８３に記載の方法。
１８７．細胞Ｉ型が、ＰＤ１遺伝子を発現するように形質導入される、実施形態１８３に記載の方法。

【0395】

１８８．細胞Ｉ型が、レンチウイルスで形質導入される、実施形態１８６又は１８７に記載の方法。
１８９．ＣＤ２０が、ｍＣＤ２０である、実施形態１８３に記載の方法。

【0396】

１９０．細胞ＩＩ型が、ＨＥＫ２９３細胞である、実施形態１８３に記載の方法。
１９１．細胞ＩＩ型が、ＣＤ２２を発現するように形質導入される、実施形態１８３に記載の方法。

【0397】

１９２．細胞ＩＩ型が、ＣＤ２０遺伝子を発現するように形質導入される、実施形態１８３に記載の方法。
１９３．細胞ＩＩ型が、レンチウイルスで形質導入される、実施形態１９１又は１９２に記載の方法。

【0398】

１９４．細胞ＩＩ型の細胞が、細胞Ｉ型の細胞の前に播種された、実施形態１８３に記載の方法。
１９５．培養細胞が、分子ＩＩ型の存在下で、対照抗体分子の存在下で、及び分子Ｉ型の非存在下でインキュベートされる、実施形態１８３に記載の方法。

【0399】

１９６．培養細胞が、分子Ｉ型及び分子ＩＩ型の存在下でインキュベートされる、実施形態１８３に記載の方法。
１９７．Ｉ型の分子が、ＰＤＬ１のエクトドメインを含む、実施形態１８３に記載の方法。

【0400】

本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が、全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に組み込まれる参照のうちの１つ以上の教示と本開示との間に矛盾がある場合には、本明細書の教示が意図される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【配列表】

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【国際調査報告】