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特表2024-544544抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241126BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241126BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241126BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241126BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241126BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241126BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20241126BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/705
C07K16/24
C12N15/62
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N15/24
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/09 Z
A61K39/395 N
A61P29/00
A61P17/00
A61P27/02
A61P17/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527702
(86)(22)【出願日】2022-11-10
(85)【翻訳文提出日】2024-07-09
(86)【国際出願番号】 CN2022131063
(87)【国際公開番号】W WO2023083243
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】202111335581.0
(32)【優先日】2021-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510277073
【氏名又は名称】三生国健薬業（上海）股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮＳＨＩＮＥ ＧＵＯＪＩＡＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ ＩＣＡＬ（ＳＨＡＮＧＨＡＩ）ＣＯ．，ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100112737
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴
(74)【代理人】
【識別番号】100136168
【弁理士】
【氏名又は名称】川上 美紀
(74)【代理人】
【識別番号】100196117
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 利恵
(72)【発明者】
【氏名】トウ▲嵐▼
(72)【発明者】
【氏名】黄浩旻
(72)【発明者】
【氏名】朱▲禎▼平
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼利芬
(72)【発明者】
【氏名】王立花
(72)【発明者】
【氏名】孟▲運▼
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、融合タンパク質の技術分野に関し、特に、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその使用に関する。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質は、抗ＩＬ－１７抗体と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質とを含む。ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲである。ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、直接的又はコネクソンを介して抗ＩＬ－１７抗体に連結される。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質は、ＩＬ－１７及びＶＥＧＦのシグナル経路を同時に阻害可能である。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質は、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療薬物の製造に使用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＩＬ－１７抗体と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質とを含み、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲであり、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、直接的又はコネクソンを介して前記抗ＩＬ－１７抗体に連結されることを特徴とする抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲの細胞外領域であり、好ましくは、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１の細胞外領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインであることを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖は相補性決定領域ＨＣＤＲ１～３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す通りであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：１５に示す通りであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示す通りであり、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖は相補性決定領域ＬＣＤＲ１～３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７に示す通りであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示す通りであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示す通りであり、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：２１に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項6】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであり、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項7】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインは野生型又は突然変異体であり、野生型ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示す通りであることを特徴とする請求項３に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項8】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位が突然変異して形成されたものであることを特徴とする請求項７に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項9】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位が置換変異して形成されたものであることを特徴とする請求項７に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項10】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、１３８Ｍ／Ａ、１３８Ｍ／Ｐ又は１３８Ｍ／Ｔから選択されることを特徴とする請求項７に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項11】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結され、或いは、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結されることを特徴とする請求項３に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項12】
前記二機能性融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、前記二機能性融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項14】
前記核酸分子は、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の重鎖の核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３をコードし、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の軽鎖の核酸配列ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９をコードすることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項15】
請求項１３又は１４に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項16】
請求項１５に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の製造方法であって、発現条件において、請求項１６に記載の宿主細胞を培養することで、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を発現するステップａ）と、
ステップａ）の前記融合タンパク質を分離及び精製するステップｂ）と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項18】
有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、１種類又は複数種類の薬学的に許容可能な担体又は添加物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項19】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質、請求項１８に記載の医薬組成物の、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療薬物の製造における使用。
【請求項20】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質、請求項１８に記載の医薬組成物の、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患の治療薬物の製造における使用であって、好ましくは、前記炎症性皮膚疾患は乾癬であり、及び／又は、前記眼科疾患は、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患又は黄斑変性から選択される使用。
【請求項21】
ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療方法であって、必要な被検者に対し、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二機能性融合タンパク質又は請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項22】
前記ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病は、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患から選択され、好ましくは、前記炎症性皮膚疾患は乾癬であり、及び／又は、前記眼科疾患は、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患又は黄斑変性から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、融合タンパク質の技術分野に関し、特に、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン１７（ＩＬ－１７）は炎症性サイトカインの一種であって、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）から主に分泌されるほか、Ｔ細胞や、肥満細胞及び好中球といった先天性免疫細胞からもわずかに分泌される。ＩＬ－１７ファミリーには６つのメンバー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＡ／Ｆ）があり、ホモ又はヘテロ二量体形式で存在する。また、ＩＬ－１７受容体には、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－１７ＲＤ、ＩＬ－１７ＲＥ及びＳＥＦがある。上記のうち、ホモ二量体ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ及びヘテロ二量体ＩＬ－１７Ａ／Ｆが主な存在形式であり、ＩＬ－１７ＲＡ及びＩＬ－１７ＲＣに共に作用する。ＩＬ－１７Ａは、正常な生理状態では発現が極めて低い。しかし、病理状態において、ＩＬ－１７Ａは大量に分泌され、細胞表面のＩＬ－１７Ｒに結合するとともに、シグナル伝達複合体ＩＬ－１７Ｒ－Ａｃｔ１－ＴＲＡＦ６により下流のＮＦ－ｋＢ、ＪＮＫ等のシグナル経路を活性化させて炎症反応に関与する。これにより、ＩＬ－１７Ａは、炎症及び自己免疫疾患（例えば、乾癬や関節リウマチ）の病理反応において重要な作用を奏する。現在、抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体薬は乾癬治療の重要な手段とされている。
【0003】
乾癬は、よく見られる再発性及び炎症性の皮膚疾患であり、ケラチノサイト（ＫＣ）の過剰増殖、炎症性細胞の浸潤、新生血管形成が病理組織学的な３要素とされる。現在の研究では、乾癬による皮膚病変箇所の真皮乳頭層に毛細血管の拡張及び伸長、透過性の亢進、血管数の増加が生じることが分かっている。且つ、このような変化は、主に後毛細管静脈に発生すると考えられている。乾癬で最初に発生する病理学的変化は、血管の分布及び形成の変化である。乾癬患者には、皮膚病変箇所以外の皮膚にも異常拡張した血管が見られることが多い。また、研究の結果、乾癬患者の皮膚病変においては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルが健常人の皮膚よりも明らかに増加することが分かっている。そのため、抗血管新生薬は乾癬治療の有効な手段となる可能性がある。また、ＩＬ－１７とＶＥＧＦを同時に標的とする薬物は、乾癬治療に対し相乗的な治療効果を有する可能性が多いにある。
【0004】
そのほか、多数の研究によって、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）及び黄斑変性でＩＬ－１７の含有量が著しく増加することが分かっている。また、レーザ光で誘導したＣＮＶモデルでは、抗ＩＬ－１７抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体を注射することで、新生血管の生成及び漏出を著しく減少させられる。よって、ＩＬ－１７とＶＥＧＦを同時に標的とする薬物は、黄斑変性等の網膜病変の革新的な新治療法となる見込みがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、ＩＬ－１７及びＶＥＧＦのシグナル経路を同時に阻害可能な新たな抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を提供することである。また、本発明の目的は、更に、前記二機能性融合タンパク質をコードする核酸分子を提供すること、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供すること、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供すること、前記二機能性融合タンパク質の製造方法を提供すること、前記二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物を提供すること、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療薬物の製造における前記二機能性融合タンパク質又は前記医薬組成物の応用を提供すること、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療に前記融合タンパク質又は前記医薬組成物を適用する方法を提供すること、である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術方案を提供する。
【0007】
本発明の第１の態様では、抗ＩＬ－１７抗体と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を提供する。前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲであり、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、直接的又はコネクソンを介して抗ＩＬ－１７抗体に連結される。
【0008】
前記ＶＥＧＦＲは完全な受容体タンパク質であってもよいし、ＶＥＧＦＲの細胞外領域であってもよい。
【0009】
好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲの細胞外領域である。例示的なＶＥＧＦＲの細胞外領域は、例えば、ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメイン又はＤ３ドメイン、ＶＥＧＦＲ２のＤ２ドメイン、Ｄ３ドメイン又はＤ４ドメイン、ＶＥＧＦＲ３のＤ１ドメイン、Ｄ２ドメイン又はＤ３ドメインである。
【0010】
好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１の細胞外領域である。
【0011】
好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインである。
【0012】
抗ＩＬ－１７抗体はどの抗ＩＬ－１７抗体であってもよく、当該抗体がＩＬ－１７とそのリガンドとの結合を抑制又は減少させられればよい。好ましくは、抗ＩＬ－１７抗体は６０８抗体である。
【0013】
具体的に、前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖は相補性決定領域ＨＣＤＲ１～３を含む。ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す通りであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５に示す通りであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示す通りである。前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖は相補性決定領域ＬＣＤＲ１～３を含む。ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７に示す通りであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示す通りであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す通りである。
ＩＤ ＮＯ：１５に示す通りであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示す通りである。前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖は相補性決定領域ＬＣＤＲ１～３を含む。ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７に示す通りであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示す通りであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す通りである。
【0014】
好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示す通りであり、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２１に示す通りである。
ＩＤ ＮＯ：２１に示す通りである。
【0015】
好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体はモノクローナル抗体である。
【0016】
好ましい実施方案において、前記ＩＬ－１７抗体はヒト化抗体である。
【0017】
好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体はＩｇＧクラス抗体であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４型の全長抗体である。
【0018】
好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであり、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示す通りである。
ＩＤ ＮＯ：１に示す通りである。
【0019】
その他の実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体は、６０８抗体と競合的にＩＬ－１７に結合するその他の抗体であってもよい。
【0020】
本発明のいくつかの具体的実施形態において、前記抗ＩＬ－１７抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す重鎖のアミノ酸配列、又は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示す軽鎖のアミノ酸配列をベースに、１つ又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個としてもよい）のアミノ酸を置換、欠損又は追加することで得られるものとしてもよい。また、置換、欠損又は追加後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の類似度を有し得る。
ＩＤ ＮＯ：１に示す軽鎖のアミノ酸配列をベースに、１つ又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個としてもよい）のアミノ酸を置換、欠損又は追加することで得られるものとしてもよい。また、置換、欠損又は追加後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の類似度を有し得る。
【0021】
一実施形態において、ＶＥＧＦＲのＤ２ドメインは野生型又は突然変異体としてもよい。
【0022】
野生型ＶＥＧＦＲ－Ｄ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示す通りである。
【0023】
前記ＶＥＧＦＲのＤ２ドメインの突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列をベースに、１つ又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個としてもよい）のアミノ酸を置換、欠損又は追加することで得られるものである。また、置換、欠損又は追加後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３４と、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の類似度を有し得る。
ＩＤ ＮＯ：３４と、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の類似度を有し得る。
【0024】
好ましい実施方案において、ＶＥＧＦＲ－Ｄ２の突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位に突然変異が存在する。
【0025】
加えて、ＶＥＧＦＲ－Ｄ２の突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位に置換変異が存在する。
【0026】
加えて、ＶＥＧＦＲ－Ｄ２の突然変異体は、１３８Ｍ／Ａ、１３８Ｍ／Ｐ又は１３８Ｍ／Ｔから選択される。これら３種類の突然変異は予測不可能な技術的効果を奏するものであり、融合タンパク質の重鎖の断裂を著しく低下させて、加速・熱安定性を向上させる。
【0027】
好ましい実施方案において、前記コネクソンは、（Ｇ４Ｓ）ｘのような柔軟なポリペプチド配列を有するものとしてもよく、ｘは、１、２、３、４、５又は６としてもよい。
いくつかの好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体ＩｇＧの重鎖のＣ末端（図１Ａに示す）又はＮ末端（図１Ｂに示す）と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は直列に連結されて、二機能性融合タンパク質の重鎖を形成する。
いくつかの好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体ＩｇＧの重鎖のＣ末端（図１Ａに示す）又はＮ末端（図１Ｂに示す）と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は直列に連結されて、二機能性融合タンパク質の重鎖を形成する。
【0028】
いくつかの好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体ＩｇＧの軽鎖のＣ末端（図１Ｃに示す）又はＮ末端（図１Ｄに示す）と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は直列に連結されて、二機能性融合タンパク質の軽鎖を形成する。
【0029】
好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結される。また、別の好ましい実施方案において、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結される。
【0030】
融合タンパク質の断裂を低下させるために、Ｆｃの末端のアミノ酸を突然変異させてもよい。例えば、実施例では、ヒトＩｇＧ１型のＦｃ領域末端のアミノ酸ＫをＡに突然変異させている。
【0031】
好ましい実施方案において、前記二機能性融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、前記二機能性融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りである。
ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、前記二機能性融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りである。
【0032】
本発明の第２の態様では、核酸分子を提供する。前記核酸分子は、前記融合タンパク質をコードする。
【0033】
好ましい実施方案において、前記核酸分子は、融合タンパク質の重鎖の核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３をコードし、軽鎖の核酸配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９をコードする。
ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３をコードし、軽鎖の核酸配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９をコードする。
【0034】
当業者は、上記融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子に、置換、欠損、変更、挿入又は追加を適切に導入することで、核酸分子の同族体を提供可能なことを周知している。
【0035】
本発明の第３の態様では、発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは前記核酸分子を含む。
【0036】
本発明の第４の態様では、宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は前記発現ベクターを含む。
【0037】
本発明の第５の態様では、二機能性融合タンパク質の製造方法を提供する。前記製造方法は、以下のステップａ）及びステップｂ）を含む。
ステップａ）において、発現条件において、上述した宿主細胞を培養することで、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を発現する。
ステップｂ）において、ステップａ）の前記二機能性融合タンパク質を分離及び精製する。
ステップａ）において、発現条件において、上述した宿主細胞を培養することで、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を発現する。
ステップｂ）において、ステップａ）の前記二機能性融合タンパク質を分離及び精製する。
【0038】
本発明の第６の態様では、医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、有効量の前記二機能性融合タンパク質と、１種類又は複数種類の薬学的に許容可能な担体又は添加物を含む。
【0039】
本発明の第７の態様では、前記二機能性融合タンパク質、医薬組成物の、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療薬物の製造における使用を提供する。
【0040】
本発明によれば、前記ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病は、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患から選択される。
【0041】
例えば、前記炎症性皮膚疾患は乾癬である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
【0042】
本発明の第８の態様では、前記二機能性融合タンパク質、医薬組成物の、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患の治療薬物の製造における使用を提供する。
【0043】
例えば、前記炎症性皮膚疾患は乾癬である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
【0044】
本発明における抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその医薬組成物は、ヒトを含む動物に投与する際に、患者の年齢や体重、疾病の特性や重大性及び投与経路によって投与量が異なる。よって、動物実験の結果及び様々な状況を参考にして、総投薬量が一定の範囲を超えないようにすべきである。当該分野の常識に基づいて、上記の各好ましい条件を任意に組み合わせることで、本発明の各好ましい実施例を取得可能である。
【0045】
本発明の第９の態様では、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療方法を提供する。当該方法は、必要な被検者に対し、前記二機能性融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む。
【0046】
本発明によれば、前記ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病は、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患から選択される。
【0047】
例えば、前記炎症性皮膚疾患は乾癬である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
【0048】
本発明の第１０の態様では、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患の治療方法を提供する。当該方法は、必要な被検者に対し、前記二機能性融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含む。
【0049】
例えば、前記炎症性皮膚疾患は乾癬である。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその医薬組成物は、被検者に投与する際に、投与量を治療有効量とする必要がある。前記治療有効量とは、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療において効果を有する量である。具体的に、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその医薬組成物は、被検者に投与する際に、患者の年齢や体重、疾病の特性や重大性及び投与経路によって投与量が異なる。よって、動物実験の結果及び様々な状況を参考にして、総投薬量が一定の範囲を超えないようにすべきである。
前記眼科疾患は、例えば、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患（ＣＮＶ）又は黄斑変性である。
前記黄斑変性は、例えば、滲出型加齢黄斑変性である。
前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその医薬組成物は、被検者に投与する際に、投与量を治療有効量とする必要がある。前記治療有効量とは、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療において効果を有する量である。具体的に、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びその医薬組成物は、被検者に投与する際に、患者の年齢や体重、疾病の特性や重大性及び投与経路によって投与量が異なる。よって、動物実験の結果及び様々な状況を参考にして、総投薬量が一定の範囲を超えないようにすべきである。
【0050】
本発明の第１１の態様では、ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインを含む融合タンパク質を提供する。前記ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインには突然変異が存在する。前記融合タンパク質は改善の安定性を有する。
【0051】
好ましい実施方案において、前記融合タンパク質は、更に、少なくとも１つの異種ドメインを含む。前記異種ドメインは、標的性、安定性、毒性、腫瘍殺傷活性等を改善すべく、抗体、Ｆｃフラグメントを含むがこれらに限らない。
【0052】
好ましい実施方案において、前記ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位に突然変異が存在する。
【0053】
加えて、前記ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位に置換変異が存在する。
【0054】
加えて、前記ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインには、１３８Ｍ／Ａ、１３８Ｍ／Ｐ又は１３８Ｍ／Ｔの突然変異が存在する。
【発明の効果】
【0055】
本発明における積極的な効果は以下の通りである。
【0056】
本発明における二機能性融合タンパク質は、ＩＬ－１７及びＶＥＧＦに対し高い親和性を持って結合可能である。また、ＩＬ－１７に対する親和性は、抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体のポジティブコントロール６０８と同等である。本発明の融合タンパク質は、ＩＬ－１７受容体とＩＬ－１７との結合を有効に阻害可能であり、その阻害能力は抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体のポジティブコントロール６０８と同等である。また、本発明の融合タンパク質は、ＶＥＧＦとその受容体ＫＤＲとの相互作用を有効に阻害可能であり、その阻害能力は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体のポジティブコントロールであるベバシズマブよりも優れている。本発明の融合タンパク質は、細胞レベルの薬効試験において、ＩＬ－１７により誘導されるＩＬ－６及びＶＥＧＦの分泌を有効に抑制可能であった。また、動物レベルの薬効試験では、乾癬及び脈絡膜血管新生疾患を有効に治療可能であった。総括すると、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ－１７及びＶＥＧＦ活性に関連する疾病の治療において潜在力を有している。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【発明を実施するための形態】
【0058】
以下の実験例は本発明を更に説明するためのものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。実施例では、例えば、核酸分子の作製方法、ベクター及びプラスミドの作製方法、タンパク質をコードする遺伝子を上記のようなベクター及びプラスミドに挿入する方法又はプラスミドを宿主細胞に導入する方法、宿主細胞の培養方法等の従来の方法又は当該分野における一般的な方法については詳細に記載しない。このような方法は、当業者にとって周知であり、下記を含む多くの出版物に記載されている。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ。
【0059】
本発明において、「二機能性融合タンパク質」との用語は、２つ又は複数の同じ又は異なるポリペプチド配列を融合して得られる新たなポリペプチド配列を意味する。また、「融合」との用語は、ペプチド結合による直接連結、或いは、１つ又は複数の連結ペプチド（ペプチドリンカー）を介した有効な連結を意味する。また、「連結ペプチド（コネクソン）」との用語は、２つのポリペプチド配列を連結可能な短鎖ペプチドを意味し、一般的には長さが２～３０個のアミノ酸からなるペプチドのことである。
【0060】
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ，略語Ａｂ）」との用語は、全長抗体及び抗体フラグメントを含む。「全長抗体」とは、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質のことであり、２本の同じ軽鎖（ＬＣ）及び２本の同じ重鎖（ＨＣ）から構成される。また、各重鎖は一端に可変領域（ＶＨ）を有し、その後が定常領域となっている。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインから構成される。また、各軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は１つのドメインＣＬを含む。軽鎖の定常領域と重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインは対となっており、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は対となっている。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、異なるエフェクター機能を示し、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与する。重鎖の定常領域には、サブタイプとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４がある。また、軽鎖の定常領域には、κ（Ｋａｐｐａ）又はλ（Ｌａｍｂｄａ）がある。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィド結合によって共有結合される。抗体の２本の重鎖は、ヒンジ領域の間に形成されるポリペプチド間のジスルフィド結合により共有結合される。また、「抗体フラグメント」とは、抗体に由来し、且つ、抗原のエピトープに結合する能力を維持した機能性フラグメントであって、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）を含むが、これらに限らない。
ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与する。重鎖の定常領域には、サブタイプとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４がある。また、軽鎖の定常領域には、κ（Ｋａｐｐａ）又はλ（Ｌａｍｂｄａ）がある。抗体の重鎖と軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＣＬドメインの間のジスルフィド結合によって共有結合される。抗体の２本の重鎖は、ヒンジ領域の間に形成されるポリペプチド間のジスルフィド結合により共有結合される。また、「抗体フラグメント」とは、抗体に由来し、且つ、抗原のエピトープに結合する能力を維持した機能性フラグメントであって、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）を含むが、これらに限らない。
【0061】
本発明において、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」との用語は、基本的に均一な集団から得られる抗体を意味する。即ち、存在し得る自然発生的な少数の突然変異を除き、当該集団に含まれる各抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高い特異性を持って１つの抗原の部位を標的とする。且つ、一般的なポリクローナル抗体製剤（通常は、異なる抗原決定基を標的とする異なる抗体を有する混合物である）とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の１つの決定基を標的とする。また、特異性だけでなく、モノクローナル抗体はハイブリドーマの培養により合成可能なため、その他の免疫グロブリンにより汚染されないことが利点である。
【0062】
本発明において、「ヒト化」との用語は、ＣＤＲがヒト以外の種（好ましくはマウス）の抗体に由来し、抗体分子中の残りの部分（フレームワーク領域及び定常領域を含む）がヒト抗体に由来することを意味する。また、結合親和性を維持するために、フレームワーク領域の残基は変更されてもよい。
【0063】
本発明において、「抗」及び「結合」との用語は、例えば、抗体と抗体が標的とする抗原との間の反応といった２つの分子間の非ランダムな結合反応を意味する。通常、抗体は、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満又は更に小さい、例えば約１０－７Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で前記抗原に結合する。「ＫＤ」との用語は、特定の抗体－抗原間の相互作用の平衡解離定数であり、抗体と抗原との結合親和性を表すために用いられる。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合はより緊密となり、抗体と抗原との親和性がより高くなる。例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ
Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，略称ＳＰＲ）を用い、ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）で抗体と抗原との結合親和性を測定するか、ＥＬＩＳＡで抗体と抗原との結合の相対的な親和性を測定する。
Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，略称ＳＰＲ）を用い、ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）で抗体と抗原との結合親和性を測定するか、ＥＬＩＳＡで抗体と抗原との結合の相対的な親和性を測定する。
【0064】
本発明において、「ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメイン」とは、ＶＥＧＦＲ１の細胞外領域のＤ２ドメインのことであり、天然型配列及びそのバリアント（少なくとも１つのアミノ酸の突然変異を含む）を含み、前記突然変異のドメインがＶＥＧＦとの結合活性を維持していればよい。
【0065】
本発明において、「発現ベクター」との用語は、特定の目的タンパク質又はその他の物質を発現するための発現カセットを備えるベクターを意味し、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、バクテリオファージ、酵母プラスミド又はその他のベクターのことである。また、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の適切な調節配列を含む当該分野において一般的な発現ベクターを意味し、当該発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド又はその他のベクターとしてもよい。前記発現ベクターは、好ましくは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．４（＋）、ｐＤＨＦＲ又はｐＴＴ５を含む。関連配列を取得すれば、組換え法により関連配列を大量に取得可能である。これについては、通常、関連配列をベクターにクローニングしてから細胞に導入する。そして、一般的な方法で、増殖後の宿主細胞から関連配列を分離して取得する。
【0066】
本発明において、「宿主細胞」との用語は、当該分野において一般的な各種宿主細胞を意味し、ベクターを安定的に自己複製可能とし、且つ、付帯する核酸分子を有効に発現させられればよい。前記宿主細胞は、原核生物発現細胞及び真核生物発現細胞を含む。前記宿主細胞は、好ましくは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、２９３Ｆ細胞又は２９３Ｅ細胞から選択される。
【0067】
本発明において、「医薬組成物」との用語は、上述した二機能性融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体又は添加物を含むものを意味する。通常は、これらの物質を無害且つ不活性であり、薬学的に許容可能な水性の担体培地において調製する。なお、ｐＨ値は調製物質の性質及び治療対象の病症に応じて変化させてもよいが、通常は、ｐＨを約４～８とし、好ましくはｐＨを約５～７とする。調製した医薬組成物は、静脈注射、静脈点滴、皮下注射、局所注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（例えば腹膜内）、頭蓋内注射又は腔内注射を含む（ただし、これらに限らない）一般的な経路で投与可能である。
【0068】
本発明において、「医薬組成物」との用語は、より安定的に治療効果を発揮するための医薬製剤を意味する。これらの製剤は、本発明で開示する二機能性融合タンパク質におけるアミノ酸コア配列の立体構造の完全性を保証し得るとともに、タンパク質の複数の官能基を保護して分解（凝集、脱アミノ又は酸化を含むがこれらに限らない）を防止することも可能である。
【0069】
「薬学的に許容可能」とは、薬物を動物又はヒトに適切に投与する際に、それらが不都合な反応、アレルギー反応又はその他の副反応を生じないことを意味する。
【0070】
「薬学的に許容可能な担体又は添加物」は、前記有効成分に適合している必要がある。即ち、前記有効成分と混合されたとしても、通常の状況では薬物の効果を大幅に低下させてはならない。薬学的に許容可能な担体又は添加物となり得るいくつか物質の具体例には、ラクトース、グルコース及びサッカロースのような糖類、コーンスターチ及び片栗粉のようなデンプン、メチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びメチルセルロースのようなセルロース及びその誘導体、トラガカントゴム粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムのような固体潤滑剤、硫酸カルシウム、ピーナッツオイル、綿実油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油及びココアバターのような植物油、プロパンジオール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール、アルギン酸、Ｔｗｅｅｎのような乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤、着色剤、調味剤、打錠剤、安定剤、希釈剤、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、パイロジェンフリー水、平衡塩溶液、リン酸塩緩衝液のような緩衝液等がある。これらの物質は、必要に応じて組成の安定性を補助したり、活性又はバイオアベイラビリティの向上を補助したり、経口投与時に許容可能な口当たり又は香りを発生させたりする。
【0071】
本発明における医薬組成物は、安全有効量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明における上記二機能性融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む。この種の担体は、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを含む（ただし、これらに限らない）。また、医薬製剤は投与方式に適合させるべきである。本発明の医薬組成物は、注射薬の形式で製造してもよく、例えば、生理食塩水、或いは、グルコース及びその他の助剤を含む水溶液用いて一般的な方法で製造する。注射薬や溶液といった医薬組成物は無菌条件で製造すべきである。また、活性成分の投与量は治療有効量とし、例えば、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重とする。そのほか、本発明における二機能性融合タンパク質は、その他の治療剤と合わせて使用してもよい。
【0072】
本発明において、「有効量」との用語は、本発明の医薬組成物を被検者に投与したあと、治療した個体に所期の効果が現れる量又は投与量を意味する。当該所期の効果には個体の病症の改善が含まれる。また、「被検者」との用語には、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類動物、ラット及びマウス等の哺乳動物が含まれるが、これらに限らない。
本発明におけるＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療方法において、前記「治療」又は「治療方法」には、何らかの状態の予防又は軽減、何らかの状態の発生又は進行速度の低減、何らかの状態の進行リスクの低減、何らかの状態に関する症状の進行の予防又は遅延、何らかの状態に関する症状の減少又は停止、何らかの状態の完全な又は部分的な逆転の発生、何らかの状態の治癒、或いは以上の組み合わせが含まれる。
本発明におけるＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療方法において、前記「治療」又は「治療方法」には、何らかの状態の予防又は軽減、何らかの状態の発生又は進行速度の低減、何らかの状態の進行リスクの低減、何らかの状態に関する症状の進行の予防又は遅延、何らかの状態に関する症状の減少又は停止、何らかの状態の完全な又は部分的な逆転の発生、何らかの状態の治癒、或いは以上の組み合わせが含まれる。
【0073】
いくつかの実施形態において、本文で記載する方法は、更に、従来技術におけるその他の化合物又はその他の治療プランと組み合わせて実施してもよい。以下の実施例で言及する配列に対応する配列番号を末尾の表６にまとめる。
【0074】
（実施例１）
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の作製
本発明では、抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体（６０８モノクローナル抗体）ＩｇＧの重鎖のＣ末端（図１Ａに示す）又はＮ末端（図１Ｂに示す）と、軽鎖のＣ末端（図１Ｃに示す）及び軽鎖のＮ末端（図１Ｄに示す）にＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインをそれぞれ直列に連結する方式で、抗体融合タンパク質を作製した。６０８モノクローナル抗体は、中国特許出願第２０１７８００３３６７０．５号におけるヒト化した抗ヒトＩＬ１７Ａモノクローナル抗体から取得した。また、ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメイン（１２９～２２７番目のアミノ酸）は、野生型のＤ２ドメイン及び特異的に突然変異したＤ２ドメインを含んでいた。各融合タンパク質の構造の説明については、表１に示す通りである。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の作製
本発明では、抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体（６０８モノクローナル抗体）ＩｇＧの重鎖のＣ末端（図１Ａに示す）又はＮ末端（図１Ｂに示す）と、軽鎖のＣ末端（図１Ｃに示す）及び軽鎖のＮ末端（図１Ｄに示す）にＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインをそれぞれ直列に連結する方式で、抗体融合タンパク質を作製した。６０８モノクローナル抗体は、中国特許出願第２０１７８００３３６７０．５号におけるヒト化した抗ヒトＩＬ１７Ａモノクローナル抗体から取得した。また、ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメイン（１２９～２２７番目のアミノ酸）は、野生型のＤ２ドメイン及び特異的に突然変異したＤ２ドメインを含んでいた。各融合タンパク質の構造の説明については、表１に示す通りである。
【0075】
【表1】
【0076】
（実施例２）
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の作製
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．４ベクター（サーモフィッシャー社より購入。Ａ１４６９７）にそれぞれサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して、ＣＨＯ細胞及び／又は２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションした。次に、細胞を７日間培養したあと、培養液を高速遠心分離にかけ、精密濾過膜で真空濾過してからＨｉＴｒａｐ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに投入した。続いて、１００ｍＭのクエン酸及びｐＨ３．５の溶出液を用いてタンパク質をワンステップ溶出し、対象サンプルを回収するとともに、透析して培養液をＰＢＳに交換した。そして、精製後のタンパク質をＨＰＬＣで測定した。結果は、図２Ａ～図２Ｈに示す通りとなった。測定の結果、融合タンパク質の分子状態は均一であり、精製１回後のモノマー純度が９４．０～９８．９％の間であることが分かった。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の作製
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．４ベクター（サーモフィッシャー社より購入。Ａ１４６９７）にそれぞれサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して、ＣＨＯ細胞及び／又は２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションした。次に、細胞を７日間培養したあと、培養液を高速遠心分離にかけ、精密濾過膜で真空濾過してからＨｉＴｒａｐ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに投入した。続いて、１００ｍＭのクエン酸及びｐＨ３．５の溶出液を用いてタンパク質をワンステップ溶出し、対象サンプルを回収するとともに、透析して培養液をＰＢＳに交換した。そして、精製後のタンパク質をＨＰＬＣで測定した。結果は、図２Ａ～図２Ｈに示す通りとなった。測定の結果、融合タンパク質の分子状態は均一であり、精製１回後のモノマー純度が９４．０～９８．９％の間であることが分かった。
【0077】
（実施例３）
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による抗原に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性測定
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による抗原に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性測定
【0078】
３．１ ＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質とＩＬ－１７Ａとの親和性測定
ＩＬ－１７Ａタンパク質（アクロバイオシステムズ社より購入。Ｃａｔ．＃ＩＬＡ－Ｈ５１１８）を１００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間放置したあと、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して待機した。また、希釈液で抗体を２５ｎＭまで希釈し、４倍希釈により８つの濃度勾配を形成した。これをブロッキングしたＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（アブカム社より購入。Ｃａｔ．＃ａｂ８７４２２）を加え、３７℃で３０分間放置した。そして、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、吸水紙上で残留液をできるだけ落とし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加えて室温（２０±５℃）で遮光しながら５分間放置した。続いて、各ウェルに停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＥＣ５０を算出した。
ＩＬ－１７Ａタンパク質（アクロバイオシステムズ社より購入。Ｃａｔ．＃ＩＬＡ－Ｈ５１１８）を１００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間放置したあと、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して待機した。また、希釈液で抗体を２５ｎＭまで希釈し、４倍希釈により８つの濃度勾配を形成した。これをブロッキングしたＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（アブカム社より購入。Ｃａｔ．＃ａｂ８７４２２）を加え、３７℃で３０分間放置した。そして、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、吸水紙上で残留液をできるだけ落とし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加えて室温（２０±５℃）で遮光しながら５分間放置した。続いて、各ウェルに停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＥＣ５０を算出した。
【0079】
実験結果は図３Ａに示す通りとなった。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質１７Ｖ０１、１７Ｖ０２、１７Ｖ０３、１７Ｖ０４及びポジティブコントロールである６０８モノクローナル抗体は、いずれもＩＬ－１７Ａに有効に結合可能であった。また、ＥＣ５０（ｎＭ）値は、それぞれ、０．０５２、０．０６２、０．０４１、０．１０５及び０．０５２であり、親和性が同等であった。
【0080】
３．２ ＥＬＩＳＡによる抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質とＶＥＧＦとの親和性測定
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質とＶＥＧＦとの結合能力を測定するために、ＶＥＧＦタンパク質（アクロバイオシステムズ社より購入。Ｃａｔ．＃ＶＥ５－Ｈ４２１０）を１００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間放置したあと、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して待機した。また、希釈液で抗体を２５ｎＭまで希釈し、４倍希釈により８つの濃度勾配を形成した。これをブロッキングしたＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（アブカム社より購入。Ｃａｔ．＃ａｂ８７４２２）を加え、３７℃で３０分間放置した。そして、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、吸水紙上で残留液をできるだけ落とし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加えて室温（２０±５℃）で遮光しながら５分間放置した。続いて、各ウェルに停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＥＣ５０を算出した。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質とＶＥＧＦとの結合能力を測定するために、ＶＥＧＦタンパク質（アクロバイオシステムズ社より購入。Ｃａｔ．＃ＶＥ５－Ｈ４２１０）を１００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間放置したあと、ＰＢＳＴでプレートを１回洗浄して待機した。また、希釈液で抗体を２５ｎＭまで希釈し、４倍希釈により８つの濃度勾配を形成した。これをブロッキングしたＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＨＲＰで標識したヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（アブカム社より購入。Ｃａｔ．＃ａｂ８７４２２）を加え、３７℃で３０分間放置した。そして、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、吸水紙上で残留液をできるだけ落とし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加えて室温（２０±５℃）で遮光しながら５分間放置した。続いて、各ウェルに停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＥＣ５０を算出した。
【0081】
実験結果は図３Ｂに示す通りとなった。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質１７Ｖ０１、１７Ｖ０２、１７Ｖ０３、１７Ｖ０４、ＦＣ－Ｄ２は、いずれもＶＥＧＦに有効に結合可能であった。また、ＥＣ５０（ｎＭ）値は、それぞれ、０．３７９、０．３２７、０．３２６、０．３７１及び０．３９７であり、親和性が同等であった。一方、抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体６０８はＶＥＧＦに有効に結合し得なかった。
【0082】
（実施例４）
抗原ＩＬ－１７Ａに対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性・解離定数ＫＤの測定
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ分子間相互作用解析装置を用い、捕捉法により、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質と抗原ＩＬ－１７Ａとの結合・解離の動態パラメータを測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ７．４（Ｃａｔ．＃ＢＲ－１００７－６９，ＧＥヘルスケア社）を希釈用緩衝液とし、１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６、６０８を１．５μｇ／ｍｌまでそれぞれ希釈した。そして、ＩＬ－１７Ａの最高濃度を１２．５ｎＭとする６つの濃度勾配を設けるとともに、０濃度を追加した。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ（Ｃａｔ．＃２９－１２７５－５６，ＧＥヘルスケア社）チップが結合された捕捉抗体を使用した。そして、ＩＬ－１７Ａを分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）として投入し、結合－解離曲線を取得してから、６Ｍのグアニジン塩酸塩（Ｃａｔ．＃３００９５５１６，国薬集団化学試剤有限公司より購入）を再生緩衝液として溶出したあと、次のサイクルを繰り返した。データはＢｉａｃｏｒｅ
８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。
抗原ＩＬ－１７Ａに対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性・解離定数ＫＤの測定
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ分子間相互作用解析装置を用い、捕捉法により、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質と抗原ＩＬ－１７Ａとの結合・解離の動態パラメータを測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ７．４（Ｃａｔ．＃ＢＲ－１００７－６９，ＧＥヘルスケア社）を希釈用緩衝液とし、１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６、６０８を１．５μｇ／ｍｌまでそれぞれ希釈した。そして、ＩＬ－１７Ａの最高濃度を１２．５ｎＭとする６つの濃度勾配を設けるとともに、０濃度を追加した。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ（Ｃａｔ．＃２９－１２７５－５６，ＧＥヘルスケア社）チップが結合された捕捉抗体を使用した。そして、ＩＬ－１７Ａを分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）として投入し、結合－解離曲線を取得してから、６Ｍのグアニジン塩酸塩（Ｃａｔ．＃３００９５５１６，国薬集団化学試剤有限公司より購入）を再生緩衝液として溶出したあと、次のサイクルを繰り返した。データはＢｉａｃｏｒｅ
８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。
【0083】
実験結果は表２に示す通りとなった。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６は、ＩＬ－１７Ａに対する親和性がポジティブコントロールである抗ＩＬ－１７モノクローナル抗体６０８と同等であった。
【0084】
【表2】
【0085】
（実施例５）
抗原ＶＥＧＦに対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性・解離定数ＫＤの測定
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ分子間相互作用解析装置を用い、捕捉法により、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質と抗原ＶＥＧＦとの結合・解離の動態パラメータを測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ７．４を希釈用緩衝液とし、ベバシズマブ、１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６を５μｇ／ｍｌまでそれぞれ希釈した。そして、ＶＥＧＦの最高濃度を１０ｎＭとする６つの濃度勾配を設けるとともに、０濃度を追加した。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａチップが結合された捕捉抗体を使用した。そして、ＶＥＧＦを分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）として投入し、結合－解離曲線を取得してから、６Ｍのグアニジン塩酸塩を再生緩衝液として溶出したあと、次のサイクルを繰り返した。データはＢｉａｃｏｒｅ
８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。
抗原ＶＥＧＦに対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の親和性・解離定数ＫＤの測定
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ分子間相互作用解析装置を用い、捕捉法により、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質と抗原ＶＥＧＦとの結合・解離の動態パラメータを測定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ７．４を希釈用緩衝液とし、ベバシズマブ、１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６を５μｇ／ｍｌまでそれぞれ希釈した。そして、ＶＥＧＦの最高濃度を１０ｎＭとする６つの濃度勾配を設けるとともに、０濃度を追加した。また、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａチップが結合された捕捉抗体を使用した。そして、ＶＥＧＦを分析物（Ａｎａｌｙｔｅ）として投入し、結合－解離曲線を取得してから、６Ｍのグアニジン塩酸塩を再生緩衝液として溶出したあと、次のサイクルを繰り返した。データはＢｉａｃｏｒｅ
８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。
【0086】
実験結果は表３に示す通りとなった。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６は、ＶＥＧＦに対する親和性がポジティブコントロールであるベバシズマブよりもやや優れていた。
【0087】
【表3】
【0088】
（実施例６）
ＩＬ－１７Ａにより誘導されるＨｅＬａ細胞のＩＬ－６分泌に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の阻害作用
ＩＬ－１７Ａは上皮細胞を刺激してＩＬ－６を分泌させることが可能である。そこで、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１７Ａを用いてヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを刺激したところ、ＥＬＩＳＡにより明らかなヒトＩＬ－６の分泌が測定された。このシステムを用いることで、ヒトＩＬ－１７Ａにより誘導されるＨｅＬａのヒトＩＬ－６分泌に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の阻害レベルを測定可能であった。対数期まで培養したＨｅＬａ細胞から培地を捨てて、パンクレアチンで消化したあと、３００ｇで５分間遠心分離にかけ、再懸濁、カウントしてから、密度を調整した細胞を９６ウェルマイクロプレートに接種した。なお、１００００個／ウェルとし、各ウェルに１００μｌ加えた。これを細胞培養装置に置いて２時間培養した。また、培地を用いて各被検サンプルを開始濃度４０μｇ／ｍｌまで希釈し、３倍希釈により１０個の濃度を形成した。そして、群ごとに２つのウェルを設け、７０μｌを新たな９６ウェルマイクロプレートに取った。また、培地を用いてＩＬ－１７Ａの濃度を４０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、７０μｌの希釈された抗体を含む９６ウェルマイクロプレートに７０μｌ加えた。続いて、接種済みのＨｅＬａ細胞に当該溶液を１ウェルあたり１００μｌ加えた。即ち、抗体の終濃度は１０μｇ／ｍｌ、ＩＬ－１７Ａの終濃度は１０ｎｇ／ｍｌとなった。これを３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養した。
ＩＬ－１７Ａにより誘導されるＨｅＬａ細胞のＩＬ－６分泌に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の阻害作用
ＩＬ－１７Ａは上皮細胞を刺激してＩＬ－６を分泌させることが可能である。そこで、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１７Ａを用いてヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを刺激したところ、ＥＬＩＳＡにより明らかなヒトＩＬ－６の分泌が測定された。このシステムを用いることで、ヒトＩＬ－１７Ａにより誘導されるＨｅＬａのヒトＩＬ－６分泌に対する抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の阻害レベルを測定可能であった。対数期まで培養したＨｅＬａ細胞から培地を捨てて、パンクレアチンで消化したあと、３００ｇで５分間遠心分離にかけ、再懸濁、カウントしてから、密度を調整した細胞を９６ウェルマイクロプレートに接種した。なお、１００００個／ウェルとし、各ウェルに１００μｌ加えた。これを細胞培養装置に置いて２時間培養した。また、培地を用いて各被検サンプルを開始濃度４０μｇ／ｍｌまで希釈し、３倍希釈により１０個の濃度を形成した。そして、群ごとに２つのウェルを設け、７０μｌを新たな９６ウェルマイクロプレートに取った。また、培地を用いてＩＬ－１７Ａの濃度を４０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、７０μｌの希釈された抗体を含む９６ウェルマイクロプレートに７０μｌ加えた。続いて、接種済みのＨｅＬａ細胞に当該溶液を１ウェルあたり１００μｌ加えた。即ち、抗体の終濃度は１０μｇ／ｍｌ、ＩＬ－１７Ａの終濃度は１０ｎｇ／ｍｌとなった。これを３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養した。
【0089】
ラット抗ヒトＩＬ－６抗体をコーティングバッファで２．５μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡ用プレートに加えて、４℃で一晩置いた。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２００μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、３７℃で２時間放置したあと、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して待機した。また、ＩＬ－６標準品を作製した。即ち、培地を用いて標準品を作製し、初期濃度を５０ｎｇ／ｍｌとした。また、順に２倍希釈することで、合計１２個の勾配を形成した。これを１ウェルあたり１００μｌでコーティング済みのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。なお、濃度ごとに２つのウェルを設けた。続いて、一晩培養したＨｅＬａ細胞を均一に混合し、１００μｌを取ってＤＭＥＭ培地で２倍に希釈した。これを新たな９６ウェルマイクロプレートに移したあと、３００ｇで５分間遠心分離にかけた。そして、各ウェルの上清を１００μｌ取ってＥＬＩＳＡ用プレートに加え、室温で１．５時間培養した。次に、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ビオチン化したラット抗ヒトＩＬ－６（作用濃度１：２０００）を１ウェルあたり１００μｌ加えて、３７℃で１時間放置した。続いて、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、吸水紙上で残留液をできるだけ落とし、各ウェルにストレプトアビジンＨＲＰを１００μｌ加えて室温で１時間培養した。そして、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄したあと、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加えて室温（２０±５℃）で遮光しながら５分間放置した。次に、各ウェルに５０μｌの２Ｍ
Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ソフトウェアを用いて各ウェルのＩＬ－６発現レベルを算出した。また、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＩＣ５０を算出した。
Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて基質の反応を停止させた。そして、酵素結合免疫測定装置の４５０ｎｍ箇所でＯＤ値を読み取り、ソフトウェアを用いて各ウェルのＩＬ－６発現レベルを算出した。また、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを作成するとともに、ＩＣ５０を算出した。
【0090】
実験結果は図４に示す通りとなった。結果より、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質１７Ｖ０５、１７Ｖ０６及びポジティブコントロールである６０８モノクローナル抗体は、いずれも、ヒトＩＬ－１７Ａにより誘導されるＨｅＬａ細胞のヒトＩＬ－６分泌を投与量依存的に阻害した。また、ＩＣ５０は、それぞれ、０．７２６、０．７７８及び０．８７７ｎＭであり、二機能性融合タンパク質と６０８モノクローナル抗体は同等の生物学的活性を示した。
【0091】
（実施例７）
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質によるＶＥＧＦと受容体ＫＤＲとの結合阻害の細胞実験
単層培養した対数増殖期の密度約８０～９０％のＫＤＲ細胞（プロメガ社より購入。Ｃａｔ．＃ＧＡ１０８２）を取り、成長培地を捨てた。次に、ＤＰＢＳで１回洗浄したあと、アクターゼ（登録商標）溶液（シグマ社，Ｃａｔ．＃Ａ６９６４）で消化し、パンクレアチンを中和したあと、２００ｇで５分間遠心分離にかけた。次に、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社，Ｃａｔ．＃１１９９５）を用いて細胞を再懸濁したあと、トリパンブルーにより細胞をカウントした。そして、細胞密度を４００００個／ウェルに調整してプレーティングし、５０μｌ／ウェルで３７℃の５％ＣＯ２に放置した。また、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いてＶＥＧＦを３０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、ＶＥＧＦを含有する培地で抗体を倍希釈した。これにより、３倍希釈で１０個の勾配を形成した。次に、希釈した抗体を１ウェルあたり２５μｌで細胞に加え（最終的なＶＥＧＦ濃度は１０ｎｇ／ｍｌ、抗体の開始濃度は１００ｎＭとなった）、３７℃で６時間培養したあと、各ウェルに７５μｌの検出試薬Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（プロメガ社より購入。Ｃａｔ．＃Ｇ７９４０）を加えた。これを室温で１０分間培養したあと、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ
ｉ３ｘでルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を読み取った。全てのデータは２ウェルずつとし、取得した信号の値から平均値を取ったあと、４パラメータ法でフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行った。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質によるＶＥＧＦと受容体ＫＤＲとの結合阻害の細胞実験
単層培養した対数増殖期の密度約８０～９０％のＫＤＲ細胞（プロメガ社より購入。Ｃａｔ．＃ＧＡ１０８２）を取り、成長培地を捨てた。次に、ＤＰＢＳで１回洗浄したあと、アクターゼ（登録商標）溶液（シグマ社，Ｃａｔ．＃Ａ６９６４）で消化し、パンクレアチンを中和したあと、２００ｇで５分間遠心分離にかけた。次に、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社，Ｃａｔ．＃１１９９５）を用いて細胞を再懸濁したあと、トリパンブルーにより細胞をカウントした。そして、細胞密度を４００００個／ウェルに調整してプレーティングし、５０μｌ／ウェルで３７℃の５％ＣＯ２に放置した。また、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いてＶＥＧＦを３０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、ＶＥＧＦを含有する培地で抗体を倍希釈した。これにより、３倍希釈で１０個の勾配を形成した。次に、希釈した抗体を１ウェルあたり２５μｌで細胞に加え（最終的なＶＥＧＦ濃度は１０ｎｇ／ｍｌ、抗体の開始濃度は１００ｎＭとなった）、３７℃で６時間培養したあと、各ウェルに７５μｌの検出試薬Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（プロメガ社より購入。Ｃａｔ．＃Ｇ７９４０）を加えた。これを室温で１０分間培養したあと、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ
ｉ３ｘでルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を読み取った。全てのデータは２ウェルずつとし、取得した信号の値から平均値を取ったあと、４パラメータ法でフィッティングし、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行った。
【0092】
実験結果は図５に示す通りとなった。抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びポジティブコントロールであるベバシズマブは、いずれもＶＥＧＦとその受容体ＫＤＲとの相互作用を有効に阻害可能であった。且つ、二機能性融合タンパク質の阻害能力の方が優れていた。また、１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６及びベバシズマブのＩＣ５０は、それぞれ、０．０７２、０．０８４、０．０７２及び０．４３０ｎＭであった。
【0093】
（実施例８）
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の物理的安定性
ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ，示差走査熱量測定法）により、ＰＢＳ緩衝系における抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の熱安定性を測定した。サンプルをＰＢＳ緩衝液中に置き換えてサンプル濃度を１ｍｇ／ｍｌに制御し、ＭｉｃｒｏＣａｌ＊Ｖｐ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ
ＤＳＣ（マルバーン社）を用いて測定した。測定前に、サンプル及びブランク緩衝液は０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過した。そして、サンプルプレートの各ウェルに４００μｌのサンプル又はブランク緩衝液（６組のブランク緩衝対を設定した）を加えた。最後に、３組のマイクロプレートに洗浄用としてｄｄＨ２Ｏを加えた。サンプルプレートにサンプルを投入し終えたあとは、プラスチック製のソフトカバーを被せた。走査温度は２５℃で開始し、１００℃で終了させた。また、走査速度は１５０℃／ｈとした。具体的な結果は表４に示す通りとなった。サンプル１７Ｖ０１、１７Ｖ０５及び１７Ｖ０６のタンパク質はいずれも良好な熱安定性を示した。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の物理的安定性
ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ，示差走査熱量測定法）により、ＰＢＳ緩衝系における抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の熱安定性を測定した。サンプルをＰＢＳ緩衝液中に置き換えてサンプル濃度を１ｍｇ／ｍｌに制御し、ＭｉｃｒｏＣａｌ＊Ｖｐ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ
ＤＳＣ（マルバーン社）を用いて測定した。測定前に、サンプル及びブランク緩衝液は０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過した。そして、サンプルプレートの各ウェルに４００μｌのサンプル又はブランク緩衝液（６組のブランク緩衝対を設定した）を加えた。最後に、３組のマイクロプレートに洗浄用としてｄｄＨ２Ｏを加えた。サンプルプレートにサンプルを投入し終えたあとは、プラスチック製のソフトカバーを被せた。走査温度は２５℃で開始し、１００℃で終了させた。また、走査速度は１５０℃／ｈとした。具体的な結果は表４に示す通りとなった。サンプル１７Ｖ０１、１７Ｖ０５及び１７Ｖ０６のタンパク質はいずれも良好な熱安定性を示した。
【0094】
【表4】
【0095】
（実施例９）
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の加速・熱安定性研究
前段階の研究より、二機能性融合タンパク質に天然型Ｄ２ドメイン配列を使用した場合には、いくつかの製剤組成の加速・熱安定性研究において、少量の重鎖に断裂が生じることが分かった。そこで、１３８番目のメチオニンを突然変異させて、改変後の分子の製剤組成における加速・熱安定性を考察した。
抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の加速・熱安定性研究
前段階の研究より、二機能性融合タンパク質に天然型Ｄ２ドメイン配列を使用した場合には、いくつかの製剤組成の加速・熱安定性研究において、少量の重鎖に断裂が生じることが分かった。そこで、１３８番目のメチオニンを突然変異させて、改変後の分子の製剤組成における加速・熱安定性を考察した。
【0096】
１７Ｖ０１、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６及び１７Ｖ０７タンパク質を、それぞれ、ＰＢＳ緩衝液又はヒスチジン緩衝液（Ｌ－ヒスチジン
０．３４ｍｇ／ｍｌ、ヒスチジン塩酸塩一水和物 １．６４ｍｇ／ｍｌ、アルギニン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍｌ、α，αトレハロース二水和物 ５０．０ｍｇ／ｍｌ、ポリソルベート８０
０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５±０．５）中に限外濾過濃縮し、タンパク質濃度を５～１０ｍｇ／ｍＬの間とした。これを３７℃で４週間培養したあと、サンプリングして、遠心分離、限外濾過及び脱塩処理を行った。次に、限外濾過及び脱塩後のタンパク質を１００μｇ取り、濃度５０００００Ｕ／ｍｌのＮＥＢ
ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ社より購入。Ｃａｔ．＃Ｐ０７０４Ｌ）を１μｌ加え、３７℃で２時間培養したあと、１ＭのＤＴＴ（上海生工社より購入。Ｃａｔ．＃Ａ６２００５８）を終濃度５０ｍＭとなるまで加え、３７℃で３０分間培養した。そして、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用い、タンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍｌとなるまでサンプルを希釈して、均一に混合したあと、１０分間遠心分離にかけた（回転速度≧１２０００ｒｐｍ）。続いて、ＡＣＱＵＩＴＹ
ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ４ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍクロマトグラフィーカラムで分離したあと、融合タンパク質の重鎖の分子量を質量分析した（Ｗａｔｅｒｓ
ＵＰＬＣ－ＸＥＶＯ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム）。その結果、表５に示す通り、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６及び１７Ｖ０７の分子は、天然型Ｄ２ドメイン配列を用いた１７Ｖ０１分子よりも加速・熱安定性に優れていた。
０．３４ｍｇ／ｍｌ、ヒスチジン塩酸塩一水和物 １．６４ｍｇ／ｍｌ、アルギニン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍｌ、α，αトレハロース二水和物 ５０．０ｍｇ／ｍｌ、ポリソルベート８０
０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５±０．５）中に限外濾過濃縮し、タンパク質濃度を５～１０ｍｇ／ｍＬの間とした。これを３７℃で４週間培養したあと、サンプリングして、遠心分離、限外濾過及び脱塩処理を行った。次に、限外濾過及び脱塩後のタンパク質を１００μｇ取り、濃度５０００００Ｕ／ｍｌのＮＥＢ
ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ社より購入。Ｃａｔ．＃Ｐ０７０４Ｌ）を１μｌ加え、３７℃で２時間培養したあと、１ＭのＤＴＴ（上海生工社より購入。Ｃａｔ．＃Ａ６２００５８）を終濃度５０ｍＭとなるまで加え、３７℃で３０分間培養した。そして、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用い、タンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍｌとなるまでサンプルを希釈して、均一に混合したあと、１０分間遠心分離にかけた（回転速度≧１２０００ｒｐｍ）。続いて、ＡＣＱＵＩＴＹ
ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ４ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍクロマトグラフィーカラムで分離したあと、融合タンパク質の重鎖の分子量を質量分析した（Ｗａｔｅｒｓ
ＵＰＬＣ－ＸＥＶＯ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム）。その結果、表５に示す通り、１７Ｖ０５、１７Ｖ０６及び１７Ｖ０７の分子は、天然型Ｄ２ドメイン配列を用いた１７Ｖ０１分子よりも加速・熱安定性に優れていた。
【0097】
【表5】
【0098】
（実施例１０）
レーザ光で誘導したマウス脈絡膜新生血管モデルにおける抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の抑制作用
レーザ光照射によりマウスの眼底に脈絡膜血管新生及び漏出を誘導し、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質による血管新生及び漏出に対する抑制作用を検証した。
レーザ光で誘導したマウス脈絡膜新生血管モデルにおける抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の抑制作用
レーザ光照射によりマウスの眼底に脈絡膜血管新生及び漏出を誘導し、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質による血管新生及び漏出に対する抑制作用を検証した。
【0099】
ゾレチル（Ｚｏｌｅｔｉｌ）（２５～５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）＋キシラジン塩酸塩注射液（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を用いて、１１～１２週齢のメスのヒト化ＩＬ－１７マウス（百奥賽図社より購入）に麻酔をかけた。そして、５３２ｎｍのレーザ光を用い、両目の視神経乳頭から１．５～２ＰＤ部分の視神経乳頭周りの３点を等距離で光凝固させることで、３つのレーザスポットを焼き付けた。レーザ光でモデルを作製したあとは、すぐにＯＣＴ検査を行ってブルッフ膜の破損有無を確認するとともに、ブルッフ膜に破損がないスポット、或いは、網膜に出血が生じたスポットを除去した。レーザ光によるモデル作製から６日目（ｄａｙ６）にＦＦＡ検査を行い、発生した漏出スポットに基づき群分けした。そして、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質投与群には１７Ｖ０５（１７．４９ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ注射し、アフリベルセプト投与群にはアフリベルセプト（１０ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ注射し、対照群にはＰＢＳを２μＬ注射することで、両眼の硝子体内に注射を１回行った。また、投与から７日後（ｄａｙ１４）に再びＦＦＡ検査を行い、ハイデルベルグスペクトラリスシステムを用いてマウス生体のＣＮＶ漏出を観察した。且つ、ＦＦＡ初期（１分以内）及び後期（３分後）を撮像し、蛍光漏出面積を統計するとともに、蛍光漏出状況に基づき評価・レベル分けを行った（レベルＩ～ＩＶ）。
レベルＩ 強い蛍光は見られない
レベルＩＩ 病巣の初期又は中期は高蛍光を示すが、漏出は見られない
レベルＩＩＩ 病巣の初期は高蛍光を示し、後期には漏出が見られる
レベルＩＶ 病巣の初期は明るい高蛍光を示す。また、後期には漏出が見られ、且つ熱傷領域の境界を超えている
レベルＩ 強い蛍光は見られない
レベルＩＩ 病巣の初期又は中期は高蛍光を示すが、漏出は見られない
レベルＩＩＩ 病巣の初期は高蛍光を示し、後期には漏出が見られる
レベルＩＶ 病巣の初期は明るい高蛍光を示す。また、後期には漏出が見られ、且つ熱傷領域の境界を超えている
【0100】
検査の完了後、動物に大量の二酸化炭素を吸入させ、頸椎脱臼により安楽死させたあと、実験動物の両目の眼球を採取して、４％のＰＦＡにより室温で２時間固定した。そして、予め冷却しておいたＰＢＳに交換したあと、眼球を解剖して前区組織、水晶体、硝子体、網膜を切り取り、ＲＰＥ／Ｃｈｏｒｏｉｄを含むプレパラートを保持して免疫蛍光染色を行った。検査指標はｉｓｏｌｅｃｔｉｎ
Ｂ４、ＤＡＰＩとし、病巣ごとに同じ倍率及び蛍光で撮像するとともに、ｉｍａｇｅＪでＣＮＶ面積を算出し、統計・分析を行った。
Ｂ４、ＤＡＰＩとし、病巣ごとに同じ倍率及び蛍光で撮像するとともに、ｉｍａｇｅＪでＣＮＶ面積を算出し、統計・分析を行った。
【0101】
図６は、投与から７日後と投与前との比較である。血管漏出面積の変化率については、等モルの投与濃度の場合、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質及びアフリベルセプトはいずれも漏出面積を有効に減少させることができた。また、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の薬効の方が優れていた。図７は、レベル３～４の漏出スポットの統計データである。投与から７日後（ｄａｙ１４）に、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を投与した実験群は、レベル３～４の漏出スポット数がネガティブコントロール群に比べて明らかに低下した。また、その効果はポジティブコントロールであるアフリベルセプトよりも優れていた。図８は、脈絡膜のプレパラートを作製したあとにＩＢ４免疫蛍光染色を行うことで、投与から７日後のマウスの眼底新生血管面積を測定したものである。ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を投与した実験群は、新生血管面積がネガティブコントロール群に比べて明らかに低下した。また、その効果はポジティブコントロールであるアフリベルセプトよりも優れていた。
【0102】
実験結果を総括すると、ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質はマウスの眼底の脈絡膜血管新生及び漏出を有効に抑制可能であり、且つ、その効果はポジティブコントロールであるアフリベルセプトよりも優れていることが分かった。
【0103】
以上の実施例は、本発明で開示した実施方案を説明するためのものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。また、本文中に列挙した各種の修正及び発明の方法の変更は、本発明の範囲及び精神を逸脱しないことを前提に、当業者にとって自明である。なお、本発明における複数の具体的な好ましい実施例を組み合わせて本発明につき具体的に記載したが、理解すべき点として、本発明はこれらの具体的実施例に限定すべきではない。実際に、当業者にとって自明の各種の上記修正により得られる発明は、いずれも本発明の範囲に含まれるものとする。
【0104】
【表6】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＩＬ－１７抗体と、ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質とを含み、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は、直接的又はコネクソンを介して前記抗ＩＬ－１７抗体に連結され、前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１の細胞外領域であることを特徴とする抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項3】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖は相補性決定領域ＨＣＤＲ１～３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：１４に示す通りであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示す通りであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示す通りであり、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖は相補性決定領域ＬＣＤＲ１～３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７に示す通りであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示す通りであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：２０に示す通りであり、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：４に示す通りであり、軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項6】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインは野生型又は突然変異体であり、野生型ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４に示す通りであることを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項7】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位が突然変異して形成されたものであることを特徴とする請求項６に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項8】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４に示すアミノ酸配列の１３８位が置換変異して形成されたものであることを特徴とする請求項６に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項9】
ＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインの突然変異体は、１３８Ｍ／Ａ、１３８Ｍ／Ｐ又は１３８Ｍ／Ｔから選択されることを特徴とする請求項６に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項10】
前記抗ＩＬ－１７抗体の重鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結され、或いは、前記抗ＩＬ－１７抗体の軽鎖のＣ末端又はＮ末端はＶＥＧＦＲ１のＤ２ドメインに連結されることを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項11】
前記二機能性融合タンパク質の重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す通りであり、前記二機能性融合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項13】
前記核酸分子は、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の重鎖の核酸配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３３をコードし、前記抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の軽鎖の核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９をコードすることを特徴とする請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項14】
請求項１２に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項15】
請求項１４に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質の製造方法であって、発現条件において、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することで、抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質を発現するステップａ）と、
ステップａ）の前記融合タンパク質を分離及び精製するステップｂ）と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項17】
有効量の請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、１種類又は複数種類の薬学的に許容可能な担体又は添加物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項18】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質、請求項１７に記載の医薬組成物の、ＩＬ－１７及び／又はＶＥＧＦを過剰発現する疾病の治療薬物の製造における使用。
【請求項19】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－１７／ＶＥＧＦ二機能性融合タンパク質、請求項１７に記載の医薬組成物の、炎症性皮膚疾患又は眼科疾患の治療薬物の製造における使用。
【請求項20】
前記炎症性皮膚疾患は乾癬であり、及び／又は、前記眼科疾患は、糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生疾患又は黄斑変性から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【国際調査報告】