特表 2024-544565 養子細胞移入免疫療法を増強する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】養子細胞移入免疫療法を増強する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/48 20060101AFI20241126BHJP

   C12N 9/54 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 9/42 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241126BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

A61K38/48

C12N9/54 ZNA

C12N9/42

A61K38/47

A61K35/17

A61P43/00 105

A61P37/02

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/06

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/00

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024528591

(86)(22)【出願日】2022-11-14

(85)【翻訳文提出日】2024-07-12

(86)【国際出願番号】 EP2022081841

(87)【国際公開番号】W WO2023084095

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/279,398

(32)【優先日】2021-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517280580

【氏名又は名称】ハンサ バイオファーマ エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】ランガナタン、ラグヴェール

(72)【発明者】

【氏名】ボッカーマン、ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ロバートソン、アンナ－カリン

(72)【発明者】

【氏名】シェルマン、クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ドッティ、ジャンピエトロ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA04

4C084DC07

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZA961

4C084ZB071

4C084ZB081

4C084ZB151

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC541

4C084ZC751

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB15

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC54

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を増強する方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、前記養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法。

【請求項2】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、がんを治療する方法。

【請求項3】

前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ若しくはＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、前記養子細胞移入免疫療法が施される前に投与される、又は前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ若しくはＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、前記養子細胞移入免疫療法が施された後に投与される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を以前受けたことがある及び／又は受ける予定のある患者に投与することを含む、がんを治療する方法。

【請求項5】

前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある及び／又は投与される予定のある患者に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を施すことを含む、がんを治療する方法。

【請求項6】

抗体媒介性自己免疫疾患を治療する方法であって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある及び／又は投与される予定のある患者に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を施すことを含み、
任意で、前記抗体媒介性自己免疫疾患が、若年性関節炎（特に、若年性特発性関節炎）、関節リウマチ、全身性粘液水腫性苔癬（硬化性粘液水腫）、グレーブス病、ＩｇＡ駆動性水疱性皮膚症、ＩｇＧ４駆動性水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、及びループス乳腺炎からなる群から選択される方法。

【請求項7】

前記免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法が、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体を発現するＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、又は樹状細胞を投与することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体が、ヒトκ免疫グロブリン軽鎖又はヒトλ免疫グロブリン軽鎖等の免疫グロブリン軽鎖と特異的に結合するｓｃＦｖ等の結合ドメインを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記養子細胞移入免疫療法において投与された細胞の活性、生存率、及び／又は増殖を増加させる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記養子細胞移入免疫療法において投与された細胞の、抗体媒介性補体沈着、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、消耗、受容体活性化細胞死、受容体ブロック、及び／又は免疫グロブリン架橋を低減する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記疾患ががんであり、前記がんがＢ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病等のＢ細胞新生物である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

（ｉ）前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）等の連鎖球菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼであり、任意で、前記タンパク質が、ＩｄｅＳ又はＩｄｅＺである；あるいは
（ｉｉ）前記ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、化膿性連鎖球菌、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）等の連鎖球菌由来、又はヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、若しくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり、任意で、前記タンパク質が、ＥｎｄｏＳ、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、又はＥｎｄｏＦ_２である、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

（ｉ）前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２、４、５、若しくは９１のアミノ酸配列、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片若しくはバリアントを含むか又はからなるポリペプチドである、あるいは
（ｉｉ）前記ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号９０のアミノ酸配列、又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するその断片若しくはバリアントを含むか又はからなるポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

（ｉ）前記ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２、４、５、若しくは９１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドであるか、又は前記ＩｇＧシステインプロテアーゼが、配列番号６～２５及び５５～６９のいずれか１つの配列を含むか若しくはからなり、任意で、前記配列が、Ｎ末端に追加のメチオニン及び／又はＣ末端にヒスチジンタグを含む；あるいは
（ｉｉ）前記ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号９０と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法のための患者のコンディショニング又は準備において使用するための、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益の改善において使用するための、あるいは免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を受けているか又は受ける予定のある患者において、血漿ＩｇＧレベルの低下又は血漿ＩｇＧ分子による補体若しくはＦｃ受容体の結合の減少において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の改良に関する。

【背景技術】

【0002】

養子細胞移入免疫療法は、がんを含む様々な疾患を治療するための療法の新たに確立されたクラスである。固形腫瘍又は造血器起源の腫瘍の治療では、理想的には腫瘍関連抗原に特異的な患者のＴ細胞をインビトロで増幅させた後、再注入する。Ｔ細胞の数、特異性、活性、及び有効性が、これら治療の制限要因である。腫瘍回避の例示的な要因の１つは、腫瘍抗原の提示に必要なＨＬＡのダウンレギュレーションである。

【0003】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）でトランスフェクトされた細胞は、患者自身のＮＫ細胞及びＴ細胞が本来持っている細胞溶解能を利用した細胞ベースの免疫療法の新興分野である。これら改変された自己細胞は、腫瘍特異的ｓｃＦｖドメインからその特異性を受け取る、細胞表面で発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入を通して、Ｂ細胞悪性腫瘍又は結腸がん若しくは乳がんのような固形腫瘍に対するものになり得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍活性と腫瘍関連抗原特異的抗体由来のｓｃＦｖエレメントの特異性及び親和性とを併せ持つ。自己Ｔ細胞は、選択したＣＡＲでインビトロにおいてトランスフェクトする前に、患者から十分な数を収集することができる。更に増幅させると、ＨＬＡ非依存性の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が大量に得られる。

【0004】

リンパ系悪性腫瘍を治療するための、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法が開発中である（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０２１及びＶｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８）。Ｂリンパ球は、κ又はλの軽鎖のいずれかを有する表面単クローン性免疫グロブリンを発現し、多くのリンパ系悪性腫瘍でも同様である。従って、リンパ系悪性腫瘍が発現する免疫グロブリン軽鎖を標的とした養子細胞移入免疫療法は、抗がん活性を有することが期待される。他の免疫グロブリン軽鎖系列を発現する非がん細胞は養子細胞移入免疫療法の影響を受けないので、このような養子細胞移入免疫療法は患者の免疫に対する悪影響も最小限に抑えられると予測される。

【0005】

ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法の有効性は、注射後の患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞の生存及び活性の持続性によって制限される可能性がある。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存及び有効性を制限する要因については、まだ十分には検討されておらず、議論の余地がある。理論的には、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する体液性応答が、抗体媒介性エフェクター機構を誘発し得るにもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞の成功の制限要因が抗体によって引き起こされることを示す直接的証拠はほとんど見出されていない。その代わり、ＣＤ１９のような標的抗原の喪失（Ｍａｊｚｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ，２０１８，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，８（１０）：１２１９－２６）、ＣＡＲ Ｔ細胞の欠如の多機能性（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｂｌｏｏｄ，１３２（８）：８０４－８１４）、又は腫瘍浸潤の欠如（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６８：１３９－１５２）に起因する腫瘍回避は、ＣＡＲ Ｔ細胞の成功についての懸念事項である。反復注入の失敗は、例えばＣＡＲ Ｔ細胞のＨＬＡにおけるｓｃＦｖによるマウスペプチドの提示によって引き起こされるＴ細胞媒介性細胞傷害に起因することが多い（Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，－２０１６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２６（６）：２１２３－２１３８）。これと一致して、ＦＤＡに承認されたＣＡＲ Ｔ細胞であるチサゲンレクロイセル（Ｋｙｍｒｉａｈ）は、既存の及び誘導された体液性免疫の影響を受けないといわれている（Ｔｈｕｄｉｕｍ－Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３６（１５），２０１８）。

【0006】

免疫グロブリンＧ分解システインプロテアーゼであるイムリフィダーゼ（ＩｄｅＳ）は、現在、腎移植における迅速脱感作治療として開発中のＩｇＧエンドペプチダーゼである。イムリフィダーゼは特異性が高く、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスを切断する。イムリフィダーゼは、抗体薬物製品を投与する際のＦｃ受容体についての競合を低減するのに有用であり得る（国際公開第２０１６／０１２２８５号）。

【0007】

がんを治療するための改善された方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、該養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法を提供する。本発明者らは、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の有効性が、血漿中の免疫グロブリンによる細胞の刺激によって低下し、細胞の消耗及び機能低下を引き起し得ることを明らかにした。加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞等の移入細胞の生存期間及び持続的活性が限られていることにより、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の有効性が制限され得る。本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、可溶性免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化し、オフ腫瘍細胞刺激を低減し、ひいては抗がん活性を向上させ得ることを実施例で示した。更に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の有効性は、細胞表面受容体が可溶性免疫グロブリンに結合することにより低下し、これにより、養子細胞移入免疫療法と標的腫瘍細胞との相互作用がブロックされ得る。ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、可溶性抗体を消化し、腫瘍上の標的への受容体の結合を増加させるのに有効であり得る。本発明者らはまた、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、移入細胞を保護し得ることも実施例で示した。具体的には、本発明者らは、既存の抗体及び移入細胞の投与後に作製された抗体を含む細胞表面受容体特異的抗体が、移入細胞の潜在力を短縮する可能性があり、移入細胞の治療効果は、レシピエントのコンディショニングを通して抗体のエフェクター機能を除去することから利益を得られることを明らかにした。免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法によって結合する可溶性抗体もまた、移入細胞に対して同様の有害作用を及ぼす可能性がある。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、移入細胞の生存及び活性を高め、改善された養子細胞移入免疫療法による治療を提供することができる。また、本発明者らは、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の受容体コンストラクトに対する細胞表面受容体特異的抗体及び他の細胞ベースの治療薬が、受容体とその標的タンパク質との相互作用に干渉し得ること、並びにＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、抗体を消化し、受容体のその標的に対する結合を増加させるのに有効であることを明らかにした。

【0009】

実施例で実証する通り、ＩｇＧシステインプロテアーゼであるイムリフィダーゼ（ＩｄｅＳ）で処理すると、可溶性免疫グロブリンの存在下において免疫グロブリン軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン産生を減少させるか又は阻止することができる。実施例で更に実証する通り、ＩｇＧシステインプロテアーゼであるイムリフィダーゼ（ＩｄｅＳ）及びＩｇＧエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏＳで処理すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する抗体及び他の細胞ベースの治療薬の制限エフェクター機能の一部を軽減する。従って、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、該養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、がん、特にＢ細胞新生物を治療する方法を提供する。

【0010】

ＣＡＲ－Ｔ療法及び免疫グロブリン軽鎖を標的とする他の養子細胞移入免疫療法の制限要因の１つは、抗カッパ及び抗ラムダのＣＡＲコンストラクトが血漿中の免疫グロブリンに結合することであり得る。これにより、腫瘍外でＣＡＲ－Ｔ細胞が刺激され、その結果、細胞が消耗し、機能低下する可能性がある。その結果、患者内に可溶性免疫グロブリンが存在すると、ＣＡＲ－Ｔがより速く消耗し、最大の腫瘍細胞傷害が達成できなくなる可能性がある。更に、可溶性免疫グロブリンはＣＡＲ－Ｔ療法と腫瘍細胞上のその標的との間の相互作用をブロックし得る。本発明によれば、ＩｇＧシステインプロテアーゼ及びＩｇＧエンドグリコシダーゼを使用して、血漿免疫グロブリンによるＣＡＲ－Ｔ細胞のオフ腫瘍刺激及び結合を低減することができる。血漿免疫グロブリンが切断されると、その安定性及び半減期が減少し、たとえ血漿免疫グロブリンが完全には破壊されなくても（例えば、抗体の断片が残る）ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する有害作用が減少する。また、免疫グロブリンを切断することでＣＡＲとＦｃｇＲとの間の架橋が阻止され得るが、これを阻止しなければ、オフ腫瘍活性化及び疲弊につながる可能性がある。

【0011】

ＣＡＲ－Ｔ療法及び他の養子細胞移入免疫療法の更なる制限要因の１つは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような様々な抗体媒介性エフェクター機構、浸透圧刺激又は受容体活性化誘導性細胞死に起因する消耗を通じてその有効性に影響を及ぼす、ＣＡＲコンストラクトに対する天然に存在する既存の抗体である可能性がある。注射後、このような抗体により、患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞の生存及び活性の持続性が低下する可能性がある。ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入すると、キメラ受容体に対する抗体レベルの上昇が誘導され、それにより、最初の治療過程においてＣＡＲとその標的細胞との相互作用が妨げられると共に、その増幅及び持続が制限される可能性さえある。２回目の治療ラウンドの成功は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）のレベルが上昇し、恐らく親和性もより高くなることから、更により困難になる可能性がある。ＣＡＲ Ｔ細胞が自己起源の細胞であったとしても、キメラ受容体によって導入される変化及びＴ細胞トランスフェクションプロセスからのウイルス抗原の発現により、宿主の免疫応答に対して脆弱な細胞となる。一部の免疫原性部分は、受容体の構成要素間の接合領域である場合もあるが、最も顕著なのはｓｃＦｖ部分であり、これは、ＣＡＲ－Ｔ開発の初期段階では、例えば腫瘍特異的マウスＩｇＧから取られたものであった。その後のＣＡＲコンストラクトでは、外来エピトープの数を減らすためにヒト化ＩｇＧを用いることが多いにもかかわらず、これらｓｃＦｖは依然として抗原結合ドメインにネオエピトープを含有している。これら外来エピトープは、細胞性宿主Ｔ細胞応答の抗原となり得、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存を制限することが示されている（Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＭＡｂｓ，２（３）：２５６－６５，Ｍｅｕｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｃｅｌｌ．＆ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。 一方、実施例のデータは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、移入細胞の生存及び活性を高め、細胞表面受容体特異的抗体の不活性化を通じて改善された治療を提供し得ることを実証する。免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法により結合した可溶性抗体もまた、移入細胞に対する同様の抗体媒介性エフェクター機構を活性化することができ、本発明に従ってＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を用いると、これら悪影響を低減することができる。

【0012】

ＣＡＲ Ｔ細胞等の移入細胞の活性、増幅、及び生存が抗体によって影響を受け得る機序としては、様々な可能性がある。例えば、ＣＡＲ特異的抗体は、補体沈着ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰによってＣＡＲ Ｔ細胞の破壊を促進し得る。また、細胞表面受容体に結合した可溶性抗体も、同じ機序によってＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊を促進し得る。実施例は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、これらプロセスを軽減し、それによって、養子細胞移入免疫療法を改善するのに有効であり得ることを実証する。また、抗体自体が受容体に結合することで、ＡＤＣＣ、消耗、又は受容体活性化誘導性細胞死を引き起こす可能性もある。ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質はまた、これらプロセスを軽減するのにも有用であろう。

【0013】

これら開発に鑑みて、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法を提供する。好ましくは、免疫療法はがん療法であり、より好ましくはＢ細胞新生物に対する療法である。他の実施形態では、免疫療法は、抗体媒介性自己免疫疾患に対する療法である。任意で、疾患は、若年性関節炎（特に、若年性特発性関節炎）、関節リウマチ、全身性粘液水腫性苔癬（硬化性粘液水腫）、グレーブス病、ＩｇＡ駆動性水疱性皮膚症、ＩｇＧ４駆動性水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、及びループス乳腺炎からなる群から選択される。

【0014】

特定の実施形態では、タンパク質は、養子細胞移入免疫療法の前に投与される。タンパク質を事前に投与することで、血漿から免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化し、投与された際の細胞の抗がん活性を最大化することができる。実施例はまた、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳが既存の抗体を不活性化するのに有効であることを実証し、例えば、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳは、補体源又はエフェクター細胞の添加前に使用した場合に有効であった。また、実施例では、養子細胞移入免疫療法を施されたことのない健常個体及びＨＬＡ感作患者の血清中に存在する抗体が、受容体コンストラクト及びＣＡＲ Ｔ細胞等の細胞に結合し、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＣ、及び標的結合への干渉等の有害な作用を媒介し得（このような同種抗体は、例えば、妊娠又は輸血によって誘導され得る）、その全てをＩｄｅＳ処理によって低減し得ることが実証される。特定の実施形態では、タンパク質は、養子細胞移入免疫療法を施した後に投与される。実施例は、抗血小板特異的抗体の後にＩｄｅｓ及びＥｎｄｏＳを投与した場合に免疫性血小板減少症が低減されたことから、Ｉｄｅｓ及びＥｎｄｏＳが、誘導された抗体の不活性化に有効であることを実証する。また、実施例は、ヒト血清中に存在する同種抗体がＣＡＲ－Ｔ細胞等の養子細胞移入免疫療法細胞に悪影響を及ぼし得ること、及び本発明のタンパク質がそのような悪影響を低減又は阻止できることを実証する。養子細胞移入免疫療法は、このような同種抗体を誘導し得るので、本発明のタンパク質は、養子細胞移入免疫療法の投与後に投与した場合に有用である可能性がある。

【0015】

本発明はまた、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法、養子細胞移入の一部として投与される細胞の生存期間を延長する及び／又は増殖を増強する方法、養子細胞移入免疫療法のために患者をコンディショニング又は準備する方法、養子細胞移入免疫療法を受けているか若しくは受ける予定のある患者における血漿ＩｇＧレベルを低下させる又は血漿ＩｇＧ分子による補体及び／若しくはＦｃ受容体結合を低減する方法であって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む方法も提供する。本発明のポリペプチドについて実施例で示す効果は、そのような方法において大きな利益をもたらすであろう。好ましくは、免疫療法はがん療法であり、より好ましくはＢ細胞新生物に対する療法である。

【0016】

本発明はまた、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の前、後、又は同時に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む、養子細胞移入療法の効力を増大させる又は養子細胞移入療法の細胞表面受容体とその標的との間の結合を増加させる方法も提供する。実施例は、本発明のポリペプチドが、そのような効力及び結合を増大させるのに有効であることを実証する。好ましいそのような実施形態では、標的はカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖であり、好ましくは、細胞表面受容体は抗カッパ又は抗ラムダのＣＡＲである。

【0017】

本発明の任意の方法の特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、養子細胞移入療法により結合し、細胞消耗を引き起こす血漿中の免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化することにより、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善するか又はがんの治療を改善する。また、本発明の任意の方法の特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、養子細胞移入療法の細胞表面受容体のその標的への結合を阻害するＩｇＧ抗体を除去することにより、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善するか又はがんの治療を改善する。該抗体は、細胞表面受容体、特にＣＡＲに結合する場合もあり、又はＣＡＲアダプター分子に結合する場合もあり、又は標的自体に結合する場合もあり、そして、受容体とその標的との結合を立体障害的に阻害し得る。

【0018】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼを使用する。特に好ましい実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼは、ＩｄｅＳ又はＩｄｅＺのポリペプチド、最も好ましくはＩｄｅＳポリペプチド、例えば、配列番号２、４、５、又は９１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドである。実施例は、このようなポリペプチドが細胞を保護し、循環している免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化するのに有効であることを実証する。

【0019】

更なる実施形態では、ＩｇＧエンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳポリペプチド、例えば、配列番号９０と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドである。実施例は、このようなポリペプチドが細胞を保護し、循環している免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化するのに有効であることを実証する。

【0020】

本発明の特に好ましい実施形態では、方法は、Ｂ細胞新生物の治療において、ＩｄｅＳポリペプチドを、免疫グロブリン軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ療法と組み合わせて投与することを含む。

【0021】

特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、養子細胞免疫療法前にＩｄｅＳポリペプチドを投与すること、例えば、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞免疫療法を受ける予定のある患者にＩｄｅＳポリペプチドを投与することを含む。このような方法によって、低減しなければ細胞療法の効果が消耗及び低下する可能性がある、又は細胞療法と腫瘍細胞上のその標的との間の相互作用をブロックする可能性がある、血漿中の免疫グロブリンが低減される。

【0022】

本発明はまた、本発明の方法において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を含む組成物、特に医薬組成物を提供する。

【0023】

本発明の任意の態様の好ましい実施形態では、養子細胞免疫療法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を発現しない。本発明の任意の態様の好ましい実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、単離されたタンパク質又は単離されたタンパク質を含む組成物の形態で患者に投与される。この措置は有利であるが、その理由は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、移入細胞と直接結合しないので、腫瘍細胞が発現する免疫グロブリン軽鎖を切断する可能性が低いためである。養子細胞免疫療法とＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質とは、同時に投与する場合であっても、別々の組成物で別々に投与することができる。このようなアプローチは、例えば、投与された養子細胞免疫療法の活性を最大化するために、血漿免疫グロブリンを全身的に除去又は不活性化することができるため、特に有効であると予測される。

【0024】

本発明の特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質は、養子細胞免疫療法によって標的とされる可溶性免疫グロブリンを不活性化するために使用され、養子細胞免疫療法に対する抗薬物抗体を不活性化するためには使用されない。特定の実施形態では、本発明に従って治療される患者は、養子細胞免疫療法に対する抗薬物抗体を有していないか、又はそのような抗体を有しているとは予測されず、疑われもしない。

【0025】

本発明の更なる実施形態は、以下の付番された段落に提供される。
１． ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、該養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法。
２． ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、がんを治療する方法。
３． ＩｇＧシステインプロテアーゼ若しくはＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、養子細胞移入免疫療法を施す前に投与される、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ若しくはＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、養子細胞移入免疫療法を施した後に投与される、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ若しくはＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質が、２回目以降の養子細胞移入免疫療法を施す前に投与される、実施形態１又は２に記載の方法。
４． ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を以前受けたことがある及び／又は受ける予定のある患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
５． ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある及び／又は投与される予定のある患者に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を施すことを含む、がんを治療する方法。
６． 抗体媒介性自己免疫疾患を治療する方法であって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある及び／又は投与される予定のある患者に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を施すことを含み、
任意で、該抗体媒介性自己免疫疾患が、若年性関節炎（特に、若年性特発性関節炎）、関節リウマチ、全身性粘液水腫性苔癬（硬化性粘液水腫）、グレーブス病、ＩｇＡ駆動性水疱性皮膚症、ＩｇＧ４駆動性水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、及びループス乳腺炎からなる群から選択される方法。
７． 養子細胞移入免疫療法が、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体を発現するＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、又は樹状細胞を投与することを含む、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
８． キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体が、ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖又はヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖等の免疫グロブリン軽鎖と特異的に結合するｓｃＦｖ等の結合ドメインを含む、実施形態７に記載の方法。
９． がんを治療する方法であり、該がんが、Ｂ細胞新生物、例えば、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。
１０． がんが、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；小リンパ球性リンパ腫；Ｂ細胞性前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫；マントル細胞リンパ腫；濾胞性リンパ腫；粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；脾性辺縁帯リンパ腫；ヘアリーセル白血病；形質細胞腫／形質細胞骨髄腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫等）、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、及び原発性眼内リンパ腫からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
１１． 養子細胞移入免疫療法において投与される細胞の活性を増大させる、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。
１２． 養子細胞移入免疫療法において投与される細胞の生存率及び／又は増殖を増大させる、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。
１３． 養子細胞移入免疫療法において投与される細胞の抗体媒介性補体結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、消耗、及び／又は受容体活性化細胞死を低減する、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
１４． （ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）等の連鎖球菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼであり、任意で、該タンパク質が、ＩｄｅＳ又はＩｄｅＺである；あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、化膿性連鎖球菌、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）等の連鎖球菌由来、又はヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、若しくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり、任意で、該タンパク質が、ＥｎｄｏＳ、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、又はＥｎｄｏＦ_２である、実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。
１５． （ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２、４、５、若しくは９１のアミノ酸配列、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片若しくはバリアントを含むか又はからなるポリペプチドである、あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号９０のアミノ酸配列、又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するその断片若しくはバリアントを含むか又はからなるポリペプチドである、実施形態１４に記載の方法。
１６． （ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２、４、５、若しくは９１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドであるか、又は該ＩｇＧシステインプロテアーゼが、配列番号６～２５及び５５～６９のいずれか１つの配列を含むか若しくはからなり、任意で、該配列が、Ｎ末端に追加のメチオニン及び／又はＣ末端にヒスチジンタグを含む；あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号９０と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である配列を有するポリペプチドである、実施形態１４に記載の方法。
１７． 免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法のための患者のコンディショニング又は準備において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質。
１８． 免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質。
１９． 免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を受けているか又は受ける予定のある患者において、血漿ＩｇＧレベルの低下又は血漿ＩｇＧ分子による補体若しくはＦｃ受容体結合の減少において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】抗体が標的とするＤａｕｄｉ細胞のＣ１ｑ及びＣ４ｄの沈着は、ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳによる処理によって避けることができる。Ｄａｕｄｉ細胞を、ＩｄｅＳ（Ａ＋Ｂ）又はＥｎｄｏＳ（Ｃ＋Ｄ）のタイトレーションと一緒に約２時間ＲＴＸ（又はＩｇＧ１アイソタイプ対照）と共にインキュベートした後、更に２時間にわたってヒト血清補体を添加した。細胞を分注し、抗ヒトＣ１ｑ（Ａ＋Ｃ）又はＣ４ｄ（Ｂ＋Ｄ）で染色し、続いて、ＳＡ－ＰＥで最終検出を行った。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターを用いて、ＦＬ２中の細胞を分析した。ＭＦＩ値を記載する。

【図2】ＡＤＣＣは、ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳで阻止又は低減させることができる。ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞を、５０μｇ／ｍＬのＩｄｅＳ（四角）、ＥｎｄｏＳ（三角）、又は培地（菱形）と一緒にＲＴＸ（０．２μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまでタイトレート）と共にインキュベートした。補体源として仔ウサギ血清を添加することを通してＣＤＣを誘導した。結果は、９０分間インキュベーション後を１００％とし、ＲＴＸなしの細胞生存率として正規化した。ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（ＣＣＫ８）を用いて、細胞の細胞傷害性を評価した。正常陽性対照群には、治療のための酵素を投与せず、タイトレートしたＲＴＸのみを投与した。これは、指定の濃度におけるＲＴＸの最大毒性を表す。

【図3】オプソニン化された標的細胞をＩｄｅＳ処理することにより、ＡＤＣＰが阻止される。カルセイン染色したＤａｕｄｉ細胞を、タイトレートしたＲＴＸ（７．５μｇ／ｍＬから０．０１μｇ／ｍＬまで）でオプソニン化し、４０μｇ／ｍＬのＩｄｅＳ（四角）、ＥｎｄｏＳ（三角）、又は酵素なし（培地のみ、菱形）のいずれかと共にインキュベートした後、ＦａｒＲｅｄ染色したＴＨＰ１エフェクター細胞を添加した。２時間インキュベートした後に細胞を固定し、ＦＬ２及びＦＬ４中でフローサイトメーターによって分析した。ゲーティングされたＦＬ２陽性細胞を１００％とした。この集団を、ＦＬ２単一陽性細胞とＦＬ２－ＦＬ４二重陽性細胞とに更に分類し、これらをＴＨＰ１が貪食したＤａｕｄｉ細胞について読み取った。

【図4】インビトロにおいてＩｄｅＳで切断された抗ＰＬＴ抗体はＩＴＰを誘導しない。血小板減少性抗ＰＬＴ ＩｇＧ（２５０μｇ／マウス）は、単回注射後にＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＩＴＰを誘導した（四角）。１回切断された抗ＰＬＴ ＩｇＧ（三角）は、同用量でＩＴＰを部分的にしか誘導しなかったが、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｃに完全に切断された抗ＰＬＴ ＩｇＧは、正常血小板レベルに影響を与えなかった。マウスに、２００μＬ ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／マウスの精製ＩｇＧを腹腔内投与した。１日目に自動セルカウンターＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５を使用して血小板カウントを求めた。

【図5】抗体によって誘導されるＩＴＰは、インビボにおけるＩｄｅＳ処理で阻止することができる。精製したインタクトなウサギ抗マウス血小板ＩｇＧ（０．２５ｍｇ／マウス）を１回ｉ．ｐ．注射することにより、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＩＴＰのためにプライミングした。ＩＴＰの誘導の１時間後に、３つの異なる用量（０．２μｇ／マウス、２μｇ／マウス、２０μｇ／マウス）のＩｄｅＳによる処理をｉ．ｖ．投与した。「ＰＢＳのみ」（丸）処理群には、ＩｄｅＳを投与せず、ＩＴＰ誘導の陽性対照として抗ＰＬＴ－ＩｇＧのみを投与した。担体溶液のみを投与したナイーブマウス（菱形）は、健常対照群を表す。１日目に自動セルカウンターＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５を使用して、血小板カウントを求めた。

【図6】ＥｎｄｏＳは、抗ＰＬＴ抗体注射後であってもマウスにおけるＩＴＰを阻止する。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６／群）に、ＩＴＰのためのプライミングとして５０μｇの抗ＰＬＴ ＩｇＧを注射した、又は正常レベルの血小板のための対照としてＰＢＳのみ（丸）を注射した。３０分後に、ＥｎｄｏＳ（１０μｇ／マウス、３０μｇ／マウス、９０μｇ／マウス）による治療的ｉ．ｐ．注射を注射した。ＩＴＰ誘導対照にはＰＢＳを注射した（菱形）。２４時間後に採血し、自動セルカウンターＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５を用いて血小板カウントについて分析した。

【図7】抗ＣＡＲ特異的抗体の同定－Ｆ（ａｂ’）２特異的ポリクローナル抗体は、ＣＡＲ Ｔ細胞受容体に特異的に結合する。ポリクローナルウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）を、（Ａ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び（Ｂ）抗ＢＣＭＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、並びにそれぞれ陰性対照及び陽性対照としての（Ｃ）モックトランスフェクトＴ細胞及び（Ｄ）ＢＣＲ発現Ｄａｕｄｉ細胞を含む初代ＣＡＲ Ｔ細胞に対する結合について評価した。結合した抗Ｆ（ａｂ’）２抗体を、ビオチン化抗ウサギＦｃ及びＳＡ－ＡＦ６４７を用いたフローサイトメトリー分析によって検出した。同様に、ポリクローナルウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）２及び抗ヒトＦ（ａｂ’）２（１０μｇ／ｍＬ）の結合も、ＦＡＣＳ分析により抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（Ｅ）（ＣＡＲＪ－ＺＰ００５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して評価し、ＭＦＩとして表した。

【図8】ＨＡＭＡ及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞アロ特異的血清の同定。（Ａ）正常ヒト血清サンプル（ＢｉｏＩＶＴ）を、認証されたサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いてヒト抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＡＭＡ）についてスクリーニングした。ＨＡＭＡ陽性血清の閾値は、＞１０ｎｇ／ｍＬとした。（Ｂ）ＥＬＩＳＡでスクリーニングしたＨＡＭＡ血清を、抗ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ野生型細胞が、ＣＡＲ陰性染色対照として機能した。ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ検出抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。（Ｃ）ＨＡＭＡ陽性及び陰性の血清を選択し、フローサイトメトリー分析によって抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞への特異的結合について更に試験した。更に、これら血清を使用して、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と共にＩｇＧエフェクター機構についてアッセイした。（Ｄ）ＨＬＡ感作された患者からの血清を、抗ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対する同種反応性についてスクリーニングした。ＨＬＡクラスＩの陽性及び陰性の対照として、ＯｎｅＬａｍｂｄａ製の血清を使用した。

【図9】ＣＡＲ特異的抗体によって誘導されるＡＤＣＰは、イムリフィダーゼ処理によって阻止することができる－ＡＤＣＰのための抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のポリクローナル抗Ｆ（ａｂ’）２抗体のオプソニン化は、イムリフィダーゼ処理によって阻止される。フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰ分析のために、（Ａ、Ｂ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ、（Ｄ、Ｅ）Ｊｕｒｋａｔ野生型細胞、並びに（Ｃ、Ｆ）ＣＤ２０及びＢＣＲ発現Ｄａｕｄｉ細胞を含む標的細胞を、カルセインＡＭで染色した後、指定濃度のイムリフィダーゼ処理したウサギの（Ａ、Ｃ、Ｄ）抗マウスＦ（ａｂ’）２又は（Ｂ、Ｅ、Ｆ）抗ヒトＦ（ａｂ’）２と共にインキュベートした。単球性貪食性エフェクター細胞株ＴＨＰ－１を９０分間標的細胞に添加する前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄで染色した。フローサイトメトリーによって貪食を評価した。貪食された標的細胞を反映する二重陽性細胞の量を、標的細胞の百分率として表す。

【図10】イムリフィダーゼは、同種血清でオプソニン化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＡＤＣＰの誘導を阻止する。標的細胞である抗ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔを、イムリフィダーゼ（１０μｇ／ｍＬ）処理の有り無しで、（Ａ）健常ドナー及び（Ｂ）高度に感作された抗ＨＬＡ患者からの血清でオプソニン化した。洗浄後、標的細胞をＦｃγＲＩ発現レポーター細胞と共に３７℃で６時間インキュベートして、ＡＤＣＰを誘導させた。レポーター細胞が活性化した結果であるルシフェラーゼ活性を、ルミネセンスリーダーを用いて測定し、発光シグナル（ＲＬＵ）を誘導値の平均倍率変化±ＳＤとして提示する。

【図11】抗ＣＤ１９ ＣＡＲ特異的抗体によって誘導されるＡＤＣＣ（Ｖ１５８）は、イムリフィダーゼ処理によって阻止される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、イムリフィダーゼ（２０μｇ／ｍＬ）の有り無しで、指定濃度のポリクローナルウサギの（Ａ）抗マウス及び（Ｂ）抗ヒトのＦ（ａｂ’）_２特異的抗体でオプソニン化した。ＡＤＣＣの誘導を、高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）をトランスフェクトしたレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７０１５）のルシフェラーゼレポーターバイオアッセイを用いて定量した。（Ｃ）ＣＡＲ陰性Ｊｕｒｋａｔ野生型細胞を、イムリフィダーゼの存在下／非存在下においてウサギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２で処理した。ＢＣＲ及びＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞は、（Ｄ）リツキシマブ及び（Ｅ）抗ヒトＦ（ａｂ’）_２特異的抗体によるＡＤＣＣ誘導についての陽性標的細胞対照を表す。活性化されたエフェクター細胞に由来する発光シグナル（ＲＬＵ）を、（デュープリケートの）誘導値の平均倍率変化±ＳＤとして提示する。

【図12】抗ＣＤ１９ ＣＡＲ特異的抗体によって誘導されるＡＤＣＣ（Ｆ１５８）は、イムリフィダーゼ処理によって阻止される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、イムリフィダーゼ（２０μｇ／ｍＬ）の有り無しで、指定濃度の（Ａ）ポリクローナルウサギ抗マウス及び（Ｂ）抗ヒトのＦ（ａｂ’）_２特異的抗体でオプソニン化した。ＡＤＣＣの誘導を、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）をトランスフェクトしたレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ９７９Ａ）のルシフェラーゼレポーターバイオアッセイを用いて定量した。（Ｃ）ＣＡＲ陰性Ｊｕｒｋａｔ野生型細胞を、イムリフィダーゼの存在下／非存在下においてウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２で処理した。ＢＣＲ及びＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞は、（Ｄ）リツキシマブ及び（Ｅ）抗ヒトＦ（ａｂ’）_２特異的抗体によるＡＤＣＣ誘導についての陽性標的細胞対照を表す。活性化されたエフェクター細胞に由来する発光シグナル（ＲＬＵ）を、（デュープリケートの）誘導値の平均倍率変化±ＳＤとして提示する。

【図13】ＨＡＭＡでオプソニン化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＡＤＣＣ誘導は、イムリフィダーゼ処理で阻止することができる。ＣＤ１６ ＦｃγＲＩＩＩａ高親和性（Ｖ１５８）アレルを発現するレポーター細胞株を用いて、ＡＤＣＣ誘導についてアッセイした。マウスｍＡｂ ＦＭＣ６３ベースのｓｃＦｖ－ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、イムリフィダーゼの存在／非存在下で、マウスＩｇＧに対するＨＡＭＡレベルについてＥＬＩＳＡによって事前に試験した正常ヒト血清サンプルと共にインキュベートし、ＨＡＭＡ陽性（１８４、１８７、２０８、２５０）及びＨＡＭＡ陰性（１６４）ヒト血清をＡＤＣＣアッセイに含めた。活性化されたエフェクター細胞に由来する発光シグナル（ＲＬＵ）を、（デュープリケートの）誘導値の平均値±ＳＤとして提示する。

【図14】血清のイムリフィダーゼ処理により、標的ＣＤ１９－タンパク質と抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞との会合が改善される－血清に曝露された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞へのＣＤ１９－タンパク質の結合は、イムリフィダーゼ処理により増加させることができる。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、イムリフィダーゼ（１０μｇ／ｍＬ）の有り無しで、ＨＡＭＡ陽性及び陰性の血清サンプルと共にインキュベートした。次の工程中にイムリフィダーゼを不活性化するために、全てのサンプルにＩＨＡｃ（１ｍＭ）を添加した。それぞれ可能なＩｇＧについてＦ（ａｂ’）２を抗ＣＤ１９ ＣＡＲに結合させるために、血清サンプルを抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と共にインキュベートした。洗浄後、組み換えａｔｔｏ－６４７Ｎ標識ヒトＣＤ１９－Ｆｃタンパク質（ＡＴＭ９２６９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を細胞に添加し、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ１９－標的タンパク質との相互作用を評価した。結果を、中央蛍光強度（ＦＩ）として提示する。

【図15】免疫グロブリン軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞と可溶性免疫グロブリンとのインビトロにおける共培養でみられたＩＦＮγ産生の消失。２人の健常ヒトドナー（ＢＣ１７０９０９及びＢＣ１７０８０３）からのＴ細胞に、ＣＤ１９．ＣＡＲ、カッパ．ＣＤ２８、又は非形質導入（ＮＴＤ）のいずれかを形質導入した。ＮＴＤ及びＣＤ１９．ＣＡＲは陰性対照として機能し、可溶性免疫グロブリンと一緒にプレーティングした場合、いずれの細胞型からもＩＦＮγ産生は予測できない。次いで、可溶性免疫グロブリンなし（ＴＣＭと表示）又は血清中１０％、５０％、９０％可溶性免疫グロブリンの範囲で可溶性免疫グロブリン濃度を変化させ、ＩｄｅＳの有り無しいずれかで、血清中にプレーティングした。次いで、プレーティングの２４時間後に共培養物から上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮγ濃度を測定した。ＮＴＤ及びＣＤ１９．ＣＡＲは、予測通り、いずれのプレーティング条件でもＩＦＮγを産生しなかった。カッパ．ＣＤ２８（グラフではＫ２８と表示）は、可溶性免疫グロブリンの存在下でＩＦＮγの産生量が増加した。しかし、ＩＦＮγを産生するカッパ．ＣＤ２８の能力は、グラフの右側に示されているように、ＩｄｅＳを共培養物に添加すると消失する。バーの各群において、バーは左から右へＮＴＤ、ＣＤ１９、Ｋ２８を示す。

【図16】カッパ．ＣＡＲ内でみられるＩＦＮγ産生の抑制。別の健常ドナー由来のＴ細胞にＣＤ１９．ＣＡＲ、カッパ．ＣＤ２８、ラムダ軽鎖を標的とするＣＡＲコンストラクト（ラムダ．ＣＤ２８）、及びＮＴＤを形質導入した。カッパ．ＣＤ２８は、可溶性免疫グロブリンの濃度を上昇させる条件でプレーティングするとＩＦＮγ産生を示し続け、ＩｄｅＳの存在下ではＩＦＮγ産生が減少した。ラムダ．ＣＤ２８ ＣＡＲコンストラクトは、ＩｄｅＳ分子の有無にかかわらず有意差を示さなかった。これは、共培養に用いた可溶性免疫グロブリン血清の多クローン性に起因している可能性が高く、ラムダ軽鎖の比率がラムダ．ＣＤ２８ ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するのに必要な閾値未満である可能性が高い。図１６Ａでは、バーの各群において、バーは左から右へＮＴＤ １Ｅ６、ＮＴＤ ２Ｅ６、ＮＴＤ ３Ｅ６を示す。図１６Ｂでは、バーの各群において、バーは左から右へＣＤ１９．ＣＤ２８ｚ １Ｅ６、ＣＤ１９．ＣＤ２８ｚ ２Ｅ６、ＣＤ１９．ＣＤ２８ｚ ３Ｅ６を示す。図１６Ｃでは、バーの各群において、バーは左から右へカッパ．ＣＤ２８ １Ｅ６、カッパ．ＣＤ２８ ２Ｅ６、カッパ．ＣＤ２８ ３Ｅ６を示す。図１６Ｄでは、バーの各群において、バーは左から右へラムダ．ＣＤ２８ １Ｅ６、ラムダ．ＣＤ２８ ２Ｅ６、ラムダ．ＣＤ２８ ３Ｅ６を示す。

【0027】

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＳの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１としても入手可能である。

【0028】

配列番号２は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＳの成熟配列である。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＦ１３９４９．１としても入手可能である。

【0029】

配列番号３は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＺの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１としても入手可能である。

【0030】

配列番号４は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＺの成熟配列である。

【0031】

配列番号５は、ハイブリッドＩｄｅＳ／Ｚの配列である。Ｎ末端は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠くＩｄｅＺをベースとする。

【0032】

配列番号６～２５は、本発明の方法において使用するための例示的なプロテアーゼの配列である。

【0033】

配列番号２６は、ＩｄｅＳポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号２の配列を含む（内部参照ｐＣＡＲＴ１２４）。

【0034】

配列番号２７は、ＩｄｅＺポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号４の配列を含む（内部参照ｐＣＡＲＴ１４４）。

【0035】

配列番号２８は、ＩｄｅＳ／Ｚポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号５の配列を含む（内部参照ｐＣＡＲＴ１４５）。

【0036】

配列番号２９は、配列番号３の６３～７３位に対応する連続配列ＰＬＴＰＥＱＦＲＹＮＮである。

【0037】

配列番号３０は、配列番号１の５８～６５位に対応する連続配列ＰＰＡＮＦＴＱＧである。

【0038】

配列番号３１は、配列番号３の３５～５４位に対応する連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。

【0039】

配列番号３２は、配列番号１の３０～４９位に対応する連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴである。

【0040】

配列番号３３～５５は、上記のプロテアーゼをコードしているヌクレオチド配列である。

【0041】

配列番号５６～６９は、本発明の方法において使用するための例示的なプロテアーゼの配列である。

【0042】

配列番号７０は、配列番号１の３３６～３３９位に対応する連続配列ＮＱＴＮである。

【0043】

配列番号７１は、配列番号１の３０～４９位に対応する連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲ ＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴである。

【0044】

配列番号７２～８６は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。

【0045】

配列番号８７は、配列番号１の３１～４９位に対応する連続配列ＳＦＳＡＮＱＥＩＲＹ ＳＥＶＴＰＹＨＶＴである。

【0046】

配列番号８８は、ＩｄｅＺポリペプチドＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１の３６～５４位に対応する配列ＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹ ＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。

【0047】

配列番号８９は、本発明のポリペプチドのＮ末端に存在し得る配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡ ＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。

【0048】

配列番号９０は成熟エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）のアミノ酸配列を示す。分泌シグナルを含む全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ００８５０．１で入手可能である。

【0049】

配列番号９１は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＩｄｅＺよりもヒトＩｇＧの切断により有効であるポリペプチドを表す。

【0050】

配列番号９２は、配列番号９１に関連し、配列番号９１のＮ末端の最初の２０アミノ酸が欠失していることを除いて配列番号９１と同一である。

【0051】

発明を実施するための形態
養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法
本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、該養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法を提供する。本発明者らは、血漿中の免疫グロブリンが免疫グロブリン軽鎖を標的とする移入細胞によって結合され得、このことが、消耗を引き起こし、移入細胞と腫瘍上のその標的との間の相互作用をブロックする可能性があることを明らかにした。本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が血漿中の免疫グロブリンを切断し得、このことが移入された治療細胞の抗がん活性を維持するのに役立つことを実証した。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、免疫グロブリン軽鎖を標的と養子細胞移入免疫療法の活性を増大又は維持することができる。

【0052】

本発明者らはまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞等の移入細胞の生存が制限されかつ活性の持続性が制限されることによって、養子細胞移入免疫療法の有効性が低下し得ることを明らかにし、本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質が移入細胞を保護し得ることを実施例において示した。具体的には、本発明者らは、細胞表面受容体特異的抗体が、移入細胞の潜在力を短縮する可能性があり、移入された細胞の治療効果は、レシピエントのコンディショニングを通して抗体のエフェクター機能を除去することから利益を得られることを明らかにした。同様に、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法によって結合した可溶性抗体も、移入細胞の能力を短縮し得る。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、移入細胞の生存及び活性を高め、改善された治療を提供することができる。また、本発明者らは、細胞表面受容体特異的抗体が、養子細胞移入免疫療法の受容体のその標的への結合に干渉し得ることも実証した。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することによって、養子細胞移入免疫療法の効力及び効果を高めることができる。

【0053】

特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入の一部として投与される細胞の活性を維持する又は増大させる方法であって、養子細胞移入免疫療法の前、後、又は同時にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、養子細胞移入の一部として投与される細胞の生存期間を延長する及び／又は増殖を増強する方法であって、養子細胞移入免疫療法の前、後、又は同時にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む方法を提供する。

【0054】

特定の実施形態では、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法のための患者のコンディショニング又は準備の方法を提供する。

【0055】

特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を受けているか又は受ける予定のある患者において、血漿ＩｇＧレベルを低下させるか又は血漿ＩｇＧ分子による補体若しくはＦｃ受容体の結合を減少させる方法を提供する。

【0056】

特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の前、後、又は同時にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入療法の効力を高める方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、養子細胞移入免疫療法の前、後、又は同時に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む、養子細胞移入療法の細胞表面受容体とその標的との結合を増加させる方法を提供する。

【0057】

特定の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与し、その後、養子細胞移入免疫療法を施すことを含む。このような方法により、血漿中に存在する免疫グロブリンを除去及び／又は不活性化することが可能になり、細胞を投与する前に既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）をタンパク質で不活性化することが可能になるので、細胞のより良好な活性、増幅、及び生存が可能になる。ＡＤＡは、発現したＣＡＲ若しくはＴＣＲ又はＨＬＡ抗原（特に同種療法において）を含む任意の細胞療法の任意の部分に結合することができる。実施例は、ＩｄｅＳ等のタンパク質が、免疫グロブリン軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を刺激又はブロックする抗体を除去するのに有効であることを実証する。実施例はまた、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳが既存の抗体を不活性化するのに有効であることを実証し、例えば、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳは、補体源又はエフェクター細胞の添加前に使用した場合に有効であった。また、実施例では、養子細胞移入免疫療法を施されたことのない健常個体及びＨＬＡ感作患者の血清中に存在する抗体が、受容体コンストラクト及びＣＡＲ Ｔ細胞等の細胞に結合し、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＣ、及び標的結合の減少等の有害な作用を媒介し得、本発明のタンパク質で処理することによってその全てを低減し得ることが実証される。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法による患者の治療のコンディショニングにおいて使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法による治療を受ける予定のある患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の開発のために以前血液を提供したことがあり、未だ免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を受けたことがない患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある患者を治療するための、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0058】

好ましい実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、養子細胞移入免疫療法を施す前にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。このような方法によって、可溶性血漿免疫グロブリンは切断され、その結果、免疫グロブリン軽鎖特異的細胞を刺激し、消耗させることもブロックすることもできなくなる。従って、移入細胞の活性が改善される。また、本発明は、患者が受けることが予定されている養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法の治療を受ける予定のある患者の治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を受ける予定のある患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある患者を治療するための養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0059】

特定の実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、養子細胞移入免疫療法を施した後にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。このような方法によって、既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）及び養子細胞移入免疫療法によって惹起された抗体を不活性化することが可能になる。このような方法では、不活性化しなければ移入細胞が結合し得る可溶性抗体を不活性化することもできる。従って、移入細胞の増幅及び生存率が改善される。実施例は、抗血小板特異的抗体の後にＩｄｅｓ及びＥｎｄｏＳを投与した場合に免疫性血小板減少症が低減されたことから、Ｉｄｅｓ及びＥｎｄｏＳが有害なポリクローナル抗体及び誘導された抗体を不活性化するのに有効であることを実証する。また、本発明は、以前施された養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を以前受けたことのある患者の治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法による治療を以前受けたことのある患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与を受ける予定のある患者を治療するための養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0060】

更なる実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、養子細胞移入免疫療法を複数回施す前及び後の両方にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。このような方法によって、既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）及び養子細胞移入免疫療法によって惹起された抗体の両方を不活性化することが可能になる。このような方法では、不活性化しなければ移入細胞が結合し得る可溶性抗体を不活性化することもできる。従って、移入細胞の増幅及び生存率が改善される。

【0061】

更なる実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、第１の養子細胞移入免疫療法を施した後かつ第２の養子細胞移入免疫療法を施す前にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。従って、タンパク質は、２回以上養子細胞移入免疫療法を施す間に投与される。このような方法では、過去の注射に由来する任意のＡＤＡが不活性化されるので、移入細胞がより良好に増幅及び生存することが可能になる。このような方法では、不活性化しなければ移入細胞が結合し得る可溶性抗体を不活性化することもできる。また、移入細胞を消耗又はブロックし得る可溶性抗体も除去又は不活性化される。好ましくは、そのような実施形態では、第１及び第２の、並びに任意のその後の養子細胞移入免疫療法は、同一又は類似のコンストラクト及び細胞を使用する。このような実施形態では、類似のコンストラクト又は細胞は、ＡＤＡ交差反応性エピトープを有し得る。また、本発明は、１回目の養子細胞移入免疫療法を既に受けており、２回目の養子細胞移入免疫療法を受ける予定のある患者の治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質も提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を複数回施すレジメンを受けている患者におけるＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法による治療を複数回施すレジメンの患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法組成物の投与を以前受けたことがあり、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与を以前受けたことがある患者を治療するための養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0062】

更なる実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、養子細胞移入免疫療法を２回以上施した後にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。このような方法は、養子細胞移入免疫療法によって惹起された抗体を不活性化することができる。このような方法では、不活性化しなければ移入細胞が結合し得る可溶性抗体を不活性化することもできる。また、移入細胞を消耗又はブロックし得る可溶性抗体も除去又は不活性化される。従って、移入細胞の増幅及び生存率が改善される。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法が既に２回以上施された患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。 また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を既に２回以上受けた患者の治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法による治療を既に２回以上受けた患者における血清ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。

【0063】

本発明の特定の実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を複数回投与することと、養子細胞移入免疫療法を複数回施すこととを含む。特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を複数回投与することは、同じ酵素を投与することを含む。ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の反復投与は、１～７日、５～７日、又は６～８日等の任意の適切な期間隔てられていてよい。特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を複数回投与することは、異なる酵素を投与することを含む。

【0064】

本発明の特定の実施形態では、養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益を改善する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与及び養子細胞移入免疫療法を同時に行うことを含む。実施例は、細胞表面受容体特異的抗体が養子細胞移入免疫療法受容体のその標的への結合に干渉し得るが、本発明のタンパク質の処理により結合を増加させることができるので、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の同時投与により、養子細胞移入免疫療法の効力及び効果を増大させ得ることを実証する。

【0065】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与すると、血漿ＩｇＧ免疫グロブリンの安定性、半減期、及びＦｃエフェクター機能が低下するので、免疫療法細胞に対する悪影響が低減する。また、ＩｇＧ免疫グロブリンが切断されると免疫療法細胞とＦｃｇＲとの間の架橋を阻害することができるが、そうしなければオフ腫瘍活性化及び消耗が引き起こされる可能性がある。本発明の方法の好ましい実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与により、患者の血漿中に存在する全て又は実質的に全てのＩｇＧ分子が切断される。

【0066】

本発明の方法の好ましい実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与により、患者の血漿中に存在する全て又は実質的に全てのＩｇＧ分子が不活性化される。特定の実施形態では、タンパク質は、患者の血漿中に存在する全て又は実質的に全てのＩｇＧ分子によるＦｃ受容体又は補体の結合を排除するのに十分な量で投与される。

【0067】

本発明の方法の特定の実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与により、血液中の抗体が除去又は不活性化される。特定の実施形態では、リンパ中の抗体も不活性化される。 特定の実施形態では、間質液中の抗体も不活性化される。従って、本発明に係る血漿からの抗体の除去又は不活性化は、リンパ及び／又は間質液からの抗体の除去又は不活性化を含み得る。リンパ及び／又は間質液中の抗体を除去又は不活性化すると血漿抗体の補充が遅れるので、血漿抗体の移入細胞に対する悪影響がより長く低減される。

【0068】

養子細胞移入免疫療法を施す前にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与する本発明の方法では、これら２つの投与及び施行は、好ましくは被験体の血漿中に存在する全て又は実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分な時間間隔だけ隔てられている。該間隔は、典型的には少なくとも３０分間、典型的には最長２１日間であってよい。ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与は、リンパ球枯渇と同時（例えば、同日）に行ってもよく、リンパ球枯渇の１～７日間前又は後に行ってもよい。特定の実施形態では、タンパク質の投与は、リンパ球枯渇と細胞療法の施行との間に行われる。「実質的に全て」とは、典型的には、血漿ＩｇＧによるＦｃ受容体及び補体の結合が、投与前に存在していたレベルの３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満に低下することを意味する。例えば、タンパク質がプロテアーゼ（ＩｄｅＳ等）である場合、その間隔は、被験体において任意の好適なアッセイで測定したとき、任意の好適なアッセイで測定したとき、被験体における血漿ＩｇＧの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を剤が切断するのに必要な時間となる。

【0069】

養子細胞移入免疫療法を施した後にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与する本発明の方法では、タンパク質は、好ましくは、養子細胞移入免疫療法の施行の２週間以内、１週間以内、２日以内、１日以内、又は５時間以内等、移入細胞の増殖中に投与される。

【0070】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、養子細胞移入免疫療法において患者に以前投与された細胞の抗体媒介性補体沈着、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、消耗、又は受容体活性化細胞死を低減する方法である。他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、養子細胞移入免疫療法においてその後患者に投与される細胞の抗体媒介性補体沈着、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、消耗、又は受容体活性化細胞死を低減する方法である。好ましい実施形態では、本発明は、養子細胞移入免疫療法において患者に以前投与された細胞の抗体媒介性補体沈着、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、消耗、又は受容体活性化細胞死の低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。他の好ましい実施形態では、本発明は、養子細胞移入免疫療法においてその後患者に投与される抗体媒介性補体沈着、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、消耗、又は受容体活性化細胞死の低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞又はＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）エフェクター細胞によって媒介される。

【0071】

特定の実施形態では、本発明の方法は、マウス免疫グロブリンに対する特異性を有する免疫グロブリンであるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を検出可能なレベルで有する患者に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。該投与は、養子細胞移入免疫療法を施す前であっても、後であっても、又は同時であってもよい。実施例は、患者血清中のＨＡＭＡが養子細胞移入免疫療法細胞に対して有害な作用を及ぼし得るが、これらの作用は本発明のタンパク質で処理することによって低減又は阻止できることを実証する。ＨＡＭＡは、マウス抗原との接触により正常個体でも誘導される可能性がある。マウスｍＡｂベースの生物製剤を投与されている患者では、ＨＡＭＡの頻度及び濃度が更に高くなり、場合によっては、これら治療薬の部分的な中和さえも引き起こすと予測することができる。

【0072】

本発明の方法では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼは、免疫抑制剤と共投与してもよい。本発明の方法では、プロテアーゼは、好ましくは静脈内注入によって投与されるが、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内、髄腔内、脳室内、又は他の適切な投与経路を含む任意の好適な経路によって投与されてもよい。投与されるプロテアーゼ又はエンドグリコシダーゼの量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ～２ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．０５～１．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ～１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｋｇ～０．７ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、最も好ましくは、０．２ｍｇ／ｋｇ～０．３ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、特に０．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＷであってよい。タンパク質を同一の被験体に複数回投与してもよいが、但し、タンパク質と結合することができる被験体の血漿中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）の量が臨床医によって決定された閾値を超えないことを条件とする。プロテアーゼに結合することができる被験体の血漿中のＡＤＡの量は、剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験又はタイターアッセイ等の任意の好適な方法によって求めることができる。

【0073】

がんを治療する方法
本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法と組み合わせて投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。実施例に示す可溶性免疫グロブリンの存在下におけるサイトカイン産生及び刺激の低減は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、移入細胞の消耗を低減し、活性を増大させ、改善されたがん治療を提供できることを示す。また、実施例に示す細胞の保護は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することにより、移入細胞の生存率及び活性が増大し、改善されたがん治療を提供できることを示す。

【0074】

好ましい実施形態では、がんを治療する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与し、その後、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を施すことを含む。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法によるがん治療のための患者のコンディショニングにおいて使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法によるがん治療を受ける予定のある患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法の開発のために以前血液を提供したことがあり、未だ養子細胞移入免疫療法を受けたことがない患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を以前投与されたことがある患者におけるがんを治療するための免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0075】

特定の実施形態では、がんを治療する方法は、養子細胞移入免疫療法を施した後、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。また、本発明は、以前施された養子細胞移入免疫療法の患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を以前受けたことのある患者におけるがんの治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法によるがん治療を以前受けたことのある患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与を受ける予定のある患者におけるがんを治療するための養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0076】

更なる実施形態では、がんを治療する方法は、養子細胞移入免疫療法を複数回施す前及び後の両方に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。

【0077】

更なる実施形態では、がんを治療する方法は、第１の養子細胞移入免疫療法の施行後かつ第２の養子細胞移入免疫療法の施行前に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。好ましくは、そのような実施形態では、第１及び第２の、並びに任意のその後の養子細胞移入免疫療法は、同一又は類似のコンストラクト及び細胞を使用する。また、本発明は、１回目の養子細胞移入免疫療法を既に受けており、２回目の養子細胞移入免疫療法を受ける予定のある患者におけるがんの治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質も提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を複数回施すレジメンを受けている患者におけるＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法によるがん治療を複数回施すレジメンの患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法組成物の投与を以前受けたことがあり、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与を以前受けたことがある患者におけるがんを治療するための養子細胞移入免疫療法組成物を提供する。

【0078】

更なる実施形態では、がんを治療する方法は、養子細胞移入免疫療法を２回以上施した後に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法が既に２回以上施された患者にとっての利益の改善において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法を既に２回以上受けた患者におけるがんの治療において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、養子細胞移入免疫療法によるがん治療を既に２回以上受けた患者における血漿ＩｇＧレベルの低減において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を提供する。

【0079】

本発明の特定の実施形態では、がんを治療する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を複数回投与することと、養子細胞移入免疫療法を複数回施すこととを含む。

【0080】

本発明の特定の実施形態では、がんを治療する方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質及び養子細胞移入免疫療法を同時に行うことを含む。

【0081】

本発明の治療方法では、既にがんに罹患している被験体に、がん又はその症状のうちの１つ以上を治癒、緩和、又は部分的に停止させるのに十分な量のタンパク質を投与し、養子細胞移入免疫療法を施す。このような治療的処置の結果、がんの寛解、安定化、転移の減少、消失がもたらされる可能性がある。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。被験体は、任意の適切な手段によって、がんに罹患しておりかつ養子細胞移入免疫療法に適していると同定されていてよい。

【0082】

養子細胞移入免疫療法
本発明の方法は、養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法から得られる利益を増大させ、それによって、がん、及び抗体媒介性自己免疫疾患等の他の疾患を治療する改善された方法を提供する。ＡＣＴ免疫療法は、特にがんを治療するための確立された強力なアプローチである。ＡＣＴとは、移植片の免疫学的な機能及び特徴を移行させることを目的として、エクスビボで成長させた細胞、最も一般的には免疫由来細胞を受動的に宿主に移入するものである。

【0083】

本発明に従って用いられるＡＣＴ免疫療法は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする。免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖であってもラムダ軽鎖であってもよい。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリン軽鎖である。ＡＣＴ免疫療法は、免疫グロブリン軽鎖と特異的に結合するｓｃＦｖ等の結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等の受容体コンストラクトを発現させることにより、免疫グロブリン軽鎖と結合する。ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖を標的とする例示的な抗体は、ＣＲＬ－１７５８（ＡＴＣＣ）ハイブリドーマによって産生される。ヒト免疫グロブリンのラムダ軽鎖を標的とする例示的な抗体は、ＨＰ６０５４（ＡＴＣＣ）ハイブリドーマによって産生される。カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を標的とする他の抗体も容易に入手可能である。ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖に結合するｓｃＦｖ又は代替コンストラクトは、そのような抗体の可変領域を用いて容易に作製することができる。

【0084】

ＡＣＴは、養子Ｔ細胞療法で一般的であるように自己（例えば、白血球除去によって単離され、形質導入され、投与の直ぐ約４週間前に選択される）であってもよく、同種であってもよく、この場合、本発明の方法は、同種細胞上で発現した受容体及び／又は他の抗原を認識する抗体を除去することによってＡＣＴを改善することができる。更に、ＡＣＴは、異種であってもよい。好ましい実施形態では、ＡＣＴは、自己である。

【0085】

ＡＣＴは、黒色腫等の進行固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を有する患者の治療に使用することができる自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の移入も含み得る。

【0086】

ＡＣＴはまた、黒色腫等の進行固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を有する患者の治療に使用することができる、健常ドナーから単離、調製、及び保存（例えば、凍結）された同種リンパ球の「既製品」の移入も含み得る。

【0087】

本発明の養子細胞免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞の投与を含んでいてもよく、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含んでいてもよい。抗原を認識するＣＡＲ／ＴＣＲを発現する細胞の集団は、活性化されたＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は樹状細胞の集団を含み得る。樹状細胞は、腫瘍を直接死滅させるだけでなく、抗原を提示することもできる。樹状細胞は、例えば、抗カッパ又はラムダＣＡＲを発現することができる。ＣＡＲ／ＴＣＲを発現する細胞の集団は、遺伝子編集された細胞の集団を含み得る。

【0088】

ＡＣＴでは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、デルタ－ガンマＴ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、及び末梢血単核細胞等の細胞型を使用し得る。ＡＣＴでは、腫瘍抗原との接触後に樹状細胞及び／又はマクロファージへの分化を誘導する目的で単球を使用してもよい。

【0089】

本発明の好ましい実施形態によれば、養子細胞療法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法であってよい。ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞で発現するカッパ又はラムダの軽鎖と特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを遺伝子操作することにより、カッパ又はラムダの軽鎖を標的とするように遺伝子操作することができる。好ましい実施形態では、細胞療法は、造血起源の細胞を使用する。実施例は、本発明の方法が造血器起源の細胞に対して特に有効であることを実証する。

【0090】

好ましい実施形態では、養子細胞療法、好ましくはＣＡＲ Ｔ細胞療法は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を標的とする細胞を用いる。例示的なＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０２１及びＶｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８に記載されている。ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖を標的とする例示的な抗体は、ＣＲＬ－１７５８（ＡＴＣＣ）ハイブリドーマによって産生される。ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖を標的とする例示的な抗体は、ＨＰ６０５４（ＡＴＣＣ）ハイブリドーマによって産生される。カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を標的とする他の抗体も容易に入手可能である。ヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖に結合するｓｃＦｖ又は代替コンストラクトは、例えば、Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０２１及びＶｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８に記載の通り、そのような抗体の可変領域を用いて容易に作製することができる。本発明で使用するためのＣＡＲ－Ｔコンストラクトは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のヒトＩｇＧ１ ＣＨ_２－ＣＨ_３領域及びヒンジ及びゼータ鎖、並びに任意でＣＤ２８ドメインを含んでいてよい。本発明で使用するためのＣＡＲ－Ｔコンストラクトは、ヒトＣＤ８ａヒンジ、及び膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８共刺激エンドドメイン、及びＴＣＲ／ＣＤ３複合体の細胞質内ＣＤ３ｚ鎖を含んでいてよい。

【0091】

好ましい養子細胞移入免疫療法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、自己細胞療法及び同種細胞療法）である。ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＮＨＬ、ＤＬＢＣＬ、及びＣＬＬ等の血液悪性腫瘍を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞療法が好ましい。承認されているＣＡＲ Ｔ細胞療法の例としては、ＮＨＬ及びＤＬＢＣＬを治療するためのＫＹＭＲＩＡＨ（登録商標）（チサゲンレクロイセル）、並びにＮＨＬを治療するためのＹＥＳＣＡＲＴＡ（登録商標）（アキシカブタゲンシロロイセル）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0092】

本発明の特定の態様によれば、ＣＡＲ／ＴＣＲ又はＴＩＬを発現する細胞の集団は、自己細胞であってもよく、別のヒトドナー由来の同種細胞であってもよく、異なる種の動物由来の異種細胞であってもよい。

【0093】

本発明の特定の態様によれば、ＣＡＲ／ＴＣＲ又はＴＩＬを発現する細胞の集団は、自己幹細胞の場合のように、白血球除去によって単離し、形質導入し、投与の直ぐ約４週間前に選択してもよく、いわゆる「既製品」の同種ＣＡＲ－Ｔ幹細胞療法の場合のように、健常ドナーから単離し、事前に調製し、次いで、１人以上の患者用に例えば凍結調製品等で保存してもよい。

【0094】

本発明の特定の態様によれば、ＣＡＲ／ＴＣＲを発現する細胞の集団は、抗原を認識するＣＡＲ／ＴＣＲを発現する活性化Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は樹状細胞の集団を含み得る。樹状細胞は、腫瘍を直接死滅させるだけでなく、抗原を提示することもできる。

【0095】

ＣＡＲ Ｔ細胞は、２つ以上の異なる抗原を標的とすることができる抗原結合ドメインを含んでいてもよい（すなわち、二重特異性又は二価、三重特異性又は三価、四重特異性等）。このように、ＣＡＲ Ｔ細胞は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み得る（例えば、タンデムＣＡＲ）。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫グロブリン軽鎖結合ドメイン及びＣＤ１９又はＣＤ２２の結合ドメインを含んでいてよく、従って、免疫グロブリン軽鎖及びＣＤ１９又はＣＤ２２の両方を認識し、結合することができる。又は更には、ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫グロブリン軽鎖結合ドメイン及びＣＤ２０結合ドメインを含んでいてよく、従って、免疫グロブリン軽鎖及びＣＤ２０の両方を認識し、結合することができる。

【0096】

あるいは、細胞集団中の各細胞又は細胞集団全体が、各ＣＡＲ Ｔ細胞コンストラクトが異なる抗原を認識することができる、１つを超える異なるＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、コンストラクト）を含んでいてもよい。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は３つの抗原を標的とすることができる。

【0097】

本発明の特定の態様によれば、細胞の集団は、自己であろうと同種であろうと、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９（クラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等による遺伝子編集技術を用いて操作され得る。これら技術は、遺伝子操作の技術分野において認識され、実践されており、関心対象の細胞のゲノムを改変するために標的配列を選択的に編集、破壊、又は挿入することを可能にする。従って、本発明で実施される養子移入用の単離された自己又は同種の細胞を編集して、既知の遺伝子又は配列を欠失又は置換させることができる。例えば、レシピエント患者における移植片対宿主病を排除する手段として、ＣＡＲ－Ｔ形質導入の前又は後に同種Ｔ細胞集団中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を欠失又は置換させることができる。

【0098】

本発明の特定の態様によれば、養子細胞移入免疫療法として投与される細胞の集団は、ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞、又は樹状細胞の集団を含んでいてよく、該ＣＡＲは、ヒト化抗カッパ又はラムダ軽鎖結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞質共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞外抗体又は抗体断片を含む。

【0099】

本発明の特定の実施形態では、養子細胞移入免疫療法として投与される細胞集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＣＲは、抗原提示細胞又は任意の有核細胞（例えば、赤血球を除く体内の全てのヒト細胞）の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の生成物に関連して提示される抗原性ペプチドの認識に関与する抗原特異的分子である。対照的に、抗体は、典型的には、可溶性又は細胞表面の抗原を認識し、ＭＨＣによる抗原の提示を必要としない。この系は、Ｔ細胞に、ＴＣＲを介して、細胞内で短いペプチドに加工され、細胞内ＭＨＣ分子に結合し、ペプチドＭＨＣ複合体として表面に送達される、細胞が発現する一連の細胞内抗原（ウイルスタンパク質を含む）全部を認識する潜在能力を授ける。この系により、事実上任意の外来タンパク質（例えば、変異したがん抗原又はウイルスタンパク質）又は異常発現したタンパク質をＴ細胞の標的として利用することが可能になる。

【0100】

本発明の特定の態様によれば、遺伝子操作されたＣＡＲ細胞は、健常ドナーからの同種であってよく、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮ等の遺伝子編集技術によって内因性ＴＣＲを切除又は置換するように更に遺伝子操作されてもよく、その場合、内因性ＴＣＲの欠失がＣＡＲ駆動性移植片対宿主病を排除する機能を有する。

【0101】

本発明の特定の態様によれば、自己細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞又は樹状細胞）を被験体から回収してもよい。これら細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本発明の特定の態様によれば、典型的には健常ドナーから単離された同種又は異種の細胞を使用してよい。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、又は多能性幹細胞が同種又は異種の細胞である場合、当技術分野で入手可能な任意の数の細胞株を使用することができる。

【0102】

細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離等の当業者に公知の任意の数の技術を使用して被験体から回収した血液の単位から得ることができる。本発明の特定の態様によれば、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。

【0103】

ネガティブ選択による細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの方法は、負の磁気免疫粘着を介した細胞の選別及び／若しくは選択、又はネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーである。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１ １ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。本発明の特定の態様によれば、細胞集団を濃縮する又はポジティブ選択することが望ましい場合がある。例えば、制御性Ｔ細胞に対するポジティブ濃縮は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋についてのポジティブ選択を使用することができる。

【0104】

回収された細胞を、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによってＣＡＲ又はＴＣＲを発現するように遺伝子操作してもよい。更に、遺伝子操作された細胞を、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって増幅してもよい。上に詳述した通り、ＣＡＲ又はＴＣＲは、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性であってよく、ＣＡＲ又はＴＣＲは、ｇｏＣＡＲ若しくはｇｏＴＣＲ、又は安全スイッチＣＡＲ若しくはＴＣＲ等のスイッチを含んでいてよく、ＣＡＲ又はＴＣＲは、武装化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ又はＴＣＲ等の免疫調節タンパク質を発現してよい。

【0105】

本発明の特定の態様によれば、本明細書に記載の増幅細胞が必要とされ得るときよりも前の任意の時期に、被験体から血液サンプル又はアフェレーシス生成物を回収してよい。このように、遺伝子操作され、増幅される（又はＴＩＬの場合には単に増幅される）細胞の供給源は、必要な任意の時点で回収されてよく、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、又はＴＩＬ等の所望の細胞を単離し、後に本明細書に記載のＡＣＴ等のＡＣＴにおいて使用するために凍結させてよい。

【0106】

本発明の特定の態様によれば、ＣＡＲ／ＴＣＲを発現する細胞の集団を用量分割によって被験体に投与してもよく、この場合、全用量のうちの第１の割合を治療の最初の日に投与し、全用量のうちの第２の割合を治療のその後の日に投与し、任意で、全用量のうちの第３の割合を治療の更に後の日に投与する。

【0107】

例示的な全用量は、１０^３ ～１０^１１ 細胞／被験体の体重、例えば、１０^３ ～１０^１０ 細胞／被験体の体重、又は１０^３ ～１０^９ 細胞／被験体の体重、又は１０^３ ～１０^８ 細胞／被験体の体重、又は１０^３ ～１０^７ 細胞／被験体の体重、又は１０^３ ～１０^６ 細胞／被験体の体重、又は１０^３ ～１０^５ 細胞／被験体の体重を含む。更に、例示的な全用量は、１０^４ ～１０^１１ 細胞／被験体の体重、例えば、１０^５ ～１０^１１ 細胞／被験体の体重、又は１０^６ ～１０^１１ 細胞／被験体の体重、又は１０^７ ～１０^１１ 細胞／被験体の体重を含む。

【0108】

例示的な全用量は、体重ではなく患者の体表面積に基づいて投与されてもよい。このように、全用量は、１０^３ ～１０^１３ 細胞／ｍ^２を含み得る。

【0109】

例示的な用量は、体重でも体表面積でもなく、平坦な又は一定の投与スケジュールに基づいてもよい。平板な一定用量は、潜在的な用量の計算ミスを回避することができる。更に、ジェノタイピング及びフェノタイピング戦略、並びに治療薬モニタリングを用いて、適切な用量を算出することができる。すなわち、患者の免疫抑制細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、骨髄由来抑制細胞）の免疫レパートリー及び／又は疾患負荷に基づいて投与を行ってよい。このように、全用量は、１０^３ ～１０^１３ 個の全細胞を含み得る。

【0110】

本発明の特定の態様によれば、細胞は、治療直後に被験体から得ることができる。これに関しては、特定のがん治療、特に免疫系に損傷を与える薬物による治療後、被験体が通常治療から回復しているであろう期間中の治療直後に、得られる特定の細胞（例えば、Ｔ細胞）の品質が、エクスビボにおける増幅能力について最適であり得る又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を用いてエクスビボにおいて操作した後、これら細胞は、生着の亢進及びインビボにおける増幅にとって好ましい状態であり得る。従って、この回復期中にＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、又は造血系統の他の細胞を含む血液細胞を回収することが、本発明の状況において企図される。

【0111】

本発明の特定の態様によれば、第２の投与は、同じ又は異なる有効量の、同じ又は異なるＣＡＲ／ＴＣＲを発現する細胞の異なる集団であってもよい。ＣＡＲ／ＴＣＲの相違は、例えば、異なる結合若しくは抗原認識ドメイン又は共刺激ドメイン等、ＣＡＲ／ＴＣＲの任意の局面におけるものであってよい。第２の投与は、追加的又は代替的に、ＩＬ－１２と共に分泌細胞を含んでいてもよく、細胞療法注入と同時に又は逐次、ＢＴＫ、Ｐ１３Ｋ、ＩＤＯの阻害剤等の低分子阻害剤による補助免疫療法を更に含んでいてもよい。

【0112】

本発明の特定の態様によれば、方法は、養子細胞移入免疫療法及びＩｇＧシステインプロテアーゼ又はエンドグリコシダーゼに加えて、１つ以上の追加の治療剤の投与を含んでいてもよい。例示的な治療剤としては、化学療法剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0113】

治療剤は、当技術分野で公知の任意の標準的な投与レジメンに従って投与してよい。例示的な化学療法剤としては、タキサン等の有糸分裂阻害剤、例えばドセタキセル及びパクリタキセル、並びにビンカアルカロイド、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンが挙げられる。例示的な化学療法剤としては、トポテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。

【0114】

例示的な化学療法剤としては、成長因子阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、Ｐ３８ａ ＭＡＰキナーゼ阻害剤；血管新生、新生血管形成、及び／又は他の血管形成の阻害剤；コロニー刺激因子、赤血球生成剤、抗アレルギー剤、免疫抑制及び／又は免疫調節剤、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫チェックポイント阻害剤、ＢＣＲ阻害剤（例えば、ＢＴＫ、Ｐ１３Ｋ等）、免疫代謝剤（例えば、ＩＤＯ、アルギナーゼ、グルタミナーゼ阻害剤等）等が挙げられる。本発明の特定の態様によれば、１つ以上の治療剤は、抗骨髄腫剤を含んでいてもよい。例示的な抗骨髄腫剤としては、デキサメタゾン、メルファラン、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、レナリドミド、プレドニゾン、カルムスチン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、及びサリドマイドが挙げられ、これらの幾つかは、化学療法剤、抗炎症剤、又は免疫抑制剤として上に示されている。

【0115】

治療されるがん
本発明の方法は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を用いて治療することができる任意のがんの治療を改善することができる。本発明の方法は、Ｂ細胞新生物を治療する方法において特に有用である。Ｂリンパ球はカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかを有する表面単クローン性免疫グロブリンを発現するので、Ｂ細胞新生物は、一般に免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法に適応すると予測される。免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を用いて治療可能であり得、そして本発明の好ましい実施形態において治療されるＢ細胞新生物の例は、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；小リンパ球性リンパ腫；Ｂ細胞性前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫；マントル細胞リンパ腫；濾胞性リンパ腫；粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；脾性辺縁帯リンパ腫；ヘアリーセル白血病；形質細胞腫／形質細胞骨髄腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫等）、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、及び原発性眼内リンパ腫である。特定の実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞白血病である。好ましい実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）、特に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、又は進行性濾胞性リンパ腫（ＦＬ）であり、これらは、カッパ又はラムダの軽鎖のいずれかにクローン的に制限される表面免疫グロブリンを発現することが確立されている。

【0116】

特定の実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、本発明の方法は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼを複数回投与することを含み、治療されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫である。特定のそのような実施形態では、がんを治療する方法は、好ましくは免疫グロブリン軽鎖、特にカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を含む、養子細胞移入免疫療法を２回以上施した後に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与することを含む。特定のそのような実施形態では、方法はまた、免疫抑制も含む。本発明の方法は、免疫抑制を必要とする腫瘍の治療に特に有効であり得る。

【0117】

特定の実施形態では、治療されるがんは、その表面にカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を発現する。特定の実施形態では、治療される患者は、その表面にカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を発現するＢ細胞新生物を有すると確定されている。

【0118】

固形がんに対する患者の抗がん応答は、がん性細胞だけでなく腫瘍微小環境によっても駆動される。この微小環境は、線維芽細胞、Ｔ細胞、及びＢリンパ球のような非悪性細胞によって作り出され、寛容原性であり得る。特にＴ細胞は、腫瘍溶解機能だけでなく、免疫系の天然の抗腫瘍応答を減少させる制御性サプレッサー表現型を発現し得るサブグループも有する。Ｂ細胞についても同じ二重の役割が観察されている。例えば、Ｂｒｅｇ細胞（例えば、腫瘍塊でＩＬ１０を産生するもの）は内因性の抗腫瘍応答を抑制することができる。

【0119】

軽鎖特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を用いてＢｒｅｇ細胞を腫瘍環境から除去することは、がんの治療に有利である可能性がある（Ｌｅｏｎｇ ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ，Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２１ Ｊｕｎ；１０（６）：２８３０－２８４１）。しかし、例えばリツキシマブでＢ細胞をほとんど除去してしまうと、すでに弱っているがん患者が感染症によりかかりやすくなる可能性がある。このような場合、本発明の方法を用いてＣＡＲ Ｔ細胞、例えばカッパ又はラムダの軽鎖特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で患者を治療して、それぞれの軽鎖Ｂ細胞集団を温存しながら腫瘍内のＢ細胞塊の大部分を除去して、完全に取り除かれた体液性応答性から患者を保護することは、特に有利である。

【0120】

好ましくは、本発明の方法は、ヒト患者を治療するために使用される。被験体がヒトである場合、被験体は任意の年齢であってよい。例えば、被験体は、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、８０歳以上、８５歳以上、又は９０歳以上であってよい。あるいは、被験体は、６０歳以下、５５歳以下、５０歳以下、４５歳以下、４０歳以下、３５歳以下、３０歳以下、２５歳以下、又は２０歳以下であってもよい。がんに罹患しているヒト被験体の場合、被験体は、新たに診断されてもよく、再発及び／又は難治性であってもよく、寛解期であってもよい。

【0121】

他の治療される疾患
本発明の方法は、免疫グロブリン軽鎖を標的とする養子細胞移入免疫療法を用いて治療することができる任意の疾患の治療を改善するのに好適である。幾つかの自己免疫疾患は、カッパ又はラムダの軽鎖のいずれかを有する単クローン性又はオリゴクローン性の免疫グロブリンの存在を特徴としている。免疫系の液性アームを完全に抑制することなく、カッパ又はラムダのＩｇを産生するＢ細胞を標的として排除することは、これら患者にとって有益である可能性がある。

【0122】

好適な疾患の例としては、若年性関節炎（特に、若年性特発性関節炎）、関節リウマチ、全身性粘液水腫性苔癬（硬化性粘液水腫）、グレーブス病、ＩｇＡ駆動性水疱性皮膚症、ＩｇＧ４駆動性水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、及びループス乳腺炎等のＩｇ軽鎖偏向自己免疫疾患が挙げられる。

【0123】

若年性関節炎は、これら患者におけるラムダ軽鎖のレベルが有意に上昇したことから、本発明の方法を用いて治療することができる（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．；Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｊａｎ；６５（１）：７６－８３）。更に、シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）のｋ：λ軽鎖の偏りが関節リウマチで観察されている（Ｓｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０２１ Ｍａｒ ３０；１６（３）：ｅ０２４７８４７．）。

【0124】

全身性硬化性粘液水腫の特徴は、単クローン性ガンマグロブリン血症（一般にＩｇＧλ）、並びに神経症状、リウマチ症状、心臓症状、肺症状、消化器症状、血液学的症状、及び眼徴候を含む全身性の兆候である。ＩｇＧλを発現する主な患者グループとは別に、クローン性カッパ若しくはラムダＩｇＡ、又はＩｇＭカッパを発現する患者サブグループも存在する。

【0125】

グレーブス病は、甲状腺刺激自己抗体がサイロトロピン受容体を活性化し、これが標的臓器を活性化することによって引き起こされる。シグナル伝達の増加は甲状腺の過形成を引き起こし、甲状腺ホルモン分泌を増加させ、臨床的な甲状腺中毒症を引き起こす可能性があり、これによって生命を脅かす甲状腺クリーゼが引き起こされる可能性がある。多くの患者は、カッパ又はラムダのオリゴクローン性ＩｇＧ１抗体を有している（Ｃｈａｚｅｎｂａｌｋ ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００２ Ｊｕｌ；１１０（２）：２０９－１７）

【0126】

水疱性皮膚症及び水疱性類天疱瘡は、自己免疫性水疱性皮膚疾患のサブタイプである。皮膚の水疱形成は、皮膚マトリックス成分に対する抗体によって駆動されると考えられる。水疱性類天疱瘡では抗基底膜領域抗体が優勢であり、該抗体はＩｇＧ４においてカッパ軽鎖への偏りを示す。
線状ＩｇＡ水疱性皮膚症を呈する患者は、カッパ又はラムダの軽鎖ＩｇＡのいずれかが優勢であり得る（Ｆｌｏｔｔｅ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６ Ｊａｎ；１３６（２）：４９１－６）。

【0127】

ＩｇＡラムダの偏りは、シェーグレン症候群でも観察されている。（Ｊａｓａｎｉ；Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９８８ Ｊａｎ；１５４（１）：１－５．）

【0128】

ループス乳房炎の幾つかの症例では、患者はカッパ軽鎖に制限された形質細胞の浸潤を有することが観察されたが、形質細胞新生物の免疫表現型は示さなかった（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２４ （２０２０））。このような患者は、本発明の方法を用いた治療から利益を得られる可能性がある。

【0129】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ
本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼを用いることにより、細胞を保護し、その生存を改善できるので、養子細胞移入免疫療法と組み合わせてがんの治療に有用であり得ることを実証した。本発明で使用するためのＩｇＧシステインプロテアーゼは、哺乳類血漿中の抗体の優勢なクラスであるＩｇＧに特異的である。

【0130】

好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのプロテアーゼは、イムリフィダーゼ（ＩｄｅＳ）（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、化膿性連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素）である。ＩｄｅＳは、ヒト病原体化膿性連鎖球菌によって産生される細胞外システインプロテアーゼである。ＩｄｅＳは元々Ａ群連鎖球菌株の血清型Ｍ１から単離されたが、現在では試験した全てのＡ群連鎖球菌株においてｉｄｅｓ遺伝子が同定されている。ＩｄｅＳは、並外れて高い程度の基質特異性を有しており、その唯一同定されている基質がＩｇＧである。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスの重鎖の下部ヒンジ領域において、単一のタンパク質分解的切断を触媒する。ＩｄｅＳはまた、様々な動物におけるＩｇＧの幾つかのサブクラスの重鎖の対応する切断も触媒する。ＩｄｅＳは、２段階機序を介してＩｇＧをＦｃ及びＦ（ａｂ’）_２の断片に効率的に切断する。第１段階では、ＩｇＧの１本（第１の）重鎖が切断されて、非共有結合的に結合したＦｃ分子を有する単一切断型ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）分子が作製される。ｓｃＩｇＧ分子は、事実上、元のＩｇＧ分子の残りの（第２の）重鎖を保持する中間生成物である。機序の第２段階では、この第２の重鎖がＩｄｅＳによって切断されて、Ｆ（ａｂ’）_２断片及びホモ二量体Ｆｃ断片が遊離する。これらは、生理学的条件下で一般的に観察される生成物である。還元条件下では、Ｆ（ａｂ’）_２断片は２つのＦａｂ断片に解離し得、ホモ二量体Ｆｃはその構成単量体に解離し得る。配列番号１は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＳの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１としても入手可能である。配列番号２は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＳの成熟配列である。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＦ１３９４９．１としても入手可能である。

【0131】

別の実施形態では、本発明の方法で使用するためのプロテアーゼは、主にウマでみられる細菌であるストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）の亜種ズーエピデミカス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）によって産生されるＩｇＧシステインプロテアーゼであるＩｄｅＺである。配列番号３は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＺの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１としても入手可能である。配列番号４は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＺの成熟配列である。

【0132】

別の実施形態では、本発明の方法において使用するためのプロテアーゼは、配列番号５等のハイブリッドＩｄｅＳ／Ｚである。Ｎ末端は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠くＩｄｅＺをベースとする。

【0133】

好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号２、４、又は５を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。本発明で使用するプロテアーゼは、標準的な細菌発現系での発現及びそれからの単離を支援するためにＮ末端に追加のメチオニン（Ｍ）残基及び／又はＣ末端にタグを含み得る。好適なタグとしては、ポリペプチドのＣ末端に直接連結されてもよく、任意の好適なリンカー配列、例えば、３つ、４つ、又は５つのグリシン残基によって間接的に連結されてもよいヒスチジンタグが挙げられる。ヒスチジンタグは、典型的には６つのヒスチジン残基からなるが、これよりも典型的には最大７アミノ酸、最大８アミノ酸、最大９アミノ酸、最大１０アミノ酸、又は最大２０アミノ酸長くてもよく、例えば５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸短くてもよい。

【0134】

更に好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号６～２５のいずれか１つの配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又はからなっていてもよい。これら配列は、プロテアーゼ活性が増大した及び／又は免疫原性が低下したＩｄｅＳ及びＩｄｅＺのポリペプチドを表す。配列番号６～２５はそれぞれ、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含んでいてもよい。ヒスチジンタグは、好ましくは、６つのヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、３×グリシン残基又は５×グリシン残基のリンカーによってＣ末端に連結される。

【0135】

更に好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号５６～６９のいずれか１つの配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又はからなっていてもよい。これら配列は、プロテアーゼ活性が増大した及び／又は免疫原性が低下したＩｄｅＳポリペプチドを表す。配列番号５６～６９はそれぞれ、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含んでいてもよい。ヒスチジンタグは、好ましくは、６つのヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、３×グリシン残基又は５×グリシン残基のリンカーによってＣ末端に連結される。

【0136】

更に好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、任意で最大３つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のアミノ酸置換を有する、配列番号６～２５のいずれか１つの配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又はからなっていてもよい。配列番号６～２５及びそのバリアントはそれぞれ、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含んでいてもよい。

【0137】

更に好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、任意で最大３つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のアミノ酸置換を有する、配列番号５６～６９のいずれか１つの配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又はからなっていてもよい。配列番号５６～６９及びそのバリアントはそれぞれ、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含んでいてもよい。

【0138】

更に好ましい実施形態では、本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号９１、配列番号９２、又はそれぞれ配列番号９１若しくは配列番号９２に対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸改変（複数可）を有する配列番号９１若しくは配列番号９２のバリアントの配列を含んでいてもよく、又はから本質的になっていてもよく、又はからなってもよいが、但し、該配列は、（ａ）配列番号３の１０ ９５位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）、（ｂ）配列番号３の９９位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）、及び（ｃ）配列番号３の２２６位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）を保持しており、同じアッセイで測定した場合、ポリペプチドは、それぞれ配列番号９１又は９２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも同程度ヒトＩｇＧを切断するのに有効であることを条件とする。好ましくは、改変のうちの少なくとも１つ又は改変の全ては、配列番号４のポリペプチド配列における対応する位置に存在するアミノ酸と同じアミノ酸をもたらさない。

【0139】

本発明のポリペプチドは、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも２６０アミノ酸長、少なくとも２７０アミノ酸長、少なくとも２８０アミノ酸長、少なくとも２９０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、又は少なくとも３１０アミノ酸長である。本発明のポリペプチドは、典型的には、４００アミノ酸長以下、３５０アミノ酸長以下、３４０アミノ酸長以下、３３０アミノ酸長以下、３２０アミノ酸長以下、又は３１５アミノ酸長以下である。上記下限のいずれかを上記上限のいずれかと組み合わせて、本発明のポリペプチドの長さについての範囲を提供できることが理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、１００～４００アミノ酸長又は２５０～３５０アミノ酸長であってよい。ポリペプチドは、好ましくは、２９０～３２０アミノ酸長、最も好ましくは、３００～３１５アミノ酸長である。

【0140】

本発明のプロテアーゼの一次構造（アミノ酸配列）は、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、又はＩｄｅＳ／Ｚの一次構造、具体的には、それぞれ配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列に基づく。本発明のプロテアーゼの配列は、配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列のバリアントを含んでいてもよい。バリアント配列は、配列番号２、４、又は５の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であってよい。バリアントは、国際公開第２０１６／１２８５５８号又は同第２０１６／１２８５５９号で同定された指定の改変のうちの１つ以上を含むことを除いて、配列番号２、４、又は５の配列と同一であってよい。配列番号２、４、又は５の配列に対する同一性は、配列番号２、４、若しくは５に示す配列の少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、若しくはそれ以上の連続するアミノ酸の領域にわたって、又はより好ましくは配列番号４、若しくは５の完全長にわたって測定してよい。

【0141】

本発明で使用するためのプロテアーゼは、配列番号２、４、又は５の配列に対して改変、例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換が行われている配列番号２、４、又は５のアミノ酸配列のバリアントを含むＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、又はＩｄｅＳ／Ｚのポリペプチドであってよい。このような改変は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換では、アミノ酸が類似の化学的構造、類似の化学的特性、又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換される。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は電荷を有していてよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族のアミノ酸の代わりに、芳香族又は脂肪族の別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変更は、当技術分野で周知である。

【0142】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は、任意の好適な方法によって、例えば、ＩｇＧを含有するサンプルと共にポリペプチドをインキュベートし、ＩｇＧ切断産物の存在を判定することによって評価することができる。好適な方法については、国際公開第２０１６／１２８５５９号に記載されている。好適なアッセイとしては、国際公開第２０１６／１２８５５９号に記載されているもの等のＥＬＩＳＡベースのアッセイが挙げられる。このようなアッセイでは、典型的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の抗体標的でアッセイプレートのウェルをコーティングする。次いで、試験するポリペプチドのサンプルをウェルに添加し、続いて、この例ではＢＳＡに特異的な抗体である標的特異的抗体のサンプルを添加する。ポリペプチド及び抗体を、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に好適な条件下で相互作用させる。好適な間隔後にアッセイプレートを洗浄し、標的特異的抗体に特異的に結合する検出抗体を、標的特異的抗体への結合に好適な条件下で添加する。検出抗体は、各ウェル中の標的に結合している任意のインタクトな標的特異的抗体に結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、そのウェルに結合した標的特異的抗体の量に比例する。検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接又は間接的にコンジュゲートすることができ、その結果、各ウェルに残存する検出抗体の量を求めることができる。ウェル中に存在していた被験ポリペプチドの効力が高いほど、残存するインタクトな標的特異的抗体が少なく、従って、存在する検出抗体も少ない。典型的には、所与のアッセイプレートの少なくとも１つのウェルには、被験ポリペプチドの代わりにＩｄｅＳが含まれており、その結果、被験ポリペプチドの効力をＩｄｅＳの効力と直接比較することができる。比較のためにＩｄｅＺ及びＩｄｅＳ／Ｚを含めてもよい。

【0143】

他のアッセイでは、被験ポリペプチドによるＩｇＧの切断によって生じるＩｇＧの断片を直接可視化及び／又は定量することにより、被験ポリペプチドの効力を求めることができる。この種のアッセイについては、国際公開第２０１６／１２８５５９号にも記載されている。このようなアッセイでは、典型的には、タイトレーション系列における異なる濃度の試験ポリペプチド（又は対照としてのＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、及びＩｄｅＳ／Ｚのうちの１つ以上）と共にＩｇＧのサンプルをインキュベートする。次いで、各濃度でインキュベートの結果生じた生成物を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥによってゲル電気泳動を用いて分離する。次いで、ＩｇＧ全体及びＩｇＧの切断によって生じた断片をサイズによって同定し、好適な色素による染色の強度によって定量することができる。切断断片の量が多いほど、所与の濃度における被験ポリペプチドの効力が高い。本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＺ及び／又はＩｄｅＳよりも低い濃度（タイトレーション系列におけるより低い点）で検出可能な量の切断断片を生成する。この種のアッセイは、各切断事象から生じた異なる断片の量を求めることもできるので、ＩｇＧ分子の第１又は第２の重鎖の切断により有効である被験ポリペプチドの同定も可能になり得る。本発明のポリペプチドは、特にＩｇＧがＩｇＧ２アイソタイプである場合、ＩｇＧ分子の第２の鎖よりも第１の鎖の切断により有効であり得る。本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ２よりもＩｇＧ１の切断により有効であり得る。

【0144】

ＩｇＧエンドグリコシダーゼ
本発明者らは、ＩｇＧエンドグリコシダーゼを用いることにより、細胞を保護し、その生存を改善できるので、養子細胞移入免疫療法と組み合わせてがんの治療に有用であり得ることを実証した。本発明で使用するためのＩｇＧエンドグリコシダーゼは、哺乳類血漿中の抗体の優勢なクラスであるＩｇＧに特異的である。

【0145】

剤は、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する、好ましくはＩｇＧのＦｃ領域におけるＡｓｎ－２９７（Ｋａｂａｔ付番）のグリカン部分を切断するタンパク質であってよい。このようなタンパク質の好ましい例は、ＥｎｄｏＳ（Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ｏｆ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、化膿性連鎖球菌のエンドグリコシダーゼ）であり、これは、実施例において有効であることが示される。ＥｎｄｏＳは、正常にグリコシル化されたＩｇＧのアスパラギン結合型グリカンのβ－１，４－ジ－Ｎ－アセチルキトビオースコアを加水分解する（図１８を参照）。ＥｎｄｏＳの成熟配列を配列番号９０として提供する。タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、又は別の細菌、例えば、腺疫菌若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス、又はヒツジ偽結核菌、大便連鎖球菌、若しくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカに由来するそのホモログであってもよい。剤は、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、又はＥｎｄｏＦ_２であってよい。

【0146】

あるいは、タンパク質は、配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有し、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する任意のアミノ酸配列を含むか又はからなるＥｎｄｏＳタンパク質のバリアントであってもよい。ＥｎｄｏＳタンパク質のバリアントは、配列番号９０のアミノ酸配列に対して最大１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失がなされたアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよいが、但し、バリアントがＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有することを条件とする。該アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的である。

【0147】

あるいは、剤は、配列番号９０の断片を含むか又はからなり、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよく、好ましくは、該断片は、４００～９５０アミノ酸長、５００～９５０アミノ酸長、６００～９５０アミノ酸長、７００～９５０アミノ酸長、又は８００～９５０アミノ酸長を有する。好ましい断片は、配列番号９０のアミノ酸１～４０９からなり、これは、連鎖球菌システインプロテイナーゼＳｐｅＢによる切断によって生成されたＥｎｄｏＳの酵素的に活性のあるα－ドメインに対応する。断片は、配列番号９０のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を欠失させることによって作製されてもよい。最大１残基、２残基、３残基、４残基、５残基、１０残基、２０残基、３０残基、４０残基、５０残基、１００残基、２００残基、３００残基、４００残基、５００残基、若しくは５５０残基、又はそれ以上を欠失させてよい。欠失した残基は、他の残基と隣接していてもよい。

【0148】

配列番号２の任意の断片又はバリアントは、好ましくは、配列番号９０の残基１９１～１９９、すなわち、配列番号１のＬｅｕ－１９１、Ａｓｐ－１９２、Ｇｌｙ－１９３、Ｌｅｕ－１９４、Ａｓｐ－１９５、Ｖａｌ－１９６、Ａｓｐ－１９７、Ｖａｌ－１９８、及びＧｌｕ－１９９を含む。これらアミノ酸は、グルタミン酸で終わる完璧なキチナーゼファミリー１８の活性部位を構成する。キチナーゼの活性部位におけるグルタミン酸が、酵素活性に必須である。従って、最も好ましくは、配列番号９０のバリアントは、配列番号９０のＧｌｕ－１９９を含有する。配列番号２のバリアントは、１つ以上の保存的置換を有する配列番号９０の残基１９１～１９９を含有していてもよいが、但し、バリアントが配列番号９０のＧｌｕ－１９９を含有することを条件とする。

【0149】

ＩｇＧレベルの評価及び投与のタイミング
本発明の方法におけるＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与及び養子細胞移入免疫療法の適切なタイミングは、例えば、血漿又は血清のＩｇＧレベルを評価するためのアッセイを使用して決定することができる。例えば、被験体の血清又は血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子によるＦｃ受容体及び／又は補体の結合をタンパク質が不活性化又は排除するのに要する時間量を測定してよい。これは、任意で、個体から採取した血清又は血漿のサンプルを試験し、任意の好適なアッセイを適用することによって決定することができる。幾つかの例示的な好適なアッセイを、実施例に記載する。

【0150】

このようなアッセイは、例えばＥＬＩＳＡにおいて、１つ以上のＦｃ受容体に結合することができる血清又は血漿のサンプル中のＩｇＧ分子の存在について直接試験することができる。あるいは、そのようなアッセイは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質でＩｇＧを処理することによって生じると予測される１つ以上の反応生成物の存在について試験してもよいという点で間接的であってもよい。例えば、剤がＩｇＧタンパク質を切断する酵素である場合、血清又は血漿のサンプルをインタクトなＩｇＧ分子又は切断の結果生じた断片の存在についてアッセイしてよい。これは、任意の好適な方法によって、例えば、例えば質量分析若しくはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分子量に基づいて分子及び断片を分離することによって、又は例えばＥＬＩＳＡによって分子若しくは断片を特異的に検出することによって、達成することができる。あるいは、被験体由来の血清又は血漿をＦｃｇＲを発現する細胞と混合し、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧを用いたフローサイトメトリーによってＩｇＧの結合をモニタリングすることにより、ＩｇＧを検出することもできる。

【0151】

臨床状況で血清又は血漿のサンプル等のサンプル中のＩｇＧの量を評価するための従来の方法は、その速度、使用の容易さ、及び精度からネフェロメトリー及び比濁法に依拠している。ネフェロメトリー及び比濁法のいずれにおいても、透明な容器内の液体サンプルに光源を投射する。比濁法は、光の強度の減少を測定し、ネフェロメトリーは、サンプルを通過する際の光の散乱を測定し、これは溶液中の免疫グロブリンの濃度に比例する。いずれの原理も、添加された抗ＩｇＧ抗体がサンプル中の抗原と反応して抗原／抗体複合体を形成（凝集）することに基づいている。ＰＥＧを添加することにより、反応が終点まで速やかに進行し、感度が増大し、過剰な抗原を含有するサンプルから偽陰性の結果が生じるリスクを低減することができる。ＩｇＧ分析の場合、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）_２部分が抗ＩｇＧ抗体によって架橋され、凝集反応を引き起こす。しかし、存在するＩｇＧの一部又は全部がインタクトではない可能性があるとき、このような方法は適切でない場合がある。例えば、例えば本発明の方法においてサンプルを採取した被験体にＩｇＧシステインプロテアーゼ（ＩｄｅＳ等）が投与された場合又はサンプルにそのようなプロテアーゼが投与された場合、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｃの断片等の切断断片が存在するであろう。これは、Ｆ（ａｂ’）_２断片が依然としてサンプル中に存在する限り、従来のネフェロメトリー及び比濁法の凝集反応には影響を与えない。インタクトなＩｇＧと比較してＦ（ａｂ’）_２断片の半減期は短いことから、凝集は経時的に減少するが、サンプル中に存在するインタクトなＩｇＧの量に比例するわけではない。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ（ＩｄｅＳ等）の存在によって影響を受けるサンプルは、従来の方法によって評価することができない。本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ（ＩｄｅＳ等）の存在によって影響を受けるサンプルに適合し、本発明の他の方法との併用を含む（がこれに限定されない）任意の臨床状況で使用可能な、ＩｇＧ濃度の新規アッセイを開発した。

【0152】

該方法は、インタクトなＩｇＧとＩｄｅＳによって生成されたＦ（ａｂ’）_２断片とを識別することができる。これは、異なる断片、すなわち、抗Ｆａｂ抗体及び抗Ｆｃ抗体を検出する抗体を利用することによって達成された。アッセイにおいて使用される抗体は、サンプルに影響を与えるＩｇＧシステインプロテアーゼ（典型的には、ＩｄｅＳ）の基質であってはならない。これにより、サンプル中に存在する可能性のある任意の活性プロテアーゼがアッセイ試薬に影響を与えるのを避けられる。これは、異なる種由来のＩｇＧを試験することによって、又は抗体全体の代わりに抗体断片（すなわち、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）_２断片）を使用することによって達成することができる。通常、抗Ｆ（ａｂ’）_２剤を捕捉試薬としてサンプルと共にインキュベートする。捕捉試薬は、典型的には、例えばアッセイプレートのウェルに固定される。次いで、結合したＩｇＧを、検出試薬としての抗Ｆｃ剤と共にインキュベートすることによって検出する。従って、ネフェロメトリー及び比濁法とは対照的に、Ｆａｂ部分及びＦｃ部分の両方を保有するＩｇＧのみが検出される。検出試薬は、典型的には、蛍光色素又は発色基質と反応する酵素等の検出を容易にする部分に直接又は間接的にコンジュゲートすることができる。捕捉試薬及び検出試薬は、ＩｇＧのＦａｂ部分又はＦｃ部分を特異的に認識する任意の他の分子であってよく、逆の順序で使用してもよい、すなわち、抗Ｆｃを用いて捕捉し、抗Ｆａｂを用いて検出してもよい。アッセイは、従来のＥＬＩＳＡ又はＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙフォーマット等の任意の好適なフォーマットで実施することができる。

【0153】

場合によっては、ＩｇＧシステインプロテアーゼがＩｄｅＳである場合等、サンプルは、一方の重鎖のみが切断され、Ｆ（ａｂ’）_２が他方のインタクトな重鎖に付着したままであるｓｃＩｇＧ等の中間断片を含み得る。このような場合、ｓｃＩｇＧ断片は、アッセイによってインタクトなＩｇＧとして誤って同定される恐れがある。従って、方法は、サンプル中に存在する断片のサイズを評価する補完工程を含んでいてもよい。ヒンジ領域の下方の重鎖間にはジスルフィド橋が存在しないので、ｓｃＩｇＧ断片における重鎖のＦｃ部分は、変性条件下で約２０～２５ｋＤａのタンパク質としてインタクトな重鎖から分離される。異なる断片サイズは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の任意の好適な方法を用いて検出及び定量することができる。任意の補完工程を含む方法の具体的な実施形態については、実施例１（有効性評価を参照）に記載する。方法は、臨床状況におけるＩｄｅＳの有効性を評価するのに特に有効である。

【0154】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質がＩｇＧにおけるグリカン部分を切断する酵素である場合、正常な若しくは切断されたグリカンのいずれかを保有するＩｇＧ分子の存在又は切断の結果生じたグリカン断片について、血清又は血漿のサンプルをアッセイしてよい。これは、任意の好適な方法によって、例えば、例えば質量分析若しくはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分子量に基づいて分子及び／若しくは断片を分離することによって、又は例えばＥＬＩＳＡによって分子若しくは断片を特異的に検出することによって達成することができる。

【0155】

養子細胞移入免疫療法の前にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与する方法では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与と養子細胞移入免疫療法との間の時間間隔の下限は、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、又は少なくとも６時間から選択することができる。被験体の血清又は血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が、より早い時点で十分に減少又は消失したと判断された場合、下限は上記のいずれよりも短くてよい。好ましくは、下限は２時間である。

【0156】

養子細胞移入免疫療法の前にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与する方法では、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与と養子細胞移入免疫療法との間の時間間隔の上限は、下限とは独立して選択してよく、ＩｇＧの内因的産生が始まって、方法を実施する前に被験体の血清又は血漿中に存在していたＩｇＧ分子に置き換わる又は完全に置き換わるのに要する時間によって決定してよい。これは、個体から採取した血清又は血漿のサンプルを試験し、下限に関して上述したもの等の任意の好適なアッセイを適用することによって決定することができる。新たに合成されたＩｇＧは、典型的には、３～４日以内に血漿中に再び現れ始め、約３週間（２１日）までに全ての置き換えが完了する。従って、上限は、最長２１日、最長１８日、最長１４日、最長１３日、最長１２日、最長１１日、最長１０日、最長９日、最長８日、最長７日、最長６日、最長５日、最長４日、最長３日、最長２日、最長２４時間、最長１８時間、最長１２時間、最長１０時間、最長８時間、最長７時間、最長６時間、最長５時間、最長４時間、最長３時間、最長２時間、又は最長１時間から選択することができる。好ましくは、上限は４８時間である。

【0157】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質の投与と養子細胞移入免疫療法との間の時間間隔は、最長２４時間、最長１２時間、又は最長６時間であってよく、その結果、投与工程（ａ）及び（ｂ）の両方を同日に又は治療センターへの同一来院中に実施することが可能である。これは、特に治療センターへのアクセスが限られる可能性がある場合、非常に有利である。

【0158】

免疫療法の有効性を高めるために養子細胞移入免疫療法の後にＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼの活性を有するタンパク質を投与する方法では、投与のタイミングは、ＩｇＧ ＡＤＡの増加に依存する。特定の実施形態では、タンパク質は、養子細胞移入免疫療法の４～８日後、例えば、５～７日後又は６日後に投与される。抗体応答がリコール応答である場合、このタイミングが適切であり得る。抗体応答が一次応答である場合、タンパク質は、養子細胞移入免疫療法の１週間超後、例えば、１０日後、２週間後、３週間後、若しくは４週間後、又は１０日～２週間後、１０日～３週間後、２～４週間後に投与してよい。

【0159】

安全スイッチ
いかなる種類の養子細胞移入免疫療法を施す場合でも懸念されるのは、重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＳＲ）又は他の合併症が発生する可能性である。従って、養子細胞移入免疫療法による標的細胞の溶解を一時的に停止できることが、安全性の面から望ましい。これを行うための好適な手段は、当技術分野において公知である。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の枯渇は、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、又はヒトチミジル酸キナーゼ（ＴＭＰＫ）等の自殺遺伝子も発現するＣＡＲコンストラクトを設計することによって達成できる。

【0160】

Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の場合、ＢＣＲは、カッパ又は軽鎖ＣＡＲ Ｔ細胞のトリガー標的となる。細胞表面からＢＣＲが一時的に除去されると、エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞の活性が低下する。

【0161】

ＣＡＲの除去は多数の方法で行うことができる。例えば、細胞外リガンド結合ドメイン（複数可）と細胞内シグナル伝達ドメインとを接続するＣＡＲスペーサーを含むように、細胞を遺伝子操作してよい。有利なことに、これらのスペーサーはプロテアーゼによって切断されやすい可能性がある。これは、これらスペーサーを含有する任意の所与のｓｃＦｖ特異性のＣＡＲ Ｔ細胞は、プロテアーゼに曝露されると一時的に盲目化する可能性があり、その結果、患者における全てのＣＡＲ Ｔ細胞が排除される可能性があるため、有用である。

【0162】

好ましくは、スペーサーは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のＩｇＧの定常領域を含み得る。これら実施形態では、スペーサーは、イムリフィダーゼのようなＩｇＧ切断酵素によって切断され得る。これらＣＡＲスペーサーは、ＣＨ２又はＣＨ２－ＣＨ３のドメインを含み得る。ＩｇＧは、野生型の配列を有していてもよく、又は変異していてもよい。例えば、スペーサーは、変異を有するスペーサーを含まないＣＡＲ Ｔ細胞と比較してインビボにおける細胞のＦｃＲ媒介性認識が低下するように変異していてもよい。

【0163】

好適なスペーサーは、当技術分野において公知である。例えば、Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５ Ａｐｒ；２３（４）：７５７－７６８）には、ＦｃＲ結合を低減する変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃスペーサーを含むＣＡＲ Ｔについて記載されている。同様に、Ｓａｖｏｌｄｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１ Ｍａｙ；１２１（５）：１８２２－６）には、ｓｃＦｖとシグナル伝達ドメインとの間にインフレームでクローニングされたヒトＩｇＧ１－ＣＨ２ＣＨ３ドメイン由来のスペーサー領域を含むＣＡＲ Ｔについて記載されている（Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１５ Ｆｅｂ；３（２）：１２５－３５）も参照）。

【0164】

また、他のＩｇＧ切断酵素、例えばブデロビブリオ・バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）からクローニングされたもの等のシステインプロテアーゼ又はジンジパインを使用して実施してもよい。

【0165】

あるいは、養子細胞移入免疫療法を施す前にＩｇＧシステインプロテアーゼを投与する。これら実施形態では、ＩｇＧシステインプロテアーゼを投与してから養子細胞移入免疫療法を開始するまでの間に、プロテアーゼの少なくとも一部又は全部が患者の血液からクリアランスされるのに十分な時間（好ましくは、３日間超、例えば４日間超、５日間超、６日間超、７日間超、８日間超、９日間超、又は１０日間超）を確保することが好ましい。好適な時間枠は、当業者に公知である。

【0166】

ポリペプチドの生成
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の好適な手段によって生成することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学、又は液相ペプチド合成等の当技術分野において公知の標準的な技術を使用して直接合成してよい。あるいは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、該ポリペプチドをコードしている核酸分子又はベクターで形質転換することによって生成してもよい。細菌宿主細胞において発現させることによるポリペプチドの生成については、以下に記載され、国際公開第２０１６／１２８５５９号に例示されている。

【0167】

ポリペプチドを含む組成物及び製剤
本発明はまた、本発明の治療方法において使用するための、ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼを含む組成物も提供する。例えば、本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む組成物を提供する。担体（複数可）は、組成物の他の成分と適合し、かつ組成物が投与される被験体にとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体及び最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。

【0168】

好適な組成物の製剤化は、標準的な医薬製剤化の化学及び方法論を用いて実施することができ、それらは全て、当業者が容易に利用可能なものである。例えば、剤を１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤又はビヒクルと合わせてよい。湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、還元剤等の補助物質が、賦形剤又はビヒクル中に存在していてもよい。好適な還元剤としては、システイン、チオグリセロール、チオレドュシン（thioreducin）、グルタチオン等が挙げられる。賦形剤、ビヒクル、及び補助物質は、一般に、組成物を受け取る個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る薬学的剤である。薬学的に許容し得る賦形剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロール、及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。その中に薬学的に許容し得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩を含めてもよい。薬学的に許容し得る賦形剤、ビヒクル、及び補助物質に関する綿密な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。

【0169】

このような組成物は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売され得る。注射可能な組成物は、アンプル又は保存剤を含む複数回投与用容器等の単位剤形で調製、包装、又は販売され得る。組成物は、懸濁剤、液剤、油性又は水性のビヒクル中の乳剤、ペースト剤、及び移植可能な持続放出性又は生分解性の製剤を含むが、これらに限定されない。このような組成物は、懸濁化剤、安定剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用の組成物の一実施態様では、好適なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するための（例えば、散剤又は顆粒剤用の）乾燥形態で活性成分が提供された後、再構成された組成物が非経口投与される。組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁剤又は液剤の形態で調製、包装、又は販売され得る。この懸濁剤又は液剤は、公知の分野に従って製剤化され得、そして、活性成分に加えて、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、又は懸濁化剤等の追加成分を含んでいてもよい。このような無菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒、例えば水又は１，３－ブタンジオールを使用して調製され得る。他の許容し得る希釈剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油、例えば合成のモノグリセリド又はジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0170】

有用である他の非経口的に投与可能な組成物は、微結晶性形態で、リポソーム調製品で、又は生分解性ポリマー系の成分として活性成分を含むものを含む。制御放出又は移植用の組成物は、薬学的に許容し得る高分子又は疎水性の材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含んでいてよい。組成物は、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内、又は他の適切な投与経路を含む任意の好適な経路による投与に好適であり得る。好ましい組成物は、静脈内注入による投与に好適である。

【0171】

概要
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。

【0172】

更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する言及は、「複数のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」等を含む。

【0173】

特に禁止しない限り、本明細書に開示される方法の工程は、任意の適切な順序で実行され得、工程が列挙される順序は、限定的であるとみなされるべきではない。

【0174】

「ポリペプチド」は、本明細書では、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、Ｄ型又はＬ型の光学異性体を両方含む天然及び／又は非天然、すなわち合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ及びペプチドミメティックを指す。

【0175】

「患者」及び「被験体」という用語は互換的に使用され、典型的にはヒトを指す。ＩｇＧに対する言及は、特に断りのない限り、典型的にはヒトＩｇＧを指す。

【0176】

上述のアミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して同一性を計算したり、配列を並べたりすることができる（典型的には、そのデフォルト設定で）等価な又は対応する配列を同定する等）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲）。これら初期近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見つけるための検索を始めるためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの拡張を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。

【0177】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ある配列が別の配列と類似しているとみなされる。あるいは、ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）。

【0178】

上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0179】

実施例
既存の又は治療によって誘導された抗体がＣＡＲ Ｔ細胞に対して負の作用を有するかどうか、またイムリフィダーゼ又はＥｎｄｏＳによる処理を通じてこれらの作用を軽減することができるかどうかを調べるために、実施例１～５における実験を行った。ＩｇＧが細胞表面受容体に結合するインビトロ及びインビトロのモデルを使用することによって、ＣＡＲ Ｔ細胞に結合する抗薬物抗体を模倣するための系を開発した。これらモデルは、キメラ抗原受容体上の表面結合抗体の抗体媒介性エフェクター機構を模倣する。モデル系において、イムリフィダーゼ又はＥｎｄｏＳによる処理の効果について調べた。

【0180】

特に指示のない限り、使用した方法は、標準的な生化学的及び分子生物学的技術である。好適な方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。

【0181】

材料及び方法－実施例１～４
動物及び細胞株
Ｂａｌｂ／ｃ ＪＢｏｍＴａｃ、６週齢の雌をＴａｃｏｎｉｃから購入し、９週齢で使用する前に馴化させた。倫理承認Ｍ７２－１３（Ｌｕｎｄ）に従ってマウスを飼育し、処理した。

【0182】

Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＣＣ７８）及びＴＨＰ１単球細胞株（ＡＭＬ；ＴＩＢ－２０２）を完全Ｄ－ＭＥＭ １０培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｄ－ＭＥＭ、５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）中で培養した。

【0183】

抗体及び補体
ウサギ抗マウス血小板ＩｇＧ（血清）（コード＃ＣＬＡ３１４４０、ロット６３２７、Ｃｅｄｅｒｌａｎｄ）をプロテインＧで精製した。免疫性血小板減少（ＩＴＰ）実験のために、精製されたＩｇＧをＩｄｅＳで処理してｓｃＩｇＧ及び完全に切断されたＦｃ／Ｆ（ａｂ’）２の画分を作製した。切断産物の純度を、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲル分析によって確認した。

【0184】

抗ＣＤ２０ ＩｇＧ（リツキシマブ、Ｎ７０２２、１０ｍｇ／ｍＬ）はＭａｂｔｈｅｒａから購入し、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照（＃Ｉ５１５４）はＳｉｇｍａから購入した。

【0185】

Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｊａｐａｎ）製の細胞計数キットであるＣＣＫ－８を説明書に従って使用した。

【0186】

仔ウサギ血清補体（ＣＬ３４４１；ロット６３７４；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）は、使用前に滅菌水で再構成し、最終希釈度１：１０で培地で希釈した。

【0187】

ヒト血液を血清用のＢＤ ＣＡＴチューブ（＃３６８８１５；噴霧乾燥した血餅活性化剤（シリカ、ＰＶＰ、Ｌ－７２０））に回収し、－２０℃で凍結させた。血清は、補体源として使用する前に、Ｄａｕｄｉ細胞に対する低毒性について試験した。

【0188】

マウス抗ヒトＣ４ｄ（Ａ２１３、Ｑｕｉｄｅｌ）は、社内でビオチン化し、細胞染色のために１μｇ／ｍＬで使用した。

【0189】

ポリクローナルヒツジ抗ヒトＣ１ｑ（ＭＤ－１４－０１６２、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）をＦ（ａｂ’）２に分画し、ＦｒａｇＩＴキット（Ａ２－ＦＲ２－０２５、Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いて精製した（最終染色濃度、７５μｇ／ｍＬ）。蛍光色素ＳＡ－ＰＥ（ＢＤ－Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５４０６１）と一緒に、検出抗体としてロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｂｉｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ、７１３－０６５－００３）を使用した（２，５μｇ／ｍＬ）。

【0190】

７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、Ａ９４００）をＣＤＣアッセイにおける死細胞マーカーとして使用した。

【0191】

ＡＤＣＰアッセイでは、ＴＨＰ１細胞をＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬ（約２ｍＭ）のＦａｒＲｅｄ ＤＤＡＯ－ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃ３４５５３、ロット：３３Ｃ１－１）で染色し、Ｄａｕｄｉ細胞をカルセイン、ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３０９９、ロット２５２５７Ｗ）；（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬ原液）で染色した。

【0192】

酵素
化膿性連鎖球菌由来のＨｉｓタグ付きＥｎｄｏＳを大腸菌で発現させ、精製した。ＥｎｄｏＴｒａｐ ｂｌｕｅ ｍａｔｒｉｘを使用してリポ多糖（ＬＰＳ）を除去した。ＳＤＳ－ｐａｇｅゲルで純度を制御した。予測される１００ｋＤのバンドを超えるＨｉｓタグ精製後の追加のタンパク質バンドは、質量分析により宿主細胞タンパク質ではなく、ＥｎｄｏＳ起源であることが示された。

【0193】

ＩｄｅＳ（ＩｇＧ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、化膿性連鎖球菌のＩｇＧ分解酵素）は、ヒト病原体である化膿性連鎖球菌が分泌するシステインエンドペプチダーゼであり、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の下部ヒンジにおける単一のタンパク質分解を高度に特異的に触媒する。

【0194】

実施例１－標的細胞への抗体媒介性補体結合
ＡＤＡのＣＡＲへの結合と同様に受容体特異的抗体（ＲＴＸ）が細胞表面受容体（ＣＤ２０）に結合するという意味でＣＡＲ－Ｔ療法におけるＡＤＡ相互作用のモデル系である、リツキシマブ（ＲＴＸ）でオプソニン化したＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞を用いて、細胞療法に対する既存の又は治療によって誘導された抗体の効果並びにそのような抗体に対するＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳの影響について調べた。

【0195】

Ｄａｕｄｉ細胞への補体沈着
Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０Ｅ７個／ｍＬで５０μＬ）を、１００μｇ／ｍＬで出発して最終濃度０．０１μｇ／ｍＬまで低下させた１：１０段階タイトレーションのＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳと共に、最終濃度２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０抗体ＲＴＸ又はヒトＩｇＧ１陰性対照抗体で処理した。総体積１５０μＬ／ウェルを含有するＶ字型９６ウェルマスタープレートを３７℃で１１０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、５０μＬの体積の上清を除去した。１００μＬの補体をヒト血清の形態で１：５の希釈度で添加し、その結果、最終的な血清希釈度は１：１０になった。プレートを３７℃で１２０分間インキュベートした。０．５％ＢＳＡを補給したＤ－ＭＥＭ中で、全ての希釈及び洗浄工程を行った。

【0196】

細胞への補体付着についてのフローサイトメトリー染色
樹脂結合型ＩｄｅＳ（ＦｒａｇＩＴキット、＃Ａ０－ＦＲ６；Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いて予めＦｃ及びＦ（ａｂ’）２の断片に切断しておいたポリクローナルＩｇＧ（＃ＭＤ－１４－０１６２；ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）から作製したヒツジ抗Ｃ１ｑ Ｆ（ａｂ’）２と共にインキュベーションすることを通して、Ｃ１ｑ補体結合を評価した。Ｆｃ断片は、プロテインＡカラムで除去した。ポリクローナルＦ（ａｂ’）２は、最終濃度７５μｇ／ｍＬで使用した）。ビオチン化ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（＃７１３－０６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ヒツジ抗ヒトＣ１ｑ Ｆ（ａｂ’）２を検出した。ＳＡ－ＰＥをＤ－ＭＥＭ（＋０，５％ＢＳＡ）で希釈し、検出用蛍光色素として使用した。

【0197】

ビオチン化マウス抗ヒトＣ４ｄ抗体（＃Ａ２１３；Ｑｕｉｄｅｌ）と共にインキュベーションすることを通して、Ｃ４ｄ補体結合を評価した。ＳＡ－ＰＥをＤ－ＭＥＭ（０，５％ＢＳＡ）で希釈し、検出用蛍光色素として使用した。最後に、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトフルオロメーターを用いてＦＬ２における平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。

【0198】

結果
標的細胞に結合しているＩｇＧへの補体沈着は、古典的な補体経路を開始させ得、これにより膜攻撃複合体（ＭＡＣ）が形成され、細胞死を引き起こす可能性がある。抗体結合を通して促進される補体カスケードの初期段階は、補体受容体を介した補体媒介性貪食について細胞に合図を送って停止させる（flag）こともできる。従って、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する既存の及び誘導された抗体が、患者におけるＣＡＲ－Ｔの持続性を制限する可能性がある。

【0199】

ＲＴＸでオプソニン化し、その後、指定濃度のＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳと共にインキュベートしたＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞を用いて、ＩｇＧでコーティングされた細胞の補体沈着について調べた。２時間後にヒト血清を補体源として更に２時間かけて添加した。細胞を分注し、抗ヒトＣ１ｑ－又はＣ４ｄ－特異的検出抗体及び蛍光色素としてのＳＡ－ＰＥを使用して染色した。細胞をシングルセルフローサイトメトリーによってＭＦＩについて分析した。

【0200】

ＩｇＧによるＣ１ｑとＣ４ｄの沈着は、ＩｄｅＳとＥｎｄｏＳによって阻止することができる（図１を参照）。このことは、ＩｇＧ感作ＣＡＲ Ｔ細胞もＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳ処理によって補体沈着から保護されることを示唆しており、これは軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞にも当てはまると予測される。

【0201】

実施例２－補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
既存の又は誘導されたＣＡＲ特異的抗体を含む抗体の受容体分子への結合は、細胞傷害性ＭＡＣの形成につながる完全な補体活性化を引き起こし得る。これを模倣するために、Ｄａｕｄｉ細胞をＣＤ２０受容体特異的抗体ＲＴＸと共にインキュベートし、ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳによる処理を通してＣＤＣを阻止することができるかどうかについて調べた。

【0202】

Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０Ｅ６個）を、マスタープレートにおいて３７℃で６０分間、タイトレーションされた濃度のリツキシマブ（ＲＴＸ）（ウェル内濃度５０μｇ／ｍＬ、１：２段階希釈で０，２μｇ／ｍＬまで）と一緒に、ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳ（５０μｇ／ｍＬ）と共に６０分間インキュベートした。

【0203】

５０μＬの細胞ミックスを、補体源としての５０μＬの仔ウサギ血清（１：５希釈）と共にＥＬＩＳＡプレートに移し、ＣＤＣ溶解のために３７℃で４５分間インキュベートした。各１００μＬのミックスに１０μＬのＣＣＫ８を添加し、ＣＯ２インキュベータ内において３７℃で更に６０分間インキュベートした。ＨＣｌ（５０μＬ、０，１Ｍ）を停止液として使用した。ＯＤ値を４５０ｎｍで取得した。ＲＴＸを含まないウェルからのＯＤ値を１００％生存とした。

【0204】

結果
０．７８μｇ／ｍＬのＲＴＸ濃度では、培地群の細胞の７０％が死滅するが、この濃度のＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳの存在下では、全てのＤａｕｄｉ細胞が生存している（図２を参照）。ＥｎｄｏＳの保護効果はＲＴＸ濃度の増加と共に減少し、５０μｇ／ｍＬで３０％の生存率になったが、これはＥｎｄｏＳ無しで同じ生存率である０．７８μｇ／ｍＬよりも６０倍高いＲＴＸ濃度であった。従って、高い抗体濃度（５０μｇ／ｍＬ）でさえも、ＩｄｅＳでＣＤＣを阻止することができるが、ＥｎｄｏＳも強力な保護活性を示す。これは、軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞にも当てはまると予測される。

【0205】

実施例３－ＴＨＰ１エフェクター細胞による、ＲＴＸでオプソニン化されたＤａｕｄｉ細胞のＡＤＰＣ
これら実験により、既存の又は誘導されたＣＡＲ特異的抗体の存在下でＣＡＲ Ｔ細胞の持続性を制限する可能性がある機序の１つであるＦｃγＲ媒介性貪食（ＡＤＣＰ）を、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳが低減することができるかどうかという疑問に対処した。

【0206】

細胞培養
ＴＨＰ１（単球エフェクター細胞）及びＤａｕｄｉ標的細胞を、完全Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｄ－ＭＥＭ（５％ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）で増幅させ、洗浄し、Ｄ－ＭＥＭ １０培地で希釈した後、実験を行った。

【0207】

標的細胞の標識
Ｄａｕｄｉ細胞をＰＢＳで２回洗浄してタンパク質を除去した後、標識した。細胞をＰＢＳに再懸濁させ、カルセイン（４μＬ、６ｍＬの細胞に対して１ｍｇ／ｍＬから）を用いて染色し、暗所、ＲＴでインキュベートした。１５分後に細胞を培地（０，５％ＢＳＡ）で２回洗浄し、３ｍＬのＤ－ＭＥＭ １０培地に２×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁させた。

【0208】

エフェクター細胞の標識
ＴＨＰ１細胞をＰＢＳで２回洗浄してタンパク質を除去し、５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。ＦａｒＲｅｄを添加し（５ｍＬの細胞に対して５μＬ）、暗所、ＲＴでインキュベートした。２０分後、細胞を培地で２回洗浄し、Ｄ－ＭＥＭ １０に３，６×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁させた。

【0209】

標的－エフェクター細胞のインキュベーション
タイトレーションしたＲＴＸ及び酵素（ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳ）を３７℃で６０分間インキュベートした。Ｄａｕｄｉ標的細胞（２×１０Ｅ６個／ｍＬで５０μＬ）を３０分間インキュベートしてオプソニン化した後、ＴＨＰ１エフェクター細胞（３，６×１０Ｅ６個／ｍＬで５０μＬ）を添加し、約２時間インキュベートして、Ｄａｕｄｉ細胞のＡＤＣＰを可能にした。細胞を５％ ＰＦＡで３分間固定し、洗浄し、ＦＡＣＳ解析のために移した。ＦＬ２（カルセイン）及びＦＬ４（ＦａｒＲｅｄ）におけるＭＦＩについて、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターを用いて細胞を分析した。二重陽性細胞をＡＤＣＰ陽性であるとみなした。

【0210】

結果
単球ＴＨＰ１エフェクター細胞によるＦｃγＲ媒介性貪食からＲＴＸでオプソニン化されたＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞を保護するＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳの有効性をフローサイトメトリーによって分析した。簡潔に述べると、カルセインで標識したＤａｕｄｉ細胞を漸増濃度のＲＴＸでオプソニン化した後、一定濃度のＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＦａｒＲｅｄで標識したＴＨＰ１－エフェクター細胞を約２時間にわたって添加した。次いで、洗浄及び固定した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＦＬ２におけるカルセイン陽性細胞全てをゲーティングし、１００％ Ｄａｕｄｉ細胞と定義した。次いで、ＦＬ２陽性細胞を全て、ＦＬ４においてＲａｒＲｅｄ陽性についてゲーティングした。これらカルセイン／ＦａｒＲｅｄ二重陽性細胞は、ＴＨＰ１に貪食されたＤａｕｄｉ細胞である。ＩｄｅＳによるＦｃ部分の除去により、オプソニン化されたＤａｕｄｉ細胞を貪食するＴＨＰ１細胞の能力が完全に消失した。また、ＥｎｄｏＳによりＲＴＸのＮ２９７位で脱グリコシル化した結果、このモデルにおいても貪食が減少した（図３を参照）。

【0211】

従って、ＡＤＣＰでは、単球細胞株ＴＨＰ１による抗体でオプソニン化された細胞の飲み込みは、ＩｄｅＳ処理によって完全に阻止され、ＥｎｄｏＳ処理によって減少する。これは、軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞にも当てはまると予測される。
実施例４－免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）モデルにおける血小板の保護
ＲＴＸ及びＤａｕｄｉ細胞を用いて上で実証した通り、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳは、細胞表面受容体特異的抗体のエフェクター機能を軽減する。以下の実験では、血小板減少症（ＩＴＰ）モデルを用いて、これら酵素が抗体感作された内因性細胞をインビボにおいて排除から保護するかどうかについても調べた。これにより、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性に対する抗ＣＡＲ抗体の状況におけるこれら酵素の作用を模倣するイムリフィダーゼ又はＥｎｄｏＳによる処理を通して、細胞表面受容体に対する有害なポリクローナル抗体が不活性化され得ることを実証する。

【0212】

ＩＴＰインビボＥｎｄｏＳ処理
プロテインＧによってウサギ抗マウス血小板血清（Ｃｅｄｅｒｌａｎｄ ＃ＣＬＡ３１４４０）から精製した抗血小板特異的抗体（抗ＰＬＴ ＩｇＧ）（５０μｇ ＩｇＧ／マウス）２００μＬをｉ．ｐ．単回注射することによって、９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ^{ＪＢｏｍＴａｃ}マウスを免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）のためにプライミングした。３０分後に指定量のＥｎｄｏＳ（１０μｇ／マウス、３０μｇ／マウス、９０μｇ／マウス）をｉ．ｐ．注射し、それぞれＰＢＳを陰性対照とした。両方の場合に担体溶液（ＰＢＳ）を注射したマウスを正常対照として使用した。注射４時間後に血腫又は異常行動についてマウスを評価した。２４時間後に尾静脈から血液サンプルを採取してＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ＥＤＴＡ ＃１６．４４４．１００）に入れた。血液サンプル中の血小板を、血液分析装置ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５でカウントした。

【0213】

インビトロにおいてＩｄｅＳで切断された抗ＰＬＴ抗体によるＩＴＰの誘導
抗マウスＰＬＴ ＩｇＧを、マウス血小板で免疫したウサギの血清（コード＃ＣＬＡ３１４４０、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）からプロテインＧ精製した。ＩｇＧを処理して、インビボ実験のためにＩｄｅＳ切断産物ｓｃＩｇＧ及び完全に切断されたＦｃ／Ｆ（ａｂ’）２断片を生成した。

【0214】

２５０μｇ／マウスの抗ＰＬＴ ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、又はＦｃ／Ｆ（ａｂ’）２断片のいずれか２００μＬをｉ．ｐ．単回注射することによって、９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ^{ＪＢｏｍＴａｃ}マウスをＩＴＰのためにプライミングした。一部のマウスにはＰＢＳを注射して、血小板の正常対照レベルを確立した。２４時間後に尾静脈から血液サンプルを採取してＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ＥＤＴＡ ＃１６．４４４．１００）に入れた。血液サンプル中の血小板を、血液分析装置ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５でカウントした。

【0215】

ＩＴＰインビボＩｄｅＳ処理
プロテインＧによってウサギ抗マウス血小板血清（Ｃｅｄｅｒｌａｎｄ ＃ＣＬＡ３１４４０）から精製した抗ＰＬＴ ＩｇＧ（２５０μｇ ＩｇＧ／マウス）２００μＬをｉ．ｐ．単回注射することによって、９週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ^{ＪＢｏｍＴａｃ}マウスをＩＴＰのためにプライミングした。抗ＰＬＴ ＩｇＧをｉ．ｐ．注射した１時間後に、ＩｄｅＳ（０μｇ／マウス、０．２μｇ／マウス、２μｇ／マウス、２０μｇ／マウス）をｉ．ｖ．投与した。血小板レベルが正常な対照マウスにはＰＢＳのみを注射した。２４時間後に尾静脈から血液サンプルを採取してＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ＥＤＴＡ ＃１６．４４４．１００）に入れた。血液サンプル中の血小板を、血液分析装置ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５でカウントした。

【0216】

結果
この研究の目的は、インビボにおけるインタクトな抗ＰＬＴ ＩｇＧと比較して、ＩｄｅＳ切断産物であるｓｃＩｇＧ又はＦ（ａｂ’）２ ＩｇＧ断片のエフェクター機能のメディエーターとしてのインビボにおける効果を評価することであった。

【0217】

０．２５ｍｇ／マウスの用量のウサギ抗マウス血小板精製インタクトＩｇＧ、ウサギｓｃＩｇＧ、又はＦ（ａｂ’）２断片のいずれかをＢＡＬＢ／ｃ マウスにｉ．ｐ．単回注射することによって、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）を誘導した。ＩＴＰを誘導した１日後にマウスから採血し、血液を尾静脈から回収した。血小板をＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５で自動的にカウントした。ＰＢＳのみを投与したナイーブマウス２匹を対照マウスとして使用した。これらマウスは、血小板数が８６×１０^９血小板／Ｌまで低下したウサギ抗マウス血小板精製ＩｇＧを注射したマウスと比較して、６５７×１０^９血小板／Ｌと正常な血小板レベルを有していた（図４を参照）。しかし、抗ＰＬＴ ｓｃＩｇＧを注射したマウスでは、血小板のわずかな減少がみられた。精製ウサギ抗マウス血小板（Ｆ（ａｂ’）２ ＩｇＧ断片で処理したマウスでは、血小板減少症の誘導は観察されなかった。

【0218】

この実験から、ＩｄｅＳによるｓｃＩｇＧ又は（Ｆ（ａｂ’）２）のインビトロ生成を通して、血小板減少症からの保護効果を実現できると結論付けることができる。軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、キメラ抗原受容体Ｔ細胞上のネオエピトープを標的とする他の既存の又はデノボの抗体からも、同様の保護効果を予測することができる。

【0219】

血小板減少症は、ｓｃＩｇＧ調製物を注射した場合には部分的に予防することができ、ＩｇＧをＩｄｅＳによってＦｃ及びＦ（ａｂ’）２の断片に切断した後には完全に消失した（図４を参照）。

【0220】

ＩｄｅＳがインビボにおいても治療効果を有するかどうかについて調べるために、まずマウスに血小板減少用量の抗ＰＬＴウサギＩｇＧを注射した。１時間後に、異なる用量のＩｄｅＳを注射した。２４時間後に血液を回収し、異なる群における血小板数を確定した。マウスにおける血小板を正常レベルに回復させるには、マウス１匹あたり２μｇのＩｄｅＳで完全に十分であった（図５参照）。従って、ＩＴＰマウスモデルを用いて、有害な抗血小板抗体（抗ＰＬＴ）に対するＩｄｅＳの治療効果をインビボで試験した。インタクトなポリクローナル抗ＰＬＴウサギ抗体（２５０μｇ）をマウスに注射すると、血小板枯渇を伴う強いＩＴＰ表現型が引き起こされる。

【0221】

ＥｎｄｏＳを抗ＰＴＬ ＩｇＧ感作マウスに注射した場合も同様の結果がみられた。２４時間以内に血小板数を約６００×１０Ｅ９個／Ｌから２００×１０Ｅ９個／Ｌに減少させるには、５０μｇの抗ＰＬＴ抗体で十分であった。マウスを血小板減少症から保護するには、マウス１匹あたり１０μｇのＥｎｄｏＳで十分であった（図６を参照）。

【0222】

これら実験は、ＩｄｅＳ又はＥｎｄｏＳを用いることで、オプソニン化された細胞の病原性抗体媒介性エフェクター機能を阻止又は回復させ得ることを示す。これらデータに基づいて、これら酵素は、既存の及び治療によって誘導されたＡＤＡの不活性化を通じてＣＡＲ Ｔ／ＮＫ細胞の生存及び有効性も改善すると予測される。

【0223】

まとめると、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＡＤＡ応答を模倣する、試験した抗体媒介性エフェクター機能（Ｃ１ｑ及びＣ４ｄの沈着、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ）は、ＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＳの使用を通して阻止できることが示された。

【0224】

実施例５
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）キメラ抗原受容体又はＣＡＲ－Ｔ細胞上の同種エピトープに対する抗体が有害な作用を有するかどうかを確認するための実験を行った。従って、異なる起源からのＣＡＲ及びアロ特異的抗体を、結合及びＦｃ媒介性抗体エフェクター機能、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）について試験した。更に、イムリフィダーゼ処理により、これら有害なＩｇＧエフェクター機構からＣＡＲ－Ｔ細胞を保護できることが確認された。

【0225】

材料及び方法
細胞
ＣＡＲ－Ｔ細胞株、クローンＥ６－１に基づく抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）－ｈ（２８ζ）ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＣＡＲＪ－ＺＰ００５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）；Ｊｕｒｋａｔ野生型（ｗｔ）（クローンＥ６－１）（＃ＥＰ－ＣＬ－０１２９、ＥｌａｂＳｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）；初代ヒトＣＡＲ Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＢＣＭＡ－４－ＴＭ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲ－Ｔ細胞）（ＰＭ－ＣＡＲ１０３７、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ１９－ｓｃＦｖ－Ｆｌａｇ－ＴＭ－－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータＣＡＲ－Ｔ細胞）（ＰＭ－ＣＡＲ１００７、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；モックｓｃＦｖ制御Ｔ細胞（ＰＭ－ＣＡＲ１０００、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。抗ＣＤ１９－ｓｃＦｖは、マウスＣＤ１９特異的モノクローナル抗体ＦＭＣ６３に由来していた。

【0226】

ＴＨＰ－１単球細胞株（ＡＣＣ１６、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＩｇＭ ＢＣＲ及びＣＤ２０陽性のＤａｕｄｉ細胞（ＡＣＣ７８、ＤＳＭＺ）。全ての細胞を、完全ＲＰＭＩ １０培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、及びＰＥＳＴ）で培養した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ピューロマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）選択下で培養した。

【0227】

抗体及びヒト血清
ＣＡＲ ｓｃＦｖ交差反応性抗Ｆ（ａｂ’）_２特異的抗体は、アフィニティ精製されたウサギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的（＃３０９－００５－００６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）、アフィニティ精製されたウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的（＃３１５－００５－００６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＰＥ（ＬＳ－ＡＢ２、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）、及びビオチン化ヤギ抗ウサギＦｃ（＃１１１－０６６－０４６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含む。ビオチン化ヤギ抗ウサギＦｃの検出は、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＳＡ－ＡＦ６４７）（＃０１６－６００－０８４、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用することによって達成した。

【0228】

ヒト血清サンプル（ｎ＝１１９、男女両方）はＢｉｏＩＶＴ（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の定量及びアロ特異的抗体のスクリーニングに使用した。ＨＬＡ高感作患者（ｎ＝８）及び第１相の健常ボランティア（ｎ＝１１）からの匿名臨床試験サンプルを、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＨＡＭＡ及びＨＬＡアロ応答性についてスクリーニングした。ＦｌｏｗＰＲＡ ＨＬＡクラスＩ陽性対照血清（ＦＬ１－ＰＣ、ＯｎｅＬａｍｂｄａ、Ｗｅｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＦｌｏｗＰＲＡ ＨＬＡクラスＩＩ陽性対照血清（ＦＬ１－ＰＣ、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）、及びＨＬＡ陰性対照血清（ＬＳ－ＮＣ、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）を含むＨＬＡ同種反応性の対照血清は、ＯｎｅＬａｍｂｄａから購入したか、又は健常ドナーから供与された研究サンプルであった。

【0229】

ＥＬＩＳＡベースのＨＡＭＡ検出
ブリッジングＥＬＩＳＡキット「ＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ（ＨＡＭＡ）」（カタログ番号４３８３０７、ロット番号Ｂ３２９８４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、ヒト血清中のＨＡＭＡを検出するために使用した。簡潔に述べると、マウスＩｇＧでプレコーティングされたプレートを洗浄し、未希釈のヒト血清サンプル（ＢｉｏＩＶＴ）、ＨＡＭＡ品質管理、標準曲線サンプル、及びマウスＩｇＧコンジュゲートと共にインキュベートした。内容物を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを洗浄した。基質溶液を添加し、プレートを室温（ＲＴ）で１５分間暗所にてインキュベートした。停止液を添加するによって、反応を終了させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、３０分以内に４５０ｎｍ及び５７０ｎｍで吸光度を測定した。ＯＤの結果を、４パラメータロジスティック曲線フィッティングアルゴリズムを用いて、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で解析した。ＨＡＭＡが１０ｎｇ／ｍＬを超える血清サンプルをＨＡＭＡ陽性とみなした。

【0230】

フローサイトメトリーによるＣＡＲ特異的ヒト血清のスクリーニング
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔ野生型のＴ細胞（１×１０Ｅ５個／ウェル）をＰＢＳで洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＥＬＩＳＡベースのＨＡＭＡ検出から選択したヒト血清サンプル５０μＬに再懸濁させた。次いで、血清をインキュベートした細胞を洗浄し、ヤギ抗ヒトＦｃ－ＰＥ抗体（ＯｎｅＬａｍｂｄａ）で染色し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルについてＦＬ２においてフローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター、＃Ｃ０２９４５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって分析した。

【0231】

フローサイトメトリーによるＣＡＲ－Ｔ Ｊｕｒｋａｔアロ応答性ヒト血清のスクリーニング
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０Ｅ５個）をＰＢＳで洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを指定のヒト血清サンプル５０μＬに再懸濁させた。対照として、ＦｌｏｗＰＲＡクラスＩ陽性対照血清（ＯｎｅＬａｍｂｄａ）、ＦｌｏｗＰＲＡクラスＩＩ陽性対照血清（ＯｎｅＬａｍｂｄａ）、及びＨＬＡ陰性対照血清（ＯｎｅＬａｍｂｄａ）を使用した。ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＬＳ－ＡＢ２、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）を用いて、結合した同種抗体を検出した。洗浄工程の後、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメーター（ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を用いてＭＦＩ値について分析した。

【0232】

初代ＣＡＲ－Ｔに対するポリクローナルＩｇＧの結合
抗ＢＣＭＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＭ－ＣＡＲ１０３７、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＰＭ－ＣＡＲ１００７、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びモックｓｃＦｖ対照細胞（ＰＭ－ＣＡＲ１０００、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む初代ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）_２特異的（＃３１５－００５－００５、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に３０分間インキュベートした。ＢＣＲを発現しているＤａｕｄｉ細胞をＦ（ａｂ’）_２陽性対照として染色した。次いで、細胞を洗浄し、逐次ビオチン化ヤギ抗ウサギＦｃ抗体及びＳＡ－ＡＦ６４７（＃０１６－６００－０８４、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。同様のアプローチを使用して、ポリクローナル抗マウス抗体及び抗ヒトＩｇＧ抗体の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞への結合を評価した。

【0233】

ＦｃγＲＩ発現エフェクター細胞を用いた抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を血清と共にインキュベートし、ＦｃγＲＩ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（＃ＣＳ１７８１Ｃ０１、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてＡＤＣＰ誘導について試験した。簡潔に述べると、ヒト血清サンプル（ＢｉｏＩＶＴ、及び０６－ｓｔｕｄｙからの匿名血清）、ＨＬＡクラスＩ陽性対照血清（ＦＬ１－ＰＣ、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）、及びＨＬＡ陰性対照血清（＃ＬＳ－ＮＣ、ＯｎｅＬａｍｂｄａ）を１０μｇ／ｍＬイムリフィダーゼの有り無しで、３７℃で３０分間インキュベートした。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ標的Ｔ細胞（ＣＡＲＪ－ＺＰ００５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）（７５００個／ウェル）を遠心分離し、Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、付属のアッセイバッファー（ＲＰＭＩ－１６４０中４％の低ＩｇＧ血清）に再懸濁させた。標的細胞をイムリフィダーゼ処理／非処理抗体及び血清と共に３７℃で１時間インキュベートした。この後、ＦｃγＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現するエフェクター細胞（７５０００個／ウェル）をオプソニン化された標的細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。最後に、細胞をＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に周囲温度で１０分間インキュベートした後、積分時間を０．５秒／ウェルに設定して、発光リーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。アッセイバッファーを含むプレートのバックグランドは、３回の反復実験の平均として算出し、一方、イムリフィダーゼの存在下／非存在下において細胞のみを含有する抗体なし対照は、２回の反復実験の平均として算出した。誘導倍率（ＦｏＩ）は、以下の通り算出した、ＦｏＩ＝ＲＬＵ（誘導－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）。

【0234】

ＦｃｇＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）高親和性及びＦｃｇＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）低親和性発現エフェクター細胞を用いた抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
抗体（リツキシマブ、マブセラ、Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ウサギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及びヒト血清（ＢｉｏＩＶＴ及びＨＬＡ高感作患者からの匿名血清を、２０μｇ／ｍＬのイムリフィダーゼの有り無しで、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、４℃で一晩保存した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ（ＣＡＲＪ－ＺＰ００５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｊｕｒｋａｔ野生型（ＥＰ－ＣＬ－０１２９、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、及びＤａｕｄｉ（ＡＣＣ７８、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞を含む標的細胞（７５００細胞／ウェル）を遠心分離し、Ｄ－ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ，ＵＳＡ）で１回洗浄し、アッセイバッファー（ＲＰＭＩ－１６４０（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中４％低ＩｇＧ血清）に再懸濁させ、イムリフィダーゼ処理／非処理抗体及び血清と共に３７℃で１時間インキュベートした。この後、低親和性（＃Ｇ９７９Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）又は高親和性（＃Ｇ７０１Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）のＦｃγＲＩＩＩａを発現しているエフェクター細胞７５０００個をオプソニン化された標的細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。最後に、細胞をＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に周囲温度で１０分間インキュベートした後、積分時間を０．５秒／ウェルに設定して、発光リーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。生データをエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて解析した。アッセイバッファーを含むプレートのバックグランドは、３回の反復実験の平均として算出し、一方、イムリフィダーゼの存在下／非存在下において細胞のみを含有する抗体なし対照は、２回の反復実験の平均として算出した。定量的な抗ＨＬＡのクラスＩ及びクラスＩＩの抗体を有しない健常ドナーの血清サンプルを表すＨＬＡ陰性対照も含めた。誘導倍率（ＦｏＩ）は、以下の通り算出した、ＦｏＩ＝ＲＬＵ（誘導－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）。

【0235】

フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰアッセイ
ＡＤＣＰ標的細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ野生型Ｔ細胞、及びＤａｕｄｉ細胞）を、指定濃度のイムリフィダーゼ処理（±１０μｇ／ｍＬ）したウサギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２特異的（＃３０９－００５－００６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）又は抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）_２特異的（＃３１５－００５－００６、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）抗体と共にインキュベートする前に、カルセイン－ＡＭ（Ｃ３０９９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色した。あるいは、標的細胞ペレットを、ＨＡＭＡ又は同種ＩｇＧによるオプソニン化のためにイムリフィダーゼ処理（±１０μｇ／ｍＬ）したヒト血清サンプル（２５μＬ）と共に未希釈で再懸濁させた。単球エフェクター細胞株であるＴＨＰ－１をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ ＤＤＡＯ－ＳＥ（Ｃ３４５５３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で染色した後、標的細胞に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター、＃Ｃ０２９４５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により貪食を評価した。ＴＨＰ１細胞によって貪食された標的細胞を反映するＦＬ１及びＦＬ４二重陽性細胞の量を、標的細胞の百分率として表した。

【0236】

ＣＤ１９－タンパク質結合ブロッキング実験
ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２特異的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びヒト血清（ＢｉｏＩＶＴ）を、１０μｇ／ｍＬイムリフィダーゼの有り無しで、３７℃で６０分間インキュベートした。ＩＨＡｃ（１ｍＭ）（Ｉ４３８６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を全てのサンプルに３０分間にわたって添加して、後続のインキュベーション工程中にイムリフィダーゼを不活性化させた。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ及びＪｕｒｋａｔ野生型Ｔ細胞を、調製した血清及びＩｇＧサンプルと共にＲＴで６０分間インキュベートした。組み換えヒトＣＤ１９－Ｆｃキメラタンパク質、ａｔｔｏ ６４７Ｎコンジュゲート（ＡＴＭ９２６９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を細胞に添加し、４５分間インキュベートした後、フローサイトメトリーによって分析した（ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター、＃Ｃ０２９４５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。

【0237】

結果
Ｆ（ａｂ’）_２特異的ポリクローナル抗体はＣＡＲ Ｔ細胞受容体に特異的に結合する
自己ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するために抗ＣＤ１９又はＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体でトランスフェクトした初代ヒトＴ細胞を、ＣＡＲ特異的抗体を同定するために使用した。ＣＡＲの抗原特異的ｓｃＦｖドメインが、例えばマウスモノクローナル抗体を起源とする場合、自己ＣＡＲ Ｔ細胞治療の場合でさえも、レシピエントにとって異物であるエピトープを含有する。ＣＡＲ Ｔ細胞に対するＣＡＲ特異的抗体の影響について調べるために、異なる供給元のＣＡＲ特異的抗体を結合について試験した。ポリクローナルウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２特異的抗体は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（図７Ａ）及び抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞（図７Ｂ）に対して交差反応性を示したが、モックトランスフェクトされたＴ細胞（図７Ｃ）は未染色のままであった。ポリクローナルウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２検出試薬と交差反応することが先に示されているＢ細胞受容体発現Ｄａｕｄｉ細胞（図７Ｄ）を、Ｆ（ａｂ’）_２陽性対照染色に使用した。受容体のｓｃＦｖがマウスｍＡｂ ＦＭＣ６３に基づく抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲが形質導入されたヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔの染色から、ウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２抗体の強い結合が実証された。ウサギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２を使用しても、若干の交差反応が観察された。これらデータから、異なる標的に対する様々な異なる受容体コンストラクトが抗体に結合し得ることが確認される。このような結合は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療等の養子細胞移入免疫療法に対して負の作用を発揮する可能性があるため、更に抗体を用いて、抗ＣＡＲ Ｔ細胞抗体媒介性エフェクター機能、及びイムリフィダーゼによる処理でそれをどの程度阻止できるかについて調べた。

【0238】

ＨＡＭＡ及びＣＤ１９－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞アロ特異的血清の同定
潜在的にＣＡＲ特異的である抗体の１つの群は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）である。ヒト血清サンプル中のＨＡＭＡレベルは、マウスＩｇＧでコーティングされたアッセイプレートを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで定量することができる。承認されたＨＡＭＡ ＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒト血清をＨＡＭＡについてスクリーニングした（図８Ａ）。同定されたＨＡＭＡ陽性及び陰性のサンプルの選択を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞との結合について試験した。ＨＡＭＡ特異的ＩｇＧの結合をＨＬＡ同種応答と区別するためにＪｕｒｋａｔ野生型Ｔ細胞を含めた。ＥＬＩＳＡ ＨＡＭＡ陽性血清も抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞受容体に特異的に結合することを実証することができた（図８Ｂ）。ＥＬＩＳＡによってＨＡＭＡについてスクリーニングした血清を示す（図８Ｃ）。次いで、これらサンプルを、ＩｇＧの結合についてフローサイトメトリーによって更にスクリーニングした。これにより、ＨＡＭＡ又は抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞同種反応性血清を選択して、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するこれら異なるＩｇＧ群の作用を更に解明することができた。ＨＡＭＡは、マウス抗原との接触により正常個体でも誘導されると考えられる。マウスｍＡｂベースの生物製剤を投与されている患者では、ＨＡＭＡの頻度及び濃度が更に高くなり、場合によっては、これら治療薬の部分的な中和さえも引き起こすと予測することができる。健常個体と比較して、ＨＬＡ感作された移植患者の血清では抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するより高レベルの同種抗体を検出することができる（図８Ｄ）。スクリーニングされた抗ＨＬＡ高感作患者８名のうち５名が、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対して陽性であり、１名が抗ＨＬＡ高感作であった。スクリーニングされた個体のうち２名は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する同種抗体を有していなかった。

【0239】

これらデータは、受容体コンストラクトに結合することができる抗体が、健常個体を含むヒト患者で検出可能であり、移植等のＨＬＡ感作を高めることができる処理を受けたことのある患者で増加していることを実証する。

【0240】

同種抗体は、臓器移植で誘導されるだけでなく、妊娠及び輸血に起因して誘導されることもある。同種細胞療法を患者に注入すると、同種抗体が更に誘導される可能性があり、同種ＣＡＲ Ｔ細胞処理に支障を来す可能性がある。
ＡＤＣＰのためのポリクローナル抗Ｆ（ａｂ’）_２抗体による抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のオプソニン化は、イムリフィダーゼ処理により阻止され、イムリフィダーゼは、同種血清でオプソニン化されたＣＤ１９－ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＡＤＣＰ誘導を阻止する。

【0241】

ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲドメインに特異的なポリクローナル抗Ｆ（ａｂ’）_２抗体及び同種抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＨＬＡ特異的抗体を、抗体媒介性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の誘導及びＩｇＧ切断酵素イムリフィダーゼによる処理を通じた阻止について試験した（図９及び図１０を参照）。カルセインで染色した標的細胞及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄで標識した単球ＴＨＰ１エフェクター細胞と共に、フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰモデルを使用した。フローサイトメトリーによって細胞を取得することにより、単一及び二重の陽性細胞、すなわち、貪食された細胞を識別することができた。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ標的細胞を、ウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２抗体（図９Ａ）又は交差反応性抗ヒトＦ（ａｂ’）_２抗体（図９Ｂ）のいずれかでオプソニン化した。いずれの場合も、イムリフィダーゼ（１０μｇ／ｍＬ）の添加により、標的細胞のＡＤＣＰが阻止された。Ｊｕｒｋａｔ野生型細胞の取り込みはなく、これは、貪食が抗ＣＤ１９ ＣＡＲ依存性であったことを示す（図９Ｄ、Ｅ）。ＢＣＲ陽性Ｄａｕｄｉ標的細胞を、Ｆ（ａｂ’）_２抗体媒介性ＡＤＣＰの陽性対照として使用した（図９Ｃ、Ｆ）。これらデータは、受容体特異的抗体が、細胞療法に負の作用を及ぼすと予測される、Ｔ細胞に対するＡＤＣＰを誘導できることを実証する。また、データは、イムリフィダーゼによる処理がＡＤＣＰの阻止に有効であることも実証する。更に、同種Ｊｕｒｋａｔ ＣＡＲ Ｔ細胞に対して感作されたヒト血清によるオプソニン化及びＡＤＣＰの誘導を、生物発光ＦｃγＲＩレポーターアッセイ（＃ＣＳ１７８１Ｃ０１、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃ＣＳ１７８１Ｃ０１）を用いて試験した。正常個体（図１０Ａ）及び抗ＨＬＡ高感作患者（図１０Ｂ）の血清は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をオプソニン化し、ＡＤＣＰを誘導することができた。同種細胞に対する血清ＩｇＧによるＡＤＣＰの誘導は、イムリフィダーゼによる処理を通じて低減することができた。従って、これらデータから、正常個体及び感作患者の両方の血清中の抗体が養子細胞移入免疫療法細胞に対するＡＤＣＰを誘導するが、イムリフィダーゼ処理によってこれを低減できることが確認される。

【0242】

ＦｃγＲＩＩＩａアレル（Ｖ１５８）及びアレル（Ｆ１５８）抗ＣＤ１９ ＣＡＲ特異的抗体に誘導されるＡＤＣＣ（Ｖ１５８）は、イムリフィダーゼ処理によって阻止される。
抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）は、ＩｇＧでオプソニン化された標的細胞によるエフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）への会合を通じて誘発される。一般集団には、１５８位にバリンを有する高親和性バリアント（Ｖ１５８）及び１５８位にフェニルアラニンを有する低親和性バリアント（Ｆ１５８）の２つの主要なＣＤ１６ａアレルが存在する。これらアレルを、ＡＤＣＣ生物発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のエフェクター細胞に導入した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、イムリフィダーゼ（２０μｇ／ｍＬ）処理の有り無し両方で、ウサギ抗マウス（図１１Ａ）又は抗ヒト（図１１Ｂ）Ｆ（ａｂ’）_２抗体のいずれかと共にインキュベートした。オプソニン化された標的細胞を高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞と共にインキュベートした。抗マウスＦ（ａｂ’）_２抗体でオプソニン化された標的細胞によって、ＡＤＣＣが強く誘導された。イムリフィダーゼ処理したサンプルでは、ＡＤＣＣの誘導が完全に消失した（図１１Ａ）。ポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）_２は、より弱い刺激効果を誘導したが、１００μｇ／ｍＬでＡＤＣＣを誘発することができた（図１１Ｂ）。陰性対照であるＪｕｒｋａｔ野生型細胞では、効果はみられなかった（図１１Ｃ）。リツキシマブ（図１１Ｄ）又は抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（図１１Ｅ）でオプソニン化したＤａｕｄｉ細胞を陽性対照として使用した。また、オプソニン化されたＤａｕｄｉ標的細胞をイムリフィダーゼ処理すると、ＡＤＣＣの誘導が阻止された（図１１Ｄ、Ｅ）。

【0243】

低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ ＡＤＣＣ生物発光レポーターアッセイを用いても同様の結果がみられた（図１２）。抗マウスＦ（ａｂ’）_２で処理した抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞はＡＤＣＣシグナル伝達を誘導したが、これはイムリフィダーゼで処理することによって阻止することができた（図１２Ａ）。他方、ポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）_２抗体は、最高抗体濃度（１００μｇ／ｍＬ）でさえもＡＤＣＣシグナル伝達を誘発することはできなかった（図１２Ｂ）。リツキシマブ（図１２Ｄ）又は抗ヒトＦ（ａｂ’）_２（図１２Ｅ）と共にインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞は、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａのＡＤＣＣを誘導し、その効果はイムリフィダーゼ処理によって阻止された。

【0244】

これらデータは、更に、受容体特異的抗体が養子細胞移入免疫療法細胞、特に、細胞療法に負の影響を及ぼすと予測されるＡＤＣＣに対して有害な作用を媒介し得ることを実証する。また、データは、イムリフィダーゼによる処理がＡＤＣＣを阻止するのに有効であることも実証する。

【0245】

ＨＡＭＡでオプソニン化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＡＤＣＣ誘導は、イムリフィダーゼ処理で阻止することができる
２０μｇ／ｍＬのイムリフィダーゼで処理したか又は処理しなかったＥＬＩＳＡ－ＨＡＭＡ陰性（１６４）及び陽性（１８４、１８７、２０８、２５０）の血清を抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とインキュベートした後、オプソニン化された標的細胞をＦｃγＲＩＩＩａ高親和性アレルがトランスフェクトされたエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。２つのＨＡＭＡ陽性血清（１８４、２５０）からの生物発光シグナルは、イムリフィダーゼの存在下で減少した（図１３）。このことは、ヒト血清中のマウスＩｇＧ結合ＨＡＭＡ抗体の一部が、エフェクター細胞のＣＤ１６ ＦｃγＲＩＩＩａを誘発することができる方法で抗ＣＤ１９ ＣＡＲに結合することを示唆している。従って、これらデータから、ヒト血清中の抗体は養子細胞移入免疫療法細胞に対して有害な作用を媒介するが、イムリフィダーゼ処理によってこれを低減できることが更に実証される。

【0246】

血清に曝露された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞へのＣＤ１９タンパク質の結合は、イムリフィダーゼ処理によって改善することができる
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を成功させるためには、そのキメラ抗原受容体の標的タンパク質との特異的な相互作用が必要な工程である。血清ＩｇＧの抗ＣＤ１９ ＣＡＲへの結合が、標的細胞上のＣＤ１９等との同族会合に干渉する可能性がある。ＥＬＩＳＡによって同定されたＨＡＭＡ陽性及び陰性の血清サンプル（図１４）を、組み換えａｔｔｏ－６４７Ｎ標識ヒトＣＤ１９タンパク質と抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞との結合への干渉について試験した。血清ＩｇＧをイムリフィダーゼによって消化した結果、ほとんどのサンプルで抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞由来のＦＩシグナルの中央値が増加し、これはａｔｔｏ－６４７Ｎ標識ＣＤ１９タンパク質の結合が増加したことを示唆している。これは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞等の養子細胞免疫療法の標的タンパク質との相互作用を、イムリフィダーゼ処理によってＩｇＧ－Ｆｃ部分を除去するだけで増大させることができ、これにより立体障害を軽減できることを示唆している。Ｆ（ａｂ’）２断片をブロックすると、インタクトなＩｇＧ等価物よりも短い半減期を有するようになるので、イムリフィダーゼのインビトロにおける効果はインビボで更に強くなる可能性がある。

【0247】

実施例６－ＩｄｅＳの存在下における可溶性免疫グロブリンと共に培養したＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン産生の消失

【0248】

序論
本研究では、免疫グロブリン軽鎖を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞コンストラクト（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ，２０２１及びＶｅｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８に開示されているもの等）が、免疫グロブリンの存在下でサイトカインＩＦＮｇ及びＩＬ－２のベースライン産生を示すかどうかについて調べた。また、この懸濁液にＩｄｅＳを添加することで、可溶性免疫グロブリンが切断され、サイトカイン産生が減少又は消失するかどうかについても調べた。

【0249】

方法
第１の実験では、２人の健常ヒトドナーから取得した末梢血単核球からＴ細胞を分離した。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲコンストラクト（ＣＤ１９．ＣＡＲ）又はカッパ軽鎖を標的とするＣＡＲコンストラクト（カッパ．２８）をＴ細胞に形質導入した。陰性対照として、非形質導入細胞（ＮＴＤ）の集団を用いた。次いで、細胞を４つの異なる培養条件でプレーティングし、各条件はその中に漸増濃度の可溶性免疫グロブリンの濃度を有していた。次いで、同様にプレーティングしたＣＡＲ－Ｔ細胞の別の群にＩｄｅＳを添加して、サイトカイン産生の変動を観察した。

【0250】

第２の実験では、第２の軽鎖を標的とするコンストラクト、ラムダ軽鎖を標的とするＣＡＲ（ラムダ．２８）を用いて第１の実験を反復した。健常ヒトドナーから得たＴ細胞を使用し、ＣＤ１９．ＣＡＲ、カッパ．２８、ラムダ．２８のいずれかで形質導入した、又は形質導入しなかった（ＮＴＤ）。先の実験と同様に同じ漸増濃度の可溶性免疫グロブリン中に、またＩｄｅＳの有り無しで、細胞をプレーティングした。

【0251】

結果
図１に示すように、ＮＴＤ細胞及びＣＤ１９．ＣＡＲは、血清中に存在する可溶性免疫グロブリンの濃度にかかわらず、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を全く産生しなかった。ＮＴＤ細胞及びＣＤ１９．ＣＡＲは可溶性免疫グロブリンを認識しないので、このアッセイが機能していることが確認された。

【0252】

カッパ．２８Ｔ細胞は可溶性免疫グロブリンの存在下でＩＦＮγを産生し、ベースラインサイトカイン産生を示した。更に、より高濃度の可溶性免疫グロブリンを含む血清では、より多くのＩＦＮγが産生された。しかし、同様にプレーティングしたカッパ．２８細胞にＩｄｅＳを添加すると、ＩＦＮγ産生が抑制された。これら結果は両ドナーで再現可能であった。これらデータは、軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞が可溶性免疫グロブリンによってオフ腫瘍刺激され得ること、そして、この刺激がＩｄｅＳによって抑制され得ることを実証する。従って、ＩｄｅＳ投与はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を維持し、消耗を低減するのに有用であると予測される。

【0253】

第２の実験でも、図２に示すように同様の結果が観察された。これらデータから、軽鎖特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞が可溶性免疫グロブリンによってオフ腫瘍刺激され得ること、そして、この刺激がＩｄｅＳによって抑制され得ることが確認される。従って、ＩｄｅＳ投与はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を維持し、消耗を低減するのに有用であると予測される。ラムダ．２８コンストラクトは最小のＩＦＮγした産生せず、これは、使用した可溶性ヒト免疫グロブリン血清が多クローン性であり、ヒトの体内で天然に存在するように２：１のカッパ：ラムダ比を有するという事実に起因する可能性がある。そのため、使用した可溶性免疫グロブリン血清中のラムダ軽鎖の量は、サイトカイン産生を惹起するのに十分ではなかった可能性がある。

【0254】

【図1(A)】

【図1(B)】

【図1(C)】

【図1(D)】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7(A)-(D)】

【図7(E)】

【図8(A)】

【図8(B)】

【図8(C)】

【図8(D)】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【配列表】

2024544565000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-07-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024544565000001.xml

【国際調査報告】