特表 2024-544571 トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３及びその検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３及びその検出方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/46 20180101AFI20241126BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241126BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/6858 20180101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241126BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20241126BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20241126BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20241126BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

A01H6/46 ZNA

C12N15/31

C12N15/11 Z

A01H5/10

C12Q1/6858 Z

C12Q1/6895 Z

C12Q1/686 Z

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12Q1/6813 Z

C12N15/82 Z

C12N15/29

A01H1/00 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6806 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529114

(86)(22)【出願日】2022-11-11

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 US2022079768

(87)【国際公開番号】W WO2023091884

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】63/264,100

(32)【優先日】2021-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500207899

【氏名又は名称】パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】アズベリー，アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】コン，ビン

(72)【発明者】

【氏名】クレイン，バージニア

(72)【発明者】

【氏名】キング，ジェイムス エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ムッティ，ジャスディープ エス．

(72)【発明者】

【氏名】オニール，デニス

(72)【発明者】

【氏名】パスカル，エム．アレハンドラ

(72)【発明者】

【氏名】バン ダイク，マリア マグダレナ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ポー－ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ウースリー，アーロン ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ウォーデン，サラ イー．

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ04

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書に開示される実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡ構築物に関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む耐虫性コーン植物、並びに試料及びその組成物中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の存在を検出するためのアッセイに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型が、配列番号２２及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２２及び配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物。

【請求項2】

前記遺伝子型が、配列番号２３及び配列番号２６に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２３及び配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項3】

前記遺伝子型が、配列番号２４及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４及び配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項4】

２つの作動可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡ構築物であって、前記発現カセットの１つが、
６）ｕｂｉＺＭ１プロモーター
７）ｕｂｉＺＭ１ ５’ＵＴＲ；
８）ｕｂｉＺＭ１イントロン；
９）ｃｒｙ１Ｄａ２；及び
１０）ｕｂｉＺＭ１ターミネーターを含み、
他の発現カセットが、
６）ｕｂｉＺＭ１プロモーター
７）ｕｂｉＺＭ１ ５’ＵＴＲ；
８）ｕｂｉＺＭ１イントロン；
９）ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ；及び
１０）ｕｂｉＺＭ１ターミネーターを含む、ＤＮＡ構築物。

【請求項5】

請求項４に記載のＤＮＡ構築物を含む植物。

【請求項6】

コーン植物である、請求項５に記載の植物。

【請求項7】

配列番号１９に示される配列、又は配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む植物。

【請求項8】

前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３。

【請求項9】

請求項８に記載のコーンイベントの植物部分。

【請求項10】

コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む種子であって、前記種子が配列番号２２及び配列番号２５から選択されるＤＮＡ分子を含み、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、種子。

【請求項11】

請求項１０に記載の種子から成長したコーン植物又はその部位。

【請求項12】

請求項８に記載のコーン植物から作製されたトランスジェニック種子。

【請求項13】

請求項１２に記載の種子から成長したトランスジェニックコーン植物又はその部位。

【請求項14】

配列番号１９及び２２～２７から選択されるヌクレオチド配列、並びにその完全長相補体を含む単離された核酸分子。

【請求項15】

配列番号１９～２１から選択される核酸配列及びその完全長相補体を含むアンプリコン。

【請求項16】

コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物、組織又は種子に由来する生物学的試料であって、前記試料が、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、核酸増幅又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、生物学的試料。

【請求項17】

前記生物学的試料が、植物、植物組織又はトランスジェニックコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の種子を含む、請求項１６に記載の生物学的試料。

【請求項18】

前記生物学的試料が、前記トランスジェニックコーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３から抽出されたＤＮＡ試料であり、前記ＤＮＡ試料が、配列番号１９～２７から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上と、その相補体とを含む、請求項１７に記載の生物学的試料。

【請求項19】

コーン粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される、請求項１６に記載の生物学的試料。

【請求項20】

コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物、組織又は種子に由来し、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含む抽出物であって、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、抽出物。

【請求項21】

前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記抽出物中で検出可能である、請求項２０に記載の抽出物。

【請求項22】

前記抽出物が、トランスジェニックコーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３の植物、植物組織、又は種子を含む、請求項２１に記載の抽出物。

【請求項23】

コーン粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される組成物であり、前記組成物は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の抽出物。

【請求項24】

ハイブリッドコーン種子を生産する方法であって、
ａ．配列番号１９～２７から選択されるヌクレオチドを含む第１の近交コーン系統と、異なる遺伝子型を有する第２の近交系統とを有性交配すること；
ｂ．前記交配から子孫を成長させること；及び
ｃ．それによって生産されたハイブリッド種子を収穫することを含む、方法。

【請求項25】

前記第１の近交コーン系統が、雌親又は雄親である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

鱗翅目害虫に抵抗性のコーン植物の製造方法であって、
ａ．第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と有性交配することであって、前記第１の親コーン植物又は前記第２の親コーン植物がイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含み、それにより、複数の第１世代子孫植物を産生すること；
ｂ．前記第１世代子孫植物を自殖することにより、複数の第２世代子孫植物を産生すること；及び
ｃ．前記第２世代子孫植物から、前記イベントＤＡＳ－０１１３１－３を含み、鱗翅目害虫に抵抗性である植物を選択することを含む、方法。

【請求項27】

ハイブリッドコーン種子を生産する方法であって、
ａ．請求項４に記載のＤＮＡ構築物を含む第１の近交コーン系統を、請求項４に記載のＤＮＡ構築物を含まない第２の近交系統と有性交配すること；及び
ｂ．それによって生産されたハイブリッド種子を収穫することを含む、方法。

【請求項28】

コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む第２世代子孫植物を、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡを欠く親植物に戻し交配し、それによって鱗翅目害虫に抵抗性の戻し交配子孫植物を作製する工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

生物学的試料におけるイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、
ａ．前記試料を第１のＤＮＡ分子対及び第２の異なるＤＮＡ分子対と接触させて、
ｉ．コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用される場合、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を診断する第１のアンプリコンを産生し、
ｉｉ．ＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用される場合、ＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡについて診断的である第２のアンプリコンを産生すること；
ｂ．核酸増幅反応を実施すること；及び
ｃ．そのように産生されたアンプリコンを検出することを含み、両方のアンプリコンの存在の検出が、前記試料がコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡについてヘテロ接合性であることを示し、前記第１のアンプリコンのみの検出が、前記試料がコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡについてホモ接合性であることを示す、方法。

【請求項30】

前記第１のＤＮＡ分子対が配列番号１０及び１１のプライマー対を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記第１及び第２のＤＮＡ分子対が検出可能な標識を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記検出可能な標識が、前記プライマー分子のうちの１つ以上と共有結合している、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

コーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸分子の存在を検出する方法であって、
ａ．前記試料を、イベントＤＡＳ－０１１３１－３からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において使用された場合に、イベントＤＡＳ－０１１３１－３について診断的であるアンプリコンを生成する一対のプライマーと接触させること；
ｂ．核酸増幅反応を行い、それにより、イベントＤＡＳ－０１１３１－３について診断的であるアンプリコンを生成すること；及び
ｃ．イベントＤＡＳ－０１１３１－３の診断であるアンプリコンを検出することを含む、方法。

【請求項35】

ＤＡＳ－０１１３１－３のイベントを診断する前記核酸分子が、前記核酸増幅連鎖反応によって産生されるアンプリコンである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記試料をプローブと接触させることを更に含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記プローブが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記検出可能な標識が、前記プローブと共有結合している、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ鋳型を標的とし、ポリメラーゼ連鎖反応法の結果としてイベントＤＡＳ－０１１３１－３のアンプリコン診断を生成する１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドプライマー。

【請求項40】

請求項３９に記載の複数のポリヌクレオチドプライマーであって、
ａ．第１のポリヌクレオチドプライマーが、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列及びその相補体を含み；及び
ｂ．第２のポリヌクレオチドプライマーが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列及びその相補体を含む、ポリヌクレオチドプライマー。

【請求項41】

前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーが少なくとも１８ヌクレオチドである、請求項４０に記載のプライマー。

【請求項42】

試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ．トウモロコシＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３由来のＤＮＡとハイブリダイズし、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブと接触させること；
ｂ．前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び
ｃ．前記プローブの前記ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出することを含み；
ハイブリダイゼーションの検出が、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の存在を示す、方法。

【請求項43】

核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの連続するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含み、試料中の標的核酸配列の増幅又は標的核酸配列へのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列へのハイブリダイゼーションの際に、前記試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸配列の存在について診断する、イベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸を検出するためのキット。

【請求項44】

前記核酸分子が、配列番号１０～２７からのヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

前記核酸分子が、配列番号１０～１８及びその相補体から選択されるプライマーである、請求項４３に記載のキット。

【請求項46】

前記遺伝子型が、配列番号２４又は配列番号２７の１つにおいて１、２、３、４、又は５個のヌクレオチド変化を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のコーン植物。

【請求項47】

配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含む、請求項１に記載のコーン植物。

【請求項48】

ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、ゲノム工学技術を前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列に適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含む、方法。

【請求項49】

前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列において重複した配列番号２２又は配列番号２５の全部又は一部を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項52】

前記切除が、１つ以上の調節エレメントの活性に実質的に影響を及ぼさない配列番号３の前記１つ以上の調節エレメントからの切除を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列から切除された配列番号２２又は配列番号２５の全部又は一部を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列から切除された配列番号３の少なくとも３０％を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

配列番号３の少なくとも８０％が前記改変ＤＮＡ配列から切除される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

配列番号３の全てが前記改変ＤＮＡ配列から切除される、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントゲノム編集システムで使用するためのガイドポリヌクレオチドを生成する方法であって、配列番号３の少なくとも一部を認識する１つ以上のガイドポリヌクレオチドを設計することと、前記ガイドポリヌクレオチドを合成することとを含む方法。

【請求項58】

アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有するＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡを改変する方法であって、前記ＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡを改変するために、ゲノム工学組成物の一部として請求項５７に記載の前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドを前記ＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡに導入することを含む、方法。

【請求項59】

ＣＡＳポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、及びＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントドナーＤＮＡを含むＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントゲノム編集システム。

【請求項60】

アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有するＡＴＣＣに寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントの少なくとも１つの発現カセットを改変する方法であって、ゲノム編集技術を使用して少なくとも１つの発現カセットを改変することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３イベントに由来する得られたトウモロコシ植物が少なくとも１つの改変カセットを含む、方法。

【請求項61】

前記方法が、ｃｒｙ１Ｄａ２の発現を変更させることを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的であるヌクレオチド配列を含むコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物から生産された穀粒を加工することを含む商品植物製品を生産する方法であって、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、前記穀粒が、コーン副生成物を含有するために全体的又は部分的に製造されたコーン粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンスターチ、及びシリアルから選択される商品植物製品に加工され、組成物／商品植物製品は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む、方法。

【請求項63】

鱗翅目昆虫を防除する方法であって、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の耐虫性トウモロコシ植物に前記鱗翅目昆虫を曝露することを含む、方法。

【請求項64】

前記鱗翅目昆虫が、ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記鱗翅目昆虫がコーンイアワーム（へリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ））である、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記鱗翅目昆虫からの損傷が、イベントＤＡＳ－０１１３１－３のトウモロコシ粒又は穀粒について防除される、請求項６３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年１１月１６日に出願された米国仮出願第６３／２６４，１００号の利益を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された配列表の参照
２０２２年１０月２５日に作成されたファイル名「８７６５＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」、サイズ８５，１２６バイトのＸＭＬ形式の配列表が、明細書と同時にコンピュータ可読形式でファイル化される。このＸＭＬ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本明細書に開示される実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡ構築物を含む植物分子生物学の分野に関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む昆虫抵抗性コーン植物並びに試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の存在を検出するためのアッセイ及びその組成物も含む。

【背景技術】

【0004】

コーンは、重要な作物であり、世界の多くの地域の主要な食料源である。害虫によって引き起こされる被害は、化学農薬などの防護対策が講じられているにもかかわらず、世界のコーン作物損失の主な要因である。このような事情を踏まえて、虫害の防除及び従来の化学農薬の必要性の低減を目的として、コーンなどの作物に昆虫抵抗性をもたらす遺伝子操作が行われている。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の一群は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）由来のδ－エンドトキシン群である。δ－エンドトキシンは、ワタ、ジャガイモ、イネ、ヒマワリ、並びにコーンなどの作物植物において首尾よく発現されており、特定の状況では、害虫に対する優れた防除を提供することが証明されている。（Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：９３９－９４３；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３１３－３２１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１５１－１１５５；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１０１－１１０４；ＰＣＴ公開国際公開第０１／１３７３１号パンフレット；及びＢｉｎｇ，Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４^ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）。

【0005】

植物におけるトランス遺伝子の発現は、個々の目的遺伝子の発現をドライブするカセットの向き及び組成並びに植物ゲノム中での位置（恐らくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）又は組込み部位の近くにある転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近接性が原因となる）を含め、多くの異なる要因に影響されることが公知である（Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７）。

【0006】

有性交配の後代が目的のトランス遺伝子を含むかどうかを決定するため、特定のイベントの存在を検出することが可能であれば有利となるであろう。

【0007】

トランス遺伝子の存在の検出は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸プローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によって可能である。これらの検出方法では、概して、多くのＤＮＡ構築物についてコード領域が交換可能であるという理由で、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子など、使用頻度の高い遺伝エレメントに焦点が置かれている。結果として、かかる方法は、異なるイベント間、特に同じＤＮＡ構築物又は極めて類似した構築物を使用して作られたイベント間を区別するには、挿入された異種ＤＮＡに隣接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でない限り、有用でないこともある。

【発明の概要】

【0008】

本実施形態は、昆虫抵抗性コーン（トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３、別名「トウモロコシ系統ＤＡＳ－０１１３１－３」、「コーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３」及び「ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ」、コーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３のＤＮＡ植物発現構築物並びにコーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３及びその後代におけるトランス遺伝子構築物、隣接及び挿入（標的遺伝子座）領域を検出するための方法及び組成物に関する。

【0009】

一態様において、組成物及び方法は、昆虫抵抗性の単子葉作物植物を作製及び選択する方法に関する。組成物は、植物細胞及び植物で発現したときに昆虫に対する抵抗性を付与するＤＮＡ構築物を含む。一態様において、宿主細胞に導入され、そこで複製する能力のある、植物細胞及び植物で発現したときに植物細胞及び植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡ構築物が提供される。トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３は、アグロバクテリウムによるプラスミドＰＨＰ８８４９２の形質転換によって産生された（図１）。本明細書に記載されるように、これらのイベントは、特定の鱗翅目植物有害生物に対する抵抗性を付与するｃｒｙ１Ｄａ２遺伝子（配列番号５のアミノ酸をコードする配列番号４のポリヌクレオチド）カセット（表１）を含む。昆虫防除成分は、鱗翅目昆虫種に対する有効性を実証した。

【0010】

プラスミドＰＨＰ８８４９２のＴ－ＤＮＡ領域を図２に概略的に示し、その配列を配列番号２として提供する。プラスミドＰＨＰ８８４９２のＴ－ＤＮＡは２つの遺伝子カセットを含む。

【0011】

第１のカセット（ｃｒｙ１Ｄａ２遺伝子カセット）は、いずれもバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（米国特許第９８９０３９０号明細書［Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８］）由来の殺虫性コア毒素及びｃｒｙ１Ａｂ遺伝子の誘導体をコードするｃｒｙ１Ｄａ２遺伝子由来の配列から構成されるキメラ遺伝子を含む。発現されたＣｒｙ１Ｄａ２タンパク質は、特定の鱗翅目害虫の制御を付与する。Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質は、ｃｒｙ１Ａｂに由来する最後の９アミノ酸を含む６０３アミノ酸長であり、約６８ｋＤａの分子量を有する（図３）。ｃｙ１Ｄａ２遺伝子の発現は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びイントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）を含むトウモロコシユビキチン遺伝子１（ｕｂｉＺＭ１）由来のプロモーター領域によって制御される。ｃｒｙ１Ｄａ２遺伝子のターミネーターは、ｕｂｉＺＭ１遺伝子由来のターミネーター領域である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；米国特許第９６８８９９６号明細書［Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７］）。

【0012】

第２のカセット（ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子カセット）は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）及びブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）（国際公開第２０１３１１６７００号パンフレット［Ｌｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３］；Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１）由来のキメラ葉緑体移行ペプチド（ポリヌクレオチド配列番号６及びアミノ酸配列番号７）、ＴｒａＰ８（ポリヌクレオチド配列番号８及びアミノ酸配列番号９）に融合したストレプトミセス・スビセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｖｉｃｅｕｓ）由来の５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ（ｅｐｓｐｓ）遺伝子を含む。発現されたＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳタンパク質は、グリホサート除草剤に対する耐性を提供するために、ＴｒａＰ８ペプチドを介してトウモロコシ葉緑体に標的化される。ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子の推定発現は、４８１アミノ酸の全長及び６５アミノ酸のＴｒａＰ８ペプチド並びに２アミノ酸リンカーを含む約５１ｋＤａの分子量を有する前駆体タンパク質をもたらす。ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子の発現は、５’ＵＴＲ及びイントロンを含むｕｂｉＺＭ１プロモーターの第２のコピー、及びｕｂｉＺＭ１ターミネーターの第２のコピーによって制御される。

【0013】

ＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡは、２つのａｔｔＢ組換え部位（ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２）、２つの操作されたランディングパッド領域（ＥＬＰ１領域１及びＥＬＰ１領域２）、及び４つのジンクフィンガーヌクレアーゼ標的認識部位（ＺＦＮ）を含む（それぞれＨａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００及びＫａｔｚｅｎ，２００７；米国特許第１０１６０９７５号明細書［Ａｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８］；Ａｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。機能するためには、これらの部位は、植物に天然には存在しない特定のリコンビナーゼ酵素（Ｃｏｘ，１９８８；Ｄａｌｅ ａｎｄ Ｏｗ，１９９０；Ｔｈｏｒｐｅ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９８）を必要とするため、これらの部位が単独で存在しても組換えは生じない。

【0014】

いくつかの実施形態によれば、ＤＡＳ－０１１３１－３（すなわち、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２７０７７に寄託されている、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を有する植物）と呼ばれる新規コーン植物を同定するための組成物及び方法が提供される。本方法は、ＤＡＳ－０１１３１－３の５’及び／又は３’隣接配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づく。ＰＣＲ反応で利用されたとき、トランスジェニックイベントＤＡＳ－０１１３１－３にユニークなアンプリコンを産生することになるプライマー配列を含むＤＮＡ分子が提供される。一実施形態において、こうした分子を含むコーン植物及び種子が企図される。更に、こうしたプライマー配列を利用して、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントを同定するためのキットが提供される。

【0015】

一部の実施形態は、本明細書に記載されるとおりのＤＡＳ－０１１３１－３の特異的隣接配列に関し、これを使用して、生物学的試料中のＤＡＳ－０１１３１－３の同定方法を開発することができる。より詳細には、本開示は、ＤＡＳ－０１１３１－３の５’及び／又は３’隣接領域に関し、これを使用して特異的プライマー及びプローブを開発することができる。更なる実施形態は、かかる特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＤＡＳ－０１１３１－３の存在の同定方法に関する。

【0016】

一部の実施形態によれば、試料中のコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。このような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡプライマーセットであって、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーンから抽出されたゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応で使用されるとき、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の診断指標となるアンプリコンを産生するＤＮＡプライマーセットに接触させること；（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりアンプリコンを産生すること；及び（ｃ）アンプリコンを検出することを含む。一部の態様において、プライマーセットは、配列番号１０及び１１と、任意選択で、配列番号１２を含むプローブとを含む。

【0017】

いくつかの実施形態によれば、試料中のＤＡＳ－０１１３１－３イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でコーン含有イベントＤＡＳ－０１１３１－３から抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子と接触させること；（ｂ）前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；（ｃ）含有イベントＤＡＳ－０１１３１－３コーンから抽出されたＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。より具体的には、試料中のＤＡＳ－０１１３１－３イベントに対応するＤＮＡ分子の存在の検出方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、イベントにユニークな配列、例えば接合配列を含むＤＮＡプローブ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３から抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子に接触させること；（ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。

【0018】

加えて、ＤＡＳ－０１１３１－３特異的領域を検出するものである、生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を同定するためのキット及び方法が提供される。

【0019】

ＤＡＳ－０１１３１－３の少なくとも１つの接合配列を含むＤＮＡ分子が提供され；ここで、接合配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、その挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞のＤＮＡとの間に位置する接合にまたがる。接合配列の検出は、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントの診断とすることができる。

【0020】

いくつかの実施形態によれば、耐虫性コーン植物を産生する方法は、（ａ）昆虫に対する耐性を付与する、本明細書中に開示される発現カセットを含む第１の親コーン系統と、そのような発現カセットを欠く第２の親コーン系統とを有性交配し、それにより、複数の子孫植物を作製すること；（ｂ）昆虫耐性である子孫植物を選択することを含む。かかる方法は、任意選択で、後代植物を第２の親コーン系統と戻し交配することにより、昆虫抵抗性のある純種コーン植物を作製する更なるステップを含み得る。

【0021】

一部の実施形態は、昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、コーン細胞をＤＮＡ構築物ＰＨＰ８８４９２で形質転換すること、形質転換されたコーン細胞をコーン植物に成長させること、昆虫に対して抵抗性を示すコーン植物を選択すること及びコーン植物を稔性のコーン植物に更に成長させることを含む方法を提供する。この稔性のコーン植物を自家受粉するか、又は適合性のあるコーン品種と交配させることにより、昆虫抵抗性の後代を作製することができる。

【0022】

一部の実施形態は、生物学的試料中のトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３を同定するためのＤＮＡ検出キットに更に関する。このキットは、ＰＣＲ同定プロトコルでの使用のための、ＤＡＳ－０１１３１－３の５’又は３’隣接領域を特異的に認識する第１のプライマーと、ＤＡＳ－０１１３１－３の非天然標的遺伝子座ＤＮＡ内にあるか又は隣接ＤＮＡ内にある配列を特異的に認識する第２のプライマーとを含む。更なる実施形態は、生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の特異的領域と約８０％～１００％の配列同一性を有する配列に対応するか又はそれと相補的な配列を有する特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の５’又は３’隣接領域の一部を含む特異的領域に対応し得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２のプライマーは、配列番号１０～１１、１３～１４又は１６～１７のいずれか１つを含む。

【0023】

本明細書に開示される実施形態に包含される方法及びキットは、以下のような異なる目的に使用することができるが、これらに限定されない：植物、植物材料又は植物材料を含む若しくは植物材料に由来する食品又は飼料製品（生鮮品又は加工品）などであるがこれらに限定されない製品におけるイベントＤＡＳ－０１１３１－３を特定する；追加的又は代替的に、本方法及びキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料との間の分離を目的としてトランスジェニック植物材料を同定するために使用することができる。追加的又は代替的に、方法及びキットを使用して、トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む植物材料の品質を決定することができる。本キットは、検出方法の実施に必要な試薬及び材料も含有し得る。

【0024】

更なる実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーン植物又はその一部、限定はされないが、コーン植物ＤＡＳ－０１１３１－３の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核及び卵細胞の核並びにこれらに由来する後代に関する。別の実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３のトウモロコシ植物及び種子を標的とするＤＮＡプライマー分子は、特異的アンプリコン産物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子カセットを含むプラスミドＰＨＰ８８４９２の概略図を示す。プラスミドＰＨＰ８８４９２のサイズは１８，０２４ｂｐ（配列番号１）である。

【図2】ｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子カセットを示すＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡ領域の概略図を示す。Ｔ－ＤＮＡのサイズは１２，６６４ｂｐ（配列番号２）である。

【図3】ＤＡＳ－０１１３１－３の形質転換及び開発の概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本明細書で使用されるとき、単数形「１つの」、「及び」及び「その」には、文脈上特に明確に指図されない限り、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「ある細胞」という表現は、複数のかかる細胞を含み、「そのタンパク質」という表現は、１つ以上のタンパク質及びその均等物を含む等となる。別途明確な指示がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。添付の配列表に列挙され、本明細書で参照される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な略語を使用して示される。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。

【0027】

本開示の組成物は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－１２７０７７として寄託された種子並びにそれに由来する植物、植物細胞及び種子を含む。本出願人らは、２０２１年５月２６日に、少なくとも６２５個のトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３（特許寄託番号ＰＴＡ－１２７０７７）の種子をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０－２２０９ ＵＳＡに寄託した。これらの寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に基づき管理されることになる。２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託されたこの種子は、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ－Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、７２５０ ＮＷ ６２^ｎｄ Ａｖｅｎｕｅ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｉｏｗａ ５０１３１－１０００によって管理されている寄託物から取られた。この申請の係属中は、Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓの長官及び申請に対して長官がその権利を有すると認めた者がこの寄託物を入手できる。本出願の請求項が許可されると、本出願人は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０－２２０９によるハイブリッドトウモロコシの少なくとも６２５個の種子の寄託の試料を公衆に利用可能にする。トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３の種子のこの寄託物は、公的寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間若しくは最後に請求があったときから５年又は本特許の効力が続く間のいずれか長い期間にわたって管理されることになり、その期間中に生存不能になった場合、交換されることになる。更に、出願人は、寄託時に試料の生存率を提示することを含め、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０１条～１．８０９条の全ての要件を満足させている。出願人は、生物物質の移動又はその商業的な輸送に対して法が課す制限を撤回する権限を有しない。本出願人らは、本特許に基づき与えられるその権利又は植物品種保護法（Ｐｌａｎｔ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｃｔ）（合衆国法典第７巻第２３２１条以下）に基づくイベントＤＡＳ－０１１３１－３に適用可能な権利のいかなる侵害も免除しない。無許可の種子増殖は禁止されている。種子は規制を受けることもある。

【0028】

本明細書で使用される場合、用語「コーン」は、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）又はトウモロコシを意味し、野生トウモロコシ種を含め、コーンと共に育種され得る全ての植物品種を含む。

【0029】

本明細書で使用される場合、「昆虫耐性」及び「衝撃性害虫」という用語は、限定するものではないが、以下を含む、発生の任意の段階で昆虫の摂食、成長、及び／又は行動の変化をもたらすことを指す。虫を殺すこと；成長遅延；生殖能力の低下；供給を阻止する；などである。

【0030】

本明細書で使用されるとき、用語「殺害虫活性」及び「殺昆虫活性」は、適切な時間長さにわたって生物又は物質を摂餌させた後及び／又はそれに曝露した後に、限定はされないが、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避並びに害虫の他の行動的及び身体的変化を含め、多くのパラメータによって測定することのできる生物又は物質（例えば、タンパク質など）の活性を指して同義語として使用される。例えば、「殺害虫タンパク質」は、単独で又は他のタンパク質との組み合わせで殺害虫活性を示すタンパク質である。

【0031】

本明細書で使用されるとき、「インサートＤＮＡ」は、植物材料の形質転換に使用される発現カセット内にある異種ＤＮＡを指し、一方、「隣接ＤＮＡ」は、植物などの生物に自然に存在するゲノムＤＮＡのもの又は元のインサートＤＮＡ分子にとって異質な、形質転換法によって導入される外来性（異種）ＤＮＡのもの、例えば形質転換イベントに関連する断片のいずれかを指し得る。「隣接領域」又は「隣接配列」は、本明細書で使用されるとき、元の非天然インサートＤＮＡ分子の直接上流にそれと隣接して位置するか、且つ／又は直接下流にそれと隣接して位置するかのいずれかの少なくとも１０ｂｐ（一部の狭義の実施形態では、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ及び最大で少なくとも５０００ｂｐ）の配列を指す。外来性ＤＮＡの形質転換手順により、各形質転換体に特徴的でユニークな種々の隣接領域を含む形質転換体が生じ得る。従来の交配を通じて組換えＤＮＡが植物に導入されるとき、概してその隣接領域は変化しないことになる。数世代の植物育種及び従来の交配を通じて隣接領域に一塩基変化が起こる可能性もあり得る。形質転換体は、異種インサートＤＮＡ片とゲノムＤＮＡとの間若しくは２つのゲノムＤＮＡ片間又は２つの異種ＤＮＡ片間にユニークな接合を含むことにもなる。「接合」は、２つの特異的ＤＮＡ断片がつながっている箇所である。例えば、接合は、インサートＤＮＡが隣接ＤＮＡにつながっているところに存在する。接合箇所は、天然の生物に見られるものと比べて改変された形態で２つのＤＮＡ断片が一体につながっている形質転換生物にも存在する。「接合ＤＮＡ」は、接合箇所を含むＤＮＡを指す。本開示に示される接合配列は、トウモロコシゲノムＤＮＡとインサートの５’末端との間に位置する接合箇所を含んで、その接合箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２２）、その接合箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号２３）及びその接合箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号２４）の範囲に及ぶもの；並びにインサートの３’末端とトウモロコシゲノムＤＮＡとの間に位置する接合箇所を含んで、その接合箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２５）、その接合箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号２６）及びその接合箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号２７）の範囲に及ぶものである。本開示に示される接合配列は、標的遺伝子座とインサートの５’末端との間に位置する接合箇所も含む。隣接領域を伴う完全なインサートは、配列番号３に表される。

【0032】

一実施形態では、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む種子、植物及び植物部分が提供され、前記種子、植物及び植物部分は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７から選択されるＤＮＡ配列、又は配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から選択されるＤＮＡ配列を含み、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。別の実施形態では、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む種子、植物及び植物部分が提供され、前記種子、植物及び植物部分は、配列番号３、又は配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0033】

本明細書で使用されるとき、核酸配列に言及した「異種」は、性的適合性のない異なる種を起源とするか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座がその天然形態と比べて実質的に改変されている核酸配列である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのヌクレオチド配列の由来となった種と異なる種のものであり得るか又は同じ種のものである場合、そのプロモーターが自然中でそのヌクレオチド配列に作動可能に連結されて見出されることはない。異種タンパク質は、外来種を起源とし得るか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によってその元の形態と比べて実質的に改変されている。

【0034】

用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有する核酸分子、即ち作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳発現パターンに影響を及ぼす能力を有するものを指す。従って用語「遺伝子調節活性」は、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現に対し、その作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすことによって影響を及ぼす能力を指す。遺伝子調節活性は、正及び／又は負であり得、その効果は、その時間的、空間的、発生的、組織、環境、生理学的、病理学的、細胞周期及び／又は化学的応答の質によると共に、定量的又は定性的指標によっても特徴付けられ得る。

【0035】

「プロモーター」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する能力のあるヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。これに従えば、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することのできるヌクレオチド配列であり、プロモーターの固有のエレメントであり得るか、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され得るか、又は更に合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当技術分野の当業者によれば、異なる調節エレメントは、異なる組織又は細胞型における、又は異なる発生段階にある、又は異なる環境条件に応答した遺伝子の発現を導き得ることが理解される。ほとんどの細胞型でほぼ常に核酸断片の発現を生じさせるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義付けられていないため、異なる長さの核酸断片が同一の又は類似したプロモーター活性を有し得ることが更に認識される。

【0036】

「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡでは翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を含め、多くのパラメータに影響を及ぼし得る。

【0037】

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びその他の、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼす能力のある調節シグナルをコードする配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。

【0038】

ＤＮＡ構築物は、１つ以上の発現カセットを提供する一体に連結されたＤＮＡ分子の集合体である。ＤＮＡ構築物は、細菌細胞における自己複製が可能となるようにされた、機能性遺伝エレメント、即ちとりわけプロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、３’終結領域を提供するＤＮＡ分子の導入に有用な様々なエンドヌクレアーゼ酵素制限部位を含むプラスミドであり得るか；又はＤＮＡ構築物は、発現カセットなど、ＤＮＡ分子の線状の集合体であり得る。ＤＮＡ構築物内に含まれる発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写をもたらすのに必要な遺伝エレメントを含む。発現カセットは、原核細胞又は真核細胞で発現するように設計することができる。本実施形態の発現カセットは、植物細胞で発現するように設計される。

【0039】

本明細書に開示されるＤＮＡ分子は、目的の生物における発現用の発現カセットに提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していること及び２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、隣接していて、且つ同じリーディングフレームにあることを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーターと第２の配列との間の機能的連結を指し示すことが意図され、ここで、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ、それを媒介する。カセットは、加えて、生物に同時形質転換しようとする少なくとも１つの追加的な遺伝子を含有し得る。代わりに、そうした１つ又は複数の追加的な遺伝子は、複数の発現カセット上又は複数のＤＮＡ構築物上に提供され得る。

【0040】

発現カセットは、転写の５’から３’方向に：宿主として働く生物において機能する転写及び翻訳開始領域、コード領域、並びに転写及び翻訳終結領域を含み得る。転写開始領域（例えば、プロモーター）は、宿主生物にとって未変性若しくは類似体であり得るか、又は外来性若しくは異種であり得る。加えて、プロモーターは、天然配列であり得るか、又は代わりに合成配列であり得る。発現カセットは、加えて、発現カセット構築物に５’リーダー配列を含有し得る。そのようなリーダー配列は、翻訳を強化するように働き得る。

【0041】

本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック」には、概して、その遺伝子型が異種核酸の存在によって変化し（当初からそのように変化したもの並びに初期トランスジェニックからの有性交配又は無性繁殖によって作り出されたものを含む）、且つかかる異種核酸を保持している任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物が含まれることが理解されるべきである。

【0042】

トランスジェニック「イベント」は、目的のトランス遺伝子を含む核酸発現カセットを含めた、１つ又は複数の異種ＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換、トランス遺伝子が植物のゲノムに挿入されることによって生じる植物集団の再生及び特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる植物の選択によって作製される。イベントは、トランス遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは植物体の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」は、形質転換体と別の品種との間での有性異系交配によって作製された後代も指し、この後代は、異種ＤＮＡを含む。反復親との戻し交配後、その交配の後代には、形質転換した親からの挿入されたＤＮＡ及び連結している隣接ゲノムＤＮＡが同じ染色体位置に存在する。後代植物は、従来の育種技法の結果として生じるインサートの配列変化を含み得る。用語「イベント」は、挿入されたＤＮＡと、その挿入されたＤＮＡに直接隣接する隣接配列とを含む元の形質転換体からのＤＮＡであって、挿入されたＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体及び自殖によって生じる後代）と、その挿入されたＤＮＡを含まない親系統との有性交配の結果として、目的のトランス遺伝子を含め、挿入されたＤＮＡを受け取る後代に受け継がれることが期待されるであろうＤＮＡも指す。

【0043】

昆虫抵抗性ＤＡＳ－０１１３１－３コーン植物の育種は、初めに、昆虫抵抗性を付与する本実施形態の発現カセットによる形質転換に由来するトランスジェニックＤＡＳ－０１１３１－３イベント植物及びその後代を有する第１の親コーン植物と、かかる発現カセットを欠いている第２の親コーン植物とを有性交配し、それにより複数の第１の後代植物を作製すること；及び次に昆虫に対して抵抗性のある第１の後代植物を選択すること；及び第１の後代植物を自殖させて、それにより複数の第２の後代植物を作製すること；及び次に第２の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択することによることができる。これらのステップは、第１の昆虫抵抗性の後代植物又は第２の昆虫抵抗性の後代植物を第２の親コーン植物又は第３の親コーン植物と戻し交配し、それにより昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製することを更に含み得る。用語「自殖」は、同じ生物からの配偶子及び／又は核の合体を含め、自家受粉を指す。

【0044】

本明細書で使用されるとき、用語「植物」には、全植物、植物の部位、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞及びその後代への言及が含まれる。一部の実施形態において、トランスジェニック植物の部位は、本明細書に開示されるＤＮＡ分子で以前に形質転換されていて、従って少なくとも一部はトランスジェニック細胞からなるトランスジェニック植物又はその後代を起源とする、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚並びに花、茎、果実、葉及び根を含む。

【0045】

本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞」には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子が含まれる。使用し得る植物クラスは、概して、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含めた、形質転換技法に適している高等植物クラスと同程度に広範である。

【0046】

「形質転換」は、核酸断片を宿主生物のゲノムに移入する結果、遺伝的に安定して受け継がれるようになることを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主植物は、「トランスジェニック」植物と称される。

【0047】

本明細書で使用されるとき、用語「後代」は、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の文脈では、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む親植物の任意の世代の子孫を指す。

【0048】

本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞への導入能及びそこでの複製能のある組換え構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に取り込まれ得る。かかる構築物は、複製システム並びに所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写能及び翻訳能を有する配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定なトランスフェクション又はトランスジェニック植物の確立に適したいくつかのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５；Ｓｕｐｐ．１９８７）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＦｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下にある１つ以上のクローニングされた遺伝子並びに優勢選択マーカーを含む。かかる植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導性の若しくは構成的な、環境的に若しくは発生的に調節された又は細胞特異的若しくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及び／又はポリアデニル化シグナルも含有することができる。

【0049】

インサートを植物細胞のゲノムに導入する過程では、インサート及び／又はゲノム隣接配列の何らかの欠失又は他の変化が起こることも珍しくない。従って、本明細書で提供されるプラスミド配列の関連セグメントは、トランケーションを含むいくつかの小さな変異を含み得る。本明細書で提供される隣接配列及び連結配列についても同じことが可能である。従って、本主題の隣接及び／又はインサート配列と何らかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、本主題の開示の範囲内にある。本開示の配列との同一性は、本明細書に例示される又は記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。本明細書に提供されるとおりのハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション条件も、本主題の開示のかかる植物及びポリヌクレオチド配列を定義するのに用いることができる。隣接配列＋完全インサート配列を含む配列は、寄託された種子を基準として確認することができる。

【0050】

一部の実施形態において、２つの異なるトランスジェニック植物を交配することにより、２つの独立に分離する加えられた外因性遺伝子を含む子孫を作製することもできる。適切な後代の自殖により、加えられた外因性遺伝子に関してホモ接合の植物を作製することができる。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も栄養繁殖と同じく企図される。

【0051】

「プローブ」は、従来の合成の検出可能標識又はレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤又は酵素が取り付けられている単離核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、例えばイベントからのＤＮＡを含むコーン植物又は試料からであるかにかかわらず、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３からの単離されたＤＮＡの鎖と相補的である。プローブには、デオキシリボ核酸又はリボ核酸が含まれるのみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、且つその標的ＤＮＡ配列の存在の検出に使用することができるポリアミド及び他の改変ヌクレオチドも含まれる。

【0052】

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールする単離核酸であり、それによりプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドが形成され、次にはそれが標的ＤＮＡ鎖に沿ってポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより伸張される。プライマー対とは、例えばＰＣＲ又は他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅へのその使用を指す。「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡセグメントの増幅に用いられる技法である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，８００，１５９号明細書を参照されたく；本明細書において参照により援用される）。

【0053】

プローブ及びプライマーは、操作者が決定したハイブリダイゼーション条件又は反応条件で標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択の検出方法において有用となるのに十分な長さである任意の長さであり得る。概して、１１ヌクレオチド以上の長さ、１８ヌクレオチド以上及び２２ヌクレオチド以上が用いられる。かかるプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。実施形態に係るプローブ及びプライマーは、標的配列と完全なＤＮＡ配列類似性の連続するヌクレオチドを有し得るが、標的ＤＮＡ配列と異なる、且つ標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイズ能を保持しているプローブが、従来方法によって設計され得る。プローブはプライマーとして使用されることもできるが、概して標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、増幅過程に使用されない。

【0054】

特異的プライマーは、生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を同定するための「特異的プローブ」として使用し得るアンプリコンを作製するため、組込み断片の増幅に使用され得る。プローブによる試料への結合を許容する条件下でプローブが生物学的試料の核酸にハイブリダイズすると、その結合を検出することができ、ひいては生物学的試料中にイベントＤＡＳ－０１１３１－３が存在すると指示することが可能となる。本開示のある実施形態において、特異的プローブは、適切な条件下でイベントの５’又は３’隣接領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、且つそれに隣接する外来性ＤＮＡの一部も含む配列である。特異的プローブは、イベントの特異的領域と少なくとも８０％、８０及び８５％、８５及び９０％、９０及び９５％及び９５及び１００％同一の（又は相補的な）配列を含み得る。

【0055】

プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以降、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５（定期的更新を含む）（以降「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５」）；及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、バージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；及びＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５（著作権）、１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー分析ツールなど、この目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列から導き出すことができる。加えて、当業者に公知の手引きを用いて配列を目視で読み取り、プライマーを手作業で同定することができる。

【0056】

「キット」は、本明細書で使用されるとき、本開示の方法の実施形態の実施、より詳細には生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の同定を目的とした一組の試薬及び任意選択で説明書を指す。キットが使用され得、その構成要素は、品質管理（例えば種子ロットの純度）、植物材料中又は限定はされないが、食品又は飼料生産物など、植物材料を含むか又はそれに由来する材料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の検出を目的として具体的に調整することができる。「植物材料」は、本明細書で使用されるとき、植物から入手されたか又はそれに由来する材料を指す。

【0057】

本明細書に開示される隣接ＤＮＡ及びインサート配列をベースとするプライマー及びプローブを使用すると、開示される配列を従来の方法により、例えば、かかる配列のリクローニング及びシーケンシングにより確認する（及び必要に応じて修正する）ことができる。核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション又は増幅方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベントからのＤＮＡの存在を同定し得る。

【0058】

核酸分子は、別の核酸分子の「相補体」であると、それらが完全な相補性又は最小限の相補性を呈する場合に言われる。本明細書で使用されるとき、分子は、それらの分子の一方のあらゆるヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的であるとき、「完全な相補性」を呈すると言われる。２つの分子は、それらが少なくとも従来の「低いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが従来の「高いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９及びＨａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌにより Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に記載されており、従って完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱によって分子が二本鎖構造を形成する能力が完全になくならない限りは許容できる。核酸分子がプライマー又はプローブとしての役割を果たすために、利用される詳細な溶媒及び塩濃度の下で配列が安定した二本鎖構造を形成することを可能とするのに十分な相補性がありさえすればよい。

【0059】

ハイブリダイゼーション反応では、特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、決定的因子は、最終的な洗浄溶液のイオン強度及び温度である。熱的融点（Ｔ_ｍ）は、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズするときの（一定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔ_ｍを、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７－２８４：の式から近似することができ；Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％形態）－５００／Ｌ（式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）から概算することができる。Ｔ_ｍは、１％のミスマッチ毎に約１℃ずつ低下する；このように、所望の同一性の配列をハイブリダイズさせるため、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を調整することができる。例えば、９０％超の同一性を有する配列を得たい場合には、Ｔ_ｍを１０℃低下させ得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列及びその相補配列についてのＴ_ｍと比べて約５℃低くなるように選択される。しかしながら、一部の実施形態では、他のストリンジェンシー条件が適用され得、重度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも１、２、３又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも６、７、８、９又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低いストリンジェンシー条件は、Ｔ_ｍよりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができるなどが含まれる。

【0060】

この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄の組成、並びに所望されるＴ_ｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に記載されることを理解するであろう。所望ミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ_ｍをもたらす場合、使用者は、より高い温度を用いることができるように、ＳＳＣ濃度を増加させることを選択し得る。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に見られる。

【0061】

一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子と同じ長さを有する。一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長い又は短い。一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１％、２％、３％、４％又は５％長い又は短い。一部の実施形態において、相補配列は、ヌクレオチド毎に見たときに相補的であり、即ちミスマッチのヌクレオチドがない（いずれのＡもＴと対合し、いずれのＧもＣと対合する）ということになる。一部の実施形態において、相補配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ未満のミスマッチを含む。一部の実施形態において、相補配列は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％又はそれ未満のミスマッチを含む。

【0062】

参照配列（対象）に対する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大限のパーセント配列同一性を実現した後に、いかなるアミノ酸保存的置換も配列同一性の一部と見なすことなく、候補配列（問い合わせ）中、参照配列のそれぞれのアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージとして決定される。パーセント配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にある様々な方法において、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２などの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較下の配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを実現するためにどのアルゴリズムが必要かを含め、配列のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（例えば、問い合わせ配列のパーセント同一性＝問い合わせ配列と対象配列との間の同一の位置の数／問い合わせ配列の位置の総数×１００）。

【0063】

特定の増幅プライマー対を使用した標的核酸配列の（例えば、ＰＣＲによる）増幅に関して、ストリンジェントな条件とは、プライマーが対応する野生型配列（又はその相補体）を有したならばＤＮＡ熱増幅反応において結合し、任意選択でユニークな増幅産物であるアンプリコンを産生するであろう標的核酸配列に限り、そのプライマー対がハイブリダイズすることを許容するものである。

【0064】

本明細書で使用されるとき、「増幅されたＤＮＡ」又は「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交配から得られたコーン植物が、本明細書に開示されるコーン植物からのトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するため、コーン植物の組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する隣接配列に由来する第１のプライマーと、挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含むＤＮＡプライマー対を使用した核酸増幅法に供すると、イベントＤＮＡの存在の診断指標となるアンプリコンが産生される。代わりに、第２のプライマーは、隣接配列に由来し得る。アンプリコンは、同様にイベントの診断指標になる長さ及び配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の合計長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって産生可能な任意の長さのアンプリコンに至るまでの範囲の長さであり得る。代わりに、プライマー対は、挿入されたＤＮＡの両側にある隣接配列に由来することができ、そのため、ＰＨＰ８８４９２発現構築物のインサートヌクレオチド配列全体並びにトランスジェニックインサートに隣接する配列の一部分を含むアンプリコンが産生されることになる。隣接配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列から離れた位置にあり得、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大で増幅反応の限界に至るまでの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマー二量体を具体的に除外する。

【0065】

核酸増幅は、ＰＣＲを含め、当技術分野において公知の様々な核酸増幅方法のいずれによっても達成され得る。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書、並びにＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）（上記）に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ＫｂのゲノムＤＮＡ及び最大４２ＫｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５－５６９９，１９９４）。本開示の実施形態の実施では、ＤＮＡ増幅のこれらの方法並びに当技術分野において公知の他の方法を用いることができる。具体的な実験室条件に合わせて具体的なＰＣＲプロトコルの幾つものパラメータを調整する必要があり得ること、及びわずかに変更され得、それでもなお同様の結果を集めることが可能であることが理解される。それらの調整は、当技術分野の当業者に明らかであろう。

【0066】

これらの方法によって産生されたアンプリコンは、限定されないが、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４１６７－４１７５，１９９４）を含む複数の技術によって検出することができ、隣接する隣接ＤＮＡ配列及び挿入されたＤＮＡ配列の両方と重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されている。このオリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。目的の領域（例えば、挿入された配列中の１つのプライマー及び隣接する隣接配列中の１つのプライマーを使用する工程）のＰＣＲに続いて、一本鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ及び予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型として機能させることができる。読取り値は、蛍光又はＥＬＩＳＡベースであり得る。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるインサート／隣接配列の存在を指示している。

【0067】

別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（２０００）Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８－２４によって記載されるとおりのパイロシーケンシング技法である。この方法では、隣接するＤＮＡとインサートＤＮＡとの接合にオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域からの一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入された配列に１つのプライマー及び隣接配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸及びルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個別に加え、取込みの結果、光シグナルが生じ、それを測定する。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション並びに単一塩基又は多塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を指示している。

【0068】

Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２－４９８によって記載されている蛍光偏光もアンプリコンの検出に用いることができる方法である。この方法を用いて、隣接と挿入されたＤＮＡとの接合にオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入されたＤＮＡに１つのプライマー及び隣接ＤＮＡ配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの取込みが起こる。取込みは、偏光の変化として蛍光光度計を用いて測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／隣接配列の存在を指示している。

【0069】

定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量化する方法として記載され、市販品製造者が提供する説明書の中で十分に理解されている。簡潔に言えば、かかるｑＰＣＲ方法の１つでは、隣接とインサートＤＮＡとの接合にオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及び隣接ゲノム配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＦＲＥＴプローブがハイブリダイズする結果、蛍光部分の切断及び放出が起こり、ＦＲＥＴプローブのクエンチング部分から離れる。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによる隣接／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

【0070】

Ｔｙａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３－３０８に記載されるとおり、配列検出における使用のための分子ビーコンが記載されている。簡潔に言えば、隣接とインサートＤＮＡとの接合にオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブがユニークな構造である結果、それが、蛍光部分とクエンチング部分とをごく接近した状態に保つ二次構造を備えることになる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（例えば、インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及び隣接配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＰＣＲ増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズする結果、プローブ二次構造が取り除かれて、蛍光部分とクエンチング部分とが空間的に分離する。蛍光シグナル結果。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによる隣接／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

【0071】

アンプリコン内に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応によって産生されたアンプリコンの検出に用いられるなおも別の方法である。

【0072】

害虫としては、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）等、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）から選択される昆虫が挙げられる。

【0073】

興味深いのは、ノクチダエ．スポドプテラ・フルジペルダ（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＪＥ Ｓｍｉｔｈ（ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ））科のヨトウムシ、ハスモンヨトウ、ルーパー及びヘリオチン；Ｓ．エクシグア・ハブナー（Ｓ．ｅｘｉｇｕａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（テントウムシ）；Ｓ．リツラ・ファブリカス（Ｓ．ｌｉｔｕｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（タバコカットワーム、クラスターキャタピラ）；ヨトウムシ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ Ｗａｌｋｅｒ）（ヨトウムシ（ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ｍ．ブラシカエリンナエウス（Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（キャベツガ）；アグロティス．イプシロン・ハフナゲル（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ Ｈｕｆｎａｇｅｌ）（黒色ヨトウムシ）；Ａ．オルトゴニア・モリソン（Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（ハリガネムシ）；Ａ．サブテラネア・ファブリシウス（Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（粒状条虫）；アラバマ．アルギラセア・ヒューブナー（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ワタハリガネムシ）；トリコプルシア．ニ・ヒューブナー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（キャベツルーパー）；シュードプルジア．インクルーデンス・ウォーカー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ）（大豆ルーパー）；アンティカルシアゲメタリス・ヒューブナー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ベルベットビーンキャタピラ）；ハイペナスカブラファブリキウス（Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ミドリクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ））；ヘリオチス．ビレセンス・ファブリシウス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（タバコブドウォーム）；シューダレティア．ウニプンクタ・ハワース（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（アーミーワーム）；アテティスミンダラ・バーネス（Ａｔｈｅｔｉｓ ｍｉｎｄａｒａ Ｂａｒｎｅｓ）及びマクデュナフ（ Ｍｃｄｕｎｎｏｕｇｈ）（粗皮カットワーム）；エウコサ．メソリア・ハリス（Ｅｕｘｏａ ｍｅｓｓｏｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（暗色ヨトウムシ）；エアリアス．インスラナ・ボイスデュバル（Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（トノサマバッタ）；Ｅ．ビッテラ・ファブリシウス（Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（斑点虫）；ヘリコベルパ．アミゲラ・ヒューブナー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（アメリカハリガネムシ）；Ｈ．ジー・ブーディー（Ｈ．ｚｅａ Ｂｏｄｄｉｅ）（コーンイアワーム又はワタ虫）；メランクラピクタ・ハリス（Ｍｅｌａｎｃｈｒａ ｐｉｃｔａ Ｈａｒｒｉｓ）（ゼブラキャタピラ）；エギラ（Ｅｇｉｒａ）サイロメゲス（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）キュリアリス・グローテ（ｃｕｒｉａｌｉｓ Ｇｒｏｔｅ）（シトラスカトミムシ）；ピラリダエ．オストリニア．ヌビリアリス・ヒューブナー（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ヨーロッパコーンボーラー）科のパファレータ、カゼベアラ、ハリガネムシ、ハリガネムシ、及び骨格化動物；アミエロイス・トランシテラ・ウォーカー（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ）（ハリガネムシ）；アナガスタ・クエニエラ・ツェラー（Ａｎａｇａｓｔａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ）（コナガ）；カドラ・カウテラ・ウォーカー（Ｃａｄｒａ ｃａｕｔｅｌｌａ Ｗａｌｋｅｒ）（アーモンドガ）；ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（イネ茎パファレータ）；Ｃ．パルテルス（Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）、（モロコシパファレータ）；コルシクラ・セファロニカ・ステイントン（Ｃｏｒｃｙｒａ ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ）（イネガ）；クランブス・カリギノセル・クレメンス（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（コーンルートウェブワーム）；Ｃ．テトレルス・ジンケン（ブルーグラス・ウェブワーム）；クナファロクロイス・メディナリス・グエネ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ）（ブルーグラスウェブワーム）；デスミア・フネラリス・ヒューブナー（Ｄｅｓｍｉａ ｆｕｎｅｒａｌｉｓ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ブドウリーフホルダー）；ダイアファニア・ヒアリナタ・リンナエウス（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｈｙａｌｉｎａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（メロンワーム）；ミカンキイロアザミウマ（Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ Ｓｔｏｌｌ）（ピックルワーム）；ディアトレア・グランディオセラ・ダイアー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ Ｄｙａｒ（タイワントウガ）、Ｄ．サッカラリス・ファブリクス（Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（サトウキビボーラー）；エオレウマ・ロフティニ・ダイアー（Ｅｏｒｅｕｍａ ｌｏｆｔｉｎｉ Ｄｙａｒ）（メキシコ産イネボーラー）；エフェスティア・エルテラ・ヒューブナー（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｅｌｕｔｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（タバコ（カカオ）ガ）；ガレリア・メロネラ・リナエウス（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヤケガ）；ヘルペトグラッマ・リカルシサリス・ウォーカー（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（ソッドウェブワーム）；ホモエソマ・エレクテルム・フルストＨｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ Ｈｕｌｓｔ（ヒマワリガ）；エラスモパルプス・リグノセルス・ゼラー（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ Ｚｅｌｌｅｒ）（カラスムギボーラー（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ））；クロイア・グリセラ・ファブリシウス（Ａｃｈｒｏｉａ ｇｒｉｓｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（コナガ）；ロキソステージスティチカリス・リンナエウス（Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ハモムシ）；オルタガ・キリサリス・ウォーカー（Ｏｒｔｈａｇａ ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ）（チャタテガ）；マルカ・テストラリス（Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ Ｇｅｙｅｒ）（豆鞘ボーラー）；プロディアインテルプンクテラ・ヒューブナー（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（インドコガ）；シルポファガ・インセルトゥラ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ Ｗａｌｋｅｒ）（イエローステムボーラー）；ウデア・ルビガリス（Ｕｄｅａ ｒｕｂｉｇａｌｉｓ Ｇｕｅｎｅｅ）（セロリーリーフティエ）；ハサミムシ（Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ Ａｃｌｅｒｉｓ ｇｌｏｖｅｒａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（セイヨウトビムシ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌａｃｋｈｅａｄ ｂｕｄｗｏｒｍ））科のハマキブシ、バッドワーム、ハサミムシ（ｓｅｅｄ ｗｏｒｍ）及びウサミムシ（ｆｒｕｉｔ ｗｏｒｍ）；Ａ．バリアナ・フェルナルド（Ａ．ｖａｒｉａｎａ Ｆｅｒｎａｌｄ）（東ブラックヘッドバッドワーム（Ｅａｓｔｅｒｎ ｂｌａｃｋｈｅａｄ ｂｕｄｗｏｒｍ））；アルキプス・アルギロスピラ・ウォーカー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ Ｗａｌｋｅｒ）（果樹葉ローラー）；Ａ．ロサナ・リナエウス（Ａ．ｒｏｓａｎａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ヨーロッパリーフローラ）；及び他のアルキプス（Ａｒｃｈｉｐｓ）種、アドキソフェス・オラナ・フィッシャー・フォン・ロスラースタム（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｖｏｎ Ｒｏｅｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ）（夏果実ハマキガ）；コキリス（Ｃｏｃｈｙｌｉｓ）ホスフェス（Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（ヒマワリガ（ｂａｎｄｅｄ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ））；シディアラティフェレアナワルシンガム（Ｃｙｄｉａ ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（糸状虫）；Ｃ．ポモネラ・リンナエウス（Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コードガ）；プラチノータ・フラベデナ・クレメンス（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｆｌａｖｅｄａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（板状リーフローラー）；Ｐ．スツルタナ・ウォルシンガム（Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（オムニボラリーフローラ）；ロベシア・ボツラナ・デニス＆シフェールミュラー（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ Ｄｅｎｉｓ＆Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｅｌｌｅｒ）（ヨーロッパブドウガ）；スピロノータ・オセラーナ・デニス（Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ ｏｃｅｌｌａｎａ Ｄｅｎｉｓ）＆シフェールミュラー（Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（アイスポットハマキガ）；エンドピーザ・ビテアナ・クレメンス（Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ Ｃｌｅｍｅｎｓ）（ブドウベリーガ）；エウポエシラ・アンビグエラ・ヒューブナー（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ツガ）；ボナゴタ・サブブリコラ・メイリック（Ｂｏｎａｇｏｔａ ｓａｌｕｂｒｉｃｏｌａ Ｍｅｙｒｉｃｋ）（ブラジルリンゴリーフロール）；グラフォリタ・モレスタ・ブスク（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ Ｂｕｓｃｋ）（オリエンタル果実ガ）；スレイマ・ヘリアンサーナ・リレイ（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ Ｒｉｌｅｙ）（ヒマワリ芽ガ）；アルギロタエニア属（Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ ｓｐｐ）；及びコリストネウラ属（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｓｐｐ．）含むがこれらに限定されない鱗翅目の幼虫及び成体である。

【0074】

鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の選択された他の農学的有害生物には、それだけに限らないが、アルソフィラ・ポメタリア・ハリス（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｐｏｍｅｔａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（フォールシャクトリムシ（ｆａｌｌ ｃａｎｋｅｒｗｏｒｍ））；アナリシア・リネテラ・ゼラ（Ａｎａｒｓｉａ ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ Ｚｅｌｌｅｒ）（モモアカアブラムシ）；アニソタ・セナトリア（Ａｎｉｓｏｔａ ｓｅｎａｔｏｒｉａ）Ｊ．Ｅ．スミス（オレンジ縞アブラムシ）；アンセラエア・ペルニ・グエリン－メネビレ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）チャイニーズオークサクカイコ）；ボンビクス・モリ・リンナエウス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（カイコ（Ｓｉｌｋｗｏｒｍ））；ブクラトリクス・サルベリエラ・ブスク（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ Ｂｕｓｃｋ）（ワタ葉パファレータ）；コリアス・エウレテメ・ボイスデュバル（Ｃｏｌｉａｓ ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（アルファルファキャタピラ）；ダタナ・インテゲリマ・グローテ（Ｄａｔａｎａ ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ Ｇｒｏｔｅ）＆ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）（クルミキャタピラー）；デンドロリムス・シビリクス・スチェットウェリコフ（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ）（シベリアンシルクモース）、エンノモス・スブシグナリア・ヒューブナー（Ｅｎｎｏｍｏｓ ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ Ｈｕｅｂｎｅｒ）（ニレスパンワーム）；エラニス・チラリア・ハリス（Ｅｒａｎｎｉｓ ｔｉｌｉａｒｉａ Ｈａｒｒｉｓ）（リンデンルーパ）；ユープロクティス・クリソルローエア・リンナエウス（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ブラウンテールガ（ｂｒｏｗｎｔａｉｌ ｍｏｔｈ））；ハリシナ・アメリカーナ・グエリン－メネビル（Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｇｕｅｒｉｎ－Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）（グラフェレアフスケルトナイザー）；ヘミレウカ・オリビアエ・コックレル（Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ ｏｌｉｖｉａｅ Ｃｏｃｋｒｅｌｌ）（レンジキャタピラ）；ヒファントリア・クネア・ドルリー（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ Ｄｒｕｒｙ）（イエバエ）；ケイフェリア・リコペリシセラ・ウァルシンガム（Ｋｅｉｆｅｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ）（トマトピンワーム）；ランブディナ・フィスセラリア・フィスセラリア・フルスト（Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ Ｈｕｌｓｔ）（イヌビエ）；Ｌ．フィスセラリア・ルグブローサ・フルスト（ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ ｌｕｇｕｂｒｏｓａ Ｈｕｌｓｔ）（ウェスタンヘムロックルーパー）；レウコマ・サリシス・リナエウス（Ｌｅｕｃｏｍａ ｓａｌｉｃｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（サテンガ）；リマントリア・ディスパー・リンナエウス（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ジプシーガ（ｇｙｐｓｙ ｍｏｔｈ））；マンデュカ・キンクエマクラタ・ハワース（Ｍａｎｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（５斑点化ホークガ、トマト角虫）；Ｍ．セクスタ・ハワース（ｓｅｘｔａ Ｈａｗｏｒｔｈ）（トマト角虫、タバコ角虫）；クスノキ（Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（冬ガ）；パレアクリタ・ベルナータ・リナエウス（Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ ｖｅｒｎａｔａ Ｐｅｃｋ）（トビイロウンカ）；パピロクレスフォンテス・クレイマー（Ｐａｐｉｌｉｏ ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ Ｃｒａｍｅｒ）（オウバク（ｇｉａｎｔ ｓｗａｌｌｏｗｔａｉｌ ｏｒａｎｇｅ）イヌ）；フィガニジア・カリフォルニカ・パッカード（Ｐｈｒｙｇａｎｉｄｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｐａｃｋａｒｄ）（カリフォルニアオークワーム（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｏａｋｗｏｒｍ）；フィロクニスティス・シトレラ・ステイントン（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ Ｓｔａｉｎｔｏｎ）（カンキツリーフマイナー）；フィロノリクター・ブランカルデラ・ファブリシウス（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（斑点腱様リーフマイナー（ｓｐｏｔｔｅｄ ｔｅｎｔｉｆｏｒｍ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（大きな白い蝶）；Ｐ．ラパエ・リナエウス（ｒａｐａｅ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（小さい白い蝶）；Ｐ．ナピ・リナエウス（ｎａｐｉ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（緑色の葉脈のある白い蝶）；プラティピラ・カルデゥイダクティラ・リレー（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ Ｒｉｌｅｙ）（アーチチョークプルーム）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（コナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ））；ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（ピンクボールワーム）；ポニタ・プロトダイス・ボイスドュバル及びレコンテ（Ｐｏｎｔｉａ ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ ａｎｄ Ｌｅｃｏｎｔｅ）（サザンカバゲワーム）；サブロデス・アエグロタータ・グエネー（Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ ａｅｇｒｏｔａｔａ Ｇｕｅｎｅｅ）（オムニボラルーパ）；シズラ・コンシンナ（Ｓｃｈｉｚｕｒａ ｃｏｎｃｉｎｎａ）Ｊ．Ｅ．スミス（赤こぶキャタピラー）；シトトロガセレアレラ・オリビエル（Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ Ｏｌｉｖｉｅｒ）（アンゴモワグレインガ（Ａｎｇｏｕｍｏｉｓ ｇｒａｉｎ ｍｏｔｈ））；トウメトポエア・ピチョカンパ・シフェールミュラー（Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ）（マツ加工キャタピラー（ｐｉｎｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｒｙ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；チネオラ・ビッセリエラ・フメル（Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ Ｈｕｍｍｅｌ）（ウェビングクロセスガ）；チュータ・アブソルータ・メイリック（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ Ｍｅｙｒｉｃｋ）（トマトリーフマイナー）；イポノメウタ・パデラ・リンナエウス（Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（エルミネガ（ｅｒｍｉｎｅ ｍｏｔｈ））；ヘリオティス・サブフレクサ・ギネー（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ Ｇｕｅｎｅｅ）；マラコソーマ属（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ）種及びオルギア属（Ｏｒｇｙｉａ）が挙げられる。

【0075】

一部の実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、追加的な形質のスタックを更に含み得る。ポリヌクレオチド配列のスタックを含む植物は、従来の育種方法によるか又は遺伝子工学的方法を介するかのいずれか一方又は両方によって入手することができる。それらの方法としては、限定はされないが、各々が目的のポリヌクレオチドを含む個別の系統を育種すること、本明細書に開示される遺伝子を含むトランスジェニック植物を後続の遺伝子で形質転換すること及び単一の植物細胞への遺伝子の同時形質転換が挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「スタックした」には、同じ植物に存在する複数の形質を有することが含まれる（即ち両方の形質とも核ゲノムに取り込まれるか、一方の形質が核ゲノムに取り込まれ、一方の形質がプラスチドのゲノムに取り込まれるか、又は両方の形質ともプラスチドのゲノムに取り込まれる）。

【0076】

一部の実施形態において、単独での又は１つ以上の追加的な昆虫抵抗性形質とスタックした、本明細書に開示されるＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、１つ以上の追加的な入力形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス抵抗性、ストレス耐性、病害抵抗性、雄性不稔、柄強度など）又は出力形質（例えば、収量の増加、加工デンプン、油プロファイルの向上、均衡のとれたアミノ酸、リジン又はメチオニン高値、消化性の増加、繊維品質の向上、耐乾性など）とスタックすることができる。このように、本実施形態を用いると、幾つもの作物栽培学的害虫を柔軟に且つコスト効率よく防除する能力のある、向上した作物品質の完全な作物栽培学的パッケージを提供することができる。

【0077】

更なる実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、限定はされないが、米国特許第８，１０１，８２６号明細書、同第６，５５１，９６２号明細書、同第６，５８６，３６５号明細書、同第６，５９３，２７３号明細書及び国際公開第２０００／０１１１８５号パンフレットに開示されるＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書及び同第８，５１３，４９２号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書、同第７，２７６，５８３号明細書及び同第８，７５９，６２０号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ａ毒素；又は米国特許第７，３０９，７８５号明細書、同第７，５２４，８１０号明細書、同第７，９８５，８９３号明細書、同第７，９３９，６５１号明細書及び同第６，５４８，２９１号明細書に開示されるＣｒｙ３４／３５毒素を含めた、１つ以上の追加的な殺昆虫性毒素とスタックされ得る。

【0078】

更なる実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、これらのＢｔ殺昆虫性毒素及び他の抗甲虫目活性Ｂｔ殺昆虫性形質を含む１つ以上の追加的なトランスジェニックイベント、例えば、米国特許第７，７０５，２１６号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８６３；米国特許第８，８８４，１０２号明細書に開示されるイベントＭＩＲ６０４；米国特許第９，１３３，４７４号明細書に開示されるイベント５３０７；米国特許第７，８７５，４２９号明細書に開示されるイベントＤＡＳ－５９１２２；米国特許第８，５７５，４３４号明細書に開示されるイベントＤＰ－４１１４；米国特許第９，４４１，２４０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ ８７４１１；；及び米国特許第８，６８６，２３０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８８０１７（これらは、全て参照により本明細書に援用される）とスタックされ得る。一部の実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、ＭＯＮ－８７４２９－９（ＭＯＮ８７４２９イベント）；ＭＯＮ８７４０３；ＭＯＮ９５３７９；ＭＯＮ９５２７５；ＭＯＮ８７４２７；ＭＯＮ８７４１９；ＭＯＮ－００６０３－６（ＮＫ６０３）；ＭＯＮ－８７４６０－４；ＬＹ０３８；ＤＡＳ－０６２７５－８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；ＭＩＲ１６２；ＧＡ２１；ＭＺＤＴ０９Ｙ；ＳＹＮ－０５３０７－１；ＤＰ－９１５６３５－２；ＤＰ－２３２１１；及びＤＡＳ－４０２７８－９とスタックされ得る。

【0079】

さらなる実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシイベントは、以下に提供される除草剤耐性形質のうちの１つ以上のさらなるものと積み重ねられ得る。グリホサート除草剤は、ＥＰＳＰＳ酵素（５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ）を阻害することによる作用機序を含む。この酵素は、植物の成長及び発達に必須の芳香族アミノ酸の生合成に関与している。この酵素を阻害するために利用することができる様々な酵素機構が当技術分野で公知である。そのような酵素をコードする遺伝子は、本開示の遺伝子調節エレメントに作動可能に連結され得る。一実施形態において、選択マーカー遺伝子には、グリホサート耐性遺伝子をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない：２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ｃｐ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子、ｍＥＰＳＰＳ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子などの変異ＥＰＳＰＳ遺伝子；及びグリホサート分解遺伝子、例えばグリホサートアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｔ）及びグリホサートオキシダーゼ遺伝子（ｇｏｘ）。これらの形質は、現在、Ｇｌｙ－Ｔｏｌ（商標）、Ｏｐｔｉｍｕｍ（登録商標）ＧＡＴ（登録商標）、Ａｇｒｉｓｕｒｅ（登録商標）ＧＴ及びＲｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ（登録商標）として市販されている。グルホシネート及び／又はビアラホス化合物の耐性遺伝子には、ｄｓｍ－２、ｂａｒ及びｐａｔ遺伝子が含まれる。バー形質及びパット形質は、ＬｉｂｅｒｔｙＬｉｎｋ（登録商標）として現在市販されている。ａａｄ－１遺伝子（ａａｄ－１遺伝子はアロキシフェノキシプロピオン酸除草剤に対してさらなる活性を有することに留意されたい）及びａａｄ－１２遺伝子（ａａｄ－１２遺伝子はピリジルオキシ酢酸合成オーキシンに対してさらなる活性を有することに留意されたい）などの２，４－Ｄに対する耐性を提供する耐性遺伝子も含まれる。これらの形質は、Ｅｎｌｉｓｔ（登録商標）作物保護技術として市販されている。ＡＬＳ阻害剤（スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルチオベンゾエート、及びスルホニルアミノ－カルボニル－トリアゾリノン）に対する耐性遺伝子が当技術分野では知られている。

【0080】

これらの耐性遺伝子は、最も一般的には、ＡＬＳコード遺伝子配列に対する点変異から生じる。他のＡＬＳ阻害剤耐性遺伝子には、ｈｒａ遺伝子、ｃｓｒ１－２遺伝子、Ｓｒ－ＨｒＡ遺伝子及びｓｕｒＢ遺伝子が含まれる。これらの形質のいくつかは、商品名Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）で販売されている。ＨＰＰＤを阻害する除草剤としては、ピラゾロン、例えばピラゾキシフェン、ベンゾフェナップ及びトプラメゾンが挙げられる。メソトリオン、スルコトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロンなどのトリケトン；及びイソキサフルトールなどのジケトニトリル。これらの例示的なＨＰＰＤ除草剤は、既知の形質によって許容され得る。ＨＰＰＤ阻害剤の例としては、ｈｐｐｄＰＦ＿Ｗ３３６遺伝子（イソキサフルトールに対する耐性）及びａｖｈｐｐｄ－０３遺伝子（メオストリオンに対する耐性）が挙げられる。オキシニル除草剤耐性形質の例としては、ｂｘｎ遺伝子が挙げられ、これは、除草剤／抗生物質ブロモキシニルに対する耐性を付与することが示されている。ジカンバに対する耐性遺伝子には、国際公開第２００８／１０５８９０号パンフレットに開示されているようなジカンバモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｄｍｏ）が含まれる。ＰＰＯ又はＰＲＯＴＯＸ阻害剤型除草剤（例えば、アシフルオルフェン、ブタフェナシル、フルプロパジル、ペントキサゾン、カルフェントラゾン、フラゾレート、ピラフルフェン、アクロニフェン、アザフェニジン、フルミオキサジン、フルミクロラック、ビフェノックス、オキシフルオルフェン、ラクトフェン、フォメサフェン、フルオログリコフェン、及びスルフェントラゾン）の耐性遺伝子は、当技術分野で公知である。ＰＰＯに対する耐性を付与する例示的な遺伝子としては、野生型シロイナズナＰＰＯ酵素（Ｌｅｒｍｏｎｔｏｖａ Ｉ ａｎｄ Ｇｒｉｍｍ Ｂ，（２０００）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｉｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ＩＸ ｏｘｉｄａｓｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２２：７５－８３．）、Ｂ．スブチリスＰＰＯ遺伝子（Ｌｉ，Ｘ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌ Ｄ．２００５． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＰＰＯ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｒｏｐｓ． Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ． ６１：２７７－２８５ ａｎｄ Ｃｈｏｉ ＫＷ，Ｈａｎ Ｏ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｙｕｎ ＹＣ，Ｍｏｏｎ ＹＨ，Ｋｉｍ ＭＫ，Ｋｕｋ ＹＩ，Ｈａｎ ＳＵ ａｎｄ Ｇｕｈ ＪＯ，（１９９８）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ，ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ，ｖｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：５５８－５６０）が挙げられる。ピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンの耐性遺伝子には、ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子（例えば、Ａｃｃ１－Ｓ１、Ａｃｃ１－Ｓ２及びＡｃｃ１－Ｓ３）が含まれる。シクロヘキサンジオン及び／又はアリールオキシフェノキシプロパン酸に対する耐性を付与する例示的な遺伝子としては、ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキシプロップ、フルアジホップ及びキザロホップが挙げられる。最後に、ｐｓｂＡ遺伝子による耐性（トリアジンに対する耐性）、１ｓ＋遺伝子による耐性（トリアジンに対する耐性）、及びニトリラーゼ遺伝子による耐性（ベンゾニトリルに対する耐性）を含む除草剤が光合成を阻害することができる。上に掲げた選択マーカーは、それらに限定することを意図するものではない。任意の除草剤耐性遺伝子が本開示に包含される。

【0081】

一部の実施形態において、開示される組成物は、ゲノム編集技術を用いて植物のゲノムに導入することができるか、又は植物のゲノムに既に導入されているポリヌクレオチドが、ゲノム編集技術を用いて編集され得る。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどのゲノム編集系を使用することによって、植物のゲノム内の所望の位置に導入することができる。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、部位特異的挿入のため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてゲノムにおける所望の位置に導入することができる。植物ゲノムにおける所望の位置は、育種に適しているゲノム領域など、挿入が所望される任意の標的部位であり得るか、又は既存の目的形質を含むゲノムウィンドウに位置する標的部位であり得る。目的の既存の形質は、内因性形質又は以前に導入された形質のいずれかであり得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、開示されたポリヌクレオチドがゲノムに以前に導入されている場合、ゲノム編集又はゲノム工学技術を使用して、隣接する染色体ゲノム配列を含む導入されたポリヌクレオチド配列を変更又は改変することができる。開示される組成物に導入することができる部位特異的改変としては、限定されないが、配列修復オリゴヌクレオチド単独の使用を介して、又はドナーＤＮＡの有無にかかわらず、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの部位特異的ゲノム改変ツールの使用を介して、部位特異的改変を導入するための任意の方法を使用して生成されるものが挙げられる。開示されたポリヌクレオチド（ゲノム隣接及び接合配列を含む）に対する部位特異的改変としては、限定されないが、コドン使用頻度の変化、プロモーター、イントロン、ターミネーター、エンハンサー、５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、又は他の非コード配列などの調節エレメントの変化、及びポリヌクレオチドの他の領域が挙げられ得、ここで、改変は、得られるトウモロコシ植物の表現型特徴に悪影響を及ぼさない。改変されたポリヌクレオチド配列を含有するＤＡＳ－０１１３１－３イベント植物も本明細書において企図される。

【0083】

部位特異的改変を導入するのに適したＣａｓポリペプチドとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃａｓ－α、Ｃａｓ１４）、Ｃａｓ１２ｌ（Ｃａｓ－ｂｅｔａ）、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１タンパク質）、Ｃａｓ１３（Ｃ２ｃ２タンパク質）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３タンパク質）、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体が挙げられる。いくつかの態様では、プログラム可能なＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであるトランスポゾン関連ＴｎｐＢを使用することができる。

【0084】

いくつかの局面において、ゲノム編集系は、Ｃａｓ－アルファ（例えば、Ｃａｓ１２ｆ）エンドヌクレアーゼと、標的ポリヌクレオチド配列に１つ以上の部位特異的改変を導入し、改変された標的配列をもたらす１つ以上のガイドポリヌクレオチドとを含む。本明細書で使用される場合、「変更された標的部位」、「変更された標的配列」、「改変された標的部位」及び「改変された標的配列」は交換可能に使用され、改変されていない標的配列と比較した場合に少なくとも１つの改変又は改変を含む本明細書に開示される標的配列を指す。そのような変更又は改変には、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換若しくは置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが含まれる。

【0085】

いくつかの態様において、ゲノム編集系は、Ｃａｓ－アルファエンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、及び場合によりドナーＤＮＡを含む。いくつかの例示的なＣａｓ－αエンドヌクレアーゼは、例えば国際公開第２０２０１２３８８７号パンフレットに記載されている。

【0086】

いくつかの態様では、ゲノム編集系は、Ｃａｓポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、及び場合によりドナーＤＮＡを含み、標的ポリヌクレオチド配列を編集することは、Ｃａｓポリペプチド媒介二本鎖切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）を含む。二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、切断を修復するように活性化される。破損した末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は非相同末端結合経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。結果として、欠失、挿入又は他の再編成が可能である（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１；Ｐａｃｈｅｒら、（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。又は、二本鎖切断は、相同ＤＮＡ配列間の相同組換えによって修復することができる。二本鎖切断部分近傍の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌクレアーゼ活性によって変わると、非分裂体細胞中の相同染色体、又はＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列が利用できるなら、遺伝子変換経路が、元の構造に修復することができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２－５２）。異所性及び／又は後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換えのＤＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。

【0087】

いくつかの態様において、ゲノム編集系は、Ｃａｓポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド及びドナーＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓポリペプチドのゲノム標的部位に挿入される目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物である。エンドヌクレアーゼによって二本鎖切断が標的部位に導入されると、ドナーＤＮＡの相同性の第１及び第２の領域は、それらの対応する相同性のゲノム領域との相同組換えを受けて、ドナーＤＮＡと標的ゲノム領域との間でＤＮＡの交換をもたらすことができる。従って、提供される方法は、ドナーＤＮＡの目的のポリヌクレオチドを植物ゲノムの標的部位の二本鎖切断に組み込み、それによって元の標的部位を改変し、改変されたゲノム標的部位を生成する。

【0088】

いくつかの局面において、ゲノム編集システムは、塩基編集剤及び複数のガイドポリヌクレオチドを含み、標的ポリヌクレオチド配列を編集することは、変異体ヌクレオチド配列をもたらす複数の核酸塩基編集を標的ポリヌクレオチド配列に導入することを含む。他の態様には、ゲノム編集系を使用して産生された改変ＤＡＳ－０１１３１－３イベント植物が含まれる。

【0089】

標的ゲノム配列の１つ以上の核酸塩基は、いくつかの場合、塩基を１つの型から別の型に、例えばシトシンからチミンに、又はアデニンからグアニンに変化させるように化学的に変化させることができる。いくつかの態様では、複数の塩基、例えば２又はそれを超える、５又はそれを超える、１０又はそれを超える、２０又はそれを超える、３０又はそれを超える、４０又はそれを超える、５０又はそれを超える、６０又はそれを超える、７０又はそれを超える、８０又はそれを超える、９０又はそれを超える、１００又はそれを超える、又は更に１００、２００又はそれを超える、数千個までの塩基を改変又は変更して、複数の改変された塩基を有する植物を作製することができる。

【0090】

ＲＮＡガイド型ポリペプチド（例えば、デアミナーゼに関連するｄＣａｓなど）に関連する塩基編集剤などの任意の塩基編集複合体を使用して、生物のゲノム内の所望の遺伝子座を標的として結合し、標的ゲノム配列の１つ以上のヌクレオチドを化学的に改変することができる。

【0091】

部位特異的ヌクレオチド塩基変換は、ゲノムに１つ以上の編集を作成するために１つ以上のヌクレオチド変化を操作するために達成され得る。これらには、例えば、Ｃ・ＧからＴ・Ａにすることによって媒介される部位特異的塩基編集、又はＡ・ＴからＧ・Ｃへの塩基編集デアミナーゼ酵素が挙げられる（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６３０５）（２０１６）；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．”Ｎａｔｕｒｅ ５３３（７６０３）（２０１６）：４２０－４）。シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼタンパク質に融合した触媒的に「死んだ」又は不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ）ポリペプチド、例えば不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ｆ（ｄＣａｓ１２ｆ）、又は本明細書に開示される別のＣａｓポリペプチドは、ＤＮＡ切断を誘導することなくＤＮＡ塩基を変更することができる特異的な塩基編集剤になる。塩基エディターは、Ｃ－＞Ｔ（又は反対の鎖上でＧ－＞Ａ）に変換し、又はアデニンをイノシンに変換するアデニン塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチドによって特定される編集ウィンドウ内のＡ－＞Ｇ変化をもたらす。核酸塩基の変化をもたらす任意の分子が「塩基編集剤」である。ｄＣａｓは、標的部位のゲノム配列と相同性を共有するガイドポリヌクレオチドと機能的複合体を形成し、更にデアミナーゼ分子と複合体を形成する。誘導されたＣａｓポリペプチドは、標的配列を認識して結合し、二本鎖を開いて個々の塩基を露出させる。シチジンデアミナーゼの場合、デアミナーゼはシトシン塩基を脱アミノ化し、ウラシルを生成する。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）は、ＵがＣに戻る変換を防止するために提供される。ＤＮＡ複製又は修復機構はその後、ウラシルをチミン（ＵからＴ）に変換し、その後、反対の塩基（元のＧ－Ｃ対の以前のＧ）をアデニンに修復して、Ｔ－Ａ対を生成する。

【0092】

挿入されたイベント及び／又は隣接するゲノムＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドは、プライム編集技術を使用して改変することができる。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡＮａｔｕｒｅ ５７６，１４９－１５７（２０１９）を参照されたい。プライム編集複合体は、逆転写酵素ドメインに融合され、ｐｅｇＲＮＡと複合体化したＣａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓｄ１２ｆ１ニッカーゼ）などのＲＮＡガイドＤＮＡニッキングドメインを含むプライム編集タンパク質を含む。ＰＥ－ｐｅｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ含有鎖をニッキングすることによって、ゲノム内の所望の位置に標的ＤＮＡ編集を導入することができる。得られた３’末端は、選択されたプライマー結合部位にハイブリダイズし、次いで、ｐｅｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型を使用して所望の編集を含む新しいＤＮＡ配列の逆転写をプライミングする。

【0093】

開示された組換え発現カセットの得られた調節発現エレメントは、トランケートされていてもよく、又は本明細書に例示又は記載される調節エレメント配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

【0094】

他の改変は、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡの他の部分に対する改変を含み得る。いくつかの実施形態では、ゲノム工学技術を使用して、本明細書に記載の１つ以上の発現カセットを、同じ染色体、又はトウモロコシ若しくは異なる作物の異なる染色体の１つ以上の異なる位置に再配置することができる。そのような実施形態において、本明細書中に記載される接合部配列の１つ又はそれを超えるもの（配列番号２２及び／又は２５）を含むポリヌクレオチドは、部分的又は完全に発現カセットと共に保持され得るか、又は除去され得る。更に、本明細書に記載のゲノム隣接配列はまた、部分的又は完全に発現カセットと共に保持されてもよく、又は除去されてもよい。

【0095】

別の実施形態では、ゲノム工学技術を使用して、本明細書に記載の５’又は３’接合配列に物理的に近接した１つ以上の導入遺伝子又は発現カセットを共配置することができる。染色体上の物理的位置に関して、並置された導入遺伝子及び／又は発現カセットは、例えば、約１メガベース（ＭＢ；１００万ヌクレオチド）、約５００キロベース（Ｋｂ；１０００ヌクレオチド）、約４００Ｋｂ、約３００Ｋｂ、約２００Ｋｂ、約１００Ｋｂ、約５０Ｋｂ、約２５Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約５Ｋｂ、約４Ｋｂ、約３Ｋｂ、約２Ｋｂ、約１Ｋｂ、約５００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド又はそれ未満だけ、５’又は３’接合部配列から分離することができる。染色体上の遺伝的距離に関して、同じ場所に配置された導入遺伝子及び／又は発現カセットは、例えば、約１０ｃＭ、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、０．１ｃＭだけ、５’又は３’接合配列から分離することができる。例えば、上記の１つ又はそれを超えるさらなるトランスジェニックイベントから得られた１つ又はそれを超える発現カセットは、本明細書に記載の５’又は３’接合配列に物理的に近接して同じ場所に配置され得る。

【0096】

別の実施形態では、接合配列の１つ（配列番号２２又は２５）を含むポリヌクレオチドを、挿入された異種ＤＮＡの一方又は両方の末端に導入することができる。例えば、５’接合配列を含むポリヌクレオチドは、欠失され、３’接合配列を含むポリヌクレオチドと置き換えられてもよく、又はその逆であってもよい。

【0097】

別の実施形態では、ゲノム編集技術を使用して、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントの挿入されたＤＮＡのポリヌクレオチドの少なくとも１つを反転させることによって、以前に導入されたポリヌクレオチドを改変することができる。

【0098】

かかるゲノム編集技術を用いると、以前に導入されたポリヌクレオチドを、導入されたポリヌクレオチドの範囲内での１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失及び／又は置換によって改変することができる。代わりに、二本鎖切断技術を用いて、導入されたポリヌクレオチドに追加的なヌクレオチド配列を付加することができる。付加し得る追加的な配列としては、エンハンサー及びプロモーター配列など、追加的な発現エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。欠失され得る配列には、欠失された場合に機能に悪影響を及ぼさない調節エレメント又はその一部が含まれるが、これらに限定されない。発現パターンを調節するための改変（例えば、特定の組織における殺虫性ポリペプチドの発現レベルの低下）もまた、導入された発現カセットに対する部位特異的改変によって企図される。

【0099】

別の実施形態では、ゲノム工学技術を使用して、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有する２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントの１つ以上の発現カセットの全部又は一部を削除又は改変することができる。この実施形態では、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有する２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントに由来する得られたトウモロコシ植物は、本明細書に記載の発現カセットの一部、本明細書に記載の発現カセットのいずれも含まないか、又は本明細書に記載の発現カセットの改変を含み得る。

【0100】

別の実施形態において、標的化ＤＳＢ技術を用いることにより、殺昆虫性の活性があるタンパク質の分子スタックを作成するため、追加的な殺昆虫性の活性があるタンパク質を植物のゲノムの範囲内で本明細書に開示される本開示の組成物にごく近接して位置させ得る。

【0101】

別の実施形態において、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオチド配列を認識するガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）など）を設計することと、上記ガイドポリヌクレオチドを合成するか、又は得ることと、上記ガイドポリヌクレオチドをゲノム工学組成物の一部として導入して、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有する２０２１年５月２６日にＡＴＣＣに寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡを改変することとを含む方法において使用される。そのような得られた改変は、本明細書に例示又は記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0102】

実施形態は、本明細書に記載のゲノム工学技術を使用して生産された改変ＤＡＳ－０１１３１－３イベント植物を含む。

【0103】

一実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物を含み、前記遺伝子型は、配列番号２２及び配列番号２５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２２及び配列番号２５と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0104】

別の実施形態は、任意の先の実施形態のコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物を含み、前記遺伝子型は、配列番号２３及び配列番号２６に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２３及び配列番号２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0105】

別の実施形態は、任意の先の実施形態のコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物を含み、前記遺伝子型は、配列番号２４及び配列番号２７に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２４及び配列番号２７と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0106】

一実施形態は、２つの作動可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含み、発現カセットの１つは、
１）ｕｂｉＺＭ１プロモーター
２）ｕｂｉＺＭ１ ５’ＵＴＲ；
３）ｕｂｉＺＭ１イントロン；
４）ｃｒｙ１Ｄａ２；及び
５）ｕｂｉＺＭ１ターミネーターを含み；
他の発現カセットは、
１）ｕｂｉＺＭ１プロモーター
２）ｕｂｉＺＭ１ ５’ＵＴＲ；
３）ｕｂｉＺＭ１イントロン；
４）ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ；及び
５）ｕｂｉＺＭ１ターミネーターを含む。

【0107】

別の実施形態は、任意の先の実施形態の２つの作動可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含む植物を含む。

【0108】

さらなる実施形態は、任意の先の実施形態の２つの操作可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含む植物を含み、植物はコーン植物である。

【0109】

一実施形態は、配列番号１９に示される配列、又は配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む植物を含む。

【0110】

一実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含み、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0111】

他の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の植物部分を含み、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に先のいずれかの実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７で寄託されている。

【0112】

一実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む種子を含み、前記種子は、配列番号２２及び配列番号２５から選択されるＤＮＡ分子を含み、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0113】

別の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む種子から成長したコーン植物又はその一部を含み、前記種子は配列番号２２及び配列番号２５から選択されたＤＮＡ分子を含み、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の種子の代表的な試料はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に先のいずれかの実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７で寄託されている。

【0114】

さらなる実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３のコーン植物から産生されたトランスジェニック種子を含み、ここで、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、任意の先行する実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0115】

他の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３のコーン植物から生産された種子から成長させたトランスジェニックコーン植物又はその一部を含み、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に先のいずれかの実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７で寄託されている。

【0116】

一実施形態は、配列番号１９及び２２～２７から選択されるヌクレオチド配列及びその完全長相補体を含む単離された核酸分子を含む。

【0117】

一実施形態は、配列番号１９～２１及びその完全長相補体から選択される核酸配列を含むアンプリコンを含む。

【0118】

一実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物を含み、前記試料又は抽出物は、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0119】

別の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物由来の生物学的試料又は抽出物、組織又は種子を含み、前記試料又は抽出物は、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか、又はそれに相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、ここで、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、以前のいずれかの実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、前記生物学的試料又は抽出物はトランスジェニックコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の植物、植物組織又は種子を含む。

【0120】

別の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物、組織又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物を含み、前記試料又は抽出物は、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料又は抽出物中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子代表的な試料は、任意の先の実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、前記生物学的試料又は抽出物は、トランスジェニックコーン植物イベントＤＡＳ－０１１３１－３から抽出されたＤＮＡ試料であり、前記ＤＮＡ試料は、配列番号１９～２７及びその相補体から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む。

【0121】

別の実施形態は、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物、組織、又は種子に由来する生物学的試料又は抽出物を含み、前記試料又は抽出物は、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか、又はそれに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料又は抽出物において検出可能であり、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、先のいずれかの実施形態のアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、前記生物学的試料又は抽出物はコーン副産物を含有するために全体的又は部分的に製造されたコーン粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンスターチ、及びシリアルから選択される。

【0122】

一実施形態は、ハイブリッドコーン種子を生産する方法であって、
ａ）配列番号１９～２７から選択されるヌクレオチドを含む第１の近交コーン系統と、異なる遺伝子型を有する第２の近交系統とを有性交配すること；
ｂ）前記交配から子孫を成長させること；及び
ｃ）それによって生産されたハイブリッド種子を収穫することを含む、方法を含む。

【0123】

別の実施形態は、第１の近交コーン系統が、雌親又は雄親である、任意の先の実施形態のハイブリッドコーン種子を生産する方法を含む。

【0124】

一実施形態は、鱗翅目害虫に抵抗性であるコーン植物を産生する方法であって、
ａ）第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と有性交配することであって、前記第１の親コーン植物又は前記第２の親コーン植物がイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含み、それにより、複数の第１世代子孫植物を産生すること；
ｂ）第１世代子孫植物を自殖することにより、複数の第２世代子孫植物を産生すること；及び
ｃ）第２世代子孫植物から、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を含み、鱗翅目害虫に抵抗性である植物を選択することを含む、方法を含む。

【0125】

別の実施形態は、ハイブリッドコーン種子を生産する方法であって、
ａ）第１の近交コーン系統を、以前のいずれかの実施形態の操作可能に連結された２つの発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含まない第２の近交系統を有する任意の実施形態の以前の操作可能に連結された２つの発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含む有性交配すること；及び
ｂ）それによって生産されたハイブリッド種子を収穫することを含む、方法を含む。

【0126】

別の実施形態は、任意の先の実施形態の鱗翅目害虫に対して耐性であるコーン植物を産生する方法であって、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含む第２世代子孫植物を、コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡを欠く親植物に戻し交配し、それにより、鱗翅目害虫に耐性のある戻し交配子孫植物を作製することを更に含む方法を含む。

【0127】

一実施形態は、生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、
ａ）前記試料を第１のＤＮＡ分子対及び第２の異なるＤＮＡ分子対と接触させて、
１）コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用される場合、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を診断する第１のアンプリコンを産生し、
２）ＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡを含む核酸増幅反応で使用される場合、ＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡについて診断的である第２のアンプリコンを産生すること；
ｂ）核酸増幅反応を実施すること；及び
ｃ）そのように産生されたアンプリコンを検出することを含み、両方のアンプリコンの存在の検出が、前記試料がコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ＤＮＡについてヘテロ接合性であることを示し、第１のアンプリコンのみの検出が、前記試料がコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡについてホモ接合性であることを示す、方法を含む。

【0128】

別の実施形態は、任意の先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法を含み、ＤＮＡ分子の第一対は配列番号１０及び１１のプライマー対を含む。

【0129】

別の実施形態は、任意の先の実施形態における生物学的試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法を含み、ここで、ＤＮＡ分子の第１及び第２の対は検出可能な標識を含む。

【0130】

さらなる実施形態は、生物学的試料中にイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、ＤＮＡ分子の第１及び第２の対が、任意の先行する実施形態において検出可能な標識を含み、ここで、検出可能な標識が蛍光標識である、方法を含む。

【0131】

他の実施形態は、生物学的試料中にイベントＤＡＳ－０１１３１－３を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、ＤＮＡ分子の第１及び第２の対が、任意の先行する実施形態において検出可能な標識を含み、検出可能な標識が、プライマー分子のうちの１つ以上と共有結合している、方法を含む。

【0132】

一実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸分子の存在を検出する方法であって、
ａ）試料を、イベントＤＡＳ－０１１３１－３からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において使用された場合に、イベントＤＡＳ－０１１３１－３について診断的であるアンプリコンを生成する一対のプライマーと接触させること；
ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、イベントＤＡＳ－０１１３１－３について診断的であるアンプリコンを生成すること；及び
ｃ）イベントＤＡＳ－０１１３１－３の診断であるアンプリコンを検出することを含む、方法を含む。

【0133】

別の実施形態は、任意の先の実施形態のコーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸分子の存在を検出する方法を含み、イベントＤＡＳ－０１１３１－３を診断する核酸分子は、核酸増幅連鎖反応によって産生されるアンプリコンである。

【0134】

別の実施形態は、任意の先行する実施形態のコーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３にユニークな分子である核酸の存在を検出する方法であって、方法が、試料を、プローブに接触させることを更に含む、方法を含む。

【0135】

さらなる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸の存在を検出する方法であって、試料を任意の先行する実施形態のプローブと接触させることを更に含み、プローブが検出可能な標識を含む、方法を含む。

【0136】

さらなる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３にユニークな核酸の存在を検出する方法であって、試料をプローブと接触させることを更に含み、プローブが、任意の先行する実施形態の検出可能な標識を含み、検出可能な標識が蛍光標識である、方法を含む。

【0137】

さらなる実施形態は、コーン核酸を含む試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３にユニークな核酸の存在を検出する方法であって、試料をプローブと接触させることを更に含み、プローブが、任意の先行する実施形態の検出可能な標識を含み、検出可能な標識が、プローブと共有結合している、方法を含む。

【0138】

一実施形態は、試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３ ＤＮＡ鋳型を標的とし、ポリメラーゼ連鎖反応法の結果としてイベントＤＡＳ－０１１３１－３のアンプリコン診断を生成する１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドプライマーを含む。

【0139】

別の実施形態は、任意の先の実施形態による複数のポリヌクレオチドプライマーを含み、ここで、
ａ）第１のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列及びその相補体を含み；及び
ｂ）第２のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列及びその相補体を含む。

【0140】

別の実施形態は、任意の先の実施形態のプライマーを含み、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーは少なくとも１８ヌクレオチドである。

【0141】

一実施形態は、試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ）トウモロコシＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３由来のＤＮＡとハイブリダイズし、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブと接触させること；
ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び
ｃ）プローブのＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出することを含み；
ここで、ハイブリダイゼーションの検出は、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の存在を示す、方法を含む。

【0142】

一実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベンＤＡＳ－０１１３１－３にユニークな核酸を検出するためのキットであって、核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーション時、試料中における、イベントＤＡＳ－０１１３１－３にユニークな核酸配列の存在の診断指標となる、キットを含む。

【0143】

別の実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの連続するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含み、試料中の標的核酸配列の増幅又はハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、任意の以前の実施形態の試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸配列の存在について診断する、イベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸を検出するためのキットを含み、核酸分子は配列番号１０～２７のヌクレオチド配列を含む。

【0144】

別の実施形態は、核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの連続するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含み、試料中の標的核酸配列の増幅又はハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、任意の以前の実施形態の試料中のイベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸配列の存在について診断する、イベントＤＡＳ－０１１３１－３に固有の核酸を検出するためのキットを含み、核酸分子は配列番号１０～１８及びその相補体から選択されるプライマーである。

【0145】

別の実施形態は、任意の先の実施形態のコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物を含み、遺伝子型は、配列番号２４又は配列番号２７のうちの１つにおいて１、２、３、４、又は５個のヌクレオチド変化を有するヌクレオチド配列を含む。

【0146】

別の実施形態は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含む、任意の先の実施形態のコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３の遺伝子型を含むコーン植物を含む。

【0147】

一実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７のＡＴＣＣに寄託され、ゲノム工学技術を前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列に適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含む、方法を含む。

【0148】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用して、任意の先行する実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0149】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法を含み、ここで、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、任意の先行する実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを改変するために、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列において重複した配列番号２２又は配列番号２５の全部又は一部を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む。

【0150】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料がアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用して、任意の先行する実施形態の前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0151】

さらなる実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託されており、ゲノム工学技術を前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列に適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、任意の先行する実施形態の配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記切除が、前記１つ以上の調節エレメントの活性に実質的に影響を及ぼさない配列番号３の１つ以上の調節エレメントからの切除を含む、方法を含む。

【0152】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法を含み、ここで、前記コーンイベントの種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、前記コーンイベントのＤＮＡを改変するために、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、任意の以前の実施形態の配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列から切除された配列番号２２又は配列番号２５の全部又は一部を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む。

【0153】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、前記コーンイベントのＤＮＡを改変するために、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、任意の以前の実施形態の配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、前記改変ＤＮＡ配列から切除された配列番号３の少なくとも３０％を有する改変ＤＮＡ配列を生成することを含む、方法を含む。

【0154】

さらなる実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、前記コーンイベントのＤＮＡを改変するために、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列にゲノム工学技術を適用することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、任意の以前の実施形態の配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含み、配列番号３の少なくとも８０％が前記改変ＤＮＡ配列から切除される、方法を含む。

【0155】

別の実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントを改変する方法であって、前記コーンイベントの種子の代表的な試料が、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託され、ゲノム工学技術を前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡ配列に適用して、前記コーンイベントのＤＮＡを改変することを含み、前記ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントのＤＮＡを改変して、任意の以前の実施形態の配列番号３からの切除を含む改変ＤＮＡ配列を生成することを含み、配列番号３の全てが前記改変ＤＮＡ配列から切除される、方法を含む。

【0156】

一実施形態は、ＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントゲノム編集システムで使用するためのガイドポリヌクレオチドを生成する方法であって、配列番号３の少なくとも一部を認識する１つ以上のガイドポリヌクレオチドを設計することと、前記ガイドポリヌクレオチドを合成することとを含む方法を含む。

【0157】

別の実施形態は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有するＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡを改変する方法であって、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡを改変するために、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントのＤＮＡに、ゲノム工学組成物の一部として任意の先の実施形態のＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントゲノム編集システムと共に使用するための前記１つ以上のガイドポリヌクレオチドを導入することを含む、方法を含む。

【0158】

一実施形態は、ＣＡＳポリペプチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、及びＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントドナーＤＮＡを含むＤＡＳ－０１１３１－３コーンイベントゲノム編集システムを含む。

【0159】

一実施形態は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７を有するＡＴＣＣによって寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントの少なくとも１つの発現カセットを改変する方法を含み、この方法は、ゲノム編集技術を使用して少なくとも１つの発現カセットを改変することを含み、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントに由来する得られたトウモロコシ植物は、少なくとも１つの改変カセットを含む。

【0160】

別の実施形態は、少なくとも１つのアクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でＡＴＣＣに寄託されたＤＡＳ－０１１３１－３イベントのカセット発現を改変する方法であって、ゲノム編集技術を使用して、少なくとも１つの発現カセットを修飾することを含み、０１１３１－３イベントから得られたトウモロコシ植物が、任意の先行する実施形態の少なくとも１つの変更されたカセットを含み、ｃｒｙ１Ｄａ２の発現を変化させることを含む、方法を含む。

【0161】

一実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、イベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫抵抗性トウモロコシ植物に鱗翅目昆虫を曝露することを含む、方法を含む。

【0162】

別の実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫を先のいずれかの実施形態のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫耐性トウモロコシ植物に曝露することを含み、鱗翅目昆虫がツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））である、方法を含む。

【0163】

別の実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫をイベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫耐性トウモロコシ植物に曝露することを含み、鱗翅目昆虫がコーンイアワーム（へリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ））である、方法を含む。

【0164】

別の実施形態は、鱗翅目昆虫を防除する方法であって、鱗翅目昆虫を任意の先の実施形態のイベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫耐性トウモロコシ植物に曝露することを含み、鱗翅目昆虫がイベントＤＡＳ－０１１３１－３からのトウモロコシ粒又は穀粒について制御される、方法を含む。

【0165】

別の実施形態は、配列番号２２及び配列番号２５から選択される配列であるか又はそれに相補的であるヌクレオチド配列を含むコーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３植物から生産された穀物を加工することを含む商品植物製品を生産する方法を含み、前記コーンイベントＤＡＳ－０１１３１－３種子の代表的な試料は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２７０７７でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、前記穀物は、コーン粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンスターチ、及びコーン副産物を含有するように全体的又は部分的に製造されたシリアルから選択される商品植物製品に加工され、前記商品植物製品は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む。

【0166】

一部の実施形態において、ＤＡＳ－０１１３１－３イベントを含むコーン植物は、種子処理で処理され得る。一部の実施形態において、種子処理は、殺真菌剤、殺昆虫剤又は除草剤であり得る。

【0167】

以下の実施例は、実例として提供するものであって、限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0168】

実施例１．Ｃｒｙ１Ｄａ２及びＤＧＴ－２８をコードする構築物を含むトランスジェニック植物のカセット設計
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）を、プラスミドＰＨＰ８８４９２（配列番号１）を用いたアグロバクテリウム媒介形質転換によって形質転換した。このプラスミドのＴ－ＤＮＡ領域を図２に概略的に示し、その配列を配列番号２として提供する。Ｃｒｙ１Ｄａ２及びＤＧＴ－２８ ｅｐｓｐｓカセット中の遺伝エレメント及びプラスミドＰＨＰ８８４９２のＴ－ＤＮＡ上のそれらの位置の要約をそれぞれ表１及び２に提供する。

【0169】

【表1】

【0170】

【表2】

【0171】

実施例２．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換によるトウモロコシの形質転換及びＣｒｙ１Ｄａ２及びＤＧＴ－２８遺伝子を含むＤＡＳ－０１１３１－３トランスジェニック植物の再生
近交系統をプラスミドＰＨＰ８８４９２で形質転換し、トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３を作製した。未成熟トウモロコシ胚を、受粉のおよそ１０～１４日後に近交系トウモロコシの表面滅菌された花穂から収集し、プラスミドＰＨＰ８８４９２を含有するアクロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＤＡｔ１３１９２（Ｍｅｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を接種した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＤＡｔ１３１９２は、ｖｉｒ遺伝子を含有し、接種された宿主植物組織への形質転換プラスミドのＴ－ＤＮＡ領域の効率的な移入を可能にする非防御株である。３～４日の胚及び固体培養培地上でのアグロバクテリウム共培養及び抗生物質カルベニシリンを含有する固体培養培地上での７日間の静止の後、選択せずに残留アグロバクテリウムを死滅させた後、胚をグリホサート除草剤選択及びカルベニシリンを含む培地に移した。次いで、形質転換されたカルスを発芽培地に移し、インキュベートしてシュート及び根の発達を開始させた。シュート及び根が確立されたら、健康な植物を選択し、ＰＣＲを使用して、ＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡインサートの存在を確認した。形質転換及び組織培養から再生された植物（Ｔ０植物と命名）をさらなる特性評価のために選択した。

【0172】

変換及びイベント開発の概略図を図３に示す。

【0173】

実施例３．トウモロコシイベントの特定ＤＡＳ－０１１３１－３
ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ内に含まれるｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子、並びにＤＡＳ１１３１トウモロコシの挿入部位にまたがるゲノム接合部の検出のために、各固有の配列に特異的なプライマー及びＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを使用して、７６ｂｐ～９８ｂｐに及ぶ領域を増幅した。更に、内因性参照遺伝子、Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ａ（ｈｍｇ－Ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７１８７４．１）の７９ｂｐ領域を、各アッセイの定性的及び定量的評価のために各アッセイと二重鎖で使用し、ＰＣＲ反応内に十分な品質及び量のＤＮＡが存在することを実証することが検証された（Ｋｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ｈｍｇ－Ａからのデータをスコアリングに関する計算に使用した。データを、検証された陽性又はコピー数キャリブレータ、並びに陰性ゲノム対照のいずれかの性能と比較した。

【0174】

リアルタイムＰＣＲ反応は、熱活性化ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用した。２つのプライマー及び１つのプローブは、５’蛍光レポーター色素及び３’クエンチャー色素を含有するプローブを用いて標的ＤＮＡにアニーリングした。各ＰＣＲサイクルで、ポリメラーゼによってアニーリングしたプローブからレポーター色素を切断し、その後の各サイクルで増強される蛍光シグナルを放出した。試料アンプリコンの発光強度が検出閾値を上回って上昇したサイクルをＣ_Ｔ値と呼んだ。増幅が起こらなかった場合、機器によって計算されたＣ_Ｔはなく、４０．００のＣ_Ｔ値が割り当てられた。

【0175】

試験試料のコピー数を決定する場合、コピー数キャリブレータ（目的の遺伝子の定義されたコピー、例えば１コピー又は２コピーを含むことが知られている試料）を目的の内因性遺伝子及び遺伝子の両方の対照として使用した。倍数差を使用して、各試験試料にコピー数を適用した。倍数差又は倍数変化は、２^－ΔＣＴの式を使用して計算される。上記のように、試験試料及びコピー数キャリブレータについてΔＣ_Ｔを計算した。コピー数１を試料集団に適用し、２コピーキャリブレータと比較した場合、最大範囲０．７５で０と０．７との間の倍率変化を生じた。同様に、単一のコピーキャリブレータと比較した場合、１．５から２．２の範囲の倍率変化を生じる試料集団にコピー数２を適用し、最大範囲は０．９１であった。コピー数３を、２コピーキャリブレータと比較した場合、最大範囲０．３５で、１．３から１．５の範囲の倍率変化を生じる試料集団に適用した。

【0176】

ゲノムＤＮＡを、ＢＣ１Ｆ１の各々から約１００個の植物についてＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ葉組織から単離した。水酸化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ_２－ＥＤＴＡ）及びトリス塩酸塩からなるアルカリ性緩衝液を使用してＤＮＡ試料を抽出した。１反応あたり約３ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した。

【0177】

標的イベント及び導入遺伝子を支持する各アッセイをｈｍｇ－Ａ内因性参照アッセイと多重化した。目的の遺伝子及びＰＣＲ反応のための内因性遺伝子の両方を支持するための全ての成分をそれぞれ含む反応混合物を調製した。添加剤として３０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むベースマスターミックス、Ｂｉｏｌｉｎｅ ＳｅｎｓｉＦａｓｔ（商標）Ｐｒｏｂｅ Ｌｏ－ＲＯＸマスターミックスを使用した。プライマーの個々の濃度は、分析検証中に確立された最適濃度に応じて、反応ごとに３００ｎＭ～９００ｎＭの間で変化した。反応あたりのプローブの個々の濃度は８０ｎＭであった。アッセイ対照には、水又はトリス－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）並びにコピー数較正物質及び陰性対照からなる鋳型対照（ＮＴＣ）は含まれず、これらは全て、実施した各アッセイについて検証された。各ＰＣＲ分析に使用したプライマー及びプローブを表３及び４に示す。ＰＣＲ分析中に使用したアニーリング温度及びサイクル数を表５に示す。

【0178】

２００個のＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物（ＢＣ１Ｆ１世代のそれぞれからの１００個の植物）の収集された葉試料から単離されたゲノムＤＮＡ試料を、コピー数キャリブレータ、陰性及びＮＴＣ対照と共に、ｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子に特異的なプライマー対及びプローブ、並びにＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシにおけるＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡ挿入の固有の同定を表すトウモロコシゲノムへのイベント特異的接合部の存在下で、ＳｅｎｓｉＦａｓｔ（商標）プローブＬｏ－ＲＯＸマスターミックス（英国ロンドン、Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用してｑＰＣＲ増幅に供した。アッセイ及びＤＮＡ品質モニタリングのために、トウモロコシｈｍｇ－Ａを、内因性コントロールとしての各反応と共に二重鎖に含めた。各ｑＰＣＲ反応は、約３ｎｇ（０．５μＬ容量）の単離されたゲノムＤＮＡを含む３μＬの総容量で設定された。

【0179】

ｑＰＣＲコピー数分析の結果は、プラスミドＰＨＰ８８４９２のＴ－ＤＮＡ内の遺伝子の単一コピーの安定な組込み及び分離を示し、後続世代への移入が実証されている。

【0180】

ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシの挿入部位並びにプラスミドＰＨＰ８８４９２由来のＴ－ＤＮＡ内の遺伝子を表す７６ｂｐ～９８ｂｐのサイズの範囲のＰＣＲ産物を増幅し、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシの葉試料並びに８コピー数キャリブレーターゲノムコントロールで観察したが、８つの陰性ゲノムコントロール及び８つのＮＴＣコントロールのそれぞれには存在しなかった。各アッセイについて合計４回実施したが、観察された結果は同じであった。各試料及び全ての対照について、Ｃ_Ｔ値、ΔＣ_Ｔ値、及びコピー数を計算した。

【0181】

トウモロコシ内在性参照遺伝子ｈｍｇ－Ａを使用して、７９ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、ＤＡＳ１１３１トウモロコシ由来の葉試料並びに８コピー数キャリブレータ及び８陰性ゲノム対照において観察した。内因性遺伝子の増幅は、ＣＴ値を生成せずに試験した８つのＮＴＣ対照では観察されなかった。各試料について、各アッセイを二重鎖で実施し、挿入部位及び全ての遺伝子について合計４回分析し、毎回同じ結果が観察された。各試料について、Ｃ_Ｔ値、ΔＣ_Ｔ値及びコピー数（該当する場合）を計算した。

【0182】

構築物特異的ＰＣＲアッセイの感度を評価するために、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシＤＮＡを対照トウモロコシゲノムＤＮＡで希釈し、合計５ｎｇのトウモロコシＤＮＡ中に様々な量のＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ（５ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、２５０ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２０ｐｇ、１０ｐｇ及び５ｐｇ）を含有する試験試料を得た。これらの様々な量のＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシＤＮＡは、それぞれ、全トウモロコシゲノムＤＮＡ中のＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシＤＮＡの１００％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．４％、０．２％及び０．１％に対応する。様々な量のＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシＤＮＡを、ｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子、並びにＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシの挿入部位についてリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。これらの分析に基づいて、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシについての５ｎｇの総ＤＮＡ中の検出限界（ＬＯＤ）は、ｃｒｙ１Ｄａ２について約１ｎｇ（２０％）、ｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓについて１ｎｇ（２０％）、及びイベントＤＡＳ－０１１３１－３について５００ｐｇ（１０％）であると決定された。記載される各アッセイの決定された感度は、多くのスクリーニング適用に十分である。各濃度を合計５回試験した。試験した標的の増幅が各複製物において検出されなかった時点で、先行する濃度を感度の限界であると決定した。

【0183】

イベント特異的アッセイ及び構築物特異的アッセイを使用したＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのリアルタイムＰＣＲ分析により、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシにおけるイベントＤＡＳ－０１１３１－３並びにｃｒｙ１Ｄａ２及びｄｇｔ－２８ ｅｐｓｐｓ遺伝子の定量化された検出によって実証されるように、試験した葉試料におけるプラスミドＰＨＰ８８４９２のＴ－ＤＮＡの単一コピーの安定な組込み及び分離が確認される。これらの結果は、実施した全てのレプリケートｑＰＣＲ分析間で再現可能であった。ｈｍｇ－Ａを検出するためのトウモロコシ内因性参照遺伝子アッセイは、全ての試験試料及び陰性対照で予想通りに増幅され、ＮＴＣ試料では検出されなかった。記載された条件下での各アッセイの感度は、５００ｐｇ～１ｎｇのＤＮＡの範囲であり、全てＰＣＲによる多くのスクリーニング用途に十分であった。

【0184】

【表3】

【0185】

【表4-1】

【0186】

【表4-2】

【0187】

【表5】

【0188】

実施例４．完全性及びコピー数についてのＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのサザンバイシーケンシング（ＳｂＳ）分析
ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代の２つの植物からゲノムＤＮＡを抽出した。サザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）は、プローブベースの配列捕捉、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技法及びバイオインフォマティクス手順を利用して、トウモロコシゲノム内にある挿入されたＤＮＡを単離、シーケンシング及び同定するものである。多数のユニーク配列決定リードをコンパイルし、それらを形質転換プラスミド配列と比較することによって、挿入されたＤＮＡに起因するユニークな接合部がバイオインフォマティクス分析において同定され、植物ゲノム内の挿入数を決定するために使用することができる。ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代をＳｂＳによって分析して、挿入コピー数を決定した。

【0189】

重複するビオチン化オリゴヌクレオチドを捕捉プローブとして設計するために、ＰＨＰ８８４９２プラスミド配列を包含する一連のユニーク配列を使用した。捕捉プローブは、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｉｎｃ．によって設計及び合成された。プローブセットは、濃縮プロセス中にＰＨＰ８８４９２形質転換プラスミド配列を標的とするように設計された。プローブをトウモロコシゲノムと比較して、ＰＨＰ８８４９２に由来する配列と同時に捕捉及び配列決定されるであろうトウモロコシゲノム配列のレベルを決定した。

【0190】

ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ及び対照トウモロコシについて別々のＮＧＳライブラリーを構築した。Ｚａｓｔｒｏｗ－Ｈａｙｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）により本質的に記載されるとおり、ＳｂＳを実施した。２ラウンドのハイブリダイゼーションを通じてシーケンシングライブラリを捕捉プローブにハイブリダイズさせることにより、標的配列を濃縮した。ＮＧＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ）に続いて、シーケンシングリードはトリミング及び品質保証のためにバイオインフォマティクスパイプラインに入った。リードをトウモロコシゲノムに対してアラインメントし、意図された挿入及びＰＨＰ８８４９２の配列をアラインメントし、ゲノム配列及びプラスミド配列の両方を含むリードを接合リードとして同定した。目的の挿入の配列に対する接合リードのアラインメントは、予想される挿入に対する挿入されたＤＮＡの境界を示す。

【0191】

内因性トウモロコシ配列に起因する推定接合部を同定するために、対照トウモロコシゲノムＤＮＡライブラリーを別々に捕捉し、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物と同じ方法で配列決定した。これらのライブラリーを、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物試料の深度の約５倍の平均深度まで配列決定した。これにより、プローブによって捕捉された内因性接合部が対照試料で検出される確率が高まり、その結果、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ試料でそれらを同定及び除去することができた。

【0192】

構築物ＰＨＰ８８４９２に由来するＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシにおいて、挿入のインテグレーション及びコピー数を決定した（図１）。形質転換に使用されるＰＨＰ８８４９２プラスミド及びＰＨＰ８８４９２由来のＴ－ＤＮＡの概略図を図１及び２に提供する。

【0193】

ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代からの２つの植物に対してＳｂＳを実施して、ゲノム内の挿入コピー数を決定した。ＳｂＳリードの予想される挿入領域へのアラインメントは、ゲノム隣接配列と挿入されたＤＮＡとの間に、両方の植物において同じである２つの固有の接合部をもたらした。植物において検出されたＰＨＰ８８４９２配列とトウモロコシゲノムとの間に他の接合部は存在せず、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシには追加のプラスミド由来挿入が存在しないことを示している。更に、ＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡの非連続領域間に接合部はなく、挿入されたＤＮＡに検出可能な再配列又は切断がないことを示している。更に、Ｔ５植物では、トウモロコシゲノム配列とＰＨＰ８８４９２の主鎖配列との間に接合部が存在せず、プラスミド主鎖配列がＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシに組み込まれなかったことが実証された。

【0194】

ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代のＳｂＳ分析は、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシにおいて、ＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡ由来の所望の遺伝子を含有する単一挿入が存在し、そのゲノムには追加の挿入が存在しないことを実証した。

【0195】

ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代について、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｙ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳｂＳ）解析を行い、挿入コピー数を確認した。結果は、植物中のＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡ由来の所望の遺伝子を含む単一挿入を示す。対照植物では、ＰＨＰ８８４９２配列とトウモロコシゲノムとの間の接合は検出されず、予想通り、これらの植物は、ＰＨＰ８８４９２に由来する挿入物を全く含まないことが示された。更に、分析したＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ植物ではプラスミド骨格配列は検出されなかった。ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシのＴ５世代のＳｂＳ分析は、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシにおいて、ＰＨＰ８８４９２ Ｔ－ＤＮＡ由来の所望の遺伝子を含有する単一挿入が存在し、そのゲノムには追加の挿入が存在しないことを実証した。

【0196】

表６に示す以下の連結配列を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｙ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳｂＳ）分析によって検証した。

【0197】

【表6】

【0198】

実施例５．北米におけるトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫有効性
ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシを、ツマジロクサヨトウに対する昆虫活性Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質の有効性について圃場内で評価した。２０２０年に、米国に１箇所及びＰｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏに２箇所を有する北米のトウモロコシ栽培地域で圃場試験を行った（表７）。各圃場位置で、３回繰り返した無作為化完全ブロック実験計画で、単列プロットを配置した。列は、Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ，ＭＳの場所で長さ１３フィート（３．９ｍ）、Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏの場所で１４フィート（４．３ｍ）であった。列間の間隔は３０インチであった。（７６ｃｍ）。種子植付率は、１列あたり約２２個の種子であった。全ての試験区及び対照区について、必要に応じて手作業による除草を含む、当該地域の通常の最良の慣行に従って従来の雑草抑制プログラムを実施し、地上の殺虫剤散布は適用しなかった。農学的慣行は、所与の場所の全てのプロットに対して均一であった。

【0199】

【表7】

【0200】

ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））の評価
Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏの場所は、自然界ではツマジロクサヨトウがはびこるため、用手的なはびこることはなかった。植物がＶ８～Ｖ９成長段階に達したときに、プロットをツマジロクサヨトウ植物傷害について視覚的に評価した。プロットの４番目の植物から開始して、１０個の連続する植物を、Ｄａｖｉｓスケール（０－９）を使用して葉損傷について個別にスコア化したところ、０のスコアは目に見える植物損傷がないことを示し、９個の示された植物のスコアはほぼ完全に破壊された（表８）。

【0201】

Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅの場所では、植物がＶ４成長段階に到達したときに、自然の寄生が手動の寄生によって増強された。列内の第４の植物から開始して、１プロットあたり７つの連続する植物に、それぞれの植物の渦巻きに適用された落下する新生ツマジロクサヨトウ及び市販のコーンコブグリットを含有する混合物を手作業で接種した。１日おきに、２回の別々の施用を、各植物について、施用あたり４０匹の新生児の目標繁殖率で行った。植物がＶ７成長段階にあるとき、最後の寄生日の１４日後に、プロットをツマジロクサヨトウ植物傷害について視覚的に評価した。以下の表に記載のＤａｖｉｓスケール（０－９）を使用して、葉損傷について中央の５つの寄生植物を個々にスコア化した。

【0202】

【表8】

【0203】

統計的分析：
場所全体（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ）：ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ及び陰性対照トウモロコシの葉損傷評価を評価及び比較するために線形混合モデルを使用して統計分析を実施した。場所（Ｌ）_ｉ、複製（Ｒ）_ｊ、イベント（Ｅ）_ｍ、プロット（Ｋ）_ｋ、及び植物ｓのＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ（Ｙ_{ｉｊｍｋｓ}）のデータを、全体平均μ、場所、複製による場所、イベント、イベントによる場所、各場所（Ｋ／Ｌ）_ｉｋ内のプロット、及び各場所（ε／Ｌ）_{ｉｊｍｋｓ}内の残差の関数としてモデル化した。モデルは、以下のように指定することができる。
Ｙ_{ｉｊｍｋｓ}＝μ＋Ｌ_ｉ＋（Ｌ×Ｒ）_ｉｊ＋Ｅ_ｍ＋（Ｌ×Ｅ）_ｉｍ＋（Ｋ／Ｌ）_ｉｋ＋（ε／Ｌ）_{ｉｊｍｋｓ}
ここで、イベント及び位置は固定効果として扱われ、他の全ての効果は０の平均を有する独立した正規分布ランダム変数として扱われた。処置手段をモデルフィッティングから推定した。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、治療効果を比較した。

【0204】

個々の場所（Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ）：複製（Ｒ）ｉ、イベント（Ｅ）ｎ、プロット（Ｋ）ｋ及び植物ｓのＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ（Ｙｉｎｋｓ）のデータを、全体平均μ、複製因子、イベント、プロット及び残留εインクの関数としてモデル化した。モデルは、以下のように指定することができる。
Ｙ_ｉｎｋｓ＝μ＋Ｒ_ｉ＋Ｅ_ｎ＋Ｋ_ｋ＋ε_ｉｎｋｓ
ここで、イベントは固定効果として扱われ、他の全ての効果は０の平均を有する独立した正規分布ランダム変数として扱われた。処置手段をモデルフィッティングから推定した。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、治療効果を比較した。

【0205】

全域及び個々の部位の分析の両方について、差のＰ値が０．０５未満である場合、差を統計学的に有意であると見なした。全ての統計データの分析及び比較は、ＡＳＲｅｍｌ－Ｒ ３．０（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ，２００９）を用いて行った。

【0206】

ツマジロクサヨトウ摂食による植物被害結果の概要を表９に示す。陰性対照について観察された７を超える平均葉損傷評価によって示されるように、これらの試験で中程度から高レベルのツマジロクサヨトウ摂食圧力が達成された。これらの結果は、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシで発現される昆虫活性Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質が、ツマジロクサヨトウによる摂食からの保護を提供することを示している。

【0207】

【表9】

【0208】

実施例６．南米におけるトウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３の昆虫有効性
ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシを圃場において、昆虫活性Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質の、ツマジロクサヨトウ、サトウキビボーラー及びコーンイアワームに対する有効性について評価した。ツマジロクサヨトウについて、２０１９～２０２０年に野外試験を行った。２０１８年には、サトウキビボーラー及びコーンイアワームが、南米（アルゼンチン；表１０）のトウモロコシ栽培地域で発見された。各圃場位置で、２行プロットを、４つの反復を有するランダム化完全ブロック実験計画で配置した。列は長さ４．２ｍ（１３．８フィート）であり、列間の間隔は５２ｃｍ（２０．５インチ）であった。種子植付率は、１列あたり約２０個の種子であった。全ての試験区及び対照区について、必要に応じて手作業による除草を含む、当該地域の通常の最良の慣行に従って従来の雑草抑制プログラムを実施し、地上の殺虫剤散布は適用しなかった。農学的慣行は、所与の場所の全てのプロットに対して均一であった。

【0209】

【表10】

【0210】

ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））の評価
Ｄａｓ Ｔｕｃｕｍａｎの部位には、自然にツマジロクサヨトウが寄生したため、用手的な寄生は行わなかった。Ｖ９成長段階において、プロットをツマジロクサヨトウ植物損傷について目視評価し、この最終評価の結果を報告する。各プロットの２０個の植物を、Ｄａｖｉｓスケール（０－９）を使用して葉損傷について個別にスコア化したところ、０のスコアは目に見える植物損傷がないことを示し、９個の示された植物のスコアはほぼ完全に破壊された（表１１）。

【0211】

【表11】

【0212】

サトウキビボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）の評価
Ｓａｎ Ｌｕｉｓ ２の場所では、サトウキビボーラーの天然の寄生に手による寄生を補足した。植物がおよそＲ１成長段階にあるとき、プロットあたり１０個の植物に２５個の新生児を手で外寄生させた。茎トンネリングの総センチメートルを測定することによって、Ｒ６成長段階でのサトウキビボーラー損傷について植物を評価した。各植物について、各切れ目を入れた植物の茎を長手方向に分割し（土壌表面から上方に下方の６～８節の節間）、植物当たりのサトウキビボーラーのトンネリングの量を合計センチメートルで測定した。土壌表面の下で継続するストークトンネリングも測定し、合計に含めた。

【0213】

コーンイアワーム（へリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ））評価
Ｓａｎ Ｌｕｉｓ １の場所では、コーンイアワームの自然の寄生を手動の寄生で補った。Ｒ２作物段階では、１プロット当たり１０株において、１株当たり５匹のＬ１幼虫を外寄生させた。植物がほぼＲ４成長段階にあるとき、植物をコーンイアワーム損傷について評価した。各プロットにおける１０個の植物の一次花穂を、花穂損傷の総平方センチメートルについて個別に評価した。各花穂の穀粒及び先端を評価に含めた。

【0214】

統計的分析
ツマジロクサヨトウ：複製（Ｒ）_ｉ、バックグラウンド（Ｇ）_ｇ、概念（Ｐ）_ｍ、イベント（Ｅ）_ｎ、プロット（Ｋ）_ｋ及び植物ｓのＤＡＳ－０１１３１－３（Ｙ_{ｉｇｍｎｋｓ}）のデータを、全体平均μ、複製因子、バックグラウンド、概念、イベントによるバックグラウンド、プロット及び残留ε_{ｉｇｍｎｋｓ}の関数としてモデル化した。モデルは、以下のように指定することができる。
Ｙ_{ｉｇｍｎｋｓ}＝μ＋Ｒ _ｉ ＋Ｇ _ｇ ＋Ｐ_ｍ＋（Ｇ×Ｅ） _ｇｎ ＋＋Ｋ _ｋ ＋ε _{ｉｇｍｎｋｓ}

【0215】

ここで、概念は固定効果として扱われ、他の全ての効果は０の平均を有する独立した正規分布ランダム変数として扱われた。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、治療効果を比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。全てのデータ分析及び比較はＡＳＲｅｍｌ ３．０（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ，２００９）で行った。

【0216】

サトウキビボーラー及びコーンイアワーム：各場所は、各有害生物について別々にモデル化された。複製（Ｒ）ｉ、イベント（Ｅ）ｎ、プロット（Ｋ）ｋ及び植物ｓのＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシ（Ｙｉｎｋｓ）のデータを、全体平均μ、複製因子、イベント、プロット及び残留εインクの関数としてモデル化した。モデルは、以下のように指定することができる。
Ｙ_ｉｎｋｓ＝μ＋Ｒ_ｉ＋Ｅ_ｎ＋Ｋ_ｋ＋ε_ｉｎｋｓ
ここで、イベントは固定効果として扱われ、他の全ての効果は０の平均を有する独立した正規分布ランダム変数として扱われた。処置手段をモデルフィッティングから推定した。モデルからの標準誤差を用いたＴ検定を実施して、治療効果を比較した。

【0217】

差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。全ての統計データの分析及び比較は、ＡＳＲｅｍｌ－Ｒ ３．０（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ，２００９）を用いて行った。

【0218】

ツマジロクサヨトウ（表１２）、サトウキビボーラー（表１３）、及びコーンイアワーム（表１４）について、植物損傷結果の概要を以下に示す。これらの結果は、高い昆虫圧の下では、これらの試験におけるツマジロクサヨトウ及びコーンイアワームに関して、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシで発現される昆虫活性Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質が、陰性対照と比較して摂食からの保護を提供することを示している。これらの試験における虫圧はサトウキビボーラーでは低かった；しかし、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシで発現された昆虫活性Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質は、陰性対照トウモロコシと比較して摂食からの保護を提供した。

【0219】

【表12】

【0220】

【表13】

【0221】

【表14】

【0222】

実施例７．トウモロコシイベントＤＡＳ－０１１３１－３の作物圃場評価及び収量圃場評価
ＤＡＳ－０１１３１－３を含む圃場試験は、収量データを生成し、他の農学的特徴を評価することであった。イベントに関して試験した全ての近交系及び交雑系材料は、単一のＴ０植物から生成した。

【0223】

交雑系試験
２つのハイブリッド試験を合計２６箇所に植え、一方の試験を１６箇所、他方の試験を１０箇所にし、各箇所にエントリーリストを２つ複製した。２６箇所中１１箇所から穀粒を採取した。共通のバックグラウンドにおける各エントリーを、２つの試験にわたって合計８名の試験者に交配して、試験用のハイブリッド種子を作製した。実験は、試験品に関して枝分れにし、エントリーは各枝分れの範囲内で無作為化した。各植付け地点において、生育期全体を通じて様々な観察及びデータを収集した。以下の農学的特徴を、野生型エントリー（ＷＴ）、又は同じ遺伝学を有するがＣｒｙ１Ｄａを含まないエントリー（ベース比較対照とも呼ばれる）との比較のために分析した（表１５）：
１．）花穂高（ＥＡＲＨＴ）：地面から植物上の最も発達した花穂の付着点までの測定。花穂高はインチ単位で測定される。
２．）排出される成長度単位（ＧＤＵＳＨＤ）：測定は、プロット中の植物の５０％が花粉を放出している雄穂を有する場合の総累積成長度単位を記録する。１日分は、このデータセットの約１．５度単位の増加である。
３．）絹に対する成長度単位（ＧＤＵＳＬＫ）：測定は、プロット中の植物の５０％が露出した絹を有する場合の総累積成長度単位を記録する。１日分は、このデータセットの約１．５度単位の増加である。
４．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地面から旗葉の基部までのドローンによる測定。稈長はインチ単位で測定される。
５．）水分（ＭＳＴ）：収穫時の穀粒水分パーセントの測定。
６．）収量：各プロットから採取した穀粒の記録重量。報告されるブッシェル／エーカー収量の計算は、各試験区の水分測定値で調整することにより行った。

【0224】

近交系試験
近交系試験は、８地点において、各地点２反復のエントリーリストとして植付けを行った。解析のために６箇所から穀粒を採取した。各地点で一方の反復を構築物設計に関して枝分れにした；他方の反復は、完備型乱塊法で植え付けた。近交系試験用に作物栽培学的データ及び観測を収集し、野生型エントリー（ＷＴ）又は同じ遺伝子型で形質のないバージョンとの比較のため分析した。近交系試験のために作成されたデータには、以下の農学的形質が含まれた（表１６）：
１．）花穂高（ＥＡＲＨＴ）：地面から植物上の最も発達した花穂の付着点までの測定。花穂高はインチ単位で測定される。
２．）排出される成長度単位（ＧＤＵＳＨＤ）：測定は、プロット中の植物の５０％が花粉を放出している雄穂を有する場合の総累積成長度単位を記録する。このデータセットについて１日換算は約１．５成長度日である。
３．）絹に対する成長度単位（ＧＤＵＳＬＫ）：測定は、プロット中の植物の５０％が露出した絹を有する場合の総累積成長度単位を記録する。このデータセットについて１日換算は約１．５成長度日である。
４．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地面から旗葉の基部までの測定。稈長はインチ単位で測定される。
５．）花穂測光法収量（ＰＨＴＹＬＤ）：各試験区から収穫された花穂の画像からの計算上の収量推定値。示される値の単位はブッシェル／エーカーである。

【0225】

試験結果
交雑系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。マルチロケーション分析では、主効果構築物設計は固定効果と見なされる。場所、背景、試験者、イベント、構造物設計による背景、構造物設計による試験者、イベントによる試験者、背景による場所、構造物設計による場所、試験者による場所、構造物設計による背景による場所、構造物設計による試験者による場所、イベントによる場所、イベントによる試験者による場所、及び地点内の反復数についての要因は、ランダムな影響と見なされる。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景について構築物設計の推定及びイベントの予測を生成した。構築物の設計／イベントをＷＴと比較するために、Ｔ検定を行った。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

【0226】

近交系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。マルチロケーション分析では、主効果構築物設計は固定効果と見なされる。地点、背景、イベント、背景×構築物設計、地点×背景、地点×構築物設計、地点×背景×構築物設計、地点×イベント及び地点内の反復数についての要因を変量効果と見なす。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景について構築物設計の推定及びイベントの予測を生成した。Ｔ検定を行うことにより、構築物設計／イベントをＷＴと比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

【0227】

【表15】

【0228】

【表16】

【0229】

実施例８．タンパク質の発現及び濃度
タンパク質抽出
葉試料を、ＤＡＳ１１３１トウモロコシの２つの分離世代（ＢＣ１Ｆ１ ［２つのエントリーから構成される］）から収集した。各世代から５つの植物について試料を収集した。植物は試料収集時にＶ９成長段階（すなわち、第９のリーフのカラーが見えるようになると、）にあった。処理された葉組織サブ試料を１０ｍｇの目標重量で秤量した。Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質について分析した試料を、ポリソルベート２０（ＰＢＳＴ）を含有する冷却リン酸緩衝生理食塩水０．６０ｍｌで抽出した。ＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳタンパク質について分析した試料を、９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ポリエチレングリコール、１．０％ ＰＶＰ－４０、１．０％ウシ血清アルブミン、０．００７％チメロサール、０．３％ポリソルベート２０及び１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で構成されるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．６０ｍｌの冷却Ｈ５緩衝液で抽出した。抽出した試料を遠心し、次に上清を除去し、分析用に調製した。

【0230】

Ｃｒｙ１Ｄａ２及びＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳタンパク質の濃度を、方法の適合性を実証するために内部で検証されている特定の定量的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。

【0231】

Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質濃度の決定
分析前に、試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。標準（典型的には３つ組のウェルで分析）及び希釈試料（典型的には２つ組のウェルで分析）を、Ｃｒｙ１Ｄａ２特異的抗体でプレコートしたプレート中でインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流した。酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした異なるＣｒｙ１Ｄａ２特異的抗体をプレートに添加し、インキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＣｒｙ１Ｄａ２抗体複合体の検出を、ＨＲＰの存在下で着色生成物を生成する基質の添加によって達成した。反応を酸性溶液で停止させ、プレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度（ＯＤ）を決定した。

【0232】

ＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳタンパク質濃度の決定
分析の前に、試料をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＨ５緩衝液で適用可能なように希釈した。標準（典型的には３つ組のウェルで分析）及び希釈試料（典型的には２つ組のウェルで分析）を、ＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳ特異的抗体で予めコーティングしたプレートでインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流した。酵素ＨＲＰにコンジュゲートした異なるＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳ特異的抗体をプレートに添加し、インキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で着色生成物を生成する基質の添加によって達成された。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルのＯＤを、プレートリーダーを使用して決定した。

【0233】

タンパク質濃度を決定するための計算
各一組の試料ウェルについて入手されたＯＤ値をタンパク質濃度値に変換するために必要な計算は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートデータソフトウェアを使用して実施した。

【0234】

各ＥＬＩＳＡプレートには、検量線を含めた。検量線の方程式をソフトウェアによって求め、このソフトウェアは二次関数の当てはめを用いて各一組の検量線ウェルについて入手されたＯＤ値をそれぞれの検量線濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関係付けるものであった。

【0235】

試料濃度値は、内挿された濃度にＮを乗算することによって、１：Ｎとして表される希釈係数に対して調整された。
調整後濃度＝補間した試料濃度×希釈係数

【0236】

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰソフトウェアによって求められた調整後試料濃度値を以下のとおりｎｇ／ｍｌからｎｇ／ｍｇ試料重量に変換した。

【数1】

【0237】

結果
タンパク質濃度の結果（平均、標準偏差、及び範囲）を、ＤＡＳ－０１１３１－３トウモロコシの２つの分離世代（ＢＣ１Ｆ１ ［２つのエントリーから構成される］）由来のＶ９葉組織におけるＣｒｙ１Ｄａ２及びＤＧＴ－２８ ＥＰＳＰＳタンパク質について決定した。

【0238】

【表17】

【0239】

本開示の様々な例示される実施形態の上記の説明は、網羅的であること又は範囲を開示される詳細な形態に限定することを意図するものではない。本明細書では、具体的な実施形態及び例が例示を目的として説明されているが、当業者が認識するであろうとおり、本開示の範囲内で様々な均等な改良形態が可能である。本明細書に提供される教示は、上記に説明される例以外の他の目的に適用することができる。上記の教示に鑑みて、多くの改良形態及び変形形態が可能であり、従って、それらは、添付の特許請求の範囲内にある。

【0240】

上記の詳細な説明に鑑みて、これら及び他の変更形態がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態にその範囲を限定するものと解釈されてはならない。

【0241】

背景、詳細な説明及び実施例において引用される各文献の開示全体（特許、特許出願、ジャーナル論文、抄録、マニュアル、書籍又は他の開示を含む）は、全体として参照により本明細書に援用される。

【0242】

使用される数（例えば、量、温度、濃度等）に関して、正確さを確保するように努めたが、幾らかの実験誤差及び偏差が許容されなければならない。特に指示されない限り、部数は、重量部数であり、分子量は、平均分子量であり；温度は、セルシウス度単位であり；及び圧力は、大気圧又はその近傍の圧力である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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【国際調査報告】