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特表2024-544595診断および治療に有用なエンドペルオキシドに基づく薬物送達システム、およびその方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】診断および治療に有用なエンドペルオキシドに基づく薬物送達システム、およびその方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20241126BHJP
A61K 31/4706 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20241126BHJP
A61P 33/06 20060101ALI20241126BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241126BHJP
C07D 323/04 20060101ALI20241126BHJP
C07D 405/12 20060101ALI20241126BHJP
C07H 15/26 20060101ALI20241126BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241126BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241126BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20241126BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61K31/4706
A61K31/495
A61K31/704
A61P33/06
A61P35/00
C07D323/04
C07D405/12
C07H15/26
A61K45/00
A61P29/00
A61P3/10
A61P9/00
A61P25/00
A61P31/00
A61K49/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024530424
(86)(22)【出願日】2022-12-13
(85)【翻訳文提出日】2024-07-04
(86)【国際出願番号】 IB2022062107
(87)【国際公開番号】W WO2023111829
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】117644
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524191996
【氏名又は名称】ファカルダーデ デ ファルマシア ダ ウニベルシダーデ デ リスボン
【氏名又は名称原語表記】Ｆａｃｕｌｄａｄｅ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ ｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ
(74)【代理人】
【識別番号】100139723
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 洋
(72)【発明者】
【氏名】シルヴァ，マガリャエス ディオゴ
(72)【発明者】
【氏名】モレイラ，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】ロペス，フランシスカ
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス，セシリア
(72)【発明者】
【氏名】マルケス，ヴァンダ
【テーマコード（参考）】
4C057
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057AA18
4C057BB02
4C057CC03
4C057DD03
4C057JJ55
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC04
4C076CC11
4C076CC21
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC34
4C076DD59
4C076EE59
4C084AA17
4C084NA13
4C084NA15
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB311
4C084ZB312
4C084ZB381
4C084ZB382
4C084ZC351
4C084ZC352
4C085HH11
4C085KA27
4C085KB37
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC28
4C086BC50
4C086EA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA15
4C086ZA01
4C086ZA36
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZB31
4C086ZB38
4C086ZC35
(57)【要約】
本発明は、対象において、より高いレベルのＦｅ（ＩＩ）の存在下で医薬品有効成分（ＡＰＩ）を放出するように適切に修飾された、１，２，４，５－テトラオキサンなどのエンドペルオキシド部分、すなわち式Ｉの化合物に基づく新規な薬物送達システムに関し、式Ｉの鉄代謝異常は、マラリアおよび癌などの疾患において起こる。したがって、本発明はまた、式Ｉの前記化合物を含むバイオマーカーに関する。別の態様では、本発明は、式Ｉの化合物およびそれぞれの中間体の合成プロセスに関する。さらに、本発明はまた、組織試料中の腫瘍の標識化、検出、および同定のためのプロセスに関する。したがって、本発明は、医学的および薬理学的分野、特に癌の検出および治療、ならびにマラリア治療に関連する分野に適用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エナンチオマーおよびそのラセミ混合物を含む式Ｉの化合物であって、【化1】
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ１およびＲ２は、カップリングして、置換または非置換シクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルを形成し得、
Ｘは、－ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２－または－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）－、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－または－Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、水素、－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ａまたは－ＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｓ）Ａであり、式中、Ａは独立して、炎症、糖尿病、心血管疾患、マラリア、希少疾患、神経変性疾患、感染症および癌の診断および治療のための１つまたは複数のＡＰＩ、タンパク質および抗体であり、
Ｒ５およびＲ６は独立して、水素、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ａまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｓ）Ａであり、式中、Ａは独立して、炎症、糖尿病、心血管疾患、マラリア、希少疾患、神経変性疾患、感染症および癌の診断および治療のための１つまたは複数のＡＰＩ、タンパク質および抗体である、
化合物。
【請求項2】
式ＩＩａによって表され、【化2】
Ｒ１は、アダマンチルであり、
Ｒ２は、アダマンチルであり、
Ｘは、－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、（４－（（７－メトキシキノリン－５－イル）アミノ）ペンチル）カルバモイルオキシであり、
Ｒ６は、水素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
式ＩＩｂによって表され、【化3】
Ｒ１は、アダマンチルであり、
Ｒ２は、アダマンチルであり、
Ｘは、－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）ピペラジン－１，４－ジカルボキシレートであり、
Ｒ６は、水素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
式ＩＩｃによって表され、【化4】
Ｒ１は、アダマンチルであり、
Ｒ２は、アダマンチルであり、
Ｘは、－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（２Ｓ，４Ｓ）－４，５，１２－トリヒドロキシ－４－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバモイルオキシであり、
Ｒ６は、水素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項5】
式ＩＩｄによって表され、【化5】
Ｒ１は、５－ヒドロキシアダマンチルであり、
Ｒ２は、５－ヒドロキシアダマンチルであり、
Ｘは、－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（２Ｓ，４Ｓ）－４，５，１２－トリヒドロキシ－４－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバモイルオキシであり、
Ｒ６は、水素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項6】
式ＩＩｅによって表され、【化6】
Ｒ１は、５－ヒドロキシアダマンチルであり、
Ｒ２は、５－ヒドロキシアダマンチルであり、
Ｘは、－Ｏ－Ｏ－であり、
Ｒ３は、－Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）－であり、
Ｒ４は、（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（（１Ｒ，３Ｒ）－３，５，１２－トリヒドロキシ－３－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバモイルオキシであり、
Ｒ５は、であり、
Ｒ６は、水素である
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項7】
請求項１に記載の式Ｉのテトラオキサン化合物および請求項２～６にそれぞれ記載される化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅに基づく薬物送達システムであって、前記化合物は、対象において、より高いレベルのＦｅ（ＩＩ）の存在下で医薬品有効成分（ＡＰＩ）を放出するように適切に修飾されることを特徴とする、薬物送達システム。
【請求項8】
式ＩＩａまたはＩＩｂを有する前記化合物は、１つまたは複数の抗マラリアＡＰＩ、例えば、プリマキンおよびｂｏｃ－ピペラジン、アトバコン、硫酸キニーネ、スルホンアミド（スルファドキシンおよびスルファメトキシピリダジン）およびファルシパイン阻害剤（ジペプチジルビニルスルホンおよびペプチド模倣ピリミジンニトリル）、ならびにそれらの組合せまたは誘導体とカップリングされることを特徴とする、請求項７に記載の薬物送達システム。
【請求項9】
式ＩＩｃ、ＩＩｄまたはＩＩｅを有する前記化合物は、１つまたは複数の抗腫瘍ＡＰＩ、例えば、ドキソルビシン、アレクチニブ、アファチニブ、酢酸アビラテロン、アザシチジン、アキシチニブ、ベンダムスチン、ブリガチニブ、ボスチニブ、ビカルタミド、カリケアミシン、カペシタビン、カルフィルゾミブ、コンブレタスタチン、セリチニブ、クラドリビン、クロファラビン、コビメチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、シタラビン、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デュオカルマイシン、エナシデニブ、エピルビシン、メシル酸エリブリン、エルロチニブ、エベロリムス、エトポシド、エキサテカン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヘミアスタリン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（アベキシノスタット、ベリノスタット、エンチノスタット、ジビノスタット、モセチノスタット、オキサムフラチン、 パノビノスタット、ピロキサミド、キシノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、タセシナリン、ツシジノスタット、ツバスタチンＡ）、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イリノテカン、イキサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、メイタンシン、マイトマイシンＣ、モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡ－Ｅ、ＭＭＡ－Ｆ、ドラスタチン１０およびドラスタチノール）、メトトレキサート、ネラチニブ、ニロチニブ、ニラパリブ、オラパリブ、オクトレオチド、オシメルチニブ、パクリタキセル、パルボシクリブ、パゾパニブ、ピロロベンゾジアゼピン、ペメトレキセド、ポマリドミド、ポナチニブ、リボシクリブ、ルカパリブ、ソラフェニブ、タモキシフェン、トリアゼン、トリフルリジン、トポテカン、ツブリシン、バンデタニブ、ならびにそれらの組合せまたは誘導体と、または、腫瘍マーカーＡＰＩ、例えば、４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、シアニン、ジシアノメチン、ドキソルビシン、フルオレセイン、ニトロベンゾフラザン、ローダミン、ならびにそれらの組合せまたは誘導体に、カップリングされることを特徴とする、請求項７に記載の薬物送達システム。
【請求項10】
請求項７～９のいずれか一項に記載の式Ｉを有する１，２，４，５－テトラオキサンをベースとする薬物送達システムの調製方法であって、以下の工程：【化7】
（ｉ）二クロム酸ナトリウム二水和物、水、硫酸は、１，３－シクロヘキサンジオールである化合物０の酸化のために反応して、ｒａｃ－３－ヒドロキシシクロヘキサノン化合物１を生成し；
（ｉｉ）酸化レニウム（ＶＩＩ）、５０％過酸化水素、アセトニトリルであって、化合物１は、酸化レニウム（ＶＩＩ）の存在下で過酸化水素と反応して、ジヒドロペルオキシドである化合物２を生成し；
（ｉｉｉ）２－アダマンタノンまたは５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン、酸化レニウム（ＶＩＩ）、ジクロロメタン：アセトニトリル（１：１）、不活性雰囲気であって、ジヒドロペルオキシドである化合物２は、触媒量の酸化レニウム（ＶＩＩ）を用いて、カルボニル試薬と反応し、２－アダマンタノン（化合物３）および５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（化合物４）は、テトラオキサンの形成のためのカルボニルとして使用でき；
（ｉｖ）４－ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、ジクロロメタンであって、化合物３および化合物４は、過剰なアミン塩基（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンおよび４－ジメチルアミノピリジン）とともに４－ニトロフェニルクロロホルメートで活性化されて、それぞれ化合物（５）および（６）を生成し；
（ｖ）ＡＰＩ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであって、化合物５は、プリマキン・ジホスフェートとカップリングされて化合物ＩＩａを生成するまたはｂｏｃ－ピペラジンとカップリングされて化合物ＩＩｂを生成する、または２つのカーボネートがドキソルビシンとカップリングされてカルバメートＩＩｃおよびＩＩｄを得る
ことを特徴とする、方法。
【請求項11】
－工程（ｉ）において、二クロム酸ナトリウム二水和物、水、硫酸、および化合物０は、ホルムアルデヒド、Ｎ－メチルピロリジン、水酸化バリウム八水和物、水：メタノール（５：１）、および化合物７に置き換えられ、－工程（ｉｉ）において、化合物１は、化合物８に置き換えられ、
－工程（ｉｉｉ）において、化合物２は、化合物９に置き換えられ、
－工程（ｉｖ）において、化合物３または４は、化合物１０に置き換えられ、
－工程（ｖ）において、化合物５または６は、化合物１１に置き換えられる
ことを特徴とする、請求項１０に記載の薬物送達システムの調製方法。
【請求項12】
請求項１０または請求項１１に記載の式Ｉを有する１，２，４，５－テトラオキサンをベースとする薬物送達システムの調製方法に使用される中間化合物であって、以下の式１～１１：化合物１は、ｒａｃ－３－ヒドロキシシクロヘキサノンであり、
化合物２は、３，３－ジヒドロペルオキシシクロヘキサン－１－オールであり、
化合物３は、ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－オールであり、
化合物４は、ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”，５－ジオールであり、
化合物５は、ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－ニトロフェニル）カーボネートであり、
化合物６は、５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－ニトロフェニル）カーボネートであり、
化合物７は、２－シクロヘキセン－１－オンであり、
化合物８は、２－（ヒドロキシメチル）シクロヘキス－１－エン－１－オンであり、
化合物９は、（６，６－ジヒドロペルオキシシクロヘキス－１－エン－１－イル）メタノールであり、
化合物１０は、２”－（ヒドロキシメチル）ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－２”－エン－５－オールであり、
化合物１１は、５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－２”－エン－２”－イル）メチル（４－ニトロフェニル）カーボネートである
によって表されることを特徴とする、中間化合物。
【請求項13】
請求項１～６のいずれか一項に記載の式Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅの化合物、または医薬として使用される請求項７～９のいずれか一項に記載の前記化合物を含む薬物送達システム。
【請求項14】
－請求項８に記載の式ＩＩａおよびＩＩｂの化合物は、抗マラリア薬として使用され、－請求項９に記載の化合物ＩＩｃ、ＩＩｄまたはＩＩｅは、抗腫瘍薬として使用される
ことを特徴とする、請求項１３に記載の薬物送達システム。。
【請求項15】
－請求項９に記載の化合物ＩＩｃ、ＩＩｄまたはＩＩｅは、腫瘍マーカーとして使用されることを特徴とする、請求項１３に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象において、より高いレベルのＦｅ（ＩＩ）の存在下で医薬品有効成分（ＡＰＩ）を放出するように適切に修飾された、１，２，４，５－テトラオキサンなどのエンドペルオキシド部分、すなわち式Ｉ：
の化合物に基づく新規な薬物送達システムに関する。
【化1】
【0002】
鉄代謝異常は、マラリアおよび癌などの疾患において起こる。したがって、本発明はまた、式Ｉの前記化合物を含むバイオマーカーに関する。
【0003】
別の態様では、本発明は、式Ｉの化合物およびそれぞれの中間体の合成プロセスに関する。
【0004】
さらに、本発明はまた、組織試料中の腫瘍の標識化、検出、および同定のためのプロセスに関する。
【0005】
したがって、本発明は、医学的および薬理学的分野、特に癌の検出および治療、ならびにマラリア治療に関連する分野に適用可能である。
【0006】
本発明は、Ｆｅ（ＩＩ）と選択的に反応する１，２，４，５－テトラオキサン足場に基づく、２つの異なるビアを有する薬物送達システムを開示する：第１の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）との反応後に医薬品有効成分（ＡＰＩ）を自然に放出するが、第２の薬物送達システムは、わずかに改変された第１のシステムの代わりに、医薬品有効成分（ＡＰＩ）を放出するためにＦｅ（ＩＩ）およびグルタチオンと反応する必要がある。
【背景技術】
【0007】
鉄は、ミトコンドリア呼吸および細胞周期制御などの重要な生物学的プロセスに関与する酵素の補因子である。その役割は、第二鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ））と第一鉄（Ｆｅ（ＩＩ））との間の酸化還元サイクルに依存する。しかしながら、それはまた、過酸化水素とのＦｅ（ＩＩ）の反応によって活性酸素種（ＲＯＳ）生成をもたらし得る。いくつかの生物学的プロセスにとって極めて重要であるにもかかわらず、鉄は潜在的に有害でもあり得る。
【0008】
細胞における鉄ホメオスタシスは、レドックス活性第一鉄形態における鉄の利用可能性を低下させる一方で、その機能を保証するのに十分な鉄のレベルを厳密に維持する。鉄の取り込み、貯蔵および排出の間の均衡は、細胞における鉄のホメオスタシスを確保する。鉄代謝のメカニズムは、主に細胞質ゾルに存在する不安定な鉄プールと呼ばれる第一鉄（レドックス活性鉄）に関連する。
【0009】
鉄代謝異常は、炎症、感染症、癌、心血管疾患、および神経変性疾患などの疾患において生じる。
【0010】
アルテミシニンおよびその誘導体などのエンドペルオキシドは、マラリアの治療のために臨床で使用される。１，２，４－トリオキサン、１，２，４－トリオキソランおよび１，２，４，５－テトラオキサンなどのエンドペルオキシドは、Ｆｅ（ＩＩ）に富む寄生虫に感染した赤血球によって選択的に活性化されて、炭素中心ラジカルを形成する。感染赤血球は、健常組織において検出されるものと比較して、上昇したレベルのＦｅ（ＩＩ）を含有するようである。
【0011】
抗マラリア薬は有害な副作用を有し、マラリアの１次治療に対する耐性の増加が報告されている。
【0012】
いくつかの研究は、鉄と癌との間の関連性を報告し、癌細胞内で、それらの生物学的必要性を支持するために、不安定な鉄プールのレベルが増加することが示されている。さらに、多くの癌は、鉄の取り込みおよび排出プロセスを改変し、正常細胞と比較して、不安定な鉄プールのレベルの増大をもたらし、これは、「鉄中毒」と呼ばれる現象である。
【0013】
現在、化学療法薬は、それらの作用部位に対して選択的ではない。結果として、それらは重篤で有害な副作用をもたらす。
【0014】
鉄代謝異常は、テトラオキサンに基づく２つのシステムを調製することにより、選択的薬物送達のための新規な戦略を表す。本発明に記載される薬物送達システムは、不活性に投与され、選択された標的、この場合は第一鉄に対して選択的に活性化されるので、薬効および薬物耐性の状況を改変することができる。
【0015】
特許文献１は、より高いレベルの第一鉄を示す状態に関連する寄生虫および腫瘍性疾患の治療のための１，２，４－トリオキサンまたは１，２，４－トリオキソラン環系に基づく化合物を記載している。
【0016】
しかしながら、特許文献１は、１，２，４，５－テトラオキサンをベースとする化合物を含む送達システムに関しては何も言及していない。さらに、文献において広く認識されているように、１，２，４－トリオキソラン環系は良好な代謝安定性を示さず、これは依然として臨床開発に対する大きな障害である。１，２，４，５－テトラオキソラン環系は、１，２，４－トリオキソラン環系よりも熱力学的および代謝的により安定である。さらに、これらの化合物は、生物に対して非常に毒性である。最後に、開示される第２の薬物送達システムは、１，２，４－トリオキソラン足場の調製に固有の制限のため、１，２，４－トリオキソラン環系を含有するのに適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１２３５９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、標的組織に対して選択的であり、マラリアおよび癌の治療に寄与することができ、さらにバイオマーカーとして首尾よく使用することができる、新規な１，２，４，５－テトラオキサン化合物および当該化合物に基づく２つの薬物送達システムを提供することによって、従来技術の問題を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明は、対象において、より高いレベルのＦｅ（ＩＩ）の存在下で医薬品有効成分（ＡＰＩ）を放出するように適切に修飾された、１，２，４，５－テトラオキサンなどのエンドペルオキシド部分、すなわち式Ｉの化合物に基づく新規な薬物送達システムに関する。
【0020】
１．新規なテトラオキサン化合物
本発明による新規なテトラオキサン化合物は、式Ｉで表される：
本発明による新規なテトラオキサン化合物は、式Ｉで表される：
【化2】
【0021】
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールである。
【0022】
Ｒ１およびＲ２は、カップリングして、置換または非置換シクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルを形成し得る。
【0023】
Ｘは、－ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２－または－Ｏ－Ｏ－である。
【0024】
Ｒ３は、－Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）－、－ＣＨ（Ｒ４）－ＣＨ（Ｒ５）－または－Ｃ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）－である。
【0025】
Ｒ４は、水素、－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ａまたは－ＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｓ）Ａであり、式中、Ａは独立して、炎症、糖尿病、心血管疾患、マラリア、希少疾患、神経変性疾患、感染症および癌（診断および治療）のための１つまたは複数のＡＰＩ、タンパク質および抗体である。
【0026】
Ｒ５およびＲ６は独立して、水素、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ａまたは－Ｏ（Ｃ＝Ｓ）Ａであり、式中、Ａは独立して、炎症、糖尿病、心血管疾患、マラリア、希少疾患、神経変性疾患、感染症および癌（診断および治療）のための１つまたは複数のＡＰＩ、タンパク質および抗体である。
【0027】
式Ｉの化合物は、式ＩＩａ～ＩＩｅの化合物にさらに細分化して、診断および治療における薬物送達システムとして本発明のテトラオキサンを利用することができる。
【0028】
１．１．マラリア治療のための本発明の化合物の特徴および特性（式ＩＩａおよびＩＩｂ）
【化3】
【0029】
化合物ＩＩａおよびＩＩｂは、薬物送達システムＩＩａおよびＩＩｂを規定するマラリア治療のための薬物とカップリングされる。好ましい実施形態において、化合物ＩＩａは、臨床で使用される抗マラリア薬であるプリマキンとカップリングされる。別の実施形態において、化合物ＩＩｂはｂｏｃ－ピペラジンとカップリングされる。これらの化合物は、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性３Ｄ７株に対してナノモル範囲の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。したがって、これらの化合物は、マラリア治療に適用することができる。化合物ＩＩａおよびＩＩｂはまた、それぞれのラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーを含む。
【0030】
１．２．がん治療のための本発明の化合物の特徴および特性（式ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅ）
さらなる化合物が本発明の範囲内であり、例えば、式ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅの化合物である。
さらなる化合物が本発明の範囲内であり、例えば、式ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅの化合物である。
【化4】
【0031】
化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅは、臨床で典型的に使用される抗癌剤とカップリングされ、したがって薬物送達システムＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅを画定する。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、ドキソルビシンとカップリングされる。これらの化合物は、鉄代謝が不安定性な少なくとも４種類の癌について、インビトロでマイクロモル範囲で細胞死を誘導することができ、ここで、特定の細胞株は括弧内に同定される：膠芽腫（Ｕ２５１）、乳腺癌（ＭＣＦ７）、前立腺癌（ＰＣ３）および結腸直腸癌（ＨＣＴ１１６）。したがって、これらの化合物は癌治療に適用することができる。化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅはまた、それぞれのラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーを含む。
【0032】
１．３．癌診断のための本発明の化合物（式ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅ）の特徴および特性
癌細胞において細胞死を誘導するその能力に加えて、ドキソルビシンなどの固有の蛍光を有するいくつかの他の化合物は、本発明の化合物とカップリングしたときに腫瘍マーカーとして使用するのに有用である。この蛍光は、前記化合物が薬剤化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅに結合されると失われる。これらの蛍光化合物が癌細胞において活性化されると、第一鉄との反応により、前記蛍光化合物はＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅから放出され、したがって、その蛍光特性が回復し、蛍光顕微鏡によって検出される。したがって、これらの化合物はまた、腫瘍マーカーのための薬物送達システムとして使用され得る。好ましい実施形態において、ドキソルビシンは、腫瘍マーカーとして使用される化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅに結合される。
癌細胞において細胞死を誘導するその能力に加えて、ドキソルビシンなどの固有の蛍光を有するいくつかの他の化合物は、本発明の化合物とカップリングしたときに腫瘍マーカーとして使用するのに有用である。この蛍光は、前記化合物が薬剤化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅに結合されると失われる。これらの蛍光化合物が癌細胞において活性化されると、第一鉄との反応により、前記蛍光化合物はＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅから放出され、したがって、その蛍光特性が回復し、蛍光顕微鏡によって検出される。したがって、これらの化合物はまた、腫瘍マーカーのための薬物送達システムとして使用され得る。好ましい実施形態において、ドキソルビシンは、腫瘍マーカーとして使用される化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅに結合される。
【0033】
２．式Ｉの化合物の調製方法
本発明の一実施形態では、前節に記載される式Ｉの化合物（実施例１を参照）および式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄの化合物（実施例２を参照）の調製方法は、以下のスキーム１によって表され：
以下の工程を用いる：
（ｉ）二クロム酸ナトリウム二水和物、水、硫酸；
（ｉｉ）酸化レニウム（ＶＩＩ）、５０％過酸化水素、アセトニトリル；
（ｉｉｉ）２－アダマンタノンまたは５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン、酸化レニウム（ＶＩＩ）、ジクロロメタン：アセトニトリル（１：１）、不活性雰囲気；
（ｉｖ）４－ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン，４－ジメチルアミノピリジン，ジクロロメタン；
（ｖ）ＡＰＩ，１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、トリエチルアミン，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド。
本発明の一実施形態では、前節に記載される式Ｉの化合物（実施例１を参照）および式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄの化合物（実施例２を参照）の調製方法は、以下のスキーム１によって表され：
【化5】
（ｉ）二クロム酸ナトリウム二水和物、水、硫酸；
（ｉｉ）酸化レニウム（ＶＩＩ）、５０％過酸化水素、アセトニトリル；
（ｉｉｉ）２－アダマンタノンまたは５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン、酸化レニウム（ＶＩＩ）、ジクロロメタン：アセトニトリル（１：１）、不活性雰囲気；
（ｉｖ）４－ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン，４－ジメチルアミノピリジン，ジクロロメタン；
（ｖ）ＡＰＩ，１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、トリエチルアミン，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド。
【0034】
工程ｉ）において、１，３－シクロヘキサンジオール（化合物０）の酸化により、ｒａｃ－３－ヒドロキシシクロヘキサノン（化合物１）が生成される。
【0035】
工程ｉｉ）において、化合物１は、酸化レニウム（ＶＩＩ）の存在下で過酸化水素と反応して、ジヒドロペルオキシド（化合物２）を生成する。
【0036】
工程ｉｉｉ）において、ジヒドロペルオキシド（化合物２）は、再び触媒量の酸化レニウム（ＶＩＩ）を用いて、カルボニル試薬と反応する。２－アダマンタノン（化合物３）および５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（化合物４）は、第１の薬物送達システムの１，２，４，５－テトラオキサン足場の形成のためのカルボニルとして使用することができる。シクロヘキサン環の３”位のアルコール基は、立体中心を有する非対称テトラオキサン（化合物３および４）を生成し、２つのエナンチオマーを得る。したがって、この工程はまた、１，２，４，５－テトラオキサン系の立体制御合成を行う代わりに、薬物送達システムとして適用されるテトラオキサンのラセミ混合物を用いてもよい。
【0037】
次に、工程ｉｖ）において、化合物（３）および（４）を、過剰のアミン塩基（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンおよび４－ジメチルアミノピリジン）と共に４－ニトロフェニルクロロホルメートで活性化して、化合物（５）および（６）をそれぞれ生成した。
【0038】
最後に、化合物（５）を、それぞれ５５％および３３％の収率で、プリマキン・ジホスフェート（ＩＩａ）およびｂｏｃ－ピペラジン（ＩＩｂ）とカップリングした。化合物（５）および（６）をドキソルビシンとカップリングさせて、６０％（ＩＩｃ）および７５％（ＩＩｄ）のカルバメートを得て、対応する薬物送達システムを生成した。
【0039】
上記の式を有する化合物１～６、および化合物３～６のエナンチオマーは、化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄ、ならびにそれぞれの薬物送達システムの製造方法における中間体として本発明に含まれる。
【0040】
最後に、中間化合物３～６が化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄを調製する方法において使用されることを考慮すると、これは、前記化合物およびそれぞれの薬物送達システムがラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーを含むという結果をもたらす。したがって、本発明はまた、化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄのラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーならびに対応する薬物送達システムに関する。
【0041】
本発明の別の実施形態において、式Ｉの化合物（実施例１参照）および式ＩＩｅの化合物（実施例２参照）の調製方法は、以下のスキーム２に記載され：
以下の工程を用いる：
（ｉ）ホルムアルデヒド、Ｎ－メチルピロリジン、水酸化バリウム八水和物、水：メタノール（５：１）；
（ｉｉ）酸化レニウム（ＶＩＩ）、５０％過酸化水素、アセトニトリル；
（ｉｉｉ）５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン、酸化レニウム（ＶＩＩ）、ジクロロメタン：アセトニトリル（１：１）、不活性雰囲気；
（ｉｖ）４－ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、ジクロロメタン；
（ｖ）ＡＰＩ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、トリエチルアミン，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド。
【化6】
（ｉ）ホルムアルデヒド、Ｎ－メチルピロリジン、水酸化バリウム八水和物、水：メタノール（５：１）；
（ｉｉ）酸化レニウム（ＶＩＩ）、５０％過酸化水素、アセトニトリル；
（ｉｉｉ）５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン、酸化レニウム（ＶＩＩ）、ジクロロメタン：アセトニトリル（１：１）、不活性雰囲気；
（ｉｖ）４－ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、ジクロロメタン；
（ｖ）ＡＰＩ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、トリエチルアミン，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド。
【0042】
工程ｉ）において、ヒドロキシメチル基を、森田－バイリス－ヒルマン化によって２－シクロヘキセン－１－オン（化合物７）の２位に導入し、化合物８を生成した。
【0043】
工程ｉｉ）において、化合物８は、酸化レニウム（ＶＩＩ）の存在下で過酸化水素と反応して、ジヒドロペルオキシド（化合物９）を生成する。
【0044】
工程ｉｉｉ）において、ジヒドロペルオキシド（化合物９）は、再び触媒量の酸化レニウム（ＶＩＩ）を用いて、カルボニル試薬と反応する。５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（化合物１０）は、第２の薬物送達システムの１，２，４，５－テトラオキサン足場の形成のためのカルボニルとして使用することができる。アダマンチル基の５位のアルコール基は、立体中心を有する非対称テトラオキサン（化合物１０）を生成し、２つのエナンチオマーを得る。この工程はまた、この薬物送達システムの立体制御合成を行う代わりに、薬物送達システムとして適用されるテトラオキサンのラセミ混合物を用いてもよい。
【0045】
次に、工程ｉｖ）において、化合物（１０）を、過剰のアミン塩基（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンおよび４－ジメチルアミノピリジン）と共に４－ニトロフェニルクロロホルメートで活性化して、化合物（１１）を生成した。
【0046】
最後に、化合物（１１）をドキソルビシン（ＩＩｅ）と７３％の収率でカップリングした。
【0047】
上記の式を有する化合物８～１１、および化合物１０および１１のエナンチオマーは、式Ｉおよび式ＩＩｅの化合物の製造方法における中間体として本発明に含まれる。
【0048】
最後に、中間化合物１０および１１が上述の化合物を調製する方法において使用されることを考慮すると、これは、前記化合物がラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーを含むという結果をもたらす。したがって、本発明はまた、化合物ＩおよびＩＩｅのラセミ混合物またはそれぞれのエナンチオマーに関する。
【0049】
３．本発明による第１の薬物送達システムのメカニズム
第１の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）と反応してシクロヘキサノン中間体を形成する１，２，４，５－テトラオキサン足場を含有する（スキーム３）。この中間体は、レトロマイケル反応（β－脱離）によってＡＰＩを自然に放出する。
第１の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）と反応してシクロヘキサノン中間体を形成する１，２，４，５－テトラオキサン足場を含有する（スキーム３）。この中間体は、レトロマイケル反応（β－脱離）によってＡＰＩを自然に放出する。
【0050】
スキーム３は、本発明のテトラオキサン化合物のＦｅ（ＩＩ）活性化およびその後のβ－脱離を介する薬物送達のメカニズムを示し、式中、Ａは、テトラオキサンにカップリング可能な１つまたは複数のＡＰＩを表す。
【化7】
【0051】
化合物ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃおよびＩＩｄ中に存在するテトラオキサンと第一鉄源との反応は、シクロヘキサノン誘導体を生成し、これは、β－脱離によってＡＰＩを自然に放出する（スキーム３）。
【0052】
本発明の範囲内で、治療および／または診断の異なる目的のために単独でまたは組み合わせて使用することができるいくつかの適切なＡＰＩが存在し、それらのうちのいくつかを以下に述べる。
【0053】
このスキームでは、化合物ＩＩａおよびＩＩｂを、プリマキンおよびｂｏｃ－ピペラジンなどのマラリア原虫に対する１つまたは複数のＡＰＩとカップリングさせることができる。マラリアに対してこのシステムとカップリングするのに適した他の化合物は、以下のものおよびそれらの誘導体である：アトバコン、硫酸キニーネ、スルホンアミド（スルファドキシンおよびスルファメトキシピリダジン）およびファルシパイン阻害剤（ジペプチジルビニルスルホンおよびペプチド模倣ピリミジンニトリル）。
【0054】
化合物ＩＩｃおよびＩＩｄは、好ましくは、癌に対するＡＰＩであるドキソルビシンとカップリングすることができる。単独でまたは組み合わせて、癌に対してこのシステムとカップリングするのに適した他の化合物は、以下のものおよびそれらの誘導体である：アレクチニブ、アファチニブ、酢酸アビラテロン、アザシチジン、アキシチニブ、ベンダムスチン、ブリガチニブ、ボスチニブ、ビカルタミド、カリケアミシン、カペシタビン、カルフィルゾミブ、コンブレタスタチン、セリチニブ、クラドリビン、クロファラビン、コビメチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、シタラビン、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デュオカルマイシン、エナシデニブ、エピルビシン、メシル酸エリブリン、エルロチニブ、エベロリムス、エトポシド、エキサテカン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヘミアスタリン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（アベキシノスタット、ベリノスタット、エンチノスタット、ジビノスタット、モセチノスタット、オキサムフラチン、 パノビノスタット、ピロキサミド、キシノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、タセシナリン、ツシジノスタット、ツバスタチンＡ）、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イリノテカン、イキサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、メイタンシン、マイトマイシンＣ、モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡ－Ｅ、ＭＭＡ－Ｆ、ドラスタチン１０およびドラスタチノール）、メトトレキサート、ネラチニブ、ニロチニブ、ニラパリブ、オラパリブ、オクトレオチド、オシメルチニブ、パクリタキセル、パルボシクリブ、パゾパニブ、ピロロベンゾジアゼピン、ペメトレキセド、ポマリドミド、ポナチニブ、リボシクリブ、ルカパリブ、ソラフェニブ、タモキシフェン、トリアゼン、トリフルリジン、トポテカン、ツブリシン、バンデタニブ。
【0055】
腫瘍マーカーとしてこのシステムとカップリングするのに適した他の化合物としては、フルオロフォア、４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、シアニン、ジシアノメチン、ドキソルビシン、フルオレセイン、ニトロベンゾフラザン、ローダミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。
【0056】
３．１．第１の薬物送達システムの機構論的概念実証
Ｆｅ（ＩＩ）との反応後の１，２，４，５－テトラオキサン足場の活性化によって、炭素中心ラジカルが生成される。この反応メカニズムは、テトラオキサン環の２つの可能な酸素とのＦｅ（ＩＩ）配位に関与する。第１の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）の存在下で、炭素中心ラジカルおよびシクロヘキサノン誘導体を生成すると予想されるテトラオキサン足場を含有する。この誘導体は、β－脱離によってＡＰＩを自然に放出する。提案された薬物送達メカニズムを確認するために、化合物ＩＩｃを、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ． Ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１１， ５４， ６４４３に記載されるように、Ｆｅ（ＩＩ）の無機塩および２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）に曝露した。ＴＥＭＰＯをこの実験で使用して、薬物送達システムによる炭素中心ラジカルの形成を検証した。ＴＥＭＰＯは、この反応で生成されたラジカルと反応し、超高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ）による検出を可能にする。
Ｆｅ（ＩＩ）との反応後の１，２，４，５－テトラオキサン足場の活性化によって、炭素中心ラジカルが生成される。この反応メカニズムは、テトラオキサン環の２つの可能な酸素とのＦｅ（ＩＩ）配位に関与する。第１の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）の存在下で、炭素中心ラジカルおよびシクロヘキサノン誘導体を生成すると予想されるテトラオキサン足場を含有する。この誘導体は、β－脱離によってＡＰＩを自然に放出する。提案された薬物送達メカニズムを確認するために、化合物ＩＩｃを、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ． Ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１１， ５４， ６４４３に記載されるように、Ｆｅ（ＩＩ）の無機塩および２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシルラジカル（ＴＥＭＰＯ）に曝露した。ＴＥＭＰＯをこの実験で使用して、薬物送達システムによる炭素中心ラジカルの形成を検証した。ＴＥＭＰＯは、この反応で生成されたラジカルと反応し、超高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ）による検出を可能にする。
【0057】
Ｆｅ（ＩＩ）をトリガーとするテトラオキサン活性化および化合物ＩＩｃの断片化によって、炭素中心ラジカルの形成と一致するＵＨＰＬＣ－ＭＳによりＴＥＭＰＯ付加物が検出された（実施例３参照）。さらに、シクロヘキサノン誘導体およびドキソルビシンもまた、ＵＨＰＬＣ－ＭＳによって同定され（実施例３参照）、これによって、提案された薬物送達メカニズムによるＡＰＩ放出が確認される。
【0058】
４．本発明に開示される第２の薬物送達システムのメカニズム
上述の第１のシステムの特定の実施形態である代替的な第２の薬物送達システムもまた１，２，４，５－テトラオキサン足場を含み、これは、Ｆｅ（ＩＩ）との反応後にシクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する。この誘導体は、ＡＰＩを自然に放出しない。この誘導体は、グルタチオンとの反応（マイケル付加）後に脱離によるＡＰＩの放出を可能にするアルケン基を有する（スキーム４）。ＡＰＩ放出が、多くの種類の癌において上昇するＦｅ（ＩＩ）およびグルタチオンとの反応後にのみ起こることを考慮すると、これは、第１の薬物送達システムと比較して改善された選択性をもたらし得る。
上述の第１のシステムの特定の実施形態である代替的な第２の薬物送達システムもまた１，２，４，５－テトラオキサン足場を含み、これは、Ｆｅ（ＩＩ）との反応後にシクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する。この誘導体は、ＡＰＩを自然に放出しない。この誘導体は、グルタチオンとの反応（マイケル付加）後に脱離によるＡＰＩの放出を可能にするアルケン基を有する（スキーム４）。ＡＰＩ放出が、多くの種類の癌において上昇するＦｅ（ＩＩ）およびグルタチオンとの反応後にのみ起こることを考慮すると、これは、第１の薬物送達システムと比較して改善された選択性をもたらし得る。
【0059】
スキーム４は、Ｆｅ（ＩＩ）－活性化、グルタチオンのマイケル付加および本発明のテトラオキサン化合物の脱離を介する薬物送達のメカニズムを示し、式中、Ａはテトラオキサンにカップリングされ得るＡＰＩを表す。
【化8】
【0060】
化合物ＩＩｅ中に存在するテトラオキサンと第一鉄源との反応により、シクロヘキス－２－エノン誘導体が生成され、これは、グルタチオンとの反応後に脱離によってＡＰＩを放出する（スキーム４）。
【0061】
本発明の範囲内で、治療および／または診断の異なる目的のために単独でまたは組み合わせて使用することができるいくつかの適切なＡＰＩが存在し、それらのうちの一部を以下に述べる。
【0062】
このスキームにおいて、化合物ＩＩｅは、好ましくは、癌に対するＡＰＩであるドキソルビシンとカップリングされる。単独でまたは組み合わせて、癌に対してこのシステムとカップリングするのに適した他の化合物は、以下のものおよびそれらの誘導体である：アレクチニブ、アファチニブ、酢酸アビラテロン、アザシチジン、アキシチニブ、ベンダムスチン、ブリガチニブ、ボスチニブ、ビカルタミド、カリケアミシン、カペシタビン、カルフィルゾミブ、コンブレタスタチン、セリチニブ、クラドリビン、クロファラビン、コビメチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、シタラビン、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デュオカルマイシン、エナシデニブ、エピルビシン、メシル酸エリブリン、エルロチニブ、エベロリムス、エトポシド、エキサテカン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヘミアスタリン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（アベキシノスタット、ベリノスタット、エンチノスタット、ジビノスタット、モセチノスタット、オキサムフラチン、 パノビノスタット、ピロキサミド、キシノスタット、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、タセシナリン、ツシジノスタット、ツバスタチンＡ）、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イリノテカン、イキサベピロン、ラパチニブ、レナリドミド、メイタンシン、マイトマイシンＣ、モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡ－Ｅ、ＭＭＡ－Ｆ、ドラスタチン１０およびドラスタチノール）、メトトレキサート、ネラチニブ、ニロチニブ、ニラパリブ、オラパリブ、オクトレオチド、オシメルチニブ、パクリタキセル、パルボシクリブ、パゾパニブ、ピロロベンゾジアゼピン、ペメトレキセド、ポマリドミド、ポナチニブ、リボシクリブ、ルカパリブ、ソラフェニブ、タモキシフェン、トリアゼン、トリフルリジン、トポテカン、ツブリシン、バンデタニブ。
【0063】
腫瘍マーカーとしてこのシステムとカップリングするのに適した他の化合物としては、フルオロフォア４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、シアニン、ジシアノメチン、ドキソルビシン、フルオレセイン、ニトロベンゾフラザン、ローダミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。
【0064】
４．１．第２の薬物送達システムの機構論的概念実証
第１の薬物送達システムについて説明したように、第２の薬物送達システムの第一鉄源とのテトラオキサン反応もまた、テトラオキサン足場の２つの酸素とのＦｅ（ＩＩ）配位によって、炭素中心ラジカルを生成する。第２の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）による活性化によって、シクロヘキス－２－エノン誘導体を生成し、次いで、細胞内グルタチオンによるマイケル付加およびその後の脱離によるＡＰＩの放出を受ける。提案された薬物送達メカニズムの第１の工程を確認するために、化合物ＩＩｅを、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ． Ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１１， ５４， ６４４３に記載されるように、Ｆｅ（ＩＩ）の無機塩およびＴＥＭＰＯに曝露した。ＴＥＭＰＯをこの実験で使用して、薬物送達システムによる炭素中心ラジカルの形成を検証した。ＴＥＭＰＯは、この反応で生成されたラジカルと反応し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳによるそれらの検出を可能にする。さらに、この実験は、シクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する化合物ＩＩｅのテトラオキサン断片化を確認するために行われた。最後に、ドキソルビシンは、グルタチオンまたは類似の薬剤が存在しないため、これらの条件下で放出されず、したがって、シクロヘキス－２－エノン誘導体へのマイケル付加は起こり得ない。
第１の薬物送達システムについて説明したように、第２の薬物送達システムの第一鉄源とのテトラオキサン反応もまた、テトラオキサン足場の２つの酸素とのＦｅ（ＩＩ）配位によって、炭素中心ラジカルを生成する。第２の薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）による活性化によって、シクロヘキス－２－エノン誘導体を生成し、次いで、細胞内グルタチオンによるマイケル付加およびその後の脱離によるＡＰＩの放出を受ける。提案された薬物送達メカニズムの第１の工程を確認するために、化合物ＩＩｅを、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ． Ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１１， ５４， ６４４３に記載されるように、Ｆｅ（ＩＩ）の無機塩およびＴＥＭＰＯに曝露した。ＴＥＭＰＯをこの実験で使用して、薬物送達システムによる炭素中心ラジカルの形成を検証した。ＴＥＭＰＯは、この反応で生成されたラジカルと反応し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳによるそれらの検出を可能にする。さらに、この実験は、シクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する化合物ＩＩｅのテトラオキサン断片化を確認するために行われた。最後に、ドキソルビシンは、グルタチオンまたは類似の薬剤が存在しないため、これらの条件下で放出されず、したがって、シクロヘキス－２－エノン誘導体へのマイケル付加は起こり得ない。
【0065】
Ｆｅ（ＩＩ）をトリガーとするテトラオキサン活性化および化合物ＩＩｅの断片化によって、Ｆｅ（ＩＩ）との配位の２つの可能性について、炭素中心ラジカルの形成と一致する、ＵＨＰＬＣ－ＭＳによるＴＥＭＰＯ付加物が検出された（実施例４参照）。さらに、提案されたメカニズムに従って、ＵＨＰＬＣ－ＭＳによってシクロヘキス－２－エノン誘導体も同定された（実施例４参照）。最後に、この実験では、ドキソルビシンは検出されなかった。
【0066】
この薬物送達システムは、Ｆｅ（ＩＩ）による活性化後に細胞内グルタチオンによるマイケル付加およびその後のＡＰＩの放出を受けることができるシクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する。薬物送達のこのメカニズムを確認するために、化合物ＩＩｅを第一鉄源およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）と反応させて、チオール基（－ＳＨ）に依存するグルタチオンのマイケル付加をシミュレートした。この例では、この反応が起こることを確実にするため、チオール基が脱プロトン化（－Ｓ－）されるために８超のｐＨが必要である。
【0067】
Ｆｅ（ＩＩ）をトリガーとするテトラオキサン活性化および化合物ＩＩｅの断片化によって、ＵＨＰＬＣ－ＭＳにより炭素中心ラジカルが検出された（実施例４参照）。さらに、この薬物送達システムの活性化の第１の工程に従って、シクロヘキス－２－エノン誘導体も検出された（実施例４参照）。最後に、ドキソルビシンの放出が検出され（実施例４参照）、シクロヘキス－２－エノン誘導体へのＮＡＣのマイケル付加が起こったため、この薬物送達システムの作用機序が検証された。
【0068】
５．生物学的活性評価
本発明の化合物および対応する薬物送達システムの生物学的活性は、当業者による既知のプロセスに従って、異なるパラメータの測定によってアクセスすることができる。
本発明の化合物および対応する薬物送達システムの生物学的活性は、当業者による既知のプロセスに従って、異なるパラメータの測定によってアクセスすることができる。
【0069】
５．１．抗マラリア効果の評価
化合物ＩＩａおよびＩＩｂの抗マラリア活性は、クロロキンおよびメフロキン感受性である３Ｄ７株などのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株（実施例５参照）を前記化合物に曝露することによって、およびＭａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ． ２０１６， ２， １０１０に記載されるようなＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉアッセイを使用することによって、アクセスすることができる。
化合物ＩＩａおよびＩＩｂの抗マラリア活性は、クロロキンおよびメフロキン感受性である３Ｄ７株などのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株（実施例５参照）を前記化合物に曝露することによって、およびＭａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ． ２０１６， ２， １０１０に記載されるようなＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉアッセイを使用することによって、アクセスすることができる。
【0070】
非同期寄生虫を、各化合物の存在下で７２時間培養する。マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｒｉａｄ， Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて蛍光強度を測定した。化合物ＩＩａおよびＩＩｂは、マラリア原虫に対して活性であった（実施例５、表１参照）。
【0071】
５．２．抗腫瘍効果の評価
典型的には、癌細胞増殖に対する抗腫瘍効果は、Ｆｌｏｒｉｎｄｏ ｅｔ． ａｌ， Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ ２０１６，４５，１１９２６の記載に従って、評価される化合物に曝露された細胞培養物中の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することによって評価される。
典型的には、癌細胞増殖に対する抗腫瘍効果は、Ｆｌｏｒｉｎｄｏ ｅｔ． ａｌ， Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ ２０１６，４５，１１９２６の記載に従って、評価される化合物に曝露された細胞培養物中の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することによって評価される。
【0072】
ＩＣ５０値は、用量反応曲線によって、例えばＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア、続いて統計分析を使用することによって計算することができる。
【0073】
この目的のために、腫瘍細胞株を、適切な化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅならびに対応する薬物送達システムの濃度範囲に曝露し、７２時間後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）により細胞代謝活性を評価し、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して吸光度シグナルを記録する。化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅは、試験した全ての腫瘍細胞株において細胞死を誘導することができた（実施例６、表２参照）。さらに、化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅは、これらの化合物においてカップリングされる癌に対するＡＰＩであるドキソルビシンよりも効力が低かった。
【0074】
５．３．毒性における化合物の効果の評価
化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅならびにドキソルビシンを、非腫瘍性細胞株（ＡＭＬ１２）において試験して、本発明に記載の化合物の毒性を評価した。毒性は、この非腫瘍性細胞株における化合物のＩＣ５０を計算することによって測定することができる。アッセイの条件およびソフトウェアは、４つの腫瘍細胞株に対する化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅについて上記に記載されたものと同じであり得る。化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅは、ドキソルビシンに関連する毒性を改善することができた（実施例７参照）。
化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅならびにドキソルビシンを、非腫瘍性細胞株（ＡＭＬ１２）において試験して、本発明に記載の化合物の毒性を評価した。毒性は、この非腫瘍性細胞株における化合物のＩＣ５０を計算することによって測定することができる。アッセイの条件およびソフトウェアは、４つの腫瘍細胞株に対する化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅについて上記に記載されたものと同じであり得る。化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅは、ドキソルビシンに関連する毒性を改善することができた（実施例７参照）。
【0075】
５．４．鉄に依存する生物学的活性の評価
化合物ＩＩｄおよびＩＩｅを、Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ． ａｌ， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１６，５２，１３５８（実施例８参照）に記載されるように、結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）において、単独で、および鉄キレート剤であるメシル酸デスフェロキサミン（ＤＦＯ）と共にインキュベートした。細胞代謝活性は、抗腫瘍効果の評価について上述したように、ＭＴＳアッセイおよび吸光度シグナル検出を用いて再度決定することができる。ＩＣ５０計算および統計分析はまた、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２によって実施することもできる。
化合物ＩＩｄおよびＩＩｅを、Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ． ａｌ， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１６，５２，１３５８（実施例８参照）に記載されるように、結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）において、単独で、および鉄キレート剤であるメシル酸デスフェロキサミン（ＤＦＯ）と共にインキュベートした。細胞代謝活性は、抗腫瘍効果の評価について上述したように、ＭＴＳアッセイおよび吸光度シグナル検出を用いて再度決定することができる。ＩＣ５０計算および統計分析はまた、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２によって実施することもできる。
【0076】
化合物ＩＩｄによる細胞死の誘導は、この化合物の細胞毒性が鉄キレート剤ＤＦＯの存在下で減少したため、鉄に依存する（図１）。したがって、Ｆｅ（ＩＩ）の存在は、細胞における第１の薬物送達システムの活性に不可欠である。
【0077】
第２の薬物送達システムは、第１の薬物送達システムと比較して、選択性の追加要素としてアルケン基を含有する。化合物ＩＩｅは、鉄によって細胞内で活性化されるが、細胞毒性の主要な寄与因子は、細胞内グルタチオンによるマイケル付加に関連する。化合物ＩＩｅによる細胞死の誘導は、鉄キレート剤ＤＦＯの存在下で、この化合物の細胞毒性のわずかな減少を示した（図２）。したがって、この例では、Ｆｅ（ＩＩ）の存在は、細胞における第２の薬物送達システムを活性化する。この活性化により、アルケン基を含有するシクロヘキス－２－エノン誘導体が生成され、細胞内グルタチオンとの反応後にＡＰＩの放出が可能になり、これは実施例４にさらに記載される。
【0078】
５．５．腫瘍マーカーとしての式（ＩＩ）の化合物
腫瘍マーカーとしての本発明の薬物送達システムＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅの評価を、蛍光顕微鏡を用いて行い、それらの細胞局在を検出した。化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンを結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）中でインキュベートし、２４時間のインキュベーション後に、ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ Ｒ３カメラと連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡で画像を取得し、Ｚｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２ Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎで画像を分析した。化合物ＩＩｄは、ドキソルビシンと比較して、異なる細胞局在で存在した（実施例９および図３を参照）。
腫瘍マーカーとしての本発明の薬物送達システムＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅの評価を、蛍光顕微鏡を用いて行い、それらの細胞局在を検出した。化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンを結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）中でインキュベートし、２４時間のインキュベーション後に、ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ Ｒ３カメラと連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡で画像を取得し、Ｚｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２ Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎで画像を分析した。化合物ＩＩｄは、ドキソルビシンと比較して、異なる細胞局在で存在した（実施例９および図３を参照）。
【0079】
５．６．第１の薬物送達システムについてのインビボ検証
化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンを、異種移植マウスモデルにおいてＨＴ－２９細胞を使用して結腸直腸癌について試験した。処置中、腫瘍サイズを分析し、腫瘍体積および相対腫瘍体積を決定するために使用した。２０匹の免疫不全Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕマウスを４つの群に分けた：陰性対照、ビヒクル対照、化合物ＩＩｄおよびドキソルビシン。陰性対照群は、処置を受けなかった５匹のマウスからなる。ビヒクル対照群は、化合物ＩＩｄを溶解するために使用した溶媒を受けた５匹のマウスからなる。最後に、５匹のマウスを化合物ＩＩｄで処置し、５匹のマウスをドキソルビシンで処置した。化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンは、対照群と比較して、相対腫瘍質量の減少においてより効率的であった（図４）。相対腫瘍質量の減少は、ドキソルビシンで処置したマウスと比較して、化合物ＩＩｄで処置したマウスの方が高かった（図４）。
化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンを、異種移植マウスモデルにおいてＨＴ－２９細胞を使用して結腸直腸癌について試験した。処置中、腫瘍サイズを分析し、腫瘍体積および相対腫瘍体積を決定するために使用した。２０匹の免疫不全Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕマウスを４つの群に分けた：陰性対照、ビヒクル対照、化合物ＩＩｄおよびドキソルビシン。陰性対照群は、処置を受けなかった５匹のマウスからなる。ビヒクル対照群は、化合物ＩＩｄを溶解するために使用した溶媒を受けた５匹のマウスからなる。最後に、５匹のマウスを化合物ＩＩｄで処置し、５匹のマウスをドキソルビシンで処置した。化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンは、対照群と比較して、相対腫瘍質量の減少においてより効率的であった（図４）。相対腫瘍質量の減少は、ドキソルビシンで処置したマウスと比較して、化合物ＩＩｄで処置したマウスの方が高かった（図４）。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】図１は、結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）における以下の存在下での細胞死（Ｙ軸）の効果を示す：カラム＃３によって表される化合物ＩＩｄ単独、カラム＃４によって表される化合物ＩＩｄおよび鉄キレート剤（メシル酸デフェロキサミン－ＤＦＯ）、カラム＃２によって表されるＤＦＯ単独、およびカラム＃１によって表される対照化合物としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。Ｙ軸上に、（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－）２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）代謝アッセイによって決定された細胞生存率が示される。代謝活性のある細胞（生存している）はＭＴＳをホルマザンに代謝し、この分子を吸光度によって定量する。より多量のホルマザンは、化合物に曝露された場合に細胞が生存できることを意味し、より少量のホルマザンは、化合物が細胞死を誘導できることを意味する。 この図から、化合物ＩＩｄが細胞死を誘導し、化合物ＩＩｄとＤＦＯとの共処理が細胞死のより低い誘導を促進することが観察できる。したがって、化合物ＩＩｄによって与えられる細胞死は鉄依存性である。データは、未処理の対照（ＤＭＳＯ）に対する３回の独立した実験の平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。通常の一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定。対ＤＭＳＯ：δ ｐ＜０．０００１；対ＤＦＯを含まない化合物ＩＩｄ：＊＊ｐ＜０．０１。
【図2】図２は、結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）における以下の存在下での細胞死（Ｙ軸）の効果を示す：カラム＃３によって表される化合物ＩＩｅ単独、カラム＃４によって表される化合物ＩＩｅおよび鉄キレート剤（メシル酸デフェロキサミン－ＤＦＯ）、カラム＃２によって表されるＤＦＯ単独、およびカラム＃１によって表される対照化合物としてのＤＭＳＯ。Ｙ軸上に、（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）代謝アッセイによって決定された細胞生存率が示される。代謝活性のある細胞（生存している）はＭＴＳをホルマザンに代謝し、この分子を吸光度によって定量する。より多量のホルマザンは、化合物に曝露された場合に細胞が生存できることを意味し、より少量のホルマザンは、化合物が細胞死を誘導できることを意味する。 この図から、化合物ＩＩｅが細胞死を誘導し、化合物ＩＩｅとＤＦＯとの共処理が化合物ＩＩｅによる細胞死の誘導のわずかな減少を促進することが観察できる。したがって、化合物ＩＩｅによって与えられる細胞死は、鉄依存性であり得るが、これは、第一鉄（Ｆｅ（ＩＩ））が細胞内でこの化合物を活性化するからである。データは、未処理の対照（ＤＭＳＯ）に対して正規化した３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。通常の一元配置分散分析。対ＤＭＳＯ：δ ｐ＜０．０００１。
【図3】図３は、システムコントロール（ＤＭＳＯ）、ドキソルビシンおよび化合物ＩＩｄによる２４時間のインキュベーション後のＨＣＴ１１６細胞の画像を示す。４６０ｎｍ発光フィルター（青色チャネル）および５６０ｎｍ発光フィルター（赤色チャネル）を用いて蛍光発光を検出した。ヘキスト色素３３２５８は、細胞核を染色するために使用される蛍光染料であり、その蛍光発光は、青色チャネルによって検出することができる。ドキソルビシンは固有の蛍光を有し、その発光波長は赤色チャネルによって検出される。マージは、それぞれヘキスト色素３３２５８およびドキソルビシンによって与えられる青色および赤色チャネルによって検出される蛍光の重なりである。ＡＡはシステムコントロール（ＤＭＳＯ）および青色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＡＢはシステムコントロール（ＤＭＳＯ）および赤色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＡＣはシステムコントロール（ＤＭＳＯ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージを表し、ＡＤはシステムコントロール（ＤＭＳＯ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージについてのズームインフィールドを表し、ＢＡはドキソルビシン（１μＭ）および青色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＢＢはドキソルビシン（１μＭ）および赤色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＢＣはドキソルビシン（１μＭ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージを表し、ＢＤはドキソルビシン（１μＭ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージについてのズームインフィールドを表し、ＣＡは化合物ＩＩｄ（１μＭ）および青色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＣＢは化合物ＩＩｄ（１μＭ）および赤色チャネルにおける蛍光発光を表し、ＣＣは化合物ＩＩｄ（１μＭ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージを表し、ＣＤは化合物ＩＩｄ（１μＭ）および両方のチャネル（青色および赤色）からの蛍光発光のマージについてのズームインフィールドを表す。対物：６３倍。スケールバー＝５０μｍ。 これらの画像から、システムコントロール（ＤＭＳＯ）における蛍光は青色チャネルにのみ存在することが観察でき、これは核のみが検出できることを意味する（画像ＡＡ、ＡＣおよびＡＤ）。ドキソルビシンは、青色および赤色チャネルの蛍光の共局在化を通して核に蓄積することが観察できる（画像ＢＣおよびＢＤ）。一方、化合物ＩＩｄは、核の周りに蛍光を示す（画像ＣＣおよびＣＤ）。化合物ＩＩｄは固有の蛍光を有さないので、これは、化合物ＩＩｄが細胞質ゾル中で活性化され、そこで第一鉄（Ｆｅ（ＩＩ））レベルが上昇し、ドキソルビシンを放出することを意味する。
【図4】図４は、処置日数（Ｘ軸）の間に結腸直腸癌細胞（ＨＴ－２９）に以下を投与された４つの群のマウスについての相対腫瘍体積（Ｙ軸）を示す：塗りつぶしていない円で表される化合物ＩＩｄで処置されたマウス、および塗りつぶしていない正方形で表されるドキソルビシンで処置されたマウス。処置なしのマウス（陰性対照群）を塗りつぶしていない逆三角形で表し、投与のために化合物ＩＩｄを溶解する溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水中のクレモホールを投与されたマウス（ビヒクル対照）を塗りつぶした円で表す。Ｙ軸上に、各群のマウスについて、示された日の体積と処置開始時の体積との間の比によって決定された相対腫瘍体積をｍｍ３で示す。 この図から、陰性対照群およびビヒクル対照と比較した場合、化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンで処置したマウスの腫瘍塊の進行の減少を観察することが可能である。さらに、化合物ＩＩｄは、ドキソルビシンよりも腫瘍質量の低減においてより有効であった。混合効果分析（２元配置分散分析など）およびＴｕｋｅｙの多重比較検定。１２日目に、化合物ＩＩｄで処置したマウスは、ビヒクル対照に対して腫瘍体積の有意な減少を示した：＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0081】
実施例１．式Ｉの１，２，４，５－テトラオキサン化合物の合成
カルボニル（２－アダマンタノンまたは５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン）の存在下でのジヒドロペルオキシド（２）の環化縮合により、１，２，４，５－テトラオキサン足場（３）および（４）が生成された。４－ニトロフェニルクロロホルメートによる３位のアルコール活性化により、化合物（５）および（６）が生成された。最後に、化合物（５）および（６）とのＡＰＩカップリングにより、第１の薬物送達システムについて本発明に記載される４つの化合物（ＩＩａ～ＩＩｄ）が生成された。
カルボニル（２－アダマンタノンまたは５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン）の存在下でのジヒドロペルオキシド（２）の環化縮合により、１，２，４，５－テトラオキサン足場（３）および（４）が生成された。４－ニトロフェニルクロロホルメートによる３位のアルコール活性化により、化合物（５）および（６）が生成された。最後に、化合物（５）および（６）とのＡＰＩカップリングにより、第１の薬物送達システムについて本発明に記載される４つの化合物（ＩＩａ～ＩＩｄ）が生成された。
【0082】
カルボニル試薬、この場合は５－ヒドロキシ－２－アダマンタノンの存在下でのジヒドロペルオキシド（９）の環化縮合により、１，２，４，５－テトラオキサン足場（１０）が生成された。４－ニトロフェニルクロロホルメートによる化合物（１０）のアルコール活性化により、化合物（１１）が生成された。最後に、化合物（１１）とのＡＰＩカップリングにより、第２の薬物送達システムについて本発明に記載される化合物ＩＩｅが生成された。
【0083】
この目的のために、いくつかの中間化合物（１～６および８～１１）を下記の方法に従って生成した。
【0084】
１．１．化合物（１）の合成：ｒａｃ－３－ヒドロキシシクロヘキサノン
【化9】
【0085】
濃硫酸／水（１．７ｍＬ／１２ｍＬ）中の二クロム酸ナトリウム溶液（３．０１ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、ジエチルエーテル（１２ｍＬ）中の１，３－シクロヘキサンジオール（３．４５ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）溶液に滴下して添加した。添加完了後、反応物を２５℃で３．５時間撹拌させた。反応混合物を酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。溶離液としてヘキサン：酢酸エチル（２：８）を使用するフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、化合物１を無色油状物（１．３５ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）としておよび１，３－シクロヘキサンジオール（１．２６ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を単離した。
【0086】
収率：６３％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．１８～４．１０（ｍ，１Ｈ）、２．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．６０（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，４．２Ｈｚ，１Ｈ）、２．３７（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，７．５Ｈｚ，１Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．０９～１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．８０～１．５５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）２１０．４，６９．８，５０．５，４１．０，３２．８，２０．８；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋１１４．９（１２）。
【0087】
１．２．化合物（２）の合成：３，３－ジヒドロペルオキシシクロヘキサン－１－オール
【化10】
【0088】
２５ｍＬの丸底フラスコに、アセトニトリル（１０．５ｍＬ）中のｒａｃ－３－ヒドロキシシクロヘキサノン（０．２１９ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）および酸化レニウム（ＶＩＩ）（０．０４４ｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を入れた。次いで、５０％過酸化水素（０．４０ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、４０分間撹拌させた。混合物をシリカプラグを通して真空下で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶液を濃縮し、化合物２を無色油状物（０．３１３ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）として単離した。
【0089】
収率：１００％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）：δ（ｐｐｍ）δ９．９９（ｓ，１Ｈ）、９．６７（ｓ，１Ｈ）、３．９１～３．６３（ｍ，２Ｈ）、２．４６～２．３６（ｍ，１Ｈ）、２．１３～２．０７（ｍ，１Ｈ）、１．９１～１．８２（ｍ，１Ｈ）、１．６９～１．５９（ｍ，１Ｈ）、１．５３～１．１４（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）：δ（ｐｐｍ）１１０．７、６７．５、３９．６、３９．４、３５．６、２０．４；。
【0090】
１．３．化合物（３）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－オール
【化11】
【0091】
２５ｍＬの丸底フラスコに、不活性雰囲気下でジクロロメタン（５．７ｍＬ）中、２－アダマンタノン（０．４３３ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）、酸化レニウム（ＶＩＩ）（０．０２０ｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を入れた。次いで、アセトニトリル（５．７ｍＬ）中の３，３－ジヒドロペルオキシシクロヘキサン－１－オール（０．３１３ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を室温で添加し、４５分間撹拌した。混合物をシリカプラグを通して真空下で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶液を濃縮し、ヘキサン：酢酸エチル（７：３）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物３を白色固体（０．３１５ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）として単離した。
【0092】
収率：５６％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．５２～４．４５（ｍ，１Ｈ）、３．１１～３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．１６～１．６７（ｍ，２１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１１０．７、７３．２、４１．３、３７．０、３５．８、３３．８、３３．２、３１．０、２７．１、２５．９；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋２９７．２（１０）；［Ｍ－テトラオキサン開裂］＋１６７．０（１００）。
【0093】
１．４．化合物（４）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”，５－ジオール
【化12】
【0094】
化合物４の合成のために、出発物質として３，３－ジヒドロペルオキシシクロヘキサン－１－オール（０．１４１ｇ、０．８６１ｍｍｏｌ）を用いて同じ方法を使用した；しかしながら、２－アダマンタノンを５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（０．２１６ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）に置き換えた。ヘキサン：酢酸エチル（２：８）でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物４を白色固体（０．１４５ｇ、０．４６４ｍｍｏｌ）として単離した。
【0095】
収率：５４％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．６３～４．５９（ｍ，１Ｈ）、３．１８～３．１２（ｍ，１Ｈ）、２．５９～２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．１６～１．５０（ｍ，１８Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１０８．６、７４．６、６６．７、４３．７、４２．１、４１．５、３８．８、３４．７、３０．４、２９．９；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ－テトラオキサン開裂］＋１８３．０（１００）。元素分析：実測値：Ｃ，６１．４６；Ｈ、７．６０。Ｃ１６Ｈ２４Ｏ６は、Ｃ、６１．５２；Ｈ、７．７４を必要とする。
【0096】
１．５．化合物（５）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－ニトロフェニル）カーボネート
【化13】
【0097】
化合物３（０．１２０ｇ、０．４０４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．６ｍＬ）に溶解し、その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍＬ、１．２１ｍｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（０．０５２０ｇ、０．４２１ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。０℃で、４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．１６８ｇ、０．８１４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を不活性雰囲気下で１５分間、０℃～室温で１０分間および室温で２０分間撹拌させた。反応混合物をジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈し、５％重硫酸カリウム（１０ｍＬ）および炭酸水素ナトリウム飽和溶液（５×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後濾過し、濃縮した。ヘキサン：酢酸エチル（９：１）でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物５を白色固体（０．０４１６ｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）として単離した。
【0098】
収率：２２％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３９（ｄｄ，Ｊ＝６．９，２．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、３．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．１３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．２３～１．５７（ｍ，２０Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１５５．７、１５１．７、１４５．５、１２５．４、１２２．０、１１１．０、７５．６、３７．０、３３．２、３０．６、２７．１；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ－ＮＯ２］＋４１５．２（２０）。
【0099】
１．６．化合物（６）の合成：５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－ニトロフェニル）カーボネート
【化14】
【0100】
化合物６を同じ方法を用いて調製したが、出発物質は化合物４（０．１５１ｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）であった。ヘキサン：酢酸エチル（１：１）でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物６を白色固体（０．０９９６ｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）として単離した。
【0101】
収率：４３％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３６（ｄｄ，Ｊ＝６．９，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７６～４．６９（ｍ、１Ｈ）、３．３４～３．２６（ｍ、１Ｈ）、２．６８～１．７４（ｍ、２０Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１５５．４、１５０．０、１４５．５、１２５．４、１２１．９、８１．９、７３．９、４１．３、３９．８、３８．２、３４．７、３０．６、２９．９；。
【0102】
１．７．化合物（８）の合成：２－（ヒドロキシメチル）シクロヘキス－１－エン－１－オン
【化15】
【0103】
１０ｍＬ丸底フラスコに、水／メタノール（５：１；２：０．５ｍＬ）に溶解した水酸化バリウム八水和物（０．００７９ｇ、０．０２５０ｍｍｏｌ）を入れ、Ｎ－メチルピロリジン（５．５μＬ、０．０５２０ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ホルムアルデヒド（０．１２ｍＬ、１．５６ｍｍｏｌ）および化合物７（０．１０ｍＬ、１．０４ｍｍｏｌ）を前の溶液に連続的に添加し、反応物を０℃で２１時間撹拌させた。反応混合物を、ｐＨ＝３になるまで塩酸溶液（濃度：１ｍｏｌ／Ｌ）でクエンチした。次いで、炭酸水素ナトリウム飽和溶液をｐＨ約７まで添加し、得られた水相をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。溶離液としてヘキサン：酢酸エチル（４：６）を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物８を無色油状物（０．０７０６ｇ、０．５６０ｍｍｏｌ）として単離した。
【0104】
収率：５４％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）６．９３（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２４（ｑ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．４８～２．３５（ｍ，４Ｈ）、２．３２～２．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．０８～１．９５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）２００．６、１４７．９、１３８．２、６１．３、３８．２、２５．６、２２．７；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋１７（７５）。
【0105】
１．８．化合物（９）の合成：（６，６－ジヒドロペルオキシシクロヘキス－１－エン－１－イル）メタノール
【化16】
【0106】
２５ｍＬ丸底フラスコに、アセトニトリル（３．７ｍＬ）中の化合物８（０．０７７４ｇ、０．６１４ｍｍｏｌ）および酸化レニウム（ＶＩＩ）（０．０１７１ｇ、０．０３５３ｍｍｏｌ）を入れた。次いで、５０％過酸化水素（０．１４ｍＬ、２．４６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、５０分間撹拌させた。混合物をシリカプラグを通して真空下で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶液を濃縮し、化合物９を無色油状物（０．１０５ｇ、０．５９８ｍｍｏｌ）として単離した。
【0107】
収率：９７％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）：δ（ｐｐｍ）９．９７（ｓ，１Ｈ）、９．６５（ｓ，１Ｈ）、４．２６～４．１３（ｍ，１Ｈ）、４．０２～３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．７１～３．６２（ｍ，１Ｈ）、２．４９～１．２５（ｍ，２Ｈ）、２．０１～１．６２（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）：δ（ｐｐｍ）１４５．１、５９．５、３７．８、２６．１、２３．８。
【0108】
１．９．化合物（１０）の合成：２”－（ヒドロキシメチル）ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－２”－エン－５－オール
【化17】
【0109】
２５ｍＬの丸底フラスコに、不活性雰囲気下で、ジクロロメタン（４．０ｍＬ）中、５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（０．３３８ｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、酸化レニウム（ＶＩＩ）（０．０１６５ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を入れた。次いで、アセトニトリル（４．０ｍＬ）中の化合物９（０．２３４ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、１時間撹拌した。混合物をシリカプラグを通して真空下で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶液を濃縮し、ヘキサン：酢酸エチル（２：８）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１０を白色固体（０．１３２ｇ、０．４０６ｍｍｏｌ）として単離した。
【0110】
収率：３１％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．６８～４．５９（ｍ，１Ｈ）、３．２４～３．１５（ｍ，１Ｈ）、２．４９～２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．１６～１．６８（ｍ，１８Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋ＡＣＮ＋Ｈ］＋３６６（３０）、［Ｍ＋Ｎａ］＋３４７（３０）。
【0111】
１．１０．化合物（１１）の合成：５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－２”－エン－２”－イル）メチル（４－ニトロフェニル）カーボネート
【化18】
【0112】
化合物１０（０．１２６ｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５３ｍＬ）に溶解し、その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２０ｍＬ、１．１７ｍｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（０．０５１０ｇ、０．４１３ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。０℃で、４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．１６２ｇ、０．７８８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を不活性雰囲気下で１５分間、０℃～室温で１０分間および室温で３０分間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和溶液（５×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相をブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後濾過し、濃縮した。ヘキサン：酢酸エチル（１：１）でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物１１を白色固体（０．０５６５ｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）として単離した。
【0113】
収率：３０％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３６（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７６～４．６９（ｍ、１Ｈ）、３．３４～３．２６（ｍ、１Ｈ）、２．６６～１．７７（ｍ、２０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋ＡＣＮ＋Ｎａ］＋５５３（１５）、［Ｍ＋ＮＨ４］＋５０７（１００）。
【0114】
実施例２。本発明の化合物（ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄおよびＩＩｅ）の合成
２．１．化合物（ＩＩａ）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－（７－メトキシキノリン－５－イル）アミノ）ペンチル）カルバメート）
２．１．化合物（ＩＩａ）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（４－（７－メトキシキノリン－５－イル）アミノ）ペンチル）カルバメート）
【化19】
【0115】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．３４ｍＬ）中のプリマキン・ジホスフェート（０．０４２ｇ、０．０９２２ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（１２．０μＬ、０．０８６６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．０１２ｇ、０．０８８８ｍｍｏｌ）を先の溶液に添加し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．３４ｍＬ）中の化合物５（０．０２０５ｇ、０．０４４４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し続けた。次いで、ブライン（２０ｍＬ）を混合物に加え、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、蒸留水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を、溶離液としてヘキサン：酢酸エチル（７：３）を使用する分取薄層クロマトグラフィーによって精製した。化合物ＩＩａを単離した（０．０１４３ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）。
【0116】
収率：５５％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．５２（ｄｄ，Ｊ＝４．２，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，４．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．３２（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，２．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．００（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．７０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．８９（ｓ，３Ｈ）３．６２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．１８（ｂｒ ｓ，３Ｈ）、２．８１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．１５～１．６２（ｍ，２４Ｈ）、１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋５８２（１００）。
【0117】
２．２．化合物（ＩＩｂ）の合成：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）４－ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル）ピペラジン－１，４－ジカルボキシレート
【化20】
【0118】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２７ｍＬ）中のｂｏｃ－ピペラジン（０．０１４ｇ、０．０７５２ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（１０．０μＬ、０．０６８４ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．００９８ｇ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を先の溶液に添加し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２７ｍＬ）中の化合物５（０．０１５８ｇ、０．０３４２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し続けた。次いで、ブライン（２０ｍＬ）を混合物に加え、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、蒸留水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を、溶離液としてヘキサン：酢酸エチル（８：２）を使用する分取薄層クロマトグラフィーによって精製した。化合物ＩＩｂを単離した（０．００５７ｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）。
【0119】
収率：３３％；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．９１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．４１（ｍ，８Ｈ）、３．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．００～２．５６（ｍ，１Ｈ）、２．３１～１．５５（ｍ，２０Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）。
【0120】
２．３．化合物（ＩＩｃ）の合成：ジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（２Ｓ，４Ｓ）－４，５，１２－トリヒドロキシ－４－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバメート
【化21】
【0121】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．７６ｍＬ）中のドキソルビシン塩酸塩（０．１１２ｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（２７．０μＬ、０．１９３ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．０２７ｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を先の溶液に添加し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．７６ｍＬ）中の化合物５（０．０４４５ｇ、０．０９６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し続けた。次いで、ブライン（２０ｍＬ）を混合物に加え、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、蒸留水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を、溶離液としてジクロロメタン：メタノール４％を使用する分取薄層クロマトグラフィーにより精製した。化合物ＩＩｃと合致する赤色粉末を単離した（０．０５０ｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）。
【0122】
収率：６０％；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１３．９４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），１３．１８（ｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）５．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．１３～５．０４（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｓ，３Ｈ），４．５９～４．４６（ｍ，１Ｈ），４．１５－４．０９（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ）３．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．２８～２．８５（ｍ，４Ｈ），２．７７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．６８～２．３７（ｍ，１Ｈ），２．３６～２．２６（ｍ，１Ｈ）２．２４～２．０８（ｍ、２Ｈ）、２．０４～１．５７（ｍ、２１Ｈ）、１．２８（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）２１４．０、１８７．１、１８６．７、１６１．１、１５６．３、１５５．７、１５５．１、１３５．９、１３５．５、１３３．７、１２０．９、１１９．９、１１８．６、１１１．６、１１１．５、１１０．８、１１０．７、１００．９、７６．７６９．８，６９．６，６７．４，６５．７，５６．８，４７．０，３７．０，３５．８，３４．１，３３．２，３１．１，３１．０，３０．３，３０．２，２９．８，２７．１，１７．０；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｎａ］＋８８８（９０）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ－Ｈ］－Ｃ４４Ｈ５０ＮＯ１７の計算値：８６４．３０８４、実測値：８６４．３０６２。
【0123】
２．４．化合物（ＩＩｄ）の合成：５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－３”－イル（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（（２Ｓ，４Ｓ）－４，５，１２－トリヒドロキシ－４－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバメート
【化22】
【0124】
化合物ＩＩｄを同じ方法を用いて調製したが、出発物質は化合物６（０．０３１０ｇ、０．０６４９ｍｍｏｌ）であった。ジクロロメタン：メタノールでの分取薄層クロマトグラフィーによる精製により、４％の化合物ＩＩｄを赤色粉末として単離した（０．０４２９ｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）。
【0125】
収率：７５％；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）１３．９７（ｓ，１Ｈ），１３．２１（ｓ，１Ｈ），７．８９～７．８０（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，１Ｈ）５．１７（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．８４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．６６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）４．１１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、３．６２（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．４４～３．３７（ｍ，２Ｈ）、３．０２～２．８２（ｍ，４Ｈ）、２．７６～２．６０（ｍ，１Ｈ）、２．４５～１．５１（ｍ、１９Ｈ）、１．０９（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）２１３．９、１８６．５、１８６．４、１７６．７、１６０．８、１５６．１、１５４．５、１５４．１、１３６．２、１３５．５、１３４．６、１３４．１、１１９．９、１１９．７、１１９．０、１１０．８、１１０．６、１００．４、７５．９７５．０，７３．６，６９．８，６８．１，６６．７，６３．７，５６．６，４６．７，４０．９，３８．５，３６．５，３４．８，３４．７，３４．２，３２．１，２９．８，２９．７，２９．２，１７．０；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋２ＡＣＮ＋Ｈ］＋９６４（２５）、［Ｍ＋ＣＨ３ＯＨ＋Ｈ］＋９１４（４５）、［Ｍ＋Ｎａ］＋９０４（３０）；ＭＳ（ＥＳ－）：［Ｍ－Ｈ］－８８０（３５）、［Ｍ＋ＨＣＯＯＨ－Ｈ］－９２５（２０）。
【0126】
２．５．化合物（ＩＩｅ）の合成：５－ヒドロキシジスピロ［アダマンタン－２，３’－［１，２，４，５］テトラオキサン－６’，１”－シクロヘキサン］－２”－エン－２”－イル）メチル（３－ヒドロキシ－２－メチル－６－（（（１Ｒ，３Ｒ）－３，５，１２－トリヒドロキシ－３－（２－ヒドロキシアセチル）－１０－メトキシ－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－１－イル）オキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）カルバメート
【化23】
【0127】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）中のドキソルビシン塩酸塩（０．０７４３ｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（１８．０μＬ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．０１８３ｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を先の溶液に添加し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５０ｍＬ）中の化合物１１（０．０３１２ｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で７時間撹拌し続けた。次いで、ブライン（２０ｍＬ）を混合物に加え、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、蒸留水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を、溶離液としてジクロロメタン：メタノール４％を使用する分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により精製した。化合物ＩＩｅを赤色粉末として単離した（０．０４１５ｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）。
【0128】
収率：７３％；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）１３．９５（ｓ，１Ｈ），１３．２０（ｓ，１Ｈ），７．９０～７．７６（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３７（ｓ，１Ｈ）５．１６（ｓ、１Ｈ）、４．９１～４．８１（ｍ、２Ｈ）、４．７３～４．６１（ｍ、１Ｈ）、４．６０～４．４５（ｍ、４Ｈ）、４．１１（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．６２（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．３９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．０４～２．７５（ｍ，４Ｈ）、２．４０～１．５０（ｍ，２０Ｈ）、１．４１（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）、１．０９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δ（ｐｐｍ）２１３．９、１８６．５、１８６．４、１７６．７、１６０．８、１５６．１、１５４．５、１５４．１、１３６．２、１３５．５、１３４．６、１３４．０、１１９．９、１１９．７、１１９．０、１１０．７、１１０．６、１００．４、７５．９７５．０，７３．５，６９．８，６８．１，６６．７，６３．７，５６．６，４６．７，４０．９，３８．５，３６．５，３４．８，３４．７，３４．２，３２．１，２９．８，２９．７，２９．２，１７．０；ＭＳ（ＥＳ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋８９４（３５）、［Ｍ＋Ｎａ］＋９１６（７０）；ＭＳ（ＥＳ－）：［Ｍ－Ｈ］－８９２（４０）。
【0129】
実施例３－第１の薬物送達システムの機構論的概念実証
ジクロロメタン中の化合物ＩＩｃ（０．００９ｍｍｏｌ）の溶液を、不活性雰囲気下でシュレンク管に添加し、アセトニトリル中の臭化鉄（ＩＩ）（２当量）およびＴＥＭＰＯ（２当量）を充填した。反応物を室温で２４時間撹拌させた。反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、蒸留水（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。移動相は、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含有するミリポア水からなり、流速は０．３０ｍＬ ｍｉｎ－１であった。１０％Ｂで１分間、１０～９５％Ｂで５分間、および９５％Ｂで４分間からなる勾配溶出を適用し、最後に初期条件（１０％Ｂ）に５分間戻した。
ジクロロメタン中の化合物ＩＩｃ（０．００９ｍｍｏｌ）の溶液を、不活性雰囲気下でシュレンク管に添加し、アセトニトリル中の臭化鉄（ＩＩ）（２当量）およびＴＥＭＰＯ（２当量）を充填した。反応物を室温で２４時間撹拌させた。反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、蒸留水（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。移動相は、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含有するミリポア水からなり、流速は０．３０ｍＬ ｍｉｎ－１であった。１０％Ｂで１分間、１０～９５％Ｂで５分間、および９５％Ｂで４分間からなる勾配溶出を適用し、最後に初期条件（１０％Ｂ）に５分間戻した。
【0130】
Ｆｅ（ＩＩ）源およびＴＥＭＰＯを用いたテトラオキサン反応を化合物ＩＩｃについて行い、テトラオキサン断片化、およびより重要なことに、シクロヘキサノン誘導体の自発的β－脱離が起こり、ドキソルビシンが遊離することを確認した。
【0131】
この反応のＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｆｅ（ＩＩ）との配位の２つの可能性について、陽性モード（［Ｍ＋Ｈ］＋＝３２４）および陰性モード（［Ｍ－Ｈ］－＝３２２；［Ｍ－Ｈ］－＝８５５および［Ｍ＋ＣＮ－Ｈ］－＝８８１）で２つのＴＥＭＰＯ付加物を検出し、これは、炭素中心ラジカルの形成によるテトラオキサン断片化を確認する（スキーム５）。さらに、提案されたメカニズムに従って、２－アダマンタノン（［Ｍ＋Ｋ］＋＝１８９）およびシクロヘキサノン誘導体（［Ｍ－Ｈ］－＝６８２）も同定された。重要なことに、ドキソルビシンも検出され（［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４４；［Ｍ－Ｈ］－＝５４２）、シクロヘキサノン誘導体のβ－脱離によるＡＰＩ放出が確認された（スキーム６）。
【0132】
スキーム５は、ＴＥＭＰＯ付加物を生成する化合物ＩＩｃのＦｅ（ＩＩ）活性化およびＴＥＭＰＯ反応を示す。
【化24】
【0133】
スキーム６は、シクロヘキサノン誘導体による化合物ＩＩｃ活性化およびドキソルビシン放出を示す。
【化25】
【0134】
実施例４－第２の薬物送達システムの機構論的概念実証
第２の薬物送達システムの第一鉄活性化およびＴＥＭＰＯ捕捉を検証するために、以下のプロトコルを実施した。ジクロロメタン中の化合物ＩＩｅ（０．００７７ｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の溶液を、不活性雰囲気下でシュレンク管に添加し、テトラヒドロフラン中の臭化鉄（ＩＩ）（２当量）およびＴＥＭＰＯ（２当量）を充填した。反応物を室温で２４時間撹拌させた。反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、蒸留水（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。移動相は、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含有するミリポア水からなり、流速は０．３０ｍＬ ｍｉｎ－１であった。３０％Ｂで１分間、３０～９５％Ｂで５分間、および９５％Ｂで４分間からなる勾配溶出を適用し、最後に初期条件（３０％Ｂ）に５分間戻した。
第２の薬物送達システムの第一鉄活性化およびＴＥＭＰＯ捕捉を検証するために、以下のプロトコルを実施した。ジクロロメタン中の化合物ＩＩｅ（０．００７７ｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の溶液を、不活性雰囲気下でシュレンク管に添加し、テトラヒドロフラン中の臭化鉄（ＩＩ）（２当量）およびＴＥＭＰＯ（２当量）を充填した。反応物を室温で２４時間撹拌させた。反応混合物を酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、蒸留水（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。移動相は、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含有するミリポア水からなり、流速は０．３０ｍＬ ｍｉｎ－１であった。３０％Ｂで１分間、３０～９５％Ｂで５分間、および９５％Ｂで４分間からなる勾配溶出を適用し、最後に初期条件（３０％Ｂ）に５分間戻した。
【0135】
第２の薬物送達システムの第一鉄活性化およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）マイケル添加を検証するために、以下のプロトコルを実施した。テトラヒドロフラン中の化合物ＩＩｅの１０ｍＭストック溶液２５０μＬをシュレンク管に添加し、不活性雰囲気下で、２５０μＬのミリポア水中の臭化鉄（ＩＩ）（２当量）およびＮＡＣ（１．５当量）を充填した。次いで、１００μＬの水酸化ナトリウム（濃度６．２５ｍｏｌ／Ｌ）を添加して、塩基性ｐＨを確保した。反応物を室温で２４時間撹拌させた。反応混合物を蒸留水（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出した。水性画分を塩酸（濃度：１ｍｏｌ／Ｌ）で酸性化し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。水相を水酸化ナトリウム（濃度：６．２５ｍｏｌ／Ｌ）で中和し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＵＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した。移動相は、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を含有するミリポア水からなり、流速は０．３０ｍＬ ｍｉｎ－１であった。３０％Ｂで１分間、３０～９５％Ｂで５分間、および９５％Ｂで４分間からなる勾配溶出を適用し、最後に初期条件（３０％Ｂ）に５分間戻した。
【0136】
化合物ＩＩｅは、鉄源およびＴＥＭＰＯ捕捉と反応し、テトラオキサン断片化を確認し、より重要なことに、これらの条件下でドキソルビシンは放出されなかった。
【0137】
この反応のＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、Ｆｅ（ＩＩ）との配位の２つの可能性について、陽性モードで２つのＴＥＭＰＯ付加物（［Ｍ＋Ｈ］＋＝３４０；［Ｍ＋Ｋ］＋＝９０７）を検出し、これは、炭素中心ラジカルの形成を伴うテトラオキサンフラグメンテーションを確認する（スキーム７）。
【0138】
スキーム７は、ＴＥＭＰＯ付加物を生成する化合物ＩＩｅのＦｅ（ＩＩ）活性化およびＴＥＭＰＯ捕捉を示す。
【化26】
【0139】
さらに、提案されたメカニズムに従って、５－ヒドロキシ－２－アダマンタノン（［Ｍ＋ＮＨ４］＋＝１８４；［Ｍ＋ＤＭＳＯ＋Ｈ］＋＝２４５）およびシクロヘキス－２－エノン誘導体（［Ｍ＋Ｋ］＋＝７３４；［Ｍ＋ＤＭＳＯ＋Ｈ］＋＝７７４）も同定された（スキーム７および８）。最後に、この実験では、ドキソルビシンは検出されなかった。
【0140】
スキーム８は、シクロヘキス－２－エノン誘導体を生成する化合物ＩＩｅのＦｅ（ＩＩ）活性化を示す。試薬および条件：（ｉ）臭化鉄（ＩＩ）、ＴＥＭＰＯ、テトラヒドロフラン。
【化27】
【0141】
化合物ＩＩｅをＦｅ（ＩＩ）源およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）と反応させて、第２の薬物送達システムのメカニズムを確認した。この反応のＵＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、陽性モード（［Ｍ＋Ｈ］＋＝７１３および［Ｍ＋Ｎａ］＋＝７３５）で１つの炭素中心ラジカル（スキーム９）を検出し、Ｆｅ（ＩＩ）との反応時のテトラオキサン断片化を確認した。
【0142】
スキーム９は、炭素中心ラジカルを生成する化合物ＩＩｅのＦｅ（ＩＩ）活性化を示す。
【化28】
【0143】
さらに、第２の薬物送達システムの活性化の第１の工程に従って、シクロヘキス－２－エノン誘導体（［Ｍ＋Ｎａ］＋＝７１８および［Ｍ＋Ｋ］＋＝７３４）もまた検出された。最後に、ドキソルビシンの放出が検出され、シクロヘキス－２－エノン誘導体へのＮＡＣのマイケル付加が起こったため、第２の薬物送達システムの作用メカニズムが検証された（スキーム１０）。
【0144】
スキーム１０は、ドキソルビシンの検出後に検証された化合物ＩＩｅの薬物送達のメカニズムを示す。
【化29】
【0145】
実施例５。マラリアに対する式ＩＩの化合物の生物学的活性の評価
試料の調製
化合物を、ＡｌｂｕＭＡＸＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充したＬ－グルタミン（Ｂｉｏｗｅｓｔ（商標））を含むＲＰＭＩ－１６４０に溶解し、本明細書では以下ＲＰＭＩｃと称し、１００μＭの中間体溶液を得た。
試料の調製
化合物を、ＡｌｂｕＭＡＸＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充したＬ－グルタミン（Ｂｉｏｗｅｓｔ（商標））を含むＲＰＭＩ－１６４０に溶解し、本明細書では以下ＲＰＭＩｃと称し、１００μＭの中間体溶液を得た。
【0146】
熱帯熱マラリア原虫インビトロ培養
クロロキンおよびメフロキン感受性株である実験室適応の熱帯熱マラリア原虫株３Ｄ７を、他の箇所に記載されるように連続的に培養した（Ｍａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２０１６，２，１０１０）。寄生虫を５％ヘマトクリット、３７℃および５％のＣＯ２を含む雰囲気中で培養した。０．５％のＡｌｂｕＭＡＸＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を、培養培地中のヒト血清の代替物として使用した。
クロロキンおよびメフロキン感受性株である実験室適応の熱帯熱マラリア原虫株３Ｄ７を、他の箇所に記載されるように連続的に培養した（Ｍａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２０１６，２，１０１０）。寄生虫を５％ヘマトクリット、３７℃および５％のＣＯ２を含む雰囲気中で培養した。０．５％のＡｌｂｕＭＡＸＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を、培養培地中のヒト血清の代替物として使用した。
【0147】
抗マラリア活性を全細胞ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩアッセイを使用して特定した
ステージングおよび寄生虫血症を、ギムザ染色薄血液塗抹標本の光学顕微鏡検査によって特定した。抗マラリア活性を、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩアッセイを使用して決定した（Ｍａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２０１６，２，１０１０およびＬｏｂｏ ｅｔ．ａｌ，Ｍａｌａｒ．Ｊ．２０１８，１７，１）。簡潔には、非同期寄生虫を、各化合物の１：３連続希釈の存在下で７２時間培養した。蛍光強度をマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｒｉａｄ，Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、それぞれ４８５および５３５ｎｍの励起および発光波長で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰により分析してＩＣ５０値を決定した。
ステージングおよび寄生虫血症を、ギムザ染色薄血液塗抹標本の光学顕微鏡検査によって特定した。抗マラリア活性を、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩアッセイを使用して決定した（Ｍａｃｈａｄｏ ｅｔ． ａｌ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２０１６，２，１０１０およびＬｏｂｏ ｅｔ．ａｌ，Ｍａｌａｒ．Ｊ．２０１８，１７，１）。簡潔には、非同期寄生虫を、各化合物の１：３連続希釈の存在下で７２時間培養した。蛍光強度をマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｒｉａｄ，Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、それぞれ４８５および５３５ｎｍの励起および発光波長で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰により分析してＩＣ５０値を決定した。
【0148】
化合物ＩＩａおよびＩＩｂは、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン感受性３Ｄ７株に対して強力であった。化合物ＩＩａおよびＩＩｂは、それぞれ３２．８２ｎＭおよび１１．３８ｎＭのＩＣ５０を有する（表１）。両方の化合物は、臨床で使用される抗マラリア薬であるクロロキン（ＣＱ）と同程度に強力であった（表１）。
【表1】
【0149】
実施例６。癌治療における式ＩＩの化合物の生物学的活性の評価
ＰＣ３ヒト前立腺癌、ＭＣＦ７ヒト乳腺癌、ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌およびＵ２５１ヒト膠芽腫を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。
ＰＣ３ヒト前立腺癌、ＭＣＦ７ヒト乳腺癌、ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌およびＵ２５１ヒト膠芽腫を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。
【0150】
細胞株を、全て１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）抗生物質／抗真菌剤溶液（全てＧｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を補充した、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０（ＰＣ３）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＭＣＦ７およびＵ２５１）、マッコイ５Ａ（ＨＣＴ１１６）中で接着条件下で培養した。さらに、ＭＣＦ７培地に１％（ｖ／ｖ）グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）を補充し；Ｕ２５１に１％（ｖ／ｖ）グルタマックスおよび１％（ｖ／ｖ）４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（いずれもＧｉｂｃｏから）を補充した。全ての細胞株を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で培養した（ＨｅｒａＣｅｌｌ １５０ｉ ＣＯ２インキュベーター、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【0151】
化合物の阻害能力を定量的に評価するために、半数阻害濃度（ＩＣ５０）を用量反応曲線によって特定した。細胞株を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングし、２４時間後、細胞を化合物ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅ、ドキソルビシン、化合物３および化合物１０（１．５×１０－３ρＭ～１ｍＭの範囲の濃度）で処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞代謝活性をＭＴＳ代謝の測定によって評価した。生存細胞（代謝的に活性な細胞）はＭＴＳをホルマザンに代謝し、この分子を吸光度によって定量する。ホルマザンの量が多いほど、化合物への曝露後に生存する細胞が多くなり、ホルマザンの量が少ないほど、代謝的に活性でない細胞が多くなる。
【0152】
全てのアッセイについて、細胞代謝活性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定し、吸光度シグナルをＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ５０決定およびすべての統計分析を行った。全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして表される。シャピロ・ウィルク検定、一元配置分散分析またはクラスカル・ウォリス検定で評価した値分布の正規性に従って、次いでボンフェローニまたはダン多重比較検定を使用して、試料群間の差異を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【0153】
全ての化合物を、単独で、および適切な用量で、癌細胞株のパネルで試験し、結果を表２に示す。
【0154】
表２から観察することができるように、化合物ＩＩｃは、サブマイクロモル範囲であったＵ２５１細胞株を除いて、マイクロモル範囲の全ての細胞株において強力であった。さらに、化合物ＩＩｃは、ドキソルビシン単独よりも効力が低かった。
【0155】
化合物ＩＩｄもまた、以前に使用された癌細胞株（Ｕ２５１、ＰＣ３、ＭＣＦ７およびＨＣＴ１１６）で試験された。親油性の点での違いにもかかわらず、化合物ＩＩｄもまた、マイクロモル範囲で強力であり、ドキソルビシンよりも強力ではなかった。
【0156】
化合物（３）を対照として試験して、癌細胞に対する化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの効力が化合物（３）にカップリングしたＡＰＩに依存することを実証した。化合物（３）は化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの中心構造を表すので、この化合物を選択した。
【0157】
化合物（３）は、試験した細胞株に対して活性ではなかった。これらの結果は、化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの効力が、テトラオキサン構造ではなく、システム中でカップリングしたＡＰＩに依存することを示す。
【0158】
化合物ＩＩｅは、全ての癌細胞株においてマイクロモル範囲で強力であった。化合物ＩＩｅは、評価した全ての癌細胞株においてドキソルビシンよりも効力が低かった。
【0159】
化合物（１０）を対照として試験して、癌細胞に対する化合物ＩＩｅの効力が化合物（１０）にカップリングしたＡＰＩに依存することを実証した。化合物１０は化合物ＩＩｅの中心構造を表すので、この化合物を選択した。
【0160】
化合物（１０）は、試験した全ての細胞株において活性ではなかった（表２）。したがって、これらの結果は、テトラオキサン足場が細胞毒性を有さず、化合物ＩＩｅの活性の寄与因子がシステムにカップリングされたＡＰＩ、この場合はドキソルビシンであることを証明している。
【表2】
【0161】
実施例７。非腫瘍細胞に対する毒性における式ＩＩの化合物の効果の評価
ドキソルビシンの毒性効果を評価するために、化合物ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅおよびドキソルビシンを非腫瘍性細胞株（ＡＭＬ１２）で試験し、結果を表３に示す。ＡＭＬ１２マウス不死化肝細胞株を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，ＵＫ）から入手した。ＡＭＬ１２細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）インスリン－トランスフェリン－セレン（Ｇｉｂｃｏ）および４０ｎｇ／ｍＬのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充したＤＭＥＭ／栄養混合物Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で接着条件下で培養した。この細胞株を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で培養した（ＨｅｒａＣｅｌｌ １５０ｉ ＣＯ２インキュベーター、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＡＭＬ１２細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングし、２４時間後、細胞を化合物ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅおよびドキソルビシン（１．５×１０－３ρＭ～１ｍＭの範囲の濃度）で処理した。細胞代謝活性を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して７２時間後に測定し、吸光度シグナルをＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ５０決定およびすべての統計分析を行った。全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして表される。シャピロ・ウィルク検定、一元配置分散分析またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでボンフェローニまたはダン多重比較検定で評価した値分布の正規性に従って、試料群間の差異を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
ドキソルビシンの毒性効果を評価するために、化合物ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅおよびドキソルビシンを非腫瘍性細胞株（ＡＭＬ１２）で試験し、結果を表３に示す。ＡＭＬ１２マウス不死化肝細胞株を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，ＵＫ）から入手した。ＡＭＬ１２細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）インスリン－トランスフェリン－セレン（Ｇｉｂｃｏ）および４０ｎｇ／ｍＬのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充したＤＭＥＭ／栄養混合物Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で接着条件下で培養した。この細胞株を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で培養した（ＨｅｒａＣｅｌｌ １５０ｉ ＣＯ２インキュベーター、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＡＭＬ１２細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングし、２４時間後、細胞を化合物ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅおよびドキソルビシン（１．５×１０－３ρＭ～１ｍＭの範囲の濃度）で処理した。細胞代謝活性を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して７２時間後に測定し、吸光度シグナルをＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ５０決定およびすべての統計分析を行った。全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして表される。シャピロ・ウィルク検定、一元配置分散分析またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、次いでボンフェローニまたはダン多重比較検定で評価した値分布の正規性に従って、試料群間の差異を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【0162】
表３から、化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの両方がドキソルビシンより低い毒性を誘導できたことが観察できる。興味深いことに、化合物ＩＩｃは、ドキソルビシンと比較した場合、１０倍毒性が低かった。しかしながら、ＡＭＬ１２細胞は化合物ＩＩｄに対して高度に耐性であり、ＩＣ５０比は４２９４であった。
【0163】
結論として、本発明による第１の薬物送達システムは、ドキソルビシンの毒性を低減することができる。
【0164】
表３から、化合物ＩＩｅは非腫瘍性細胞においてドキソルビシンよりも毒性が低いことが観察できる。興味深いことに、化合物ＩＩｅは、ドキソルビシンと比較した場合、１８０倍毒性が低かった。したがって、第２の薬物送達システムは、ドキソルビシンに関連する毒性を低減することができる。
【表3】
【0165】
実施例８。鉄に依存する生物学的活性の評価
鉄競合アッセイのために、ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭのＤＦＯ（図１のカラム＃２）、１０μＭの化合物ＩＩｄ（図１のカラム＃３）、および１０μＭの化合物ＩＩｄと１μＭのＤＦＯ（図１のカラム＃４）とともに、インキュベートした。さらに、ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭのＤＦＯ（図２のカラム＃２）、１０μＭの化合物ＩＩｅ（図２のカラム＃３）および１０μＭの化合物ＩＩｅと１μＭのＤＦＯ（図２のカラム＃４）とともに、インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞代謝活性を測定した。細胞代謝活性を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定し、吸光度シグナルをＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ５０決定およびすべての統計分析を実施した。全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして表される。シャピロ・ウィルク検定、一元配置分散分析またはクラスカル・ウォリス検定、次いでボンフェローニまたはダン多重比較検定で評価した値分布の正規性に従って、試料群間の差異を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
鉄競合アッセイのために、ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭのＤＦＯ（図１のカラム＃２）、１０μＭの化合物ＩＩｄ（図１のカラム＃３）、および１０μＭの化合物ＩＩｄと１μＭのＤＦＯ（図１のカラム＃４）とともに、インキュベートした。さらに、ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭのＤＦＯ（図２のカラム＃２）、１０μＭの化合物ＩＩｅ（図２のカラム＃３）および１０μＭの化合物ＩＩｅと１μＭのＤＦＯ（図２のカラム＃４）とともに、インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞代謝活性を測定した。細胞代謝活性を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定し、吸光度シグナルをＧｌｏＭａｘ（登録商標）－ＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．２ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＩＣ５０決定およびすべての統計分析を実施した。全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均値±ＳＥＭとして表される。シャピロ・ウィルク検定、一元配置分散分析またはクラスカル・ウォリス検定、次いでボンフェローニまたはダン多重比較検定で評価した値分布の正規性に従って、試料群間の差異を評価した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【0166】
化合物ＩＩｄを、ＨＣＴ１１６細胞中で第一鉄キレート剤（メシル酸デフェロキサミン－ＤＦＯ）と共にインキュベートした。化合物ＩＩｄ単独（図１のカラム＃３）と比較した場合、化合物ＩＩｄの効力の有意な減少が検出された（図１のカラム＃４）。したがって、化合物ＩＩｄによる細胞死は鉄依存性である。化合物ＩＩｅを、ＨＣＴ１１６細胞中で鉄キレート剤ＤＦＯと共にインキュベートした。化合物ＩＩｅ単独（図２のカラム＃３）と比較した場合、化合物ＩＩｅの効力のわずかな低下（７％）が検出された（図２のカラム＃４）。おそらく、化合物ＩＩｅは、記載されるようにＦｅ（ＩＩ）によって活性化されるが、細胞毒性の主要な寄与因子は、シクロヘキス－２－エノン誘導体とグルタチオンとの反応（マイケル付加）に関連し、脱離によるＡＰＩの放出を可能にする（実施例４参照）。シクロヘキス－２－エノン誘導体は、Ｆｅ（ＩＩ）によるテトラオキサン活性化後にのみ利用可能になるアルケン基を有し、これは、第１の薬物送達システムと比較して選択性を改善することを可能にする。
【0167】
実施例９。腫瘍マーカーとしての式ＩＩの化合物の生物学的活性の評価
量子収率の決定
紫外線（ＵＶ）スペクトルをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１ ＵＶ－可視分光光度計で追跡した。ＳＨＩＭＡＤＺＵ Ｓｐｅｃｔｒｏ蛍光光度計ＲＦ－６０００機器で蛍光測定を行った。蛍光量子収率は、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中のフルオレセインを標準として測定した（Φｆ＝０．９５）。すべての溶媒は分析試薬グレードであり、Ａｌｆａ ＡｃｅｒまたはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ドキソルビシンは蛍光特性を有する。３０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水中の化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびドキソルビシンの希釈溶液を調製した。ドキソルビシンの量子収率は２．８％であり、化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの量子収率は１％未満であった。
量子収率の決定
紫外線（ＵＶ）スペクトルをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１ ＵＶ－可視分光光度計で追跡した。ＳＨＩＭＡＤＺＵ Ｓｐｅｃｔｒｏ蛍光光度計ＲＦ－６０００機器で蛍光測定を行った。蛍光量子収率は、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中のフルオレセインを標準として測定した（Φｆ＝０．９５）。すべての溶媒は分析試薬グレードであり、Ａｌｆａ ＡｃｅｒまたはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ドキソルビシンは蛍光特性を有する。３０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水中の化合物ＩＩｃ、ＩＩｄおよびドキソルビシンの希釈溶液を調製した。ドキソルビシンの量子収率は２．８％であり、化合物ＩＩｃおよびＩＩｄの量子収率は１％未満であった。
【0168】
化合物細胞局在化のための蛍光イメージング
ＨＣＴ１１６細胞を、ガラスカバースリップ上で２．５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で３５ｍｍ皿にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、細胞をシステムコントロール（ＤＭＳＯ）または１μＭの化合物ＩＩｄまたはドキソルビシンとともにさらに２４時間インキュベートした。細胞を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で穏やかに洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、ｐＨ７．４、室温で固定した。固定した細胞をヘキスト色素３３２５８（５μｇ／ｍＬ）と共に暗所で１０分間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、７μＬのＭｏｗｉｏｌ（登録商標）を含むガラススライドにマウントした。画像を、ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ Ｒ３カメラと連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡で取得し、Ｚｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２ Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， ＧｍｂＨ）で画像を分析した。
ＨＣＴ１１６細胞を、ガラスカバースリップ上で２．５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で３５ｍｍ皿にプレーティングした。プレーティングの２４時間後、細胞をシステムコントロール（ＤＭＳＯ）または１μＭの化合物ＩＩｄまたはドキソルビシンとともにさらに２４時間インキュベートした。細胞を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で穏やかに洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、ｐＨ７．４、室温で固定した。固定した細胞をヘキスト色素３３２５８（５μｇ／ｍＬ）と共に暗所で１０分間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、７μＬのＭｏｗｉｏｌ（登録商標）を含むガラススライドにマウントした。画像を、ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲ Ｒ３カメラと連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡で取得し、Ｚｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２ Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， ＧｍｂＨ）で画像を分析した。
【0169】
ドキソルビシンの光ルミネセンス特性は、式ＩＩの薬物送達システムにおいて消失される（量子収率１％未満）。したがって、次に本発明者らは、細胞における化合物ＩＩｄの細胞局在を調査した。興味深いことに、ＨＣＴ１１６細胞における蛍光イメージングは、２４時間のインキュベーション後、ドキソルビシンが核に蓄積する一方（図３ＢＣおよびＢＤ）、化合物ＩＩｄは活性化され、不安定な鉄プールが上昇する脂肪質においてドキソルビシンを放出した（図３ＣＣおよびＣＤ）ことを示した。
【0170】
実施例１０－第１の薬物送達システムのインビボ検証
化合物ＩＩｄの抗腫瘍効果を異種移植マウスモデルにおいて試験した。免疫不全状態のＦｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕマウスは、右側腹部にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液（１００μＬ）に懸濁した結腸直腸癌細胞株（２×１０６ＨＴ－２９細胞）の皮下注射を受けた。腫瘍塊が触知可能になったとき、治療を開始した。群あたり５匹のマウスを有する４つの群を確立した：陰性対照群－いかなる治療も受けなかったマウス；ビヒクル対照－クレモホールをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（化合物ＩＩｄを可溶化するために使用した溶媒）中に投与したマウス；ＩＩｄ－試験中の化合物を投与されたマウス；ドキソルビシン－ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液に可溶化されたドキソルビシンを投与したマウス。全ての試験製剤を、２ｍｇ／ｋｇ体重の治療用量で合計８回の注射で尾静脈に静脈内投与した。マウスに投与される用量は、化合物の質量と動物の体重との間の比によって確立された。腫瘍サイズは、デジタルキャリパーを用いて定期的にモニタリングした。それぞれの腫瘍体積を以下の式に従って計算した：Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ２）／２、式中、ＬおよびＷはそれぞれ腫瘍の最長軸および最短軸を表す。各動物について相対腫瘍体積も決定した：指定日の体積と治療開始時の体積との比。体重も定期的に評価した。
化合物ＩＩｄの抗腫瘍効果を異種移植マウスモデルにおいて試験した。免疫不全状態のＦｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕマウスは、右側腹部にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液（１００μＬ）に懸濁した結腸直腸癌細胞株（２×１０６ＨＴ－２９細胞）の皮下注射を受けた。腫瘍塊が触知可能になったとき、治療を開始した。群あたり５匹のマウスを有する４つの群を確立した：陰性対照群－いかなる治療も受けなかったマウス；ビヒクル対照－クレモホールをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液（化合物ＩＩｄを可溶化するために使用した溶媒）中に投与したマウス；ＩＩｄ－試験中の化合物を投与されたマウス；ドキソルビシン－ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液に可溶化されたドキソルビシンを投与したマウス。全ての試験製剤を、２ｍｇ／ｋｇ体重の治療用量で合計８回の注射で尾静脈に静脈内投与した。マウスに投与される用量は、化合物の質量と動物の体重との間の比によって確立された。腫瘍サイズは、デジタルキャリパーを用いて定期的にモニタリングした。それぞれの腫瘍体積を以下の式に従って計算した：Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ２）／２、式中、ＬおよびＷはそれぞれ腫瘍の最長軸および最短軸を表す。各動物について相対腫瘍体積も決定した：指定日の体積と治療開始時の体積との比。体重も定期的に評価した。
【0171】
化合物ＩＩｄおよびドキソルビシンで治療したマウスは、陰性対照群およびビヒクル対照と比較して、腫瘍質量がより減少した（図４）。また、腫瘍質量の減少は、化合物ＩＩｄで治療したマウスの方が高かった（図４）。化合物ＩＩｄの分子量は、ドキソルビシンの分子量よりも３０％高い。したがって、化合物ＩＩｄから放出されたドキソルビシンのモル数は、ドキソルビシン単独投与のモル数と比較して３０％低かった。おそらく、動物に同じモル数の両方の化合物を投与する実験は、化合物ＩＩｄとドキソルビシンとの間の腫瘍質量の減少においてより高い差異をもたらし得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】