知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】少量の抗体副産物の定量
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241126BHJP
G01N 21/41 20060101ALI20241126BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20241126BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N21/41 101
C07K16/46
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531273
(86)(22)【出願日】2022-11-18
(85)【翻訳文提出日】2024-07-10
(86)【国際出願番号】 EP2022082453
(87)【国際公開番号】W WO2023094282
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】21210551.4
(32)【優先日】2021-11-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ラリヴィエール ローラン
(72)【発明者】
【氏名】シュロータウアー ティルマン
(72)【発明者】
【氏名】スピック クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ツビック アドリアン
【テーマコード（参考）】
2G059
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G059AA01
2G059BB06
2G059BB14
2G059CC17
2G059DD03
2G059DD13
2G059EE04
2G059JJ12
2G059MM12
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体と、二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のホモ二量体アビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を使用して決定するための方法であって、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物は、２つ以上、しかし少なくとも、正しく会合した二重特異性抗体より多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、正しく会合した二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、誤って会合した二重特異性抗体はホモ二量体であり、ＳＰＲ分析の解離相で残留結合（すなわち、より強いＳＰＲシグナル）が決定され得る場合、ホモ二量体アビド結合性副産物の存在が決定される、方法に関する。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
正しく会合した二重特異性抗体と、前記二重特異性抗体の１つ以上のアビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のアビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、前記正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
前記二重特異性抗体の前記アビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、前記正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、前記第１抗原に対する結合部位を含み、
前記方法は、
ｉ）前記正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、前記第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、前記第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、前記ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）前記二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、前記第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、前記第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液を前記ＳＰＲチップにアプライし、前記ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定された前記ＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定された前記ＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、前記二重特異性抗体の前記アビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記第１抗原が、少なくとも２０００ＲＵで固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１抗原が、２０００ＲＵ以上かつ８０００ＲＵ以下で固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ローディング溶液および／または前記サンプルの前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも３００秒間である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ローディング溶液および／または前記サンプルの前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも４００秒間である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記解離溶液の前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも６００秒間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記解離溶液の前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも１２００秒間である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ローディング溶液および前記サンプルの前記アプライが同じ条件下である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライが、同じ条件下である、請求項１～３および６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記流量が１５μＬ／分～３５μＬ／分である、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
工程ｉｉｉ）における前記決定が、前記解離溶液の前記アプライの開始後少なくとも４００秒の時点で決定された前記ＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライの開始時の前記ローディング溶液で得られた前記ＳＰＲシグナルが同一とされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｉｉ）における前記決定が、前記解離溶液の前記アプライの開始後少なくとも１２００秒の時点で決定された前記ＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライの開始時の前記ローディング溶液で得られた前記ＳＰＲシグナルが同一とされる、請求項１～６および８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体が、ｉ）ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉ）ＴＣＢフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉｉ）２＋１フォーマットの二重特異性抗体
である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を決定するためのものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を定量するためのものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分析方法の分野に属する。本発明は、（特に副産物の望ましくない増大したアビド（ａｖｉｄ）結合特性をもたらす）抗体鎖の誤った対合から生じる抗体関連副産物（例えばヘテロマー多重特異性抗体）を決定および定量するための方法に関する。そのような副産物は、増大した生物学的活性を有し、正しく会合した多重特異性抗体と比較して望ましくない副作用をもたらし得る。
【背景技術】
【0002】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、分子相互作用を検出するために利用される光学技術である。金属薄膜に固定化された分子（リガンド）に移動性分子（分析物）が結合すると、その膜の屈折率が変化する。偏光がフィルムに衝突した後に反射された光の消光角が変化し、反射強度の低下（表面プラズモン共鳴現象）に対する検出器位置の変化として監視される。この方法は質量を厳密に検出するので、相互作用する成分を標識する必要がなく、それ故、それらの分子特性の起こり得る変化が排除される（Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９３（２００９）３２３－３４３（非特許文献1））。
【0003】
ＳＰＲ結合分析方法は、分子相互作用を研究するために使用される。１つの相互作用パートナーが、化学反応（例えばアミンカップリング反応）によって直接的に、または結合対（例えばビオチン－ストレプトアビジン）をセンサーチップ上に形成することによって間接的に、固定化される。次いで、チップを、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）から入手可能なＳＰＲ機器のフローチャンバーに挿入する。第２の相互作用パートナーであるフロースルー分析物が、チャンバーに添加されると、固定化された第１の相互作用パートナーに結合し、金表面での屈折率の小さな変化が生じる。この変化を高精度に定量化し得る。結合アフィニティは、速度定数の比から得ることが可能であり、タンパク質－タンパク質相互作用の直接的な特徴付けがもたらされる（Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９３（２００９）３２３－３４３（非特許文献１））。
【0004】
残念ながら、ＳＰＲ検出の普遍的な性質は基本的な制限をも構成しており、全ての結合事象が同様の屈折率シグナルを引き起こすため、同様の質量変化をもたらす異なる結合事象を区別することは不可能である。従来のＳＰＲの情報量が制限され得る急速に関心が高まっている分野の１つは、二重特異性結合体（例えば、二重特異性抗体）の研究である。ここでは、特殊なアッセイ形式が必要であり、２つの種の結合は、並行してではなく、順番に研究されなければならない。関連する事例は、分析物分子が、同一または類似の結合部位で表面種に結合する、競合ベースのアッセイである。原則として、競合アッセイは、残留結合を計算することによってＳＰＲを使用して実施し得る。しかし、サンプル間の有機溶媒ビヒクル（すなわちＤＭＳＯ）のわずかな濃度差が、達成可能なシグナル対ノイズ比に大きな悪影響を及ぼし、残留結合シグナルを正確に決定する能力を妨げる可能性があるため（Ｅｎｇ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４９７（２０１８）１３３－１３８（非特許文献２））、これは小分子競合物質にとっては些細なことではない。
【0005】
Ｅｎｇら（前出）は、標準的な市販の単一波長ＳＰＲ装置を使用して２つの異なる同時に結合する種の定性的識別および定量的監視を可能にすることによってＳＰＲの情報量を増加させるための標識強化ＳＰＲ（ＬＥ－ＳＰＲ）技術を報告した。ＬＥ－ＳＰＲは、結合反応中のＳＰＲディップ全体の読み出しおよびソフトウェアベースの形状分析と組み合わせた、特殊な色素標識による結合分子の標識に基づいている。それらは、二重種検出の３つの例：ｉ）混合バルク溶液サンプル中の２つの異なる種の正確な定量的決定；ｉｉ）２つの異なる同時に結合する種の従来のセンサーグラムを２つの種の別々の結合曲線に定性的に分解し、続いて元のセンサーグラムを忠実に再構築すること；およびｉｉｉ）表面上のタンパク質に結合する混合物中の２つの異なる種の結合解離定数の同時決定を示している。
【0006】
Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢまたはＴＣＢ）は、患者のＴ細胞を動員してがん細胞を死滅させる有望ながん免疫療法である。臨床試験中のＴＤＢの数は増加しており、その治療可能性が広く認識されていることを示している。ＴＤＢが抗ＣＤ３（ａＣＤ３）アームを介してＴ細胞に結合して活性化させるという事実により、ａＣＤ３ホモ二量体（ａＣＤ３ ＨＤ）および高分子量種（ＨＭＷＳ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の二価の結合および二量体化を介して非特異的なＴ細胞活性化を引き起こすことによって潜在的な安全リスクをもたらす、生成物関連不純物である。この非特異的な（標的細胞非依存的としても知られる）Ｔ細胞活性化は、サイトカイン分泌を誘導し、患者において望ましくない免疫応答を引き起こす可能性がある。ａＣＤ３ ＨＤによる非特異的なＴ細胞活性化は、望ましくない活性であり、最終的に標的腫瘍細胞を死滅させるＴＤＢによるＴ細胞活性化とは異なる。したがって、ＴＤＢ製剤中のａＣＤ３ ＨＤのレベルを制御することが重要であり、その定量化を可能にするために高感度アッセイが必要である（Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９（２０１９）３９００（非特許文献３））。
【0007】
非特異的Ｔ細胞活性化のレベルを監視および制御するために、Ｌｅｅら（前出）は、標的細胞の非存在下でＴ細胞を活性化するその能力を利用することによってＴＤＢ製剤中のａＣＤ３ ＨＤを検出し得る高感度かつ定量的な細胞ベースのＴ細胞活性化アッセイを報告した。
【0008】
国際公開第２０２０／２００９４１号（特許文献１）は、第１のタンパク質部分と第２のタンパク質部分とを含むヘテロ二量体融合ポリペプチドであって、第１のタンパク質部分および第２のタンパク質部分は、第１のタンパク質部分に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のタンパク質部分に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第１および第２抗原であり、第１のタンパク質部分は、ＩｇＧ１サブタイプの第１の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、第２のタンパク質部分は、ＩｇＧ１サブタイプの第２の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端と融合しており、第１および第２の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、ジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成し、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方または両方は、そのＣ末端で固相に固定されるためのタグを含み、第１および第２のＦｃ領域ポリペプチドは、それぞれ変異Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む、融合ポリペプチド；ならびに、第１抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性抗体の、第１抗原および第２抗原に対するアビディティに基づく結合強度を、表面プラズモン共鳴法において決定するための、前記融合ポリペプチドの使用を報告している。
【0009】
Ａｍａｒａｌ，Ｍ．らは、多重特異性抗体フォーマットの操作技術および生物分析を報告している（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．２０２０（６）２６－５１（非特許文献４））。
【0010】
米国特許出願公開第２０１７／００３２９５号（特許文献２）には、多価多重特異性分子の生物学的活性を決定するためのＳＰＲベースのブリッジアッセイフォーマットが報告されている。
【0011】
国際公開第２０１４／１７７４６０号（特許文献３）には、ヒトＦｃＲｎ結合修飾抗体および使用方法が報告されている。
【0012】
特開２０２０／２０２８４８号公報（特許文献４）には、修飾された抗原結合ポリペプチド構築物およびその使用が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】国際公開第２０２０／２００９４１号
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１７／００３２９５号
【特許文献3】国際公開第２０１４／１７７４６０号
【特許文献4】特開２０２０／２０２８４８号公報
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９３（２００９）３２３－３４３
【非特許文献2】Ｅｎｇ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４９７（２０１８）１３３－１３８
【非特許文献3】Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９（２０１９）３９００
【非特許文献4】Ａｍａｒａｌ，Ｍ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．２０２０（６）２６－５１
【発明の概要】
【0015】
本明細書では、正しく会合した治療用抗体と、治療用抗体関連副産物との間の見かけの結合アフィニティの差に基づく、すなわち結合アビディティの上昇に基づく、治療用抗体関連副産物の決定または／および定量のための方法を報告する。
【0016】
この理論に拘束されるものではないが、正しく会合した抗体と比較して増加した結合価を有する任意の抗体関連副産物は、本明細書に記載のアプローチを使用して決定または／および定量化され得ると仮定される。同様に、見かけの結合アフィニティの差の決定に適した任意の方法、例えばＥＬＩＳＡおよびＳＰＲを使用し得る。
【0017】
見かけの結合アビディティが上昇した抗体関連副産物は、正しく会合した抗体よりもそれぞれの標的（すなわち抗原）に対する結合部位が多く、例えば、１つではなく２つの結合部位、２つではなく４つの結合部位などを含む。
【0018】
本明細書に記載のアッセイの原理は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法）などの種々の検出方法を使用する種々のバイオアッセイに適用し得る。
【0019】
例えば、抗体と価数増加抗体関連副産物との間の結合アビディティの上昇に起因する見かけのアフィニティの差をＥＬＩＳＡで定量し得る。その中で、適切な洗浄条件を適用することによって、副産物－リガンド複合体をインタクトにしたまま、抗体－リガンド相互作用を解離させる。さらに、得られたシグナルは、サンプル中の多価副産物の含有量に比例する。当該量は、検量線を用いて定量され得る。
【0020】
同様に、残留結合シグナルの時間依存的な差をもたらす異なる解離速度をもたらす副産物特異的相互作用特性を活用するために、ＳＰＲを使用し得る。
【0021】
より詳細には、一態様では、本発明は、以前は確立された定量方法の検出限界を下回っていた（二重特異性）抗体関連副産物の量を決定することを可能にする、ＳＰＲに基づくアッセイに関する。
【0022】
本発明による方法は、標的に対する結合価が大きい抗体関連副産物の決定または／および定量に特に適している。
【0023】
二重特異性抗体の形成のために、ヘテロ二量体形成を促進するための異なるアプローチが知られている。１つは、ノブ・イントゥ・ホール設計である（例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１；国際公開第９８／０５０４３１号）。二重特異性抗体の開発の際に、通常、有害事象を発生させる可能性がより高い結合体は、ノブ・イントゥ・ホール抗体フォーマットでノブ鎖に連結される。ノブ－ノブホモ二量体の形成は、ホール－ホールホモ二量体の形成と比較して立体的に好ましくない。これにより、この抗体組成物は好ましくないので、抗体産生中に抗体関連副産物としてもたらされる誤対合ノブ－ノブ分子は非常に少量である。
【0024】
これらのノブ－ノブ副産物は抗体産物のごく一部を構成するが、有害な副作用、例えば毒物学的副作用を引き起こし得るか、または例えば意図された生物学的作用を行い得ないことによって薬物の効率を低下させる可能性があるので、これらを集中的に監視する必要がある。これらの望ましくない事象は、アビディティ（アビド結合）による薬物－標的複合体安定性の増強によって引き起こされる。
【0025】
本発明は、少なくとも部分的には、そのようなアビディティの上昇をＳＰＲアッセイで活用して、ＳＥＣまたはＭＳなどの確立された方法によって以前に検出可能であったよりも低い副産物濃度を検出し得るという知見に基づく。確立された方法は、単離された薬物に対する残留結合を使用しているが、本発明による方法は、他の定量化方法においては使用されないアビディティによる濃縮を使用する。
【0026】
本発明によるＳＰＲ方法では、抗体標的、すなわち抗原が、ＳＰＲセンサーチップ上に固定化される。その後、検出される抗体および抗体関連副産物を含むサンプルが注入される。これにより、センサー表面上に抗体－標的複合体が形成される。その後、抗体を含まず、抗体関連副産物も含まない緩衝液を系に注入して、抗体－標的複合体を解離させ得る。これにより、抗体関連副産物の解離は、正しく会合した抗体の解離と比較して解離プロファイルが遅くなる。このようなより遅い解離により、抗体関連アビド結合性副産物のない抗体サンプルと比較して、規定の解離時間後のＳＰＲ結合シグナルが強い。この強いシグナルは、抗体関連ホモ二量体副産物のアビディティによる残留結合である。それにより、サンプル中に存在する抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の量、それによって最終的には抗体関連アビド結合性ホモ二量体副産物の濃度を、非常に低い検出限界で定量することができる。
【0027】
本発明は、少なくとも部分的に、抗体標的（＝抗原）が、試験される多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体のフォーマットに応じて最小密度または密度範囲で固定化されなければならないという知見に基づく。特定の実施形態では、抗体標的は、少なくとも１０００ＲＵで固定化されなければならない。好ましい一実施形態では、標的は少なくとも２０００ＲＵで固定化される。特定の実施形態では、標的は、少なくとも４０００ＲＵで固定化される。特定の実施形態では、標的は、２０００～４０００ＲＵで固定化される。
【0028】
本発明は、少なくとも部分的には、抗体注入時間を長くすることによって、アビド結合が可能な抗体関連副産物が結合時間中にチップの表面に蓄積するため、本方法の検出限界を低くすることができる、という知見に基づく。特定の実施形態では、結合時間は少なくとも２４０秒である。特定の実施形態では、結合時間は少なくとも３００秒である。好ましい一実施形態では、注入時間は少なくとも３６０秒である。特定の実施形態では、結合時間は少なくとも４２０秒である。
【0029】
本発明は、少なくとも部分的には、ＳＰＲチップ上の抗体複合体安定性と抗体関連副産物複合体安定性との間の差を使用して抗体関連副産物を定量し得るという知見に基づく。好ましい一実施形態では、残留結合が決定される解離時間は少なくとも１２００秒である。特定の実施形態では、残留結合が決定される解離時間は少なくとも１８００秒である。
【0030】
残留結合は、サンプル中の抗体関連アビド結合性副産物の量または割合、ならびに抗体関連副産物と標的との複合体の安定性、すなわち正しく会合した抗体と比較した複合体安定性の差に依存する。
【0031】
したがって、残留結合が小さい場合、アッセイ条件を調整して残留結合を増加させ得る。これは、本発明の知識において、例えば、単離された抗体および検出される抗体関連副産物の熱力学的および速度論的特性に関する一般的な知識に基づいて、当業者に知られている種々の手段によって行い得る。例示的な手段を以下の表に列挙する。
【0032】
【0033】
本発明による一態様は、正しく会合した抗体および誤って会合した抗体副産物を含むサンプル中の誤って会合した抗体副産物を決定するための方法であって、
正しく会合した抗体および誤って会合した抗体副産物は、（第１の）標的に結合し、
誤って会合した抗体副産物は、正しく会合した抗体よりも、標的への結合部位を多く含み、
本方法は、
ｉ）好ましくは少なくとも１０００ＲＵ、より好ましくは少なくとも１５００ＲＵ、最も好ましくは少なくとも２０００ＲＵで、標的をＳＰＲチップの表面に高密度で固定すること、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた表面に、（標的に結合する唯一の種として）正しく会合した抗体を含む緩衝溶液を、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライし、負荷された表面を生成させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた負荷された表面に、標的に結合する化合物を含まない（すなわち、正しく会合した抗体も、誤って会合した抗体副産物も含まない）（緩衝）溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｉｖ）場合により、ＳＰＲ表面を再生すること、
ｖ）工程ｉ）と同様にして得られたＳＰＲ表面または工程ｉｖ）の再生されたＳＰＲ表面に、誤って会合した抗体副産物を含む疑いのある（緩衝化された）サンプル溶液を、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライし、負荷された表面を生成させること、
ｖｉ）工程ｖ）で得られた負荷された表面に、標的に結合する化合物を含まない（緩衝）溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｖｉｉ）標的に結合する化合物を含まない（緩衝化）溶液のアプライの開始後、好ましくは開始後少なくとも７．５分、より好ましくは開始後少なくとも１５分、最も好ましくは標的に結合する化合物を含まない（緩衝化）溶液のアプライの開始後２０分において、工程ｖｉ）で決定されたＳＰＲシグナルが、工程ｉｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルを上回る／上回って残る場合に、誤って会合した抗体副産物を決定すること
を含む、方法である。
正しく会合した抗体および誤って会合した抗体副産物は、（第１の）標的に結合し、
誤って会合した抗体副産物は、正しく会合した抗体よりも、標的への結合部位を多く含み、
本方法は、
ｉ）好ましくは少なくとも１０００ＲＵ、より好ましくは少なくとも１５００ＲＵ、最も好ましくは少なくとも２０００ＲＵで、標的をＳＰＲチップの表面に高密度で固定すること、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた表面に、（標的に結合する唯一の種として）正しく会合した抗体を含む緩衝溶液を、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライし、負荷された表面を生成させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた負荷された表面に、標的に結合する化合物を含まない（すなわち、正しく会合した抗体も、誤って会合した抗体副産物も含まない）（緩衝）溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｉｖ）場合により、ＳＰＲ表面を再生すること、
ｖ）工程ｉ）と同様にして得られたＳＰＲ表面または工程ｉｖ）の再生されたＳＰＲ表面に、誤って会合した抗体副産物を含む疑いのある（緩衝化された）サンプル溶液を、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライし、負荷された表面を生成させること、
ｖｉ）工程ｖ）で得られた負荷された表面に、標的に結合する化合物を含まない（緩衝）溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｖｉｉ）標的に結合する化合物を含まない（緩衝化）溶液のアプライの開始後、好ましくは開始後少なくとも７．５分、より好ましくは開始後少なくとも１５分、最も好ましくは標的に結合する化合物を含まない（緩衝化）溶液のアプライの開始後２０分において、工程ｖｉ）で決定されたＳＰＲシグナルが、工程ｉｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルを上回る／上回って残る場合に、誤って会合した抗体副産物を決定すること
を含む、方法である。
【0034】
本発明の一態様は、正しく会合した二重特異性抗体と、二重特異性抗体の誤って会合した副産物とを含むサンプル中の、二重特異性抗体の誤って会合した副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、
正しく会合した二重特異性抗体は、第１抗原に対する正確に１つの結合部位および第２抗原に対する１つ以上の結合部位を含み、すなわち、二重特異性抗体は、第１抗原に（特異的に）結合する１つの結合部位および第２抗原に（特異的に）結合する１つ以上の結合部位を有し、
二重特異性抗体の誤って会合した副産物は、第１抗原に対する２つ以上の結合部位および第２抗原に対する０～２つの結合部位を含み、
正しく会合した二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、誤って会合した二重特異性抗体はＦｃ領域に関してホモ二量体であり、好ましくはヘテロ二量体はノブ・イントゥ・ホール法によって形成され、
本方法は、：
ｉ）ＳＰＲチップの少なくとも１つのフローセルの表面上に第１抗原を高密度で、好ましくは少なくとも１０００ＲＵで、より好ましくは少なくとも１５００ＲＵで、最も好ましくは少なくとも２０００ＲＵで固定すること、
ｉｉ）単離された二重特異性抗体を抗原に結合する唯一の種として含む緩衝溶液（または、正しく会合した二重特異性抗体と、上限量の二重特異性抗体の誤って会合した副産物とを含む、参照標準）を、工程ｉ）で得られた少なくとも１つのフローセルに、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライすること、
ｉｉｉ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も、二重特異性抗体の誤って会合した副産物も含まない）緩衝溶液を、工程ｉｉ）で得られた少なくとも１つのフローセルに、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録し、その後、場合により少なくとも１つのフローセルを再生すること、
ｉｖ）二重特異性抗体の誤って会合した副産物を含む（または二重特異性抗体の誤って会合した副産物の量を上限量を超えて含む）疑いのある緩衝されたサンプル溶液を、工程ｉ）と同様にして得られた少なくとも１つのフローセルまたは工程ｉｉｉ）で得られた再生されたフローセルに、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量で、アプライすること、
ｖ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も、誤って会合した二重特異性抗体副産物も含まない）緩衝溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間、工程ｉｖ）で得られた少なくとも１つのフローセルにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｖｉ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も二重特異性抗体の誤って会合した副産物も含まない）緩衝溶液のアプライの開始後、標的に結合する化合物を含まない（緩衝化された）溶液のアプライの、好ましくは開始後少なくとも７．５分、より好ましくは開始後少なくとも１５分、最も好ましくは２０分において、工程ｖ）で決定されたＳＰＲシグナルが、工程ｉｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルを上回る場合、二重特異性抗体の誤って会合した副産物を決定すること
を含む、方法である。
正しく会合した二重特異性抗体は、第１抗原に対する正確に１つの結合部位および第２抗原に対する１つ以上の結合部位を含み、すなわち、二重特異性抗体は、第１抗原に（特異的に）結合する１つの結合部位および第２抗原に（特異的に）結合する１つ以上の結合部位を有し、
二重特異性抗体の誤って会合した副産物は、第１抗原に対する２つ以上の結合部位および第２抗原に対する０～２つの結合部位を含み、
正しく会合した二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、誤って会合した二重特異性抗体はＦｃ領域に関してホモ二量体であり、好ましくはヘテロ二量体はノブ・イントゥ・ホール法によって形成され、
本方法は、：
ｉ）ＳＰＲチップの少なくとも１つのフローセルの表面上に第１抗原を高密度で、好ましくは少なくとも１０００ＲＵで、より好ましくは少なくとも１５００ＲＵで、最も好ましくは少なくとも２０００ＲＵで固定すること、
ｉｉ）単離された二重特異性抗体を抗原に結合する唯一の種として含む緩衝溶液（または、正しく会合した二重特異性抗体と、上限量の二重特異性抗体の誤って会合した副産物とを含む、参照標準）を、工程ｉ）で得られた少なくとも１つのフローセルに、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量でアプライすること、
ｉｉｉ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も、二重特異性抗体の誤って会合した副産物も含まない）緩衝溶液を、工程ｉｉ）で得られた少なくとも１つのフローセルに、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間アプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録し、その後、場合により少なくとも１つのフローセルを再生すること、
ｉｖ）二重特異性抗体の誤って会合した副産物を含む（または二重特異性抗体の誤って会合した副産物の量を上限量を超えて含む）疑いのある緩衝されたサンプル溶液を、工程ｉ）と同様にして得られた少なくとも１つのフローセルまたは工程ｉｉｉ）で得られた再生されたフローセルに、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも７分間、最も好ましくは少なくとも１０分間、好ましくは３０μＬ／分以下（５０μＬ／分～５μＬ／分の範囲内）、より好ましくは２５μＬ／分以下（４０μＬ／分～７．５μＬ／分の範囲内）、最も好ましくは２０μＬ／分以下（３０μＬ／分～１０μＬ／分の範囲内）の流量で、アプライすること、
ｖ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も、誤って会合した二重特異性抗体副産物も含まない）緩衝溶液を、好ましくは少なくとも７．５分間、より好ましくは少なくとも１５分間、最も好ましくは少なくとも２０分間、工程ｉｖ）で得られた少なくとも１つのフローセルにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録すること、
ｖｉ）抗原に結合する化合物を含まない（すなわち、二重特異性抗体も二重特異性抗体の誤って会合した副産物も含まない）緩衝溶液のアプライの開始後、標的に結合する化合物を含まない（緩衝化された）溶液のアプライの、好ましくは開始後少なくとも７．５分、より好ましくは開始後少なくとも１５分、最も好ましくは２０分において、工程ｖ）で決定されたＳＰＲシグナルが、工程ｉｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルを上回る場合、二重特異性抗体の誤って会合した副産物を決定すること
を含む、方法である。
【0035】
本発明の一態様は、正しく会合した二重特異性抗体と、二重特異性抗体の１つ以上のアビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のアビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、
正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
二重特異性抗体のアビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、
本方法は、：
ｉ）正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、二重特異性抗体のアビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法である。
正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
二重特異性抗体のアビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、
本方法は、：
ｉ）正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、二重特異性抗体のアビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体と、該二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のホモ二量体アビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物は、２つ以上、しかし少なくとも、正しく会合した二重特異性抗体より多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、正しく会合した二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、誤って会合した二重特異性抗体はホモ二量体であり、ＳＰＲ分析の解離相で残留結合（すなわち、より強いＳＰＲシグナル）が決定され得る場合にホモ二量体アビド結合性副産物の存在が決定される、方法に関する。
本発明は、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体と、該二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のホモ二量体アビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、二重特異性抗体の誤って会合したホモ二量体アビド結合性副産物は、２つ以上、しかし少なくとも、正しく会合した二重特異性抗体より多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、正しく会合した二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、誤って会合した二重特異性抗体はホモ二量体であり、ＳＰＲ分析の解離相で残留結合（すなわち、より強いＳＰＲシグナル）が決定され得る場合にホモ二量体アビド結合性副産物の存在が決定される、方法に関する。
【0037】
本発明は、少なくとも部分的には、誤って会合した多重特異性抗体のアビディティの上昇をＳＰＲアッセイにおいて利用して、ＳＥＣまたはＭＳなどの確立された方法によって以前に検出可能であったよりも低い副産物濃度を検出し得るという知見に基づく。確立された方法は、単離された薬物に対する残留結合を使用しているが、本発明による方法は、他の定量化方法では使用されないアビディティによる濃縮を使用する。
【0038】
したがって、本発明は、正しく会合した治療用抗体と治療用抗体関連副産物との間の見かけの結合アフィニティの差に基づく、すなわち結合アビディティの上昇に基づく、治療用抗体関連副産物の決定または／および定量のための方法に関する。
【0039】
本発明による方法は、正しく会合した抗体と比較して増加した結合価を有する抗体関連副産物の存在の決定を可能にする。
【0040】
換言すれば、見かけの結合アビディティが上昇した抗体関連副産物は、正しく会合した抗体よりも多くのそれぞれの標的（すなわち抗原）に対する結合部位を含み、例えば、１つではなく２つの結合部位、２つではなく４つの結合部位などを含む。
【0041】
定義
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
【0042】
「アフィニティ」または「結合アフィニティ」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（＝標的）（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強さを指す。別途示されない限り、本明細書中で使用される場合、「結合アフィニティ」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および標的（抗原））間の１：１の相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティは、概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、それは解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価のアフィニティは、異なる速度定数を含み得る。アフィニティは、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で既知の一般的な方法によって測定し得る。アフィニティを測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0043】
本明細書における「抗体」という用語は、少なくともヘテロ二量体多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体）を定義するために使用される。
【0044】
Ｙ字型完全長抗体は、一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの対は、抗体の結合部位を形成する。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）食細胞などのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞への、またはｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体としても知られる胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞への抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域は、（Ｃ１ｑ）成分などの古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合も媒介する。抗体重鎖の定常ドメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むのに対して、軽鎖は、カッパーアイソタイプまたはラムダアイソタイプであり得るただ１つの定常ドメインＣＬを含む。
【0045】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。
【0046】
「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおける抗体のその抗原への結合を表し、特定の実施形態では、標的が表面に結合し、標的への抗体の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される結合アッセイにおける結合を表す。結合は、例えば、標的Ａもしくは標的Ｂに対する、または捕捉分子、例えば、抗体に対する抗ヒトＦａｂ捕捉に対する抗体の結合能の測定を意味する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
【0048】
「価数」という用語は、本出願内で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、抗体中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位が存在することを意味する。二重特異性抗体は、例えば、結合部位が異なる標的に特異的に結合する少なくとも２つの結合部位を含む。
【0049】
「結合アフィニティ」という用語は、単一の結合部位とそのそれぞれの標的との相互作用の強さを表す。実験的には、アフィニティは、例えば、平衡における抗体および抗原の結合速度定数（ｋＡ）および解離速度定数（ｋＤ）を測定することによって決定し得る。
【0050】
「結合アビディティ」という用語は、１つの抗体の複数の結合部位と同じ標的との相互作用の複合強度を表す。したがって、アビディティは、結合の合計ではなく、結合アフィニティの相乗的な強度の合算である。アビディティに必要なものは、１つの標的（抗原）に対する抗体または機能的多量体の多価性、１つの可溶性標的上の複数のアクセス可能なエピトープ、または様々な固定化標的上の１つのエピトープに対する抗体の複数の結合である。したがって、そのような抗体は、その標的に対するアビド結合を示す。
【0051】
原則として、複合体結合は、アフィン結合とアビド結合との間で異なっていない。しかしながら、アビド結合の場合の複合体解離は、関与する全ての結合部位の同時解離に依存する。したがって、（アフィン結合と比較して）アビド結合による結合強度の増加は、解離速度論／複合体安定性に依存する。それにより、例えば、一価結合体は、多価結合体と比較してより速く解離する。本発明の方法による長期間にわたる多価結合体の濃縮は、本方法の感度を高めるために使用し得る。
【0052】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣもしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される場合に９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
【0053】
多重特異性抗体
本発明による方法では、少なくともヘテロ二量体および少なくとも二重特異性抗体の１以上のアビド結合性副産物の量が決定される。
本発明による方法では、少なくともヘテロ二量体および少なくとも二重特異性抗体の１以上のアビド結合性副産物の量が決定される。
【0054】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる標的、すなわち抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一方は、第１抗原に対するものであり、他方は、異なる第２抗原に対するものである。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する。
【0055】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによって（国際公開第２００９／０８９００４号）、またはロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を作製することによって作製され得る（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照されたい）。
【0056】
抗体はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号または国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されているような多重特異性抗体であり得る。
【0057】
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【0058】
種々の二重特異性抗体フォーマットが知られている。
【0059】
本発明による方法を使用し得る例示的な二重特異性抗体フォーマットは以下の通りである。
－ ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット（＝ＣｒｏｓｓＭａｂ）：第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが、互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置換され、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；および
第２のＦａｂ断片が、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ＣｒｏｓｓＭａｂは、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、ここで、両方のＣＨ３ドメインは、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、第１の重鎖および修飾された第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されている。
－ 一アーム一本鎖形式（＝一アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである。
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット（ＴＣＢフォーマット）：多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）それぞれが第１抗原に特異的に結合する第１および第２のＦａｂ断片、
ｂ）第２抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置換されている、１つのドメイン交換Ｆａｂ断片、
ｃ）第１の重鎖Ｆｃ領域のポリペプチドと第２の重鎖Ｆｃ－領域ポリペプチドを含む、１つのＦｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ドメイン交換Ｆａｂ断片のＣＬドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、かつ、
第２のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端またはドメイン交換Ｆａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に接続されており、
第１抗原または第２抗原は、ヒトＣＤ３である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
あるいは
ａ）それぞれが第１抗原に特異的に結合する第１および第２のＦａｂ断片、
ｂ）第２抗原に特異的に結合し、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに置換されている、１つのドメイン交換Ｆａｂ断片、
ｃ）第１の重鎖Ｆｃ領域のポリペプチドと第２の重鎖Ｆｃ－領域ポリペプチドを含む、１つのＦｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ドメイン交換Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、かつ、
第２のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端またはドメイン交換Ｆａｂ断片のＶＬドメインのＮ末端に接続されており、
第１抗原または第２抗原は、ヒトＣＤ３である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ ドメイン交換およびさらなる重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体（２＋１フォーマット）：多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、および
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片、を含み、
第２抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ 二アーム一本鎖形式（＝２アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性形式（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）。
－ ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット（＝ＣｒｏｓｓＭａｂ）：第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが、互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置換され、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに置換されており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；および
第２のＦａｂ断片が、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ＣｒｏｓｓＭａｂは、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、ここで、両方のＣＨ３ドメインは、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、第１の重鎖および修飾された第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されている。
－ 一アーム一本鎖形式（＝一アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである。
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット（ＴＣＢフォーマット）：多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）それぞれが第１抗原に特異的に結合する第１および第２のＦａｂ断片、
ｂ）第２抗原に特異的に結合し、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが互いに置換されている、１つのドメイン交換Ｆａｂ断片、
ｃ）第１の重鎖Ｆｃ領域のポリペプチドと第２の重鎖Ｆｃ－領域ポリペプチドを含む、１つのＦｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ドメイン交換Ｆａｂ断片のＣＬドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、かつ、
第２のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端またはドメイン交換Ｆａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に接続されており、
第１抗原または第２抗原は、ヒトＣＤ３である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
あるいは
ａ）それぞれが第１抗原に特異的に結合する第１および第２のＦａｂ断片、
ｂ）第２抗原に特異的に結合し、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに置換されている、１つのドメイン交換Ｆａｂ断片、
ｃ）第１の重鎖Ｆｃ領域のポリペプチドと第２の重鎖Ｆｃ－領域ポリペプチドを含む、１つのＦｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの１つのＮ末端に接続しており、ドメイン交換Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、他の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続しており、かつ、
第２のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第１のＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端またはドメイン交換Ｆａｂ断片のＶＬドメインのＮ末端に接続されており、
第１抗原または第２抗原は、ヒトＣＤ３である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ ドメイン交換およびさらなる重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体（２＋１フォーマット）：多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、および
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片、を含み、
第２抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、またはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ 二アーム一本鎖形式（＝２アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性形式（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）。
【0060】
本明細書で使用される「ＴＣＢ」という用語は、Ｔ細胞二重特異性抗体を表す。そのような抗体は、例えば国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されているようなフォーマットを有し得る。それらの分子は、Ｔ細胞上のＣＤ３（第１の特異性）および標的（例えば、腫瘍）細胞上の抗原（第２の特異性）に同時に結合し、それによって標的細胞の死滅を誘導し得る。ＴＣＢは、４つのポリペプチドまたはポリペプチド鎖、完全長軽鎖である１つの軽鎖、ドメイン交換完全長軽鎖であるさらなる軽鎖、完全長重鎖である１つの重鎖、および追加のドメイン交換重鎖または軽鎖Ｆａｂ断片を含む伸長重鎖であるさらなる重鎖からなる三価二重特異性抗体である。
【0061】
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１およびＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（またはＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
【0062】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、且つＶＨおよびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
【0063】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体はＣｒｏｓｓＭａｂ－フォーマットである。
【0064】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体はＴＣＢ－フォーマットである。
【0065】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体は２＋１－フォーマットである。
【0066】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体は一本鎖抗体である。
【0067】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体は２アーム一本鎖抗体である。
【0068】
特定の実施形態では、多重特異性抗体または二重特異性抗体は一般的な軽鎖抗体である。
【0069】
ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾のためのいくつかのアプローチが存在し、これらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号明細書、国際公開第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、第第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５号、同第２０１２０５８７６８号、同第２０１３１５７９５４号、同第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、そのような全てのアプローチにおいて、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインはいずれも、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がそれ自体とホモ二量体をもはや形成し得ず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するように強制されるように相補的に操作される（その結果、第１および第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第１または２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体は形成されない）。重鎖ヘテロ二量体化の改善のためのこれらの異なるアプローチは、ベンス・ジョーンズタイプ副産物の軽鎖誤対合を減少させる本発明による多重特異性抗体における重－軽鎖修飾（１つの結合アームにおけるＶＨおよびＶＬ交換／置換、ならびにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる選択肢として企図される。
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾のためのいくつかのアプローチが存在し、これらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号明細書、国際公開第２００７／１１０２０５号、同第２００７／１４７９０１号、同第２００９／０８９００４号、第第２０１０／１２９３０４号、同第２０１１／９０７５４号、同第２０１１／１４３５４５号、同第２０１２０５８７６８号、同第２０１３１５７９５４号、同第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、そのような全てのアプローチにおいて、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインはいずれも、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がそれ自体とホモ二量体をもはや形成し得ず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するように強制されるように相補的に操作される（その結果、第１および第２のＣＨ３ドメインはヘテロ二量体化し、２つの第１または２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体は形成されない）。重鎖ヘテロ二量体化の改善のためのこれらの異なるアプローチは、ベンス・ジョーンズタイプ副産物の軽鎖誤対合を減少させる本発明による多重特異性抗体における重－軽鎖修飾（１つの結合アームにおけるＶＨおよびＶＬ交換／置換、ならびにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる選択肢として企図される。
【0070】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するために、例えば多重特異性抗体または二重特異性抗体の産生のために導入されたＣＨ３ドメインにおける例示的な変異を以下に概説する。
【0071】
そのような変異の例は、いわゆる「ノブ イントゥ ホール」置換である（例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１；国際公開第９８／０５０４３１号；米国特許第７，６９５，９３６号および米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖における以下のノブおよびホール置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることがわかっている。１）一方の鎖のＹ４０７Ｔおよび他方の鎖のＴ３６６Ｙ；２）一方の鎖にＹ４０７Ａ、他方の鎖のＴ３６６Ｗ；３）一方の鎖のＦ４０５Ａおよび他方の鎖のＴ３９４Ｗ；４）一方の鎖のＦ４０５Ｗおよび他方の鎖のＴ３９４Ｓ；５）一方の鎖のＹ４０７Ｔおよび他方の鎖のＴ３６６Ｙ；６）一方の鎖のＴ３６６ＹおよびＦ４０５Ａならびに他方の鎖のＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔ；７）一方の鎖のＴ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗならびに他方の鎖のＴ３９４ＳおよびＹ４０７Ａ；８）一方の鎖のＦ４０５ＷおよびＹ４０７Ａ、ならびに他方の鎖のＴ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓ；かつ９）一方の重鎖Ｆｃ領域中のＴ３６６Ｗおよび他のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖであり、最後に列挙したものが特に適しており、したがって好ましい一実施形態の主題である。さらに、２つのＦｃ領域ポリペプチド鎖間の新しいジスルフィド架橋の形成を可能にする置換は、ヘテロ二量体の形成を促進する（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５；米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照されたい）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖中に新しい鎖内ジスルフィド結合を形成するための適切に離間したシステイン残基をもたらす以下の置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている：好ましい一実施形態では、１つの重鎖Ｆｃ領域中のＹ３４９Ｃおよびそれぞれの他の重鎖Ｆｃ領域中のＳ３５４Ｃ；一方の鎖のＹ３４９Ｃおよび他方の鎖のＥ３５６Ｃ；一方の鎖のＹ３４９Ｃおよび他方の鎖のＥ３５７Ｃ；一方の鎖のＬ３５１Ｃおよび他方の鎖のＳ３５４Ｃ；一方の鎖のＴ３９４Ｃおよび他方の鎖のＥ３９７Ｃ；または一方の鎖のＤ３９９Ｃおよび他方の鎖のＫ３９２Ｃである。
【0072】
アミノ酸変化を促進するヘテロ二量体化のさらなる例は、いわゆる「電荷対置換」である（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照されたい）。サブクラスＩｇＧ１のＩｇＧ抗体のＦｃ領域の個々のポリペプチド鎖における以下の電荷対置換は、ヘテロ二量体形成を増加させることがわかっている。１）一方の鎖のＫ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅおよび他方の鎖のＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；２）一方の鎖のＫ３９２ＤまたはＫ３９２Ｅおよび他方の鎖のＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖のＫ４３９ＤまたはＫ４３９Ｅおよび他方の鎖のＥ３５６ＫまたはＥ３５６Ｒ；４）一方の鎖のＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅおよび他方の鎖のＥ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒ；５）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ、加えて他方の鎖のＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；６）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄ、加えて他方の鎖のＤ３９９ＫおよびＥ３５７Ｋ；７）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、加えて他方の鎖のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６ＫおよびＥ３５７Ｋ；８）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄならびに他方の鎖のＤ３９９Ｋ；９）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄならびに他方の鎖のＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；１０）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄならびに他方の鎖のＤ３９９ＫおよびＤ３５７Ｋ；１１）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄならびに他方の鎖のＤ３９９ＫおよびＤ３５７Ｋ；１２）一方の鎖のＤ３９９Ｋならびに他方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ；かつ１３）一方の鎖のＫ４０９ＤおよびＫ４３９Ｄならびに他方のＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ。
【0073】
全ての態様および実施形態の好ましい一実施形態では、第１のＦｃ領域ポリペプチドは変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（「ホール」）を含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含む。
【0074】
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾のための他の技術は、本発明の方法で使用される代替方法として企図され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１に記載されている。
【0075】
国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｋ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸Ｌ３５１Ｄ変異を含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸Ｌ３５１Ｋ変異を含む。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅ（好ましくは、Ｌ３６８Ｅ）から選択されるさらなるアミノ酸変異を含む。
【0076】
国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０またはＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１ＥまたはＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９ＹまたはＤ３９９Ｋ、ｃＳ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＶまたはＦ４０５Ｗ、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２ＦまたはＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ変異を含む。特定の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９ＲおよびＳ４００Ｒ変異を含む。
【0077】
特定の実施形態では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化アプローチは、例えば、３６８位および４０９位からなる群から選択される位置のアミノ酸修飾と共に代わりに使用し得る。
【0078】
上記のノブ・イントゥ・ホール技術も使用する国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｗ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ａ変異を含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｔ３６６Ｙ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸Ｙ４０７Ｔ変異を含む。
【0079】
国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２またはＮ３９２の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２ＤまたはＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６またはＥ３５７の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋ）によるアミノ酸置換を含み、好ましい一実施形態では、Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋによるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはＫ４０９またはＲ４０９の負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９ＤまたはＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、さらにまたは代替的に、Ｋ４３９および／またはＫ３７０の負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ））によるアミノ酸置換を含む。
【0080】
国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。特定の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２ＫおよびＫ３２２Ｄ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０ＫおよびＫ２９２Ｄ変異を含む。
【0081】
特定の実施形態では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用し得る。
【0082】
組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法および組成物を使用して産生し得る。特定の実施形態では、抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。特定の実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド）が提供される。特定の実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、（例えば、形質転換された）以下を含む：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むプラスミド、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のプラスミドおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のプラスミド。特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。特定の実施形態では、本発明による方法は、その中で試験される抗体を作製する工程をさらに含み、この方法は、上で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程、および抗体関連アビド結合性副産物の含有量を測定または決定するための本発明による方法に抗体を供する工程を含む。
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換え方法および組成物を使用して産生し得る。特定の実施形態では、抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。特定の実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド）が提供される。特定の実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、（例えば、形質転換された）以下を含む：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むプラスミド、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のプラスミドおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のプラスミド。特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。特定の実施形態では、本発明による方法は、その中で試験される抗体を作製する工程をさらに含み、この方法は、上で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程、および抗体関連アビド結合性副産物の含有量を測定または決定するための本発明による方法に抗体を供する工程を含む。
【0083】
上記で概説したような方法を用いた抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸、例えば上記のような核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のプラスミドに挿入する。そのような核酸は、従来の手順（例えば、変異型Ｆｃ領域ポリペプチドまたは抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に単離され、配列決定され得る。
【0084】
抗体をコードするプラスミドのクローニングまたは発現に適した宿主細胞としては、真核細胞が挙げられる。
【0085】
例えば、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌および酵母株を含む、抗体をコードするプラスミドのための適切なクローニングまたは発現宿主であり、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；およびＬｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照されたい。
【0086】
例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されているＨＥＫ２９３または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）ｐ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、および、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．およびＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５～２６８頁を参照されたい。好ましい一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯまたはＨＥＫ細胞である。
【0087】
最先端の表面プラズモン共鳴法
それぞれの抗原に対する、抗体の動力学的結合パラメータは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、表面プラズモン共鳴によって検討され得る。
それぞれの抗原に対する、抗体の動力学的結合パラメータは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、表面プラズモン共鳴によって検討され得る。
【0088】
簡単に説明すると、アフィニティ決定のために、捕捉剤、例えば抗体の標的／抗原を、捕捉および分析されるそれぞれの抗体への提示のために、アミンカップリングを介してチップ、例えばＣＭ５チップ上に共有結合的に固定化する。
【0089】
例えば、１０～３０μｇ／ｍｌの標的溶液の約２，０００～１２，０００応答単位（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによって、１０～３０μｌ／分の流量でｐＨ５．０のＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置中のＣＭ５センサーチップの全てのフローセル上にカップリングさせる。
【0090】
結合は、２５℃（またはその代わりに４℃～４５℃の範囲の異なる温度で）のＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）、またはＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤ＰＳ２０、ｐＨ７．４）、またはＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０））中で測定される。
【0091】
その結果、抗体を１０ｎＭ～１μＭの範囲の濃度で３０秒間注入し、活性フローセル（例えば、２、３および４または２および３）に結合させ、他のフローセルを参照フローセルとする。
【0092】
次いで、抗体のアフィニティに応じて、例えば１４４ｎＭ、４８ｎＭ、１６ｎＭ、５．３３ｎＭ、１．７８ｎＭ、０．５９ｎＭ、０．２０ｎＭおよび０ｎＭなどの溶液中の様々な濃度で対応する抗原（二次標的）を添加する。
【0093】
結合は、抗原注入によって測定される。
【0094】
解離は、分析物を含まない緩衝液でチップの表面を洗浄することによって測定される。
【0095】
ＫＤ値は、製造者のソフトウェアおよび指示書を用いて１：１ラングミュア結合モデルを使用して推定される。システム固有のベースラインドリフトの補正およびノイズシグナル低減のために、サンプル曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。
【0096】
本発明による方法の実施例および例示的な実施形態
２＋１フォーマット抗体を用いる本発明による方法
本発明による方法は、二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体を用いて以下の第１の実施例に例示する。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
２＋１フォーマット抗体を用いる本発明による方法
本発明による方法は、二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体を用いて以下の第１の実施例に例示する。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【0097】
この実施例で使用される二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体は、ヒトＡベータタンパク質に特異的に結合する２つの結合部位と、Ａベータ抗体の重鎖のＣ末端の１つにペプチドリンカーを介して融合したヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する１つのさらなる単一特異性Ｆａｂとを含むＹ字形完全長抗体から形成される。
【0098】
血液脳関門を適切にシャトリングするために、二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体は、二価結合がシャトリングを大幅に減少させるか、または消失させるので、ヒトトランスフェリン受容体に対して一価でなければならない（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／２０７２４５号を参照されたい）。
【0099】
二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体は２つの異なる重鎖を含むので、重鎖のＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化戦略（Ｍｅｒｃｈａｎｔら（前出）を参照されたい）に従って修飾されている。さらなるＦａｂにコンジュゲートされた重鎖はノブ変異を含み、他方の、伸長されていない重鎖はホール変異を含む。
【0100】
この例示的抗体について、本発明による方法で検出される抗体関連アビド結合性副産物は、さらなるＦａｂに連結された２つの重鎖を含むホモ二量体、すなわちＡベータタンパク質に対する２つの結合部位およびヒトトランスフェリン受容体の２つの結合部位を含む抗体である。正しく会合した二重特異性抗体は、上記で概説したように、ヒトＡベータタンパク質に対する２つの結合部位を含むが、ヒトトランスフェリン受容体に対する１つの結合部位のみを含む。この抗体関連アビド結合性副産物は、ヒトトランスフェリン受容体への二価結合に起因して、血液脳関門を通過する適切なシャトリングができないいので、検出されなければならない。
【0101】
本発明の方法によれば、検出される副産物が、正しく会合した抗体と比較して結合部位の数が増加した抗原、すなわち、この例では１つではなく２つが、ＳＰＲチップの表面に固定化されている。この実施例では、固定化は間接的な固定化であった。抗原、すなわちヒトトランスフェリン受容体は、チップ上にプレコートされた一本鎖ＤＮＡをそのストレプトアビジン担持補体鎖とハイブリダイズさせた後、ビオチンタグに連結され、ストレプトアビジン修飾ＣＡＰチップ（Ｃｙｔｉｖａ）の表面に捕捉されている（図１を参照されたい）。
【0102】
この実施例では、約２２５０ＲＵまで固定化を行った。
【0103】
固定化されたヒトトランスフェリン受容体の表面に、正しく会合した二重特異性抗Ａベータ／トランスフェリン受容体抗体を含むサンプルをアプライした。当該正しく会合した抗体は、固定化ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。これにより、ＳＰＲシグナルが生成される。チップの表面から抗体を解離させるために、二重特異性抗体またはヒトトランスフェリン受容体に結合する任意の他の化合物を含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録し、これを基準値とする。
【0104】
本発明による方法におけるヒトトランスフェリン受容体へのアビド結合を有する抗体関連副産物の存在／量を決定するために、固定化トランスフェリン受容体チップの表面を前に概説したように調製した。固定されたヒトトランスフェリン受容体を有するこの表面に、正しく会合した抗体ならびにホモ二量体抗体関連アビド結合性副産物を含むサンプルをアプライした。抗体および副産物は、固定化されたヒトトランスフェリン受容体に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。
【0105】
低濃度の副産物では、正しく会合した抗体と抗体関連ホモ二量体副産物との重量差は非常に小さく、サンプルをチップの表面にアプライした後の正しく会合した抗体のみの結合と比較して、ＳＰＲシグナルの検出可能な差は実質的に生じない。
【0106】
しかし、固定化されたトランスフェリン受容体への二価およびアビド結合による抗体関連ホモ二量体副産物は、固定化されたトランスフェリン受容体に対して一価のみであり、アフィン結合のみを有する正しく会合した抗体と置換するので、負荷（ローディング）段階中にチップの表面に蓄積する。アビド結合性副産物とトランスフェリン受容体との複合体は、正しく会合したアフィン結合性抗体の複合体よりも複合体安定性が高く、それによってその蓄積が達成される。
【0107】
正しく会合した抗体ならびにアビド結合性副産物をチップの表面から解離させるために、当該抗体またはヒトトランスフェリン受容体に結合する任意の他の化合物を含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録し、これはシグナル値である。
【0108】
解離の開始後の規定の時点で、シグナル値と基準値との差を決定する。この差は、残留結合と呼ばれる。
【0109】
残留結合は、サンプル中の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の量に依存する。
【0110】
例示的なＳＰＲセンサーグラムを図２に示す（ＲＳ＝正しく会合した抗体；ｋ／ｋ＝ノブ－ノブ－ホモ二量体）。
【0111】
既知量の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物を、単離された正しく会合した抗体サンプルに添加することによって、種々の標準物質を調製し、検量線を作成した。検量線は、少なくとも５％（ｗ／ｗ）の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物含量まで直線であり（図３を参照されたい）、Ｒ２値は０．９７８５である。
【0112】
したがって、決定された残留結合は、アプライされたサンプル中の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の量と直接相関し得る／直接相関する。
【0113】
本発明による方法を適用することにより、サンプル中の少量の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物を定量することが可能になる。特に、抗体関連アビド結合性副産物の２％をはるかに下回る量の定量が可能である。
【0114】
２＋１フォーマットの抗体についての本実施例の条件：
・ 抗原の固定化レベル＝２２５０ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝３０μｌ／分
・ 結合時間＝１８０秒
・ 解離時間＝６００秒
・ 温度＝２５℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－ＥＰ＋
・ 抗原の固定化レベル＝２２５０ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝３０μｌ／分
・ 結合時間＝１８０秒
・ 解離時間＝６００秒
・ 温度＝２５℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－ＥＰ＋
【0115】
基準値およびシグナル値の逐次的な決定／記録に加えて、ＳＰＲチップまたは種々のＳＰＲデバイスの種々のフローセルを使用して並列に行い得ることを指摘する必要がある。
【0116】
しかしながら、ブランクセルに適用される基準、すなわちブランクセルで得られた結果の減算を考慮する必要がある。これは、任意の独立した／非特異的な結合の影響を排除するために行われる。
【0117】
ＴＣＢフォーマット抗体を用いる本発明による方法
これは、本発明による方法の第２の実施例である。本発明による方法は、二重特異性抗ＣＤ３／抗原－２抗体を用いて以下に例示される。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
これは、本発明による方法の第２の実施例である。本発明による方法は、二重特異性抗ＣＤ３／抗原－２抗体を用いて以下に例示される。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【0118】
本実施例では、二重特異性抗ＣＤ３／抗原－２抗体を使用する。この抗体は、抗原－２に（特異的に）結合する２つのＦａｂと、抗原－２に（特異的に）結合する全長抗体のＦａｂの１つとヒンジ領域との間に挿入されたＣＤ３に（特異的に）結合する１つのさらなる単一特異性Ｆａｂとを含むＹ字形全長抗体に基づく。この抗体フォーマットは、ＴＣＢ（Ｔ細胞活性化二重特異性抗体フォーマット）と呼ばれる。
【0119】
ＴＣＢは、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に（特異的に）結合するそれらのＣＤ３結合部位を介してＴ細胞と結合する。ＴＣＢの場合、２つのＣＤ３結合部位を含むホモ二量体副産物は、ＴＣＲ二量体化によって標的細胞の非存在下でＴ細胞を活性化する能力のために、重大な安全リスクをもたらす。この非特異的な（標的細胞非依存性としても知られる）Ｔ細胞活性化は、サイトカイン分泌を誘導し得るか、または患者において望ましくない免疫応答を誘因し得る。２つのＣＤ３結合部位を含む抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物による非特異的なＴ細胞活性化は、望ましくない活性であり、正しく会合したＴＣＢにより意図されたＴ細胞活性化とは異なる。したがって、２つのＣＤ３結合部位を含む抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の量を決定することが重要である。
【0120】
二重特異性抗ＣＤ３／抗原－２抗体は２つの異なる重鎖を含むので、重鎖のＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化戦略（前掲のＭｅｒｃｈａｎｔらを参照されたい）に従って修飾されている。ＣＤ３に（特異的に）結合するさらなるＦａｂが挿入された伸長重鎖はノブ変異を含み、他方の非伸長重鎖はホール変異を含む。
【0121】
この例示的な抗体では、本発明による方法で検出される抗体関連アビド結合性副産物は、それぞれ挿入されたＦａｂを有する２つの重鎖を含むホモ二量体、すなわちＣＤ３に対する２つの結合部位を含む化合物である。正しく会合した二重特異性抗体は、上記で概説したように、ＣＤ３に対する１つの結合部位のみを含む。この副産物は、ＣＤ３への二価結合に起因して非特異的なＴ細胞活性化をもたらす可能性があるので、検出されなければならない。
【0122】
本発明による方法により、検出される副産物が、正しく会合した抗体と比較して、結合部位を含む抗原の数が増加しており、すなわちこの場合は１つではなく２つがＳＰＲチップの表面に固定化されている。この実施例では、固定化は直接固定化であった。抗原、すなわちＣＤ３は、製造業者の指示に従ってアミンカップリングによってチップの表面に固定化されている。
【0123】
製造業者の指示に従ってアミンカップリングを使用してＣＭ５チップ上に、ＣＤ３を約６９００ＲＵまで固定化した。
【0124】
固定化ＣＤ３を有する表面に、正しく会合した二重特異性抗体を含むサンプルをアプライした。正しく会合した二重特異性抗体は、固定化ＣＤ３に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。これにより、ＳＰＲシグナルが生成される。チップの表面から二重特異性抗体を解離させるために、二重特異性抗体またはＣＤ３に結合する任意の他の化合物を含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録し、これを基準値とする。
【0125】
方法の第２の部分では、固定化されたＣＤ３チップの表面は、前に概説したように調製されている。固定されたＣＤ３を有するこの表面に、正しく会合した二重特異性抗体ならびに二重特異性抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物を含むサンプルをアプライした。両方とも固定化ＣＤ３に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。
【0126】
正しく会合した抗体と抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物との重量差は非常に小さいので、正しく会合した抗体の結合のみと比較して、ＳＰＲシグナルの検出可能な差は実質的に生じない。
【0127】
しかしながら、固定化されたＣＤ３への二価およびアビド結合によるホモ二量体副産物は、チップの表面に蓄積する。これは、固定化されたＣＤ３に対して一価のみであり、負荷段階中にアフィン結合のみを有する正しく会合した二重特異性抗体に取って代わる。アビド結合した二重特異性抗体関連副産物の複合体は、正しく会合したアフィン結合性二重特異性抗体の複合体と比較してより高い複合体安定性を有し、それによって負荷段階中の蓄積が可能である。
【0128】
正しく会合した二重特異性抗体およびアビド結合性副産物をチップの表面から解離させるために、抗体またはＣＤ３に結合する任意の他の化合物を含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録し、これはシグナル値である。
【0129】
解離の開始後の規定の時点で、シグナル値と基準値との差を決定する。この差は、残留結合と呼ばれる。
【0130】
残留結合は、サンプル中の二重特異性抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の量に依存する。
【0131】
検量線を決定するための２つの異なるアプローチが使用されている。１つ目（図４の上の曲線）では、アビド結合性副産物（ノブ－ノブホモ二量体；ＫＫ）の添加を、単離された二重特異性抗体に対して、すなわち、検出可能な量のアビド結合性副産物を含まない調製物に対して行った（Ｒ２値０．９９９４）。２つ目（図４の下側の曲線）では、検出可能な量のアビド結合性副産物を既に含む参照物質（Ｒ２値０．９９９８の）中でアビド結合性副産物の添加を行った。この場合、検量線も確立し得ることがわかる。検量線は、少なくとも２％（ｗ／ｗ）のホモ二量体副産物まで直線である。
【0132】
したがって、決定された残留結合は、アプライされたサンプル中の二重特異性抗体ホモ二量体アビド結合性副産物の量と相関させ得る。
【0133】
本発明による方法を適用することにより、サンプル中の少量のホモ二量体副産物を定量することが可能になる。
【0134】
ＴＣＢフォーマットの抗体についての本実施例の条件の概要：
・ 抗原の固定化レベル＝６９００ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝２０μｌ／分
・ 結合時間＝４８０秒
・ 解離時間＝１２００秒
・ 温度＝３７℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－Ｐ＋
・ 抗原の固定化レベル＝６９００ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝２０μｌ／分
・ 結合時間＝４８０秒
・ 解離時間＝１２００秒
・ 温度＝３７℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－Ｐ＋
【0135】
ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット抗体を用いる本発明による方法
これは、本発明による方法のさらなる例である。この実施例では、本発明による方法は、２つの異なるＣＤ抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を用いて例示される。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
これは、本発明による方法のさらなる例である。この実施例では、本発明による方法は、２つの異なるＣＤ抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を用いて例示される。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【0136】
本実施例で使用される二重特異性抗体は、第１のＣＤ抗原に特異的に結合する１つの結合部位と、第２の異なるＣＤ抗原に特異的に結合する１つの結合部位とを含むＹ字形完全長抗体である。二重特異性抗体は、いわゆるＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットである（上記参照）。
【0137】
二重特異性抗体は２つの異なる重鎖を含むので、重鎖のＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化戦略（前掲のＭｅｒｃｈａｎｔらを参照されたい）に従って修飾されている。第１のＣＤ抗原に結合する重鎖はノブ変異を含み、他方の重鎖はホール変異を含む。
【0138】
この例示的抗体について、本発明による方法で検出される抗体関連アビド結合性副産物は、両方とも第１のＣＤ抗原に結合する２つの重鎖を含む、ホモ二量体である。正しく会合した二重特異性抗体は、各ＣＤ抗原に対して１つの結合部位のみを含む。
【0139】
第１のＣＤ抗原に対する二価結合体は、第１のＣＤ抗原への二価結合に起因して検出されなければならず、有害な、すなわち毒性副作用が、例えば標的非依存性Ｔ細胞活性化によって生じ得る。したがって、これらの抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物は、Ｔ細胞の標的に依存しない活性化により、潜在的な安全性リスクとなる可能性があるため、モニタリングと（正確な）定量化が必要である。
【0140】
本発明による方法によれば、抗原であって、正しく会合した抗体と比較して多い数（すなわち１つではなく２つ）の、当該抗原に対する結合部位が、検出される副産物に含まれる、抗原が、ＳＰＲチップの表面に固定化されている。この実施例では、第１のＣＤ抗原の固定化は、チップの表面への直接固定化であった。
【0141】
第１のＣＤ抗原の固定化は、２０００ＲＵ超で行った。しかしながら、４０００ＲＵを超えてはならないことがわかっている。
【0142】
固定化された第１のＣＤ抗原を有する表面に、正しく会合した抗体を含むサンプルをアプライした。当該正しく会合した抗体は、固定化されたＣＤ抗原に特異的に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。これにより、ＳＰＲシグナルが生成される。チップの表面から抗体を解離させるために、二重特異性抗体も、第１のＣＤ抗原に結合する任意の他の化合物も含まない、緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録し、これを基準値とする。
【0143】
上に概説したように、第１のＣＤ抗原に対する結合価が増加した様々な可能な副産物もチップにアプライされている（図５を参照されたい）。正しく会合した二重特異性抗体よりもアビド結合が安定しているため、抗体に関連する全てのアビド結合性副産物（（Ｋ）ノブ単量体（溶液中で自発的に会合してホモ二量体となる（ＳＥＣで確認））、（ＫＫ）ノブ－ノブホモ二量体（共有結合型と非共有結合型は類似の挙動を示す）、および様々な凝集体を含む溶液を含む）が表面に保持されていることがわかる。
【0144】
単離されたアビド結合性副産物は検出可能な解離速度で解離しないが（図６参照）、正しく会合した二重特異性抗体（ｂｓｍＡｂ）は解離することがわかる。
【0145】
一価の抗体形態とアビド結合性の抗体形態との間の複合体安定性の差を強調し、より明確に利用するために、長い解離相を使用し得る。これにより、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体（一価の第１および第２ＣＤ抗原結合）がチップの表面から解離させる。対照的に、第１のＣＤ抗原に対する二価および多価のアビド結合性相互作用を有する全ての種が保持される。ＳＰＲの読み出し、すなわち「残留結合（residual binding）」は、長い解離相の後、例えば解離の開始後約１２００秒後に決定され得る。
【0146】
固定化された第１のＣＤ抗原チップの表面は、前に概説したように調製されている。この表面に、１つの単離されたノブ重鎖（単量体副産物）を含むサンプルならびにホモ二量体副産物をアプライした。全ての抗体が、固定化された第１のＣＤ抗原に（特異的に）結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる（図６および図７を参照されたい）。分析データに基づいて、単量体ノブ副産物はその場で二量体化し、ホモ二量体副産物を形成すると推測される。
【0147】
結合したホモ二量体アビド結合性副産物の複合体は、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性抗体の複合体よりも複合体安定性が高く、そのため、このホモ二量体アビド結合性副産物の負荷段階中に蓄積が起こる。
【0148】
正しく会合した抗体ならびにホモ二量体アビド結合性副産物をチップの表面から解離させるために、当該抗体または第１のＣＤ抗原に結合する任意の他の化合物を含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録した。ホモ二量体アビド結合性副産物について、顕著な残留結合が決定され得ることがわかる（図６および図７を参照されたい）。
【0149】
方法の第２の部分では、固定化された第１のＣＤ抗原のチップ表面は、前に概説したように調製されている。固定された第１のＣＤ抗原を有するこの表面に、正しく会合した抗体のみを含むサンプル、ならびに１％（ｗ／ｗ）の種々の抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物を添加したサンプルをアプライした。全てが、固定化された第１のＣＤ抗原に結合し、それによってチップの表面に結合した状態になる。
【0150】
正しく会合したヘテロ二量体抗体とホモ二量体アビド結合性副産物との重量差は小さすぎて、ＳＰＲシグナルに検出可能な差をもたらし得ない。
【0151】
同様に、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳまたはＨＩＣなどの他の生化学的方法を使用しても、これらの方法での識別に使用される分子特性は同じであるため、差を検出し得ない。本発明による方法によってのみ、種々の速度論的結合特性による区別を達成し得る。この差は全てのヘテロ二量体抗体フォーマットに存在するので、本発明による方法は、抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の決定のための少なくとも任意のそのようなフォーマットに適用し得る。
【0152】
固定化された第１のＣＤ抗原への二価およびアビド結合によるホモ二量体副産物は、チップの表面に蓄積する。これは、正しく会合したがアフィン結合性のみの（固定された第１のＣＤ抗原に対して一価のみであり、したがってアフィン結合のみを有する）二重特異性抗体と置き換わる。結合した抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の複合体は、正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体の複合体よりも複合体安定性が高い。そのため、副産物の蓄積が可能である。
【0153】
正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体ならびに抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物をチップの表面から解離させるために、当該抗体も第１のＣＤ抗原に結合する任意の他の化合物も含まない緩衝水溶液をチップにアプライした。ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰を記録したが、これはシグナル値である。
【0154】
解離の開始後の規定の時点で、シグナル値と基準値との間の差が決定され得る／決定される。この差は、残留結合と呼ばれる。
【0155】
この効果は図８に示されており、１％（ｗ／ｗ）のアビド結合性副産物が、単離された正しく会合した抗体（ＬＳ）に添加されている（１００ｎＭの正しく会合した抗体に１ｎＭの副産物が添加されている）。
【0156】
残留結合差は、サンプル中のホモ二量体副産物の量に依存する。
【0157】
全ての異なる抗体関連の二価および多価の第１ＣＤ抗原アビド結合性副産物を一緒に、すなわち合計として、定量する。
【0158】
単離されたヘテロ二量体アフィン結合性二重特異性抗体を利用できない場合、「標準添加による較正」によって定量し得る。定義されたホモ二量体分子（ホモ二量体アビド結合性副産物）を副産物標準として使用する。計算後、「高活性な二価の第１ＣＤ抗原結合体の合計の％値」は、「ホモ二量体標準の％値相当」として与えられる。
【0159】
解離の開始後の規定の時点で、シグナル値と基準値との差を決定する。この差は、残留結合と呼ばれる。
【0160】
残留結合差は、サンプル中のホモ二量体アビド結合性副産物の量に依存する。
【0161】
既知量のホモ二量体アビド結合性副産物を、単離された正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性抗体サンプルに添加することによって、種々の標準物質を調製し、検量線を作成した。検量線は、少なくとも２％（ｗ／ｗ）のホモ二量体副産物含有量まで直線である（Ｒ２値０．９９９７）（図９を参照されたい）。
【0162】
したがって、決定された残留結合は、サンプル中のホモ二量体アビド結合性副産物の量と関連付けられ得る。
【0163】
本発明による方法を適用することにより、サンプル中の少量のホモ二量体アビド結合性副産物を定量することが可能になる。
【0164】
ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットの抗体について本実施例で使用した条件：
・ 抗原の固定化レベル＝２０００ＲＵ～４０００ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝２０μｌ／分
・ 結合時間＝４８０秒
・ 解離時間＝１２００秒
・ 温度＝２５℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－Ｐ＋
・ 抗原の固定化レベル＝２０００ＲＵ～４０００ＲＵ
・ 抗体濃度＝１００ｎＭ
・ 検体流量＝２０μｌ／分
・ 結合時間＝４８０秒
・ 解離時間＝１２００秒
・ 温度＝２５℃
・ 緩衝液組成＝ＨＢＳ－Ｐ＋
【0165】
本発明による方法の一般条件：
－ 少なくとも約２０００ＲＵ、好ましい一実施形態では２０００ＲＵ～８０００ＲＵの範囲の抗原固定量
－ １８０秒～４８０秒の範囲、好ましい一実施形態では約３６０秒のローディング時間
－ ５０ｎＭ～２００ｎＭの範囲、好ましい一実施形態では約１００ｎＭの、サンプル中の正しく会合した抗体の濃度
－ １０μＬ／分～３０μＬ／分の範囲の流量、好ましい一実施形態では約２０μＬ／分～約３０μＬ／分の範囲の流量
－ 残留結合は、解離が開始した後の任意の時点で決定し得、好ましい一実施形態では、残留結合は、少なくとも４００秒後、少なくとも４８０秒後、または少なくとも１２００秒後に決定し得る
－ 残留結合は副産物の結合活性に依存するので、正しく会合した抗体とホモ二量体副生成物との間にオフレート差は必要ではない
－ 残留結合は、流量および時間によって調整し得る
－ 少なくとも約２０００ＲＵ、好ましい一実施形態では２０００ＲＵ～８０００ＲＵの範囲の抗原固定量
－ １８０秒～４８０秒の範囲、好ましい一実施形態では約３６０秒のローディング時間
－ ５０ｎＭ～２００ｎＭの範囲、好ましい一実施形態では約１００ｎＭの、サンプル中の正しく会合した抗体の濃度
－ １０μＬ／分～３０μＬ／分の範囲の流量、好ましい一実施形態では約２０μＬ／分～約３０μＬ／分の範囲の流量
－ 残留結合は、解離が開始した後の任意の時点で決定し得、好ましい一実施形態では、残留結合は、少なくとも４００秒後、少なくとも４８０秒後、または少なくとも１２００秒後に決定し得る
－ 残留結合は副産物の結合活性に依存するので、正しく会合した抗体とホモ二量体副生成物との間にオフレート差は必要ではない
－ 残留結合は、流量および時間によって調整し得る
【0166】
本発明の具体的な実施形態：
１．正しく会合した二重特異性抗体と、二重特異性抗体の１つ以上のアビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のアビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、
正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
二重特異性抗体のアビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、
本方法は、：
ｉ）正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、二重特異性抗体のアビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法。
２．第１抗原が、少なくとも２０００ＲＵで固定化されている、実施形態１に記載の方法。
３．第１抗原が、２０００ＲＵ以上かつ８０００ＲＵ以下で固定化されている、実施形態１または２に記載の方法。
４．ローディング溶液および／またはサンプルのアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも３００秒間である、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．ローディング溶液および／またはサンプルのアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも４００秒間である、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．解離溶液のアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも６００秒間である、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．解離溶液のアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも１２００秒間である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．ローディング溶液およびサンプルのアプライが同じ条件下である、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
９．工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライが、同じ条件下である、実施形態１～３および６～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．流量が１５μＬ／分～３５μＬ／分である、実施形態４～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．工程ｉｉｉ）における決定が、解離溶液のアプライの開始後少なくとも４００秒の時点で決定されたＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライの開始時のローディング溶液で得られたＳＰＲシグナルが同一とされる、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．工程ｉｉｉ）における決定が、解離溶液のアプライの開始後少なくとも１２００秒の時点で決定されたＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライの開始時のローディング溶液で得られたＳＰＲシグナルが同一とされる、実施形態１～６および８～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．抗体が、
ｉ）ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉ）ＴＣＢフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉｉ）２＋１フォーマットの二重特異性抗体である、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を決定するためのものである、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を定量するためのものである、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１．正しく会合した二重特異性抗体と、二重特異性抗体の１つ以上のアビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のアビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、
正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
二重特異性抗体のアビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、第１抗原に対する結合部位を含み、
本方法は、：
ｉ）正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定されたＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、二重特異性抗体のアビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法。
２．第１抗原が、少なくとも２０００ＲＵで固定化されている、実施形態１に記載の方法。
３．第１抗原が、２０００ＲＵ以上かつ８０００ＲＵ以下で固定化されている、実施形態１または２に記載の方法。
４．ローディング溶液および／またはサンプルのアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも３００秒間である、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．ローディング溶液および／またはサンプルのアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも４００秒間である、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．解離溶液のアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも６００秒間である、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．解離溶液のアプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも１２００秒間である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．ローディング溶液およびサンプルのアプライが同じ条件下である、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
９．工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライが、同じ条件下である、実施形態１～３および６～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．流量が１５μＬ／分～３５μＬ／分である、実施形態４～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．工程ｉｉｉ）における決定が、解離溶液のアプライの開始後少なくとも４００秒の時点で決定されたＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライの開始時のローディング溶液で得られたＳＰＲシグナルが同一とされる、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．工程ｉｉｉ）における決定が、解離溶液のアプライの開始後少なくとも１２００秒の時点で決定されたＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における解離溶液のアプライの開始時のローディング溶液で得られたＳＰＲシグナルが同一とされる、実施形態１～６および８～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．抗体が、
ｉ）ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉ）ＴＣＢフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉｉ）２＋１フォーマットの二重特異性抗体である、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を決定するためのものである、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を定量するためのものである、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【0167】
図面および実施例
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加え得ることが理解される。
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加え得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【0168】
【図1】チップ上にプレコートされた一本鎖ＤＮＡをそのストレプトアビジン担持補体鎖とハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン修飾ＣＡＰチップの表面にビオチンタグを介してヒトトランスフェリン受容体を間接的に固定化するアッセイ設定の概略図。
【図2】抗体を含まない緩衝水溶液の使用による、チップの表面からの、単離された正しく会合した抗体（下側の曲線；赤色）ならびに２０％のアビド結合性副産物を含むサンプル（上側の曲線；緑色）の解離中のＳＰＲシグナルの減衰。上側のシグナル値と下側のシグナル値との差が残留結合である。
【図3】本発明による方法を用いて確立された２＋１フォーマットの二重特異性抗体のアビド結合性副産物の決定のための検量線。
【図4】本発明による方法を用いて確立されたＴＣＢフォーマットの二重特異性抗体のアビド結合性副産物の決定のための検量線。上側の曲線：単離された抗体へのアビド結合性副産物の添加；下側の曲線：アビド結合性副産物を既に含む参照材料中のアビド結合性副産物の添加。
【図5】第１のＣＤ抗原に対する結合価が増加した、単離された様々な可能性のある副産物のＳＰＲセンサーグラム。
【図6】アビド結合性副産物の量に応じた残留結合を示すＳＰＲセンサーグラム。
【図7】抗体を含まない緩衝水溶液を使用して、正しく会合した抗体ならびにホモ二量体アビド結合性副産物をチップの表面から解離させると、ＳＰＲ（結合）シグナルの減衰が記録され、これにより、ホモ二量体アビド結合性副産物について、顕著な残留結合が決定され得ることが示された。
【図8】１％（ｗ／ｗ）のアビド結合性副産物（１００ｎＭの正しく会合した抗体に添加された１ｎＭの副産物）を含むサンプルのＳＰＲシグナルの減衰。
【図9】既知量のホモ二量体アビド結合性副産物を、単離された正しく会合したヘテロ二量体アフィン結合性抗体サンプルに添加することによって、本発明による方法を用いて決定された検量線；種々の標準を調製し、検量線を作成した－検量線は、少なくとも２％（ｗ／ｗ）のホモ二量体副産物含有量まで直線である。
【実施例】
【0169】
実施例の説明
実施例１
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：２＋１－フォーマット／抗Ａベータ／ＴｆＲ二重特異性抗体
ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＡＰチップ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器にドッキングし、ベンダーによって提供された指示に従って調製した。次いで、複数のアッセイサイクルを実施した。全てのサイクルは、チップの表面上のストレプトアビジンを結合させるための製造業者の指示によるハイブリダイゼーション工程からなった。これに続いて、１μＭのビオチン化トランスフェリン受容体溶液を、５μｌ／分の流量で１８０秒間注入した。その後、サンプルをフローチャンバーに、３０μｌ／分の流量で１８０秒間注入し（結合相）、その後、同じ流量で６００秒間、緩衝液に切り替えることによってトランスフェリン受容体から解離させた。最後に、ＳＡ ＣＡＰキットに含まれる溶液を用いてチップの表面を再生した。
実施例１
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：２＋１－フォーマット／抗Ａベータ／ＴｆＲ二重特異性抗体
ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＡＰチップ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器にドッキングし、ベンダーによって提供された指示に従って調製した。次いで、複数のアッセイサイクルを実施した。全てのサイクルは、チップの表面上のストレプトアビジンを結合させるための製造業者の指示によるハイブリダイゼーション工程からなった。これに続いて、１μＭのビオチン化トランスフェリン受容体溶液を、５μｌ／分の流量で１８０秒間注入した。その後、サンプルをフローチャンバーに、３０μｌ／分の流量で１８０秒間注入し（結合相）、その後、同じ流量で６００秒間、緩衝液に切り替えることによってトランスフェリン受容体から解離させた。最後に、ＳＡ ＣＡＰキットに含まれる溶液を用いてチップの表面を再生した。
【0170】
上記のように実施した連続サイクルでは、ある範囲（０％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、５０％および１００％の抗体副産物）の抗体－抗体副産物混合物をサンプルとして使用した。得られたシグナルを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて処理した。「結果プロット」機能を使用して、捕捉レベルを調整し、解離相が終了する前に、報告されたシグナルを１０秒間直線的に当てはめた。
【0171】
アッセイは、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４を含有する緩衝水溶液）を、ランニング緩衝液およびサンプル緩衝液として用いて２５℃で行った。
【0172】
実施例２
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：ＴＣＢ－フォーマット
少量の二価ＣＤ３結合ホモ二量体副産物の定量のために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。ＣＤ３抗原を、アミンカップリングによって、ＣＭ５チップ（ＣＤ３抗原ストック溶液をｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した）上に、６０００ＲＵ超になるように固定化した。固定化後、ランニングおよび希釈緩衝液としてＨＢＳ－Ｐ＋（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４を含む緩衝水溶液）を使用して、３７℃で分析を実施した。分析するサンプルを１００ｎＭの抗体濃度に希釈した。較正標準を以下のように調製した：規定量の副産物を１００ｎＭのサンプルに添加した（例えば、０．２５％、０．５％、１％、２％のノブ－ノブホモ二量体（ＫＫ）種）。サンプルおよび較正標準を、ＣＤ３誘導体化チップ表面に、４８０秒間注入した。２０μｌ／分の流量での１２００秒の解離時間の後、表面の再生、３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液による６０秒間の再生ステップが続いた。データは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎの機能を使用した濃度分析を使用して分析した。較正設定は、以下のように指定される：フローセル：ＦＣ２－１またはＦＣ４－３、レポートポイント：１２００秒での安定性、応答タイプ：相対応答、フィッティング機能：線形。定量は、標準添加による較正によって行われる。ホモ二量体ＣＤ３の％値：ＫＫ相当＝切片／勾配。
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：ＴＣＢ－フォーマット
少量の二価ＣＤ３結合ホモ二量体副産物の定量のために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。ＣＤ３抗原を、アミンカップリングによって、ＣＭ５チップ（ＣＤ３抗原ストック溶液をｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した）上に、６０００ＲＵ超になるように固定化した。固定化後、ランニングおよび希釈緩衝液としてＨＢＳ－Ｐ＋（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４を含む緩衝水溶液）を使用して、３７℃で分析を実施した。分析するサンプルを１００ｎＭの抗体濃度に希釈した。較正標準を以下のように調製した：規定量の副産物を１００ｎＭのサンプルに添加した（例えば、０．２５％、０．５％、１％、２％のノブ－ノブホモ二量体（ＫＫ）種）。サンプルおよび較正標準を、ＣＤ３誘導体化チップ表面に、４８０秒間注入した。２０μｌ／分の流量での１２００秒の解離時間の後、表面の再生、３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液による６０秒間の再生ステップが続いた。データは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎの機能を使用した濃度分析を使用して分析した。較正設定は、以下のように指定される：フローセル：ＦＣ２－１またはＦＣ４－３、レポートポイント：１２００秒での安定性、応答タイプ：相対応答、フィッティング機能：線形。定量は、標準添加による較正によって行われる。ホモ二量体ＣＤ３の％値：ＫＫ相当＝切片／勾配。
【0173】
実施例３
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット
少量の第１ＣＤ抗原結合ホモ二量体副産物の定量のために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。第１ＣＤ抗原を、１０μＬ／分の流量でＳＡチップ上に２０００ＲＵ～４０００ＲＵのレベルで固定化した（第１ＣＤ抗原ストック溶液をＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した）。固定化後、分析を、ランニング緩衝液および希釈緩衝液としてＨＢＳ－Ｐ＋を用いて２５℃で実施した。分析する抗体サンプルを１００ｎＭに希釈した。並行して、標準添加による較正のためにいくつかのサンプルを調製した：規定量の副産物を１００ｎＭの抗体サンプルに添加した（例えば、０．２５％、０．５％、１％および２％のノブ－ノブホモ二量体（ＫＫ）副産物）。抗体サンプルおよび較正サンプルを、２０μＬ／分の流量で、第１ＣＤ抗原のチップの表面に４８０秒間注入した。２０μｌ／分の流量での１２００秒の解離後、「Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液ｐＨ６．６」（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２１０１３）を用いて、表面を１２０秒間再生した。データ分析：データは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎの機能を使用した濃度分析を使用して分析した。較正設定は、以下のように指定される：フローセル：ＦＣ２－１またはＦＣ４－３、レポートポイント：１２００秒での安定性、応答タイプ：相対応答、フィッティング機能：線形。定量は、標準添加による較正によって行われる。ホモ二量体ＫＫ第１ＣＤ抗原の％値：ＫＫ相当＝切片／勾配。
本発明による方法を用いたアビド結合性副産物の決定：ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット
少量の第１ＣＤ抗原結合ホモ二量体副産物の定量のために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した。第１ＣＤ抗原を、１０μＬ／分の流量でＳＡチップ上に２０００ＲＵ～４０００ＲＵのレベルで固定化した（第１ＣＤ抗原ストック溶液をＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した）。固定化後、分析を、ランニング緩衝液および希釈緩衝液としてＨＢＳ－Ｐ＋を用いて２５℃で実施した。分析する抗体サンプルを１００ｎＭに希釈した。並行して、標準添加による較正のためにいくつかのサンプルを調製した：規定量の副産物を１００ｎＭの抗体サンプルに添加した（例えば、０．２５％、０．５％、１％および２％のノブ－ノブホモ二量体（ＫＫ）副産物）。抗体サンプルおよび較正サンプルを、２０μＬ／分の流量で、第１ＣＤ抗原のチップの表面に４８０秒間注入した。２０μｌ／分の流量での１２００秒の解離後、「Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液ｐＨ６．６」（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２１０１３）を用いて、表面を１２０秒間再生した。データ分析：データは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎの機能を使用した濃度分析を使用して分析した。較正設定は、以下のように指定される：フローセル：ＦＣ２－１またはＦＣ４－３、レポートポイント：１２００秒での安定性、応答タイプ：相対応答、フィッティング機能：線形。定量は、標準添加による較正によって行われる。ホモ二量体ＫＫ第１ＣＤ抗原の％値：ＫＫ相当＝切片／勾配。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
正しく会合した二重特異性抗体と、前記二重特異性抗体の１つ以上のアビド結合性副産物とを含むサンプル中の二重特異性抗体のアビド結合性副産物を、表面プラズモン共鳴を用いて決定するための方法であって、前記正しく会合した二重特異性抗体は、１つ以上の、第１抗原に対する結合部位と、１つ以上の、第２抗原に対する結合部位とを含み、
前記二重特異性抗体の前記アビド結合性副産物は、２つ以上、かつ、前記正しく会合した二重特異性抗体よりも多くの、前記第１抗原に対する結合部位を含み、
前記方法は、
ｉ）前記正しく会合した二重特異性抗体を含むローディング溶液を、前記第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、前記第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液をＳＰＲチップにアプライし、前記ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉ）前記二重特異性抗体のアビド結合性副産物を含む疑いのあるサンプル溶液を、前記第１抗原が少なくとも１０００ＲＵで固定化されたＳＰＲ表面にアプライしてＳＰＲシグナルを生成させ、その後、前記第１抗原に結合する化合物を含まない解離溶液を前記ＳＰＲチップにアプライし、前記ＳＰＲシグナルの減衰を記録する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定された前記ＳＰＲシグナルの減衰が工程ｉ）で決定された前記ＳＰＲシグナルの減衰よりも遅い場合に、前記二重特異性抗体の前記アビド結合性副産物を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記第１抗原が、少なくとも２０００ＲＵで固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１抗原が、２０００ＲＵ以上かつ８０００ＲＵ以下で固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ローディング溶液および／または前記サンプルの前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも３００秒間である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ローディング溶液および／または前記サンプルの前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも４００秒間である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記解離溶液の前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも６００秒間である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記解離溶液の前記アプライが、５μＬ／分～５０μＬ／分の流量で少なくとも１２００秒間である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ローディング溶液および前記サンプルの前記アプライが同じ条件下である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライが、同じ条件下である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記流量が１５μＬ／分～３５μＬ／分である、請求項４に記載の方法。
【請求項11】
工程ｉｉｉ）における前記決定が、前記解離溶液の前記アプライの開始後少なくとも４００秒の時点で決定された前記ＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライの開始時の前記ローディング溶液で得られた前記ＳＰＲシグナルが同一とされる、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｉｉ）における前記決定が、前記解離溶液の前記アプライの開始後少なくとも１２００秒の時点で決定された前記ＳＰＲシグナルによるものであり、工程ｉ）およびｉｉ）における前記解離溶液の前記アプライの開始時の前記ローディング溶液で得られた前記ＳＰＲシグナルが同一とされる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体が、ｉ）ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉ）ＴＣＢフォーマットの二重特異性抗体、または
ｉｉｉ）２＋１フォーマットの二重特異性抗体
である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を決定するためのものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
抗体関連ホモ二量体アビド結合性副産物の存在を定量するためのものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】