特表 2024-544617 カルバミン酸エチルを効率的に分解するロドトルラ及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】カルバミン酸エチルを効率的に分解するロドトルラ及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/16 20060101AFI20241126BHJP

【ＦＩ】

C12N1/16 G ZNA

C12N1/16 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531507

(86)(22)【出願日】2023-06-27

(85)【翻訳文提出日】2024-06-18

(86)【国際出願番号】 CN2023102849

(87)【国際公開番号】W WO2024037192

(87)【国際公開日】2024-02-22

(31)【優先権主張番号】202210985886.4

(32)【優先日】2022-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507198613

【氏名又は名称】大連工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】張素芳

(72)【発明者】

【氏名】薛思宇

(72)【発明者】

【氏名】朱▲べ▼薇

(72)【発明者】

【氏名】陳映羲

(72)【発明者】

【氏名】梁会朋

(72)【発明者】

【氏名】林心萍

(72)【発明者】

【氏名】紀超凡

(72)【発明者】

【氏名】董亮

(72)【発明者】

【氏名】代藝偉

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA72X

4B065AC20

4B065BA22

4B065CA42

4B065CA56

(57)【要約】

本発明は、カルバミン酸エチルを効率的に分解するロドトルラ及びその使用を開示し、食品バイオテクノロジーの分野に属する。本発明は、カルバミン酸エチル（ＥＣ）を効率的に分解するロドトルラＤＬ－ＸＳＹ０１を提供し、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５３４である。前記ロドトルラＤＬ－ＸＳＹ０１を、スクリーニング、同定、活性化、発酵、および埋め込みで処理することにより、ＥＣ分解製剤が得られる。本発明により得られた菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１は、埋め込みを経た後に分解剤を調製し、発酵食品におけるＥＣを除去するために用いられ、本発明は、更に菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１の分解剤を用いて異なる食品システム中のＥＣを除去し、ＥＣを効果的に除去でき、調製コストが低く、使用しやすく、食品システムから除去しやすいという特徴を有し、酒類飲料、発酵乳製品、醤油、酢などの発酵食品に広く応用される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１であって、既に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５３４であり、寄託日は２０２１年１０月０８日であることを特徴とするロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１。

【請求項2】

請求項１に記載のロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１又はその発酵液の、カルバミン酸エチルを分解可能な製品の調製のための使用。

【請求項3】

前記製品は化学物質又は微生物菌剤である、ことを特徴とする請求項２に記載の使用。

【請求項4】

製品中の前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の添加量が、少なくなくとも３×１０^８ＣＦＵ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記化学物質はカルバミン酸エチル分解剤である、ことを特徴とする請求項４に記載の使用。

【請求項6】

食品中のカルバミン酸エチルを分解する方法であって、食品の製造過程で、請求項１に記載のロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１又はその発酵液を添加してカルバミン酸エチルを分解し、分解後に殺菌し、食品を製造する、ことを特徴とする方法。

【請求項7】

前記食品は、発酵食品、アルコール飲料である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記食品は、白酒、黄酒、赤ワイン、ヨーグルト、酢、醤油である、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項9】

カルバミン酸エチル分解剤であって、前記分解剤は、
（１）請求項１に記載のロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１をＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３２℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４～４８ｈ培養し、シード液を得ることと、
（２）前記シード液を１０％～２０％の接種量に応じて発酵培地に接種し、２５～３２℃で、通気量が０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度が１５０～２５０ｒｐｍであるという条件下で、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬになるまで発酵させ、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物を得ることと、
（３）ステップ（２）で調製した前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物に対する埋め込みを行い、カルバミン酸エチル分解剤を調製することと、
を含む方法に応じて調製する、ことを特徴とするカルバミン酸エチル分解剤。

【請求項10】

請求項１に記載のロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の、カルバミン酸エチル分解のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カルバミン酸エチルを効率的に分解するロドトルラ及びその使用に関し、食品バイオテクノロジーの分野に属する。

【背景技術】

【0002】

カルバミン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ、ＥＣ）は、遺伝毒性や高い発癌性がある代謝生成物であり、アルコール飲料や発酵食品（例えば、腐乳、醤油、チーズ、食酢、キムチなど）に広く含まれる。

【0003】

近年、世界中の学者たちは、相次いで蒸留酒、黄酒とワインにＥＣが含まれていることを発見したが、そのうち、蒸留酒と黄酒中のＥＣの含有量が高く、ワイン中のＥＣの含有量が低い。ＥＣには静菌作用と抗腫瘍作用があり、２０世紀４０年代初期には、ＥＣは麻酔薬として使用され、１９４３年、ＥＣに発癌性があることが判明したが、十分に注目されるには至らなかった。１９７４年、国際がん研究機関はＥＣをグループ２Ｂの発癌性物質に分類し、２００７年、グループ２Ａの発癌性物質に格上げした。同時に、ＥＣには多部位発癌性があり、肺癌、リンパ癌、肝臓癌と皮膚癌などを引き起こす可能性があることが示されている。動物モデルでの実験において、転写因子ＳＴＡＴ３、ＮＦ－ｋＢと細胞外シグナル伝達プロテインキナーゼＥＲＫが、ＥＣにより誘導される腫瘍の発展に関与することが示されている。一方、ＥＣは、酸化ストレス反応を誘導し、解毒能力を低減させ、エネルギーを消耗し、膜構造の完全性を破壊し、ＤＮＡとタンパク質などを破壊することにより、人体肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２の死亡を誘導することも示されている。現在、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品添加物委員会のデータによれば、醸造酒による人体へのＥＣの平均摂取量は６５ｎｇ・ｋｇ^－１・ｄ^－１であり、他の発酵食品より５倍も遥かに高くなっている。

【0004】

ＥＣは、主に、尿素、シトルリン、カルバモイルリン酸などを前駆体として、エタノールとの反応によって生成される。ＥＣの制限方法には主に、前駆体を制限する方法とＥＣを抑制する方法の２つが含まれる。前駆体を制限するためにはしばしば、ウレアーゼを使用して尿素を除去するが、ウレアーゼの特異性が単一であり、前駆体の種類及び異なるシステムの適用性を考慮する必要があり、その有用性は限られている一方、ＥＣの削減は、適用範囲が広く、より一般的に使用され、この方法は一般的に、ＥＣ加水分解酵素及び酵素産生微生物により機能し、ＥＣをエタノール、アンモニアと二酸化炭素に加水分解することを実現する。

【0005】

しかし、現在は、従来のＥＣ分解菌株の資源ライブラリは食品中のＥＣ生分解の現実的なニーズを満たすことができず、ＥＣを分解する菌株が分離され、公に報告されている例は少なく、報告されているＥＣ分解菌株のほとんどが非食品由来であり、更に条件付き病原性菌株であるため、発酵食品中のＥＣを直接除去する菌株の応用は、やや限られている。

【0006】

１９９１年、Ｋｏｂａｓｈｉら（Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９１，３９（１２）：３３０３－３３０６）は、マウスの胃腸管からバチルス・リケニフォルミスＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｐ．をスクリーニングしたが、そのＥＣ加水分解酵素のＥＣに対する親和性が弱いため、実用化には至らなかった。１９９４年、Ｋｏｂａｓｈｉら（Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９４，１７（６）：７７３－７７８）は、またＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｐを分離し、そのＥＣ分解酵素の酵素学的特徴が明らかにされただけで、今まで当該菌株の実用化は報道されていない。１９９７年、Ｍｏｈａｐａｔｒａ（Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，２５（６）：３９３－３９６．）は海洋生物の海綿からＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．を分離し、その中から分離した酸性ＥＣ加水分解酵素は高いエタノール耐性を有するが、今まで当該菌株の実用化は報道されていない。２００６年、Ｙｕｋｉｅら（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，．２００６，７０（４）：４２２－４２９）は、土壌サンプルからＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉを分離し、そのＥＣ加水分解酵素の配列を解析したが、当該酵素のＥＣに対する特異性は高くない。２０１４年、李京京ら（食品とバイオテクノロジー学報，２０１４，３３（１２）：１２３９－１２４５．）は、マウスの胃からＥＣ分解菌株Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓをスクリーニングし、それから精製されたＥＣ加水分解酵素は、醤油中のＥＣを除去する可能性がある。２０１４年、卜攀攀ら（バイオ工学学報，２０１４，３０（３）：４０４－４１１）は、マウスの胃からＥＣ分解菌株クレブシエラ・ニューモニエＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａを取得し、それから耐塩のＥＣ加水分解酵素を分離したが、当該酵素は酸ストレスに耐えられないので、環境のｐＨが６未満である時、酵素活性が顕著に低下し、適用が制限される。２０１７年、劉らはＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＪＮ－Ｂ８１５からカルバミン酸エチル加水分解酵素を取得し、ｐＨ４～７の範囲で酵素活性が８０％残り、エタノール濃度が３５％である時、酵素活性が４０％残る。この酵素はエタノールと酸性環境にある程度耐えられるが、現在までその実用化された例はない。田亜平ら（Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３：１－１１）は、マウスの胃腸管からスクリーニング分離によりＥＣ分解菌株ペニシリウム・バリアビレＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅを取得し、その中からＥＣ加水分解酵素を分離し、当該酵素は白酒中のＥＣを有効に分解することができることが分かった。

【0007】

白酒の醸造過程から分離された菌株では、徐岩ら（Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０１８，６６（６）：１５８３－１５９０．）により白酒発酵過程から分離されたＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＭＴ３と、呉群ら（Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３：１－１３．）により中国白酒の醸造過程から分離されたロドトルラ・ムクラギノーサ菌株と、が報道されていた。発酵食品由来のＥＣ分解菌株の資源ライブラリの拡張が強く求められる。

【0008】

そのため、本発明は、発酵食品中のＥＣを分解することができる微生物に対するスクリーニング、分離、同定と特徴付けを行い、発酵食品由来のＥＣ分解菌株の資源ライブラリを拡張し、発酵食品中のＥＣを低減する効果的な手段を提供し、発酵食品の安全性を確保するための技術サポートを提供する。

【発明の概要】

【0009】

既存の分解菌株が少ない上、そのほとんどが非食品由来であり、ＥＣ分解菌剤がＥＣの分解に有効でないという問題に対し、本発明の目的は、発酵食品から分離された酵母菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１及び当該菌株で調製した分解剤を提供することである。

【0010】

前記ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１は、既に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５３４であり、寄託日は２０２１年１０月０８日である。

【0011】

前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１は、山東粟酢の酢工場の酢醪から分離され、シークエンス結果に対するＢｌａｓｔｎ分析を行い、当該菌とＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓとＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａの相同性が最も高く、いずれも９９％に達することが分かった。モルフォロジーと２６ｓ ｒＲＮＡによる同定によれば、当該菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１はＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓであり、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１と名付ける。

【0012】

前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１はＹＰＤ固体平板において良好に成長し、２８℃で４８ｈ培養し、湿潤、円形、突出、滑らか、薄いピンク色のコロニーを形成し、顕微鏡検査により菌体が楕円形の長手棒状を呈し、４℃で静置した後オレンジ色を示すことが発見されている。最適な成長温度は２８℃で、最適なｐＨは５～６である。

【0013】

本発明は、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１又はその発酵液の、カルバミン酸エチルを分解可能な製品の調製のための使用を提供する。

【0014】

本発明の一実施形態において、前記製品は化学物質又は微生物菌剤である。

【0015】

本発明の一実施形態において、前記微生物菌剤の調製方法は、
（１）上記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１をＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３２℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４～４８ｈ培養し、シード液を得ることと、
（２）前記シード液を１０％～２０％の接種量に応じて発酵培地に接種し、２５～３２℃で、通気量が０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度が１５０～２５０ｒｐｍであるという条件下で、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬになるまで発酵させ、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物を得ることと、
（３）ステップ（２）で調製した前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物に対する埋め込みを行い、微生物菌剤を調製することと、を含む。

【0016】

本発明の一実施形態において、製品中の前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の添加量は、少なくなくとも３×１０^８ＣＦＵ／ｍＬである。

【0017】

本発明の一実施形態において、前記化学物質は、カルバミン酸エチル分解剤、カルバミン酸エチル吸引剤、カルバミン酸エチル抑制剤、カルバミン酸エチル分解剤、カルバミン酸エチル分解生物菌株、カルバミン酸エチル分解微生物菌剤を含むが、これらに限定されない。

【0018】

本発明は、食品中のカルバミン酸エチルを分解する方法を更に提供し、食品の製造過程で、前記ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１又はその発酵液を添加してカルバミン酸エチルを分解し、分解後に殺菌し、食品を製造する。

【0019】

本発明の一実施形態において、前記食品は、発酵食品、アルコール飲料を含むが、これらに限定されない。

【0020】

本発明の一実施形態において、前記食品は、白酒、黄酒、赤ワイン、ヨーグルト、酢、醤油である。

【0021】

本発明は、カルバミン酸エチル分解剤を更に提供し、前記分解剤は、
（１）上記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１をＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３２℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４～４８ｈ培養し、シード液を得ることと、
（２）前記シード液を１０％～２０％の接種量に応じて発酵培地に接種し、２５～３２℃で、通気量が０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度が１５０～２５０ｒｐｍであるという条件下で、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬになるまで発酵させ、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物を得ることと、
（３）ステップ（２）で調製した前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物に対する埋め込みを行い、カルバミン酸エチル分解剤を調製することと、を含む方法に応じて調製する。

【0022】

本発明の一実施形態において、前記発酵培地は、ＹＰＤ液体培地（ペプトン２０．０ｇ、酵母粉末１０．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、蒸留水を１Ｌに補充し、ｐＨを７．０に調節し、高圧で２０ｍｉｎ殺菌する）である。

【0023】

本発明の一実施形態において、前記埋め込みの方法は以下の通りである。

【0024】

Ｓ１、アルギン酸ナトリウム（４％）を、菌含有発酵液、細胞分解液および菌体懸濁液と、それぞれ１：１の割合で混合する。

【0025】

Ｓ２、１０ｍＬ注射器で吸引し、２～１０滴／秒の速度でゆっくり硬化液（０．６％ＣａＣｌ_２の飽和ホウ酸溶液）に滴下し、硬化時間は約５ｈである。

【0026】

Ｓ３、固定化細胞を生理食塩水で３～４回、洗い流し、キトサン（２％）溶液に入れ、４０ｍｉｎラミネートする。

【0027】

Ｓ４、再び０．８％生理食塩水で３～４回、洗い流し、水気を切り、４℃で保管して使用に備える。

【0028】

本発明の一実施形態において、当該ボールは湿潤状態で粒径が３～５ｍｍである。

【0029】

本発明の一実施形態において、ステップ（２）における前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物は、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌含有発酵液、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１発酵液上澄液、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液、を含む。

【0030】

本発明の一実施形態において、前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌含有発酵液は、前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物を乾燥させ、脱イオン水で元の体積の１／２０となるように調製され、
前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液は、前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の発酵生成物を４０００ｇ回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離させて菌体沈殿物を収集し、濃度を２０ ＯＤ_６００に希釈することにより得られ、
前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液は、前記ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液を細胞破砕させることにより得られる。

【0031】

本発明の一実施形態において、前記乾燥方法は凍結真空乾燥を含む。

【0032】

本発明の一実施形態において、ステップ（３）における前記の埋め込みを行った後に固定化ボールを調製する方法は、
Ｓ１、アルギン酸ナトリウム（４％）を、菌含有発酵液、細胞分解液、および菌体懸濁液と、それぞれ１：１の割合で混合することと、
Ｓ２、１０ｍＬ注射器で吸引し、２～１０滴／秒の速度でゆっくり硬化液（０．６％ＣａＣｌ_２の飽和ホウ酸溶液）に滴下し、硬化時間は約５ｈであることと、
Ｓ３、固定化細胞を生理食塩水で３～４回、洗い流し、キトサン（２％）溶液に入れ、４０ｍｉｎラミネートすることと、
Ｓ４、再び０．８％生理食塩水で３～４回、洗い流し、水気を切り、４℃で保管して使用に備えることと、を含む。

【0033】

本発明の一実施形態において、当該ボールは湿潤状態で粒径が３～５ｍｍである。

【0034】

本発明は、上記ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１の、カルバミン酸エチル分解のための使用を更に提供する。

【発明の効果】

【0035】

（１）本発明では、粟酢の酢醪からスクリーニングによりＥＣ高効率な分解菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１を取得し、当該菌株は、ＥＣを唯一の炭素源として利用・増殖することができ、ＥＣを効果的に分解することができ、分解剤によるＥＣの分解率は最大７６％に達し、高いＥＣ生分解効果を有する。

【0036】

（２）本発明で得られた菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１は発酵食品から分離されるため、当該菌株及びこれにより調製したＥＣ分解剤は発酵食品におけるＥＣを除去するために用いられ、白酒中のＥＣの分解率は７６％に達し、本発明により提供される方法は調製コストが低く、使用しやすく、発酵製品システムから除去しやすいなどの特徴を有し、アルコール飲料、ヨーグルト、醤油と酢などの発酵食品の品質と安全性を効果的に向上させることができる。

【0037】

（３）安全性評価によれば、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１は安全である。抗生物質感受性において、菌株が抗生物質セファレキシンに中程度の感受性を示し、１０種類の抗生物質、例えば、セファゾリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、アミカシンアンピシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、ミノサイクリンとペニシリンＧに対して感受性があり、溶血性試験において、ＤＬ－ＸＳＹ０１はヒツジの血液平板において２８℃で培養する時に溶血を示さなかった（γ－溶血）。しかし、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３はβ－溶血作用を示し、陽性対照が成立する。更に大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７はα－溶血を示す。そのため、ＤＬ－ＸＳＹ０１は人体健康に害がない安全な生体であると考えられる。

【0038】

（４）プロバイオティクス評価によれば、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１は人工胃液と人工腸液において良好な生存率を示し、ＤＰＰＨとＡＢＴＳ遊離基に対して良好な消去能力を示し、消去率はそれぞれ、９０．０２％と９３．６７％に達することができる。

【0039】

生体材料の寄託
ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１は、分類によってロドスポリジウム・トルロイデスＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓと名付け、既に２０２１年１０月０８日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５３４であり、寄託住所は北京市朝陽区北辰西路１番の敷地３番、中国科学院微生物研究所である。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】本発明に係るロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１の顕微鏡写真である。

【図2】本発明に係るロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１がＥＣを炭素源とする時のスクリーニング画像である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

下記実施例は、本発明の好ましい実施形態に過ぎないが、本発明の特許請求の範囲はこれに限定されず、本発明は、菌株及び前記菌株に基づく応用思想を主に説明して、実施形態における簡単なパラメータの変更については実施例において詳細な説明を省略し、その他のいかなる変更は、本発明の趣旨と原理を逸脱しない限りなされた変更、修正、代替、組み合わせ、簡略化は、等価な置換方式と見なされるべきであり、本発明に開示される技術範囲内において当業者により得られる他の実施例は、いずれも本発明の特許請求の範囲に含まれるべきである。

【0042】

以下、図面と具体的な実施例に合わせて本発明を更に説明する。特に断りのない限り、本発明の採用した試薬、方法と機器は、本技術分野における通常の試薬、方法と機器であり、特に断りのない限り、以下の実施例で使用される試薬と材料はいずれも市販品である。

【0043】

本発明に使用される様々な培地はいずれも通常方法を用いて調製し、実施例に係る分子生物学操作は、具体的な試験条件と方法が示されていない場合、いずれもＳａｍｂｒｏｏｋＪらにより編集された、科学出版社，２００２，分子クローン実験ガイド（第３版）を、或いは、製品明細書を参照されたい。

【0044】

下記実施例に係る培地の調製は以下のとおりである。

【0045】

ＹＰＤ液体培地：ペプトン２０．０ｇ、酵母粉末１０．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、蒸留水を１Ｌに補充し、ｐＨを７．０に調節し、高圧で２０ｍｉｎ殺菌する。

【0046】

ＹＰＤ固体培地：ペプトン２０．０ｇ、酵母粉末１０．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水を１Ｌに補充し、ｐＨを７．０に調節し、高圧で２０ｍｉｎ殺菌した後、平板に注ぐ。

【0047】

ＹＮＢ液体培地：硫酸アンモニウム５０００ｍｇ、イノシトール２ｍｇ、ナイアシン（ビタミンＢ３）０．４ｍｇ、チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）０．４ｍｇ、硫酸銅０．０４ｍｇ、リン酸二水素カリウム１０００ｍｇ、ホウ酸０．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）０．４ｍｇ、パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）０．４ｍｇ、パラアミノフェニル蟻酸０．２ｍｇ、硫酸マグネシウム５００ｍｇ、硫酸マンガン０．４ｍｇ、硫酸亜鉛０．４ｍｇ、塩化鉄０．２ｍｇ、リボフラビン（ビタミンＢ２）０．２ｍｇ、塩化カルシウム１００ｍｇ、ヨウ化カリウム０．１ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０．２ｍｇ、ビオチン（ビタミンＢ７、Ｈ）０．００２ｍｇ、葉酸（ビタミンＢ９）０．００２ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ、蒸留水を１Ｌに補充し、フィルターヘッドを殺菌する。

【0048】

ＹＮＢ固体培地：硫酸アンモニウム５０００ｍｇ、イノシトール２ｍｇ、ナイアシン（ビタミンＢ３）０．４ｍｇ、チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）０．４ｍｇ、硫酸銅０．０４ｍｇ、リン酸二水素カリウム１０００ｍｇ、ホウ酸０．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）０．４ｍｇ、パントテン酸カルシウム（ビタミンＢ５）０．４ｍｇ、パラアミノフェニル蟻酸０．２ｍｇ、硫酸マグネシウム５００ｍｇ、硫酸マンガン０．４ｍｇ、硫酸亜鉛０．４ｍｇ、塩化鉄０．２ｍｇ、リボフラビン（ビタミンＢ２）０．２ｍｇ、塩化カルシウム１００ｍｇ、ヨウ化カリウム０．１ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０．２ｍｇ、ビオチン（ビタミンＢ７、Ｈ）０．００２ｍｇ、葉酸（ビタミンＢ９）０．００２ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ、寒天１５ｇ、蒸留水を１Ｌに補充し、フィルターヘッドを殺菌する。

【0049】

下記実施例に係るＥＣの含有量の測定方法は以下のとおりである。

【0050】

国家標準方法ＧＢ５００９．２２３－２０１４を用いて培養上澄液中のＥＣの残存量を測定し、同時に無菌のＹＰＤ培地を対照として設置され、それぞれの処理で３回繰り返す。当該方法の具体的なステップは以下のとおりである。２ｍＬサンプルをＣｌｅａｎｅｒｔＥＣカルバミン酸エチル専用カラムにロードし、１０ｍｉｎ静置し、１０ｍＬのｎ－ヘキサンでシャワー洗浄し、真空ポンプで乾燥し、１０ｍＬの５％酢酸エチル－ジエチルエーテル溶液を用いて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出させ、溶出液を収集する。得られた溶出液を室温で０．５ｍＬになるまで窒素ブローし、メタノールで１ｍＬに定容し、その中に０．８ｇ無水硫酸ナトリウム（１００℃、２４ｈ）を加え、１００００ｒｐｍで遠心分離させ、上澄液を０．２２μｍ有機濾過膜で濾過し、流出液は気体品質テストのために用いられ（約０．５ｍＬ）、ＧＣ／ＭＳ分析のために用いられる。

【0051】

ＧＣ－ＭＳ分析条件は以下のとおりである。

【0052】

毛細管クロマトグラフィーカラムは、ＤＢ－ＩＮＮＯＷＡＸ、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）×０．２５μｍ（膜厚）であり、サンプル供給口温度は、２２０℃であり、カラム温度は、初温５０℃で１ｍｉｎ保持し、その後８℃／ｍｉｎで１８０℃まで昇温させ、プログラムの実行を終了した後、２４０℃となった後に５ｍｉｎ実行し、キャリアガスは、ヘリウムガス、純度≧９９．９９９％、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎであり、イオン源は、ＥＩであり、イオン化エネルギーは、７０ｅＶであり、イオン源温度は、２３０℃であり、四段ポール温度は、１５０℃であり、伝送線路温度は、２５０℃であり、溶媒遅延は、１１ｍｉｎであり、サンプル供給方式は、スプリットレス注入であり、サンプルの供給量：１μＬであり、検出方式は、イオン選択検出（ＳＩＭ）であり、ＥＣ選択検出イオン（ｍ／ｚ）は、４４、６２、７４、８９、定量イオン６２である。

【0053】

ピーク面積と検量線に基づいてカルバミン酸エチルの濃度を算出することができる。

【0054】

分解率計算式：

【0055】

実施例１：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１の分離と調製
１、菌株の分離と精製
（１）サンプルは山東粟酢酢工場の酢醪から収集される。
（２）分離スクリーニング方法は、まず耐酸化濃縮を行い、次にＥＣ分解機能を検証することを採用する。

【0056】

酢醪１ｇを、１０ｍＬの２ｍＭ過酸化水素を含むＹＰＤ液体培地に加え、上記サンプルをストマッカー袋に移し、３０ｍｉｎ叩き、無菌条件下で、ストマッカー袋中の部分液体を５０ｍＬ遠心分離管に移し、３０℃、２００ｒｐｍという条件下で４８ｈ培養する。強い酸化環境において、菌体の成長は、阻害されるか、更に成長せず、一方でエルゴチオネインは強い耐酸化性を示すため、高濃度のエルゴチオネインを産生する菌株は培地において正常に成長することができ、エルゴチオネインを産生できない菌株又は産出量が低い菌株は、スクリーニング圧力によって排除される。培地が濁った後、希釈液をＹＰＤ固体培地に塗布し、液体を吸収した後に３０℃で倒立に載置されて４８ｈ培養し、シングルコロニーを選別してＹＰＤ固体培地において平板スクライブラインを行い、連続に３世代に精製し、シングルコロニーを選別して顕微鏡検査を行い、汚染がないと判断した後、菌株の凍結保存を行い、菌株はＤＬ－ＸＳＹ０１と名付ける。

【0057】

Ｓ２（ＥＣ分解機能検証）：菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１を、５ｇ／ＬのＥＣを含む１０ｍＬのＹＮＢ液体培地に添加し、３０℃、２００ｒｐｍという条件下で２４ｈ培養し、５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離させ、酵母の沈殿を希釈した後、唯一の炭素源である１０ｇ／ＬのＥＣを含むＹＮＢ固体平板に均一に塗布し、２８℃で倒立に７２ｈ培養し、コロニーを形成する。菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１はＥＣを唯一の炭素源として良好に成長できることが分かり、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１がＥＣ分解機能を持つことを示している。

【0058】

図１に示すように、本発明に係るロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１がＥＣを唯一の炭素源とする時の成長画像である。

【0059】

２、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１の同定
（１）菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１ゲノムを抽出して２６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ同定を行い、ゲノム抽出方法は《精編分子生物学実験ガイド》ガラスビーズ法に応じて抽出を行う。

【0060】

ＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【0061】

増幅システムは、２×Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２５μＬ、プライマーＤ１ ２μＬ、プライマーＤ２ ２μＬ、殺菌水１９μＬ、テンプレート２μＬである。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で３ｍｉｎプレ変性し、９５℃で１５Ｓ変性し、５０℃で１５Ｓアニーリングし、７２℃で１ｍｉｎ延伸し、７２℃、１５ｍｉｎ、３０回繰り返し、４℃無限大である。

【0062】

ＰＣＲ終了後、アガロースゲル（１．０％）電気泳動を行って酵母菌サンプルＰＣＲ産物を検出し、バンドを切り出し、明るいバンドがＰＣＲ増幅に成功したゲノムであり、成功したゲノムはシークエンスに送ることができる。プライマー配列Ｄ１：ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ、Ｄ２：ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧ。

【0063】

前記菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１の２６ｓ ｒＲＮＡ配列は、ＴＴＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＴＡＧＴＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＴＴＧＴＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＣＧＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＣＣＧＡＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＴＡＡＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＴＣＧＧＴＴＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＴＴＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＣＧＡＣＣＣＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＡＡＡである。

【0064】

上記シークエンス結果に対するＢｌａｓｔｎ分析を行い、当該菌とＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓとＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａの相同性が最も高く、いずれも９９％に達することが分かった。モルフォロジーと２６ｓ ｒＲＮＡによる同定によれば、当該菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１はＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓであり、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１と名付ける。

【0065】

（２）菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１はＹＰＤ固体平板において良好に成長し、２８℃で２４～４８ｈ培養し、図２に示すように、湿潤、円形、突出、滑らか、薄いピンク色のコロニーを形成し、顕微鏡検査により菌体が楕円形の長手棒状を呈し、４℃で静置した後にオレンジ色を示すことが発見されている。最適な成長温度は２８℃で、最適なｐＨは５～６である。

【0066】

モルフォロジーと２６ｓ ｒＲＮＡによる同定によれば、当該ＥＣ分解菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１はＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓと仮称される。既に２０２１年１０月０８日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターＣＧＭＣＣに寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５３４である。寄託住所は中国北京市朝陽区北辰西路１番の敷地３番の中国科学院微生物研究所である。

【0067】

実施例２：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１菌株ＥＣ分解製剤の調製
具体的なステップは以下のとおりである。

【0068】

（１）ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌株をＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３０℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４ｈ培養し、シード液を得る。

【0069】

（２）シード液を１０％の接種量に応じてＹＰＤ発酵培地を含む生産発酵槽（７０％充填）に接種し、通気量は０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度は３００ｒｐｍであり、培養温度が２８℃に制御され、培養時間は４８～９６ｈである。発酵終了後、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬであるＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を得る。

【0070】

発酵終了後、無菌条件下で発酵液を収集し、包装ボトルで液体剤形に直接、分注する。

【0071】

（３）発酵終了後、ステップ（２）で収集されたＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を凍結真空乾燥させ、脱イオン水で元の体積の１／２０となるように調製され、ＤＬ－ＸＳＹ０１発酵液を得る。

【0072】

（４）発酵終了後、ステップ（２）で収集されたＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を４０００ｇ回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離させ、ＤＬ－ＸＳＹ０１菌体沈殿物を収集する。

【0073】

（５）ステップ（４）で得られた菌体沈殿物を希釈剤であるＰＢＳ緩衝液で希釈した後、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液を取得し、ここで、菌濃度は、ＯＤ_６００＝２０である。

【0074】

（６）ステップ（５）で得られた菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液から細胞破砕を経てＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液を得る。

【0075】

（７）それぞれステップ（３）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌含有発酵液、ステップ（５）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液とステップ（６）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液に対して、アルギン酸ナトリウムで埋め込みを行い、対応する固定化ボールを調製し、具体的なステップは以下のとおりである。

【0076】

アルギン酸ナトリウム（４％）をそれぞれ、ステップ（３）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌含有発酵液、ステップ（５）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液およびステップ（６）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液と、体積比１：１の割合で混合し、１０ｍＬ注射器で吸引し、２～１０滴／秒の速度でゆっくり硬化液（０．６％ＣａＣｌ_２の飽和ホウ酸溶液）に滴下し、硬化時間は約５ｈである。固定化細胞を調製する。

【0077】

固定化細胞を生理食塩水で３～４回、洗い流し、キトサン（２％）溶液に入れ、４０ｍｉｎラミネートする。再び０．８％生理食塩水で３～４回、洗い流し、水気を切り、４℃で保管して使用に備え、ＥＣ分解剤を調製する。

【0078】

それぞれステップ（３）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌含有発酵液、ステップ（５）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液とステップ（６）で調製したＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液により調製した埋め込み製剤はそれぞれ、ＥＣ分解剤１、ＥＣ分解剤２、ＥＣ分解剤３である。

【0079】

（８）ＥＣ分解剤１、ＥＣ分解剤２、ＥＣ分解剤３におけるＤＬ－ＸＳＹ０１の菌濃度をそれぞれ検出し、それぞれ、ＯＤ_６００＝１０、ＯＤ_６００＝２０、およびＯＤ_６００＝０である。

【0080】

実施例３：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１で調製したＥＣ分解剤の、白酒におけるＥＣ分解への使用
具体的なステップは以下のとおりである。

【0081】

実施例２で調製したＥＣ分解剤１、ＥＣ分解剤２、ＥＣ分解剤３（それぞれ２０ｍＬ）で、ＥＣを含む白酒サンプルをそれぞれ処理し、具体的には以下のとおりである。

【0082】

６０ｍＬの４５度白酒にＥＣ分解剤１、ＥＣ分解剤２とＥＣ分解剤３をそれぞれ２０ｍＬ添加し、それぞれ２５０ｍＬ発酵ボトルにおいて、２８℃、１００ｒｐｍで５ｄ反応させる。

【0083】

対照群は、６０ｍＬの４５度白酒に２０ｍＬのＹＰＤ培地を添加し、２５０ｍＬ発酵ボトルにおいて、２８℃、１００ｒｐｍで５ｄ（日）反応させる。

【0084】

反応終了後、上澄液２ｍＬをそれぞれ吸引し、０．２μｍ濾過膜で濾過し、培養上澄液中のＥＣの残存量をそれぞれ測定し、それぞれの処理では３回繰り返し、結果は表１に示すとおりである。

【0085】

結果によれば、ＥＣ分解剤１、ＥＣ分解剤２とＥＣ分解剤３はいずれも白酒中のＥＣ濃度を低減させることができ、ＥＣ濃度は、２３０．３７３７μｇ／Ｌからそれぞれ、８６．９６９３μｇ／Ｌ、１００．０９０２μｇ／Ｌ、および５５．３１１２μｇ／Ｌに低下させることができ、分解率はそれぞれ、６２．２４％、５６．５６％、および７６．００％である。

【0086】

このように、ＥＣ分解剤３の白酒中のＥＣに対する分解効果が最も良い。

【0087】

実施例４：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１で調製したＥＣ分解剤３による発酵食品に添加されるＥＣの分解実験
下記実施例では、ＥＣ分解剤３を例として、本願の菌株は様々な発酵食品及びアルコール飲料中のＥＣを分解できることが実証され、下記に用いたサンプルは、いずれも市販品である。

【0088】

下記実施例に係るＥＣ分解剤３の処理方法では、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌株を、ＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３０℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４ｈ培養し、シード液を得る。シード液を１０％の接種量に応じてＹＰＤ発酵培地を含む生産発酵槽（７０％充填）に接種し、通気量は０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度は３００ｒｐｍであり、培養温度が２８℃に制御され、培養時間は４８～９６ｈである。発酵終了後、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬであるＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を得る。発酵終了後、収集されたＤＬ－ＸＳＹ０１培養液は４０００ｇ回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離させ、ＤＬ－ＸＳＹ０１菌体沈殿物を収集する。希釈剤であるＰＢＳ緩衝液で希釈した後、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１菌体懸濁液を取得し、ここで、菌濃度は、ＯＤ_６００＝２０であり、菌体を破壁してＤＬ－ＸＳＹ０１細胞分解液を取得した後、４％アルギン酸ナトリウムと体積比１：１の割合で混合し、１０ｍＬ注射器で吸引し、２～１０滴／秒の速度でゆっくり硬化液（０．６％ＣａＣｌ_２の飽和ホウ酸溶液）に滴下し、硬化時間は約５ｈである。固定化細胞を調製する。固定化細胞を生理食塩水で３～４回、洗い流し、キトサン（２％）溶液に入れ、４０ｍｉｎラミネートする。再び０．８％生理食塩水で３～４回、洗い流し、水気を切り、４℃で保管して使用に備える。

【0089】

１、赤ワインＥＣ反応液の調製
赤ワイン（１２度）は６０ｍＬであり、ＥＣは３．０ｐｐｍであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、５日間インキュベートする。

【0090】

２、ヨーグルトＥＣ反応液の調製
ヨーグルトは６０ｍＬであり、ＥＣは３．０ｐｐｍであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、５日間インキュベートする。

【0091】

３、酢ＥＣ反応液の調製
酢は６０ｍＬであり、ＥＣは３．０ｐｐｍであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、５日間インキュベートする。

【0092】

４、醤油ＥＣ反応液の調製
醤油は６０ｍＬであり、ＥＣは３．０ｐｐｍであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、５日間インキュベートする。

【0093】

５、味噌ＥＣ反応液の調製
味噌は３０ｇであり、３０ｍＬ脱イオン水を添加し、ＥＣは３．０ｐｐｍであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、５日間インキュベートする。

【0094】

それぞれ上記内容で調製した発酵食品ＥＣ反応液について、反応後の上澄液２ｍＬを吸引し、０．２μｍ濾過膜で濾過し、培養上澄液中のＥＣの残存量を測定し、同時に無菌のＹＰＤ培地を対照として設置され、それぞれの処理では３回繰り返し、結果は表２に示すとおりである。

【0095】

結果によれば、ＤＬ－ＸＳＹ０１発酵製品及びそのＥＣ分解剤は、ＥＣを分解するのに非常に優れており、発酵食品中のエタノール含有量、塩などの成分はＤＬ－ＸＳＹ０１のＥＣ分解活性にほとんど影響を与えなかった。

【0096】

実施例５：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１の使用
下記実施例では、ＥＣ分解剤３を例として、本願の菌株は実際アルコール飲料中のＥＣを分解できることが実証され、下記に用いたサンプルは、いずれも市販品である。

【0097】

下記実施例に係るＥＣ分解剤３の処理方法は実施例４と同様である。

【0098】

１、ゴマ香タイプ白酒ＥＣ反応液の調製
ゴマ香タイプ白酒（５３度）は６０ｍＬであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、２日間インキュベートする。

【0099】

２、濃香タイプ白酒ＥＣ反応液の調製
濃香タイプ白酒（４５度）は６０ｍＬであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、２日間インキュベートする。

【0100】

３、醤香タイプ白酒ＥＣ反応液の調製
醤香タイプ白酒（４２度）は６０ｍＬであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、２日間インキュベートする。

【0101】

４、清香タイプ白酒ＥＣ反応液の調製
清香タイプ白酒（３８度）は６０ｍＬであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、２日間インキュベートする。

【0102】

５、黄酒ＥＣ反応液の調製
黄酒（１５度）は６０ｍＬであり、ＥＣ分解剤３は２０ｍＬであり、２５０ｍＬの三角フラスコにおいて、２８℃、１００ｒｐｍ、２日間インキュベートする。

【0103】

それぞれ上記内容で調製した発酵食品ＥＣ反応液について、反応後の上澄液２ｍＬを吸引し、０．２μｍ濾過膜で濾過し、培養上澄液中のＥＣの残存量を測定し、同時に無菌のＹＰＤ培地を対照として設置され、それぞれの処理では３回繰り返し、結果は表３に示すとおりである。

【0104】

結果によれば、ＤＬ－ＸＳＹ０１発酵製品及びそのＥＣ分解剤は、実際の発酵サンプル中のＥＣを分解するのに非常に優れており、アルコール飲料中のＥＣに対する分解率は７０％程度に達する。

【0105】

実施例６：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１の、発酵過程におけるＥＣの含有量を低減させるための使用
下記実施例では、ＤＬ－ＸＳＹ０１を用いて発酵過程における酢醪を処理し、本願の菌株の発酵過程にＥＣの発生を低減可能なことが実証される。

【0106】

下記実施例に係るＤＬ－ＸＳＹ０１の調製方法は、ロドスポリジウム・トルロイデスＤＬ－ＸＳＹ０１菌株をＹＰＤ液体培地に接種して活性化を行い、２５～３０℃で、１５０～２５０ｒｐｍで定温に発振して２４ｈ培養し、シード液を取得し、シード液を１０％の接種量に応じてＹＰＤ発酵培地を含む生産発酵槽（７０％充填）に接種し、通気量は０．６～１．０ｍ^３／ｍｉｎであり、撹拌速度は３００ｒｐｍであり、培養温度が２８℃に制御され、培養時間は４８～９６ｈである。発酵終了後、菌体数が３×１０^８～１．８×１０^９ＣＦＵ／ｍＬであるＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を得る。発酵終了後、収集されたＤＬ－ＸＳＹ０１培養液を凍結真空乾燥させ、乾燥菌体を得る。

【0107】

５ｇの凍結乾燥された菌体を取り、１００ｇ酢醪に加えて２０日間発酵させ、有菌発酵の白酢を得る。また１００ｇの酢醪を直接的に２０日間発酵させ、無菌発酵の白酢を得る。

【0108】

上記白酢をそれぞれ２ｍＬ吸引し、ＥＣ残存量を得て、各組のサンプルには３つ繰り返しを設定し、結果は表４に示すとおりである。

【0109】

結果によれば、凍結乾燥後のＤＬ－ＸＳＹ０１菌体を添加し、発酵過程におけるＥＣ濃度を低減させることができる。

【0110】

実施例７：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１菌株の性質
具体的なステップは以下のとおりである。

【0111】

１、ＤＬ－ＸＳＹ０１菌株安全性評価
（１）抗生物質感受性実験
板紙拡散法を用いてロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＤＬ－ＸＳＹ０１の抗生物質感受性スペクトルを示す。

【0112】

ＹＰＤ－寒天固体平板においてＤＬ－ＸＳＹ０１シングルコロニーを選別し、ＹＰＤ液体培地に搬送して培養し、菌液（約１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を取得し、
２００μＬのＤＬ－ＸＳＹ０１菌液を取ってＹＰＤ－寒天固体平板に塗布し、ゲンタマイシン（１０μｇ）、ストレプトマイシン（１０μｇ）、エリスロマイシン（１５μｇ）、テトラサイクリン（３０μｇ）、セファレキシン（３０μｇ）、バンコマイシン（３０μｇ）、セファゾリン（３０μｇ）、アンピシリン（１０μｇ）、ペニシリン（１０μｇ）、ミノサイクリン（３０μｇ）及びアミカシン（３０μｇ）という１１種類の抗生物質薬感板紙をそれぞれゆっくり載置し、各板紙の距離は２４ｍｍ以上であり、
上記板紙入り培地を、２８℃で静置して２４ｈ培養した後、静菌環の直径を測定して統計し、その耐薬品性を分析し、耐性Ｒ（≦１４ミリメートル）、中程度Ｉ（１４～２０ミリメートル）又は感受性Ｓ（≧２０ミリメートル）であり、各組で３つの繰り返しを設定し、ＤＬ－ＸＳＹ０１の抗生物質感受性は表５に示すとおりである。

【0113】

結果によれば、菌株が抗生物質セファレキシンに中程度の感受性を示し、１０種類の抗生物質セファゾリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、アミカシンアンピシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、ミノサイクリン、およびペニシリンＧに対して感受性がある。従って、ＣＬＳＩガイドに基づき、これらの結果はＤＬ－ＸＳＹ０１が安全であることが実証される。

【0114】

（２）溶血性試験
溶血性は３種類に分けられ、それぞれ、α溶血は、緑色溶血とも称され、コロニー周辺の培地には１～２ｍｍの緑色環が現れ、メトヘモグロビンによる結果であり、α溶血環における赤血球が完全に溶解せず、α溶血環を形成することができる細菌は例えば、Ａ群溶血性レンサ球菌、肺炎球菌であり、β溶血は、固体平板に培養する時、コロニー周辺に形成された、広く（２～４ｍｍ）、輪郭が鮮明で、完全に透明な溶血環、β溶血環における赤血球が完全に溶解し、菌体が産生する溶血素は赤血球を完全に溶解させる結果であり、完全溶血とも称され、β溶血環を形成することができるものは、Ｂ群溶血性レンサ球菌、黄色ブドウ球菌などを含み、γ溶血は、非溶血とも称され、コロニー周辺には溶血環がない。

【0115】

具体的なステップは以下のとおりである。

【0116】

培地構成は、コロンビア寒天＋５％ヒツジの脱繊維血液である。

【0117】

ＹＰＤ－寒天固体平板においてＤＬ－ＸＳＹ０１シングルコロニーを選別し、ＹＰＤ液体培地に搬送して培養し、菌液（約１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を取得し、
菌液を取り、５％ヒツジの脱繊維血液を含むコロンビア平板にスクライブラインし、２８℃で２４ｈ培養した後、透明な環があるか否かを観察する。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３は陽性対照として、各組で３回繰り返す。

【0118】

結果によれば、この溶血試験において、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３は陽性対照として使用される。ＤＬ－ＸＳＹ０１はヒツジの血液平板において２８℃で培養する時に溶血（γ－溶血）を示さない。しかし、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３はβ－溶血作用を示し、陽性対照が成立する。更に大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７はα－溶血を示す。従って、ＤＬ－ＸＳＹ０１は人体健康に害がない安全な生体であると考えられる。

【0119】

２、ＤＬ－ＸＳＹ０１菌株プロバイオティクス評価
（１）人工胃液実験
プロバイオティクスは、プロバイオティクス効果を果たすために、胃腸管に定植し、まず消化管の環境に対して耐性を有しなければならず、胃液に対する耐性は重要なスクリーニング基準の一つである。

【0120】

人工胃液の調製においては、希塩酸１６．４ｍＬに水を約９００ｍＬ入れ、ペプシンを１０ｇ入れ、均一に混合した後、水を入れて１０００ｍＬに定容する。それぞれｐＨを２．５に調節し、０．２２μｍ濾過膜で濾過して殺菌し、４℃で保存する。

【0121】

人工胃液耐性実験
ＹＰＤ－寒天固体平板にはＤＬ－ＸＳＹ０１シングルコロニーを選別し、ＹＰＤ液体培地に搬送して培養し、菌液（約１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を取得し、５ｍＬの菌液を取り、１００００ｒｐｍ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離させ、菌体を収集し、ｐＨ７．４の無菌リン酸塩緩衝液で２回洗浄し、上記操作を繰り返す。

【0122】

菌体をあらためて５ｍＬのｐＨ２．５の人工胃液に懸濁させる。平板塗布法によりｐＨ２．５の人工胃液において０ｈ、および３ｈインキュベートした後の生菌数を算出し、各組で３回繰り返す。

【0123】

生存率（％）＝ｌｏｇＣＦＵ（Ｎ１）／ｌｏｇＣＦＵ（Ｎ０）＊１００％。

【0124】

ここで、Ｎ０は人工胃液において０ｈインキュベートした後の生菌数を示し、Ｎ１は人工胃液において３ｈインキュベートした後の生菌数を示す。

【0125】

同時に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７を陽性対照とする。

【0126】

結果によれば、人工胃液の条件（０．３％ペプシンを含み、ｐＨが２．５である）で３ｈ培養した後、ＤＬ－ＸＳＹ０１の生存率は８６．７３％であり、陽性対照群である大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７の生存率は８６．１４％である。結果によれば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に比べて、ＤＬ－ＸＳＹ０１は人工胃液において良好な生存率を示した。

【0127】

（２）人工腸液実験
プロバイオティクスは、プロバイオティクス効果を果たすために、胃腸管に定植し、まず消化管の環境に対して耐性を有しなければならず、腸液に対する耐性は重要な基準の一つである。

【0128】

人工腸液の調製においては、殺菌後のリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）でトリプシンを、濃度が１ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、０．３％ウシの胆汁酸塩を添加し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した後、０．２２μｍのマイクロポーラスフィルタで濾過して殺菌した後に使用に備える。

【0129】

人工腸液耐性実験
ＹＰＤ－寒天固体平板においてＤＬ－ＸＳＹ０１シングルコロニーを選別し、ＹＰＤ液体培地に搬送して培養し、菌液（約１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）を取得し、
５ｍＬの菌液を取り、１００００ｒｐｍ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離させ、菌体を収集し、ｐＨ７．４の無菌リン酸塩緩衝液で２回洗浄し、上記操作を繰り返す。菌体を改めて５ｍＬのｐＨ７．４の人工腸液に懸濁させる。平板塗布法によりｐＨ７．４人工腸液において０ｈと４ｈインキュベートした後の生菌数を算出し、各組で３回繰り返す。

【0130】

生存率（％）＝ｌｏｇＣＦＵ（Ｎ１）／ｌｏｇＣＦＵ（Ｎ０）＊１００％。

【0131】

ここで、Ｎ０は人工胃液において０ｈインキュベートした後の生菌数を示し、Ｎ１は人工胃液において３ｈインキュベートした後の生菌数を示す。

【0132】

同時に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７を陽性対照とする。

【0133】

結果によれば、人工腸液の条件（０．３％トリプシンと０．３％ウシの胆汁酸塩を含む）で４ｈ培養した後、ＤＬ－ＸＳＹ０１の生存率は８５．９２％で、陽性対照群である大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７の生存率は８４．６４％である。結果によれば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に比べて、ＤＬ－ＸＳＹ０１は人工胃液において良好な生存率を示した。

【0134】

（３）耐酸化実験
ＤＰＰＨ遊離基消去率試験
０．００７８ｇのＤＰＰＨを無水エタノールで溶解させ、１００ｍｌに定容し、０．２ｍｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨを調製し、遮光して放置し、使用する直前に調製する。

【0135】

上記ステップ（１）に応じて菌濃度が１０^８ＣＦＵ／ｍＬであるＤＬ－ＸＳＹ０１菌液を調製する。

【0136】

上記１０^８ＣＦＵ／ｍＬのＤＬ－ＸＳＹ０１菌液を、体積比１：１の割合に応じて、１００％エタノールＤＰＰＨ溶液（０．２ｍＭ）と混合し、２５℃下の暗闇中で３０ｍｉｎ培養する。

【0137】

ＤＬ－ＸＳＹ０１菌液と１００％エタノールを単独に用いてブランクとし、ＤＰＰＨエタノール溶液は対照とされる。２３３０×ｇ（４１２０ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した後に上澄液を収集する。５１７ｎｍの箇所で、第１の吸光度を３回繰り返して測定する。

【0138】

ＡＢＴＳ遊離基消去率試験
ＡＢＴＳ（１４ｍＭ）と過硫酸カリウム（５ｍＭ）を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、１：１の割合で混合し、２５℃で１２～１６ｈ反応させる。

【0139】

１００μＬ菌株ＤＬ－ＢＪ０１（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）を９００μＬのＡＢＴＳ溶液に添加し、２５℃で暗闇中で１５ｍｉｎ培養する。（１４０００ｇ、１分間）遠心分離した後、７３４ｎｍの箇所で、上澄液の吸光度を測定する。

【0140】

結果によれば、ＤＬ－ＸＳＹ０１のＤＰＰＨ消去活性は９０．０２％であり、ＡＢＴＳ消去活性は９３．６７％であり、菌株ＤＬ－ＸＳＹ０１は良好な耐酸化活性を示すことが実証される。

【0141】

本発明は、既に好ましい実施例によって以上のように開示されているが、それらの実施例は本発明を限定するためのものではなく、当業者は、本発明の趣旨と範囲を逸脱しない限り、様々な変更と修飾を行うことができ、従って、本発明の保護範囲は特許請求の範囲に限定されるものに準ずるべきである。

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】