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特表2024-544620ＭＤＭ２／ＭＤＭＸに対抗するＣ－末端伸長Ｐ５３活性化因子架橋ペプチド模倣大員環
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】ＭＤＭ２／ＭＤＭＸに対抗するＣ－末端伸長Ｐ５３活性化因子架橋ペプチド模倣大員環
(51)【国際特許分類】
C07K 7/00 20060101AFI20241126BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20241126BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241126BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241126BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241126BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241126BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241126BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20241126BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241126BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/203 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/706 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/52 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/4164 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20241126BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20241126BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20241126BHJP
C12N 15/85 20060101ALN20241126BHJP
C07H 19/04 20060101ALN20241126BHJP
C07D 473/38 20060101ALN20241126BHJP
C07D 239/553 20060101ALN20241126BHJP
C07D 233/90 20060101ALN20241126BHJP
C07D 305/14 20060101ALN20241126BHJP
C07D 401/04 20060101ALN20241126BHJP
C07D 491/22 20060101ALN20241126BHJP
C07D 475/08 20060101ALN20241126BHJP
C07D 487/04 20060101ALN20241126BHJP
【ＦＩ】
C07K7/00 ZNA
A61K38/12
A61P43/00 107
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/12
A61K39/395 N
A61K31/203
A61K31/706
A61K31/52
A61K31/192
A61K31/513
A61K31/4164
A61K31/337
A61K31/506
A61K31/4745
A61K31/519
C12N15/864 100Z
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
C12N15/85 Z
C07H19/04
C07D473/38
C07D239/553 A
C07D233/90
C07D305/14
C07D401/04
C07D491/22
C07D475/08
C07D487/04 140
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531589
(86)(22)【出願日】2022-11-23
(85)【翻訳文提出日】2024-07-29
(86)【国際出願番号】 US2022050821
(87)【国際公開番号】W WO2023096947
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】63/283,614
(32)【優先日】2021-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522242018
【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー
(71)【出願人】
【識別番号】524199707
【氏名又は名称】エムエスディー・インターナショナル・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
(71)【出願人】
【識別番号】322003499
【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス、テクノロジー アンド リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ジョシン，フーベルト
(72)【発明者】
【氏名】チャンドラモハン，アルネ
(72)【発明者】
【氏名】ヨハネス，チャールズ・ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，クリストファー・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】カンナン，スリニヴァサラガヴァン
(72)【発明者】
【氏名】パートリッジ，アンソニー・ダブリュー
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルマ，チャンドラ・シェカール
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，リン
(72)【発明者】
【氏名】ユエン，ツ・イン
【テーマコード（参考）】
4C057
4C084
4C085
4C086
4C087
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C057BB02
4C057DD01
4C057LL25
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA10
4C084BA18
4C084BA25
4C084MA01
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB22
4C084ZB26
4C084ZC41
4C084ZC75
4C085AA14
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086BC38
4C086BC43
4C086BC50
4C086CB05
4C086CB07
4C086CB09
4C086CB22
4C086EA11
4C086EA16
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA07
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB22
4C086ZB26
4C086ZC41
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087CA20
4C087MA01
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB22
4C087ZB26
4C087ZC41
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA11
4C206DA17
4C206KA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA10
4C206NA05
4C206ZB22
4C206ZB26
4C206ZC41
4C206ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA31
4H045EA28
4H045FA20
4H045FA50
4H045GA25
(57)【要約】
本明細書中に開示される架橋ペプチド模倣大員環は、アルケンまたはアルキンステープルおよびポリアミノ酸Ｃ末端尾部を含む。これらの架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸ（別名ＭＤＭ４）への結合が改善されており、プロテアーゼ耐性であり、膜破壊を誘導することなく細胞透過可能であり、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸを結合し、それによってＭＤＭ２およびＭＤＭＸのｐ５３への結合に拮抗することによってｐ５３を細胞内で活性化する。これらのペプチド模倣大員環は、特に化学療法または放射線療法と組み合わせて、抗癌療法において有用であり得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
架橋ペプチド模倣大員環であって、Ｒ１－Ｒ２－ベータＡｌａ－Ｌ－Ｔ－Ｆ－Ｘ１－Ｅ－Ｙ－Ｗ－Ａ－Ｑ－Ｒ３－Ｘ２－Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６－Ｒ４（配列番号１８）（Ｉ）、
を含み、式中、
Ｒ１が、アシルおよびＣ１－１２アルキルから選択され、
Ｒ２が、天然または非天然Ｌ－アミノ酸残基であり、
Ｒ３が、脂肪族天然または非天然アミノ酸残基であり、
Ｒ４が、－ＯＨ、－ＮＨ２、および１～３個のＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択され、前記Ｃ末端尾部が酸またはアミド基であり、
Ｘ１およびＸ２の各々が独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２が、それらのそれぞれのアルファ炭素から炭化水素結合を介して架橋され、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６の各々が、独立して天然または非天然アミノ酸残基である、架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項2】
Ｒ１がアセチルである、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項3】
Ｒ２がリジン残基およびアジドリジン残基から選択される、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項4】
Ｒ３がシクロブチルアラニン残基である、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項5】
Ｒ４が、－ＮＨ２およびＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択され、Ｃ末端尾部がアミドである、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項6】
Ｘ１およびＸ２の各々が独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２が、アルケン炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項7】
Ｘ１およびＸ２の各々が独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２が、ジアルキン炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項8】
Ｘ１およびＸ２の各々が、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２が、アルケン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項9】
Ｘ１およびＸ２の各々が、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２が、ジアルキン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項10】
前記Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列が、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＡＡＥＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項11】
前記Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列が、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される、請求項１０に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項12】
Ｒ１が、アセチルであり、Ｒ２が、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３が、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４が、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々が独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２が、アルケンまたはジアルキン炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
前記Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列が、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＡＡＥＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される、
請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項13】
Ｒ１が、アセチルであり、Ｒ２が、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３が、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４が、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々が、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２が、アルケン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
前記Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列が、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される、
請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項14】
Ｒ１が、アセチルであり、Ｒ２が、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３が、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４が、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々が、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２が、ジアルキン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
前記Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列が、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される、
請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項15】
式（ＩＶ）を有する、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。【化1】
【請求項16】
式（ＩＸ）を有する、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。【化2】
【請求項17】
式（Ｘ）を有する、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【化3】
【請求項18】
式（ＸＩＩＩ）を有する、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。【化10】
【請求項19】
前記ペプチド模倣大員環が、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの両方を結合し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによる測定で検出可能な細胞膜破壊を伴わずに細胞透過可能であり、ｐ５３を細胞内で活性化する、請求項１に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項21】
対象における癌を治療する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項22】
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、ホジキンリンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、膵臓癌、気管支癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
対象におけるｐ５３および／またはＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸの活性を調節する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環または請求項２０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項24】
対象におけるｐ５３とＭＤＭ２との間および／またはｐ５３とＭＤＭＸとの間の相互作用に拮抗する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環または請求項２０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項25】
癌を治療するための医薬を調製するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環の使用。
【請求項26】
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、ホジキンリンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、膵臓癌、気管支癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
癌を治療するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項28】
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、ホジキンリンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、膵臓癌、気管支癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌から選択される、請求項２７に記載の架橋ペプチド模倣大員環。
【請求項29】
癌を治療するための併用療法であって、治療有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環と、治療有効用量の化学療法剤または放射線とを対象に投与することを含む、併用療法。
【請求項30】
前記化学療法剤もしくは放射線が対象に投与された後に前記架橋ペプチド模倣大員環が投与されるか、前記ペプチド模倣大員環が前記対象に投与された後に前記化学療法剤もしくは放射線が投与されるか、または前記化学療法剤もしくは放射線が、前記ペプチド模倣大員環の投与と同時に前記対象に投与される、請求項２９に記載の併用療法。
【請求項31】
癌の治療の併用療法であって、治療有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環と、治療用量の化学療法剤または放射線とを含む、併用療法。
【請求項32】
前記化学療法剤が、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アリトレチノイン、アザシチジン、アザチオプリン、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルモフル、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イキサベピロン、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ロミドプシン、テガフール、テモゾロミド（経口ダカルバジン）、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、ウチデロン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびボリノスタットから選択される、請求項２９、３０または３１に記載の併用療法。
【請求項33】
癌を治療するための併用療法であって、治療有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環、および治療有効用量のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを含む、併用療法。
【請求項34】
前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項３３に記載の併用療法。
【請求項35】
前記療法が、治療有効用量の化学療法剤または放射線を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３４に記載の併用療法。
【請求項36】
癌の治療であって、前記癌を有する対象へ、転写活性化活性を有する野生型ｐ５３タンパク質またはｐ５３バリアントをコードする核酸分子を含むベクターを投与すること、続いて治療有効量の請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋ペプチド模倣大員環を１回以上投与することを含む、癌の治療。
【請求項37】
前記ベクターがプラスミド、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項３６に記載の治療。
【請求項38】
前記対象に前記ベクターを投与する前に、または前記対象に前記ベクターを投与した後に、前記対象に化学療法または放射線治療を投与する、請求項３７に記載の治療。
【請求項39】
前記療法が、チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３６、３７、および３８のいずれか一項に記載の治療。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子的に提出された配列表への言及
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。ＸＭＬファイルは２０２２年１０月３日に作成され、２５３４５－ＷＯ－ＰＣＴ－ＳＥＱＬＩＳＴ－０３ＯＣＴ２０２２．ＸＭＬと名付けられ、ディスク上のサイズは７１，０００バイトである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。ＸＭＬファイルは２０２２年１０月３日に作成され、２５３４５－ＷＯ－ＰＣＴ－ＳＥＱＬＩＳＴ－０３ＯＣＴ２０２２．ＸＭＬと名付けられ、ディスク上のサイズは７１，０００バイトである。
【0002】
結合および／または物理化学的特性が改善された架橋ペプチド模倣大員環が本明細書に開示される。マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２、別名Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼ）およびＭＤＭＸ（別名ＭＤＭ４）を結合することができるこれらのペプチド模倣大員環は、膜破壊を誘導することなく細胞を透過することができ、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸを結合し、それによってＭＤＭ２およびＭＤＭＸのｐ５３への結合に拮抗することによってｐ５３を細胞内で活性化することができる。これらの大員環は、特に化学療法および／または放射線療法と組み合わせた抗癌療法として潜在的に有用である。
【背景技術】
【0003】
腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、主にＤＮＡ転写因子として機能する。それは、癌において一般に抑止され、様々なストレス信号に応答して、細胞周期停止、アポトーシスまたは老化の誘導によって細胞を保護するのに重要な役割を果たす（Ｌａｎｅ ＤＰ ｐ５３，ｇｕａｒｄｉａｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｊｕｌ ２；３５８（６３８１）：１５－６）。ｐ５３の不活性化および腫瘍形成を頻繁にもたらす機構には、ｐ５３の負の調節因子である、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸ（別名ＭＤＭ４）の発現増加が含まれる。ＭＤＭ２およびＭＤＭＸは両方とも、ｐ５３と直接相互作用し、転写に必要な関連する活性化因子、例えばｄＴＡＦＩＩおよびｈＴＡＦＩＩとのその相互作用を妨げることによって、ｐ５３の機能を減弱させる。さらに、それらは両方ともＥ３リガーゼ成分であり、プロテオソーム媒介分解のためにｐ５３を標的化する。ＭＤＭＸは、ＭＤＭ２とは異なり、内在性のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有さない。代わりに、ＭＤＭＸはＭＤＭ２とヘテロ二量体複合体を形成し、それによってＭＤＭ２のユビキチン活性を刺激する。その結果、ｐ５３活性およびタンパク質レベルは、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸ過剰発現によって急激に抑制される。したがって、ｐ５３とＭＤＭ２またはＭＤＭＸのいずれか、または両方との相互作用を破壊する阻害剤の開発は、それらがｐ５３分解を防止し、ｐ５３依存性転写抗腫瘍応答を回復させ得るので望ましい（Ａｒｎｉ－Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｏ、Ｍ．Ｌｏｋｓｈｉｎ、およびＣ．Ｐｒｉｖｅｓ．２０１６．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．１１：６１７－６４４；Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｐｅｉ，１，２ Ｙａｎｐｉｎｇ Ｚｈａｎｇ，１，２およびＪｕｎｎｉａｎ Ｚｈｅｎｇ１ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３：ａ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１２ Ｍａｒ；３（３）：２２８－２３５）。
【0004】
ｐ５３－ＭＤＭ２／ＭＤＭＸ複合体の構造界面は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの両方のＮ末端ドメインの表面の疎水性溝に結合する、ｐ５３のＮ末端トランス活性化ドメイン由来のαヘリックスによって特徴づけられる。ｐ５３の３つの疎水性残基、Ｐｈｅ１９、Ｔｒｐ２３およびＬｅｕ２６は、この相互作用の重要な決定基であり、ＭＤＭ２／ＭＤＭＸ相互作用溝中に深く突出している［図１参照］。単離されたｐ５３ペプチドは大部分が無秩序であり、結合するとαヘリックスの高次構造に変形する。これらの相互作用を模倣し、ｐ５３の放出と結合するＭＤＭ２／ＭＤＭＸに競合する小分子、ペプチドおよび生物製剤のいくつかの例がある（Ｔｉｓａｔｏ Ｖ１、Ｖｏｌｔａｎ Ｒ２、Ｇｏｎｅｌｌｉ Ａ２、Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ Ｐ２、Ｚａｕｌｉ Ｇ２．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｌ ３；１０（１）：１３３）。しかしながら、開発された小分子の大部分は、ＭＤＭ２と比較してｐ５３ペプチド結合溝にいくつかの明確な構造的差異を有するＭＤＭＸに対して、ほとんど親和性および活性を示さない。いくつかのＭＤＭ２特異的分子が最初の臨床試験に入っているが、それらは患者において用量制限毒性をほとんど満たしている（Ｔｉｓａｔｏ Ｖ１、Ｖｏｌｔａｎ Ｒ２、Ｇｏｎｅｌｌｉ Ａ２、Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ Ｐ２、Ｚａｕｌｉ Ｇ２．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｌ ３；１０（１）：１３３）。腫瘍におけるＭＤＭＸの過剰発現は、おそらくプロテオソーム分解のためにｐ５３を阻害および標的化するＭＤＭ２およびＭＤＭＸのヘテロ二量体複合体の維持によって、ＭＤＭ２特異的化合物の有効性を減弱させることが実証されている。ＭＤＭ２選択的阻害剤はまた、より高いレベルのＭＤＭＸを誘導し得る。これは、両方のタンパク質を同時に標的化して、最適な治療応答を達成するためのｐ５３の効率的な活性化を達成することの重要性を強調している。
【0005】
タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）は、ほとんどの生物学的プロセスの中心であり、疾患においてしばしば調節不全になる（Ｐｅｔｔａ Ｉ．，Ｌｉｅｖｅｎｓ Ｓ．，Ｌｉｂｅｒｔ Ｃ．，Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ Ｊ．，Ｄｅ Ｂｏｓｓｃｈｅｒ Ｋ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５；２４：７０７－７１８；Ｍａｃａｌｉｎｏ Ｓ．Ｊ．Ｙ．，Ｂａｓｉｔｈ Ｓ．，Ｃｌａｖｉｏ Ｎ．Ａ．Ｂ．，Ｃｈａｎｇ Ｈ．，Ｋａｎｇ Ｓ．，Ｃｈｏｉ Ｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８；２３：１９６３）。したがって、ＰＰＩは新規創薬の魅力的な治療目標である。しかしながら、典型的には小分子を収容する深いタンパク質空洞とは対照的に、ＰＰＩ表面は一般に大きく平らであり、これによって、ＰＰＩを標的とする小分子阻害剤の開発における成功が制限される（Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ｅ．，Ｂａｙｌｙ，Ａ．Ｒ．，Ａｂｅｌｌ，Ｃ．およびＳｋｉｄｍｏｒｅ，Ｊ．（２０１６）Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｂｉｇ ｔａｒｇｅｔｓ：ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆａｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１５，５３３－５５０）。全ＰＰＩの４０％が比較的短いペプチドモチーフによって媒介されるという認識から、リガンド－標的同族パートナー間の界面についてオルソステリックが競合するペプチドベースの阻害剤を開発する可能性が生じた（Ｎｅｖｏｌａ Ｌ，Ｇｉｒａｌｔ Ｅ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；５１：３３０２－１５）。タンパク質リガンドとの関連から取り出される場合、そのようなペプチドは、多くの場合で構造化されておらず、本質的に無秩序であるが、タンパク質標的結合時にそれらの生物学的に妥当な高次構造を達成することができる（Ｎｅｖｏｌａ Ｌ，Ｇｉｒａｌｔ Ｅ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；５１：３３０２－１５）。しかしながら、細胞内標的の場合、タンパク質分解感受性、（弱い親和性およびオフターゲット効果をもたらす）低い高次構造安定性、および貧弱な細胞透過性によってペプチドモダリティは困難であり得、細胞内標的および／または経口バイオアベイラビリティの実行をさらに制限する（Ｌａｕ，Ｊ．Ｌ．；Ｄｕｎｎ，Ｍ．Ｋ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７，２６，２７００－２７０７；Ｆｏｓｇｅｒａｕ，Ｋ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１５，２０，１２２－１２８；Ｂａｋａｉｌ Ｍ．，Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ Ｆ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ａ ｗｉｄｅ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｃｈｉｍｉｅ．２０１６，１９，１９－２７；Ａ．Ｈｅｎｎｉｎｏｔ，Ｊ．Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｎｕｓｓ．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｂａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６１（２０１８），ｐｐ．１３８２－１４１４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ．，Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ’ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｎｅ？．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １７，５３１－５３３頁（２０１８）；Ｖａｌｅｕｒ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，１０２９４－１０３２３；Ｃａｒｙ，Ｄ．Ｒ．；Ｏｈｕｃｈｉ，Ｍ．；Ｒｅｉｄ，Ｐ．Ｃ．；Ｍａｓｕｙａ，Ｋ．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｙｕｋｉ Ｇｏｓｅｉ Ｋａｇａｋｕ Ｋｙｏｋａｉｓｈｉ ２０１７，７５，１１７１－１１７８）。
【0006】
これらの問題に対処するために、大員環化し、ペプチド骨格を修飾して改善された活性および薬物動態特性を有する分子を得ること、ならびにペプチドをその生物学的に妥当な高次構造に拘束してその標的に結合させることを含む、いくつかの戦略が追求されてきた（Ｌａｕ，Ｊ．Ｌ．；Ｄｕｎｎ，Ｍ．Ｋ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７，２６，２７００－２７０７；Ｆｏｓｇｅｒａｕ，Ｋ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１５，２０，１２２－１２８；Ｂａｋａｉｌ Ｍ．，Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ Ｆ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ａ ｗｉｄｅ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｃｈｉｍｉｅ．２０１６，１９，１９－２７；Ａ．Ｈｅｎｎｉｎｏｔ，Ｊ．Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｎｕｓｓ．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｂａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６１（２０１８），ｐｐ．１３８２－１４１４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ．，Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ’ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｎｅ？Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １７，５３１－５３３頁（２０１８）；Ｖａｌｅｕｒ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，１０２９４－１０３２３；Ｃａｒｙ，Ｄ．Ｒ．；Ｏｈｕｃｈｉ，Ｍ．；Ｒｅｉｄ，Ｐ．Ｃ．；Ｍａｓｕｙａ，Ｋ．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｙｕｋｉ Ｇｏｓｅｉ Ｋａｇａｋｕ Ｋｙｏｋａｉｓｈｉ ２０１７，７５，１１７１－１１７８；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ａ．，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１９，１４１（１０），ｐｐ ４１６７－４１８１；Ｓａｗｙｅｒ，Ｔ．Ｋ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ α ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄａｌｉｔｙ：Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１８，２６，２８０７－２８１５）。第１に、ペプチドをそれらの結合した高次構造に向かって偏らせることによって、結合時のエントロピーペナルティが減少し、したがって、結合定数が改善されるだけでなく、望ましくないオフターゲット効果の機会がおそらく減少する。第２に、大員環化は、ペプチド中の重要な骨格および／または側鎖構造部分を修飾することによって、様々な程度のタンパク質分解耐性を付与し得る。第３に、大員環化は、例えば、分子内水素結合の安定性を高めて、別途無極性細胞膜を横切るペプチドの輸送で生じる脱溶媒和ペナルティを低減することによって、細胞透過性を高め得る。記載されているいくつかの環化技術の中で、特にペプチド大員環の望ましい二次構造がヘリカルである場合、アルファメチルアルケニル側鎖など、非タンパク質構成アミノ酸を使用するメタセシスによるステープリングが有効であることが証明されている（Ｓａｗｙｅｒ，Ｔ．Ｋ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ α ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄａｌｉｔｙ：Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１８，２６，２８０７－２８１５；Ｌ．Ｄ．Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｇ．Ｈ．Ｂｉｒｄ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ－ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，５７（２０１４），ｐｐ．６２７５－６２８８；Ｙ．Ｓ．Ｔａｎ，Ｄ．Ｐ．Ｌａｎｅ，Ｃ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２１（２０１６），ｐｐ．１６４２－１６５３；Ａｌｉ ＡＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｗｉｎｄｏｗ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１９，１７，２６３－２８１；Ｋｌｅｉｎ Ｍ．，Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１７，１２，１１１７－１１２５；Ｌｅｒｇｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２１０８，９，４６３８－４６４３）。ステープリングは、ヘリックスの結合面に干渉しないように、ペプチド配列に沿った適切な位置に配置される適切な非天然アミノ酸前駆体の組み込みを必要とする。リンカーは、異なるタイプであってもよく、異なる長さに及んでもよく、ｉ，ｉ＋３、ｉ，ｉ＋４またはｉ，ｉ＋７ステープルをもたらす。それらは主にヘリカル高次構造を安定化するために使用されてきたが、最近の研究はまた、閉環メタセシス（ＲＣＭ）戦略を非ヘリカルペプチドに適用した（Ｘｕ Ｗ．，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚｅｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｔａｎｋｙｒａｓｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１７，１３９（６），ｐｐ ２２４５－２２５６；Ｗｉｅｄｍａｎｎ，ＭＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ，Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ａ Ｋｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，５２４－５２９）。
【0007】
ステープルペプチド戦略を利用して、ＢＣＬ－２ファミリー－ＢＨ３ドメイン（Ｌ．Ｄ．Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇ，Ｉ．Ｅｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ，Ｓ．Ｂａｒｂｕｔｏ，Ｒ．Ｄ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．ＶｅｒｄｉｎｅおよびＳ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ａ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ－ｓｔａｐｌｅｄ ＢＨ３ ｈｅｌｉｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０５，１４６６－１４７０；Ｓ．Ａ．Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ａ．Ｃｏｌｅｓｋａ，Ｘ．Ｒａｎ，Ｈ．Ｙｉ，Ｃ．Ｙ．Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｓ．Ｗａｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｒｉａｚｏｌｅ－ｓｔａｐｌｅｄ ＢＣＬ９ α－ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ β－ｃａｔｅｎｉｎ／Ｂ－ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ９（ＢＣＬ９）ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，５５，１１３７－１１４６；Ｋ．Ｔａｋａｄａ，Ｄｉ Ｚｈｕ，Ｇ．Ｈ．Ｂｉｒｄ，Ｋ．Ｓｕｋｈｄｅｏ，Ｊ．－Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｍａｎｉ，Ｍ．Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｄ．Ｅ．Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｊ．Ｒｙａｎ；Ｄ．Ｈｏｒｓｔ，Ｍ．Ｆｕｌｃｉｎｉｔｉ，Ｎ．Ｃ．Ｍｕｎｓｈｉ，Ｗ．Ｘｕ，Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇ，Ｒ．Ａ．Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｌ．Ｄ．ＷａｌｅｎｓｋｙおよびＤ．Ｒ．Ｃａｒｒａｓｃｏ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＬ９／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１２，４，１４８ｒａ１１７）、β－カテニン－ＴＣＦ（Ｌ Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｂ Ｒａｔｈｍｅｒ，Ｋ Ｅｗａｎ，Ｔ Ｂａｎｇｅ，Ｓ Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ，ＴＣ Ｄａｌｅ，Ｄ Ｓｃｈａｄｅ，ＴＮ Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ．Ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ β－ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２４，９５８－９６８（２０１７））、Ｒａｂ－ＧＴＰアーゼ－エフェクター（Ｓｐｉｅｇｅｌ Ｊ，Ｃｒｏｍｍ ＰＭ，Ｉｔｚｅｎ Ａ，Ｇｏｏｄｙ ＲＳ，Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ ＴＮ，Ｗａｌｄｍａｎｎ Ｈ．Ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｂ－ＧＴＰａｓｅ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１４ Ｆｅｂ ２４；５３（９）：２４９８－５０３）、ＥＲα－活性化補助因子タンパク質（Ｘｉｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲα－Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ Ｉｓｏａｓｐａｒｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１７，６０（２１），ｐｐ ８７３１－８７４０）、キュリン３－ＢＴＢ（Ｐａｏｌａ ｄｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｌｌｉｎ３－ＢＴＢ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ａｐｒ ７；１０（４）：ｅ０１２１１４９）、ＶＤＲ－活性化補助因子タンパク質（Ｍｉｓａｗａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｐｌｅｄ ｓｈｏｒｔ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ）－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｍａｒ １；２３（５）：１０５５－６１）、ｅＩｆ４Ｅ（Ｌａｍａ Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｒｅｖｅａｌ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｐｌｅｄ－ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９，１０，２４８９－２５００）、ＡＴＳＰ－７０４１［国際公開第２０１３１２３２６６号を参照、ＳＡＨ－ｐ５３－８［Ｂｅｒｎａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８：４１１－４２２（２０１０）］、およびｐ５３－ＭＤＭ２／ＭＤＭＸ（Ｆ．Ｂｅｒｎａｌ，Ａ．Ｆ．Ｔｙｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｌ．Ｄ．ＷａｌｅｎｓｋｙおよびＧ．Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ．Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ａ ｓｔａｐｌｅｄ ｐ５３ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，２４５６－２４５７；Ｌ．Ｋ．Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｉ．ＧｈｏｓｈおよびＰ．Ｓ．Ａｒｏｒａ．Ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｂｏｎｄ－ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａ－ｈｅｌｉｃｅｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３／ＭＤＭ２ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，１１，２１０４－２１０７；Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｑｕａｈ，Ｊ．Ｊｏｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｇｏｈ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｉａｍ，Ｋ．Ｈ．Ｋｈｏｏ，Ｍ．Ｌ．Ｃｈｏｏｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｌｅｅ，Ｌ．Ｙｕｒｌｏｖａ，Ｋ．Ｚｏｌｇｈａｄｒ，Ｔ．Ｌ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ｃ．Ｓ．ＶｅｒｍａおよびＤ．Ｐ．Ｌａｎｅ．Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅ ｐ５３．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，５０６－５１２；Ｙ．Ｓ．Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｖ．Ｇｕｅｒｌａｖａｉｓ，Ｃ．Ｔｏｖａｒ，Ｋ．Ｐａｃｋｍａｎ，Ｔ．Ｔｏ，Ｋ．Ｏｌｓｏｎ，Ｋ．Ｋｅｓａｖａｎ，Ｐ．Ｇａｎｇｕｒｄｅ，Ａ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ｄａｒｌａｋ，Ｃ．Ｅｌｋｉｎ，Ｚ．Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ，Ｆ．Ｚ Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｈ．Ｃａｉ，Ｐ．Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ｆｅｙｆａｎｔ，Ｘ．Ｅ．Ｓｈｉ，Ｊ．Ｈｏｒｓｔｉｃｋ，Ａ．Ａｎｎｉｓ，Ｎ．Ｆｏｔｏｕｈｉ，Ｔ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｈ．Ｎａｓｈ，Ｌ．Ｔ．ＶａｓｓｉｌｅｖおよびＴ．Ｋ．Ｓａｗｙｅｒ．Ｓｔａｐｌｅｄ ａ－ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ ｐｏｔｅｎｔ ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ ｆｏｒ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，２０１３，１１０，Ｅ３４４５－Ｅ３４５５）を含む、治療能力があるいくつかのＰＰＩを阻害してきた。
【0008】
ｐ５３－ＭＤＭ２／ＭＤＭＸの場合、二重選択的ステープルペプチドであるＡＬＲＮ－６９２４（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）が、第ＩＩ相臨床試験へ進んでいる（Ａ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｍ．Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｈａｕｐｔ，Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｙ．ＨａｕｐｔおよびＥ．Ｌｉｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ＭＤＭ２／Ｘｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１６，６，１－７；Ｋ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｊ．ＩｓｈｉｚａｗａおよびＭ．Ａｎｄｒｅｅｆｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０１６，４４，７９１－７９８；Ｖ．Ｔｉｓａｔｏ，Ｒ．Ｖｏｌｔａｎ，Ａ．Ｇｏｎｅｌｌｉ，Ｐ．ＳｅｃｃｈｉｅｒｏおよびＧ．Ｚａｕｌｉ．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１７，１０，１３３）。プロテアーゼ媒介分解に対するさらなる耐性を提供するための、全Ｄ体α－アミノ酸ステープルペプチドも報告されている（Ａｒｏｎｉａ，Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｐ５３ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ，国際公開第２０２０／２５７１５３号）。
【0009】
ＡＬＲＮ－６９２４の例は、ステープルペプチドのクリニックへの前進を促しているが、課題は依然として残っている。これらの中でも、分子中の結合元素および物理化学的特性の正しいセットを操作して最適な安定性、溶解性および細胞活性を提供することは、患者への投与に必要な用量を最小化するために望ましい。さらに、この結合元素および物理化学的特性のセットを操作してオフターゲット活性を最小限に抑えることも、患者に対するオフターゲット関連有害事象のリスクを低減するために望ましい。本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、これらの課題に対処し、予想外の特性を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第２０１３１２３２６６号明細書
【特許文献2】国際公開第２０２０／２５７１５３号明細書
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｌａｎｅ ＤＰ ｐ５３，ｇｕａｒｄｉａｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｊｕｌ ２；３５８（６３８１）：１５－６ Ａｒｎｉ－Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｏ、Ｍ．Ｌｏｋｓｈｉｎ、およびＣ．Ｐｒｉｖｅｓ．２０１６．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．１１：６１７－６４４
【非特許文献2】Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｐｅｉ、１、２ Ｙａｎｐｉｎｇ Ｚｈａｎｇ、１、２およびＪｕｎｎｉａｎ Ｚｈｅｎｇ１ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３：ａ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１２ Ｍａｒ；３（３）：２２８－２３５
【非特許文献3】Ｔｉｓａｔｏ Ｖ１、Ｖｏｌｔａｎ Ｒ２、Ｇｏｎｅｌｌｉ Ａ２、Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏ Ｐ２、Ｚａｕｌｉ Ｇ２．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｌ ３；１０（１）：１３３
【非特許文献4】Ｐｅｔｔａ Ｉ．、Ｌｉｅｖｅｎｓ Ｓ．、Ｌｉｂｅｒｔ Ｃ．、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ Ｊ．、Ｄｅ Ｂｏｓｓｃｈｅｒ Ｋ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５；２４：７０７－７１８；Ｍａｃａｌｉｎｏ Ｓ．Ｊ．Ｙ．，Ｂａｓｉｔｈ Ｓ．，Ｃｌａｖｉｏ Ｎ．Ａ．Ｂ．，Ｃｈａｎｇ Ｈ．，Ｋａｎｇ Ｓ．，Ｃｈｏｉ Ｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８；２３：１９６３
【非特許文献5】Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ｅ．、Ｂａｙｌｙ、Ａ．Ｒ．、Ａｂｅｌｌ、Ｃ．およびＳｋｉｄｍｏｒｅ、Ｊ．（２０１６）Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｂｉｇ ｔａｒｇｅｔｓ：ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆａｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１５，５３３－５５０
【非特許文献6】Ｎｅｖｏｌａ Ｌ，Ｇｉｒａｌｔ Ｅ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；５１：３３０２－１５
【非特許文献7】Ｌａｕ、Ｊ．Ｌ．；Ｄｕｎｎ、Ｍ．Ｋ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７，２６，２７００－２７０７
【非特許文献8】Ｆｏｓｇｅｒａｕ，Ｋ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１５，２０，１２２－１２８
【非特許文献9】Ｂａｋａｉｌ Ｍ．、Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ Ｆ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ａ ｗｉｄｅ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｃｈｉｍｉｅ．２０１６，１９，１９－２７
【非特許文献10】Ａ．Ｈｅｎｎｉｎｏｔ、Ｊ．Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｎｕｓｓ．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｂａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６１（２０１８），ｐｐ．１３８２－１４１４
【非特許文献11】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ．、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ’ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｎｅ？ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １７，５３１～５３３頁（２０１８）
【非特許文献12】Ｖａｌｅｕｒ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，１０２９４－１０３２３
【非特許文献13】Ｃａｒｙ，Ｄ．Ｒ．；Ｏｈｕｃｈｉ，Ｍ．；Ｒｅｉｄ，Ｐ．Ｃ．；Ｍａｓｕｙａ，Ｋ．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｙｕｋｉ Ｇｏｓｅｉ Ｋａｇａｋｕ Ｋｙｏｋａｉｓｈｉ ２０１７，７５，１１７１－１１７８
【非特許文献14】Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ａ．，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１９，１４１（１０），ｐｐ４１６７－４１８１
【非特許文献15】Ｓａｗｙｅｒ，Ｔ．Ｋ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ α ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄａｌｉｔｙ：Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１８，２６，２８０７－２８１５
【非特許文献16】Ｌ．Ｄ．Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｇ．Ｈ．Ｂｉｒｄ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ－ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，５７（２０１４），ｐｐ．６２７５－６２８８
【非特許文献17】Ｙ．Ｓ．Ｔａｎ，Ｄ．Ｐ．Ｌａｎｅ，Ｃ．Ｓ．Ｖｅｒｍａ Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２１（２０１６），ｐｐ．１６４２－１６５３
【非特許文献18】Ａｌｉ ＡＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｗｉｎｄｏｗ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１９，１７，２６３－２８１
【非特許文献19】Ｋｌｅｉｎ Ｍ．，Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１７，１２，１１１７－１１２５
【非特許文献20】Ｌｅｒｇｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２１０８，９，４６３８－４６４３
【非特許文献21】Ｘｕ Ｗ．，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚｅｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｔａｎｋｙｒａｓｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１７，１３９（６），ｐｐ２２４５－２２５６
【非特許文献22】Ｗｉｅｄｍａｎｎ，ＭＭ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ，Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ａ Ｋｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，５２４－５２９
【非特許文献23】Ｌ．Ｄ．Ｗａｌｅｎｓｋｙ、Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇ、Ｉ．Ｅｓｃｈｅｒ、Ｔ．Ｊ．Ｍａｌｉａ、Ｓ．Ｂａｒｂｕｔｏ、Ｒ．Ｄ．Ｗｒｉｇｈｔ、Ｇ．Ｗａｇｎｅｒ、Ｇ．Ｌ．ＶｅｒｄｉｎｅおよびＳ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ａ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ－ｓｔａｐｌｅｄ ＢＨ３ ｈｅｌｉｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０５，１４６６－１４７０
【非特許文献24】Ｓ．Ａ．Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ａ．Ｃｏｌｅｓｋａ、Ｘ．Ｒａｎ、Ｈ．Ｙｉ、Ｃ．Ｙ．ＹａｎｇおよびＳ．Ｗａｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｒｉａｚｏｌｅ－ｓｔａｐｌｅｄ ＢＣＬ９ α－ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ β－ｃａｔｅｎｉｎ／Ｂ－ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ９（ＢＣＬ９）ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，５５，１１３７－１１４６
【非特許文献25】Ｋ．Ｔａｋａｄａ、Ｄｉ Ｚｈｕ、Ｇ．Ｈ．Ｂｉｒｄ、Ｋ．Ｓｕｋｈｄｅｏ、Ｊ．－Ｊ．Ｚｈａｏ、Ｍ．Ｍａｎｉ、Ｍ．Ｌｅｍｉｅｕｘ、Ｄ．Ｅ．Ｃａｒｒａｓｃｏ、Ｊ．Ｒｙａｎ；Ｄ．Ｈｏｒｓｔ、Ｍ．Ｆｕｌｃｉｎｉｔｉ、Ｎ．Ｃ．Ｍｕｎｓｈｉ、Ｗ．Ｘｕ、Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇ、Ｒ．Ａ．Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ、Ｌ．Ｄ．ＷａｌｅｎｓｋｙおよびＤ．Ｒ．Ｃａｒｒａｓｃｏ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＬ９／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１２，４，１４８ｒａ１１７
【非特許文献26】Ｌ Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ｂ Ｒａｔｈｍｅｒ、Ｋ Ｅｗａｎ、Ｔ Ｂａｎｇｅ、Ｓ Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ、ＴＣ Ｄａｌｅ、Ｄ Ｓｃｈａｄｅ、ＴＮ Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ．Ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ β－ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２４，９５８－９６８（２０１７）
【非特許文献27】Ｓｐｉｅｇｅｌ Ｊ、Ｃｒｏｍｍ ＰＭ、Ｉｔｚｅｎ Ａ、Ｇｏｏｄｙ ＲＳ、Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ ＴＮ、Ｗａｌｄｍａｎｎ Ｈ．Ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｂ－ＧＴＰａｓｅ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１４ Ｆｅｂ ２４；５３（９）：２４９８－５０３
【非特許文献28】Ｘｉｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲα－Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ Ｉｓｏａｓｐａｒｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１７，６０（２１），ｐｐ８７３１－８７４０
【非特許文献29】Ｐａｏｌａ ｄｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｌｌｉｎ３－ＢＴＢ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ａｐｒ ７；１０（４）：ｅ０１２１１４９
【非特許文献30】Ｍｉｓａｗａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｐｌｅｄ ｓｈｏｒｔ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ）－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｍａｒ １；２３（５）：１０５５－６１
【非特許文献31】Ｌａｍａ Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｒｅｖｅａｌ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｓｔａｐｌｅｄ－ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９，１０，２４８９－２５００
【非特許文献32】ＳＡＨ－ｐ５３－８［Ｂｅｒｎａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８：４１１－４２２（２０１０）
【非特許文献33】Ｆ．Ｂｅｒｎａｌ、Ａ．Ｆ．Ｔｙｌｅｒ、Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｌ．Ｄ．ＷａｌｅｎｓｋｙおよびＧ．Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ．Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ａ ｓｔａｐｌｅｄ ｐ５３ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，２４５６－２４５７
【非特許文献34】Ｌ．Ｋ．Ｈｅｎｃｈｅｙ、Ｊ．Ｒ．Ｐｏｒｔｅｒ、Ｉ．ＧｈｏｓｈおよびＰ．Ｓ．Ａｒｏｒａ．Ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｂｏｎｄ－ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａ－ｈｅｌｉｃｅｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３／ＭＤＭ２ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，１１，２１０４－２１０７
【非特許文献35】Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｓ．Ｔ．，Ｑｕａｈ、Ｊ．Ｊｏｎｇ、Ａ．Ｍ．Ｇｏｈ、Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｉａｍ、Ｋ．Ｈ．Ｋｈｏｏ、Ｍ．Ｌ．Ｃｈｏｏｎｇ、Ｍ．Ａ．Ｌｅｅ、Ｌ．Ｙｕｒｌｏｖａ、Ｋ．Ｚｏｌｇｈａｄｒ、Ｔ．Ｌ．Ｊｏｓｅｐｈ、Ｃ．Ｓ．ＶｅｒｍａおよびＤ．Ｐ．Ｌａｎｅ．Ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅ ｐ５３．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，５０６－５１２
【非特許文献36】Ｙ．Ｓ．Ｃｈａｎｇ、Ｂ．Ｇｒａｖｅｓ、Ｖ．Ｇｕｅｒｌａｖａｉｓ、Ｃ．Ｔｏｖａｒ、Ｋ．Ｐａｃｋｍａｎ、Ｔ．Ｔｏ、Ｋ．Ｏｌｓｏｎ、Ｋ．Ｋｅｓａｖａｎ、Ｐ．Ｇａｎｇｕｒｄｅ、Ａ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ、Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｋ．Ｄａｒｌａｋ、Ｃ．Ｅｌｋｉｎ、Ｚ．Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ、Ｆ．Ｚ Ｑｕｒｅｓｈｉ、Ｈ．Ｃａｉ、Ｐ．Ｂｅｒｒｙ、Ｅ．Ｆｅｙｆａｎｔ、Ｘ．Ｅ．Ｓｈｉ、Ｊ．Ｈｏｒｓｔｉｃｋ、Ａ．Ａｎｎｉｓ、Ｎ．Ｆｏｔｏｕｈｉ、Ｔ．Ｍａｎｎｉｎｇ、Ｈ．Ｎａｓｈ、Ｌ．Ｔ．ＶａｓｓｉｌｅｖおよびＴ．Ｋ．Ｓａｗｙｅｒ．Ｓｔａｐｌｅｄ ａ－ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａ ｐｏｔｅｎｔ ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＤＭ２ ａｎｄ ＭＤＭＸ ｆｏｒ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，２０１３，１１０，Ｅ３４４５－Ｅ３４５５
【非特許文献37】Ａ．Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｋ．Ｍ．Ｃｈｉａ、Ｓ．Ｈａｕｐｔ、Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｙ．ＨａｕｐｔおよびＥ．Ｌｉｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ＭＤＭ２／Ｘｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１６，６，１－７
【非特許文献38】Ｋ．Ｋｏｊｉｍａ、Ｊ．ＩｓｈｉｚａｗａおよびＭ．Ａｎｄｒｅｅｆｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０１６，４４，７９１－７９８
【非特許文献39】Ｖ．Ｔｉｓａｔｏ、Ｒ．Ｖｏｌｔａｎ、Ａ．Ｇｏｎｅｌｌｉ、Ｐ．ＳｅｃｃｈｉｅｒｏおよびＧ．Ｚａｕｌｉ．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１７，１０，１３３
【発明の概要】
【0012】
本明細書中に開示される架橋ペプチド模倣大員環は、アルケンまたはアルキンステープルおよびポリアミノ酸Ｃ末端尾部を含む。これらの架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸ（別名ＭＤＭ４）への結合が改善されており、プロテアーゼ耐性であり、膜破壊を誘導することなく細胞透過可能であり、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸを結合し、それによってＭＤＭ２およびＭＤＭＸのｐ５３への結合に拮抗することによってｐ５３を細胞内で活性化する。これらのペプチド模倣大員環は、特に化学療法および／または放射線療法と組み合わせて、抗癌療法において有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ｐ５３－ＭＤＭ２（蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ：１ＹＣＲ）複合体の結晶構造である（Ｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＣＳ １３４：１０３－１０６ ９２０１２）。ＭＤＭ２は表面として示され、結合ペプチドは、棒で強調された相互作用残基Ｌ－Ｐｈｅ１９、Ｌ－Ｔｒｐ２３およびＬ－Ｌｅｕ２６を含む漫画として示されている。水素結合相互作用を点線で示す。
【図2】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／４１６３４７ｖ１に従って描かれた、６ｘＡ尾部（配列番号２８）を有するアジド－ＡＴＳＰ－７０４１を表すヘリカルホイールである。図は、出現順に配列番号２７～２８をそれぞれ開示している。
【図3】分子動力学シミュレーション中にサンプリングされた、ＡＡＦＡＡＦ尾部（配列番号１６）－ＭＤＭ２複合体を有するＡＴＳＰ－７０４１の高次構造のスナップショットである。ＭＤＭ２は表面／漫画として示されており、結合ペプチドは漫画で示され、強調されたＣ末端残基Ｐｈｅ１４およびＰｈｅ１７ならびに炭化水素ステープルリンカーがヘリックスの上に連結された棒として示されている。
【図4】分子動力学シミュレーション中にサンプリングされた、ＡＡＥＡＡａ尾部（配列番号１７）－ＭＤＭ２複合体を有するＡＴＳＰ－７０４１の高次構造のスナップショットである。ＭＤＭ２は表面／漫画として示され、結合ペプチドは漫画で示され、Ｇｌｕ１４（サーモン）側鎖とＭｄｍ２ Ａｒｇ９７（青色）側鎖との間の相互作用が強調されている。炭化水素ステープルリンカーは、ヘリックスの上に接続された棒として示されている。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書中に開示される架橋ペプチド模倣大員環は、ヒトｐ５３タンパク質の一部分のペプチド模倣類似体に由来し、式（Ｉ）：
Ｒ１－Ｒ２－ベータＡｌａ－Ｌ－Ｔ－Ｆ－Ｘ１－Ｅ－Ｙ－Ｗ－Ａ－Ｑ－Ｒ３－Ｘ２－Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６－Ｒ４（配列番号１８）（Ｉ）、
によって表され、式中、
Ｒ１は、アシルおよびＣ１－１２アルキルから選択され、
Ｒ２は、天然または非天然Ｌ－アミノ酸残基であり、
Ｒ３は、脂肪族天然または非天然アミノ酸残基であり、
Ｒ４は、－ＯＨ、－ＮＨ２、および１～３個のＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択され、ここでＣ末端尾部は酸またはアミド基であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２は、それらのそれぞれのアルファ炭素から炭化水素結合を介して架橋され、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６の各々は、独立して天然または非天然アミノ酸残基である。
Ｒ１－Ｒ２－ベータＡｌａ－Ｌ－Ｔ－Ｆ－Ｘ１－Ｅ－Ｙ－Ｗ－Ａ－Ｑ－Ｒ３－Ｘ２－Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６－Ｒ４（配列番号１８）（Ｉ）、
によって表され、式中、
Ｒ１は、アシルおよびＣ１－１２アルキルから選択され、
Ｒ２は、天然または非天然Ｌ－アミノ酸残基であり、
Ｒ３は、脂肪族天然または非天然アミノ酸残基であり、
Ｒ４は、－ＯＨ、－ＮＨ２、および１～３個のＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択され、ここでＣ末端尾部は酸またはアミド基であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２は、それらのそれぞれのアルファ炭素から炭化水素結合を介して架橋され、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６の各々は、独立して天然または非天然アミノ酸残基である。
【0015】
一実施形態では、Ｒ１はアシルである。一実施形態では、Ｒ１はアセチルである。
【0016】
一実施形態では、Ｒ１はＣ１－１２アルキルである。一実施形態では、Ｒ１はＣ１－４アルキルである。
【0017】
一実施形態では、Ｒ２は、リジン残基、アジドリジン残基およびスレオニン残基から選択される。
【0018】
一実施形態において、Ｒ３は、ロイシン残基およびシクロブチルアラニン残基から選択される。
【0019】
一実施形態において、Ｒ４は、－ＯＨおよび－ＮＨ２から選択される。
【0020】
一実施形態では、Ｒ４は、Ｃ末端尾部がアミドである１～３個のＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択される。
【0021】
一実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨ２、およびＣ末端尾部がアミドであるＬ－またはＤ－アミノ酸残基から選択される。
【0022】
一実施形態では、Ｒ４は－ＮＨ２である。
【0023】
一実施形態において、Ｘ１およびＸ２の各々は独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基である。Ｘ１およびＸ２は、アルケンおよびジアルキンから選択される炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている。一実施形態において、結合はアルケン結合である。一実施形態において、結合はジアルキン結合である。
【0024】
一実施形態において、Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基から選択される。Ｘ１およびＸ２は、アルケン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている。
【0025】
一実施形態において、Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基から選択される。Ｘ１およびＸ２は、ジアルキン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されている。
【0026】
一実施形態では、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ４、およびＺ５の各々は、独立して天然または非天然アミノ酸残基である。Ｚ３およびＺ６の各々は、独立してアルキルまたは芳香族アミノ酸残基である。一実施形態では、Ｚ３およびＺ６の各々は、フェニルアラニン残基である。
【0027】
一実施形態では、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６の１つ以上は、独立して天然または非天然のＬ－またはＤ－負荷電アミノ酸残基である。
【0028】
一実施形態において、Ｚ１は、グルタミン酸残基およびガンマ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基から選択される。
【0029】
一実施形態では、Ｚ３はグルタミン酸残基である。
【0030】
一実施形態では、Ｚ５はアルファ－メチルグルタミン酸残基である。
【0031】
一実施形態では、Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＡＡＥＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
【0032】
一実施形態では、Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
【0033】
式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態において：
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２は、アルケンまたはジアルキン炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＡＡＥＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は独立して、α－一置換またはα，α－二置換の非天然Ｌ－またはＤ－アミノ酸残基であり、Ｘ１およびＸ２は、アルケンまたはジアルキン炭化水素結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＡＡＥＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）、ＡＡＡＡＡＡ（配列番号２８）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
【0034】
式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態において：
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２は、アルケン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２は、アルケン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
【0035】
式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態において：
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２は、ジアルキン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
Ｒ１は、アセチルであり、
Ｒ２は、リジン残基およびアジドリジン残基から選択され、
Ｒ３は、シクロブチルアラニン残基であり、
Ｒ４は、－ＮＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２の各々は、独立して（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基および（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基から選択され、Ｘ１およびＸ２は、ジアルキン結合を介してそれらのそれぞれのアルファ炭素から架橋されており、
Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＡＡＦＡＡＦ（配列番号１６）、ＡＡＦＡ（アルファ－Ｍｅ－Ｇｌｕ）Ｆ（配列番号１９）、ＥＡＦＡＡＦ（配列番号２１）およびＡＡＡＡＡ（Ｄ－Ａｌａ）（配列番号２２）から選択される。
【0036】
本明細書に開示されるＺ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸへの結合を改善することができる。一実施形態では、Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－Ｚ６配列は、ｐ５３細胞レポーター遺伝子アッセイにおける細胞活性をさらに改善するように修飾される。
【0037】
本明細書に開示される架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸを結合し、細胞膜への検出可能な破壊を誘導することなく細胞透過可能であり、ｐ５３を細胞内で活性化する。それらは、ｐ５３のＭＤＭ２への結合および／またはｐ５３のＭＤＭＸへの結合を妨害し、それによって機能性ｐ５３を開放し、その破壊を阻害する。
【0038】
本明細書中に記載の架橋ペプチド模倣大員環は、ｐ５３の望ましくない低レベルもしくは低活性を特徴とする癌および他の障害を治療するために、ならびに／またはＭＤＭ２もしくはＭＤＭＸの望ましくない高レベルの活性を特徴とする癌および他の障害を治療するために有用であり得る。それらはまた、不適切な細胞周期停止およびアポトーシスの状態、例えば神経変性および免疫不全に加えて、癌および自己免疫など、過剰な細胞の生存および増殖の状態につながるｐ５３転写経路の調節妨害に関連する障害を治療するために有用であり得る。
【0039】
これらの架橋ペプチド模倣大員環は、ｐ５３のＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸへの結合に拮抗するペプチドの一部分のアルファヘリカル二次構造を安定化する分子内架橋を一緒に形成する、２つの修飾アミノ酸を含む。架橋は「ステープル」と呼ばれ、架橋ペプチドは「ステープルペプチド」と呼ばれる。
【0040】
架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態では、Ｘ１またはＸ２の位置の各α－一置換またはα，α－二置換アミノ酸残基は、１つまたは２つのα－炭素結合反応性基を含み、第１のα－一置換またはα，α－二置換アミノ酸残基の反応性基は、第２のα－一置換またはα，α－二置換アミノ酸残基の反応性基と反応して架橋剤を形成することができる。一実施形態では、反応性基は末端オレフィン基を含む。別の実施形態では、反応性基は末端アルキン基を含む。
【0041】
架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態では、非天然アミノ酸残基は、位置Ｘ１では（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルデカ－９－エン酸残基であり、位置Ｘ２では（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－エン酸残基であり、ステープルは、閉環メタセシスによって得られるオレフィンである。
【0042】
架橋ペプチド模倣大員環の一実施形態では、非天然アミノ酸は、位置Ｘ１では（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルオクタ－７－イン酸残基であり、位置Ｘ２では（Ｓ）－２－アミノ－２－メチルヘプタ－６－イン酸残基であり、ステープルは、グレーサーカップリングによって得られるオレフィンである。
【0043】
一実施形態では、架橋ペプチド模倣大員環は、式（ＩＶ）：
で表される配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。
【化1】
【0044】
一実施形態では、架橋ペプチド模倣大員環は、式（ＩＸ）：
で表される配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【化2】
【0045】
一実施形態では、架橋ペプチド模倣大員環は、式（Ｘ）：
で表される配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【化3】
【0046】
一実施形態では、架橋ペプチド模倣大員環は、式（ＸＩＩＩ）：
で表される配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。
【化4】
【0047】
一実施形態において、架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの両方を結合し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによる測定で検出可能な細胞膜破壊を伴わずに細胞透過可能であり、ｐ５３を細胞内で活性化する。
【0048】
一実施形態では、架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの両方を結合し、ｐ５３を細胞内で活性化し、カウンタースクリーニングアッセイにおいて選択的である。
【0049】
一実施形態において、架橋ペプチド模倣大員環は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの両方を結合し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによる測定で検出可能な細胞膜破壊を伴わずに細胞透過可能であり、ｐ５３を細胞内で活性化し、カウンタースクリーニングアッセイにおいて選択的である。
【0050】
基準大員環１（配列番号１）および大員環２～１３（配列番号２～１３）のアミノ酸配列を表１に列挙する。
前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環を対象に投与することを含む、対象におけるｐ５３および／またはＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸの活性を調節する方法も本明細書中に開示される。
【表1】
【0051】
さらに、前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環を対象に投与することを含む、対象におけるｐ５３とＭＤＭ２との間および／またはｐ５３とＭＤＭＸとの間の相互作用に拮抗する方法が本明細書中に開示される。
【0052】
さらに、癌の治療のための前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環を本明細書中に開示する。例えば、癌を有する対象において癌を治療するための方法は、前述の架橋ペプチド模倣大員環のいずれか１つを対象に投与することを含む。
【0053】
一実施形態では、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、ホジキンリンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、膵臓癌、気管支癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌から選択される。
【0054】
癌を治療するための併用療法であって、前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、治療有効量の構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環と、治療有効量の化学療法剤または放射線とを対象に投与することを含む、併用療法を本明細書中にさらに開示する。一実施形態において、化学療法剤もしくは放射線が対象に投与された後にペプチド模倣大員環が投与されるか、ペプチド模倣大員環が対象に投与された後に化学療法剤もしくは放射線が投与されるか、または化学療法剤もしくは放射線が、ペプチド模倣大員環の投与と同時に対象に投与される。したがって、一実施形態では、癌を治療するための併用療法は、前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つの治療有効量の架橋ペプチド模倣大員環と、治療用量の化学療法剤または放射線とを含む。
【0055】
一実施形態では、癌を治療するための併用療法は、前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、治療有効量の構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環と、治療有効量のチェックポイント阻害剤とを対象に投与することを含む。特定の態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。さらなる態様では、治療は、治療有効用量の化学療法剤または放射線を対象に投与することをさらに含む。
【0056】
一実施形態では、癌の治療は、癌を有する対象への、転写活性化活性を有する野生型ｐ５３タンパク質またはｐ５３バリアントをコードする核酸分子を含むベクターの投与、続いて前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つを含む、治療有効量の構造式（Ｉ）の架橋ペプチド模倣大員環の１回以上の投与を含む。一実施形態では、ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである。一実施形態では、対象にベクターを投与する前に、または対象にベクターを投与した後に、対象に化学療法または放射線治療を投与する。一実施形態では、療法は、対象にベクターを投与する前に、または対象にベクターを投与した後に、対象にチェックポイント阻害剤を投与することを含む。チェックポイント阻害剤は、化学療法もしくは放射線治療を対象に投与する前に、または化学療法もしくは放射線治療を対象に投与した後に投与され得る。
【0057】
一実施形態では、化学療法剤は、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アリトレチノイン、アザシチジン、アザチオプリン、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルモフル、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イキサベピロン、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ロミドプシン、テガフール、テモゾロミド（経口ダカルバジン）、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、ウチデロン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびボリノスタットから選択される。
【0058】
一実施形態では、前述のペプチド模倣大員環のいずれか１つと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書に開示される。一実施形態では、ペプチド模倣大員環は、配列番号４、配列番号９、配列番号１０および配列番号１３から選択される。
【0059】
定義
「アシル」は、カルボン酸からヒドロキシル基を除去することによって形成される有機ラジカルのクラス、ＲＣＯ－を指す。一実施形態では、ＲはＣ１－１２アルキルである。一実施形態では、ＲはＣ１－４アルキルである。一実施形態では、アシルはアセチルである（すなわち、Ｒはメチルである）。
「アシル」は、カルボン酸からヒドロキシル基を除去することによって形成される有機ラジカルのクラス、ＲＣＯ－を指す。一実施形態では、ＲはＣ１－１２アルキルである。一実施形態では、ＲはＣ１－４アルキルである。一実施形態では、アシルはアセチルである（すなわち、Ｒはメチルである）。
【0060】
「投与する」および「投与すること」は、少なくとも１つのペプチド模倣大員環、または少なくとも１つのペプチド模倣大員環を含む医薬組成物を対象に導入することを意味するために使用される。投与が治療を目的とする場合、物質は、腫瘍などの異常な細胞増殖の診断時または診断後に提供される。この物質の治療的投与は、腫瘍の細胞成長または異常な細胞成長を阻害するのに役立つ。
【0061】
「アルキル」は、１～１８個の炭素原子（Ｃ１－１８アルキル）、より具体的には、１～１２個の炭素原子（Ｃ１－１２アルキル）、またはさらにより具体的には、１～４個の炭素原子（Ｃ１－４アルキル）の分枝鎖飽和脂肪族炭化水素基および直鎖飽和脂肪族炭化水素基の両方を指す。一実施形態では、アルキルはメチルである。
【0062】
「α－アミノ酸」または単に「アミノ酸」という用語は、側鎖（Ｒ基）および水素原子に結合したアミノ基、およびα－炭素と呼ばれる炭素に結合したカルボキシル基の両方を含む分子を指し、（Ｒ）および（Ｓ）α－アミノ酸について示される式：
によって表され得る。
【化5】
【0063】
一般に、Ｌ－アミノ酸は、（Ｒ）配置を有するシステイン、およびアキラルであるグリシンを除いて、（Ｓ）配置を有する。本明細書に開示される全Ｄ体ペプチドに適したα－アミノ酸には、天然アミノ酸およびその類似体、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製された非天然アミノ酸（Ｌ、Ｄまたはアキラルであり得るα，α－二置換アミノ酸を除く）のＤ異性体のみが含まれる。文脈がそうでないことを具体的に示さない限り、アミノ酸という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸類似体を含むことが意図される。本明細書で使用される場合、Ｄアミノ酸は上付き文字「Ｄ」（例えば、ＤＬｅｕ）で示され、Ｌアミノ酸は「Ｌ」（例えば、Ｌ－Ｌｅｕ）で示されるか、またはＬ識別子なし（例えば、Ｌｅｕ）で示される。
【0064】
「α、α－二置換アミノ酸」という用語は、２つの天然もしくは非天然アミノ酸側鎖、またはそれらの組み合わせに結合しているα－炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子または部分を指す。例示的なα，α－二置換アミノ酸を以下に示す。これらのα，α－二置換アミノ酸は、末端オレフィン反応性基を有する側鎖を含む。
「アミノ酸類似体」または「非天然アミノ酸」は、アミノ酸と構造的に類似しており、ペプチド模倣大員環の形成においてアミノ酸を置換することができる分子を指す。アミノ酸類似体には、アミノ基とカルボキシル基（例えば、α－アミノ、β－カルボキシ酸）との間の１つ以上の追加のメチレン基の含有、またはアミノ基もしくはカルボキシ基の同様の反応性基による置換（例えば、第一級アミンの第二級もしくは第三級アミンによる置換、またはカルボキシ基のエステルによる置換）を除いて、限定されないが、本明細書で定義されるアミノ酸と構造的に同一である化合物が含まれる。
【化6】
【0065】
「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸中のα－炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４－ヒドロキシフェニルメチル、などである。他の非天然アミノ酸側鎖は、例えば、自然に発生するもの（例えば、アミノ酸代謝産物）または合成的に作られたもの（例えば、α，α－二置換アミノ酸）も含む。
【0066】
「封鎖基」は、主題のペプチド模倣大員環のポリペプチド鎖のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに存在する化学的部分を指す。カルボキシ末端の封鎖基には、未修飾カルボン酸（すなわち、－ＣＯＯＨ）または置換基を有するカルボン酸が含まれる。例えば、カルボキシ末端をアミノ基で置換して、Ｃ末端にカルボキサミドを得ることができる（すなわち、－ＣＯＮＨ２）。様々な置換基には、これらに限定されないが、ペグ化二級アミンを含む一級および二級アミンが含まれる。アミノ末端の封鎖基には、未修飾アミン（すなわち－ＮＨ２）、または置換基を有するアミンが含まれる。例えば、アミノ末端をアシル基で置換して、Ｎ末端にカルボキサミドを得ることができる。様々な置換基には、限定されないが、Ｃ１－Ｃ６カルボニル、Ｃ７－Ｃ３０カルボニル、およびペグ化カルバメートを含む置換アシル基が含まれる。
【0067】
「共投与」は、少なくとも２つの異なる生物学的に活性な化合物の各々が、生物学的活性のそれぞれの期間が重複する時間枠の間に対象に投与されることを意味する。したがって、この用語は、連続的であると同時に共通広範の（ｃｏ－ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）投与を含む。共投与が使用される場合、投与経路は同じである必要はない。生物学的に活性な化合物には、ペプチド模倣大員環、ならびに癌の治療に有用な他の化合物、例えば、これらに限定されないが、ビンカアルカロイド、核酸阻害剤、白金剤、インターロイキン－２、インターフェロン、アルキル化剤、代謝拮抗物質、コルチコステロイド、ＤＮＡ挿入剤、アントラサイクリンおよび尿素などの薬剤を含む。本明細書中に例示されるものに加えて、具体的な薬剤の例としては、ヒドロキシ尿素、５－フルオロウラシル、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダカバジン、シタラビン、ブスルファン、チオテパ、ロムスチン、メクロレハミン、シクロホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、クロラムブシル、カルムスチン、６－チオグアニン、メトトレキサートなどが挙げられる。当業者は、２つの異なるペプチド模倣大員環が対象に共投与され得ること、またはペプチド模倣大員環および薬剤、例えば上記に提示される薬剤の１つが対象に共投与され得ることを理解するであろう。
【0068】
本明細書で使用される「併用療法」は、第１の治療剤および第２の治療剤を個体に連続的にまたは同時に投与することを含む、ヒトまたは動物個体の治療を指す。一般に、第１および第２の治療剤は、混合物としてではなく、個別に個体に投与される。しかしながら、第１および第２の治療剤が投与前に混合される実施形態が存在し得る。
【0069】
本明細書で使用される「保存的置換」は、アミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格高次構造および剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指し、それにより、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に変更を行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（第４版）（１９８７）を参照のこと）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換を表２に示す。
「用量」、「投与量」、「単位用量」、「単位投与量」、「有効量」および関連する用語は、所望の治療効果（例えば、癌細胞の死）をもたらすように計算された所定量の有効成分（例えば、ペプチド模倣大員環）を含有する物理的に別個の単位を指す。これらの用語は、治療有効量、および本明細書に開示される方法の記載された目的を達成するのに十分な量と同義である。
【表2】
【0070】
「ヘリカル安定性」は、円偏光二色性またはＮＭＲによって測定される、ペプチド模倣大員環のステープルまたはステッチによるα－ヘリカル構造の維持を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書中に開示されるペプチド模倣大員環は、円偏光二色性によって測定すると、対応する非架橋大員環と比較して少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍または２倍のα－ヘリシティの増加を示す。
【0071】
「大員環」は、少なくとも９個の共有結合した原子によって形成された輪または環を含む化学構造を有する分子を指す。
【0072】
本明細書で使用される「大員環化試薬」または「大員環形成試薬」は、２つの反応性基間の反応を媒介することによって本発明のペプチド模倣大員環を調製するために使用され得る、任意の試薬を指す。反応性基は、例えばアジドおよびアルキンであってもよく、この場合、大員環化試薬としては、限定されないが、Ｃｕ試薬、例えばＣｕＢｒ、ＣｕＩまたはＣｕＯＴｆなどの反応性Ｃｕ（Ｉ）種を提供する試薬、ならびにアスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムなどの還元剤の添加によってその場で活性Ｃｕ（Ｉ）試薬に変換され得るＣｕ（ＩＩ）塩、例えばＣｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２、ＣｕＳＯ４およびＣｕＣｌ２が挙げられる。
【0073】
大員環化試薬は、例えば、Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（（ＰＰｈ３）２、［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］４などの当技術分野で公知のＲｕ試薬、または反応性Ｒｕ（ＩＩ）種を提供し得る他のＲｕ試薬をさらに含み得る。他の場合、反応性基は末端オレフィンである。そのような実施形態では、大員環化試薬または大員環形成試薬はメタセシス触媒であり、限定されないが、安定化された後期遷移金属カルベン錯体触媒、例えば第ＶＩＩＩ族遷移金属カルベン触媒を含む。例えば、このような触媒は、＋２の酸化状態、１６の電子数および五配位を有するＲｕおよびＯｓ金属中心である。さらなる触媒は、Ｇｒｕｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、「Ｒｉｎｇ Ｃｌｏｓｉｎｇ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８，４４６－４５２、および米国特許第５，８１１，５１５号に開示されている。さらに他の場合では、反応性基はチオール基である。そのような実施形態では、大員環化試薬は、例えば、ハロゲン基などの２つのチオール反応性基で官能化されたリンカーである。
【0074】
「ＭＤＭ２」は、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼとしても知られるマウス二重微小染色体２タンパク質を指す。ＭＤＭ２は、ヒトにおいてＭＤＭ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制因子の重要な負の調節因子である。ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制因子のＮ末端トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）を認識するＥ３ユビキチンリガーゼとしても、ｐ５３転写活性化の阻害剤としても機能する。本明細書中で使用される場合、用語ＭＤＭ２は、ヒトホモログを指す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号２２８９５２；ＧＩ：２２８９５２を参照のこと。
【0075】
「ＭＤＭＸ」または「ＭＤＭ４」は、ＭＤＭ２と有意な構造類似性を示すタンパク質である、マウス二重微小染色体Ｘまたは４を指す。ＭＤＭＸまたはＭＤＭ４は、ＭＤＭＸまたはＭＤＭ４タンパク質のＮ末端領域に位置する結合ドメインを介してｐ５３と相互作用する。本明細書中で使用される場合、用語ＭＤＭＸまたはＭＤＭ４は、同じヒトホモログを指す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号８８７０２７９１；ＧＩ：８８７０２７９１を参照のこと。
【0076】
大員環または大員環形成リンカーと組み合わせて本明細書で使用される「メンバー」は、大員環を形成するかまたは形成することができる原子を指し、置換基または側鎖原子を除外する。類推して、シクロデカン、１，２－ジフルオロ－デカンおよび１，３－ジメチルシクロデカンはすべて、水素またはフルオロ置換基またはメチル側鎖が大員環の形成に関与しないので、１０員大員環とみなされる。
【0077】
「天然アミノ酸」は、自然に合成されたペプチドに一般的に見られ、一文字略記号Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶで知られている２０個のアミノ酸のいずれか１つを指す。
【0078】
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの必須の生物学的または生化学的活性（例えば、受容体結合または活性化）を消失または実質的に変化させることなく、ポリペプチドの野生型配列から変更され得る残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変更されると、ポリペプチドの必須の生物学的または生化学的活性の消失または実質的な消失をもたらす残基である。
【0079】
「ペプチド模倣大員環」または「架橋ポリペプチド」は、複数のペプチド結合によって連結された複数のアミノ酸残基、および同じ分子内の第１の天然または非天然アミノ酸残基（または類似体）と第２の天然または非天然アミノ酸残基（または類似体）との間に大員環を形成する、少なくとも１つの大員環形成リンカーを含む化合物を指す。ペプチド模倣大員環は、大員環形成リンカーが第１のアミノ酸残基（または類似体）のα－炭素を第２のアミノ酸残基（または類似体）のα－炭素に連結する実施形態を含む。ペプチド模倣大員環は、１つ以上のアミノ酸残基および／またはアミノ酸類似体残基間に１つ以上の非ペプチド結合を含んでもよく、大員環を形成する何らかに加えて、１つ以上の非天然アミノ酸残基またはアミノ酸類似体残基を含んでもよい。「対応する非架橋ポリペプチド」は、ペプチド模倣大員環との関連で言及される場合、ステープルまたはステッチの架橋に関与するアミノ酸を除いて、ペプチド模倣大員環と同じアミノ酸配列のポリペプチドに関すると理解される。
【0080】
特に明記しない限り、本明細書で言及されるペプチド模倣大員環および構造は、１つ以上の同位体濃縮原子の存在のみで異なるペプチド模倣大員環を含むことも意味する。例えば、水素がデューテリウムもしくはトリチウムで置換されている、または炭素原子が１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素で置換されている、または炭素原子がケイ素で置換されている本発明の構造を有するペプチド模倣大員環は、本開示の範囲内である。本明細書中に開示されるペプチド模倣大員環はまた、そのようなペプチド模倣大員環を構成する原子の１つ以上において非天然比率の原子同位体を含有し得る。例えば、ペプチド模倣大員環は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）または炭素－１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射性標識され得る。本発明のペプチド模倣大員環のすべての同位体変種は、放射性であろうとなかろうと、本開示の範囲内に包含される。
【0081】
「薬学的に許容される誘導体」は、本明細書に開示されるペプチド模倣大員環の任意の薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグまたは他の誘導体を意味し、それらを個体に投与すると、本明細書に開示されるペプチド模倣大員環を（直接的または間接的に）提供することができる。特に好ましい薬学的に許容される誘導体は、個体に投与した場合に（例えば、経口投与された本明細書中に開示されるペプチド模倣大員環の血液中への吸収を増大させることによって）本明細書に開示されるペプチド模倣大員環のバイオアベイラビリティを高めるか、または親種と比較して生体コンパートメント（例えば、脳またはリンパ系）への活性化合物の送達を増加させる誘導体である。いくつかの薬学的に許容される誘導体は、胃腸粘膜を越える水溶性または能動輸送を増加させる化学基を含む。
【0082】
「ポリペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）によって連結された２つ以上の天然または非天然アミノ酸を包含する。本明細書に記載のポリペプチドは、全長タンパク質（例えば、完全にプロセシングされたタンパク質）ならびにより短いアミノ酸配列（例えば、天然タンパク質のフラグメントまたは合成ポリペプチドフラグメント）を含む。
【0083】
「安定性」は、円偏光二色性、ＮＭＲもしくは別の生物物理学的計測によって測定される、本発明のペプチド模倣大員環による溶液中の定義された二次構造の維持、またはインビトロもしくはインビボでのタンパク質分解に対する耐性を指す。本発明において企図される二次構造の非限定的な例は、αヘリックス、βターン、およびβプリーツシートである。
【0084】
本明細書で使用される「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療される対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量を指す。例えば、これは、ｐ５３を、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸへのその結合を阻害することによって活性化するのに必要な本発明のペプチド模倣大員環の量であり得る。それはまた、癌を治療するために対象に一般的に投与される、癌を有する対象に投与される化学療法剤または放射線の量または線量を指し得る。
【0085】
本明細書で使用される「治療する」または「治療すること」は、治療剤、例えば本発明のペプチド模倣大員環のいずれかを含有する組成物を、薬剤が治療活性または予防活性を有する１つ以上の疾患症状を有するか、または疾患を有すると疑われる対象または患者に、内部的または外部的に投与することを意味する。典型的には、薬剤は、治療された対象または集団における１つ以上の疾患症状を、任意の臨床的に測定可能な程度でそのような症状の退縮を誘導することによって、またはそのような症状の進行を阻害することによって緩和するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療剤の量は、要因、例えば患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する薬物の能力に応じて変化し得る。疾患症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練したヘルスケア提供者によって通常使用される、任意の臨床測定によって評価することができる。この用語はさらに、障害に関連する症状の発症の延期および／またはそのような障害の症状の重症度の低下を含む。この用語はさらに、既存の無制御または望ましくない症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、およびそのような症状の根本的な原因を改善または予防することを含む。したがって、これらの用語は、有益な結果が、障害、疾患もしくは症状を有するか、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発症する可能性を有するヒトまたは動物の対象に与えられたことを意味する。
【0086】
本明細書で使用される場合、ヒトまたは獣医学的個体に適用される「治療」は、治療的処置を指し、本発明のペプチド模倣大員環による治療を必要とするヒトまたは動物個体と本発明のペプチド模倣大員環との接触を包含する。
【0087】
Ｐ５３活性化ペプチド模倣大員環
本発明の架橋ペプチド模倣大員環は、公知のペプチド模倣大員環、例えば国際公開第２０２０１１２８６８号に開示されているものと比較して改善された特性を有する。本発明のペプチド模倣大員環はまた、以下の参考文献においてより詳細に開示される大員環よりも改善された特性を有する：Ａ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｍ．Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｈａｕｐｔ，Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｙ．ＨａｕｐｔおよびＥ．Ｌｉｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ＭＤＭ２／Ｘｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１６，６，１－７；Ｋ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｊ．ＩｓｈｉｚａｗａおよびＭ．Ａｎｄｒｅｅｆｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０１６，４４，７９１－７９８；Ｖ．Ｔｉｓａｔｏ，Ｒ．Ｖｏｌｔａｎ，Ａ．Ｇｏｎｅｌｌｉ，Ｐ．ＳｅｃｃｈｉｅｒｏおよびＧ．Ｚａｕｌｉ．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１７，１０，１３３。一実施形態において、本発明の大員環は、優れた結合能力を有する。別の実施形態では、本発明の大員環は、改善された物理化学的特性を有する。
本発明の架橋ペプチド模倣大員環は、公知のペプチド模倣大員環、例えば国際公開第２０２０１１２８６８号に開示されているものと比較して改善された特性を有する。本発明のペプチド模倣大員環はまた、以下の参考文献においてより詳細に開示される大員環よりも改善された特性を有する：Ａ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｍ．Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｈａｕｐｔ，Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｙ．ＨａｕｐｔおよびＥ．Ｌｉｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ＭＤＭ２／Ｘｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１６，６，１－７；Ｋ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｊ．ＩｓｈｉｚａｗａおよびＭ．Ａｎｄｒｅｅｆｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０１６，４４，７９１－７９８；Ｖ．Ｔｉｓａｔｏ，Ｒ．Ｖｏｌｔａｎ，Ａ．Ｇｏｎｅｌｌｉ，Ｐ．ＳｅｃｃｈｉｅｒｏおよびＧ．Ｚａｕｌｉ．ＭＤＭ２／Ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１７，１０，１３３。一実施形態において、本発明の大員環は、優れた結合能力を有する。別の実施形態では、本発明の大員環は、改善された物理化学的特性を有する。
【0088】
本発明の架橋ペプチド模倣大員環は、Ｃ末端尾部で結合する追加のＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸ（４）を有することができる。特に、大部分がヘリカルＣ末端尾部に関連する親油性アミノ酸残基による位置１４および１７の修飾は、親和性および／または細胞活性をさらに高めることができる。例えば、大員環３（配列番号３）の位置１４および１７においてアラニンをフェニルアラニンで置換すると、大員環４（配列番号４）が生じる。この置換により、０％血清での細胞活性が大員環３と比較してさらに改善される。大員環４は、円偏光二色性（ＣＤ）において、大員環３と比較して同様の全体的なヘリカル性向を示す。
【0089】
一実施形態において、大員環３の位置１４におけるアラニンをグルタミン酸で置換すると、大員環３よりも改善された細胞活性を示す大員環１１（配列番号１１）が生じる。この改善は、ＭＤＭ２アルギニン９７との相互作用によるものであると考えられる。
【0090】
尾部でのさらなる結合を分子中の物理化学的特性の正しいセットで操作して、安定性、溶解性、および／または細胞活性を改善することができる。一実施形態では、負に荷電したアルファアミノ酸残基を位置１２および１６に導入することにより、ペプチドの両親媒性および全体的な特性を改善することができる。例えば、大員環４（配列番号４）の位置１６におけるアラニンをアルファ－メチルグルタミン酸で置換すると、大員環４と比較して１０％血清においてさらに改善された細胞活性を有する大員環９（配列番号９）が生じる。大員環９はまた、大員環５および７の近い類似体と比較して、１５３ｕＭの良好な溶解性を示す。
【0091】
大員環１２（配列番号１２）において位置１４および１７のフェニルアラニンを位置１２のグルタミン酸と組み合わせると、大員環１３（配列番号１３）が得られ、これは大員環１２および大員環２と比較して、さらに改善した結合および細胞活性（０％および１０％血清の両方）を示す。さらに、大員環１３は、１６７ｕＭの改善された溶解性およびＣＤにおいて優れた全体的なヘリカル性向を示す。
【0092】
結合特徴および物理化学的特性の正しいセットを操作することにより、効力および選択性が改善された化合物のような「より清浄な」薬物を得ることができる。大員環４と比較して改善された両親媒性プロファイルを特徴とする大員環９は、カウンタースクリーニングアッセイにおいて選択性プロファイルを示す。
【0093】
大員環３と比較して改善された両親媒性および細胞活性を特徴とする大員環１１はまた、ｐ５３依存性ＨＴＣ１１６細胞増殖アッセイにおいて少なくとも２倍の改善を示し、ｐ５３－ｎｕｌ Ｃａ Ｓｋｉカウンタースクリーニング増殖アッセイにおいてより清浄なプロファイルを示す。
【0094】
さらに、１０％血清で改善された細胞活性プロファイルを示す大員環１３は、大員環２と比較して、ＨＴＣ１１６細胞増殖アッセイにおいて７倍を超える改善をもたらす。
【0095】
ステープルにおける追加の修飾によって、全体的な特性をさらに改善することができる。例えば、大員環１３でのジアルキンステープルの使用は、細胞増殖アッセイの効力の改善においてさらなる利点を提供する。
【0096】
ここではＸ１とＸ２との間のステープルのみが記載されているが、Ｌ－Ｔ－Ｆ－Ｘ１－Ｅ（配列番号２３）内のＬとＥとを連結する、またはＺ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５内のＺ１とＺ５とを連結する（ラクタムまたは炭素系ｉとして、例えばｉ＋ステープル）追加のステープルも考えられる。
【0097】
したがって、本明細書に開示される代替尾部は、改善された結合および物理化学的特性を提供する。予想外の特性はまた、それらのオンターゲット対オフターゲットプロファイルのために清浄なペプチドをもたらすアルキンステープルで得られる。ステープルタイプ、ステープル位置およびＣ末端修飾の組み合わせは、予想外の生物学的特異性および活性をもたらし得る。全体として、本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、改善された生物学的プロファイルを提供する。
【0098】
医薬組成物
本開示のペプチド模倣大員環を含む医薬組成物も本明細書に開示される。ペプチド模倣大員環は、任意の適切な医薬担体または賦形剤と組み合わせて使用され得る。そのような医薬組成物は、治療有効量の１つ以上のペプチド模倣大員環、ならびに薬学的に許容される（１または複数の）賦形剤および／または（１または複数の）担体を含む。特定の製剤が、投与様式に適するであろう。特定の態様では、薬学的に許容される担体は、水または緩衝液であり得る。
本開示のペプチド模倣大員環を含む医薬組成物も本明細書に開示される。ペプチド模倣大員環は、任意の適切な医薬担体または賦形剤と組み合わせて使用され得る。そのような医薬組成物は、治療有効量の１つ以上のペプチド模倣大員環、ならびに薬学的に許容される（１または複数の）賦形剤および／または（１または複数の）担体を含む。特定の製剤が、投与様式に適するであろう。特定の態様では、薬学的に許容される担体は、水または緩衝液であり得る。
【0099】
医薬組成物に含まれる賦形剤は、例えば薬物の性質および投与様式に応じて異なる目的を有する。一般的に使用される賦形剤の例としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、感染用水（ｗａｔｅｒ－ｆｏｒ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせ、安定剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および防腐剤、等張剤、増量剤、潤滑剤（タルクまたはシリカ、および脂肪、例えば植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸など）、乳化剤、懸濁化剤または粘性剤、不活性希釈剤、充填剤（セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、植物油脂、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、およびステアリン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、結合剤（デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、または微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの修飾セルロース、スクロースおよびラクトースなどの糖、またはキシリトール、ソルビトールもしくはマルチトールなどの糖アルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコール）、湿潤剤、抗菌剤、キレート剤、コーティング（セルロースフィルムコーティング、合成ポリマー、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼインまたは他の多糖類、およびゼラチンなど）、防腐剤（ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、パルミチン酸レチニルおよびセレン、システイン、メチオニン、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、ならびにメチルパラベンおよびプロピルパラベンを含む合成防腐剤を含む）、甘味料、芳香剤、香味剤、着色剤、投与助剤およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【0100】
担体は、医薬組成物の状況において、対象への有効成分の送達を改善および／または延長する化合物および物質である。担体は、制御放出技術を使用して、対象における薬物のインビボ活性を延長するか、または薬物の放出を遅延させるのに役立ち得る。担体はまた、対象における薬物代謝を減少させ、かつ／または薬物の毒性を低下させることができる。担体を使用して、対象における特定の細胞または組織への薬物の送達を標的化することもできる。一般的な担体（親水性および疎水性担体の両方）には、脂肪エマルジョン、脂質、ＰＥＧ化リン脂質、ＰＥＧ化リポソーム、環状ＲＧＤペプチドｃ（ＲＧＤＤＹＫ（配列番号２４））でＰＥＧスペーサーを介してコーティングされたＰＥＧ化リポソーム、リポソームおよびリポスフィア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、ミクロスフェア（生分解性ポリマーまたはアルブミンで作製されたものを含む）、ポリマーマトリックス、生体適合性ポリマー、タンパク質－ＤＮＡ複合体、タンパク質コンジュゲート、赤血球、小胞、ナノ粒子、および炭化水素ステープル用の側鎖が含まれる。前述の担体を使用して、本発明のペプチド模倣大員環の細胞膜透過性を高めることもできる。
【0101】
経口投与に適合された医薬組成物は、カプセルまたは錠剤などの個別の単位として；粉末または顆粒として；溶液、シロップまたは懸濁液として（水性もしくは非水性の液体中で；または食用フォームもしくはホイップとして；またはエマルジョンとして）提供されてもよい。錠剤または硬ゼラチンカプセル剤に適した賦形剤には、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が含まれる。軟ゼラチンカプセルとの使用に適した賦形剤には、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオールなどが含まれる。溶液およびシロップの調製のために、使用され得る賦形剤には、例えば水、ポリオールおよび糖が含まれる。懸濁液の調製のために、油、例えば植物油を使用して、水中油型または油水中型懸濁液を提供することができる。特定の状況では、遅延放出調製物が有利であり得、ペプチド模倣大員環を遅延放出様式または制御放出様式で送達することができる組成物も調製され得る。長期の胃中滞留は、胃中に存在する酵素による分解の問題をもたらし、そのため、腸溶コーティングされたカプセルはまた、放出のための活性物質が胃腸管内で低下する、当技術分野における標準的な技術によって調製され得る。
【0102】
経皮投与に適合した医薬組成物は、レシピエントの表皮と長時間の密接な接触を維持することを意図した、個別のパッチとして提供され得る。例えば、有効成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６）：３１８（１９８６）に一般的に記載されているように、イオントフォレシスによってパッチから送達され得る。
【0103】
局所投与に適合した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油として製剤化され得る。軟膏に製剤化される場合、有効成分は、パラフィン系軟膏基剤または水混和性軟膏基剤のいずれかと共に使用され得る。あるいは、有効成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤を用いてクリームに製剤化されてもよい。眼への局所投与に適合した医薬組成物には、有効成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼剤が含まれる。口内への局所投与に適合した医薬組成物には、ロゼンジ、トローチおよびマウスウォッシュが含まれる。
【0104】
直腸投与に適合した医薬組成物は、坐剤または浣腸剤として提供され得る。
【0105】
経鼻投与に適合され、担体が固体である医薬組成物は、嗅剤を吸い込む様式で、すなわち、保持し、鼻に近づけた粉末の容器から鼻腔流路を通じて迅速に吸入することによって投与される、例えば２０～５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。担体が液体であり、鼻スプレーとしてまたは点鼻薬としての投与に適した組成物には、有効成分の水溶液または油溶液が含まれる。
【0106】
吸入による投与に適合した医薬組成物には、様々なタイプの定量加圧エアロゾル、ネブライザーまたは吸入器によって生成され得る微粒子ダストまたはミストが含まれる。
【0107】
膣投与に適合した医薬組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として提供され得る。
【0108】
非経口投与に適合した医薬組成物には、製剤を予定されるレシピエントの血液と実質的に等張にする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。注射用溶液に使用され得る賦形剤としては、例えば、注射用水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば水または生理食塩水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、付臭剤、塩（本発明の物質自体は、薬学的に許容される塩の形態で提供され得る）、緩衝剤、コーティング剤または酸化防止剤を含有し得る。それらはまた、本発明の物質に加えて治療活性剤を含有し得る。
【0109】
医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内または皮内経路などの便利な方法で投与され得る。医薬組成物は、特定の適応症の治療および／または予防に有効な量で投与される。一般に、医薬組成物は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。ほとんどの場合、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、毎日約１０ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【0110】
本開示のペプチド模倣大員環の投与量は、癌の場所、起源、同一性、程度および重症度、治療される個体の年齢および状態などに応じて、広い範囲の間で変動し得る。最終的に、医師が使用される適切な投与量を決定するであろう。
【0111】
ペプチド模倣大員環はまた、インビボでのアンタゴニストの発現によって、すなわち遺伝子療法によって、本開示に従って使用され得る。遺伝子療法の設定におけるペプチドまたは組成物の使用は、本発明の目的のためのペプチドの「投与」の一種であるとも考えられる。
【0112】
したがって、本発明はまた、癌を有する対象を治療する方法であって、薬学的有効量の本発明の１つ以上のペプチド模倣大員環、または１つ以上のアンタゴニストを含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。「癌」という用語は、広く解釈されることを意図しており、異常な細胞増殖および／または細胞分裂のすべての状況を包含する。例として、以下を含む：癌腫、これらに限定されないが、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌を含む癌腫、および皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、子宮頸部、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、結腸、小腸、胃、食道、胆嚢の癌を含む；肉腫、これらに限定されないが、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン細胞腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、ならびに骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管および造血組織の癌を含む；リンパ腫および白血病、これらに限定されないが、成熟Ｂ細胞腫瘍、例えば、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ腫および形質細胞腫瘍、成熟Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ならびに免疫不全関連リンパ増殖性障害を含む；胚細胞腫瘍、これらに限定されないが、精巣癌および卵巣癌を含む；芽細胞腫、これらに限定されないが、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵臓芽腫、胸膜肺芽腫および網膜芽細胞腫を含む。この用語は、良性腫瘍も包含する。
【0113】
各実施形態において、治療を受ける個体または対象は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、非ヒト霊長類、鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコもしくはげっ歯類、または別の哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【0114】
本開示の医薬組成物の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器、例えば、本開示のペプチド模倣大員環および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が充填された容器を含むキットも提供される。そのような（１または複数の）容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知を組み合わせることができ、その通知は、機関によるヒト投与のための製造、使用または販売の承認を反映する。さらに、医薬組成物は、他の治療化合物と組み合わせて使用されてもよい。
【0115】
化学療法を含む併用療法
本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、化学療法と組み合わせて、癌を有する個体に投与され得る。個体は、個体へのペプチド模倣大員環の投与と同時に化学療法を受けることができる。個体は、個体がペプチド模倣大員環による治療の過程を完了した後に化学療法を受けてもよい。個体は、個体が化学療法剤による治療の過程を完了した後にペプチド模倣大員環を投与されてもよい。本発明の併用療法はまた、疾患進行または再発癌を伴う再発性または転移性癌を有し、化学療法を受けているかまたは化学療法を完了している個体に投与され得る。
本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、化学療法と組み合わせて、癌を有する個体に投与され得る。個体は、個体へのペプチド模倣大員環の投与と同時に化学療法を受けることができる。個体は、個体がペプチド模倣大員環による治療の過程を完了した後に化学療法を受けてもよい。個体は、個体が化学療法剤による治療の過程を完了した後にペプチド模倣大員環を投与されてもよい。本発明の併用療法はまた、疾患進行または再発癌を伴う再発性または転移性癌を有し、化学療法を受けているかまたは化学療法を完了している個体に投与され得る。
【0116】
化学療法は、以下からなる群から選択される化学療法剤を含み得る：
（ｉ）アルキル化剤、限定されないが、二官能性アルキル化剤、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランを含む；
（ｉｉ）単官能性アルキル化剤、限定されないが、ダカルバジン、ニトロソ尿素、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）を含む；
（ｉｉｉ）アントラサイクリン、限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシンを含む；
（ｉｖ）細胞骨格破壊剤（タキサン）、限定されないが、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテールを含む；
（ｖ）エポチロン、限定されないが、イキサベピロンおよびウチデロンを含む；
（ｖｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、限定されないが、ボリノスタットおよびロミデプシンを含む；
（ｖｉｉ）トポイソメラーゼｉの阻害剤、限定されないが、イリノテカンおよびトポテカンを含む；
（ｖｉｉｉ）トポイソメラーゼｉｉの阻害剤、限定されないが、エトポシド、テニポシドおよびタフルポシドを含む；
（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、限定されないが、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブを含む；
（ｘ）ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、限定されないが、アザシチジン、アザチオプリン、フルオロピリミジン（例えば、カペシタビン、カルモフル、ドキシフルリジン、フルオロウラシルおよびテガフールなど）、シタラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ、以前はｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）を含む；
（ｘｉ）ペプチド抗生物質、限定されないが、ブレオマイシンおよびアクチノマイシンを含む；白金系薬剤、限定されないが、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンを含む；
（ｘｉｉ）レチノイド、限定されないが、トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテンを含む；ならびに
（ｘｉｉｉ）ビンカアルカロイドおよび誘導体、限定されないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。
（ｉ）アルキル化剤、限定されないが、二官能性アルキル化剤、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランを含む；
（ｉｉ）単官能性アルキル化剤、限定されないが、ダカルバジン、ニトロソ尿素、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）を含む；
（ｉｉｉ）アントラサイクリン、限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシンを含む；
（ｉｖ）細胞骨格破壊剤（タキサン）、限定されないが、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテールを含む；
（ｖ）エポチロン、限定されないが、イキサベピロンおよびウチデロンを含む；
（ｖｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、限定されないが、ボリノスタットおよびロミデプシンを含む；
（ｖｉｉ）トポイソメラーゼｉの阻害剤、限定されないが、イリノテカンおよびトポテカンを含む；
（ｖｉｉｉ）トポイソメラーゼｉｉの阻害剤、限定されないが、エトポシド、テニポシドおよびタフルポシドを含む；
（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、限定されないが、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブを含む；
（ｘ）ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、限定されないが、アザシチジン、アザチオプリン、フルオロピリミジン（例えば、カペシタビン、カルモフル、ドキシフルリジン、フルオロウラシルおよびテガフールなど）、シタラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ、以前はｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）を含む；
（ｘｉ）ペプチド抗生物質、限定されないが、ブレオマイシンおよびアクチノマイシンを含む；白金系薬剤、限定されないが、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンを含む；
（ｘｉｉ）レチノイド、限定されないが、トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテンを含む；ならびに
（ｘｉｉｉ）ビンカアルカロイドおよび誘導体、限定されないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。
【0117】
化学療法のための化学療法剤の用量の選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性、および治療される個体における標的細胞、組織または器官のアクセス可能性を含むいくつかの因子に依存する。追加の治療剤の用量は、許容可能なレベルの副作用をもたらす量でなければならない。したがって、各追加の治療剤の用量および投与頻度は、具体的な治療剤、治療されている癌の重症度、および患者の特徴に部分的に依存する。抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量を選択する際の指針が利用可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ Ｅｄ）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；５７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２）を参照されたい。適切な用量レジメンの決定は、例えば、当技術分野において治療に影響を及ぼすことが公知であるかもしくは疑われる、または治療に影響を及ぼすことが予測されるパラメータまたは因子を使用して臨床医によって行われてもよく、例えば、個体の病歴（例えば、以前の療法）、治療される癌のタイプおよびステージならびに併用療法における治療剤の１つ以上に対する応答のバイオマーカーに依存する。
【0118】
白金含有化学療法、ペメトレキセドおよび白金化学療法またはカルボプラチン、およびパクリタキセルまたはｎａｂ－パクリタキセルのいずれかを含む化学療法工程を含む併用療法の実施形態が企図される。特定の実施形態において、化学療法工程との併用療法は、少なくともＮＳＣＬＣおよびＨＮＳＣＣを治療するために使用され得る。
【0119】
併用療法は、任意の増殖性疾患の治療、特に癌の治療に使用され得る。特定の実施形態では、併用療法は、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、ホジキンリンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、または唾液腺癌を治療するために使用され得る。
【0120】
別の実施形態では、併用療法は、膵臓癌、気管支癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳もしくは中枢神経系癌、末梢神経系癌、子宮もしくは子宮内膜癌、口腔もしくは咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸もしくは虫垂癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織の癌を治療するために使用され得る。
【0121】
特定の実施形態では、併用療法は、黒色腫（転移性または切除不能）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、尿路上皮癌、ＭＳＩＨＣ、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、腎細胞癌（進行癌を含む）、および皮膚扁平上皮癌から選択される１つまたは複数の癌を治療するために使用され得る。
【0122】
追加の併用療法
本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、他の療法と組み合わせて使用され得る。例えば、併用療法は、１つ以上のさらなる治療剤、例えばホルモン治療、ワクチンおよび／または他の免疫療法と共に製剤化され、かつ／またはそれらと共投与されるペプチド模倣大員環を含む組成物を含み得る。他の実施形態では、ペプチド模倣大員環は、手術、放射線、凍結手術、および／または温熱療法を含む他の治療的処置モダリティと組み合わせて投与される。そのような併用療法は、有利には、より低い量の投与される治療剤を利用することができ、したがって可能性のある毒性、または様々な単剤療法に関連する合併症を回避する。
本明細書に開示されるペプチド模倣大員環は、他の療法と組み合わせて使用され得る。例えば、併用療法は、１つ以上のさらなる治療剤、例えばホルモン治療、ワクチンおよび／または他の免疫療法と共に製剤化され、かつ／またはそれらと共投与されるペプチド模倣大員環を含む組成物を含み得る。他の実施形態では、ペプチド模倣大員環は、手術、放射線、凍結手術、および／または温熱療法を含む他の治療的処置モダリティと組み合わせて投与される。そのような併用療法は、有利には、より低い量の投与される治療剤を利用することができ、したがって可能性のある毒性、または様々な単剤療法に関連する合併症を回避する。
【0123】
「と組み合わせて」によって、療法または治療剤が同時に投与され、かつ／または送達のために一緒に製剤化されなければならないことを暗示することは、これらの送達方法が本明細書に記載の範囲内にあるにもかかわらず、意図されていない。ペプチド模倣大員環は、１つ以上の他のさらなる療法または治療剤と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。ペプチド模倣大員環および他の薬剤または治療プロトコルは、任意の順序で投与され得る。一般に、薬剤は、その薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。この組み合わせで利用されるさらなる治療剤は、単一の組成物で一緒に投与されてもよく、または異なる組成物で別々に投与されてもよいことがさらに理解されるであろう。一般に、組み合わせて利用されるさらなる治療剤は、それらが個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。いくつかの実施形態では、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低くなる。
【0124】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるペプチド模倣大員環は、プログラム死受容体１（ＰＤ－１）またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１および／もしくはＰＤ－Ｌ２の、１つ以上のチェックポイント阻害剤またはアンタゴニストと組み合わせて投与される。阻害剤またはアンタゴニストは、抗体、抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ ＵＳＡ）、セチプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）またはピジリズマブ（ＣＴ－０１１）から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はＡＭＰ－２２４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えばデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、Ｒｏｃｈｅ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＣＨ）、またはアベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＳＢ－００１０７１８ＣまたはＭＤＸ－１１０５から選択される。
【0125】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを意図している。
【0126】
一般的な方法
ＭＤＭ４と共結晶化されたＡＴＳＰ－７０４１の利用可能な結晶構造を使用して、Ｃ末端伸長を有するステープルペプチドをモデル化した。これらのモデルをすべて、さらなる改良のためにＭＤ（分子動力学）シミュレーションに供した。遊離ペプチドおよびペプチド－ＭＤＭ２複合体についてＭＤシミュレーションを行った。ＡＭＢＥＲ１６のＸｌｅａｐモジュールを使用して、ＭＤシミュレーション用のシステムを準備した。水素原子を加え、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端を残基ＡＣＥ（アセチル）およびＮＨＥ（一級アミド）で封鎖した。ステープルリンカー用のパラメータは、以前の研究（Ｔａｎ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｅｎｚｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ７，３４５２－３４５７）から取った。すべてのシミュレーションシステムを適切な数の対イオンで中和した。中和されたシステムを、ＴＩＰ３Ｐ水分子を含む八面体ボックス中で溶媒和し、溶質原子とボックスの境界との間に少なくとも１０Åを残した。ＭＤシミュレーションは、ｆｆ１４ＳＢ力場と組み合わせたＡＭＢＥＲ １６パッケージを用いて行った。すべてのＭＤシミュレーションは、陽溶媒中、３００Ｋで行った。すべてのシミュレーション中、長距離静電相互作用は、９Åの実空間カットオフ距離を使用して粒子メッシュＥｗａｌｄ法で処理した。沈降アルゴリズム（ｓｅｔｔｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、水素原子を含む結合振動を抑制し、シミュレーション中に２ ｆｓの時間ステップを可能にした。
ＭＤＭ４と共結晶化されたＡＴＳＰ－７０４１の利用可能な結晶構造を使用して、Ｃ末端伸長を有するステープルペプチドをモデル化した。これらのモデルをすべて、さらなる改良のためにＭＤ（分子動力学）シミュレーションに供した。遊離ペプチドおよびペプチド－ＭＤＭ２複合体についてＭＤシミュレーションを行った。ＡＭＢＥＲ１６のＸｌｅａｐモジュールを使用して、ＭＤシミュレーション用のシステムを準備した。水素原子を加え、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端を残基ＡＣＥ（アセチル）およびＮＨＥ（一級アミド）で封鎖した。ステープルリンカー用のパラメータは、以前の研究（Ｔａｎ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｅｎｚｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ７，３４５２－３４５７）から取った。すべてのシミュレーションシステムを適切な数の対イオンで中和した。中和されたシステムを、ＴＩＰ３Ｐ水分子を含む八面体ボックス中で溶媒和し、溶質原子とボックスの境界との間に少なくとも１０Åを残した。ＭＤシミュレーションは、ｆｆ１４ＳＢ力場と組み合わせたＡＭＢＥＲ １６パッケージを用いて行った。すべてのＭＤシミュレーションは、陽溶媒中、３００Ｋで行った。すべてのシミュレーション中、長距離静電相互作用は、９Åの実空間カットオフ距離を使用して粒子メッシュＥｗａｌｄ法で処理した。沈降アルゴリズム（ｓｅｔｔｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、水素原子を含む結合振動を抑制し、シミュレーション中に２ ｆｓの時間ステップを可能にした。
【0127】
溶媒分子および対イオンは、最初に、タンパク質およびペプチド原子での拘束によるエネルギー最小化を使用して緩和された。この後、無制御にエネルギー最小化を行って、あらゆる立体衝突を除去した。続いて、０．２５ｎｓの期間にわたるタンパク質およびペプチドでの位置拘束を用いたＭＤシミュレーション（力定数：５０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１Å－２）を使用してシステムを０から３００°Ｋまで徐々に加熱し、水分子およびイオンを自由に移動させ、続いて位置拘束を徐々に取り除き、３００°Ｋで２ｎｓの無拘束平衡化を行った。得られたシステムは、ＭＤシミュレーションのそれぞれの生成段階のための出発構造として使用された。各ケースについて、（異なる初期ランダム速度を使用する）３つの独立したＭＤシミュレーションを、十分に平衡化された構造から開始して実行した。各ＭＤシミュレーションを２５０ｎｓ間実施し、高次構造を４ｐｓごとに記録した。
【0128】
高次構造のサンプリングを向上させるために、これらのペプチドのそれぞれを、バイアス電位レプリカ交換分子動力学（Ｂｉａｓｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｅｐｌｉｃａ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ：ＢＰ－ＲＥＭＤ）シミュレーションに供した。ＢＰ－ＲＥＭＤ技術は、レプリカに沿った二面角遷移を促進するバイアス電位を含む、ハミルトニアン－ＲＥＭＤ法の一種である（Ｋａｎｎａｎ Ｓ，Ｚａｃｈａｒｉａｓ Ｍ（２００７）Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｂｉａｓｉｎｇ－ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．６６：６９７－７０６；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｒ Ｋ，Ｚａｃｈａｒｉａｓ Ｍ．Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ ｒｅｐｌｉｃａ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂｉａｓｉｎｇ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｎｄ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｄｉｈｅｄｒａｌ ａｎｇｌｅｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，３５（２０１４））。各システムについて、ＢＰ－ＲＥＭＤは、バイアス無しの基準レプリカを含む８つのレプリカで行われた。ＢＰ－ＲＥＭＤを５０ｎｓ間実施し、隣接するレプリカ間の交換を２ｐｓごとに試み、メトロポリス基準に従って受け入れるかまたは拒否した。基準レプリカ（バイアス無し）でサンプリングした高次構造をさらなる分析に使用した。ＶＭＤを使用してシミュレーション軌跡を可視化し、Ｐｙｍｏｌを使用して図を生成した。
【0129】
結合エネルギー計算およびエネルギー分解分析：
分子機構ポアソン－ボルツマン表面積（ＭＭＰＢＳＡ）法をペプチドとそれらのパートナータンパク質との間の結合自由エネルギーの計算に使用し、シミュレーションの最後の５０ｎｓから抽出した２５０の高次構造を結合エネルギーの計算に使用した。エントロピー計算は計算処理的に集約されており、容易に収束することはなく、したがって無視される。ＭＭＧＢＳＡエネルギー分解スキームを使用して、有効結合エネルギーを個々の残基の寄与に分解した。ＭＭＧＢＳＡの計算は、ＭＭＰＢＳＡの計算と同じ方法で行った。溶媒和自由エネルギーへの極性寄与は、ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｒｎ（ＧＢ）法（ｉｇｂ＝２）を適用して、ｍｂｏｎｄｉ２半径を用いて決定した。非極性寄与は、０．００７２ｋｃａｌ／ｍｏｌÅ２の表面張力比例定数を使用して、溶媒露出表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ：ＳＡＳＡ）依存項によってＩＣＯＳＡ法を使用して推定した。ペプチド残基の各々をＭＤシミュレーションの各高次構造においてＤ－アラニンに変異させ、野生型ペプチドの結合エネルギーに関する変化をＭＭＰＢＳＡを用いて計算するインシリコアラニンスキャニングを行うことによって、ペプチド残基の寄与をさらに調査した。
分子機構ポアソン－ボルツマン表面積（ＭＭＰＢＳＡ）法をペプチドとそれらのパートナータンパク質との間の結合自由エネルギーの計算に使用し、シミュレーションの最後の５０ｎｓから抽出した２５０の高次構造を結合エネルギーの計算に使用した。エントロピー計算は計算処理的に集約されており、容易に収束することはなく、したがって無視される。ＭＭＧＢＳＡエネルギー分解スキームを使用して、有効結合エネルギーを個々の残基の寄与に分解した。ＭＭＧＢＳＡの計算は、ＭＭＰＢＳＡの計算と同じ方法で行った。溶媒和自由エネルギーへの極性寄与は、ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｒｎ（ＧＢ）法（ｉｇｂ＝２）を適用して、ｍｂｏｎｄｉ２半径を用いて決定した。非極性寄与は、０．００７２ｋｃａｌ／ｍｏｌÅ２の表面張力比例定数を使用して、溶媒露出表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ：ＳＡＳＡ）依存項によってＩＣＯＳＡ法を使用して推定した。ペプチド残基の各々をＭＤシミュレーションの各高次構造においてＤ－アラニンに変異させ、野生型ペプチドの結合エネルギーに関する変化をＭＭＰＢＳＡを用いて計算するインシリコアラニンスキャニングを行うことによって、ペプチド残基の寄与をさらに調査した。
【0130】
ペプチド合成
ジイソプロピルカルボジイミド／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＣ／ＨＯＢＴ）活性化剤と順次カップリングさせたＲＩＮＫ樹脂およびＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用してペプチドを合成した。二重カップリング反応を第１のアミノ酸に対して行い、ステープル位置でも行った。これらの後者の位置では、より良好なカップリング効率のために、活性化試薬をＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン／ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＤＩＥＡ／ＨＡＴＵ）に切り替えた。
ジイソプロピルカルボジイミド／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＣ／ＨＯＢＴ）活性化剤と順次カップリングさせたＲＩＮＫ樹脂およびＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用してペプチドを合成した。二重カップリング反応を第１のアミノ酸に対して行い、ステープル位置でも行った。これらの後者の位置では、より良好なカップリング効率のために、活性化試薬をＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン／ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＤＩＥＡ／ＨＡＴＵ）に切り替えた。
【0131】
最初に樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄し、引き続いて第１世代グラブス触媒（３５ｍｇを５ｍＬのＤＣＭに溶解）を添加することによって閉環メタセシス反応を行い、２時間反応させた（グラブス触媒を用いるすべての工程は暗所で行った）。閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を繰り返して完全な反応を確実にした。ＲＣＭが完了した後、十分な収率を確保するために試験切断を行った。ペプチドを切断し、次いで、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によってシス－トランス異性体の混合物として精製した。最初に樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、引き続いてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２、次いでＣｕＩを添加し、次いで超音波処理し、次いで３０℃で１６時間加熱することによって、樹脂に対してグレーザーアルキンクロスカップリング反応を行った。混合物を濾過し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄した。
【0132】
ＭＤＭ２タンパク質の作製
ペプチド結合アッセイで使用するために、ヒトＭＤＭ２ １～１２５配列をｐＮＩＣ－ＧＳＴベクターにクローニングした。ＴＶ切断部位をＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２５）からＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２６）に変更して、以下の配列（配列番号１４）を有する融合タンパク質を得た：
［配列表］
対応するプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ大腸菌細胞に形質転換し、カナマイシン選択下で増殖させた。適切な抗生物質を補充した７５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）および１００μＬのａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の瓶に、一晩増殖させた２０ｍＬの種培養物を接種した。培養物を、ＬＥＸシステム（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）において３７℃で、培養物の中に濾過空気をバブリングすることによって通気および撹拌しながらインキュベートした。培養物ＯＤ６００が２に達したら、ＬＥＸシステムの温度を１８℃に下げ、培養物を６０分後に０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。タンパク質発現を一晩継続させた。細胞を１５℃で１０分間の４０００ｇ遠心分離によって回収した。上清を廃棄し、細胞ペレットを溶解緩衝液（細胞ペレット１グラム当たり１．５ｍＬ）に再懸濁した。精製作業の前に細胞懸濁液を－８０℃で保存した。
ペプチド結合アッセイで使用するために、ヒトＭＤＭ２ １～１２５配列をｐＮＩＣ－ＧＳＴベクターにクローニングした。ＴＶ切断部位をＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２５）からＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２６）に変更して、以下の配列（配列番号１４）を有する融合タンパク質を得た：
［配列表］
【0133】
再懸濁した細胞ペレット懸濁液を解凍し、氷上、７０％振幅、３秒間オン／オフで３分間超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｉｂｒａ－ｃｅｌｌ）した。溶解物を、４℃で２５分間の４７０００ｇ遠心分離によって清澄化した。上清を１．２ｕｍシリンジフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。精製レジームを以下に簡単に説明する。
【0134】
溶解物を、１０カラム体積の洗浄１緩衝液で平衡化した１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。全体的な緩衝液条件は以下の通りであった：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）洗浄１緩衝液：２０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ｐＨ７．５；ＩＭＡＣ洗浄２緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５；ＩＭＡＣ溶出緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５。
【0135】
空気が空気センサによって０．８ｍＬ／分で検出されるまで試料をロードした。次いで、カラムを２０カラム体積の洗浄１緩衝液で洗浄し、続いて２０カラム体積の洗浄２緩衝液で洗浄した。タンパク質を５カラム体積の溶出緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を回収し、システム上の試料ループに保存し、次いでゲル濾過（ＧＦ）カラムに注入した。溶出ピークを２ｍＬの画分に収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析した。精製全体を４℃で行った。関連するピークをプールし、ＴＣＥＰを総濃度２ｍＭまで添加した。タンパク質試料をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０フィルターコンセントレーター（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）において、１５℃で約１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（＜１８ｋＤａ－５Ｋ ＭＷＣＯ、１９～４９ｋＤａ－１０Ｋ ＭＷＣＯ、＞５０ｋＤａ－３０Ｋ ＭＷＣＯ）。最終タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって評価した。最終タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで評価した。次いで、最終タンパク質バッチをより小さな画分に分注し、液体窒素で凍結し、－８０℃で保存した。
【0136】
ＭＤＭ４タンパク質の作製
ＭＤＭ４タンパク質をｐＮＩＣ－ＧＳＴベクターにクローニングし、ＮＴＵ（Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＰＰＰ）のＬＥＸシステム（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で発現させた。グリセロールストックを使用して、カナマイシンを補充した８ｇ／Ｌグリセロールを含む２０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで接種培養を開始した。培養物を３７℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌朝、カナマイシンを補充した８ｇ／Ｌのグリセロールおよび１００μＬのａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈの瓶に、種培養物を接種した。
ＭＤＭ４タンパク質をｐＮＩＣ－ＧＳＴベクターにクローニングし、ＮＴＵ（Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＰＰＰ）のＬＥＸシステム（Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で発現させた。グリセロールストックを使用して、カナマイシンを補充した８ｇ／Ｌグリセロールを含む２０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで接種培養を開始した。培養物を３７℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌朝、カナマイシンを補充した８ｇ／Ｌのグリセロールおよび１００μＬのａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈの瓶に、種培養物を接種した。
【0137】
培養物を、ＬＥＸシステムにおいて３７℃で、培養物の中に濾過空気をバブリングすることによって通気および撹拌しながらインキュベートした。ＯＤ６００が約２に達したら、温度を１８℃に下げ、培養物を３０～６０分後に０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。タンパク質発現を一晩継続させた。翌朝、１５℃で１０分間の４２００ｒｐｍ遠心分離によって細胞を回収した。上清を廃棄し、細胞を溶解緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ８．０、およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（培養７５０ｍＬあたり４ｕＬ）および２５０Ｕ／μＬのＭｅｒｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｓｅｔ ＩＩＩ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ（溶解緩衝液中１０００倍希釈））に２００ｒｐｍ、４℃で約３０分間再懸濁し、－８０℃で保存した。
【0138】
再懸濁した細胞ペレット懸濁液を解凍し、氷上、７０％振幅、３秒間オン／オフで３分間超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｉｂｒａ－ｃｅｌｌ）した。溶解物を、４℃で２５分間の４７０００ｇ遠心分離によって清澄化した。上清を１．２μｍシリンジフィルターで濾過し、１ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）ＩＭＡＣカラムを備えたＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを２０カラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）および２０ＣＶの洗浄緩衝液２（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）で、または３分間の安定なベースラインおよびデルタベース５ｍＡＵ（０．８ｍＬ／分）がそれぞれ得られるまで洗浄した。
【0139】
ＭＤＭ４タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）で溶出し、溶出ピーク（収集開始：＞５０ｍＡＵ、勾配＞２００ｍＡＵ／分、収集停止：＜５０ｍＡＵ、安定プラトー ０．５分、デルタプラトー ５ｍＡＵ）を収集し、システム上の試料ループに保存し、次いで平衡化ゲル濾過（ＧＦ）カラム（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に注入し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５で１．２ｍＬ／分の流速で溶出した。溶出ピーク（収集開始：＞２０ｍＡＵ、勾配＞１０ｍＡＵ／分、収集停止：＜２０ｍＡＵ、勾配＞１０ｍＡＵ／分、最小ピーク幅０．５分）を２ｍＬ画分に収集した。全体的な精製を４℃で行った。関連するピークをプールし、ＴＣＥＰを２ｍＭの最終濃度まで添加した。タンパク質試料をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０フィルターコンセントレーター（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）において、１５℃で約１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。最終タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって評価した。最終タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し、精製ＭＤＭ４タンパク質を液体窒素中で凍結し、－８０℃で保存した。
【0140】
円偏光二色性（ＣＤ）
実験の前に、５μｌの１０ｍＭストックペプチドを４５μｌの１００％メタノールと混合し、ＳｐｅｅｄＶａｃコンセントレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２時間乾燥させた。乾燥ペプチドを、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および５％メタノールを含有する緩衝液中で１ｍＭの濃度に再構成した。ペプチド試料を０．２ｃｍの経路長を有する石英キュベットに入れ、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ－ｐｌｕｓ ｑＣＤ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を用いて２５℃で３００～１９０ｎｍのＣＤスペクトルを記録した。ペプチドの実際の濃度は、２８０ｎＭでのペプチドの吸光度によって決定した。ペプチドの二次構造成分の推定は、ＣＤＮＮソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓによって配布）を使用して、デコンボリューション前にＣＤスペクトルを残基楕円率の平均値に変換することによって行った。すべての実験を２回行った。
実験の前に、５μｌの１０ｍＭストックペプチドを４５μｌの１００％メタノールと混合し、ＳｐｅｅｄＶａｃコンセントレーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２時間乾燥させた。乾燥ペプチドを、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および５％メタノールを含有する緩衝液中で１ｍＭの濃度に再構成した。ペプチド試料を０．２ｃｍの経路長を有する石英キュベットに入れ、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ－ｐｌｕｓ ｑＣＤ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を用いて２５℃で３００～１９０ｎｍのＣＤスペクトルを記録した。ペプチドの実際の濃度は、２８０ｎＭでのペプチドの吸光度によって決定した。ペプチドの二次構造成分の推定は、ＣＤＮＮソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓによって配布）を使用して、デコンボリューション前にＣＤスペクトルを残基楕円率の平均値に変換することによって行った。すべての実験を２回行った。
【0141】
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＩＴＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄシステムを使用して、すべての実験を２回行った。１００～２００μＭのペプチドを、１μＬごとの４０回の注入にわたって、２０μＭの精製組換えヒトＭＤＭ２タンパク質（アミノ酸１～１２５；配列番号１４）に滴定した。高濃度で不溶性のペプチドについては、２００μＭのＭＤＭ２タンパク質を２０μＭのペプチドに滴定することによって逆ＩＴＣを行った。すべてのタンパク質およびペプチドを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２、３％ ＤＭＳＯおよび０．００１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する緩衝液中で一晩透析した。ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＩＴＣ分析ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＩＴＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄシステムを使用して、すべての実験を２回行った。１００～２００μＭのペプチドを、１μＬごとの４０回の注入にわたって、２０μＭの精製組換えヒトＭＤＭ２タンパク質（アミノ酸１～１２５；配列番号１４）に滴定した。高濃度で不溶性のペプチドについては、２００μＭのＭＤＭ２タンパク質を２０μＭのペプチドに滴定することによって逆ＩＴＣを行った。すべてのタンパク質およびペプチドを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２、３％ ＤＭＳＯおよび０．００１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する緩衝液中で一晩透析した。ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＩＴＣ分析ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
【0142】
ＭＤＭ２結合アッセイ
精製ＭＤＭ２（１～１２５；配列番号１４）タンパク質を、５０ｎＭカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識１２／１ペプチド（ＦＡＭ－ＲＦＭＤＹＷＥＧＬ－ＮＨ２；配列番号１５）に対して滴定した。実験データを以下に示す１：１結合モデル式に当てはめることによって、ＦＡＭ標識１２／１ペプチドに対するＭＤＭ２の滴定のための解離定数を決定した。
精製ＭＤＭ２（１～１２５；配列番号１４）タンパク質を、５０ｎＭカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識１２／１ペプチド（ＦＡＭ－ＲＦＭＤＹＷＥＧＬ－ＮＨ２；配列番号１５）に対して滴定した。実験データを以下に示す１：１結合モデル式に当てはめることによって、ＦＡＭ標識１２／１ペプチドに対するＭＤＭ２の滴定のための解離定数を決定した。
【0143】
式１：
［Ｐ］はタンパク質濃度（ＭＤＭ２）であり、［Ｌ］は標識ペプチド濃度であり、ｒは測定された異方性であり、ｒ０は遊離ペプチドの異方性であり、ｒｂはＭＤＭ２－ＦＡＭ標識ペプチド複合体の異方性であり、Ｋｄは解離定数であり、［Ｌ］ｔは総ＦＡＭ標識ペプチド濃度であり、［Ｐ］ｔは総ＭＤＭ２濃度である。ＦＡＭ標識１２／１ペプチド（１３．０ｎＭ）の決定された見かけのＫｄ値を使用して、蛍光異方性実験においてその後の競合アッセイにおけるそれぞれの競合リガンドの見かけのＫｄ値を決定した。滴定は、ＭＤＭ２の濃度を２５０ｎＭで、標識ペプチドの濃度を５０ｎＭで一定に保ち行った。次いで、競合分子を、ＦＡＭ標識ペプチドとタンパク質との複合体に対して滴定した。見かけのＫｄ値は、実験データを以下に示す式に当てはめることによって決定した：
［Ｌ］ｓｔおよび［Ｌ］ｔは、それぞれ、標識リガンド投入濃度および総非標識リガンド投入濃度を示す。Ｋｄ２は、非標識リガンドとタンパク質との間の相互作用の解離定数である。すべての競合実験において、［Ｐ］ｔ＞［Ｌ］ｓｔであり、そうでない場合、かなりの量の遊離標識リガンドが常に存在し、測定を妨害するであろうと想定される。Ｋｄ１は、使用した標識ペプチドの見かけのＫｄであり、前の段落で記載したように実験的に決定されている。ＦＡＭ標識ペプチドを１ｍＭのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、実験用緩衝液に希釈した。読み取りは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて行った。実験は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４））および０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０緩衝液中で行った。すべての滴定を３回行った。Ｐｒｉｓｍ ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて曲線当てはめを行った。１：１結合モデルの当てはめを検証するために、ＭＤＭ２とＦＡＭ標識ペプチドとの間の直接滴定の開始時の異方性値が、遊離蛍光標識ペプチドについて観察された異方性値と有意に相違しないことを慎重に確保した。調査中のリガンドの陰性対照滴定も、（ＭＤＭ２の非存在下）蛍光標識ペプチドを用いて行って、リガンドとＦＡＭ標識ペプチドとの間に相互作用が発生していないことを確保した。さらに、本発明者らは、競合滴定の最終ベースラインが遊離ＦＡＭ標識ペプチドの異方性値を下回らないことを確保したが、これは、そうでなければリガンドとＦＡＭ標識ペプチドとの間の意図しない相互作用がＭＤＭ２結合部位から変位されなければならないことを示す。
【数1】
【数2】
【0144】
ｐ５３ベータ－ラクタマーゼレポーター遺伝子細胞機能アッセイ
ＨＣＴ１１６細胞をｐ５３応答性β－ラクタマーゼレポーターで安定にトランスフェクトし、３８４ウェルプレートに８，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（染色緩衝液またはＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むマッコイ５Ａ培地で維持した。細胞を一晩インキュベートし、続いて細胞増殖培地を除去し、０％ ＦＢＳまたは１０％ ＦＢＳのいずれかを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換した。次いで、液体ハンドラー、ＥＣＨＯ ５５５を使用してペプチドを各ウェルに分注し、４／１６時間インキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終作業濃度は０．５％であった。β－ラクタマーゼ活性を、ＴｏｘＢＬＡｚｅｒ Ｄｕａｌ Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。測定は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。最大ｐ５３活性を、５０μＭアジド－ＡＴＳＰ－７０４１（ステープルｐ５３ペプチド；Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって誘導されたβ－ラクタマーゼ活性の量と定義した。これを、ＨＣＴ１１６細胞に対する滴定によって、アジド－ＡＴＳＰ－７０４１によって誘導されたｐ５３活性の最大量として決定した。
ＨＣＴ１１６細胞をｐ５３応答性β－ラクタマーゼレポーターで安定にトランスフェクトし、３８４ウェルプレートに８，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（染色緩衝液またはＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むマッコイ５Ａ培地で維持した。細胞を一晩インキュベートし、続いて細胞増殖培地を除去し、０％ ＦＢＳまたは１０％ ＦＢＳのいずれかを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換した。次いで、液体ハンドラー、ＥＣＨＯ ５５５を使用してペプチドを各ウェルに分注し、４／１６時間インキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終作業濃度は０．５％であった。β－ラクタマーゼ活性を、ＴｏｘＢＬＡｚｅｒ Ｄｕａｌ Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。測定は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。最大ｐ５３活性を、５０μＭアジド－ＡＴＳＰ－７０４１（ステープルｐ５３ペプチド；Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって誘導されたβ－ラクタマーゼ活性の量と定義した。これを、ＨＣＴ１１６細胞に対する滴定によって、アジド－ＡＴＳＰ－７０４１によって誘導されたｐ５３活性の最大量として決定した。
【0145】
乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ（ＬＤＨ）
ＨＣＴ１１６細胞を３８４ウェルプレートに８０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むマッコイ５Ａ培地で維持した。細胞を一晩インキュベートした後、細胞培地を除去し、ＦＢＳを含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を添加した。次いで、細胞を１０％ ＦＢＳまたは無血清のいずれかのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で４／１６時間ペプチドで処理した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。乳酸デヒドロゲナーゼ放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して測定を行った。最大ＬＤＨ放出を、溶解性ペプチド（ｉＤＮＡ７９）によって誘導された放出されたＬＤＨの量と定義し、結果を正規化するために使用した。
ＨＣＴ１１６細胞を３８４ウェルプレートに８０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むマッコイ５Ａ培地で維持した。細胞を一晩インキュベートした後、細胞培地を除去し、ＦＢＳを含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を添加した。次いで、細胞を１０％ ＦＢＳまたは無血清のいずれかのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で４／１６時間ペプチドで処理した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。乳酸デヒドロゲナーゼ放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して測定を行った。最大ＬＤＨ放出を、溶解性ペプチド（ｉＤＮＡ７９）によって誘導された放出されたＬＤＨの量と定義し、結果を正規化するために使用した。
【0146】
テトラサイクリンβ－ラクタマーゼレポーター遺伝子アッセイ（カウンタースクリーニング）
Ｊｕｍｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）ＣＨＯ－Ｋ１ ＢＬＡ細胞に基づき、誘導可能なＣＭＶプロモーターの制御下で安定に組み込まれたβ－ラクタマーゼを含有する。細胞を３８４ウェルプレートに４０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞を２４時間インキュベートした後、細胞培地を除去し、１０％ ＦＢＳまたは０％ ＦＢＳのいずれかを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換した。次いで、液体ハンドラー、ＥＣＨＯ ５５５を使用してペプチドを各ウェルに分注し、４／１６時間インキュベートした。ＤＭＳＯの最終作業濃度は０．５％であった。β－ラクタマーゼ活性を、ＴｏｘＢＬＡｚｅｒ Ｄｕａｌ Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。測定は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して実行した。カウンタースクリーニング活性を、テトラサイクリンによって誘導されたβ－ラクタマーゼ活性の量と定義した。
Ｊｕｍｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）ＣＨＯ－Ｋ１ ＢＬＡ細胞に基づき、誘導可能なＣＭＶプロモーターの制御下で安定に組み込まれたβ－ラクタマーゼを含有する。細胞を３８４ウェルプレートに４０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ブラストサイジンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞を２４時間インキュベートした後、細胞培地を除去し、１０％ ＦＢＳまたは０％ ＦＢＳのいずれかを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換した。次いで、液体ハンドラー、ＥＣＨＯ ５５５を使用してペプチドを各ウェルに分注し、４／１６時間インキュベートした。ＤＭＳＯの最終作業濃度は０．５％であった。β－ラクタマーゼ活性を、ＴｏｘＢＬＡｚｅｒ Ｄｕａｌ Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用して検出した。測定は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して実行した。カウンタースクリーニング活性を、テトラサイクリンによって誘導されたβ－ラクタマーゼ活性の量と定義した。
【0147】
ＨＣＴ－１１６ウエスタンブロット分析
化合物ストックおよび作業溶液の調製：化合物の１０ｍＭまたは１ｍＭストック溶液を１００％ ＤＭＳＯ中で調製した。次いで、各化合物を１００％ ＤＭＳＯで段階希釈し、ＨＰＬＣグレードの滅菌水でさらに１０倍希釈して、各化合物の１０％ ＤＭＳＯ／水中の１０倍作動溶液を調製した。関連するアッセイで使用される必要な体積に応じて、化合物を添加して、関連する図に示すような最終濃度を１％ ｖ／ｖの残留ＤＭＳＯ濃度で得た。
化合物ストックおよび作業溶液の調製：化合物の１０ｍＭまたは１ｍＭストック溶液を１００％ ＤＭＳＯ中で調製した。次いで、各化合物を１００％ ＤＭＳＯで段階希釈し、ＨＰＬＣグレードの滅菌水でさらに１０倍希釈して、各化合物の１０％ ＤＭＳＯ／水中の１０倍作動溶液を調製した。関連するアッセイで使用される必要な体積に応じて、化合物を添加して、関連する図に示すような最終濃度を１％ ｖ／ｖの残留ＤＭＳＯ濃度で得た。
【0148】
ＨＣＴ１１６細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ細胞培地中で培養した。すべての細胞株を、５％ ＣＯ２雰囲気の３７℃加湿インキュベータ内で維持した。ＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルプレートに６０，０００細胞／ウェルの細胞密度で播種し、一晩インキュベートした。さらに細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ細胞培地で維持した。次いで、細胞培地を除去し、２％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ細胞培地中に示される濃度で様々な化合物／ビヒクル対照を含有する細胞培地と交換した。記載されたインキュベーション時間（４または２４時間）の後、細胞をＰＢＳですすぎ、次いで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給された１００μｌの１×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（ＮＰ０００８）中で回収した。次いで、試料を超音波処理し、９０℃に５分間加熱し、１０秒間２回超音波処理し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。試料を、メーカーのプロトコルに従ってトリス－グリシン４～２０％勾配ゲル（ＢＩＯＲＡＤ）で分離した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏシステム（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して、Ｉｍｍｕｎｏ－ｂｌｏｔ ＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でウエスタンブロット転写を行った。次いで、アクチン（ＡＣ－１５、Ｓｉｇｍａ）に対する抗体をローディングコントロールとして、ｐ２１（１１８マウスモノクローナル）、ＭＤＭ２（２Ａ９マウスモノクローナル抗体）およびｐ５３（ＤＯ－１マウスモノクローナル抗体）を用いて、ウエスタンブロット染色を行った。
【0149】
［実施例］
［実施例１］
Ｃ末端伸長を有するアジドＡＴＳＰ－７０４１大員環の調製
国際公開第２０２０１１２８６８Ａ号は、Ｃ末端尾部にいくつかのアラニン残基（本明細書ではポリアラニン尾部として記載される）が付加された一連のＡＴＳＰ－７０４１ペプチド類似体を記載している。先に、Ｓ１２Ａ置換を有するアジド－ＡＴＳＰ－７０４１ペプチドが作製され、Ｓ５ステープル位置までの三重Ａｌａ配列（３ｘＡ）Ｃ末端をもたらした。このペプチド（基準大員環１）は、ｐ５３細胞アッセイにおいて３３９ｎＭ（０％血清、４時間）および８４７ｎＭ（１０％血清、１６時間）の活性を有していた（表３）。Ｃ末端を３つのさらなるＡｌａ残基で伸長させて６×Ａ尾部大員環２を得ると、細胞活性は、０％血清で４時間、および１０％血清で１６時間の両方において約３．５倍改善された。５×Ａ－ｄＡ尾部を含有する大員環３も作製され、それは細胞アッセイにおいて大員環２と同様に挙動し、溶解性は基準大員環１と比較して改善された（表３および４）。
［実施例１］
Ｃ末端伸長を有するアジドＡＴＳＰ－７０４１大員環の調製
国際公開第２０２０１１２８６８Ａ号は、Ｃ末端尾部にいくつかのアラニン残基（本明細書ではポリアラニン尾部として記載される）が付加された一連のＡＴＳＰ－７０４１ペプチド類似体を記載している。先に、Ｓ１２Ａ置換を有するアジド－ＡＴＳＰ－７０４１ペプチドが作製され、Ｓ５ステープル位置までの三重Ａｌａ配列（３ｘＡ）Ｃ末端をもたらした。このペプチド（基準大員環１）は、ｐ５３細胞アッセイにおいて３３９ｎＭ（０％血清、４時間）および８４７ｎＭ（１０％血清、１６時間）の活性を有していた（表３）。Ｃ末端を３つのさらなるＡｌａ残基で伸長させて６×Ａ尾部大員環２を得ると、細胞活性は、０％血清で４時間、および１０％血清で１６時間の両方において約３．５倍改善された。５×Ａ－ｄＡ尾部を含有する大員環３も作製され、それは細胞アッセイにおいて大員環２と同様に挙動し、溶解性は基準大員環１と比較して改善された（表３および４）。
【0150】
［実施例２］
Ｃ末端尾部の修飾は０％血清における細胞取り込みを改善する
Ｃ末端尾部は、Ｃ末端尾部配列を最適化することによって細胞効力をさらに増強する機会を提供する。ヘリカルホイール（図２）を調べると、位置１４および／または１７における無極性残基の配置がＭＤＭ２結合を増強し得ることが明らかになった。分子モデリングは、これらの位置に１つ以上のフェニルアラニンを配置すると、ＭＤＭ２の結合および他の特性が改善され得ることを示唆した（図３）。
Ｃ末端尾部の修飾は０％血清における細胞取り込みを改善する
Ｃ末端尾部は、Ｃ末端尾部配列を最適化することによって細胞効力をさらに増強する機会を提供する。ヘリカルホイール（図２）を調べると、位置１４および／または１７における無極性残基の配置がＭＤＭ２結合を増強し得ることが明らかになった。分子モデリングは、これらの位置に１つ以上のフェニルアラニンを配置すると、ＭＤＭ２の結合および他の特性が改善され得ることを示唆した（図３）。
【0151】
アルファメチル化の使用を含む、１つ以上のＰｈｅ残基が位置１４および／または１７に配置された一連のペプチド（大員環４～８）を作製した（アミノ酸配列については表１を参照）。これらの位置における無極性残基の配置は、ＭＤＭ２結合をさらに増強した。そのような大員環はまた、０％ＦＢＳ（血清）、４時間アッセイにおいて、大員環２および３と比較して増強された、または同等の細胞活性を示した（例えば、大員環２の１４３ｎＭに対して大員環４の３６ｎＭ）。
【0152】
［実施例３］
位置１６に荷電残基を配置すると特性が改善される
一般に、大員環４～８は、それらのより高いＡｌｏｇＰ９８および／またはＨＰＬＣ ＬｏｇＤによって示されるように、疎水性の増加を示した（表３および４）。ここで、荷電残基を位置１６に配置すると、ＭＤＭ２結合を維持しながら溶解性および細胞効力がさらに改善されることが見出された。例えば、この位置にアルファメチルグルタミン酸を有する大員環９を作製し、それは、１６時間、１０％条件での細胞効力が大員環４と比較して改善されたことを示した（表３）。それはまた、大員環４の近い類似体である大員環５および７と比較して、１５３ｕＭの改善された溶解性を示した。大員環９はまた、大員環２と比較して、１６時間、１０％条件で改善された細胞効力を示した。したがって、架橋ペプチド模倣大員環の細胞活性および溶解性は、本明細書中に開示されるようなＣ末端尾部における修飾によって改善され得ることが示されている。
位置１６に荷電残基を配置すると特性が改善される
一般に、大員環４～８は、それらのより高いＡｌｏｇＰ９８および／またはＨＰＬＣ ＬｏｇＤによって示されるように、疎水性の増加を示した（表３および４）。ここで、荷電残基を位置１６に配置すると、ＭＤＭ２結合を維持しながら溶解性および細胞効力がさらに改善されることが見出された。例えば、この位置にアルファメチルグルタミン酸を有する大員環９を作製し、それは、１６時間、１０％条件での細胞効力が大員環４と比較して改善されたことを示した（表３）。それはまた、大員環４の近い類似体である大員環５および７と比較して、１５３ｕＭの改善された溶解性を示した。大員環９はまた、大員環２と比較して、１６時間、１０％条件で改善された細胞効力を示した。したがって、架橋ペプチド模倣大員環の細胞活性および溶解性は、本明細書中に開示されるようなＣ末端尾部における修飾によって改善され得ることが示されている。
【0153】
［実施例４］
尾部への両親媒性残基の導入は物理化学的特性を改善する
Ｃ末端尾部における両親媒性の導入は、溶解性および他の特性が改善された清浄な「薬物」様化合物をもたらし得ることが見出されている。例えば、グルタミン酸またはガンマ－カルボキシグルタミン酸を大員環２または３の尾部に離散的に導入して、大員環１０および１１を得た。位置１４にグルタミン酸を有する大員環１０は、１６時間、１０％血清において、大員環３と比較して改善された細胞活性を示した。分子モデリングは、位置１４のグルタミン酸がＭＤＭ２アルギニン、Ａｒｇ９７と係合し得ることを示唆している（図４）。位置１２にカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を有する大員環１１は、大員環２と比較して改善された結合、および５２７ｎＭで約２倍の細胞活性を１０％血清、１６時間で示した（表３）。大員環１０および１１は、どちらも優れた溶解性を示す（表４）。
尾部への両親媒性残基の導入は物理化学的特性を改善する
Ｃ末端尾部における両親媒性の導入は、溶解性および他の特性が改善された清浄な「薬物」様化合物をもたらし得ることが見出されている。例えば、グルタミン酸またはガンマ－カルボキシグルタミン酸を大員環２または３の尾部に離散的に導入して、大員環１０および１１を得た。位置１４にグルタミン酸を有する大員環１０は、１６時間、１０％血清において、大員環３と比較して改善された細胞活性を示した。分子モデリングは、位置１４のグルタミン酸がＭＤＭ２アルギニン、Ａｒｇ９７と係合し得ることを示唆している（図４）。位置１２にカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を有する大員環１１は、大員環２と比較して改善された結合、および５２７ｎＭで約２倍の細胞活性を１０％血清、１６時間で示した（表３）。大員環１０および１１は、どちらも優れた溶解性を示す（表４）。
【0154】
大員環１０および１１はまた、大員環２と組み合わせて細胞増殖アッセイにおいてプロファイリングされた（表５）。大員環１０は、ＨＴＣ１１６ ｐ５３陽性対照細胞株において、４２０ｎＭの大員環３と比較して、１８７ｎＭの約２倍の細胞効力の改善を示した。大員環１１は、大員環３の約２倍までの細胞活性を示した。
【0155】
さらに、大員環１０および１１の両方は、ｐ５３ ｎｕｌｌ陰性対照細胞株において、最高アッセイ濃度でいくらかの残存活性（５０ｕＭで２９％阻害）を示した大員環２と比較して、負担なく清浄であった（最大濃度で５０ｕＭを超えるＥＣ５０、－１８％阻害）。したがって、大員環１０および１１は、細胞アッセイおよび／またはカウンタースクリーニングアッセイにおいて改善された細胞活性を有する化合物を得るための、Ｃ末端尾部における様々な修飾の適用性を強調している。
【0156】
［実施例５］
アルケンステープルの代わりにビスアルキンを使用すると、細胞増殖アッセイにおける効力が改善した
ビス－アルキン置換およびポリアラニンＣ末端尾部を含む大員環１２を作製した。この大員環は、０％および１０％血清の両方において、大員環３と比較して同等の細胞活性（２倍以内）を示した（表３）。同等の溶解性も示した（表４）。最も著しくは、それは、細胞増殖ＨＴＣ１１６ ｐ５３陽性対照細胞株において、４２０ｎＭの大員環３と比較して、約３倍を超える１２４ｎＭまで細胞効力を改善した（表４）。それはまた、ｐ５３ ｎｕｌ陰性対照細胞株では全く負担なく清浄であった（最大濃度で５０ｕＭを超えるＥＣ５０および３％阻害）。
アルケンステープルの代わりにビスアルキンを使用すると、細胞増殖アッセイにおける効力が改善した
ビス－アルキン置換およびポリアラニンＣ末端尾部を含む大員環１２を作製した。この大員環は、０％および１０％血清の両方において、大員環３と比較して同等の細胞活性（２倍以内）を示した（表３）。同等の溶解性も示した（表４）。最も著しくは、それは、細胞増殖ＨＴＣ１１６ ｐ５３陽性対照細胞株において、４２０ｎＭの大員環３と比較して、約３倍を超える１２４ｎＭまで細胞効力を改善した（表４）。それはまた、ｐ５３ ｎｕｌ陰性対照細胞株では全く負担なく清浄であった（最大濃度で５０ｕＭを超えるＥＣ５０および３％阻害）。
【0157】
大員環４のＣ末端尾部に導入されたジアルキンモチーフは、０％血清、４時間で優れた細胞活性を示した。カウンタースクリーニングにおいて疎水性のバランスをとり、両親媒性および細胞活性プロファイルを改善するために、グルタミン酸も位置１２に導入した。得られた大員環１３は、０％血清、４時間で大員環４と同等の効力（３６ｎＭに対して５１ｎＭ）、ならびに１０％血清、１６時間で大員環４および２と比較して有意に改善された効力（２３７ｎＭおよび７４９ｎＭに対して１５３ｎＭ）を示した。大員環１３はまた、１６７ｕＭで優れた溶解性を示した。最も重要なことに、それは、細胞増殖ＨＴＣ１１６ ｐ５３陽性対照細胞株における細胞効力を、大員環４と比較して１５倍超（それぞれ７３ｎＭ対１２１５ｎＭ）、大員環２と比較して７倍超（それぞれ７３ｎＭ対５７０ｎＭ）改善した（表５）。
【0158】
したがって、本明細書に開示される大員環は、強力な細胞活性かつ清浄な化合物を提供するための様々な修飾の適用性を実証する。
本発明は、例示された実施形態を参照して本明細書に記載されているが、本発明はこれに限定されないことを理解されたい。当業者および本明細書の教示へのアクセスは、その範囲内の追加の修正および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【表3】
【表4】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】