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特表2024-544650ベータ－グルコシダーゼとその補因子を利用した二糖類の産生方法および産生された二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】ベータ－グルコシダーゼとその補因子を利用した二糖類の産生方法および産生された二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/42 20060101AFI20241126BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20241126BHJP
C12N 1/14 20060101ALI20241126BHJP
C12P 19/12 20060101ALI20241126BHJP
C12P 19/14 20060101ALI20241126BHJP
C13K 13/00 20060101ALI20241126BHJP
C07H 3/04 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20241126BHJP
C13K 7/00 20060101ALN20241126BHJP
【ＦＩ】
C12N9/42
C12N9/16 Z
C12N1/14 C
C12P19/12
C12P19/14 Z
C13K13/00
C07H3/04
C12N15/56 ZNA
C13K7/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532555
(86)(22)【出願日】2022-11-30
(85)【翻訳文提出日】2024-05-30
(86)【国際出願番号】 KR2022019160
(87)【国際公開番号】W WO2023101389
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】10-2021-0168329
(32)【優先日】2021-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0168330
(32)【優先日】2021-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507406611
【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】イ，スンキュン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ミンホ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジュン・ウォン
(72)【発明者】
【氏名】ホン，ヒョンピョ
(72)【発明者】
【氏名】キム，テクボム
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C057
【Ｆターム（参考）】
4B064AF03
4B064CA21
4B064CB07
4B064CD09
4B064CD10
4B064CE11
4B064DA20
4B065AA70X
4B065AC14
4B065AC15
4B065BB06
4B065BB16
4B065BC12
4B065BC13
4B065BC15
4B065CA31
4C057AA03
4C057BB03
(57)【要約】
本発明は、ベータ－グルコシダーゼとその補因子を利用した二糖類の産生方法、および産生された二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物に関し、具体的に、グルコース基質にベータ－グルコシダーゼとその補因子として二価金属イオンであるマンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）または銅イオン（Ｃｕ２＋）を添加する場合、二糖類の生成速度を高め、二糖類を高濃度で得ることができる。また、本発明の産生方法で製造された二糖類を高含有する組成物は、トリコデルマ属菌株の酵素産生を優秀に誘導する効果があるため、産生された二糖類を高濃度で活用した発酵工程を適用することでトリコデルマの酵素産生性向上を図ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたはその異性体を含む、組成物。
【請求項2】
前記１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたはその異性体は、（１Ｓ）－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたは１－エピ－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物は、トレハロース、イソマルトースゲンチオビオース、セロビオース、ソホロースおよびマルトースからなる群より選択されるいずれか一つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物は、微生物の酵素産生を誘導し、および/または微生物が産生する酵素の活性を増加させるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記微生物は、トリコデルマ属菌株である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記微生物は、トリコデルマ・リーセイである、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記酵素は、酸性セルラーゼ、キシラナーゼまたはフィターゼである、請求項４に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物は、単糖類含有量より二糖類含有量が高いものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物に含まれた二糖類含有量は、総組成物重量に対して３０重量％以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物に含まれた単糖類含有量は、総組成物重量に対して３０重量％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
１）グルコースをベータ－グルコシダーゼと接触させるステップ；および２）前記グルコースまたは前記ステップ１）の反応物に二価金属イオンを接触させるステップ；を含む、
微生物の酵素産生誘導用または微生物の酵素活性増加用組成物を産生する方法。
【請求項12】
前記ベータ－グルコシダーゼは、トリコデルマ属由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ベータ－グルコシダーゼは、トリコデルマ・リーセイ由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記二価金属イオンは、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）からなる群より選択された１種以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物は、トレハロース、イソマルトース、セロビオース、マルトース、ゲンチオビオース、ソホロース、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド、およびこれらの異性体、からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記微生物は、トリコデルマ属菌株である、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記方法は、二価カチオンが含まれたクロマトグラフィーを実施するステップをさらに含むものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
前記クロマトグラフィーは、擬似移動床クロマトグラフィーである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互引用］
本出願は、２０２１年１１月３０日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３２９号と２０２１年１１月３０日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３３０号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０２１年１１月３０日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３２９号と２０２１年１１月３０日付の韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３３０号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
本発明は、ベータ－グルコシダーゼとその補因子を利用した二糖類の産生方法および産生された二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物に関し、具体的には、ベータ－グルコシダーゼとその補因子として二価金属イオンを添加するステップにより、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）からゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）またはソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）の二糖類の生成速度を高め、これにより、二糖類を高濃度で得ることができる方法に関する。また、産生された二糖類を高含有するトリコデルマ属菌株の酵素産生の促進のための組成物および前記組成物を利用した酵素産生方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）は、２分子のＤ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ２－О－β結合をしている二糖類で、マルトース型二糖類の一種である。
【0004】
ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）は、β結合で連結されたＤ－グルコース２分子からなる二糖類で、アミグダロース（ａｍｙｇｄａｌｏｓｅ）ともいう。白色の結晶性固体であって水やメタノールに溶け、酸またはβ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を利用して加水分解すると、２分子のＤ－グルコースが生成される。
【0005】
ソホロースとゲンチオビオースのような二糖類は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の酵素産生誘導剤（ｉｎｄｕｃｅｒ）として知られている。
【0006】
二糖類を産生するための有用な方法の一つとして、酵素による逆加水分解反応を利用する方法がある。オリゴ糖合成のための方法に使用される代表的な酵素としてベータ－グルコシダーゼがある。ベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）は、二つのグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）あるいはグルコースと他の置換された分子との間のベータ－１，４－グルコシド結合（ｂｅｔａ－１，４－ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）を加水分解してグルコースを放出する酵素で、様々なベータＤ－グルコシド（ｂｅｔａ Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）系の基質に対する特異性が存在する一種のエキソセルラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ）である。しかし、酵素による逆加水分解反応は、平衡が加水分解方向に偏っているため、単糖類から二糖類への低い転換効率を有し、大規模産生が制限される問題点がある。
【0007】
多くの微生物が産生するセルラーゼは、誘導性酵素であり、セルロース、セロビオース、ラクトースまたはソホロースなどが良い誘導因子として報告されている（Ａｎｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ（２０１６）１５：１６４）。
【0008】
繊維素分解酵素が生合成される過程は、誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）過程、および分解代謝産物抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって調節されることが知られている。具体的に、ソホロース、ゲンチオビオースまたはラミナリビオースは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ Ｐ－２６菌株でセルラーゼ合成を誘導することが知られており（ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊａｎ．１９９２，ｐ．１０６－１１０）、トレハロースは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ ＣＦＲ－７０３菌株でセルラーゼ合成を誘導することが知られている（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（２００１）２４１－２４５）。これと共に、繊維素分解酵素の活性は、最終産物阻害（ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）によっても調節されるセルラーゼはセロビオースによって、そしてＴｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｆｕｓｃａ菌株とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ菌株の場合にはβ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは、ブドウ糖によってそれぞれ阻害される。このような複雑な調節作用の結果、合成される繊維素分解酵素は、微生物の種類と培養条件によってその合成程度と構成成分が非常に多様である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３２９号
【特許文献2】韓国特許出願第１０－２０２１－０１６８３３０号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ａｎｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ（２０１６）１５：１６４
【非特許文献2】ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊａｎ．１９９２，ｐ．１０６－１１０
【非特許文献3】Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（２００１）２４１－２４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはその異性体を含む組成物を提供することである。
【0012】
本発明の他の目的は、
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ；および
２）ステップ１の反応物に二価金属イオンを接触させるステップ；を含む微生物の酵素産生誘導用または微生物の酵素活性増加用組成物を産生する方法を提供することである。
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ；および
２）ステップ１の反応物に二価金属イオンを接触させるステップ；を含む微生物の酵素産生誘導用または微生物の酵素活性増加用組成物を産生する方法を提供することである。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）およびマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）の二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物を提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、前記二糖類を含むトリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物を利用して、トリコデルマ属菌株から酵素を産生する方法を提供することである。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、酵素産生を誘導するための、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）およびマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）の二糖類を高含有する組成物の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明で開示されるそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲内にある。また、下記記述された具体的な叙述によって本発明の範囲が制限されると見なされない。また、当該技術分野において通常の知識を有する者は、通常の実験だけを使用して、本発明に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、これらの等価物は、本発明に含まれることが意図される。
【0017】
本発明は、一様態として、
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ；および
２）グルコースまたはステップ１）の反応物に二価金属イオンを接触させるステップ；を含む微生物の酵素産生誘導用または微生物の酵素活性増加用組成物を産生する方法を提供する。
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ；および
２）グルコースまたはステップ１）の反応物に二価金属イオンを接触させるステップ；を含む微生物の酵素産生誘導用または微生物の酵素活性増加用組成物を産生する方法を提供する。
【0018】
ステップ１）の「グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）」は、液状グルコースまたはグルコース水溶液形態であってもよいが、これに限定されない。本発明のグルコースは、６５～７７％ｗ／ｗ、６７～７５％ｗ／ｗ、または６９～７３％ｗ／ｗの濃度であってもよい。
【0019】
ベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）は、トリコデルマ属由来であってもよい。具体的に、本発明のベータ－グルコシダーゼは、トリコデルマ・リーセイ由来であってもよい。より具体的に、本発明のベータ－グルコシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【0020】
微生物は、酵素を産生する微生物を意味し、微生物は、セルラーゼ、キシラナーゼまたはフィターゼ酵素を産生する微生物であってもよく、セルラーゼ、キシラナーゼおよびフィターゼ酵素を全て産生可能な微生物であってもよいが、これに制限されない。一具体例では、微生物は、トリコデルマ属菌株であり、より具体的にはトリコデルマ・リーセイ菌株であってもよい。
【0021】
ベータ－グルコシダーゼは、１，３００～２、０００Ｕ／ｍｌ、１，４００～１，９００Ｕ／ｍｌ、１，５００～１，８００Ｕ／ｍｌ、または１，５５０～１，７４０Ｕ／ｍｌであるが、これに限定されない。
【0022】
二価金属イオンは、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）からなる群より選択された１種以上であってもよく、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されない。
【0023】
ステップ２）の「接触させるステップ」は、本明細書で用語「静置させるステップ」または「反応させるステップ」と同様の意味で使用され得る。
【0024】
ステップ２）の「接触」は、２０～５０ｒｐｍ、２５～４５ｒｐｍ、または２８～４２ｒｐｍで行うものであってもよいが、これに限定されない。
【0025】
ステップ２）の「接触」は、ｐＨ３．０～７．０、ｐＨ３．５～６．５、ｐＨ４．０～６．０、またはｐＨ４．５～５．５で行うものあってもよいが、これに限定されない。
【0026】
ステップ２）の「接触」は、５０℃～７０℃、５５℃～６５℃、または５７℃～６３℃で行うものであってもよいが、これに限定されない。
【0027】
ステップ２）の「接触」は、５日以上行うものであってもよく、６日以上行うものであってもよく、７日以上行うものであってもよく、５日～２２日間行うものであってもよく、または６日～２１日間行うものであってもよいが、これに限定されない。
【0028】
産生された組成物は、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、およびこれらの異性体、からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【0029】
産生された組成物は、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）およびソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【0030】
産生された組成物は、トリコデルマ属菌株の酵素産生または産生された酵素の発酵活性を優秀に誘導する効果がある。
【0031】
また、本発明の組成物を産生する方法は、二価カチオンを含むクロマトグラフィーを実施するステップをさらに含むことができる。
【0032】
本発明のクロマトグラフィーは、擬似移動床（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ；ＳＭＢ）クロマトグラフィーであってもよい。
【0033】
本発明のクロマトグラフィーで二価カチオンは、カチオン交換樹脂が充填されたカラム形態で含むものであってもよい。
【0034】
本発明のクロマトグラフィーで二価カチオンは、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンのいずれか一つ以上であってもよい。
【0035】
本発明の擬似移動床クロマトグラフィーは、８個以上のカラムを含むものであってもよい。
【0036】
本発明の擬似移動床クロマトグラフィーは、５０℃～７０℃の水で溶離を実施するものであってもよい。具体的に、本発明の溶離は、５５℃～６５℃または５８℃～６２℃の水で実施することができる。
【0037】
他の様態として、本発明は、下記化学式１の構造を有する（１Ｓ）－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（（１Ｓ）－１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を提供する。
【0038】
【化1】
【0039】
本発明は他の様態として、下記化学式２の構造を有する１－エピ－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｅｐｉ－１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を提供する。
【0040】
【化2】
【0041】
本発明はさらに他の様態として、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはその異性体を含む組成物を提供する。
【0042】
組成物は、微生物の酵素産生を誘導し、および/または微生物が産生する酵素活性を増加させるものであってもよい。
【0043】
具体的に、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたはその異性体は、（１Ｓ）－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたは１－エピ－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドであってもよい。
【0044】
本発明は一様態として、二糖類を高含有する酵素産生の誘導のための組成物を提供する。
【0045】
二糖類は、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）およびその異性体からなる群より選択されるいずれか一つ以上であってもよい。
【0046】
本発明は、一様態として、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）およびマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を含む微生物の酵素産生の誘導のための組成物を提供する。
【0047】
本明細書において、「酵素産生の誘導」は、微生物から産生される酵素の量を誘導することを意味し、「酵素産生の誘導」は、産生された酵素の発酵活性を測定して確認することができる。
【0048】
微生物は、トリコデルマ属菌株であってもよく、トリコデルマ・リーセイ菌株であってもよく、より具体的に、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株であってもよいが、これに制限されない。
【0049】
酵素は、トリコデルマ属菌株が産生する酵素であってもよく、トリコデルマ・リーセイ菌株が産生する酵素であってもよく、より具体的に、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株が産生する酵素であってもよいが、これに制限されない。
【0050】
酵素は、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）またはフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）であってもよく、好ましくはキシラナーゼであってもよい。
【0051】
トリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物は、１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはその異性体をさらに含むことができる。
【0052】
１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたはその異性体は、（１Ｓ）－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドまたは１－エピ－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシドであってもよい。
【0053】
１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはその異性体は、
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ、および
２）グルコースまたはステップ１の反応物と二価金属イオンと接触させるステップ；を含む二糖類を産生する方法で製造されたものであってもよい。
１）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）をベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と接触させるステップ、および
２）グルコースまたはステップ１の反応物と二価金属イオンと接触させるステップ；を含む二糖類を産生する方法で製造されたものであってもよい。
【0054】
組成物は、単糖類含有量が低く、二糖類含有量が高いものであってもよい。
【0055】
組成物は、組成物に含まれた単糖類含有量よりも二糖類含有量が高いものであってもよく、二糖類含有量の増加は、擬似移動床（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ；ＳＭＢ）クロマトグラフィーによって達成されるものであってもよい。
【0056】
組成物に含まれた単糖類含有量は、総組成物重量に対して、４５重量％以下、４０重量％以下、３５重量％以下、３０重量％以下、２０重量％～４５重量％、２５重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２５重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、２５重量％～３５重量％、２０重量％～３０重量％、または２５重量％～３０重量％であってもよい。
【0057】
組成物に含まれた二糖類含有量は、総組成物重量に対して、２７重量％以上、３０重量％以上、３３重量％以上、３６重量％以上、３９重量％以上、２７重量％～５０重量％、３０重量％～５０重量％、３３重量％～５０重量％、３６重量％～５０重量％、３９重量％～５０重量％、２７重量％～４５重量％、３０重量％～４５重量％、３３重量％～４５重量％、３６重量％～４５重量％、３９重量％～４５重量％、２７重量％～４２重量％、３０重量％～４２重量％、３３重量％～４２重量％、３６重量％～４２重量％、３９重量％～４２重量％、２７重量％～４０重量％、３０重量％～４０重量％、３３重量％～４０重量％、３６重量％～４０重量％、または３９重量％～４０重量％であってもよい。
【0058】
組成物に含まれたトレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、２．５重量％以上、３重量％以上、４重量％以上、２．５重量％～６重量％、３重量％～６重量％、４重量％～６重量％、２．５重量％～５重量％、３重量％～５重量％、または４重量％～５重量％であってもよい。
【0059】
組成物に含まれたイソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、４．５重量％以上、５重量％以上、４．５重量％～７重量％、５重量％～７重量％、４．５重量％～６重量％、または５重量％～６重量％であってもよい。
【0060】
組成物に含まれたゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、１５重量％以上、１７重量％以上、１９重量％以上、２１重量％以上、１５重量％～２８重量％、１７重量％～２８重量％、１９重量％～２８重量％、２１重量％～２８重量％、１５重量％～２５重量％、１７重量％～２５重量％、１９重量％～２５重量％、２１重量％～２５重量％、１５重量％～２３重量％、１７重量％～２３重量％、１９重量％～２３重量％、または２１重量％～２３重量％であってもよい。
【0061】
組成物に含まれたセロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、１．９重量％以上、２．０重量％以上、２．１重量％以上、２．２重量％以上、１．９重量％～３．０重量％、２．０重量％～３．０重量％、２．１重量％～３．０重量％、２．２重量％～３．０重量％、１．９重量％～２．７重量％、２．０重量％～２．７重量％、２．１重量％～２．７重量％、２．２重量％～２．７重量％、１．９重量％～２．５重量％、２．０重量％～２．５重量％、２．１重量％～２．５重量％、または２．２重量％～２．５重量％であってもよい。
【0062】
組成物に含まれたソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、１．４重量％以上、１．５重量％以上、１．６重量％以上、１．７重量％以上、１．４重量％～３．０重量％、１．５重量％～３．０重量％、１．６重量％～３．０重量％、１．７重量％～３．０重量％、１．４重量％～２．５重量％、１．５重量％～２．５重量％、１．６重量％～２．５重量％、１．７重量％～２．５重量％、１．４重量％～２．０重量％、１．５重量％～２．０重量％、１．６重量％～２．０重量％、または１．７重量％～２．０重量％であってもよい。
【0063】
組成物に含まれているマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）の含有量は、総組成物重量に対して、２．６重量％以上、３．０重量％以上、３．４重量％以上、３．７重量％以上、２．６重量％～５．０重量％、３．０重量％～５．０重量％、３．４重量％～５．０重量％、３．７重量％～５．０重量％、２．６重量％～４．６重量％、３．０重量％～４．６重量％、３．４重量％～４．６重量％、３．７重量％～４．６重量％、２．６重量％～４．２重量％、３．０重量％～４．２重量％、３．４重量％～４．２重量％、３．７重量％～４．２重量％、２．６重量％～３．９重量％、３．０重量％～３．９重量％、３．４重量％～３．９重量％、または３．７重量％～３．９重量％であってもよい。
【0064】
組成物はオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）をさらに含むことができる。
【0065】
組成物に含まれたオリゴマー含有量は、総組成物含有量に対して、２９重量％～３５重量％、２９重量％～３４重量％、２９重量％～３３重量％、３０重量％～３５重量％、３０重量％～３４重量％、３０重量％～３３重量％、３１重量％～３５重量％、３１重量％～３４重量％、３２重量％～３５重量％、または３２重量％～３４重量％であってもよいが、これに制限されない。
【0066】
本明細書の一実施例では、高い単糖類含有量と低い二糖類含有量を有する組成物（ＴＧＳ）に比べて低い単糖類含有量と高い二糖類含有量を有する組成物（ＳＭＢ分離液）が、優れた酵素発酵活性を示すことを確認した。したがって、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）およびマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を高含有する組成物は、微生物の酵素産生の誘導用途に活用できる。
【発明の効果】
【0067】
本発明は、ベータ－グルコシダーゼとその補因子とを利用した二糖類の産生方法、および産生された二糖類を含む、トリコデルマ属菌株の酵素産生の誘導のための組成物に関し、具体的にグルコース基質にベータ－グルコシダーゼとその補因子、例えば二価金属イオンのマンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）または銅イオン（Ｃｕ２＋）等、を添加する場合、二糖類の生成速度を高め、二糖類を高濃度で得ることができる。また、本発明の産生方法で産生された二糖類を高含有する組成物は、トリコデルマ属菌株の酵素産生を誘導する優秀な効果があるため、産生された二糖類を高濃度で活用した発酵工程を適用することで、トリコデルマの酵素産生性の向上を図ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0068】
以下、本発明を実施例を通してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、一つ以上の具体的な例を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。
【0069】
実施例１．二糖類組成物の製造
純度９５％以上のグルコース粉末（含水結晶ブドウ糖、ＤＡＥＪＵＮＧ ＣＨＥＭＩＣＡＬ＆ＭＥＴＡＬＳ）をスチーム（ｓｔｅａｍ）を利用して溶解し、７１％ｗ／ｗ濃度のグルコース溶液４０ｋｇを製造した。製造されたグルコース溶液にβ－グルコシダーゼ（配列番号１）を１，６５０Ｕ／ｍｌ濃度で０．３ｋｇを添加し、６０℃、７日～２１日間静置させて二糖類が含まれている組成物（Ｔｒｅａｔｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｙｒｕｐ、ＴＧＳ）を製造した。
純度９５％以上のグルコース粉末（含水結晶ブドウ糖、ＤＡＥＪＵＮＧ ＣＨＥＭＩＣＡＬ＆ＭＥＴＡＬＳ）をスチーム（ｓｔｅａｍ）を利用して溶解し、７１％ｗ／ｗ濃度のグルコース溶液４０ｋｇを製造した。製造されたグルコース溶液にβ－グルコシダーゼ（配列番号１）を１，６５０Ｕ／ｍｌ濃度で０．３ｋｇを添加し、６０℃、７日～２１日間静置させて二糖類が含まれている組成物（Ｔｒｅａｔｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｙｒｕｐ、ＴＧＳ）を製造した。
【0070】
実施例２．二価金属カチオン添加を利用した二糖類組成物の製造
実施例１のグルコース溶液にβ－グルコシダーゼ（実施例１と同じ）を１，６５０Ｕ／ｍｌ濃度で０．３ｋｇを添加し、さらに２価イオン［マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）それぞれ］を１ｍＭ添加し、６０℃、７日～２１日間静置させて二糖類が含まれている組成物を製造した。
実施例１のグルコース溶液にβ－グルコシダーゼ（実施例１と同じ）を１，６５０Ｕ／ｍｌ濃度で０．３ｋｇを添加し、さらに２価イオン［マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）それぞれ］を１ｍＭ添加し、６０℃、７日～２１日間静置させて二糖類が含まれている組成物を製造した。
【0071】
実施例３．二糖類組成物に含まれた二糖類濃度および二価金属カチオン添加による二糖類増減率の増加確認
実施例１および２で製造された組成物において、二糖類であるトレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）およびソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）の生成濃度（ｇ／Ｌ）および増減率（％）を測定し、下記の表１および表２に示した。生成濃度は、電気化学検出器およびＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡＩカラムが装着されたＢｉｏ－ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－３０００，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して分析した。
実施例１および２で製造された組成物において、二糖類であるトレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）およびソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）の生成濃度（ｇ／Ｌ）および増減率（％）を測定し、下記の表１および表２に示した。生成濃度は、電気化学検出器およびＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡＩカラムが装着されたＢｉｏ－ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－３０００，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して分析した。
【0072】
【表1】
【0073】
【表2】
【0074】
実施例４．ＳＭＢクロマトグラフィーを活用した高純度多糖類の分離
実施例２で製造した組成物から単糖類を除去するために、擬似移動床（ＳＭＢ：Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーを利用した。ＳＭＢクロマトグラフィーは、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ－ｂｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｓｅｐ、Ｆｒａｎｃｅ）装備を使用し、装備は、連続的に接続された８個のカラム（各カラムの高さは９５ｃｍ、直径は２．５ｃｍ）、供給物（ｆｅｅｄ）ポンプ、再循環ポンプ、溶離液ポンプ、熱交換器、流量制御のためのバルブを含む。ＳＭＢクロマトグラフィー運転条件は、下記表３に示し、ＳＭＢクロマトグラフィーによる分離実験結果を表４に示した。回収率測定方法は、混合物（ＴＧＳ）に注入される二糖類および三糖類の量と、ラフィネートの二糖類および三糖類の量とをＳＭＢクロマトグラフィーを用いて比較して、下記計算式を利用して回収率を計算した。
実施例２で製造した組成物から単糖類を除去するために、擬似移動床（ＳＭＢ：Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーを利用した。ＳＭＢクロマトグラフィーは、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ－ｂｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｓｅｐ、Ｆｒａｎｃｅ）装備を使用し、装備は、連続的に接続された８個のカラム（各カラムの高さは９５ｃｍ、直径は２．５ｃｍ）、供給物（ｆｅｅｄ）ポンプ、再循環ポンプ、溶離液ポンプ、熱交換器、流量制御のためのバルブを含む。ＳＭＢクロマトグラフィー運転条件は、下記表３に示し、ＳＭＢクロマトグラフィーによる分離実験結果を表４に示した。回収率測定方法は、混合物（ＴＧＳ）に注入される二糖類および三糖類の量と、ラフィネートの二糖類および三糖類の量とをＳＭＢクロマトグラフィーを用いて比較して、下記計算式を利用して回収率を計算した。
【0075】
回収率（％）＝ラフィネート（糖含有量）／供給物（糖含有量）×１００
＊糖含有量＝二糖類および多糖類の総量
＊糖含有量＝二糖類および多糖類の総量
【0076】
【表3】
【0077】
【表4】
【0078】
ＳＭＢクロマトグラフィーによる分離実験結果、表４に示したように、カルシウムイオンを使用したラフィネート分画物中の二糖類および三糖類の純度は８１～８９％、回収率は８９％レベルであることを確認した。
【0079】
実施例５．製造された二糖類成分のＮＭＲ分析
実施例２で製造された組成物に対するＮＭＲ分析のために、アセチル化（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）を行った。試薬（Ｒｅａｇｅｎｔｓ）は、酢酸無水物（Ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（ｅｘｔｒａ ｐｕｒｅ、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、塩化亜鉛（Ｚｉｎｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｋａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用し、アセチル化試料の分離および分析のための設備条件は下記表５に示した。
実施例２で製造された組成物に対するＮＭＲ分析のために、アセチル化（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）を行った。試薬（Ｒｅａｇｅｎｔｓ）は、酢酸無水物（Ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（ｅｘｔｒａ ｐｕｒｅ、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、塩化亜鉛（Ｚｉｎｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｋａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用し、アセチル化試料の分離および分析のための設備条件は下記表５に示した。
【0080】
【表5】
【0081】
その結果、分析試料内で、従来知られた糖であるトレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、イソマルトース（ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）、ゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、ソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）およびマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を確認した。また、分析試料内に新規な糖である（１Ｓ）－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（（１Ｓ）－１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）または１－エピ－１－ヒドロキシグルシトール－Ｄ－グルコピラノシド（１－ｅｐｉ－１－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）が存在することを確認した。
【0082】
実施例６．グルコース溶液とグルコース溶液で二糖類が濃縮されたＳＭＢ分離液の糖含有量分析
実施例２で製造したＴＧＳとそのＳＭＢ分離液の糖含有量を分析するために、下記のような実験を行った。ＳＭＢ分離液は、実施例２で製造した二糖類組成物をＳＭＢクロマトグラフィーを行って収得した実施例４のラフィネート分画物を収得したものである。
実施例２で製造したＴＧＳとそのＳＭＢ分離液の糖含有量を分析するために、下記のような実験を行った。ＳＭＢ分離液は、実施例２で製造した二糖類組成物をＳＭＢクロマトグラフィーを行って収得した実施例４のラフィネート分画物を収得したものである。
【0083】
具体的に、単糖類および二糖類濃度は、電気化学検出器およびＣａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡＩカラムが装着されたＢｉｏ－ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－３０００，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して糖含有量を分析し、下記表６に示した。カラムを３０℃で０．１Ｍ ＮａＯＨ（０～５分）で溶出した後、酢酸ナトリウム（０～０．２Ｍ）の直線勾配を１ｍＬ／分で５～３５分間溶出した。
【0084】
【表6】
【0085】
その結果、表６に示されたように、ＴＧＳの単糖類含有量は４５．０８％、ＳＭＢ分離液の単糖類含有量は２８．０４％であり、ＴＧＳに比べてＳＭＢ分離液の単糖類含有量が低いことが確認された。また、二糖類含有量の場合、ＴＧＳは２６．３６％、ＳＭＢ分離液は３９．３７％であり、ＴＧＳに比べてＳＭＢ分離液の二糖類含有量が高いことを確認した。
【0086】
実施例７．組成物に含まれた二糖類含有量による酵素産生の誘導効果の確認
ＳＭＢ分離液がトリコデルマ属菌株の酵素産生を誘導する効果が優れているか否かを確認するために、ＴＧＳとＳＭＢ分離液とを利用して酵素の発酵活性を下記のように測定した。
ＳＭＢ分離液がトリコデルマ属菌株の酵素産生を誘導する効果が優れているか否かを確認するために、ＴＧＳとＳＭＢ分離液とを利用して酵素の発酵活性を下記のように測定した。
【0087】
具体的に、ＴＧＳまたはＳＭＢ分離液をそれぞれ培地に添加し、トリコデルマ属菌株を菌体濃度１９０または２００ｇ／Ｌになるように希釈した。ｐＨ４で２８℃の条件下で１６８時間培養した後、酸性セルラーゼ酵素活性を測定して下記表７に示した。
【0088】
より具体的な酵素の発酵活性測定は、下記実施例７－１～７－３に示した。
【0089】
実施例７－１．酵素産生菌株の準備
酵素産生菌株としてそれぞれ酸性セルラーゼ活性（ａｃｉｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；４－β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ ４－ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＥＣ ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ；１，４－β－Ｄ－ｘｙｌａｎ ｘｙｌａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ＥＣ３．２．１．８）、およびフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ；３－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．８、６－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．２６、ａｎｄ５－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．７２）産生可能なトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株（ＡＴＣＣ１３６３１）を準備した。各菌株をジャガイモデクストロース寒天プレートで３０℃、５日間成長させて胞子を形成させた。胞子形成後、各菌株の胞子を滅菌ＮａＣｌ溶液（９ｇ／Ｌ）に再懸濁させ、３０％の滅菌グリセロールを添加した。この混合物を－８０℃で１．８ｍｌチューブに保管した。
酵素産生菌株としてそれぞれ酸性セルラーゼ活性（ａｃｉｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；４－β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ ４－ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＥＣ ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ；１，４－β－Ｄ－ｘｙｌａｎ ｘｙｌａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ＥＣ３．２．１．８）、およびフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ；３－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．８、６－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．２６、ａｎｄ５－ｐｈｙｔａｓｅｓ、ＥＣ３．１．３．７２）産生可能なトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株（ＡＴＣＣ１３６３１）を準備した。各菌株をジャガイモデクストロース寒天プレートで３０℃、５日間成長させて胞子を形成させた。胞子形成後、各菌株の胞子を滅菌ＮａＣｌ溶液（９ｇ／Ｌ）に再懸濁させ、３０％の滅菌グリセロールを添加した。この混合物を－８０℃で１．８ｍｌチューブに保管した。
【0090】
実施例７－２．酵素産生菌株の流加培養
流加培養を利用した実施例７－１の各酵素を産生するトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株の培養は、ＤＯを指標としてＤＯが上昇する時点に供給培地内の炭素源の供給速度を一時間当り５．０ｇ／Ｌと一定に供給した。供給培地の供給は、ペリスタティックポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｔｉｃ ｐｕｍｐ）を利用して行った。この時、発酵培地成分は、炭水化物２０．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム５．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０．０ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄１０．０ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト４．０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ソーダ２．０ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ ８０ １．０ｇ／Ｌで組成された。供給培地は、炭素源と酵母抽出物の重量比が１：０．０１である炭水化物６００．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物６．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．０ｇ／Ｌで組成された。培地に含まれた炭水化物は、各酵素の活性実験でそれぞれＴＧＳとＳＭＢ分離液を添加した。一方、発酵条件は、培養温度２８℃で維持しながらアンモニア水を利用してｐＨを４．０に維持した。攪拌速度は、ＤＯ（溶存酸素量）制限が発生しないように６００ｒｐｍに調節した。この時、種菌培養は、５００ｍｌ三角フラスコにある１５０ｍｌ培地に１ｍｌの凍結した胞子混合物を接種し、振とう機で２８℃および２００ｒｐｍで７２時間前培養し、培養額の１０％（ｖ／ｖ）を接種した。
流加培養を利用した実施例７－１の各酵素を産生するトリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ菌株の培養は、ＤＯを指標としてＤＯが上昇する時点に供給培地内の炭素源の供給速度を一時間当り５．０ｇ／Ｌと一定に供給した。供給培地の供給は、ペリスタティックポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｔｉｃ ｐｕｍｐ）を利用して行った。この時、発酵培地成分は、炭水化物２０．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム５．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０．０ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄１０．０ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト４．０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ソーダ２．０ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ ８０ １．０ｇ／Ｌで組成された。供給培地は、炭素源と酵母抽出物の重量比が１：０．０１である炭水化物６００．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物６．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．０ｇ／Ｌで組成された。培地に含まれた炭水化物は、各酵素の活性実験でそれぞれＴＧＳとＳＭＢ分離液を添加した。一方、発酵条件は、培養温度２８℃で維持しながらアンモニア水を利用してｐＨを４．０に維持した。攪拌速度は、ＤＯ（溶存酸素量）制限が発生しないように６００ｒｐｍに調節した。この時、種菌培養は、５００ｍｌ三角フラスコにある１５０ｍｌ培地に１ｍｌの凍結した胞子混合物を接種し、振とう機で２８℃および２００ｒｐｍで７２時間前培養し、培養額の１０％（ｖ／ｖ）を接種した。
【0091】
実施例７－３．酸性セルラーゼ活性分析
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離して、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当たり国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、標準分析条件下（５ｍｇ／ｍＬ ＣＭＣ、ｐＨ４．８、５０℃）で１分間１μｍｏｌのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離して、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当たり国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、標準分析条件下（５ｍｇ／ｍＬ ＣＭＣ、ｐＨ４．８、５０℃）で１分間１μｍｏｌのＤ－ｇｌｕｃｏｓｅを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
【0092】
セルラーゼは、セルロースを加水分解して、特定温度およびｐＨ条件で単糖類およびオリゴ糖を生成する。還元末端を有するオリゴ糖および還元基を有する単糖類は、高温の条件下でＤＮＳ試薬との色反応を経て、反応液の色の強度は、酵素加水分解によって生成された還元糖の量、および砂糖生成を減少させる量および反応に比例する。液体中のセルラーゼ活性は比例しており、セルラーゼ活性は、分光光度法により反応溶液の吸光度を測定することで計算することができる。
【0093】
【表7】
【0094】
その結果、表７に示されたように、ＴＧＳを添加した場合、酸性セルラーゼの平均活性は２８２２．５ＩＵ／ｍＬ、ＳＭＢ分離液を添加した場合、酸性セルラーゼの平均活性は３８９０ＩＵ／ｍＬであり、ＳＭＢ分離液を添加した場合、酸性セルラーゼの平均活性がさらに３７．８％増加することを確認した。
【0095】
実施例８．ＳＭＢ分離液の酵素種類別の酵素産生誘導効果確認
ＳＭＢ分離液がトリコデルマ属菌株の酵素産生を誘導する効果が、酵素の種類によって差があるかを確認するために、ＴＧＳとＳＭＢ分離液を利用して、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）とフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）の発酵活性を下記のように測定した。
ＳＭＢ分離液がトリコデルマ属菌株の酵素産生を誘導する効果が、酵素の種類によって差があるかを確認するために、ＴＧＳとＳＭＢ分離液を利用して、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）とフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）の発酵活性を下記のように測定した。
【0096】
具体的に、ＴＧＳまたはＳＭＢ分離液をそれぞれ培地に添加し、トリコデルマ属菌株を菌体濃度２４０または２５０ｇ／Ｌになるように希釈した。ｐＨ４で２８℃の条件で１６８時間培養した後、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）とフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）の酵素活性を測定して下記表８に示した。
【0097】
より具体的に、実施例７－１および７－２に記載された菌株準備過程と培養過程と同様の方法で測定し、各酵素活性の分析は、下記の実施例８－１および８－２に示した。
【0098】
実施例８－１．中性キシラナーゼ活性の分析
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離してＴ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は、酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当たり国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、標準分析条件（１％ ｘｙｌａｎ、ｐＨ６．５、５０℃）で１分間１μｍｏｌのＤ－ｘｙｌｏｓｅを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離してＴ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は、酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当たり国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、標準分析条件（１％ ｘｙｌａｎ、ｐＨ６．５、５０℃）で１分間１μｍｏｌのＤ－ｘｙｌｏｓｅを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
【0099】
特定の温度とｐＨ条件下でキシラナーゼは、キシランをオリゴ糖と単糖に分解する。末端が還元されたオリゴ糖と還元基を有する単糖類はＤＮＳ試薬と発色反応をする。反応溶液の色強度は、酵素加水分解によって生成された還元糖の量に比例し、生成された還元糖の量は、反応溶液内キシラナーゼの活性に比例するため、分光光度法でキシラナーゼの活性を計算することができる。
【0100】
実施例８－２．フィターゼ活性の分析
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離してＴ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は、酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当り国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、３７℃、ｐＨ＝５．５条件下でのフィターゼ活性単位である、１分間５．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でフィチン酸ナトリウム溶液で１分間１μｍｏｌの無機リンを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
実施例７－２で収得した発酵液を遠心分離してＴ．ｒｅｅｓｅｉ細胞およびその他固体物質を除去した。培養上澄み液は、酵素分析のために適切に希釈した。すべての酵素活性は、上澄み液ｍＬ当り国際単位（ＩＵ）を使用して特定活性として表示した。１ＩＵは、３７℃、ｐＨ＝５．５条件下でのフィターゼ活性単位である、１分間５．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でフィチン酸ナトリウム溶液で１分間１μｍｏｌの無機リンを遊離させるのに必要な酵素の量として定義した。
【0101】
特定温度およびｐＨ条件下でフィターゼは、基質であるフィチン酸ナトリウムを完全に加水分解して、オルトリン酸およびイノシトール誘導体を生成する。酸性溶液では、アンモニウムバナジウムモリブデートと黄色の化合物を形成することができ、これは４１５ｎｍの波長で比色で測定することができる。
【0102】
【表8】
【0103】
その結果、表８に示されたように、ＴＧＳを添加した場合、中性キシラナーゼの平均活性は１０５，３７６ＩＵ／ｍＬ、ＳＭＢ分離液を添加した場合、中性キシラナーゼの平均活性は１４４，７１６ＩＵ／ｍＬであり、ＳＭＢ分離液を添加した場合、中性キシラナーゼ発酵活性がさらに３７．３％増加することを確認した。また、ＴＧＳを添加した場合、フィターゼの平均活性は２５，３１２ＩＵ／ｍＬ、ＳＭＢ分離液を添加した場合、フィターゼの平均活性は２６，６６８ＩＵ／ｍＬであり、ＳＭＢ分離液を添加した場合、フィターゼ発酵活性がさらに５．４％増加したことを確認した。
【国際調査報告】