特表 2024-544662 外科用メッシュの露出を処置するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】外科用メッシュの露出を処置するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20241126BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

A61K35/12

A61P17/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024532717

(86)(22)【出願日】2022-11-30

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 US2022051424

(87)【国際公開番号】W WO2023102061

(87)【国際公開日】2023-06-08

(31)【優先権主張番号】63/284,987

(32)【優先日】2021-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501083115

【氏名又は名称】メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】アッタ ベーファー

(72)【発明者】

【氏名】ジョン エー．オッチノ

(72)【発明者】

【氏名】エマニュエル シー．トラブコ

【テーマコード（参考）】

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA14

4C087ZA89

(57)【要約】

対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法は、一般に、ＰＥＰを、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、露出した外科用メッシュの領域に隣接する組織に投与することを含む。別の態様では、対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法は、一般に、露出した外科用メッシュの領域を外科的に閉鎖することと、ＰＥＰを、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、外科的閉鎖に隣接する上皮に投与することと、を含む。いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量は、上皮の増殖を増加させて、露出した外科用メッシュの領域を減少させるのに、外科用メッシュを覆う上皮の厚さを増加させるのに、又は外科用メッシュを覆う上皮の血管新生を増加させるのに有効な量であり得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法であって、
ＰＥＰを、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、前記露出した外科用メッシュの領域に隣接する組織に投与することを含む、方法。

【請求項2】

対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法であって、
露出した外科用メッシュの領域を外科的に閉鎖することと、
ＰＥＰを、前記露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、前記外科的閉鎖に隣接する上皮に投与することと、を含む、方法。

【請求項3】

前記露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な前記量が、上皮の増殖を増加させて前記露出した外科用メッシュの領域を減少させるのに、前記外科用メッシュを覆う上皮の厚さを増加させるのに、又は前記外科用メッシュを覆う上皮の血管新生を増加させるのに有効な量を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＰＥＰが、１回投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＰＥＰが、２回以上投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＰＥＰが、２～４回の投与で提供される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＰＥＰが、投与間に約７日の間隔で投与される、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

ＰＥＰが、少なくとも１０^１２個のＰＥＰエキソソームを送達するのに有効な量で投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記外科用メッシュが、少なくとも１ｃｍ×１ｃｍのサイズである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記方法が、未処置のメッシュ露出と比較して、細胞増殖の増加、上皮の厚さの増加、血管新生の増加、又は離開の欠如によって測定される、メッシュ露出の解消をもたらす、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記方法が、未処置のメッシュ露出と比較して、組織顕微鏡法によって測定される瘢痕形成の減少をもたらす、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ＰＥＰを投与することが、前記処置された領域内の１つ以上の部位にＰＥＰを注射することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＰＥＰが、細胞外マトリックス構成成分を更に含む組成物において投与される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞外マトリックス構成成分が、コラーゲンを含む、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月０１日に出願された米国仮特許出願第６３／２８４，９８７号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府資金提供
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）傘下のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓによって授与されたＴＲ００２３７７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明について一定の権利を有する。

【発明の概要】

【0003】

本開示は、一態様において、対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法を記載する。一般に、本方法は、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、露出した外科用メッシュの領域に隣接する組織にＰＥＰを投与することを含む。

【0004】

別の態様では、本開示は、対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法を記載する。一般に、本方法は、露出した外科用メッシュの領域を外科的に閉鎖することと、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、外科的閉鎖に隣接する上皮にＰＥＰを投与することと、を含む。

【0005】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量は、上皮の増殖を増加させて、露出した外科用メッシュの領域を減少させるのに、外科用メッシュを覆う上皮の厚さを増加させるのに、又は外科用メッシュを覆う上皮の血管新生を増加させるのに有効な量であり得る。

【0006】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、ＰＥＰは、１回投与される。他の実施形態では、ＰＥＰは２回以上投与される。

【0007】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、ＰＥＰは、少なくとも１０^１２個のＰＥＰエキソソームを送達するのに有効な量で投与される。

【0008】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、外科用メッシュは、少なくとも１ｃｍ×１ｃｍのサイズである。

【0009】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、本方法は、未処置のメッシュの露出と比較して、細胞増殖の増加、上皮の厚さの増加、血管新生の増加、又は離開の欠如によって測定される、メッシュ露出の解消をもたらす。

【0010】

いずれかの態様の１つ以上の実施形態では、本方法は、未処置のメッシュの露出と比較して、組織顕微鏡検査によって測定される瘢痕形成の低減をもたらす。

【0011】

上の概要は、本発明の開示される各実施形態又は全ての実装形態を説明することを意図するものではない。以下の説明で実例となる実施形態をより具体的に例示する。本出願全体のいくつかの箇所において、実施例のリストを通してガイダンスを提供し、これらの実施例は様々に組み合わせて使用することができる。各例において、列挙されたリストは代表的な群としてのみ示され、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実験方法：モデルの作製及び介入である。（Ａ）メッシュ露出モデルの作製である。０日目：膣を剥皮させ、メッシュを移植する。全ての動物は、メッシュモデルを作製するために初回手術を受けた。計画されたメッシュインプラントサイズに従って膣を剥皮させた。メッシュを縫合糸で固定した。群１は、腹側膣及び吻側膣に移植された２つの３×３センチメートル（ｃｍ）メッシュを有していた。群２は、周方向に移植された異なるサイズの３つのメッシュ：１×２ｃｍ、２×２ｃｍ、及び３×３ｃｍを有していた。ＥｄＵを投与されたこの群の１匹の動物は、異なるサイズのメッシュではなく２つの３×３ｃｍインプラントを有していた。（Ｂ）７日目の介入：外科的閉鎖である。群１の４匹の動物は、２回目の手術を受けて、膣上皮を動員し、中断された様式で下にあるメッシュ上で膣組織を閉じた（左）。これらの動物の半分は、同時にＰＥＰ注射を受ける（群１Ｂ）。群２の３匹の動物は、ＰＥＰのみの注射を受けた（右；群２）。略語：ＰＥＰ、精製エキソソーム生成物。ＥｄＵ、２’－デオキシ－５－エチニルウリジン

【0013】

【図2】肉眼病変及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）である。（Ａ）最初の手術から４週間後の肉眼的膣－メッシュ複合体である。パネル１：野生型、器具を取り付けていないブタ膣。パネル２：群１Ａ、外科的閉鎖のみの群。パネル３：群１Ｂ、外科的閉鎖を伴うＰＥＰ注射。パネル４：群２、ＰＥＰ注射のみ。白い破線のボックスは、下にあるメッシュの領域を表す。描かれた全てのメッシュは３×３ｃｍである。（Ｂ）透過電子顕微鏡法である：野生型は、上皮レベルでの健康なブタ膣を表し（上部；１５００倍の倍率）、真皮のより深部に、基底膜のレベルに焦点を合わせた（中央及び下部；３，０００倍及び１２，０００倍）。外科的閉鎖のみを受けた群１Ａは、断続的に破壊された基底膜に隣接する細胞組織化の破壊を伴う扁平上皮細胞を有していた（中央パネル）。ＰＥＰのみによる処置を受けた群２は、正常な構造及び細胞接合部を有する上皮細胞を有しており、いくつかの炎症細胞が散在していた（右上部、３０００倍）。基底膜及び隣接する細胞組織化は保存されている（右、中央及び下部）。

【0014】

【図3】膣－メッシュ複合体の組織学的評価である。（Ａ）殺処分時に得られた外植片の代表的なマッソン・トリクローム染色である。（Ｂ）上皮マーカーサイトケラチン及び間質コラーゲンＩＩＩを示す代表的な免疫蛍光画像である。（Ｃ）上皮（サイトケラチン）及び下層の皮膚組織内の増殖している（Ｋｉ６７^＋）細胞を示す代表的な免疫蛍光画像である。

【0015】

【図4】膣－メッシュ複合体の組織学的評価である。（Ａ）マッソン・トリクローム染色から得られた上皮の厚さの定量化である。ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３。（Ｂ）上皮の長さ当たりの全増殖、上皮増殖及び非上皮増殖（Ｋｉ６７^＋）細胞の定量化である。（Ａ）及び（Ｂ）については、ｎ＝２（野生型、非手術膣組織）、ｎ＝２（外科的閉鎖のみ）、ｎ＝４（外科的閉鎖を伴うＰＥＰ）、Ａについてはｎ＝７及びＥについてはｎ＝５（ＰＥＰ注射のみ）。（Ｃ）ＥｄＵは、上皮及び下層組織にわたる細胞中に存在し、４週間の治癒期間中のデノボ再生を確認している。値は平均±標準誤差として表した。

【0016】

【図5】膣－メッシュ複合体の細胞分析である。（Ａ）Ｅ－カドヘリン^＋（Ｅ－Ｃａｄ）上皮に隣接するＣＤ３^＋Ｔ細胞の代表的な免疫蛍光画像である。（Ｂ）血管新生（平滑筋アクチンに囲まれたＣＤ３１^＋内皮細胞（ＳＭＡ^＋平滑筋細胞））、並びに筋線維芽細胞（血管外ＳＭＡ^＋領域）の存在を示す代表的な免疫蛍光画像である。

【0017】

【図6】膣－メッシュ複合体の細胞分析である。（Ａ）高倍率視野当たりの相対ＣＤ３^＋の分率によるＴ細胞存在量の定量化である。（Ｂ）血管新生の定量化（ｍｍ^２当たりのＣＤ３１^＋管腔）である。ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０３、＊野生型に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）膣メッシュ外植片内の平滑筋沈着の定量化（高倍率視野当たりのＳＭＡ^＋面積分率）である。（Ｄ）強度相関指数によって測定されるＣＤ３１及びＳＭＡの共分布の定量化である。野生型、非手術膣組織：ｎ＝２；外科的閉鎖のみ：ｎ＝２；外科的閉鎖を伴うＰＥＰ：ｎ＝４；ＰＥＰ注射のみ：Ａ、Ｃ、及びＤについてｎ＝５；Ｂについてｎ＝７。

【0018】

【図7】研究フロー図である。（Ａ）メッシュ露出モデルを作製するために、３ｃｍ×３ｃｍの面積の上皮及び線維筋性組織を剥皮させ、正方形のポリプロピレンメッシュを固定した。（Ｂ）動物は急性又は亜急性アームのいずれかに入り、そこで１週間（急性）又は８週間（慢性）の治癒を受けた。この期間に続いて、動物は、ＰＥＰの１回の注射を１回（急性－単回ＰＥＰ、亜急性－単回ＰＥＰ）又は週１回４週間（急性－週１回ＰＥＰ）受けた。殺処分は、ＰＥＰの初回注射の４週間後に行った。略語：ＰＥＰ、精製エキソソーム生成物。

【0019】

【図8】メッシュ露出に対するＰＥＰ処置後の上皮再生である。（Ａ）外植されたメッシュ－膣複合体の代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）画像である。＃は、厚さ８０μｍのメッシュ繊維によって形成された孔を示す。急性単一群における断面画像は、２つの結合繊維、したがってより大きい直径の孔を示す。（Ｂ）外植メッシュ当たり４±１．４ｃｍの上皮にわたって測定された、様々なＰＥＰ処置群にわたる再生膣上皮の平均厚さである。ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２。（Ｃ）細胞再生のマーカーとしてＥｄＵ（赤色）で標識された膣上皮（サイトケラチン、緑色）の代表的な免疫蛍光画像である。（Ｄ）メッシュ当たり１．６±０．３ｃｍの上皮にわたって測定された、全増殖、上皮増殖、及び非上皮増殖細胞密度（面積当たりのＥｄＵ＋細胞）の定量化である。全増殖についてのＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０４９）、上皮増殖についてのＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０４６）、非上皮についてのＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０４３）。Ｂ／Ｄについては、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２（急性－単回ＰＥＰ）、ｎ＝４（急性－週１回ＰＥＰ）、及びｎ＝６（亜急性－単回ＰＥＰ）。データは平均値±ＳＥＭとして報告した。

【0020】

【図9】メッシュ露出に対する様々なＰＥＰ処置後の再生組織の血管新生である。（Ａ）ＥｄＵ（白色）が再生細胞をマーキングしている、上皮下血管（ＣＤ３１、赤色）の代表的な免疫蛍光画像である。（Ｂ）上皮下の面積当たりのＣＤ３１^＋管腔として報告される毛細血管密度の定量化（メッシュ当たり８．５±１．２ｍｍ^２）である。血管についてのＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．００６９）、ＥｄＵ^＋血管についてのＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０２２）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝２（急性－単回ＰＥＰ）、ｎ＝４（急性－週１回ＰＥＰ）、及びｎ＝６（亜急性－単回ＰＥＰ）；データは平均値±ＳＥＭとして報告した。

【発明を実施するための形態】

【0021】

ポリプロピレンメッシュの外科的移植は、例えばストレス性尿失禁又は骨盤臓器脱を経験している女性に対して広く受け入れられており、耐久性のある処置である。これらの手技は、行動的／非外科的手段が症状の除去に成功しない場合に行われることが多い。メッシュの移植は有効な処置であるが、女性の中には、時間が経つにつれてメッシュが露出することを経験する者もいる。メッシュの露出は、縫合線又はインプラントを覆う任意の領域に沿って生じ得る。これは、切開中の術中血行遮断と術後の創傷治癒の不良との組み合わせに起因して起こることが疑われている。埋め込まれたメッシュの体積、栄養状態、閉経状態、並びに糖尿病、免疫抑制、及び喫煙などの医学的共存症を含む多くの要因が、女性のメッシュ露出のリスクに寄与し得る。メッシュの持続的な露出は、性交疼痛、心理的苦痛、分泌物異常を引き起こし、女性を膣感染症に罹りやすくする可能性がある。膣エストロゲンは、露出に対する非外科的治療としてしばしば使用されるが、有効性に関する高レベルのデータは存在せず、多くの患者は、上皮再閉鎖又はメッシュ切除のための再手術を必要とし続ける。再手術には多大な費用がかかり、切除は症状の再発につながる可能性がある。

【0022】

メッシュ露出を処置する文脈で本明細書に記載されるが、本明細書に記載される組成物及び方法は、例えば、外科用メッシュの初期埋め込み又は除去中などの他の文脈で適用可能であってもよい。メッシュ埋め込み手技の前、メッシュ埋め込み手技の間、メッシュ埋め込み手技の後であるが、いずれかの露出又は他の合併症の前に、メッシュ露出が生じた場合の処置として、メッシュ除去手技の間、メッシュ除去手技の直後、又はメッシュ除去手技の後のある時点で、本明細書に記載の組成物を投与してもよく、及び／又は本明細書に記載の方法を実施してもよい。加えて、膣メッシュ露出の例示的モデルの文脈で本明細書に記載されるが、本明細書に記載される組成物及び方法は、例えば、ヘルニア修復、ストレス性尿失禁の処置、子宮脱、又は他の損傷組織の補強などの外科用メッシュを伴う他の手技に適用され得ることを理解されたい。

【0023】

組織再生における研究は、幹細胞療法の調査にますます向けられてきている。しかし、治療の成功は、培養技術及び送達方法の費用及び不均一性によって制限されてきた。対照的に、エキソソーム送達プラットフォームは、治療用核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）、シグナル伝達タンパク質、及び他の再生基質を送達して、内分泌経路、パラクリン経路、及び／又は抗炎症経路を活性化することができる。エキソソームは、局所的な幹細胞活性化及び増殖を駆動することができ、細胞ベースの様式の必要性を排除する。

【0024】

本開示は、精製エキソソーム生成物（ＰＥＰ）を含む治療用組成物を記載する。これらの組成物は、膣メッシュ露出を処置するための方法において使用され得る。ＰＥＰは、従来の方法を使用して調製されたエキソソームとは異なる構造及び組成を有する生成物を生成する凍結乾燥工程を使用して調製された精製エキソソーム生成物である。ＰＥＰは、室温で安定であり、以下により詳細に記載されるように、薬学的担体（例えば、ｐＨ中和コラーゲン－１）中で再構成されて、不十分な膣組織治癒の非外科的管理のための注射可能な組成物を作り出すことができる。

【0025】

精製エキソソーム生成物（ＰＥＰ）の生成は、血液から血漿を分離することと、分離された血漿から濾過及び遠心分離によってエキソソームの溶液を単離することと、を含む。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号（国際公開第ＷＯ２０１９／１１８８１７号として公開されている）、米国特許公開第２０２１／０１６９８１２Ａ１号、及び米国特許第１０，５９６，１２３号に、ＰＥＰが完全に特徴付けられ、ＰＥＰの調製方法が記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、ＰＥＰは、従来の方法を使用して調製されたエキソソームとは異なる構造を有する生成物を生成する凍結乾燥工程を使用して調製された精製エキソソーム生成物である。例えば、ＰＥＰは、典型的には、従来のエキソソーム調製方法の間にエキソソームが破壊された後のエキソソーム脂質二重層の脂質の再凝集から生じる結晶構造ではなく、球状又はスフェロイド状の構造及びインタクトな脂質二重層を有する。球状又はスフェロイド状のエキソソーム構造は、一般に、３００ｎｍ以下の直径を有する。典型的には、ＰＥＰ調製物は、比較的狭いサイズ分布を有する球状又はスフェロイド状のエキソソーム構造を含有する。いくつかの調製物において、ＰＥＰは、約１１０ｎｍ±９０ｎｍの平均直径を有する球状又はスフェロイド状のエキソソーム構造を含み、エキソソーム構造の大部分は、１１０ｎｍ±５０ｎｍ、例えば、１１０ｎｍ±３０ｎｍなどの平均直径を有する。

【0026】

未改変ＰＥＰ調製物、すなわち、調製物中のエキソソームの集団の選別又は分離によってその特徴に変化のないＰＥＰ調製物は、ＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームとの混合物を天然に含む。ＣＤ６３^－エキソソームは無制限の細胞増殖を阻害することができることから、ＣＤ６３^＋及びＣＤ６３^－エキソソームを天然に含む未改変ＰＥＰ調製物は、創傷の修復及び／又は組織再生のための細胞増殖を刺激することも、無制限の細胞増殖を制限することもできる。

【0027】

更に、ＣＤ６３^＋エキソソームを選別することによって、天然に単離されたＰＥＰ調製物からＣＤ６３^＋エキソソームを取り出し、次いで所望の量のＣＤ６３^＋エキソソームを添加し戻すことによって、ＰＥＰ生成物中のＣＤ６３^－エキソソームに対するＣＤ６３^＋エキソソームの比を制御することができる。１つ以上の実施形態において、ＰＥＰ調製物は、ＣＤ６３^－エキソソームのみを有し得る。

【0028】

１つ以上の実施形態において、ＰＥＰ調製物は、ＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームの両方を有し得る。ＣＤ６３^＋エキソソームのＣＤ６３^－エキソソームに対する比は、少なくとも部分的に、特定の用途において所望される細胞増殖の量に応じて変動し得る。例えば、ＣＤ６３^＋／ＣＤ６３^－エキソソーム比は、ＣＤ６３^＋エキソソームによって誘導される所望の細胞増殖、及び細胞接触阻害を介して達成されるＣＤ６３^－エキソソームによって提供される細胞増殖の阻害を与える。非接着性細胞が存在する組織（例えば、血液由来構成成分）などの特定のシナリオでは、この比は、治療する組織に対して細胞増殖又は細胞阻害の適切なバランスを提供するように調整することができる。例えば、非接着性細胞を有する組織においては、細胞間接触はきっかけではないので、ＣＤ６３^＋エキソソームの比を減らして、無制限の細胞増殖を回避することができる。逆に、同種異系細胞をベースとする治療又は免疫療法などにおいて、細胞のクローン集団を拡大したい場合、非常に小さな供給源から大きな細胞集団を確実に得ることができるように、ＣＤ６３^＋エキソソームの比を増加させることができる。

【0029】

したがって、１つ以上の実施形態では、ＰＥＰ調製物中のＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームとの比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、少なくとも１３：１、少なくとも１４：１、少なくとも１５：１、又は少なくとも１６：１であり得る。１つ以上の実施形態では、ＰＥＰ調製物中のＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームとの比は、最大１５：１、最大１６：１、最大１７：１、最大１８：１、最大１９：１、最大２０：１、最大２５：１、又は最大３０：１であり得る。例えば、ＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームとの比は、１：１～３０：１、２：１～２０：１、４：１～１５：１、又は８：１～１０：１であり得る。１つ以上の特定の実施形態では、ＰＥＰ生成物は、９：１の比のＣＤ６３^＋エキソソーム対ＣＤ６３^－エキソソームを含有するように製剤化される。１つ以上の特定の実施形態では、天然ＰＥＰ、例えば、ＣＤ６３^＋エキソソームとＣＤ６３^－エキソソームとの比が改変されていないＰＥＰを使用してもよい。

【0030】

本開示は、外科的介入の補助として、又は外科用メッシュ（例えば、膣メッシュ）の露出を処置するための独立型療法としてのＰＥＰの使用を記載する。標準的な外科的再閉鎖へのＰＥＰの添加は、ブタモデルにおけるメッシュ露出の改善された解消－例えば、組織の治癒及び再閉鎖－を生じる。記載されたブタモデルは、一般に、外科用メッシュ露出の種々の状況において、及びヒトを含む他の種の対象において使用するための臨床的有用性の有効な指標である。更に、ＰＥＰは、臨床的に意味のあるサイズ（例えば、１×１ｃｍを超える）の露出において、更なる外科的介入なしにメッシュ露出の解消を独立して達成することができる。再生医療（機能的組織の再生）の教義と一致して、ＰＥＰ処置組織は、非ＰＥＰ処置露出部よりも優れた血管新生、上皮の厚さ、粘弾性及び炎症プロファイルを実証している。

【0031】

対象がブタである例示的なモデルの文脈において以下に例示されるが、本明細書中に記載される組成物及び方法は、任意の適切な対象を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「対象」とは、ヒト又は任意の非ヒト哺乳動物であり得る。例示的な非ヒト動物の対象としては、家畜動物又はコンパニオンアニマルが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な非ヒト動物の対象としては、ヒト科（例えば、チンパンジー、ゴリラ、又はオランウータンを含む）、ウシ亜科（例えば、畜牛を含む）、ヤギ亜科（例えば、ヤギを含む）、ヒツジ属（例えば、ヒツジを含む）、ブタ（例えば、ブタを含む）、ウマ科（例えば、ウマを含む）、シカ科のメンバー（例えば、シカ、エルク、ムース、カリブー、トナカイなどを含む）、バイソン科のメンバー（例えば、バイソンを含む）、ネコ科（例えば、飼いネコ、虎、ライオンなどを含む）、イヌ科（例えば、飼いイヌ、オオカミなどを含む）、鳥類（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどを含む）、齧歯類（例えば、マウス、ラットなどを含む）、ウサギ科のメンバー（例えば、ウサギ又は野ウサギを含む）、イタチ科のメンバー（例えば、フェレットを含む）、又は翼手目のメンバー（例えば、コウモリを含む）が挙げられるが、これらに限定されない：

【0032】

また、メッシュ露出の結果として損傷した膣上皮を含む例示的な実施形態の文脈において以下に説明されるが、本明細書中に記載される組成物及び方法は、任意の組織－したがって、メッシュ露出の結果として損傷した任意の上皮組織－の処置を含み得る。

【0033】

外科用メッシュ露出モデル
全ての動物は、有害事象なしに研究を完了した。記載されたメッシュ露出モデルは、臨床的に意味のあるサイズのインプラントを研究するのに適切であることが証明された。体重７０～８０ｋｇのブタは、複数のメッシュを埋め込むための適切な膣内径及び深さ、並びに標準的な外科用器具の使用を可能にした。全てのメッシュを、２－０ポリプロピレンで固定することによって保持した。ＰＥＰのみの群における１匹の動物は、メッシュインプラントの中心部分の「バルーニング（ballooning）」を経験したが、メッシュの下の再上皮化を依然として実証した（組織学的に確認された）。

【0034】

膣／メッシュ複合体の肉眼的分析
図２Ａは、外植された膣－メッシュ複合体の肉眼的検査を示す。ＰＥＰ及び付随する外科的閉鎖で処置された組織（群１Ｂ）は、メッシュ露出の最も顕著な解消を実証し、続いてＰＥＰのみ（群２）、次いで外科的閉鎖のみの群（群１Ａ）であった。

【0035】

外科的閉鎖で処置された群の中で、ＰＥＰの添加は、閉鎖のみと比較して、創傷離開（例えば、損傷の周りの組織の分離）の発生率を減少させた。閉鎖のみのメッシュ（群１Ａ）の４つ全てが、メッシュの離開及び再露出を有していた。４つのＰＥＰ＋閉鎖メッシュ露出（群１Ｂ）は、５０～９５％のメッシュ露出の解消を実証した。

【0036】

ＰＥＰのみで処置した動物（群２）は、外科的閉鎖の欠如にもかかわらず、強固な膣再生を実証した。１匹の動物は、先に記載したように、メッシュ複合体のバルーニングを有していた。したがって、全体的なメッシュ露出の解消については言及することができない。組織学上、バルーニングされたメッシュの下の組織試料は、以前に剥皮された領域の中心に再生された組織の存在を示した。ＰＥＰのみの群の残りの動物は、１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、及び３ｃｍのインプラント上で膣組織の再生を示し、最大のインプラントは、露出のほぼ完全な解消を実証した（図２Ａ）。

【0037】

再生組織の組織学的分析
外科的閉鎖を伴うか、又は伴わないＰＥＰ処置された膣－メッシュ複合体は、基底膜（図２Ｂ）及び損傷していない野生型膣組織（図２Ａ）と同様のインタクトな上皮の再確立を示した。対照的に、閉鎖のみの組織は、上皮において頻繁な破壊及び細胞の乱れを示した（図２Ａ；図３Ａ、Ｂ）。ＴＥＭ分析は、閉鎖のみの群における不十分に再生された基底膜及び瘢痕形成とは対照的に、ＰＥＰ＋閉鎖群において、細胞接合を維持した基底膜及び円形細胞の存在を確認した（図２Ｂ）。組織学的標本は、独立した盲検の病理学者によって精査され、本明細書に提示される知見を確証した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片は、対照と比較して、ＰＥＰ＋閉鎖（２１７μｍ）及びＰＥＰのみ（２０８μｍ）の試料における上皮の厚さの増加を明らかにした（８０μｍ、ｐ＝０．０３；図３Ａ、図４Ａ）。ＰＥＰ処置組織の免疫組織化学的分析は、野生型組織と同様に、上皮マーカーである汎サイトケラチン（図３Ｂ、Ｃ）、粘膜下コラーゲンＩＩＩ（図３Ｂ）、及びＥ－カドヘリン（図５Ａ）の適切な発現を実証した。

【0038】

１つ以上の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、外科用メッシュにおける、又は外科用メッシュの周囲の瘢痕組織の形成を減少させ得る。瘢痕組織形成は、例えば、平坦化された無秩序な上皮細胞の顕微鏡的可視化によって測定され得る。ＰＥＰ処置群における均一な組織構造及び完全な被覆（図２Ａの「ＰＥＰ＋閉鎖」及び「ＰＥＰのみ」）と比較して、部分的なメッシュ形態が依然として存在する（図２Ａの「閉鎖のみ」）不均一な瘢痕組織形成を、メッシュ移植部位において視覚的に観察することができる。組織学的に、上皮層の異常な形態は、野生型未処置対照群と比較して、「閉鎖のみ」群（図２Ｂ）において認識することができる。ＰＥＰ処置は、野生型において観察された均一な組織構造及び細胞組織化を回復させた（図２Ｂ）。

【0039】

再生組織における増殖及び炎症の評価
膣における扁平上皮の基底細胞層は増殖の原因となる。したがって、増殖は、上皮の長さ当たりのＫｉ６７^＋細胞の数を測定することによって測定した。損傷していない野生型膣組織と比べて、全ての実験動物は、より高い割合の全増殖及び上皮増殖の傾向を示し（図３Ｃ；図４Ｂ）、高密度Ｋｉ６７^＋細胞が上皮の基底層を裏打ちしている。回復した上皮が新しい細胞に由来することを確実にするために、２’－デオキシ－５－エチニルウリジン（ＥｄＵ）パターンを評価した。ＰＥＰのみの群では、ＥｄＵは上皮及び下層組織全体に存在し、研究期間中のデノボ再生が確認された（図４Ｃ）。閉鎖のみの膣／メッシュ複合体は、非上皮粘膜下区画においてより高い増殖を有する傾向があり（図４Ｂ）、急速に増殖する線維芽細胞及び／又は炎症細胞の浸潤を示唆した。ＣＤ３発現の分析は、閉鎖のみのサブグループにおいて、慢性炎症を示す、Ｔ細胞浸潤への最も高い傾向を示した（図５Ａ；図６Ａ）。

【0040】

膣／メッシュ複合体における血管新生及び線維症
ＣＤ３１^＋発現を介した内皮細胞の存在の分析は、野生型組織と比較して、ＰＥＰ＋閉鎖群においてより高い毛細血管密度を実証した（１８５の血管／ｍｍ^２対８５の血管／ｍｍ^２、ｐ＝０．０３；図４Ｂ；図６Ｂ）。興味深いことに、閉鎖のみの組織は、部分的に過剰な間質平滑筋沈着に起因して、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現の増加を示した（図６Ｃ）。ＰＥＰで処置した組織は、損傷していない組織と比較してＳＭＡ発現の増加を示したが、閉鎖のみの組織と比べてＳＭＡ発現は減少した。ＳＭＡ及びＣＤ３１の共分布の分析は、損傷していない野生型組織において最高の強度相関指数（ＩＣＱ）、閉鎖のみの群において最低であり、及びＰＥＰ処置組織において中間であることを実証しており（図６Ｄ）、閉鎖のみのコホートにおける間質平滑筋沈着を確認している。

【0041】

上記の研究は、メッシュ露出のブタモデルにおける急性（例えば、生後１週間）膣メッシュ露出を解消するためのＰＥＰ注射の有用性を確立している。以下に記載される研究において、メッシュ露出モデルにおける創傷治癒に対する再投薬（単回投与レジメン対複数回投与レジメン）の効果。具体的には、上皮の厚さ、再生細胞集団、及び血管新生を評価した。複数回投与レジメンは、最も高い再生プロファイルを示している。メッシュ露出の解消を、外科的介入、同時ＰＥＰ注射を伴う外科的介入、及びＰＥＰ注射単独で比較した。手短に言えば、ＰＥＰ単独では、最大３ｃｍ×３ｃｍのサイズのメッシュ露出を可変的に処置した。ＰＥＰ処置された組織は、外科的管理単独と比較して、より厚い再生上皮並びにより低い線維症及び炎症プロファイルを有していた。

【0042】

全てのオンプロトコル動物は、有害事象なしに研究を完了した。系統的な多臓器オン及びオフターゲット剖検評価を行ったが、関連する所見はなかった。安全性評価には、多臓器組織学的評価、定期的バイタルサイン、及び血液検査も含まれた。結果は、一元配置分散分析（one－way ANOVA）と、それに続く事後テューキー検定（post－hoc Tukey’s test）を用いたペアワイズ比較を用いて、３つの群全てにわたって総計で分析した。結果は、（１）単回対複数回投与プロトコル、及び（２）急性対亜急性メッシュ露出を評価して提示される（例えば、図４、図６、図８、及び図９）。

【0043】

１つ以上の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、任意の好適な組織学的測定によって測定される外科用メッシュ露出の解消を改善し得る。例えば、本明細書に記載される方法及び組成物は、血管新生を増加させ、線維症を減少させ、炎症プロファイルを減少させ、上皮の厚さを増加させ、細胞増殖を増加させ、かつ／又はｅ－カドヘリン、サイトケラチン、及びコラーゲンなどの組織修復のマーカーの発現を増加させ得る。

【0044】

急性メッシュ露出における単回用量対複数回用量ＰＥＰレジメン
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片の評価は、単回ＰＥＰ群と比較して、週１回ＰＥＰ群において増加した上皮の厚さ（単回ＰＥＰ １７５．４μｍ、週１回ＰＥＰ ２５９μｍ、ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．２、統計的に有意ではない）及び質的により少ない上皮破壊を明らかにした（図８Ａ、Ｂ）。メッシュ繊維は、両方の群において上皮下線維筋性組織に十分に一体化されていることが認められた。週１回のＰＥＰ群は、より少ない繊維周囲有核細胞を示した。

【0045】

動物が、初回のＰＥＰ注射後に週２回ＥｄＵを投与されてから、介入後の組織再生を追跡した。再生は、全（上皮及び非上皮）細胞集団、上皮細胞集団、及び非上皮細胞集団について報告された（密度として報告された）。全細胞増殖は、全ての群の間で有意差があった（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０４９、図８Ｄ）。急性－週１回ＰＥＰ群を単回ＰＥＰ注射を受けた群と比較すると、より高い全増殖への傾向があったが、これは事後分析において有意ではなかった（ｐ＝０．２１６）。上皮増殖は、急性単一ＰＥＰ群に対して急性週１回ＰＥＰ群においてほぼ２倍高かった（１０１１対５５６ＥｄＵ^＋細胞／ｍｍ^２、ｐ＝０．０３８）。これは、複数回投与レジメンが上皮増殖のより高い割合に寄与することを示し、これは、上皮の厚さの差が統計的有意性に達しなかったとしても、上皮の厚さを増加させることによって更に支持される。

【0046】

ＣＤ３１^＋発現を使用した内皮細胞存在の分析は、群間の毛細血管密度の有意差を示した（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．００７、図９Ｂ）。単回投与と複数回投与との間の毛細血管密度の事後分析は有意ではなかった（ｐ＝０．３１６）。ＥｄＵ^＋／ＣＤ３１^＋血管内腔／ｍｍ^２によって測定される再生毛細血管密度を評価すると、群間で再生毛細血管密度に有意差があり（ＡＮＯＶＡ ｐ＝０．０２２）、週１回ＰＥＰ群は、単回ＰＥＰ投与群と比較してより高い再生毛細血管密度を有した（ｐ＝０．０３０）。

【0047】

単回ＰＥＰ注射による急性対亜急性メッシュ露出の処置
亜急性露出群は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片における上皮においてより少ない破壊を示した（図８Ａ）。留意すべきことに、メッシュ繊維は、亜急性群対急性群においてより少ない周囲有核細胞を伴って、上皮下空間において十分に一体化されており、おそらく、時間とともに急性期炎症細胞の減少を示している。急性及び亜急性のメッシュ露出群にわたって比較すると、上皮の厚さは類似していた（急性１７５μｍ対亜急性２０３μｍ、ｐ＝０．８２８；図８Ｂ）。

【0048】

急性群と亜急性群との間の総細胞増殖は統計的に差はなかった（ｐ＝０．９４３）。しかしながら、亜急性群は、急性群と比較してより高い上皮増殖を示し（亜急性９１４対急性５５６ＥｄＵ^＋細胞／ｍｍ^２、ｐ＝０．０８１、統計的に有意ではなかった；図８Ｄ）、非上皮増殖に対する上皮増殖の比率がより高かった（亜急性１．５対急性０．６）。この傾向は、ＥｄＵがサイトケラチン陽性上皮に濃縮されている図８Ｃに視覚的に示されている。

【0049】

毛細血管密度は、急性メッシュ露出群と亜急性メッシュ露出群との間で差はなかった（ｐ＝０．２５３；図９Ｂ）。単回投与急性群の再生毛細血管密度は、亜急性群と同様であった（ｐ＝０．５２６）。留意すべきことに、亜急性群の血管内腔は、より大きく見え（図９Ａ）、治癒を伴う自然な血管癒着を示し、これは、毛細血管密度が減少する傾向を部分的に説明する。更に、密度ではなくＥｄＵ^＋血管画分を比較すると、亜急性群は、急性群における１９％と比較して２５％のＥｄＵ^＋血管を有していた。これは、血管内腔密度はより低いが、再生血管の絶対数及びサイズの両方が亜急性群においてより高いという事実を更に確証する。

【0050】

膣メッシュ露出モデルにおいて注射可能なエキソソーム再生プラットフォーム（ＰＥＰ）を使用するこの前臨床大型動物研究において、複数回投与レジメンは、単回投与レジメンよりも優れていることが見出され、ＰＥＰエキソソームは、急性露出メッシュ及び亜急性露出メッシュの両方において有効であった。これらの知見は、膣メッシュ露出のための非外科的処置としてのＰＥＰの有効性を確立したデータに追加される。具体的には、この研究は、ＥｄＵの使用によって再生された膣組織及び血管のパターンを確立した。エキソソームは、典型的には、増殖因子、抗酸化剤、マイクロＲＮＡ、及び内分泌／パラクリンシグナルの宿主を送達して、局在化した再生を刺激する。用量依存的なＥｄＵ^＋血管新生及び上皮増殖を示す本明細書におけるデータは、この機構の更なる証拠を提供する。

【0051】

閉経状態、栄養状態、真性糖尿病及び免疫抑制などの医学的共存症、並びに喫煙を含む因子が、膣メッシュ露出に寄与する。これらの因子の間の共通点は、創傷治癒に対するそれらの効果である。ＰＥＰエキソソームの再生特性を、膣メッシュ露出に対処するために評価した。

【0052】

ＰＥＰは、メッシュ露出後の膣組織再生を、外科手術が必要でない可能性があることを示唆する程度まで改善するか、又はメッシュ露出のための第二選択処置として使用され得る（図１～６）。更に、ＰＥＰ投与の再投薬及びタイミングの効果を評価した。再生上皮（厚さ及びＥｄＵ^＋画分）並びに再生毛細血管密度を組織再生の指標として選択した。

【0053】

上皮再生は、上皮及び線維筋性組織がモデルの作製において剥皮されたことを考慮して、膣組織再生の測定可能なマーカーとして使用した。反復投与による上皮の厚さの顕著な増加があった。遅延スケジュールでの単回注射でさえも、上皮の有益な再増殖を生じた。上皮再生（ＥｄＵ^＋上皮細胞／ｍｍ^２）は、複数回投与レジメンを使用すると、統計的により高く、正の用量応答効果を示唆した。実際に、上皮再生は、急性群と比較して、単回投与亜急性群においてより高く、上皮下層内の増殖画分の相対的な減少を伴い、これは、以下に考察される毛細管合体パターンに起因し得る。

【0054】

再生毛細血管密度は、複数回投与プロトコルを使用すると高かったが、単回投与の急性メッシュ露出と亜急性メッシュ露出との間でなお類似していた。血管新生の成熟期は、損傷後２～４週間を超えて延長する。したがって、ＰＥＰ注射の４週間後において良好に形成された管腔の数の増加は、改善された生理学的血管新生を示唆している。免疫組織化学上の血管のパターン及び分布を見ると（図９Ａ）、急性群はより多数の小さな毛細血管を有し、亜急性群内のより少ないがより大きな血管とは対照的である。小さな毛細血管が合体して成熟した血管を形成するこのパターンは、創傷治癒の文献に十分に記載されている。観察された血管成熟は、この研究における上皮／非上皮増殖の割合で見られるように、オンターゲット増殖を駆動する。

【0055】

本開示は、外科用メッシュ（例えば、膣メッシュ）露出のための新規エキソソーム療法、ＰＥＰの使用を支持するブタメッシュインレイモデルからのデータを提示する。したがって、ＰＥＰは、メッシュ露出に対する非手術的でコスト削減的な解決策として役立つことができる。ＰＥＰは、貯蔵安定性であり、注射が容易であるため、都市及び地方の診療において、並びに世界的な健康の向上のために、臨床医が利用できるようになる。この療法は、幹細胞に関連する細胞培養及び細胞送達の不均一性に関する問題を回避する。本明細書に提示されるデータは、再投薬による利益を実証する。

【0056】

したがって、本開示は、メッシュ露出のための注射可能な無細胞再生プラットフォームを使用するモデル動物研究を記載する。外科的介入を伴うＰＥＰ注射は、それらの全てがメッシュの離開／再露出を経験した外科的介入単独と比較して、頑強な膣組織再生及びメッシュ露出の解消をもたらした。ＰＥＰのみで処置された露出（外科的介入なし）は、可変的なメッシュ露出解消を示し、解消は３×３ｃｍのサイズまで達成された。再生された組織は、ＴＥＭ及び光学顕微鏡で実証されるように、適切な微小解剖学的構造を確立した。更に、ＰＥＰ処置された組織は、より低い線維芽細胞増殖及び炎症を示した。これらの知見は、ＰＥＰの再生、抗炎症性、及び血管形成能力を明らかにしている。全体として、ＰＥＰで処置された組織は、閉鎖のみの群と比較して、線維症及び炎症プロファイルが減少した、より厚い再生上皮を実証した。更に、複数回投与レジメンは、露出メッシュ解消に対するＰＥＰ投与の効果を更に増大させることが示されている。

【0057】

重要なことに、本明細書で報告されるデータは、慢性の治癒していない創傷、より具体的には、メッシュ移植に対する宿主応答及びメッシュ合併症の促進因子に関する既存のデータを補完する。メッシュ合併症のための手術を経験した女性におけるメッシュ／膣複合体は、誇張されたＭ２マクロファージ及びマトリックスメタロプロテイナーゼ－９（ＭＭＰ）応答並びに線維症及び分解を示すＴ細胞集団における相対的増加を有する露出を伴う組織を含み得る。非ヒト霊長類モデルにおいて、より重く、より低い多孔度の、より硬いメッシュは、細胞外マトリックスに対して有害な影響を有し、ＭＭＰ並びにコラーゲン及びエラスチン異化作用の増加をもたらした。不十分な宿主再生努力（例えば、慢性炎症、ＥＣＭリモデリング）は、メッシュ露出及びその後のメッシュ露出の外科的管理の失敗の一因となる。したがって、炎症を軽減し、制御された再生を促進するためにＰＥＰを使用することは、メッシュ露出のリスクを減少させ、既存の露出の状況における治癒を促進することができる。

【0058】

本明細書に提示されるデータは、ＰＥＰなどのエキソソーム療法が、膣組織再生において有望であることを実証している。エキソソームで処置された膣メッシュ露出は、頑強な膣組織再生を実証し、部分的から完全な露出解消をもたらした。このプラットフォームの適用は、泌尿器科医がメッシュ合併症にどのようにアプローチするかのパラダイムシフトをもたらし得る。

【0059】

したがって、本開示は、メッシュ露出の修復を改善するための組成物及び方法を記載する。一般に、組成物は、ＰＥＰと薬学的に許容される担体を含む。外科的設定において、ＰＥＰは、外科的に修復された組織への適用に好適な担体（例えば、外科用接着剤又は組織接着剤）と組み合わせてもよい。

【0060】

したがって、この方法は、外科的に移植されたメッシュの露出後に、修復を必要とする組織に有効量の組成物を投与することを含む。本明細書で使用される場合、修復を必要とする組織は、例えば、変性した膣上皮及び／又は膣メッシュと直接接触している膣上皮組織などの外科用メッシュに隣接する組織を意味し得る。修復を必要とする組織への組成物の投与はまた、無傷又は健康な部位での投与が、例えば、組成物を送達するために使用される針で損傷組織を更に破壊することなく、近くの損傷組織の治癒を促進するように、損傷組織に十分に近接した無傷又は健康な組織に組成物を投与することを含み得る。例えば、ＰＥＰ組成物は、損傷組織から最大２５ｃｍ（例えば、１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、１０ｃｍ、２０ｃｍなど）である健康な組織への注射によって投与され得る。

【0061】

この態様では、「有効量」は、未処置の上皮組織又は担体単独（ＰＥＰなし）で処置された上皮組織と比較して、上皮の厚さ、上皮細胞の増殖、及び／又は血管新生（例えば、毛細血管密度）を増加させるのに有効な量である。

【0062】

ＰＥＰは、薬学的に許容される担体と共に製剤化して、医薬組成物を形成することができる。本明細書で使用される場合、「担体」には、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、及び／又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、ヒドロゲル、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び／又は薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性成分もまた、その組成物内に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的又は他の点で望ましくないものではない物質を指し、すなわち、その物質は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる医薬組成物の他の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、ＰＥＰとともに個体に投与することができる。上記のように、外科的設定において、例示的な好適な担体としては、外科用接着剤、組織接着剤、又は支持マトリックス（例えば、コラーゲン足場）が挙げられる。

【0063】

１つ以上の実施形態では、ＰＥＰ組成物は、ＰＥＰ小胞と混合されているか、又はＰＥＰ小胞の少なくとも一部に充填されているかのいずれかで、追加の構成成分を含んでもよい。１つ以上の実施形態では、追加の構成成分は治癒を促進することができる。１つ以上の実施形態では、追加の構成成分は、例えば、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、又は他の生体適合性足場構成成分などの１つ以上の生体適合性足場構成成分を含んでもよい。１つ以上の実施形態では、追加の構成成分は、１つ以上の薬学的に活性な成分を含み得る。１つ以上の実施形態では、薬学的に活性な成分は、例えば、治癒時間を減少させるように、疼痛緩和を提供するように、又は合併症（例えば、感染）の可能性若しくは重症度を低減するように選択され得る。薬学的に活性な成分としては、例えば、ステロイド（例えば、エストロゲン）、鎮痛剤、又は抗生物質が挙げられ得る。追加の構成成分のうちの１つ以上は、ＰＥＰ小胞の少なくとも一部に充填され得る。ＰＥＰ調製物中の特定の構成成分の存在は、例えば、ＰＥＰが由来するドナー細胞による構成成分（例えば、タンパク質）の発現の結果であり得る。追加的に又は代替的に、１つ以上の構成成分は、ＰＥＰ小胞の少なくとも一部に、直接的に（構成成分それ自体の充填）又は間接的に（例えば、組換え発現タンパク質）のいずれかで充填されてもよい。

【0064】

組成物がコラーゲンを含む１つ以上の実施形態では、コラーゲンは、プロコラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンなどの線維性コラーゲン、又はそれらの組み合わせとして提供され得る。組成物がコラーゲンを含む実施形態では、コラーゲンはコラーゲン足場として提供され得る。１つ以上の他の実施形態では、細胞外マトリックス構成成分は、精製された組換えタンパク質などの任意の好適な形態で供給され得る。１つ以上の実施形態では、組成物は、ＰＥＰと１つ以上の支持マトリックス構成成分（例えば、コラーゲン）を１：２０～１：５（５％ｖ／ｖ～２０％ｖ／ｖ）の比で含み得る。１つ以上の代替実施形態では、ＰＥＰ対支持マトリックス構成成分の比は、体積で１：１００、１：５００、１：１０００、１：１０、１：５、１：２、又は１：１であってもよい。任意の医学的に好適な形態のコラーゲン、例えば、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、又はＩＩＩ型コラーゲンが、組成物中に含まれてもよい。コラーゲンは、ウシ又はヒト供給源などの哺乳動物供給源に由来してもよい。コラーゲン原線維構造は、天然、アテロコラーゲン、加水分解されたもの、又はいくつかのタイプの組み合わせであり得る。典型的には、ゲル電気泳動を使用して、コラーゲン足場中のコラーゲンの１０％以下が、アルファよりも速い移動の特徴を示す。

【0065】

ＰＥＰを含有する医薬組成物は、好ましい投与経路に適した様々な形態で製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、粘膜下など）、又は局所（例えば、手術中に曝された神経組織への適用、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む公知の経路を介して投与することができる。医薬組成物は、例えば、鼻又は呼吸器粘膜への投与などによって（例えば、スプレー又はエアロゾルによって）、粘膜表面に投与することができる。医薬組成物はまた、持続性又は遅延性の放出を介して投与してもよい。医薬組成物は、例えば、１回以上の注射、坐剤、局所ゲル、パッチ、又はリングなどの非外科的インプラントの形態で投与することができる。医薬組成物は、包帯、縫合糸、ステープル、添え木、又は外科用メッシュなどの物理的足場に埋め込まれて投与され得る。１つ以上の実施形態では、複数の投与方法が、単一の処置の間に利用されてもよい。

【0066】

したがって、医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、又は任意の混合物の形態を含むがこれらに限定されない任意の適切な形態で提供され得る。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、又はビヒクルを含む製剤で供給され得る。例えば、製剤は、例えば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、坐剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローションなどの従来の局所剤形で供給されてもよい。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、芳香剤、香味剤、保湿剤、増粘剤などを含む１つ以上の添加剤を更に含んでもよい。

【0067】

製剤は、便利な単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野で公知の方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体を含む組成物を調製する方法は、ＰＥＰを、１つ以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、ＰＥＰを液体担体、細かく割られた固体担体、又はその両方と均一に及び／又は密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製することができる。

【0068】

投与されるＰＥＰの量は、投与されるＰＥＰの含有量（content）及び／又は供給源、対象の体重、健康状態、並びに／又は年齢、並びに／又は投与経路を含むがこれらに限定されない様々な因子に応じて変動し得る。したがって、所与の単位剤形に含まれるＰＥＰの絶対重量は、広く変動する可能性があり、対象の種、年齢、体重、及び健康状態、及び／又は投与方法などの因子に依存する。したがって、全ての考えられる用途に有効なＰＥＰの量を構成する量を一般的に記載することは現実的ではない。しかしながら、当業者は、そのような因子を十分に考慮して適切な量を容易に決定することができる。

【0069】

１つ以上の実施形態では、ＰＥＰの用量は、送達されるＰＥＰエキソソームの用量の観点で測定することができる。したがって、１つ以上の実施形態では、本方法は、例えば、約１×１０^６ＰＥＰエキソソーム～約１×１０^１５ＰＥＰエキソソームの用量を対象に提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得るが、１つ以上の実施形態では、本方法は、この範囲外の用量でＰＥＰを投与することによって行われてもよい。

【0070】

したがって、１つ以上の実施形態では、本方法は、少なくとも１×１０^６ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^７ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^８ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^９ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^１０ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも２×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも３×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも４×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも５×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも６×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも７×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも８×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも９×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、２×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、少なくとも３×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、少なくとも４×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、又は少なくとも５×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、少なくとも１×１０^１３ＰＥＰエキソソーム、又は少なくとも１×１０^１４ＰＥＰエキソソームの最小用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。

【0071】

１つ以上の実施形態において、本方法は、１×１０^１５以下のＰＥＰエクソソーム、１×１０^１４以下のＰＥＰエクソソーム、１×１０^１３以下のＰＥＰエクソソーム、１×１０^１２以下のＰＥＰエクソソーム、１×１０^１１以下のＰＥＰエクソソーム、又は１×１０^１０以下のＰＥＰエクソソームの最大用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。

【0072】

１つ以上の実施形態では、本方法は、上で特定された任意の最小用量と最小用量より大きい任意の最大用量によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けられる用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。例えば、１つ以上の実施形態では、本方法は、例えば、１×１０^１１～５×１０^１２ＰＥＰエキソソームの用量、１×１０^１２～１×１０^１３ＰＥＰエキソソームの用量、又は５×１０^１２～１×１０^１３ＰＥＰエキソソームの用量などの１×１０^１１～１×１０^１３ＰＥＰエキソソームの用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。１つ以上の特定の実施形態では、本方法は、上に列挙された任意の最小用量又は任意の最大用量に等しい用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。したがって、例えば、本方法は、１×１０^１０ＰＥＰエキソソーム、１×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、５×１０^１１ＰＥＰエキソソーム、１×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、５×１０^１２ＰＥＰエキソソーム、１×１０^１３ＰＥＰエキソソーム、又は１×１０^１４ＰＥＰエキソソームの用量を投与することを伴い得る。

【0073】

あるいは、ＰＥＰの用量は、凍結乾燥状態からの再構成時のＰＥＰの濃度に関して測定することができる。したがって、１つ以上の実施形態では、本方法は、例えば、対象に約０．０１％溶液～１００％溶液の用量でＰＥＰを対象に投与することを含み得るが、１つ以上の実施形態では、本方法は、この範囲外の用量でＰＥＰを投与することによって行われてもよい。本明細書で使用される場合、ＰＥＰの１００％溶液とは、１ｍｌの液体又はゲル担体（例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水、無血清培養培地、外科用接着剤、組織接着剤など）中に可溶化されたＰＥＰ（約２×１０^１１エキソソーム又は７５ｍｇ）の１つのバイアルを指す。比較のために、０．０１％ＰＥＰの用量は、標準的な細胞条件培地を使用したインビトロでの細胞からのエキソソーム単離などのエキソソームを得る従来の方法を使用して調製されたエキソソームの標準的な用量とほぼ等しい。

【0074】

したがって、１つ以上の実施形態では、本方法は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１．０％、少なくとも２．０％、少なくとも３．０％、少なくとも４．０％、少なくとも５．０％、少なくとも６．０％、少なくとも７．０％、少なくとも８．０％、少なくとも９．０％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％の最小用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。

【0075】

１つ以上の実施形態では、本方法は、１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、９．０％以下、８．０％以下、７．０％以下、６．０％以下、５．０％以下、４．０％以下、３．０％以下、２．０％以下、１．０％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、又は０．１％以下の最大用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。

【0076】

１つ以上の実施形態では、本方法は、上で特定された任意の最小用量と最小用量より大きい任意の最大用量によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けられる用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。例えば、１つ以上の実施形態では、本方法は、１％～５０％の用量、例えば、５％～２０％の用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。１つ以上の特定の実施形態では、本方法は、上に列挙された任意の最小用量又は任意の最大用量に等しい用量を提供するために十分なＰＥＰを投与することを含み得る。したがって、例えば、本方法は、０．０５％、０．２５％、１．０％、２．０％、５．０％、２０％、２５％、５０％、８０％、又は１００％の用量を投与することを含み得る。

【0077】

単回用量は、全て一度に、処方された時間にわたって連続的に、又は複数回の別個の投与で投与されてもよい。複数回投与を使用する場合、各回の投与量は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、処方された１日用量のものは、単回用量として、２４時間にわたって連続的に、等しくても等しくなくてもよい２回の投与として投与されてもよい。単回用量を送達するために複数回投与を使用する場合、投与間の間隔は同じであっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＰＥＰは、例えば、外科的手技中に、１回限りの投与として投与されてもよい。

【0078】

ＰＥＰ組成物の複数回投与で対象に投与する特定の実施形態では、ＰＥＰ組成物は、損傷した膣組織を所望の程度まで処置するために必要に応じて投与され得る。あるいは、ＰＥＰ組成物は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は少なくとも１０回投与され得る。投与間の間隔は、最小で少なくとも１日、例えば、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、又は少なくとも２１日などであり得る。投与間の間隔は、最大で６ヶ月以下、例えば、３ヶ月以下、２ヶ月以下、１ヶ月以下、２１日以下、又は１４日以下であり得る。

【0079】

１つ以上の実施形態では、本方法は、上で特定された任意の最小間隔と最小間隔よりも大きい任意の最大間隔によって定義されるエンドポイントを有する範囲によって特徴付けられる間隔（２回投与の場合）又は複数間隔（３回以上の投与の場合）でのＰＥＰの対象への複数回投与を含み得る。例えば、１つ以上の実施形態において、本方法は、１日～６ヶ月、例えば３日～１０日の間隔でのＰＥＰの複数回投与を含み得る。特定の実施形態において、本方法は、上に列挙した任意の最小間隔又は任意の最大間隔に等しい間隔でのＰＥＰの複数回投与を含むことができる。したがって、例えば、本方法は、３日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は６ヶ月の間隔でのＰＥＰの複数回投与を含むことができる。

【0080】

１つ以上の実施形態では、本方法は、様々な細胞型から調製されたＰＥＰのカクテルを投与することを含んでもよく、ここで、各細胞型は、例えば、タンパク質組成及び／又は遺伝子発現などの固有の上皮増殖プロファイルを有する。このようにして、ＰＥＰ組成物は、ＰＥＰ組成物が単一の細胞型から調製される場合よりも広いスペクトルの上皮組織の増殖を促進する活性を提供することができる。

【0081】

前述の説明及び以下の特許請求の範囲において、用語「及び／又は」は、列挙された要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味し、「含む」、「含んでいる」という用語及びそれらの変形は、無制限であると解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素又は工程が任意であり、存在してもしなくてもよく、別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は互換的に使用されて、１つ又は２つ以上を意味し、また、エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

【0082】

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「いくつかの実施形態」、又は「１つ以上の実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構成、組成、又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所でそのような語句が出現しても、必ずしも本開示の同じ実施形態を指しているわけではない。更に、特定の実施形態は、明確にするために単独で説明される場合がある。したがって、特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と不適合であると明示的に指定されない限り、特定の特徴、構成、組成、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わせられてもよい。したがって、一実施形態の文脈で説明される特徴は、特徴が必然的に相互に排他的である場合を除いて、異なる実施形態の文脈で説明される特徴と組み合わせることができる。

【0083】

「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で特定の利益をもたらすことができる本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ又は他の状況下で好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを示唆するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものでもない。

【0084】

別々の工程を含む本明細書に開示される任意の方法において、工程は任意の実施可能な順序で行ってもよい。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。

【0085】

例示的な実施形態
実施形態１は、対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法であって、
ＰＥＰを、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、露出した外科用メッシュの領域に隣接する組織に投与することを含む、方法である。

【0086】

実施形態２は、対象における外科用メッシュの露出を処置するための方法であって、
露出した外科用メッシュの領域を外科的に閉鎖することと、
ＰＥＰを、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量で、外科的閉鎖に隣接する上皮に投与することと、を含む、方法である。

【0087】

実施形態３は、露出した外科用メッシュの領域を処置するのに有効な量が、上皮の増殖を増加させて露出した外科用メッシュの領域を減少させるのに、外科用メッシュを覆う上皮の厚さを増加させるのに、又は外科用メッシュを覆う上皮の血管新生を増加させるのに有効な量を含む、実施形態１又は実施形態２に記載の方法である。

【0088】

実施形態４は、ＰＥＰが１回投与される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。

【0089】

実施形態５は、ＰＥＰが２回以上投与される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。

【0090】

実施形態６は、ＰＥＰが２～４回の投与で提供される、実施形態５に記載の方法である。

【0091】

実施形態７は、ＰＥＰが、投与間に約７日の間隔で投与される、実施形態５又は実施形態６に記載の方法である。

【0092】

実施形態８は、ＰＥＰが、少なくとも１０^１２個のＰＥＰエキソソームを送達するのに有効な量で投与される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法である。

【0093】

実施形態９は、外科用メッシュが少なくとも１ｃｍ×１ｃｍのサイズである、実施形態１～８のいずれかに１つに記載の方法である。

【0094】

実施形態１０は、方法が、未処置のメッシュ露出と比較して、細胞増殖の増加、上皮の厚さの増加、血管新生の増加、又は離開の欠如によって測定される、メッシュ露出の解消をもたらす、実施形態２～９のいずれか１つに記載の方法である。

【0095】

実施形態１１は、方法が、未処置のメッシュ露出と比較して、組織顕微鏡法によって測定される瘢痕形成の減少をもたらす、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。

【0096】

実施形態１２は、ＰＥＰを投与することが、処置された領域内の１つ以上の部位にＰＥＰを注射することを含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法である。

【0097】

態様１３は、ＰＥＰが、細胞外マトリックス構成成分を更に含む組成物において投与される、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法である。

【0098】

実施形態１４は、細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む、実施形態１３に記載の方法である。

【実施例】

【0099】

本発明を以下の実施例で説明する。特定の実施例、材料、量、及び処置は、本明細書に記載される本発明の範囲及び趣旨に従って広く解釈されるべきであることが理解される。

【実施例1】

【0100】

ブタとヒトの解剖学的構造が類似しており、膣の内径及び長さが、動物１匹当たり複数の臨床的に意味のあるサイズのメッシュを移植することを可能にするため、ブタモデルを使用した。

【0101】

メッシュ露出モデル
１６個のマクロ多孔性単繊維ポリプロピレンメッシュ（ＲｅｓｔｏｒｅｌｌｅＭ Ｆｌａｔ Ｍｅｓｈ；Ｃｏｌｏｐｌａｓｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、体重７０～８０ｋｇの７匹の飼育ヨークシャー交配ブタの膣に外科的に移植した。動物を２つの群に分けた：（群１）ＰＥＰ注射あり（Ｎ＝２）又はＰＥＰ注射なし（Ｎ＝２）の膣上皮再閉鎖、及び（群２）ＰＥＰ注射のみ（Ｎ＝３）。

【0102】

メッシュ露出モデルは、膣上皮及び下にある線維筋性組織を電気焼灼器で剥皮し、次いでメッシュの正方形を結節２－０ポリプロピレン縫合糸でこの領域に固定することによって作製した。グループ１については、３ｃｍ×３ｃｍのメッシュを膣の腹側及び吻側に移植した。群２については、異なるサイズのメッシュ（１ｃｍ×１ｃｍ、２ｃｍ×２ｃｍ、３ｃｍ×３ｃｍ）を円周方向に移植した（図１）。７～１０日後、動物を介入手技のために手術室に戻した。

【0103】

精製エキソソーム生成物（ＰＥＰ）の調製
ＰＥＰは、以前に記載されたように調製した（国際公開第ＷＯ２０１９／１１８８１７号として公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号）。

【0104】

ＰＥＰは、使用のために再構成するまで室温で保管した。

【0105】

精製エキソソーム生成物を用いた、又は用いない介入手技
群は、それらのメッシュ露出に対して、外科的処置、エキソソーム処置、又は併用処置を受けた。群１Ａ及び１Ｂについては、メッシュに隣接する上皮及び下にある線維筋性組織を動員し、２－０ポリグラクチン９１０縫合糸を用いて結節様式で緊張をかけずに再接近させた。群１Ｂには、２．５ｍＬの再構成ＰＥＰを、メッシュ及び閉鎖の深部に、メッシュによって取り囲まれた領域にわたって均一に、同時に注射した。群２は、ＰＥＰ注射のみを受け、ＰＥＰ（２．５ｍＬ）をメッシュの下、上記のように膣組織に注射した。

【0106】

２０％ＰＥＰゲルを、１ｍＬの滅菌水及び４ｍＬの臨床グレードＩ型ウシコラーゲン（５ｍｇ／ｍＬ；Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）中で５×１０^１２個の凍結乾燥されたＰＥＰエキソソーム（Ｒｉｏｎ ＬＬＣ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ）を再構成することによって作製し、２１ゲージ針を使用して注射した。

【0107】

２’－デオキシ－５－エチニルウリジン（ＥｄＵ）は、ＤＮＡ複製中にチミジン類似体としてＤＮＡに組み込まれる。これは、組織再生を追跡するために使用することができる。ＰＥＰのみの群の１匹の動物に、週２回、経口サプリメント（５ｍｇ／ｋｇ）として与えた。

【0108】

野生型
膣生検及び「野生型」としての比較のために、同等のサイズ及び年齢の、装着されていない雌ブタを使用した。実験群と同様に、殺処分を行った。

【0109】

殺処分及び組織採取
介入の４週間後、動物をペントバルビタールで安楽死させた。泌尿生殖器を一括して取り出し、写真撮影した。各メッシュ複合体からの再生組織の最も中心の部分を、外科用メスを用いてサンプリングした。再生が認められなかった場合、メッシュ縁部に隣接して末梢生検を採取した。次いで、組織標本をカセットに入れ、ホルマリン又はトランプ固定液に浸した。

【0110】

組織学的処理及び定量化
切除したサンプルを、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、マッソン・トリクローム染色、並びに免疫組織化学染色のために処理した。

【0111】

ホルマリン固定試料をパラフィンに包埋し、ミクロトーム上で１０μｍ切片に切断した。切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにマッソン・トリクローム染色を含む標準的な組織病理学的分析に供した（図３Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色切片を、スライドスキャナー（ＡＸＩＯ ＳＣＡＮ．Ｚ１，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像化した。免疫組織化学的分析のために、キシレン中での連続洗浄によって切片を脱パラフィン化し、減少する量のエタノール中で再水和した。切片をクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ６．０）に浸漬し、３０分間煮沸することによって、抗原賦活化を行った。切片の輪郭を疎水性ペンで描き、ブロッキング緩衝液（５％正常ロバ血清、５％ウシ血清アルブミン、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（表１）と共に４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）二次抗体（ロバ）をブロッキング緩衝液で１：５００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。ＥｄＵを、製造業者の説明書に従って、画像化キット（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ Ｐｌｕｓ ＥｄＵ ＡＦ６４７，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して標識した。十分に洗浄した後、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを各切片に添加し、カバーガラスで覆い、１０倍対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮像した。

【表1】

【0112】

平均上皮の厚さをＨ＆Ｅ染色切片から測定した。上皮の面積を、ＦＩＪＩ（ｖ．２．０）において手動で輪郭を描くことによって計算し、次いで上皮の長さで割った。ＧＤＳＣプラグイン及びカスタムマクロを備えたＦＩＪＩを使用して、閾値化、マスク作成、及び粒子分析を使用して、免疫蛍光を定量化した。増殖の程度は、上皮の長さ当たりの所与の１０倍視野におけるＫｉ６７^＋細胞の数を計数することによって評価した。上皮マーカー（汎サイトケラチン）を使用してマスクを作製して、上皮の長さ当たりの総Ｋｉ６７^＋細胞数及び上皮Ｋｉ６７細胞数を定量化した。非上皮増殖を、総Ｋｉ６７^＋細胞と上皮Ｋｉ６７細胞との間の差として計算した。上皮下面積１ｍｍ^２当たりのＣＤ３１^＋血管内腔の数を定量化することによって血管新生を評価した。ＣＤ３１^＋及びＳＭＡ^＋領域の共分布の程度を、血管の外側の平滑筋沈着の代用として使用し、強度相関指数（ＩＣＱ）として報告した。慢性炎症は、高倍率視野当たりのＣＤ３^＋細胞（Ｔリンパ球）によって覆われた面積パーセントを測定することによって評価した。組織学的処理及び定量化は、盲検化された治験担当医師によって行われた。

【0113】

超音波振動エラストグラフィ（Vibroelastography）
インビボでの組織生体力学を評価するために、殺処分前にエラストグラフィを行った。以前に記載されたように（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ２９１（２）：４７９－４８４）、手持ち式バイブレーター（Ｍｏｄｅｌ ＦＧ－１４２，Ｌａｂｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）を使用して、０．１秒の調和振動（１００ヘルツ）を会陰に発生させた。励起信号は、以前に記載されたように（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ８１（補足Ｃ）：８６－９２）、音声増幅器（Ｍｏｄｅｌ Ｄ１５０Ａ，Ｃｒｏｗｎ Ａｕｄｉｏ Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）によって増幅された。膣における波伝播を、６．４ＭＨｚの中心周波数を有するリニアアレイ超音波プローブ（Ｌ１１－５ｖ，Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）を用いて、超音波診断装置（Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）上で測定した。

【0114】

速度マップを得て、代表的なせん断波速度を各メッシュについて報告した。収集後の計算を使用して組織粘度を得た。超音波エコーの無線周波数データを得て、超音波信号のＩＱデータを得るために復調させた。組織運動を、以前に記載されたように（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎ Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ６４（９）：１２９８－１３０４）、超音波ＩＱデータの自己相関分析を使用することによって得た。相互相関技法を用いて、水平方向及び垂直方向の両方における波速度を測定し、以前に記載されたように（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎ Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ６６（５）：１３４６－１３５２）、関心領域の速度マップを得た。

【0115】

複数の周波数での波速度の測定は、フォークトモデルを用いてせん断弾性及びせん断粘度を計算するために使用することができ、

【数1】

ここで、ωは角周波数であり、μ_１はせん断弾性であり、μ_２はせん断粘度である。

【0116】

せん断弾性及び粘度は、以前に記載されたように（Ｐｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｊ Ｍｅｃ Ｂｅｈａｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ５４：９３－１０５）、異なる振動周波数における測定されたせん断波速度と予測されたせん断波速度との差を最小限に抑えることによって、レーベンバーグ・マルカートの非線形最小二乗アルゴリズムを介して特定した。目的関数の残余誤差は、次のように計算した：

【数2】

ここで、上付き文字Ｅ及びＴは、せん断波速度の実験的に測定された値及び理論的に予測された値を指し、下付き文字ｎは特定の実験状態を示す。

【0117】

平均波速度及び粘度は、群間で類似していた。これらの知見は、ＰＥＰが、好ましくない粘弾性変化をもたらす線維症優勢創傷治癒を引き起こさないことを示唆している。

【0118】

統計分析
この研究のパイロット的性質を考慮して、限定された統計分析を行った。定量化可能なデータを平均±標準偏差として報告した。適切な場合、データを、０．０５のαに設定された有意水準を用いて、一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後テューキー検定で分析した。

【実施例2】

【0119】

実験設計
動物を、ＰＥＰ注射のタイミング及び頻度に基づいて３つの群に分けた。群１：メッシュ移植の７日後の単回ＰＥＰ注射（急性－単回、Ｎ＝１、２メッシュ）。群２：毎週のＰＥＰ注射、メッシュ移植の７日後に開始し、合計４回の毎週の注射を毎週継続（急性－毎週、４回の注射、Ｎ＝２、４メッシュ）。群３：メッシュ移植８週間後の遅延単回ＰＥＰ注射（亜急性－単回、Ｎ＝３、６メッシュ）。より長い期間にわたる可能な動物及び組織の損失を説明するために、亜急性群により多くの動物を割り当てた。実施例１からの均一なデータのために、より少ない動物を対照群（急性－単回）に入れた。全ての群を、最初のＰＥＰ注射の４週間後に殺処分した（図７）。メッシュ露出のための非外科的治療としてのＰＥＰの有効性を示唆する以前のデータ（実施例１、図１～６）を考慮すると、いずれの群も同時外科的閉鎖を受けなかった。全ての動物に、複製ＤＮＡに組み込まれるチミジン類似体である２’－デオキシ－５－エチニルウリジン（ＥｄＵ、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、５ｍｇ／ｋｇの用量で投与して（１０～２０ｍＬを経口で、ＰＥＰ注射の当日に開始して週２回）、細胞増殖を追跡した。

【0120】

メッシュ露出モデル
メッシュ露出モデルは、前述の方法（実施例１）を使用して作製した。簡単に説明すると、６匹の飼育ヨークシャー交配ブタ（７０～８０ｋｇ）を麻酔し、無菌操作で準備した。ベタジンを、膣内、並びに会陰及び後肢にわたって適用した。膣上皮及び線維筋性組織を動員し、電気焼灼器を用いた通常の外科的手法によって、３ｃｍ×３ｃｍの面積で切除した。マクロ孔質単繊維ポリプロピレンメッシュ（Ｒｅｓｔｏｒｅｌｌｅ Ｍ Ｆｌａｔ Ｍｅｓｈ；Ｃｏｌｏｐｌａｓｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を３ｃｍ×３ｃｍの切片に切断し、外側縁に沿って結節２－０ポリグラクチン９１０縫合糸を使用して、中央腹側及び中央吻側膣中の露出領域に固定した（ブタ１匹当たり２メッシュを移植）。

【0121】

精製エキソソーム生成物（ＰＥＰ）の注射
２０％ＰＥＰの作用液を、５×１０^１２個の凍結乾燥ＰＥＰエキソソーム（Ｒｉｏｎ ＬＬＣ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ）を１ｍＬの滅菌水及び４ｍＬの臨床グレードＩ型ウシコラーゲン（５ｍｇ／ｍＬ；Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）中で再構成させることによって作製した。再構成後、ＰＥＰ溶液はゲル様粘稠度を形成した。滅菌ベタジン調製後、合計２．５ｍＬのＰＥＰゲルを、２１ゲージ針を使用して９つの部位（３×３格子パターン）にわたって均一に、各メッシュ露出下の線維筋性組織に注入した。

【0122】

組織採取及び組織学的処理
最初のＰＥＰ注射の４週間後、全ての動物をペントバルビタールを用いて安楽死させた。泌尿生殖器を一括して切除し、写真撮影した。その後、再生された膣－メッシュ複合体の最も中心の部分を、メスを使用してサンプリングし、カセットに入れ、ホルマリンに浸した。ホルマリン固定試料をパラフィンに包埋し、ミクロトーム上で１０μｍの切片に切断した。標準実験プロトコルに従って、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに免疫組織化学染色用に切片を処理した。Ｍｏｔｉｃ ＥａｓｙＳｃａｎＰｒｏデジタルスライドスキャナー（Ｍｏｔｉｃ Ｌｔｄ．，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）上で１０倍の対物レンズを使用して、Ｈ＆Ｅ染色切片を画像化した。

【0123】

免疫組織化学的分析のために、切片をキシレン中で連続的に洗浄して脱パラフィン化し、減少する量のエタノール中で再水和した。切片をクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ６．０）に浸漬し、３０分間煮沸することによって、抗原賦活化を行った。切片の輪郭を疎水性ペンで描き、ブロッキング緩衝液（５％正常ロバ血清、５％ウシ血清アルブミン、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（表１）と共に４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）二次抗体（ロバで産生）をブロッキング緩衝液で１：５００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。二次抗体標識を完了した後、製造業者の説明書に従って、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ Ｐｌｕｓ ＥｄＵ ＡＦ６４７イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、ＥｄＵを標識した。十分に洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）退色防止封入剤を各切片に添加し、カバーガラスで覆い、１０倍の対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮像した。

【表2】

【0124】

定量化及び統計分析
スライドスキャナーによって得られた個々の画像から自動的にステッチされた切片全体から上皮の厚さを計算した。ＦＩＪＩ（ｖ．３．０；Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９（７）：６７６－６８２）を使用して、全切片における上皮の面積及び長さの両方を手動でトレースし、平均厚さを上皮の面積対長さの比として報告した。細胞増殖を、ＦＩＪＩで書かれた半自動カスタムマクロを用いて測定した。簡単に説明すると、上皮領域（サイトケラチンについて陽性）の輪郭を描くマスクを、サイトケラチン、ＥｄＵ、及びＤＡＰＩを共染色する免疫蛍光画像に適用した。ＥｄＵ^＋核の数を、マスク内（上皮増殖）、マスクの外側（非上皮）、及び画像全体（全増殖）にわたって計数した。ＥｄＵ^＋細胞は上皮の厚さ全体にわたって存在するので、増殖を分析した上皮の面積に対して正規化した。最後に、手動デュアルカウンターを、サイトケラチン、ＣＤ３１、ＥｄＵ、及びＤＡＰＩを共染色する免疫蛍光画像に適用した。毛細血管密度は、上皮下の面積（サイトケラチン陰性面積）あたりのＣＤ３１^＋血管内腔の数として報告し、増殖性毛細血管は、少なくとも１つのＥｄＵ^＋核を示したＣＤ３１^＋血管の数として報告した。データを、平均＋／－標準誤差として報告した。必要に応じて、データをＡＮＯＶＡ及び事後テューキー検定で分析した。有意水準を０．０５のαに設定した。

【0125】

本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列の寄託、並びにＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列の寄託、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、その全体が参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示との間に何らかの不一致が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ示されている。それらによって不必要に限定されると理解してはならない。本発明は、示され、説明された正確な詳細に限定されるものではなく、当業者にとって明らかな変形形態は、特許請求の範囲によって規定される本発明に含まれる。

【0126】

他に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などを表す全ての数は、用語「約」によって、全ての場合において修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうではないと示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして請求の範囲の均等論を制限するための試みとしてではなく、それぞれの数値的なパラメータは少なくとも、報告された有効数字の数の観点において、及び一般的な丸め技術によって解釈すべきである。

【0127】

本発明の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において記載される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、全ての数値は、それらのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に由来する範囲を本質的に含む。

【0128】

全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、そのように指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】