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特表2024-544673ＳＥＴ７／９を用いたＥｎｄＭＴ関連疾患の診断および治療用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】ＳＥＴ７／９を用いたＥｎｄＭＴ関連疾患の診断および治療用途
(51)【国際特許分類】
G01N 33/573 20060101AFI20241126BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241126BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241126BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20241126BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20241126BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/4418 20060101ALI20241126BHJP
A61K 31/4725 20060101ALI20241126BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20241126BHJP
【ＦＩ】
G01N33/573 A
G01N33/53 Y
G01N33/53 M
G01N33/53 D
C12Q1/6876 Z
C07K16/40
C12N15/54
C12N9/12
A61K31/4418
A61K31/4725
A61P9/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532978
(86)(22)【出願日】2022-11-16
(85)【翻訳文提出日】2024-07-30
(86)【国際出願番号】 KR2022018093
(87)【国際公開番号】W WO2023101269
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】10-2021-0170147
(32)【優先日】2021-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0151892
(32)【優先日】2022-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523212416
【氏名又は名称】アイビーエムソル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＢＭｓｏｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】（Ｋｙｕｎｇ Ｈｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｏｅｇｉ－ｄｏｎｇ） ＃５０２， ５ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， ２３， Ｋｙｕｎｇｈｅｅｄａｅ－ｒｏ， Ｄｏｎｇｄａｅｍｕｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０２４４７， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】キム ジョンミン
(72)【発明者】
【氏名】クク ユンジン
(72)【発明者】
【氏名】イ アラム
(72)【発明者】
【氏名】ユン ウンシク
【テーマコード（参考）】
4B063
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ53
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS33
4B063QX02
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC21
4C086BC30
4C086DA27
4C086GA07
4C086GA12
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4C086MA04
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4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、ＳＥＴ７／９を用いた内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患の診断および治療用途に関し、本発明者らは、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理が強力な内皮間葉転換誘導条件であり、メチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９が内皮間葉転換誘導過程の重要な後成的遺伝因子であり、ＳＥＴ７／９の阻害が線維化シグナル伝達を調節して内皮間葉転換を阻害することを確認した。また、ＳＥＴ７／９の阻害は、内皮間葉転換による血管内皮細胞機能障害を回復させ、内皮間葉転換は、肺血管疾患と密接な関連があることを明らかにした。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９タンパク質またはそれをコードする遺伝子を有効成分として含む、内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患診断用バイオマーカー組成物。
【請求項2】
前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であることを特徴とする、請求項１に記載のＥｎｄＭＴ関連疾患診断用バイオマーカー組成物。
【請求項3】
メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤を有効成分として含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物。
【請求項4】
前記ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤は、前記ＳＥＴ７／９遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＳＥＴ７／９タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマー、または化合物であることを特徴とする、請求項３に記載のＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物。
【請求項5】
前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であることを特徴とする、請求項３に記載のＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物。
【請求項6】
請求項３～５のいずれか一項に記載の組成物を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用キット。
【請求項7】
（１）患者から分離された試料からＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを測定するステップと、（２）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを対照群試料と比較するステップと、（３）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合にＥｎｄＭＴ関連疾患と判断するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患の診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項8】
前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であることを特徴とする、請求項７に記載のＥｎｄＭＴ関連疾患の診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項9】
（１）血管内皮細胞に試験物質を接触させるステップと、（２）前記試験物質を接触した血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度を測定するステップと、（３）対照群試料と比較して前記ＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度が減少した試験物質を選別するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項10】
前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であることを特徴とする、請求項９に記載のＥｎｄＭＴ関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項11】
ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、肺動脈高血圧の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項12】
前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、（Ｒ）－ＰＦＩ－２であることを特徴とする、請求項１１に記載の肺動脈高血圧の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項13】
ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）肺動脈血管内皮細胞またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴ阻害用試薬組成物。
【請求項14】
前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）または（Ｒ）－ＰＦＩ－２であることを特徴とする、請求項１３に記載のＥｎｄＭＴ阻害用試薬組成物。
【請求項15】
ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で肺動脈血管内皮細胞に処理するか、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で肺動脈高血圧のラットモデルに処理するステップを含む、肺動脈血管内皮細胞または肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴの阻害方法。
【請求項16】
前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）または（Ｒ）－ＰＦＩ－２であることを特徴とする、請求項１５に記載のＥｎｄＭＴの阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＥＴ７／９を用いた内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患の診断および治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）とは、様々な外部刺激により血管内皮細胞の本質が消え、間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、平滑筋細胞（Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）などの細胞に再分化が可能な間葉細胞の特徴を有する細胞に変化する過程を総称する用語である。
【0003】
現在まで前記ＥｎｄＭＴに関して研究されたことによると、前記内皮細胞の線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、炎症反応とともに一連の癌または動脈硬化症などの疾病を発生または悪化させるという報告があり、前記内皮細胞の損傷を引き起こす様々な外部刺激に関しては、まだ関連研究が多く行われている状況である。
【0004】
一方、従来、ＥｎｄＭＴは、病理学的に癌や線維化などに影響を与える線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および筋線維芽細胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の原因として知られている。最近の新しい研究によると、形質転換された細胞がそれぞれ軟骨芽細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪芽細胞（Ａｄｉｐｏｂｌａｓｔ）に分化できることが知られている。しかし、ＥｎｄＭＴ研究は、上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）研究に比べて非常に不十分な状況である。
【0005】
現在、ＥｎｄＭＴにより引き起こされる関連疾病に関する研究開発者らが属する機関や企業などで関連技術に莫大な投資をしており、このような投資の生産性を向上させるために努力している。スクリーニングの通常の作業過程は化合物の分注、希釈、スクリーニング成分の混合、培養および検出、スクリーニングデータの分析および結果報告で構成され、このようなシステムを用いて数百万種のライブラリをスクリーニングしてデータを確保しているが、今後詳細な研究から導き出されると予想される数千種の活性物質に対して保有ライブラリをより迅速かつ効率的にスクリーニングするために新しいスクリーニング方法が継続的に求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９タンパク質またはそれをコードする遺伝子を有効成分として含む、内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患診断用バイオマーカー組成物を提供することにある。
【0007】
本発明の他の目的は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤を有効成分として含むＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物、および前記組成物を含むＥｎｄＭＴ関連疾患診断用キットを提供することにある。
【0008】
本発明のまた他の目的は、患者から分離された試料におけるＳＥＴ７／９の発現レベルの測定によるＥｎｄＭＴ関連疾患の診断に必要な情報を提供する方法を提供することにある。
【0009】
本発明のさらに他の目的は、血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９の発現または活性の程度の測定によるＥｎｄＭＴ関連疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、肺動脈高血圧の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）肺動脈血管内皮細胞またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴ阻害用試薬組成物を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で肺動脈血管内皮細胞に処理するか、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で肺動脈高血圧のラットモデルに処理するステップを含む、肺動脈血管内皮細胞または肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴの阻害方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
上記の目的を達成するために、本発明は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９タンパク質またはそれをコードする遺伝子を有効成分として含む、内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患診断用バイオマーカー組成物を提供する。
【0014】
また、本発明は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤を有効成分として含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物を提供する。
【0015】
また、本発明は、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用キットを提供する。
【0016】
また、本発明は、（１）患者から分離された試料からＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを測定するステップと、（２）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを対照群試料と比較するステップと、（３）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合にＥｎｄＭＴ関連疾患と判断するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【0017】
また、本発明は、（１）血管内皮細胞に試験物質を接触させるステップと、（２）前記試験物質を接触した血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度を測定するステップと、（３）対照群試料と比較して前記ＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度が減少した試験物質を選別するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0018】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、肺動脈高血圧の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0019】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）肺動脈血管内皮細胞またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴ阻害用試薬組成物を提供する。
【0020】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で肺動脈血管内皮細胞に処理するか、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で肺動脈高血圧のラットモデルに処理するステップを含む、肺動脈血管内皮細胞または肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴの阻害方法を提供する。
【発明の効果】
【0021】
本発明は、ＳＥＴ７／９を用いた内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患の診断および治療用途に関し、本発明者らは、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理が強力な内皮間葉転換誘導条件であり、メチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９が内皮間葉転換誘導過程の重要な後成的遺伝因子であり、ＳＥＴ７／９の阻害が線維化シグナル伝達を調節して内皮間葉転換を阻害することを確認した。また、ＳＥＴ７／９の阻害は、内皮間葉転換による血管内皮細胞機能障害を回復させ、内皮間葉転換は、肺血管疾患と密接な関連があることを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1a-1f】ヒトＰＡＥＣｓにおけるＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理が強力な内皮間葉転換（ＥｎｄＭＴ）を誘導するという結果を示す。
【図2a-2i】メチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９がＴＧＦ－β２およびＩＬ－１βにより誘導される内皮間葉転換遺伝子発現の変化に必要であるという結果を示す。
【図3】ＳＥＴ７／９がＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理により誘導される線維化シグナル伝達を調節するという結果を示す。
【図4】ｈＰＡＥＣｓにおいてＳＥＴ７／９が主に細胞質に位置し、メチル化によりＴＧＦ－βＲ１の発現を調節するという結果を示す。
【図5】ＳＥＴ７／９の阻害がＴＧＦ－β２およびＩＬ－１βにより誘導される血管内皮細胞機能障害を回復させるという結果を示す。
【図6】ＥｎｄＭＴが肺血管疾患で起こり、ＳＥＴ７／９が肺動脈高血圧の動物モデルおよび肺線維症の動物モデルで大幅に上向きに調節されるという結果を示す。
【図7】ＳＥＴ７／９阻害剤シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）による内皮間葉転換の回復結果を示す。
【図8】ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧の動物モデルにおけるＳＥＴ７／９阻害剤シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）の効果の結果を示す。
【図9】ＳＥＴ７／９特異的阻害剤（Ｒ）－ＰＦＩ－２による内皮間葉転換の回復結果を示す。
【図10】ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧の動物モデルにおけるＳＥＴ７／９特異的阻害剤（Ｒ）－ＰＦＩ－２の効果の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９タンパク質またはそれをコードする遺伝子を有効成分として含む、内皮間葉転換（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥｎｄＭＴ）関連疾患診断用バイオマーカー組成物を提供する。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
【0024】
また、本発明は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤を有効成分として含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物を提供する。
【0025】
詳細には、前記ＳＥＴ７／９の発現レベルを測定可能な製剤は、前記ＳＥＴ７／９遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブ、前記ＳＥＴ７／９タンパク質に特異的に結合する抗体、ペプチド、アプタマー、または化合物であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
【0026】
また、本発明は、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用組成物を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患診断用キットを提供する。
一方、本発明のキットは、マーカー成分に特異的に結合する抗体、基質との反応により発色する標識体が接合された二次抗体コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液、および酵素反応停止液などを含んでもよく、用いられる試薬成分を含む複数の別のパッケージングまたはコンパートメントで製作されてもよい。
一方、本発明のキットは、マーカー成分に特異的に結合する抗体、基質との反応により発色する標識体が接合された二次抗体コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液、および酵素反応停止液などを含んでもよく、用いられる試薬成分を含む複数の別のパッケージングまたはコンパートメントで製作されてもよい。
【0027】
本明細書において、「診断」という用語は、特定の疾病または疾患に対するある対象物の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、ある対象物が特定の疾病または疾患を現在有するか否かを判定すること、特定の疾病または疾患を有するある対象物の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはセラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために対象物の状態をモニタリングすること）を含む。
【0028】
本明細書において、「プライマー」という用語は、短い遊離３－ヒドロキシル基（ｆｒｅｅ ３’－ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列であって、相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成することができ、テンプレート鎖をコピーするための開始点として作用する短い核酸配列を指す。プライマーは、適切な緩衝溶液および温度で重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）および異なる４種類のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。ＰＣＲの条件、センスおよびアンチセンスプライマーの長さは、当業界で公知の技術に応じて適宜選択することができる。
【0029】
本明細書において、「プローブ」という用語は、ｍＲＮＡ以外に特異的に結合できる、短くても数塩基ないし長くても数百塩基に相当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識されているため、特定のｍＲＮＡの存在有無、発現量を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で製作することができる。適切なプローブの選択およびハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で公知の技術に応じて適宜選択することができる。
【0030】
本明細書において、「抗体」という用語は、当該技術分野で公知の用語であり、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味する。本発明における抗体とは、本発明のＳＥＴ７／９に対して特異的に結合する抗体を意味し、当該技術分野の通常の方法に従って抗体を製造することができる。前記抗体の形態は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、全ての免疫グロブリン抗体が含まれる。前記抗体とは、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖を有する完全な形態を意味する。また、前記抗体は、ヒト化抗体などの特殊抗体も含む。
【0031】
本明細書において、「ペプチド」という用語は、標的物質に対する結合力が高いという利点があり、熱／化学処理時にも変性が起こらない。また、分子サイズが小さいため、他のタンパク質に付着して融合タンパク質としての利用が可能である。具体的に、高分子タンパク質鎖に付着して利用可能であるため、診断キットおよび薬物送達物質として用いることができる。
【0032】
本明細書において、「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」という用語は、それ自体が安定した三次構造を有し、標的分子に高い親和性および特異性で結合できる特徴を有する特別な種類の一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸）で構成されたポリヌクレオチドの一種を意味する。上述したように、アプタマーは、抗体と同様に抗原性物質に特異的に結合することができ、かつ、タンパク質よりも安定性が高く、構造が簡単であり、合成が容易なポリヌクレオチドで構成されているため、抗体の代わりに用いることができる。
【0033】
また、（１）患者から分離された試料からＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを測定するステップと、（２）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルを対照群試料と比較するステップと、（３）前記ＳＥＴ７／９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルが対照群試料よりも高い場合にＥｎｄＭＴ関連疾患と判断するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記ＥｎｄＭＴ関連疾患は、肺線維症または肺動脈高血圧であってもよいが、これに限定されない。
【0034】
本明細書において、「患者から分離された試料」という用語は、前記ＳＥＴ７／９遺伝子またはＳＥＴ７／９タンパク質の発現レベルにおいて、対照群とは差がある組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄液、または尿のような試料を含むが、これに限定されない。
【0035】
詳細には、前記ｍＲＮＡ発現レベルを測定する方法としては、ＲＴ－ＰＣＲ、競合ＲＴ－ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、およびＤＮＡチップを用いるが、これに限定されない。
【0036】
詳細には、前記タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓａｙ）、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体結合アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、およびタンパク質チップを用いるが、これに限定されない。
【0037】
また、本発明は、（１）血管内皮細胞に試験物質を接触させるステップと、（２）前記試験物質を接触した血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度を測定するステップと、（３）対照群試料と比較して前記ＳＥＴ７／９タンパク質の発現または活性の程度が減少した試験物質を選別するステップと、を含む、ＥｎｄＭＴ関連疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0038】
本発明のスクリーニング方法を言及するときに用いられる「試験物質」という用語は、遺伝子の発現量に影響を与えるか否か、またはタンパク質の発現または活性に影響を与えるか否かを検査するために、スクリーニングで用いられる未知の候補物質を意味する。前記試料は、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス－ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）、および天然物抽出物を含むが、これに限定されない。
【0039】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、肺動脈高血圧の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、ＳＥＴ７／９に特異的に結合するアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、化合物、ペプチド、アプタマー、および抗体であってもよく、より好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、（Ｒ）－ＰＦＩ－２であってもよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、ＳＥＴ７／９に特異的に結合するアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、化合物、ペプチド、アプタマー、および抗体であってもよく、より好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、（Ｒ）－ＰＦＩ－２であってもよいが、これに限定されない。
【0040】
本発明の薬学的組成物は、有効成分以外に、薬学的に適合し、生理学的に許容される補助剤を用いて製造されてもよく、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、または香味剤などの可溶化剤を用いてもよい。本発明の薬学的組成物は、投与のために、有効成分以外に、さらに薬学的に許容可能な担体を１種以上含む薬学的組成物として好ましく製剤化することができる。液状溶液に製剤化される組成物において、許容可能な薬学的担体としては、滅菌および生体適合性のあるものとして、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化してもよい。
【0041】
本発明の薬学的組成物の薬剤製剤の形態は、顆粒剤、散剤、コーティング錠、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁剤、乳剤、点滴剤、または注射可能な液剤、および活性化合物の徐放型製剤などであってもよい。本発明の薬学的組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内、または皮内経路を介して通常の方式で投与してもよい。本発明の薬学的組成物の有効成分の有効量とは、疾患の予防または治療に必要な量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた有効成分および他の成分の種類および含量、製剤の種類および患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時に用いられる薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節されてもよい。これに限定されるものではないが、例えば、成人の場合、１日１回～数回の投与時、本発明の組成物は、１日１回～数回の投与時、化合物の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇ、ポリペプチド、タンパク質、または抗体の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇ、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡの場合、０．０１ｎｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。
【0042】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤を有効成分として含む、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）肺動脈血管内皮細胞またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴ阻害用試薬組成物を提供する。
【0043】
好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）または（Ｒ）－ＰＦＩ－２であってもよいが、これに限定されない。
【0044】
また、本発明は、ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で肺動脈血管内皮細胞に処理するか、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で肺動脈高血圧のラットモデルに処理するステップを含む、肺動脈血管内皮細胞または肺動脈高血圧のラットモデルにおけるＥｎｄＭＴの阻害方法を提供する。
【0045】
好ましくは、前記ＳＥＴ７／９の発現または活性阻害剤は、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）または（Ｒ）－ＰＦＩ－２であってもよいが、これに限定されない。
【実施例】
【0046】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を挙げて詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明の内容を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【0047】
＜実験例＞
下記の実験例は、本発明に係るそれぞれの実施例に共通に適用される実験例を提供するためのものである。
１．実験動物
ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）－誘導されたＰＦマウスモデルとしては、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｇｒａｄｅ ｆｒｏｍ ＳａｅｒｏｎＢｉｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用いた。マウスが呼吸麻酔下にあるとき、１×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に溶解した２Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２４３４）を気管内注射した。ブレオマイシン処理から３週間後にマウスの肺を採取した。
下記の実験例は、本発明に係るそれぞれの実施例に共通に適用される実験例を提供するためのものである。
１．実験動物
ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）－誘導されたＰＦマウスモデルとしては、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｇｒａｄｅ ｆｒｏｍ ＳａｅｒｏｎＢｉｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用いた。マウスが呼吸麻酔下にあるとき、１×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に溶解した２Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ２４３４）を気管内注射した。ブレオマイシン処理から３週間後にマウスの肺を採取した。
【0048】
ＰＡＨラットモデルは、８週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｇｒａｄｅ ｆｏｒｍ ＳａｅｒｏｎＢｉｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を対象とした。
【0049】
ＤＭＳＯに溶解した後、緩衝液（脱イオン水に溶解した０．５％ カルボキシメチルセルロースナトリウム、０．５％ 塩化ナトリウム、０．４％ Ｔｗｅｅｎ－８０、および０．９％ ベンジルアルコール）に懸濁したｓｅｍａｘａｎｉｂ（ＤＣ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＳＵ５４１６）を２０ｍｇ／ｋｇでラットに皮下注射した。ラットは、３週間、１０％ Ｏ２の低酸素条件に曝露された。正常の酸素条件に回復させた後、シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ；Ｃａｙｍａｎ）または（Ｒ）－ＰＦＩ－２（ＤＣ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を投与した。シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）の投与は、２週間、５ｍｇ／ｋｇで毎日腹腔内投与し、（Ｒ）－ＰＦＩ－２は、３週間、１０ｍｇ／ｋｇで２日ごとに皮下投与した。右心室収縮期圧（ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＲＶＳＰ）を測定し、ラットを犠牲にした。
【0050】
２．細胞培養およびトランスフェクション
肺動脈ＥＣｓ（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ＥＣｓ；ＰＡＥＣｓ）およびヒト臍帯静脈ＥＣｓ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ＥＣｓ；ＨＵＶＥＣｓ）は、ＭｙｃｏＺａｐ（Ｌｏｎｚａ）および１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）を添加したＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）で培養された。ヒト微小血管ＥＣｓ（Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ＥＣｓ；ＨＭＶＥＣｓ）は、ＥＧＭ－２－ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）で培養され、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ－２９３ＴおよびＭＣＦ７細胞は、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、およびＭｙｃｏＺａｐ（Ｌｏｎｚａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。全ての細胞株は、５％ ＣＯ２インキュベータで３７℃で培養され、９０％の密度で培養された。
肺動脈ＥＣｓ（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ＥＣｓ；ＰＡＥＣｓ）およびヒト臍帯静脈ＥＣｓ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ＥＣｓ；ＨＵＶＥＣｓ）は、ＭｙｃｏＺａｐ（Ｌｏｎｚａ）および１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）を添加したＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）で培養された。ヒト微小血管ＥＣｓ（Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ＥＣｓ；ＨＭＶＥＣｓ）は、ＥＧＭ－２－ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）で培養され、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ－２９３ＴおよびＭＣＦ７細胞は、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、およびＭｙｃｏＺａｐ（Ｌｏｎｚａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養された。全ての細胞株は、５％ ＣＯ２インキュベータで３７℃で培養され、９０％の密度で培養された。
【0051】
３．試薬および薬物処理
ＴＧＦ－β２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入し、０．１％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を含む純水に溶解した。ＩＬ－１βは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入し、０．１％ ＢＳＡを含む１×ＰＢＳに溶解した。ＴＧＦ－β２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）は、特定の時点で用いられた。ＰＡＥＣｓは、１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、およびＭｙｃｏＺａｐを添加したＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）とともに前記薬物を処理した。
ＴＧＦ－β２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入し、０．１％ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を含む純水に溶解した。ＩＬ－１βは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入し、０．１％ ＢＳＡを含む１×ＰＢＳに溶解した。ＴＧＦ－β２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍｌ）は、特定の時点で用いられた。ＰＡＥＣｓは、１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、およびＭｙｃｏＺａｐを添加したＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）とともに前記薬物を処理した。
【0052】
４．ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを分離するために、ｍｉＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。精製されたＲＮＡは、ｑＰＣＲＢＩＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＰＣＲ－ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて逆転写させ、メーカーの指示に従って、ｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｍｉｘ Ｈｉ－ＲＯＸ（ＰＣＲ－ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて、リアルタイムで定量的ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行った。動物の肺組織のＲＮＡ抽出物は、２５周波数（Ｈｚ）で３分間均質化し、ＱＩＡＺＯＬ（ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）に溶解した。ＲＮＡの相対的な発現を測定するために、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の内部対照群としてｒｉｂｏｓｏｍａｌ １８Ｓ ＲＮＡを用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲに用いられたＰＣＲプライマー配列を表１に示す。
全ＲＮＡを分離するために、ｍｉＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。精製されたＲＮＡは、ｑＰＣＲＢＩＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＰＣＲ－ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて逆転写させ、メーカーの指示に従って、ｑＰＣＲＢＩＯ ＳｙＧｒｅｅｎ Ｍｉｘ Ｈｉ－ＲＯＸ（ＰＣＲ－ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて、リアルタイムで定量的ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行った。動物の肺組織のＲＮＡ抽出物は、２５周波数（Ｈｚ）で３分間均質化し、ＱＩＡＺＯＬ（ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）に溶解した。ＲＮＡの相対的な発現を測定するために、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の内部対照群としてｒｉｂｏｓｏｍａｌ １８Ｓ ＲＮＡを用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲに用いられたＰＣＲプライマー配列を表１に示す。
【0053】
【表1】
【0054】
５．免疫沈降法およびウェスタンブロット法
全ての細胞は、プロテアーゼ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）およびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）阻害剤を含むＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）緩衝液（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）に２０分間溶解した。その後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度を測定し、同量のタンパク質にＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを入れて沸騰させた。免疫沈降法のために、細胞をプロテアーゼ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）およびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む免疫沈降緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％ ＮＰ－４０）に２０分間溶解した後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞溶解物にアガロースビーズ（Ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）Ａ／Ｇ（Ｓａｔａ Ｃｒｕｚ）を入れ、４℃で１時間ｐｒｅ－ｃｌｅａｒｉｎｇした後、抗体と４℃で一晩反応させた。その後、２０ｕｌのアガロースビーズ（Ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）Ａ／Ｇを入れ、４℃で２時間反応させた。それを遠心分離してできたペレットを免疫沈降緩衝液で数回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを入れて沸騰させた。
全ての細胞は、プロテアーゼ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）およびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）阻害剤を含むＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）緩衝液（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）に２０分間溶解した。その後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度を測定し、同量のタンパク質にＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを入れて沸騰させた。免疫沈降法のために、細胞をプロテアーゼ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）およびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む免疫沈降緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％ ＮＰ－４０）に２０分間溶解した後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞溶解物にアガロースビーズ（Ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）Ａ／Ｇ（Ｓａｔａ Ｃｒｕｚ）を入れ、４℃で１時間ｐｒｅ－ｃｌｅａｒｉｎｇした後、抗体と４℃で一晩反応させた。その後、２０ｕｌのアガロースビーズ（Ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）Ａ／Ｇを入れ、４℃で２時間反応させた。それを遠心分離してできたペレットを免疫沈降緩衝液で数回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを入れて沸騰させた。
【0055】
タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。０．２％ ＰＢＳ ｗｉｔｈ ＴｗｅｅｎR ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（ＰＢＳＴ）に溶解した３％ ＢＳＡで前記膜を遮断した後、前記膜上のタンパク質を表２に記載の一次抗体と一晩反応させた。免疫検出のために、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１：４０００）を一次抗体と常温で１時間接合させ（平均温度２２℃）、その後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。細胞質と核タンパク質を分けるために、ＥｐｉＱｕｉｋ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥｐｉＧｅｎｔｅｋ）をメーカーの指示に従って用いた。動物の肺組織のタンパク質抽出物は、２５周波数（Ｈｚ）で３分間ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒで均質化した。
【0056】
【表2】
【0057】
６．レンチウイルスの生産および感染
ＰＡＥＣｓにおけるＳＥＴ７／９過発現のために、ＳＥＴ７／９過発現レンチウイルスベクター（淑明女子大学校のキム・グンイル博士提供）を用いた。レンチウイルスを生産するためにＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔを用いたが、これは、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）トランスフェクション試薬を用いて、ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ｐｓＰＡＸ２およびｐＣＬ－ＶＳＶＧ）で一緒にレンチウイルスベクターでトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションしてから４８時間後、レンチウイルスを含む培地を採取し、さらに２４時間、新鮮な完全培地に交換した。Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて採取されたレンチウイルスを濃縮し、ｑＰＣＲ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｂｍｇｏｏｄ、ＬＶ９００）を用いて定量した。ＰＡＥＣｓは、無血清培地でＳＥＴ７／９過発現レンチウイルス（１００ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［ＭＯＩ］）で感染させた。２４時間後、培地を新鮮な完全培地に交換した。前記過程を合計２回繰り返した（全感染９６時間）。
ＰＡＥＣｓにおけるＳＥＴ７／９過発現のために、ＳＥＴ７／９過発現レンチウイルスベクター（淑明女子大学校のキム・グンイル博士提供）を用いた。レンチウイルスを生産するためにＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔを用いたが、これは、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）トランスフェクション試薬を用いて、ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ｐｓＰＡＸ２およびｐＣＬ－ＶＳＶＧ）で一緒にレンチウイルスベクターでトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションしてから４８時間後、レンチウイルスを含む培地を採取し、さらに２４時間、新鮮な完全培地に交換した。Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて採取されたレンチウイルスを濃縮し、ｑＰＣＲ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｂｍｇｏｏｄ、ＬＶ９００）を用いて定量した。ＰＡＥＣｓは、無血清培地でＳＥＴ７／９過発現レンチウイルス（１００ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［ＭＯＩ］）で感染させた。２４時間後、培地を新鮮な完全培地に交換した。前記過程を合計２回繰り返した（全感染９６時間）。
【0058】
７．免疫細胞化学
ＰＡＥＣｓおよびＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔは、４％ ホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞は、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で浸透させ、１×ＰＢＳに溶解した１％ ＢＳＡで常温で１時間遮断した。細胞は、以下の一次抗体で４℃で一晩反応させた。ａｎｔｉ－ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２５００Ｓ、１：１００）、ａｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、６１００７、１：１００）、ａｎｔｉ－ＴＡＧＬＮ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１０６、１：２００）、ａｎｔｉ－α－ＳＭＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ６１９８、１：２００）、ａｎｔｉ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８２４２Ｓ、１：４００）、ａｎｔｉ－ＳＥＴ７／９（ＬｓＢｉｏ、Ｃ３３７４５０、１：１００）、およびｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１０００）。ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００）の二次抗体は、常温で１時間反応させた。免疫染色イメージを得るために、６０×対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ－７００）を備えた共焦点顕微鏡を用いた。
ＰＡＥＣｓおよびＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔは、４％ ホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞は、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で浸透させ、１×ＰＢＳに溶解した１％ ＢＳＡで常温で１時間遮断した。細胞は、以下の一次抗体で４℃で一晩反応させた。ａｎｔｉ－ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２５００Ｓ、１：１００）、ａｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、６１００７、１：１００）、ａｎｔｉ－ＴＡＧＬＮ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１０６、１：２００）、ａｎｔｉ－α－ＳＭＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ６１９８、１：２００）、ａｎｔｉ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８２４２Ｓ、１：４００）、ａｎｔｉ－ＳＥＴ７／９（ＬｓＢｉｏ、Ｃ３３７４５０、１：１００）、およびｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１０００）。ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００）の二次抗体は、常温で１時間反応させた。免疫染色イメージを得るために、６０×対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ－７００）を備えた共焦点顕微鏡を用いた。
【0059】
８．免疫組織化学
採取された動物の肺組織は、パラフィンブロックに包埋した後、１０μｍに切断した。パラフィン切片は、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒを用いて１０分間脱パラフィン化した。前記切片を水和するために、純水に溶解したエタノールを濃縮勾配に応じて用いた（１００％、９０％、７０％、５０％、３０％、および０％）。組織スライドをＢｏｒｇ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ ＲＴＵ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）の中に入れ、圧力鍋を用いて、前記切片を加熱し、抗原を回復させた。回復溶液の温度が下がると、前記切片を１×ＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄した後、遮断緩衝液（１×ＰＢＳに溶解した１％ ＢＳＡおよび５％ Ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で常温で３０分間遮断した。一次抗体で４℃で一晩反応させた。ａｎｔｉ－ｖＷＦ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ８８２２、１：５０）、ａｎｔｉ－α－ＳＭＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ６１９８、１：１００）、ａｎｔｉ－ ＳＭ２２α（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１０６、１：１３０）、およびａｎｔｉ－ＳＥＴ７／９（ＬｓＢｉｏ、Ｃ３３７４５０、１：５０）が用いられた。蛍光染色のために、前記切片は、ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１５０～１：４００）、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１５０）、およびｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００）の二次抗体で常温で１時間反応させた。色染色のために、一次抗体と一晩反応させた後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、１：１００）と１時間反応させ、ＤＡＢ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＫ－４８００）を用いて色反応させた。ヘマトキシリンエオシン染色は、Ｖｅｃｔｏｒ社製の染色製品を用いて行った。４０×対物レンズを備えたＺｅｉｓｓおよびＬｅｉｃａ社製の共焦点顕微鏡を用いてイメージ分析を行った。共局在化効果は、ＭＯＣ（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ ｏｖｅｒｌａｐ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）により検証された。
採取された動物の肺組織は、パラフィンブロックに包埋した後、１０μｍに切断した。パラフィン切片は、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒを用いて１０分間脱パラフィン化した。前記切片を水和するために、純水に溶解したエタノールを濃縮勾配に応じて用いた（１００％、９０％、７０％、５０％、３０％、および０％）。組織スライドをＢｏｒｇ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ ＲＴＵ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）の中に入れ、圧力鍋を用いて、前記切片を加熱し、抗原を回復させた。回復溶液の温度が下がると、前記切片を１×ＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄した後、遮断緩衝液（１×ＰＢＳに溶解した１％ ＢＳＡおよび５％ Ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で常温で３０分間遮断した。一次抗体で４℃で一晩反応させた。ａｎｔｉ－ｖＷＦ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ、ａｂ８８２２、１：５０）、ａｎｔｉ－α－ＳＭＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ６１９８、１：１００）、ａｎｔｉ－ ＳＭ２２α（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４１０６、１：１３０）、およびａｎｔｉ－ＳＥＴ７／９（ＬｓＢｉｏ、Ｃ３３７４５０、１：５０）が用いられた。蛍光染色のために、前記切片は、ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１５０～１：４００）、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１５０）、およびｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００）の二次抗体で常温で１時間反応させた。色染色のために、一次抗体と一晩反応させた後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、１：１００）と１時間反応させ、ＤＡＢ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＫ－４８００）を用いて色反応させた。ヘマトキシリンエオシン染色は、Ｖｅｃｔｏｒ社製の染色製品を用いて行った。４０×対物レンズを備えたＺｅｉｓｓおよびＬｅｉｃａ社製の共焦点顕微鏡を用いてイメージ分析を行った。共局在化効果は、ＭＯＣ（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ ｏｖｅｒｌａｐ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）により検証された。
【0060】
９．細胞移動分析
ＰＡＥＣ移動分析は、ＳＰＬＳｃａｒ Ｂｌｏｃｋ（ＳＰＬ）を含む１２－ウェルプレートを用いて、メーカーの指示に従って行った。細胞は、１０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、およびＭｙｃｏＺａｐを添加したＥＧＭ－２で培養し、それぞれの薬物で処理した。薬物処理に対する移動分析を行い、光学顕微鏡で観測した。移動終了は、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
ＰＡＥＣ移動分析は、ＳＰＬＳｃａｒ Ｂｌｏｃｋ（ＳＰＬ）を含む１２－ウェルプレートを用いて、メーカーの指示に従って行った。細胞は、１０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン、およびＭｙｃｏＺａｐを添加したＥＧＭ－２で培養し、それぞれの薬物で処理した。薬物処理に対する移動分析を行い、光学顕微鏡で観測した。移動終了は、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【0061】
１０．デキストラン浸透分析
細胞培養インサート（ＳＰＬ、０．４μｍ）を有する２４－ウェルプレートのウェル当たり、ＰＡＥＣｓは、２×１０５細胞で接種した。薬物処理後、前記インサートを無血清培地（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ；ＳＦＭ）を含むウェルに移し、インサートの培地をＦＩＴＣ－デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦＤ４０Ｓ、１ｍｇ／ｍｌ）を含むＳＦＭに交換した。その後、１０分および１時間後にデキストラン浸透が起こったプレートウェルのＳＦＭを一部取り出し、蛍光度を測定した。蛍光強度は、マイクロプレートリーダー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ、４８５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５３０ｎｍ）上で測定した。
細胞培養インサート（ＳＰＬ、０．４μｍ）を有する２４－ウェルプレートのウェル当たり、ＰＡＥＣｓは、２×１０５細胞で接種した。薬物処理後、前記インサートを無血清培地（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ；ＳＦＭ）を含むウェルに移し、インサートの培地をＦＩＴＣ－デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦＤ４０Ｓ、１ｍｇ／ｍｌ）を含むＳＦＭに交換した。その後、１０分および１時間後にデキストラン浸透が起こったプレートウェルのＳＦＭを一部取り出し、蛍光度を測定した。蛍光強度は、マイクロプレートリーダー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ、４８５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５３０ｎｍ）上で測定した。
【0062】
１１．Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収分析
ＰＡＥＣｓは、１２－ウェルプレートのウェル当たり、２×１０５細胞で接種した。薬物処理後、細胞は、Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３時間反応させた。反応後、細胞を１×ＰＢＳで４回洗浄し、その後、蛍光顕微鏡でイメージ分析を行った。
ＰＡＥＣｓは、１２－ウェルプレートのウェル当たり、２×１０５細胞で接種した。薬物処理後、細胞は、Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３時間反応させた。反応後、細胞を１×ＰＢＳで４回洗浄し、その後、蛍光顕微鏡でイメージ分析を行った。
【0063】
１２．統計分析
全ての実験データは、少なくとも３回以上実験を行った後に分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０および７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて検証した。統計的差異は、２つのグループを比較するためのｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで分析した。グループが３つ以上である場合、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで分析した。ｐ－数値＜０．０５は、統計的有意性があるとみなした。
全ての実験データは、少なくとも３回以上実験を行った後に分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０および７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて検証した。統計的差異は、２つのグループを比較するためのｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで分析した。グループが３つ以上である場合、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで分析した。ｐ－数値＜０．０５は、統計的有意性があるとみなした。
【0064】
＜実施例１＞強力な内皮間葉転換（ＥｎｄＭＴ）の誘導条件であるＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理
ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理が内皮間葉転換を強力に引き起こす誘導因子であるか否かを調べるために、２つの薬物をそれぞれまたは同時に処理し、内皮間葉転換の程度を比較した。ウェスタンブロット（図１Ａ）とｑＲＴ－ＰＣＲ（図１Ｂ）の結果、血管内皮細胞マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）とＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ５）は、各薬物を単独で処理した場合よりも同時に処理したグループでより多く減少した。間葉細胞マーカーであるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＦＮ）、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ２）、ＳＭ２２α（ＴＡＧＬＮ）、ＭＭＰ２、ＳＮＡＩＬも、２つの薬物を同時に処理したグループでより多く増加した。内皮間葉転換が起こった場合、血管内皮細胞は、敷石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｓｈａｐｅ）である固有の特性を失い、長くて紡錘形をした間葉細胞のような形態に変化することになる。Ｆ－ａｃｔｉｎに結合するファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）染色により、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理による内皮間葉転換が起こった肺動脈血管内皮細胞（ＰＡＥＣ）では、細胞形態の変化と細胞骨格の変化が起こることを確認した（図１Ｃ）。ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βを同時に１、３、５、７日間処理した場合、内皮間葉転換の程度を比較した結果、ＳＮＡＩＬを除く間葉細胞マーカーのタンパク質発現の変化が時間の経過とともに増加した（図１Ｄ）。間葉細胞マーカーのｍＲＮＡ発現も、時間の経過とともに発現の変化が増加するが、ＣＤＨ２とＳＮＡＩＬは、１日処理グループで最も高く、その後、次第に減少する傾向を示した（図１Ｅ）。血管内皮細胞マーカーは、ｍＲＮＡとタンパク質の発現ともに時間の経過とともに次第に減少した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。免疫細胞化学染色を行った結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理による内皮間葉転換誘導条件では、タンパク質とＲＮＡの結果と同一の結果を示した（図１Ｆ）。
ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理が内皮間葉転換を強力に引き起こす誘導因子であるか否かを調べるために、２つの薬物をそれぞれまたは同時に処理し、内皮間葉転換の程度を比較した。ウェスタンブロット（図１Ａ）とｑＲＴ－ＰＣＲ（図１Ｂ）の結果、血管内皮細胞マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）とＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ５）は、各薬物を単独で処理した場合よりも同時に処理したグループでより多く減少した。間葉細胞マーカーであるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＦＮ）、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ２）、ＳＭ２２α（ＴＡＧＬＮ）、ＭＭＰ２、ＳＮＡＩＬも、２つの薬物を同時に処理したグループでより多く増加した。内皮間葉転換が起こった場合、血管内皮細胞は、敷石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｓｈａｐｅ）である固有の特性を失い、長くて紡錘形をした間葉細胞のような形態に変化することになる。Ｆ－ａｃｔｉｎに結合するファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）染色により、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理による内皮間葉転換が起こった肺動脈血管内皮細胞（ＰＡＥＣ）では、細胞形態の変化と細胞骨格の変化が起こることを確認した（図１Ｃ）。ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βを同時に１、３、５、７日間処理した場合、内皮間葉転換の程度を比較した結果、ＳＮＡＩＬを除く間葉細胞マーカーのタンパク質発現の変化が時間の経過とともに増加した（図１Ｄ）。間葉細胞マーカーのｍＲＮＡ発現も、時間の経過とともに発現の変化が増加するが、ＣＤＨ２とＳＮＡＩＬは、１日処理グループで最も高く、その後、次第に減少する傾向を示した（図１Ｅ）。血管内皮細胞マーカーは、ｍＲＮＡとタンパク質の発現ともに時間の経過とともに次第に減少した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。免疫細胞化学染色を行った結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理による内皮間葉転換誘導条件では、タンパク質とＲＮＡの結果と同一の結果を示した（図１Ｆ）。
【0065】
＜実施例２＞内皮間葉転換誘導過程の重要な後成的遺伝因子であるメチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９
ＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βにより誘導された内皮間葉転換条件から有意に変化する後成的遺伝因子を探すために、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙｓを用いた。散布図（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔ）グラフとヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）を用いて分析した結果、ＳＥＴ７／９が有力な候補因子であることを発掘した。ウェスタンブロット（図２Ａ）、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図２Ｂ）、免疫細胞化学染色（図２Ｃ）実験を行った結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理で内皮間葉転換が誘導された肺動脈血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９のタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加し、これは、後成的遺伝因子Ａｒｒａｙの結果と一致することを確認した。次に、内皮間葉転換とＳＥＴ７／９の関連性を調べるために、ＳＥＴ７／９ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）による効果を観察した。ＳＥＴ７／９ノックダウン時、ＴＧＦ－β２、ＩＬ－１β誘導内皮間葉転換による細胞表現型変化の程度が減少することをファロイジン染色により確認した（図２Ｄ）。また、ＳＥＴ７／９ノックダウンにより内皮間葉転換マーカーのタンパク質とｍＲＮＡ発現が回復することをウェスタンブロット（図２Ｅ）、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図２Ｆ）で確認した。ＳＥＴ７／９過発現時、血管内皮細胞の形状が間葉細胞と類似した形態に変化し（図２Ｇ）、内皮間葉転換マーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ発現も変化することを確認した（図２Ｈおよび図２Ｉ）。
ＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βにより誘導された内皮間葉転換条件から有意に変化する後成的遺伝因子を探すために、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙｓを用いた。散布図（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔ）グラフとヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）を用いて分析した結果、ＳＥＴ７／９が有力な候補因子であることを発掘した。ウェスタンブロット（図２Ａ）、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図２Ｂ）、免疫細胞化学染色（図２Ｃ）実験を行った結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理で内皮間葉転換が誘導された肺動脈血管内皮細胞におけるＳＥＴ７／９のタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加し、これは、後成的遺伝因子Ａｒｒａｙの結果と一致することを確認した。次に、内皮間葉転換とＳＥＴ７／９の関連性を調べるために、ＳＥＴ７／９ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）による効果を観察した。ＳＥＴ７／９ノックダウン時、ＴＧＦ－β２、ＩＬ－１β誘導内皮間葉転換による細胞表現型変化の程度が減少することをファロイジン染色により確認した（図２Ｄ）。また、ＳＥＴ７／９ノックダウンにより内皮間葉転換マーカーのタンパク質とｍＲＮＡ発現が回復することをウェスタンブロット（図２Ｅ）、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図２Ｆ）で確認した。ＳＥＴ７／９過発現時、血管内皮細胞の形状が間葉細胞と類似した形態に変化し（図２Ｇ）、内皮間葉転換マーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ発現も変化することを確認した（図２Ｈおよび図２Ｉ）。
【0066】
＜実施例３＞線維化シグナル伝達を調節して内皮間葉転換を阻害するＳＥＴ７／９の阻害
内皮間葉転換の下位シグナル伝達系を研究するために、代表的な線維化（ｐｒｏ－ｆｉｂｒｏｔｉｃ）シグナル伝達であるＴＧＦ－β－ＳＭＡＤ２／３とＮＦ－κＢシグナル伝達を研究した。ＴＧＦ－β２単独処理、およびＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理によるＳＭＡＤ２／３シグナル伝達をＳＥＴ７／９が調節するか否かを確認した。その結果、リン酸化されたＳＭＡＤ２／３がＴＧＦ－β２単独処理群よりもＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理群でより増加することを確認し、ＳＥＴ７／９ノックダウンによりこのシグナル伝達が阻害されることを確認した（図３Ａ）。また、ＳＥＴ７／９の過発現によりＳＭＡＤ２／３のリン酸化が増加することを確認した（図３Ｂ）。次に、免疫細胞化学染色法により、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理時に増加したｐ６５の発現がＳＥＴ７／９ノックダウンにより減少することを確認した（図３Ｃ）。細胞質と核に分画して確認した結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理により、細胞質ではリン酸化されたＩκＢαの発現が増加し、核ではＮＦ－κＢの蓄積が起こることを確認したが、これはいずれもＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復した（図３Ｄ）。
内皮間葉転換の下位シグナル伝達系を研究するために、代表的な線維化（ｐｒｏ－ｆｉｂｒｏｔｉｃ）シグナル伝達であるＴＧＦ－β－ＳＭＡＤ２／３とＮＦ－κＢシグナル伝達を研究した。ＴＧＦ－β２単独処理、およびＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理によるＳＭＡＤ２／３シグナル伝達をＳＥＴ７／９が調節するか否かを確認した。その結果、リン酸化されたＳＭＡＤ２／３がＴＧＦ－β２単独処理群よりもＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理群でより増加することを確認し、ＳＥＴ７／９ノックダウンによりこのシグナル伝達が阻害されることを確認した（図３Ａ）。また、ＳＥＴ７／９の過発現によりＳＭＡＤ２／３のリン酸化が増加することを確認した（図３Ｂ）。次に、免疫細胞化学染色法により、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理時に増加したｐ６５の発現がＳＥＴ７／９ノックダウンにより減少することを確認した（図３Ｃ）。細胞質と核に分画して確認した結果、ＴＧＦ－β２とＩＬ－１βの同時処理により、細胞質ではリン酸化されたＩκＢαの発現が増加し、核ではＮＦ－κＢの蓄積が起こることを確認したが、これはいずれもＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復した（図３Ｄ）。
【0067】
ＳＥＴ７／９は、ほとんど核よりも主に細胞質に位置するという研究結果があったため、ＰＡＥＣ、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、２９３Ｔ、ＭＣＦ７の５つの細胞において、核と細胞質に分画し、ＳＥＴ７／９の発現を確認した。その結果、２９３Ｔ、ＭＣＦ７と比較して、血管内皮細胞では、核よりも細胞質で高い発現を示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＳＥＴ７／９が認識してメチル化するＫ／Ｒ－Ｓ／Ｔ／Ａ－Ｋモチーフがｃａｎｏｎｉｃａｌ ＴＧＦ－β－ＳＭＡＤ２／３とＮＦ－κＢシグナル伝達に関連するタンパク質に存在するか否かを確認した（図４Ｃ）。このうち、ＴＧＦ－βＲ１の発現が内皮間葉転換誘導時に増加し、ＳＥＴ７／９ノックダウンにより調節された（図４Ｄ）。また、ＳＥＴ７／９の過発現によりＴＧＦ－βＲ１のタンパク質発現が増加することを確認した（図４Ｅ）。ＴＧＦ－βＲ１がＳＥＴ７／９のターゲットタンパク質であることを明らかにするために免疫沈降法を行い、先ず、内因性レベルでＳＥＴ７／９とＴＧＦ－βＲ１が結合していることを確認した（図４Ｆ）。ＴＧＦ－βＲ１がＳＥＴ７／９によりメチル化されることを確認するために、ＳＥＴ７／９野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＷＴ）とメチル化に重要なアミノ酸を変異させた変異型（Ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅ、ＭＴ）をそれぞれ過発現させ、メチル化抗体で免疫沈降した。その結果、ＳＥＴ７／９変異型（ＭＴ）を過発現させたグループでは、ＴＧＦ－βＲ１のメチル化が有意に減少したことを確認した（図４Ｇ）。
【0068】
＜実施例４＞内皮間葉転換による血管内皮細胞機能障害を回復させるＳＥＴ７／９の阻害
血管内皮細胞機能障害におけるＳＥＴ７／９の役割を確認するために、透過性分析（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、移動性分析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収分析（Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ ｕｐｔａｋｅ）実験を行った。内皮間葉転換誘導により増加した透過の程度がＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復することを確認した（図５Ａ）。また、ＳＥＴ７／９ノックダウンは、血管内皮細胞の移動性を減少させた（図５Ｂ）。内皮間葉転換が誘導されると、血管内皮細胞がリポタンパク質を吸収する能力が減少するが、これは、ＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復することを確認した（図５Ｃ）。
血管内皮細胞機能障害におけるＳＥＴ７／９の役割を確認するために、透過性分析（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、移動性分析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収分析（Ｄｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ ｕｐｔａｋｅ）実験を行った。内皮間葉転換誘導により増加した透過の程度がＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復することを確認した（図５Ａ）。また、ＳＥＴ７／９ノックダウンは、血管内皮細胞の移動性を減少させた（図５Ｂ）。内皮間葉転換が誘導されると、血管内皮細胞がリポタンパク質を吸収する能力が減少するが、これは、ＳＥＴ７／９ノックダウンにより回復することを確認した（図５Ｃ）。
【0069】
＜実施例５＞肺血管疾患と密接な関連がある内皮間葉転換
内皮間葉転換と肺血管疾患の関連性を確認するために、肺線維症と肺動脈高血圧の動物モデルを用いた。ブレオマイシン誘導肺線維症のマウスモデルの肺組織では、ヘマトキシリンエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）とＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（ＭＴＳ）により、コラーゲンと結合組織が増加したことを確認した（図６Ａおよび図６Ｂ）。ブレオマイシン誘導マウスの肺組織では、間葉細胞マーカーのタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。免疫組織化学染色法を用いて、ブレオマイシングループでは、血管内皮細胞マーカーｖＷＦと間葉細胞マーカーα－ＳＭＡが同時に染色される内皮間葉転換が起こった部分が増加したことを確認した（図６Ｅ）。また、ブレオマイシングループでは、ＳＥＴ７／９のタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加したことを免疫蛍光染色（図６Ｆ）、ウェスタンブロットとｑＲＴ－ＰＣＲ（図６Ｇ）で確認した。
内皮間葉転換と肺血管疾患の関連性を確認するために、肺線維症と肺動脈高血圧の動物モデルを用いた。ブレオマイシン誘導肺線維症のマウスモデルの肺組織では、ヘマトキシリンエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）とＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（ＭＴＳ）により、コラーゲンと結合組織が増加したことを確認した（図６Ａおよび図６Ｂ）。ブレオマイシン誘導マウスの肺組織では、間葉細胞マーカーのタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。免疫組織化学染色法を用いて、ブレオマイシングループでは、血管内皮細胞マーカーｖＷＦと間葉細胞マーカーα－ＳＭＡが同時に染色される内皮間葉転換が起こった部分が増加したことを確認した（図６Ｅ）。また、ブレオマイシングループでは、ＳＥＴ７／９のタンパク質とｍＲＮＡ発現が増加したことを免疫蛍光染色（図６Ｆ）、ウェスタンブロットとｑＲＴ－ＰＣＲ（図６Ｇ）で確認した。
【0070】
肺動脈高血圧の動物モデルとしてはＳｕｇｅｎ／ｈｙｐｏｘｉａ（ＳｕＨｘ）ラットモデルを用い、ＳｕＨｘグループの肺組織では、間葉細胞マーカーが著しく増加することをウェスタンブロットで確認した（図６Ｈ）。また、ＳＥＴ７／９の発現が血管で増加することを２つの免疫組織化学染色法を用いて確認した（図６Ｉおよび図６Ｊ）。
【0071】
＜実施例６＞ＳＥＴ７／９阻害剤シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）による内皮間葉転換の回復
シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）は、ＳＥＴ７／９を阻害する効果が報告されている薬物である。前記薬物の内皮間葉転換の阻害効果を確認するために、肺動脈血管内皮細胞にＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βとともにシプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を５、７日間同時処理するモデルを用いた。その結果、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ５）と、間葉細胞マーカーであるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＦＮ）、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ２）、ＳＭ２２α（ＴＡＧＬＮ）、ＳＮＡＩＬの発現が回復することをウェスタンブロット（図７Ａ）とｑＲＴ－ＰＣＲ（図７Ｂ）で確認した。シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）処理群では、内皮間葉転換の特徴である細胞骨格の変化が減少することをファロイジン染色により確認した（図７Ｃ）。内皮間葉転換により発生した内皮細胞機能障害である透過性の増加（図７Ｄ）およびＤｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収能力の低下（図７Ｅ）が、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）により回復することを確認した。この際、シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）により、内皮間葉転換誘導により増加したＴＧＦβＲ１の発現が回復し、下位シグナルであるＳＭＡＤ２／３のリン酸化の程度が減少することを確認した（図７Ｆ）。
シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）は、ＳＥＴ７／９を阻害する効果が報告されている薬物である。前記薬物の内皮間葉転換の阻害効果を確認するために、肺動脈血管内皮細胞にＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βとともにシプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を５、７日間同時処理するモデルを用いた。その結果、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ５）と、間葉細胞マーカーであるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＦＮ）、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ２）、ＳＭ２２α（ＴＡＧＬＮ）、ＳＮＡＩＬの発現が回復することをウェスタンブロット（図７Ａ）とｑＲＴ－ＰＣＲ（図７Ｂ）で確認した。シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）処理群では、内皮間葉転換の特徴である細胞骨格の変化が減少することをファロイジン染色により確認した（図７Ｃ）。内皮間葉転換により発生した内皮細胞機能障害である透過性の増加（図７Ｄ）およびＤｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収能力の低下（図７Ｅ）が、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）により回復することを確認した。この際、シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）により、内皮間葉転換誘導により増加したＴＧＦβＲ１の発現が回復し、下位シグナルであるＳＭＡＤ２／３のリン酸化の程度が減少することを確認した（図７Ｆ）。
【0072】
＜実施例７＞ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧の動物モデルにおけるＳＥＴ７／９阻害剤シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）の効果
ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧のラットにシプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を５ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間腹腔内投与したとき、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ ｍｍＨｇ）、右心室／左心室＋中隔比（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ％）、右心室重量（ＲＶ ｍｇ）が減少することを確認した（図８Ａ－Ｃ）。免疫組織化学染色の結果、ＳｕＨｘラット肺組織の約５０μｍサイズの血管に筋肉化（Ｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が見られるが、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）の投与時に筋肉化の程度が減少したことを確認した。ＳｕＨｘ肺組織では、内皮細胞と間葉細胞マーカーが同時に染色される内皮間葉転換現象が増加するが、このような現象が起こった血管では、ＳＥＴ７／９の発現が増加することを観察した。しかし、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）投与群では、血管のＳＥＴ７／９の発現が減少し、内皮細胞と間葉細胞マーカーの同時染色部分が減少することから、内皮間葉転換が阻害されたことを確認した（図８Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色により、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を投与したラットグループの肺組織における閉塞または肥大した血管がＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧グループに比べて減少したことを確認した（図８Ｅ）。シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を投与したラットグループの肺組織では、Ｎ－ｃａｄ、ＳＭ２２αのような間葉細胞マーカーとＳＥＴ７／９のターゲットタンパク質であるＴＧＦβＲ１の発現が減少し、リン酸化されたＳＭＡＤ２タンパク質の発現が有意に減少したことを確認した（図８Ｆ）。
ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧のラットにシプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を５ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間腹腔内投与したとき、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ ｍｍＨｇ）、右心室／左心室＋中隔比（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ％）、右心室重量（ＲＶ ｍｇ）が減少することを確認した（図８Ａ－Ｃ）。免疫組織化学染色の結果、ＳｕＨｘラット肺組織の約５０μｍサイズの血管に筋肉化（Ｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が見られるが、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）の投与時に筋肉化の程度が減少したことを確認した。ＳｕＨｘ肺組織では、内皮細胞と間葉細胞マーカーが同時に染色される内皮間葉転換現象が増加するが、このような現象が起こった血管では、ＳＥＴ７／９の発現が増加することを観察した。しかし、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）投与群では、血管のＳＥＴ７／９の発現が減少し、内皮細胞と間葉細胞マーカーの同時染色部分が減少することから、内皮間葉転換が阻害されたことを確認した（図８Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色により、シプロヘプタジン（ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を投与したラットグループの肺組織における閉塞または肥大した血管がＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧グループに比べて減少したことを確認した（図８Ｅ）。シプロヘプタジン（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）を投与したラットグループの肺組織では、Ｎ－ｃａｄ、ＳＭ２２αのような間葉細胞マーカーとＳＥＴ７／９のターゲットタンパク質であるＴＧＦβＲ１の発現が減少し、リン酸化されたＳＭＡＤ２タンパク質の発現が有意に減少したことを確認した（図８Ｆ）。
【0073】
＜実施例８＞ＳＥＴ７／９特異的阻害剤（Ｒ）－ＰＦＩ－２による内皮間葉転換の回復
（Ｒ）－ＰＦＩ－２は、ＳＥＴ７／９の基質ペプチド結合溝（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｏｖｅ）に結合して作用する競合阻害剤（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。したがって、ＳＥＴ７／９特異的阻害剤である（Ｒ）－ＰＦＩ－２による内皮間葉転換の回復効果を確認するために、肺動脈血管内皮細胞にＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βと（Ｒ）－ＰＦＩ－２を同時処理するモデルを用いた。その結果、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１と、間葉細胞マーカーであるＴＮＣ、ＦＮ、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、ＳＭ２２αの発現が回復することをウェスタンブロット（図９Ａ）で確認し、内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ１と、間葉細胞マーカーＦＮ、ＣＤＨ２、ＣＯＬ３Ａ１の発現が回復することをｑＲＴ－ＰＣＲ（図９Ｂ）で確認した。ファロイジン染色により、（Ｒ）－ＰＦＩ－２による細胞骨格の変化が減少（図９Ｃ）し、透過性（図９Ｄ）およびＤｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収能力（図９Ｅ）が回復することを確認した。
（Ｒ）－ＰＦＩ－２は、ＳＥＴ７／９の基質ペプチド結合溝（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｏｖｅ）に結合して作用する競合阻害剤（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。したがって、ＳＥＴ７／９特異的阻害剤である（Ｒ）－ＰＦＩ－２による内皮間葉転換の回復効果を確認するために、肺動脈血管内皮細胞にＴＧＦ－β２、ＩＬ－１βと（Ｒ）－ＰＦＩ－２を同時処理するモデルを用いた。その結果、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１と、間葉細胞マーカーであるＴＮＣ、ＦＮ、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、ＳＭ２２αの発現が回復することをウェスタンブロット（図９Ａ）で確認し、内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ１と、間葉細胞マーカーＦＮ、ＣＤＨ２、ＣＯＬ３Ａ１の発現が回復することをｑＲＴ－ＰＣＲ（図９Ｂ）で確認した。ファロイジン染色により、（Ｒ）－ＰＦＩ－２による細胞骨格の変化が減少（図９Ｃ）し、透過性（図９Ｄ）およびＤｉｌ－Ａｃ－ＬＤＬ吸収能力（図９Ｅ）が回復することを確認した。
【0074】
＜実施例９＞ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧の動物モデルにおけるＳＥＴ７／９特異的阻害剤（Ｒ）－ＰＦＩ－２の効果
動物モデルにおける（Ｒ）－ＰＦＩ－２効果を確認するために、ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧のラットに（Ｒ）－ＰＦＩ－２を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で３週間皮下投与した。（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与群では、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ ｍｍＨｇ）、右心室／左心室＋中隔比（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ％）、右心室重量（ＲＶ ｍｇ）が減少することを確認した（図１０Ａ－Ｃ）。免疫組織化学染色の結果、ＳｕＨｘラット肺組織血管の筋肉化が（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与時に有意に減少した。また、ＳｕＨｘ肺組織では、内皮間葉転換が起こった血管のＳＥＴ７／９の発現が高いことを観察したが、（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与群では、血管のＳＥＴ７／９の発現が減少し、内皮細胞と間葉細胞マーカーの同時染色部分が減少することから、内皮間葉転換が阻害されたことを確認した（図１０Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色により、（Ｒ）－ＰＦＩ－２を投与したラットグループの肺組織における閉塞または肥大した血管がＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧グループに比べて減少したことを確認した（図１０Ｅ）。（Ｒ）－ＰＦＩ－２を投与したラットグループの肺組織では、Ｔｗｉｓｔ、ｐＶＩＭのような間葉細胞マーカーとＳＥＴ７／９のターゲットタンパク質であるＴＧＦβＲ１の発現が減少し、リン酸化されたＳＭＡＤ２タンパク質の発現が有意に減少したことを確認した（図１０Ｆ）。
動物モデルにおける（Ｒ）－ＰＦＩ－２効果を確認するために、ＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧のラットに（Ｒ）－ＰＦＩ－２を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で３週間皮下投与した。（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与群では、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ ｍｍＨｇ）、右心室／左心室＋中隔比（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ％）、右心室重量（ＲＶ ｍｇ）が減少することを確認した（図１０Ａ－Ｃ）。免疫組織化学染色の結果、ＳｕＨｘラット肺組織血管の筋肉化が（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与時に有意に減少した。また、ＳｕＨｘ肺組織では、内皮間葉転換が起こった血管のＳＥＴ７／９の発現が高いことを観察したが、（Ｒ）－ＰＦＩ－２投与群では、血管のＳＥＴ７／９の発現が減少し、内皮細胞と間葉細胞マーカーの同時染色部分が減少することから、内皮間葉転換が阻害されたことを確認した（図１０Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色により、（Ｒ）－ＰＦＩ－２を投与したラットグループの肺組織における閉塞または肥大した血管がＳｕＨｘ誘導肺動脈高血圧グループに比べて減少したことを確認した（図１０Ｅ）。（Ｒ）－ＰＦＩ－２を投与したラットグループの肺組織では、Ｔｗｉｓｔ、ｐＶＩＭのような間葉細胞マーカーとＳＥＴ７／９のターゲットタンパク質であるＴＧＦβＲ１の発現が減少し、リン酸化されたＳＭＡＤ２タンパク質の発現が有意に減少したことを確認した（図１０Ｆ）。
【0075】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記載したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記載は単なる好ましい実施例にすぎず、これにより本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とこれらの等価物により定義されるといえる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図2i】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】