特表 2024-544690 Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-03

(54)【発明の名称】Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20241126BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20241126BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20241126BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12P13/08 A ZNA

C12N15/53

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024533878

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-06-05

(86)【国際出願番号】 KR2022011180

(87)【国際公開番号】W WO2023106543

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】10-2021-0173249

(32)【優先日】2021-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518431347

【氏名又は名称】デサン・コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ハ・ウン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ソン・ヒ・イ

(72)【発明者】

【氏名】ヨン・ジュ・イ

(72)【発明者】

【氏名】ボン・キ・キム

(72)【発明者】

【氏名】ソク・ヒョン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ジュン・ヒョン・パク

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE25

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

4B064DA20

4B065AA24X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA17

4B065CA41

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子のアミノ酸変異が誘導されて、酵素活性の改善によりＬ－リジンの生産収率が向上できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が改善されて、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。

【請求項2】

前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性改善は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子に位置特異的変異を誘発するものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。

【請求項3】

前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性改善は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子のアミノ酸配列内の３６番目、３７番目および１００番目のアミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸が置換されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。

【請求項4】

前記変異株は、配列番号３または５で表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。

【請求項5】

ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載の変異株を培地で培養するステップと、
ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－リジンは、人間や動物の体内で合成されない必須アミノ酸であって外部から供給されなければならず、一般的に、細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産される。Ｌ－リジンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－リジン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－リジンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して、優れたＬ－リジン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法が開発されている。

【0003】

韓国登録特許第１０－０８３８０３８号および第１０－２１３９８０６号によれば、Ｌ－リジンの生産に関連する酵素などを含むタンパク質を暗号化する遺伝子の塩基配列またはアミノ酸配列を変更してその遺伝子の発現を増加させたり不要な遺伝子を除去することにより、Ｌ－リジン生産能を向上させることができる。また、韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号には、Ｌ－リジンの生産に関与する酵素を暗号化する遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子の既存のプロモーターを強い活性を有するプロモーターに変更する方法を開示している。

【0004】

このようにＬ－リジン生産能を増加させる多様な方法が開発されているが、Ｌ－リジンの生産に直接間接的に関連づけられた酵素、転写因子、輸送タンパク質などタンパク質の種類が数十余種に達するため、このようなタンパク質の活性変化によるＬ－リジン生産能の増加の有無に関して依然として多くの研究が必要なのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国登録特許第１０－０８３８０３８号

【特許文献2】韓国登録特許第１０－２１３９８０６号

【特許文献3】韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。

【0007】

また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リジンの生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－リジン生産能が向上した新しい変異株を開発するために研究した結果、Ｌ－リジン生合成経路に関与するグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化するｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸を置換した場合、Ｌ－リジン生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。

【0009】

本発明の一態様は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性が改善されて、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。

【0010】

本発明で使用された「グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ）」は、エネルギー代謝のうち糖分解または糖合成に関与してグリセルアルデヒド３－リン酸（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と１，３－ビスホスホグリセリン酸（１，３－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）の可逆的な反応を触媒すると同時に、補酵素ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに還元したり、逆にこれを酸化する酵素を意味する。ＧＡＰＤＨは、補酵素の種類によってＧａｐＡ、ＧａｐＢおよびＧａｐＮの３つの亜型に区分される。ＧａｐＡは、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）でＮＡＤを用いてグリセルアルデヒド３－リン酸から１，３－ビスホスホグリセリン酸とＮＡＤＨを生産するだけでなく、ブドウ糖新生合成（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）でＮＡＤＨを用いて１，３－ビスホスホグリセリン酸からグリセルアルデヒド３－リン酸を生産する反応を触媒し、ＧａｐＢは、ＮＡＤとＮＡＤＰともによって活性化され、ブドウ糖新生合成でのみ作用する。ＧａｐＮは、ＮＡＤＰ依存的であり、ＡＴＰの生成なしにグリセルアルデヒド３－リン酸を１，３－ビスホスホグリセリン酸に変換する不可逆的酸化を触媒する。

【0011】

本発明では、リジン生合成過程に必要なＮＡＤＰＨを多量生産または供給するために、ＧａｐＡ活性を改善して、グリセルアルデヒド３－リン酸の変換においてＮＡＤの代わりにＮＡＤＰを用いてＮＡＤＰＨを生産する変異株を作製した。

【0012】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素は、ＧａｐＡであってもよい。

【0013】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デザーティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ウテレキー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・パケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ヒュミレデユセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム・マリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・カニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・レナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・カスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウム・フラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。

【0014】

本発明で使用された「活性が改善」は、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質が構造的に変形されて野生型菌株または変形前の菌株と異なる生産物またはタンパク質複合体を生産したり、または野生型菌株または変形前の菌株に比べて生産物またはタンパク質複合体の濃度が増加することを意味する。ここで、構造的に変形とは、タンパク質の基質または結合タンパク質に対する反応部位、例えば、酵素の活性サイト（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）が物理的に変更されることをいう。このような活性の改善は、タンパク質を暗号化する遺伝子内ヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性と異なったり、これに比べて増加した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現増加または翻訳増加などで細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて高い場合、これらの組み合わせも含む。

【0015】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性改善は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子に位置特異的変異を誘発するものであってもよい。

【0016】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるものであってもよい。

【0017】

また、本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されるものであってもよい。

【0018】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性改善は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子のアミノ酸配列内の１０～１３０番目のアミノ酸領域のうち１つ以上のアミノ酸が置換されたものであってもよい。

【0019】

より具体的には、本発明における遺伝子変異は、１０～１３０番目のアミノ酸領域のうち１個以上のアミノ酸、好ましくは２０～１２０番目、３０～１１０番目、３０～５０番目、または９０～１１０番目のアミノ酸領域のうち１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が連続的にまたは不連続的に置換されたものであってもよい。

【0020】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性改善は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子のアミノ酸配列内の３６番目、３７番目および１００番目のアミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸が置換されたものであってもよい。

【0021】

本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化するｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列において３６番目のサイトをロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）からセリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）に、３７番目のサイトをスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）からリジン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ）に置換して、ｇａｐＡ遺伝子の新しいアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号３のアミノ酸配列で表されるｇａｐＡ遺伝子を含むものであってもよい。

【0022】

また、本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化するｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列において３６番目のサイトをロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）からセリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）に、３７番目のサイトをスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）からリジン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ）に、１００番目のサイトをフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｐｈｅ）からバリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）に置換して、ｇａｐＡ遺伝子の新しいアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号５のアミノ酸配列で表されるｇａｐＡ遺伝子を含むものであってもよい。

【0023】

このように、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子またはこれを暗号化するアミノ酸配列に対する変異を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、Ｌ－リジン生産能が向上できる。

【0024】

本発明で使用された「生産能が向上した」は、親菌株に比べてＬ－リジンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になったり、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株または野生型から変異した菌株であってもよい。

【0025】

本発明の一実施例によれば、前記親菌株は、リジン生合成経路に関与するシトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（韓国出願番号第１０－２０２１－００５０３１８号）（以下、「コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株」という）であってもよい。

【0026】

本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化するｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸変異を含むことにより、Ｌ－リジン生合成に必要なＮＡＤＰＨの供給量が増加して、親菌株に比べて増加したＬ－リジン生産能を示し、特に親菌株に比べてＬ－リジン生産量が５％以上、具体的には５～２０％増加して、菌株培養液１ｌあたり７０ｇ以上、具体的には７０～８５ｇのＬ－リジンを生産することができる。

【0027】

本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親菌株にグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化するｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列が一部置換された変異体を含む組換えベクターにより実現できる。

【0028】

本発明で使用された「一部」は、アミノ酸配列、塩基配列またはポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0029】

本発明で使用された「変異体」は、Ｌ－リジンの生合成に関与するグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子のアミノ酸配列内の１０～１３０番目のアミノ酸領域のうち１つ以上のアミノ酸が置換された変異体を意味する。

【0030】

本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子のアミノ酸配列内の３６番目および３７番目のアミノ酸が置換された変異体は、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号４の塩基配列を有するものであってもよい。

【0031】

また、本発明の一具体例によれば、前記グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子のアミノ酸配列内の３６番目、３７番目および１００番目のアミノ酸が置換された変異体は、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号６の塩基配列を有するものであってもよい。

【0032】

本発明で使用された「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子の発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。

【0033】

本発明で使用された「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムに関係なく複製可能であったり、ゲノムそのものに縫い込まれる。この時、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製起点を含むことができる。

【0034】

前記形質転換は、宿主細胞に応じて好適なベクター導入技術が選択されて目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。

【0035】

前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。

【0036】

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例として、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0037】

本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換される。

【0038】

本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株であってもよい。

【0039】

また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法を提供する。

【0040】

前記培養は、当業界で知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0041】

本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。

【0042】

本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。さらに、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加されるが、これに限定されるものではない。

【0043】

本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常、２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続可能であり、例えば、１０～１６０時間であってもよい。

【0044】

本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップは、培養方法に応じて当該分野で公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－リジンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。

【0045】

本発明の一具体例によれば、リジンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。

【0046】

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リジンを回収するステップは、Ｌ－リジンを精製する工程を含むことができる。

【発明の効果】

【0047】

本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化する遺伝子のアミノ酸変異が誘導されて、酵素活性の改善によりＬ－リジンの生産収率が向上できる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】本発明の一実施例によりアミノ酸配列のうち３６番目のアミノ酸をロイシンからセリンに、３７番目のアミノ酸をスレオニンからリジンに置換したｇａｐＡ遺伝子を含むＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ１ベクターの構造を示す図である。

【図2】本発明の一実施例によりアミノ酸配列のうち３６番目のアミノ酸をロイシンからセリンに、３７番目のアミノ酸をスレオニンからリジンに、１００番目のアミノ酸をフェニルアラニンからバリンに置換したｇａｐＡ遺伝子を含むＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ２ベクターの構造を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0049】

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるのではない。

【0050】

実施例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性が改善されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、親菌株としてコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ^ＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。

【0051】

前記コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇおよび牛肉（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。

【0052】

前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。

【0053】

抗生剤カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）およびストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用した。

【0054】

ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。

【0055】

１－１．組換えベクターの作製
リジン生合成過程で必要なＮＡＤＰＨの供給を拡大してＬ－リジン生産性を増加させるために、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを生産するようにグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性を改善させた。本実施例で用いた方法は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化しているｇａｐＡ遺伝子に特異的変異を誘発した。ｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列のうち３６番目のアミノ酸をロイシンからセリンに、３７番目のアミノ酸をスレオニンからリジンに置換し、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノム上でｇａｐＡ遺伝子３６番目および３７番目のアミノ酸を含む部分を中心に左アーム４４２ｂｐ部分と右アーム５５２ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］参照）にクローニングした。前記プラスミドをＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ１と名付けた（図１参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表１のプライマーを使用した。

【0056】

【表1】

【0057】

以上のプライマーを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下で２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲを行う条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。

【0058】

このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の組換えに使用した。

【0059】

前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によりｐＣＧＩベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ６から選別した。染色体の遺伝子塩基置換（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、それぞれ断片の遺伝子を個別増幅して、オーバーラップＰＣＲで目的ＤＮＡ断片を製造した。遺伝子組換え時のＰＣＲ増幅酵素としてはＥｘ Ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用い、各種制限酵素およびＤＮＡ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を使用し、供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。

【0060】

１－２．変異株の製造
前記ＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ１を用いて変異菌株のＤＳ２－１菌株を製造した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように準備して、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて一次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシンが２０μｇ／μｌ含まれるＣＭ－寒天プレートに塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適切に挿入されたかをＰＣＲおよび塩基配列分析により確認した。このように分離された菌株を、再度二次組換えを誘導するために、ストレプトマイシンを含むＣＭ－寒天液体培地に接種し、一晩以上培養して同一濃度のストレプトマイシンを含む寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニー中でカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性のない菌株のうちｇａｐＡ遺伝子に変異が導入されたかを塩基配列分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に変異ｇａｐＡ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ２－１）を取得した。

【0061】

実施例２．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
リジン生合成過程で必要なＮＡＤＰＨの供給を拡大してＬ－リジン生産性を増加させるために、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを生産するようにグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性を改善させた。本実施例で用いた方法は、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素を暗号化しているｇａｐＡ遺伝子に特異的変異を誘発した。ｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列のうち３６番目のアミノ酸をロイシンからセリンに、３７番目のアミノ酸をスレオニンからリジンに、１００番目のアミノ酸をフェニルアラニンからバリンに置換し、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノム上でｇａｐＡ遺伝子３６番目および３７番目および１００番目のアミノ酸を含む部分を中心に左アーム４４２ｂｐ部分と右アーム３６０ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］参照）にクローニングした。前記プラスミドをＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ２と名付けた（図２参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表２のプライマーを使用した。

【0062】

【表2】

【0063】

以後、実施例１と同様の方法を行って、前記ＤＳ２－ｇａｐＡ－Ｐｍ２を用いて変異菌株のＤＳ２－２菌株を製造および取得した。

【0064】

実験例１．親菌株と変異株のＬ－リジン生産性の比較
親菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株と、実施例１および２で製造されたリジン生産変異株のＤＳ２－１およびＤＳ２－２菌株のＬ－リジン生産性を比較した。

【0065】

下記表３のような組成を有するリジン培地１０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコにそれぞれの菌株をそれぞれ接種し、３０℃で２８時間、１８０ｒｐｍの条件で振盪培養した。培養終了後、リジン分析はＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本）でＬ－リジンの生産量を測定し、その結果を下記表４に示した。

【0066】

【表3】

【0067】

【表4】

【0068】

前記表４に示しているように、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＳ２－１およびＤＳ２－２は、リジン生合成経路の強化のために、ｇａｐＡ遺伝子のアミノ酸配列の特定位置（３６番目および３７番目のアミノ酸、または３６番目、３７番目および１００番目のアミノ酸）が最適なアミノ酸残基に置換されることにより、親菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ２菌株に比べてＬ－リジンの生産性がそれぞれ約１２．５％および１１．１％増加したことが確認された。この結果を通して、ｇａｐＡ遺伝子変異がグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素の活性を改善することにより、菌株のＬ－リジン生産能を向上させることが分かった。

【0069】

以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024544690000001.xml

【国際調査報告】