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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-03
(54)【発明の名称】ポリヌクレオチドの低温等温増幅
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20241126BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20241126BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534185
(86)(22)【出願日】2022-12-07
(85)【翻訳文提出日】2024-08-07
(86)【国際出願番号】 US2022081085
(87)【国際公開番号】W WO2023107998
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/287,437
(32)【優先日】2021-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591177277
【氏名又は名称】マサチューセッツ インスチテュート オブ テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＳＳＡＣＨＵＳＥＴＴＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】アンジェネント－マリ，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】コリンズ，ジェームズ，ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ41
4B063QR01
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS34
(57)【要約】
いくつかの態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドの等温低温増幅のため、並びにその検出のための方法及び組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）プライマー結合配列を含む標的ポリヌクレオチドであって、前記プライマー結合配列がニッカーゼ認識配列を含む、標的ポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記プライマー結合配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を含むプライマーであって、（ｉ）前記プライマーが、３’ブロッキング分子をさらに含み、及び／又は（ｉｉ）前記ハイブリダイゼーション配列が、前記プライマー結合配列に相補的な８～１２個の連続したヌクレオチドからなる、プライマー、を含む組成物。
【請求項2】
前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ニッカーゼ認識配列が、ニッカーゼ認識配列の部分又は完全配列である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記プライマー結合配列が、前記標的ポリヌクレオチドの５’末端領域にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記標的ポリヌクレオチドが、前記プライマー結合配列の逆相補配列である追加の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記追加の配列が、前記標的ポリヌクレオチドの３’末端領域にある、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記３’ブロッキング分子が、３’ヘキサンジオール、３’ｄｄＣ、３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、３’炭素鎖スペーサー、３’アミノ、及び３’リン酸化から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記プライマーが、前記ニッカーゼ認識配列の５’側に安定化配列をさらに含み、任意選択で、前記安定化配列が、６～３０ヌクレオチド又は１８ヌクレオチドからなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記標的ポリヌクレオチドが、１００アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）未満の濃度で前記組成物中に存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
同種ニッカーゼ、一本鎖結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記同種ニッカーゼが、Nb.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、及びNt.BsmAIから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記一本鎖結合タンパク質が、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）、Ｔｔｈ ＲｅｃＡ、及びＥＴ ＳＳＢから選択される、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記鎖置換ポリメラーゼが、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｓｕ）、phi29、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Klenow Large Fragment、Klenow Exo-、Bsu Large Fragment、Isopol、及びIsopol SD+から選択される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
（ｉ）Ｃａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂタンパク質、（ｉｉ）検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた配列を含む検出器ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｃｒＲＮＡ、及び（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼをさらに含み、前記標的ポリヌクレオチドが、同種ＲＮＡポリメラーゼ結合配列をさらに含み、任意選択で、前記ｃｒＲＮＡが、前記標的ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに結合する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１４に記載の組成物を緩衝液中でインキュベートして、前記標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製することを含む方法。
【請求項16】
前記インキュベートすることが、摂氏約４度～摂氏約３０度又は摂氏約１６度～摂氏約２５度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記インキュベートすることが等温条件下である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記標的ポリヌクレオチドの前記複数のコピーを検出することをさらに含み、任意選択で、前記検出することが、特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を使用する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
請求項１３に記載の組成物を緩衝液中でインキュベートして、前記標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製することを含む方法。
【請求項20】
前記インキュベートすることが、摂氏約４度～摂氏約３０度又は摂氏約１６度～摂氏約２５度である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記インキュベートすることが等温条件下である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
前記標的ポリヌクレオチドの前記複数のコピーを、（ｉ）Ｃａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂタンパク質、（ｉｉ）検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた配列を含む検出器ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｃｒＲＮＡ、及び（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることをさらに含み、前記標的ポリヌクレオチドが、同種ＲＮＡポリメラーゼ結合配列をさらに含み、前記ｃｒＲＮＡが、前記標的ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに結合する配列を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記標的ポリヌクレオチドの前記複数のコピーを検出することをさらに含み、任意選択で、前記検出することが、特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を使用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１３に記載の組成物を緩衝液中でインキュベートして、前記標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製することを含む方法。
【請求項25】
前記インキュベートすることが、摂氏約４度～摂氏約３０度又は摂氏約１６度～摂氏約２５度である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記インキュベートすることが等温条件下である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記標的ポリヌクレオチドの前記複数のコピーを、Ｃａｓ１２ａタンパク質、ｃｒＲＮＡ、及び検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた検出器配列を含む検出器ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることをさらに含み、前記ｃｒＲＮＡが、前記標的ポリヌクレオチド又は前記標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合する配列を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記標的ポリヌクレオチドの前記複数のコピーを検出することをさらに含み、任意選択で、前記検出することが、特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を使用する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２８７，４３７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき利益を主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２８７，４３７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき利益を主張する。
【0002】
電子配列表の参照
電子配列表の内容（H049870749WO00-SEQ-HJD.xml；サイズ：７，１９６バイト；及び作成日：２０２２年１２月２日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子配列表の内容（H049870749WO00-SEQ-HJD.xml；サイズ：７，１９６バイト；及び作成日：２０２２年１２月２日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
背景
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックが継続中であるため、消費者に直接販売できる在宅ポイントオブケア（ＰＯＣ）核酸検査製品（ＮＡＴ）の必要性がますます明らかになってきている。ＮＡＴ関連技術の進歩を利用した一握りのこのような製品が市販されるようになっているが、利用可能な基盤技術に対する重要な改善が必要である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックが継続中であるため、消費者に直接販売できる在宅ポイントオブケア（ＰＯＣ）核酸検査製品（ＮＡＴ）の必要性がますます明らかになってきている。ＮＡＴ関連技術の進歩を利用した一握りのこのような製品が市販されるようになっているが、利用可能な基盤技術に対する重要な改善が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
本明細書において、いくつかの態様では、低温（例えば、１２～２５℃）でロバストである標的ポリヌクレオチドの等温増幅のための組成物及び方法が提供される。標的ポリヌクレオチドの低温等温増幅は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などの疾患に関連する標的ポリヌクレオチドを検出するための低コストの家庭用検査を実施するための重要なステップである。低温標的ポリヌクレオチド増幅は、少なくともある程度は、低温におけるプライマー二量体形成を阻害するように特別に設計されたプライマーを用いて達成される。
本明細書において、いくつかの態様では、低温（例えば、１２～２５℃）でロバストである標的ポリヌクレオチドの等温増幅のための組成物及び方法が提供される。標的ポリヌクレオチドの低温等温増幅は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などの疾患に関連する標的ポリヌクレオチドを検出するための低コストの家庭用検査を実施するための重要なステップである。低温標的ポリヌクレオチド増幅は、少なくともある程度は、低温におけるプライマー二量体形成を阻害するように特別に設計されたプライマーを用いて達成される。
【0005】
本明細書で提供されるプライマーは、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド上のプライマー結合配列に相補的である短い（例えば、１０～３０ヌクレオチド）ハイブリダイゼーション配列を含む。ハイブリダイゼーション配列は、いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列（例えば、ニッカ―ゼ認識配列の部分又は完全配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、ニッカーゼ認識配列の５’側にある安定化配列も含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、重合を終結させ、それによりプライマー二量体の増幅をブロッキングする３’ブロッキング分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ブロッキング分子は、以下に説明するように、プライマーの３’伸長を可能にするために、ニッカーゼ及び鎖置換ポリメラーゼを用いてプライマーから後に除去される。
【0006】
増幅及び検出される標的ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの５’末端の近傍（例えば、５０ヌクレオチド以内）に位置するプライマー結合配列、及び／又は３’末端の近傍（例えば、５０ヌクレオチド以内）に位置するプライマー結合配列を含む（例えば、含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、増幅及び検出される標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの３’末端に位置するプライマー結合配列を含む（例えば、含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドプライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列を含み、ニッカーゼ認識配列は、ニッカーゼ認識配列の部分配列又はニッカーゼ認識配列の完全配列であり得る。
【0007】
本明細書で提供される方法の一例は、図１Ａ～図１Ｊに描かれている。理論に拘束されることなく、プライマーは、まず標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列に結合する。例えば、プライマーは、ニッカーゼ認識配列を含む標的ポリヌクレオチド上のプライマー結合配列に結合し得る（図１Ａ）。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ポリヌクレオチドの５’末端から５０ヌクレオチド以内のプライマー結合配列に結合し、鎖置換ポリメラーゼは、３’から５’方向に伸長することによって、プライマーの逆相補配列を標的ポリヌクレオチドに付加する（図１Ｂ）。ニッカーゼは、いくつかの実施形態では、次いで、新たに形成された二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、プライマーにニックを入れ、これにより、鎖置換ポリメラーゼが３’ブロッキング分子を除去し、プライマーを伸長させることが可能になる（図１Ｃ～図１Ｄ）。標的ポリヌクレオチドの残りの部分の伸長は、プライマー安定化配列及びニッカーゼ認識配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを形成する（図１Ｅ）。標的ポリヌクレオチドの増幅は、ニッキングと伸長のサイクルを繰り返すことで続けることができる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、伸長中に置換された鎖を安定化させるために添加される（図１Ｆ）。いくつかの実施形態では、反復的なニッキング及び伸長は、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列の反復作製をもたらす（図１Ｇ）。いくつかの実施形態では、プライマーはまた、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合する（図１Ｈ）。いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合する。これは、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列のコピーのニッキング及び伸長をもたらし、標的ポリヌクレオチドのコピーを作製する（図１Ｉ～図１Ｊ）。これにより、標的ポリヌクレオチドが指数関数的に増幅される。いくつかの実施形態では、増幅によって作製される標的ポリヌクレオチド（又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列）のコピーは、例えば、本明細書に記載の検出方法を用いて検出される。従来の技術とは異なり、この増幅及び検出スキームは、低温での等温条件下でロバストである。
【0008】
本開示のいくつかの態様は：（ａ）プライマー結合配列を含む標的ポリヌクレオチドであって、プライマー結合配列が、ニッカーゼ認識配列を含む、標的ポリヌクレオチド；（ｂ）プライマー結合配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を含むプライマーであって、（ｉ）プライマーが、３’ブロッキング分子をさらに含み、及び／又は（ｉｉ）ハイブリダイゼーション配列が、プライマー結合配列に相補的な８～１２個の連続したヌクレオチドからなる、プライマーを含む組成物を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。
【0010】
いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列は、ニッカ―ゼ認識配列の部分又は完全配列である。
【0011】
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域にある。
【0012】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、プライマー結合配列の逆相補配列である追加の配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、追加の配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端領域にある。
【0014】
いくつかの実施形態では、３’ブロッキング分子は、３’ヘキサンジオール、３’ｄｄＣ、３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、３’炭素鎖スペーサー、３’アミノ、３’リン酸化から選択される。
【0015】
いくつかの実施形態では、プライマーは、ニッカーゼ認識配列の５’側に安定化配列をさらに含み、任意選択で、安定化配列は、６～３０個のヌクレオチド又は１８個のヌクレオチドからなる。
【0016】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、１００アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）未満の濃度で組成物中に存在する。
【0017】
いくつかの実施形態では、組成物は、同種ニッカーゼ、一本鎖結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、同種ニッカーゼは、Nb.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、及びNt.BsmAIから選択される。
【0019】
いくつかの実施形態では、一本鎖結合タンパク質は、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）、Ｔｔｈ ＲｅｃＡ、及びＥＴ ＳＳＢから選択される。
【0020】
いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｓｕ）、phi29、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Klenow Large Fragment、Klenow Exo-、Bsu Large Fragment、Isopol、及びIsopol SD+から選択される。
【0021】
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）Ｃａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂタンパク質、（ｉｉ）検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた配列を含む検出器ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｃｒＲＮＡ、及び（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼをさらに含み、標的ポリヌクレオチドは、同種ＲＮＡポリメラーゼ結合配列をさらに含み、ｃｒＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに結合する配列を含む。
【0022】
本開示の他の態様は、緩衝液中で本明細書で提供される組成物をインキュベートして標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製することを含む方法を提供する。
【0023】
いくつかの実施形態では、インキュベートすることは、約４℃～約５０℃、約４℃～約４５℃、約４℃～約４０℃、約４℃～約３５℃、約４℃～約３０℃、又は約１６℃～約２５℃である。
【0024】
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、等温条件下である。
【0025】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出することをさらに含み、任意選択で、検出することは、特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を使用する。
【0026】
本開示のさらに他の態様は、緩衝液中で本明細書で提供される組成物をインキュベートして標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製すること、次いで、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーをＣａｓ１２ａタンパク質、ｃｒＲＮＡ、及び検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた検出器配列を含む検出器ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることを含む方法を提供し、ｃｒＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合する配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出することをさらに含み、任意選択で、検出することは、特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を使用する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
図面の簡単な説明
【図2】図２は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘発ニッキングエンドヌクレアーゼ媒介鎖置換増幅（ＣＲＩＳＤＡ）プラットフォームが低温ではロバストではないことを示す。ＣＲＩＳＤＡは、既存のプライマー設計を使用した最新の周囲温度鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。ＣＲＩＳＤＡの文献（Zhou, Wenhua, et al. Nature Communications, vol. 9, no. 1, 2018）に記載されているものと同じ増幅反応を、プライマー長、プライマー濃度、及び一本鎖結合タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）濃度を示されているように変化させて行った。第２段階Ｃａｓ１２ａ検出反応からのシグナルの倍数変化は、異なる濃度のインプットｓｓＤＮＡトリガー（０アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）（ａＭ）、２０ａＭ、２ｆＭ、２００ｆＭ）で示されている。
【図3】図３は、プライマー長を短くすると、プライマー二量体の生成が減少することを示す。室温での鎖置換増幅（ＳＤＡ）プライマー二量体形成の経時変化。示された時点で（８０℃での熱殺滅によって）停止したＳＤＡ反応のアガロースゲル（４％）を、長さの異なる３対のプライマー（２０ヌクレオチド（ｎｔ）、１７ｎｔ、及び１４ｎｔ）について示されている。赤色の矢印と赤色の文字は、最初の開始プライマーよりも小さいニッカーゼ伸長産物の形成時期を示している。
【図4A】図４Ａ～図４Ｂは、９ｎｔの短いハイブリダイゼーション配列を有する新しいプライマーの設計を示す。図４Ａの左：プライマーは、ニッカーゼ認識配列（ＢｂｖＣＩ）が完全に重ならないよう二量体化するように設計されている。右：ニッカーゼ認識配列がハイブリダイゼーション配列から除外されるように二量体化するプライマーは、ニッカーゼ認識配列と指数関数的に自己増幅する二量体種を形成する。
【図4B】図４Ｂ：鎖置換増幅のための以前の設計は、ハイブリダイゼーション配列（黒色）並びにニッカーゼ認識配列（緑色）及び安定化配列（ピンク色）を有する２つのプライマーを採用している。これらのプライマーは、指数関数的に増幅する二量体種の形成を可能にするのに十分な長さである。しかしながら、本明細書に記載の改良された短い単一プライマーの設計は、不活性な非増幅二量体種のみを形成する。これは、プライマー結合配列（青色）を標的ポリヌクレオチドの３’末端及び５’末端に結合させることによって可能になる。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの３’末端及び５’末端におけるプライマー結合配列は同一の配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの３’末端及び５’末端におけるプライマー結合配列は異なる配列である。このときに、ニッカーゼ認識配列（緑色）も追加することができる。プライマー結合配列及びニッカーゼ認識配列は、バンププライマー（bump primer）、リガーゼスプリントなどの使用を含む様々な手段によって標的ポリヌクレオチドに付加することができる。標的特異的領域の除去及び２つのプライマーの統合により、通常は不可能である方法で短いプライマーを使用することが可能になる。
【図5】図５は、短いプライマーの設計が指数関数的なプライマー二量体の増幅をもたらさないことを示唆している。新しいプライマーの設計を使用する室温でのプライマー二量体形成の経時変化。示された時点で（８０℃での熱殺滅による）停止した反応のアガロースゲル（４％）は、単一の短縮された９ｎｔフォワードプライマーについて示されている。赤色の文字は、プライマー二量体の形成時期を示し、これは、特にニッカーゼ生成ではない（このような生成物は、劇的に大きくなるのではなく、開始プライマーよりも小さくなる）。
【図6A】図６Ａ～図６Ｂは、Ｃａｓ１２ａ及び短いプライマーを用いた一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）標的ポリヌクレオチドの周囲温度検出を示す。図６Ａは、Ｃａｓ１２ａを用いた標的ポリヌクレオチドの増幅及び検出のためのツーポット反応の概略図を示す。ｓｓＤＮＡ標的ポリヌクレオチドを、短いプライマーを用いて室温で２時間増幅した。増幅後、アンプリコン上のＰＡＭ含有配列を標的とするｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１２ａ複合体を反応液に添加し、フルオロフォアクエンチャーレポーター（検出器ポリヌクレオチドなど）を３０分間切断した。
【図7A】図７Ａ～図７Ｃは、Ｃａｓ１３ａを用いたｓｓＤＮＡ標的ポリヌクレオチドの周囲温度検出及び短いプライマーによる増幅を示す。図７Ａは、Ｃａｓ１３ａを用いたｓｓＤＮＡ標的ポリヌクレオチドのワンポット増幅及び検出を示す。ｓｓＤＮＡ標的ポリヌクレオチドを、プライマーを用いて室温で増幅し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）をシステムに添加した。増幅中、反応中に存在するｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３ａ複合体は、標的ポリヌクレオチドの転写されたＲＮＡコピーを検出し、それに応答してフルオロフォアクエンチャーレポーター（即ち、検出器ポリヌクレオチド）を切断した。実際の反応開始時間はｔ＝０の４５分前であった。
【図8】図８は、Ｃａｓ１３ａ及び３’ブロッキング分子を有するプライマーを用いた一本鎖標的ポリヌクレオチドの周囲温度検出を示す。一本鎖標的ポリヌクレオチドを、非ブロック３’ＯＨ又は３’ヘキサンジオールブロッキング分子のいずれかを有する短いプライマーを用いて、バックグラウンド一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（２５ｎＭ）の存在下又は非存在下、室温で増幅した。増幅中、反応中に存在するｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３ａ複合体は、標的ポリヌクレオチドの転写されたＲＮＡコピーを検出し、それに応答して検出器ポリヌクレオチドを切断した。実際の反応開始時間は、プレートリーダーに反応をセットする８０分前であった。単一反復の個々の経時変化が示されている（ｎ＝１）。
【発明を実施するための形態】
【0029】
詳細な説明
いくつかの態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドの等温低温増幅のための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、増幅の後に、標的ポリヌクレオチドのコピーの検出が続く。
いくつかの態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドの等温低温増幅のための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、増幅の後に、標的ポリヌクレオチドのコピーの検出が続く。
【0030】
組成物
本明細書において、いくつかの態様では、例えば、等温条件における周囲温度で標的ポリヌクレオチドを増幅するために使用できる組成物が提供される。組成物は、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように設計されたプライマー（例えば、目的の配列に隣接する）を含む。組成物は、いくつかの実施形態では、ニッカーゼ、一本鎖結合タンパク質、及び／又は鎖置換ポリメラーゼも含み、そのそれぞれを以下に説明する。
本明細書において、いくつかの態様では、例えば、等温条件における周囲温度で標的ポリヌクレオチドを増幅するために使用できる組成物が提供される。組成物は、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように設計されたプライマー（例えば、目的の配列に隣接する）を含む。組成物は、いくつかの実施形態では、ニッカーゼ、一本鎖結合タンパク質、及び／又は鎖置換ポリメラーゼも含み、そのそれぞれを以下に説明する。
【0031】
いくつかの実施形態では、増幅された標的ポリヌクレオチドの検出のための分子もまた、組成物に含まれるか、又は組成物に添加される。例えば、組成物は、検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた検出器ポリヌクレオチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。検出器ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼと共に、或いはＣａｓ１３エンドヌクレアーゼ及びＲＮＡポリメラーゼと共に組成物に含められる。検出器ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されているように、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ又はＣａｓ１３エンドヌクレアーゼの二次活性によって切断される。
【0032】
標的ポリヌクレオチド
本開示の方法を使用して、標的ポリヌクレオチドを増幅する。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドであり得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、又はリボソームＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは二本鎖である。さらに他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖である（即ち、一本鎖領域と二本鎖領域を含む）。
本開示の方法を使用して、標的ポリヌクレオチドを増幅する。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドであり得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、又はリボソームＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは二本鎖である。さらに他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖である（即ち、一本鎖領域と二本鎖領域を含む）。
【0033】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは病原体に由来する。病原体は、一般に、疾患を引き起こし得る細菌、ウイルス、又はその他の微生物であることが知られている。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ウイルスポリヌクレオチドである。例えば、標的ポリヌクレオチドは、非限定的な例の１つがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であるベータコロナウイルスなどのウイルスに由来し得る。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、細菌ポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、真菌ポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、原生生物又は寄生虫ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの検出が特定の病原体の存在を示すような病原体に特有である。
【0034】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、対象由来の（例えば、対象から得られた）試料中に存在する。「対象」には、限定されるものではないが、ヒト及びその他の非ヒト動物が含まれ、非ヒト動物には、例えば：イヌ、ネコ、家畜化されたブタ、フェレット、及びハムスターなどのコンパニオンアニマル；カニクイザルやアカゲザルなどの霊長類；及びウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、トリ（例えば、鶏、アヒル、ガチョウ、及び／又は七面鳥）などの農業動物が含まれる。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
【0035】
試料は、いくつかの実施形態では、血液、尿、唾液、及び粘液から選択される。いくつかの実施形態では、試料は血液試料である。他の実施形態では、試料は尿試料である。さらに他の実施形態では、試料は唾液試料である。さらに他の実施形態では、試料は粘液試料である。
【0036】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、標的ポリヌクレオチドのロバストな増幅をもたらす。標的ポリヌクレオチドのロバストな増幅は、標的ポリヌクレオチドを検出可能なレベルまで一貫して増幅する組成物及び方法を指す。一貫した増幅は、例えば、実施例２に例示するように、標的ポリヌクレオチドの増幅及び検出において再現できる成功によって証明されている。当業者は、ロバスト性は、組成物又は方法における標的ポリヌクレオチドの開始濃度に依存することを理解されよう。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法は、一般に、アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）量の標的ポリヌクレオチド、例えば、少なくとも２ａＭ、少なくとも３ａＭ、少なくとも４ａＭ、少なくとも５ａＭ、少なくとも１０ａＭ、少なくとも２０ａＭ、少なくとも５０ａＭ、又は少なくとも１００ａＭの標的ポリヌクレオチドをロバストに増幅及び検出することが期待される。
【0037】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、少なくとも２アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）（ａＭ）の濃度で試料中に存在する。例えば、標的ポリヌクレオチドは、少なくとも２ａＭ、少なくとも３ａＭ、少なくとも４ａＭ、少なくとも５ａＭ、少なくとも１０ａＭ、少なくとも２０ａＭ、少なくとも５０ａＭ、又は少なくとも１００ａＭの濃度で試料中に存在し得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、２～５ａＭ、２～１０ａＭ、２～２０ａＭ、２～４０ａＭ、２～１００ａＭ、５～１０ａＭ、５～２０ａＭ、５～４０ａＭ、５～１００ａＭ、１０～２０ａＭ、１０～５０ａＭ、２０～５０ａＭ、１０～１００ａＭ、５０～１００ａＭ、１～１０００ａＭ、５～１０００ａＭ、又は５０～１０００ａＭの濃度で試料中に存在する。いくつかの実施形態では、試料は、標的ポリヌクレオチドに加えて他の分子、例えば、他の非標的ポリヌクレオチドを含む。
【0038】
プライマー結合配列
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、１つ以上のプライマー結合配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含み得、第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列は、目的の配列に隣接している。目的の配列は、特異的に増幅される標的ポリヌクレオチド内の配列を指す。この配列は、検出中にＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ複合体によって結合される配列を含み得る。第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列は、一方のプライマー結合配列（又はその逆相補配列）が目的の配列の上流（５’側）にあり、他方のプライマー結合配列（又はその逆相補配列）が目的の配列の下流（３’側）にあるときに、目的の配列に「隣接」すると見なされる。この構成により、目的の介在配列のポリメラーゼベースの増幅が可能になる。「プライマー結合配列」を記述する実施形態は、「第１のプライマー結合配列」、「第２のプライマー結合配列の逆相補配列」、及び企図され得る任意の追加のプライマー結合配列を包含することを理解されたい。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、１つ以上のプライマー結合配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含み得、第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列は、目的の配列に隣接している。目的の配列は、特異的に増幅される標的ポリヌクレオチド内の配列を指す。この配列は、検出中にＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ複合体によって結合される配列を含み得る。第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列の逆相補配列は、一方のプライマー結合配列（又はその逆相補配列）が目的の配列の上流（５’側）にあり、他方のプライマー結合配列（又はその逆相補配列）が目的の配列の下流（３’側）にあるときに、目的の配列に「隣接」すると見なされる。この構成により、目的の介在配列のポリメラーゼベースの増幅が可能になる。「プライマー結合配列」を記述する実施形態は、「第１のプライマー結合配列」、「第２のプライマー結合配列の逆相補配列」、及び企図され得る任意の追加のプライマー結合配列を包含することを理解されたい。
【0039】
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、８～１２個の連続したヌクレオチドを含む。連続するヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの一次配列において連続するヌクレオチドであり、連続するヌクレオチド間に追加の介在ヌクレオチド又は他の分子は存在しない。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、９～１０、９～１１、９～１２、１０～１１、１０～１２、又は１１～１２個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、９～１１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個以上の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、８～１３、８～１４、８～１５、８～１６、８～１７、８～１８、８～１９、８～２０、８～２１、８～２２、８～２３、８～２４、８～２５、８～２６、８～２７、８～２８、８～２９、又は８～３０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、８個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、９個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、１０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、１１個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、１２個の連続したヌクレオチドを含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域内に位置する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域は、５’末端に最も近い７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域は、標的ポリヌクレオチドの５’末端に最も近い１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域から１０ヌクレオチド以内に位置する。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域から２５ヌクレオチド以内に位置する。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域から５０ヌクレオチド以内に位置する。
【0041】
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに結合されている。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端内に位置する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの３’末端は、３’末端に最も近い７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの３’末端は、３’末端に最も近い１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの３’末端は、標的ポリヌクレオチドの３’末端に最も近い１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端から１０ヌクレオチド以内に位置する。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端から２５ヌクレオチド以内に位置する。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端から５０ヌクレオチド以内に位置する。
【0042】
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、（以下に説明するように）ニッカ―ゼ認識配列の完全又は部分配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列の逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列は、５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’（Nb.BbvCI）、５’－ＧＣＴＣＴＴＣ－３’（Nt.BspQI）、５’－ＣＣＴ－３’、５’－ＣＣＧ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’（Nt.CviPII）、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.BstNBI）、５’－ＧＣＡＡＴＧＮＮ－３’（Nb.BsrDI）、５’－ＧＣＡＧＴＧＮＮ－３’（Nb.BtsI）、５’－ＧＧＡＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.AlwI）、５’－ＧＡＡＴＧＣＮ－３’（Nb.BsmI）、５’－ＣＡＣＧＡＧ－３’（Nb.BssSI）、及び５’－ＧＴＣＴＣＮＮ－３’（Nt.BsmAI）から選択される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、Nb.BbvCIによってニックを入れることができる’５－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、部分Nb.BbvCIニッカーゼ認識配列（太字）を含む
（配列番号１）の配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、目的の配列の５、１０、２５、又は５０塩基対以内、又は標的ポリヌクレオチドの５’末端にある。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、目的の配列の５、１０、２５、又は５０塩基対以内、又は標的ポリヌクレオチドの３’末端にある。
【化1】
【0043】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、プライマー結合配列及び追加の配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の配列は、プライマー結合配列の逆相補配列である。いくつかの実施形態では、追加の配列は、逆転写されるとき、プライマー結合配列と同じ配列である。したがって、いくつかの実施形態では、追加の配列は、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列上のプライマー結合配列である。いくつかの実施形態では、追加の配列は、上述したニッカ―ゼ認識配列の完全又は部分配列の逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の配列は、５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧ－３’ （配列番号２）の配列を含む。いくつかの実施形態では、追加の配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端領域内に位置する。いくつかの実施形態では、追加の配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端領域内に位置する。いくつかの実施形態では、追加の配列は、プライマー結合配列の逆相補配列ではない配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列及び追加の配列の逆相補配列は直交配列である。「直交」という用語は、相補配列を含む核酸分子と比較して、互いに相当程度にハイブリダイズするのに相補性が不十分である２つ以上の核酸分子を表す。
【0044】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＮＮＮ．．．ＮＮＮＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号６～７）の配列を含み、ＮＮＮ．．．ＮＮＮは目的の配列である。目的の配列は、いくつかの実施形態では、互いに逆相補配列であるプライマー結合配列（５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧ－３’（配列番号２）及び５’－ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１））に隣接する。当業者は、目的の配列の長さが変化し得ることを理解されよう。いくつかの実施形態では、目的の配列は、長さが１５～５０、１５～１００、１５～１５０、１５～２００、１５～３００、２０～５０、２０～１００、２０～１５０、２０～２００、２０～３００、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～３００、１００～１５０、１００～２００、又は１００～３００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的の配列は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的の配列は、長さが少なくとも１８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的の配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的の配列は、Ｃａｓ１２又はＣａｓ１３、又はそれらの変異体を用いて検出できる十分な長さである。
【0045】
プライマー結合配列の標的ポリヌクレオチドへの結合
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、公知の方法、例えば、制限酵素消化／ライゲーション又は平滑末端ライゲーションを用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gibson et al. ”Nature methods 6.5 (2009): 343-345に記載の等温ライゲーション方法を用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、Kershaw et al. Recombinant and In Vitro RNA Synthesis. Humana Press, Totowa, NJ, 2013. 257-269に記載されるようにスプリントライゲーションを用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、第１のプライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端に結合され、第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含む追加の配列が、標的ポリヌクレオチドの３’末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のプライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端に結合され、第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含む追加の配列が、標的ポリヌクレオチドの５’末端に結合される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドへのプライマー結合配列の結合は、等温及び低温条件で行われる。当業者は、追加の配列が、プライマー結合配列を標的ポリヌクレオチドに結合させるために使用される方法と同じ方法、又は実質的に類似の方法を用いて標的ポリヌクレオチドに結合され得ることを理解されよう。
いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、公知の方法、例えば、制限酵素消化／ライゲーション又は平滑末端ライゲーションを用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gibson et al. ”Nature methods 6.5 (2009): 343-345に記載の等温ライゲーション方法を用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、Kershaw et al. Recombinant and In Vitro RNA Synthesis. Humana Press, Totowa, NJ, 2013. 257-269に記載されるようにスプリントライゲーションを用いて標的ポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、第１のプライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの５’末端に結合され、第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含む追加の配列が、標的ポリヌクレオチドの３’末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のプライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドの３’末端に結合され、第２のプライマー結合配列の逆相補配列を含む追加の配列が、標的ポリヌクレオチドの５’末端に結合される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドへのプライマー結合配列の結合は、等温及び低温条件で行われる。当業者は、追加の配列が、プライマー結合配列を標的ポリヌクレオチドに結合させるために使用される方法と同じ方法、又は実質的に類似の方法を用いて標的ポリヌクレオチドに結合され得ることを理解されよう。
【0046】
ＲＮＡポリメラーゼ結合配列
いくつかの実施形態では、目的の増幅配列の検出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。このような実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含む安定化配列を含む増幅中のプライマーを用いて標的ポリヌクレオチドに付加される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、プライマー結合配列又は追加の配列の一部として標的ポリヌクレオチドに付加される。
いくつかの実施形態では、目的の増幅配列の検出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。このような実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含む安定化配列を含む増幅中のプライマーを用いて標的ポリヌクレオチドに付加される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、プライマー結合配列又は追加の配列の一部として標的ポリヌクレオチドに付加される。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、組成物に含まれるＲＮＡポリメラーゼと同種である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、細菌ＲＮＡポリメラーゼ結合配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ結合配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ結合配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、ＲＮＡポリメラーゼＶ、ＮｒビリオンＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合配列である。
【0048】
プライマー
本明細書で提供される方法は、１つ又は複数のプライマーを使用して標的ポリヌクレオチドを増幅する。例えば、組成物は、プライマーを含み得る。「プライマー」を説明する実施形態は、「第１のプライマー」、「第２のプライマー」、及び企図され得る任意の追加のプライマーを包含することを理解されたい。
本明細書で提供される方法は、１つ又は複数のプライマーを使用して標的ポリヌクレオチドを増幅する。例えば、組成物は、プライマーを含み得る。「プライマー」を説明する実施形態は、「第１のプライマー」、「第２のプライマー」、及び企図され得る任意の追加のプライマーを包含することを理解されたい。
【0049】
ハイブリダイゼーション配列
プライマーは、標的ポリヌクレオチドにおけるプライマー結合配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を含む。したがって、一本鎖標的ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列が結合するプライマー結合配列を含む（又は含むように修飾される）。プライマーの一本鎖標的ポリヌクレオチドへの結合及びその後のポリメラーゼベースの伸長に続いて、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列が作製される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列は、標的ポリヌクレオチドと同じプライマー結合配列を含む。これに続いて、同じプライマーが、一本鎖標的ポリヌクレオチド及び一本鎖標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合し得る。一本鎖標的ポリヌクレオチド及び逆相補配列の伸長は、標的ポリヌクレオチドの指数関数的な増幅をもたらす。
プライマーは、標的ポリヌクレオチドにおけるプライマー結合配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を含む。したがって、一本鎖標的ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列が結合するプライマー結合配列を含む（又は含むように修飾される）。プライマーの一本鎖標的ポリヌクレオチドへの結合及びその後のポリメラーゼベースの伸長に続いて、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列が作製される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの逆相補配列は、標的ポリヌクレオチドと同じプライマー結合配列を含む。これに続いて、同じプライマーが、一本鎖標的ポリヌクレオチド及び一本鎖標的ポリヌクレオチドの逆相補配列に結合し得る。一本鎖標的ポリヌクレオチド及び逆相補配列の伸長は、標的ポリヌクレオチドの指数関数的な増幅をもたらす。
【0050】
いくつかの実施形態では、組成物は、プライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、ハイブリダイゼーション配列を含む。ハイブリダイゼーション配列は、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列に相補的な配列を指す。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列に少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％）相補的である。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列に１００％相補的である。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ポリヌクレオチドの追加の配列（例えば、プライマー結合配列）の逆相補配列に相補的であるハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列である配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’（Nb.BbvCI）；５’－ＧＣＴＣＴＴＣ－３’（Nt.BspQI）；５’－ＣＣＴ－３’、５’－ＣＣＧ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’（Nt.CviPII）；５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.BstNBI）；５’－ＧＣＡＡＴＧＮＮ－３’（Nb.BsrDI）；５’－ＧＣＡＧＴＧＮＮ－３’（Nb.BtsI）；５’－ＧＧＡＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.AlwI）；５’－ＧＡＡＴＧＣＮ－３’（Nb.BsmI）；５’－ＣＡＣＧＡＧ－３’（Nb.BssSI）；及び５’－ＧＴＣＴＣＮＮ－３’（Nt.BsmAI）から選択される配列、又はこれらのニッカーゼ認識配列の１つの逆相補配列である配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、Nb.BbvCI（５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’）配列の逆相補配列である配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全又は部分配列（又はその逆相補配列）を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全又は部分配列（又はその逆相補配列）及び２、３、４、５、６、７、又は８個の追加のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全又は部分配列（又はその逆相補配列）及び２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、５～６、５～７、５～８、５～９、６～７、６～８、６～９、７～８、７～９、又は８～９個の追加のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全又は部分配列（又はその逆相補配列）及び４～６個の追加のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、９～１０、９～１１、９～１２、１０～１１、１０～１２、又は１１～１２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、９～１１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、８～１３、８～１４、８～１５、８～１６、８～１７、８～１８、８～１９、８～２０、８～２１、８～２２、８～２３、８～２４、８～２５、８～２６、８～２７、８～２８、８～２９、又は８～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、９、１０、又は１１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、９～１０、９～１１、又は１０～１１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、１０個のヌクレオチドを含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマーハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の部分配列を含み、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、第１のニッカーゼ認識配列の部分配列を含み、プライマー結合配列は、第２の部分認識配列を含み、第１のニッカーゼ認識配列の部分配列及び第２のニッカーゼ認識配列の部分配列は、伸長中に形成されるニッカーゼ認識配列の完全配列を一緒になって形成する。
【0052】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列及び追加の配列は、他方に対して逆相補配列ではない。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列及び追加の配列は、互いに直交している。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドの追加の配列の逆相補配列に相補的であり、標的ポリヌクレオチドのプライマー結合配列に相補的ではないハイブリダイゼーション配列を有する第２のプライマーを含む。
【0053】
安定化配列
いくつかの実施形態では、プライマーは、その５’末端から伸長した安定化配列をさらに含む。安定化配列は、プライマー結合に続く標的ポリヌクレオチド（又はその逆相補配列）の伸長のための鋳型を提供する（図１Ｂ）。加えて、いくつかの実施形態では、安定化配列は、プライマーがＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）によって伸長され得るように、ニッカーゼ切断後も、伸長した標的ポリヌクレオチドとの二本鎖を維持する（図１Ｃ及び図１Ｄを参照）。いくつかの実施形態では、安定化配列は、６～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、安定化配列は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、１６～２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ結合配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化配列は、５’－ＧＡＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＧＣ－３’（配列番号３）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、プライマーは、その５’末端から伸長した安定化配列をさらに含む。安定化配列は、プライマー結合に続く標的ポリヌクレオチド（又はその逆相補配列）の伸長のための鋳型を提供する（図１Ｂ）。加えて、いくつかの実施形態では、安定化配列は、プライマーがＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）によって伸長され得るように、ニッカーゼ切断後も、伸長した標的ポリヌクレオチドとの二本鎖を維持する（図１Ｃ及び図１Ｄを参照）。いくつかの実施形態では、安定化配列は、６～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、安定化配列は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、１６～２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、安定化配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ結合配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化配列は、５’－ＧＡＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＧＣ－３’（配列番号３）の配列を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、プライマーは、
（太字はハイブリダイゼーション配列）（配列番号４）の配列を含む。
【化2】
【0055】
ブロッキング分子
いくつかの実施形態では、プライマー、第１及び／又は第２のプライマーは、プライマーの３’末端の最後のヌクレオチド上にブロッキング分子を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキング分子は、プライマーの３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨ基を化学的に修飾することによってプライマーの３’方向への伸長をブロックする（例えば、伸長の進行を止める）。いくつかの実施形態では、３’ＯＨ化学修飾は、鎖置換ポリメラーゼがプライマーの３’末端ヌクレオチドに追加のヌクレオチドを付加するのをブロックする。いくつかの実施形態では、３’ブロッキング分子はまた、プライマー二量体の指数関数的な増幅を阻害し得る。
いくつかの実施形態では、プライマー、第１及び／又は第２のプライマーは、プライマーの３’末端の最後のヌクレオチド上にブロッキング分子を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキング分子は、プライマーの３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨ基を化学的に修飾することによってプライマーの３’方向への伸長をブロックする（例えば、伸長の進行を止める）。いくつかの実施形態では、３’ＯＨ化学修飾は、鎖置換ポリメラーゼがプライマーの３’末端ヌクレオチドに追加のヌクレオチドを付加するのをブロックする。いくつかの実施形態では、３’ブロッキング分子はまた、プライマー二量体の指数関数的な増幅を阻害し得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、３’ブロッキング分子は、プライマーの３’末端に結合すると、プライマーの３’方向への伸長をブロックする。いくつかの実施形態では、ブロッキング分子は、プライマーの３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨ基に結合する。いくつかの実施形態では、ブロッキング分子は、以下からなる群から選択される：
（１）３’ｄｄＮＴＰ（伸長に必要な３’ＯＨ基を有しないジデオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、又はｄｄＣＴＰ））、
（２）３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ（伸長を阻害する３’－３’結合を有する）、
（３）３’炭素鎖スペーサー（伸長に必要な３’ＯＨ基に結合した炭素鎖。スペーサーは、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上であり得る）、
（４）３’ヘキサンジオール（伸長に必要な３’ＯＨ基に結合するＣ６グリコール鎖）、
（５）３’アミノ（Ｃ１上にメトキシ基を有する４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上の炭素鎖スペーサー、及びスペーサー（４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上）の最後の炭素に結合したＮＨ２基である。アミノスペーサーは、伸長に必要な３’ＯＨ基に結合する）、及び
（６）３’リン酸化（伸長に必要な３’ＯＨに結合したリン酸基であるため、先行するヌクレオチドの５’リン酸基が、プライマー上の３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨに結合できない）。
（１）３’ｄｄＮＴＰ（伸長に必要な３’ＯＨ基を有しないジデオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、又はｄｄＣＴＰ））、
（２）３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ（伸長を阻害する３’－３’結合を有する）、
（３）３’炭素鎖スペーサー（伸長に必要な３’ＯＨ基に結合した炭素鎖。スペーサーは、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上であり得る）、
（４）３’ヘキサンジオール（伸長に必要な３’ＯＨ基に結合するＣ６グリコール鎖）、
（５）３’アミノ（Ｃ１上にメトキシ基を有する４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上の炭素鎖スペーサー、及びスペーサー（４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ、１１Ｃ、又は１２Ｃ以上）の最後の炭素に結合したＮＨ２基である。アミノスペーサーは、伸長に必要な３’ＯＨ基に結合する）、及び
（６）３’リン酸化（伸長に必要な３’ＯＨに結合したリン酸基であるため、先行するヌクレオチドの５’リン酸基が、プライマー上の３’末端ヌクレオチドの３’ＯＨに結合できない）。
【0057】
いくつかの実施形態では、ブロッキング分子は３’ヘキサンジオールである。
【0058】
ニッカーゼ
本明細書で提供される方法は、ニッカーゼを使用して、（１）プライマーの伸長中に３’ブロッキング基の除去を可能にするためにプライマーを含む二本鎖ＤＮＡにニックを入れ、且つ（２）伸長中の鎖置換を可能にするために二本鎖ポリヌクレオチドにニックを入れる。ニック、ニッキング、及びニックが入れられたはすべて、二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、標的ポリヌクレオチド）の一本鎖をニッカーゼによって切断することを指す。本明細書で用いるニッカーゼは、特定のニッカーゼ認識配列にニックを入れることができる。同種ニッカーゼという用語は、対応するニッカーゼ認識配列と対をなすニッカーゼを説明するために使用される。例えば、Nb.BbvCIは、５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’と同種である。
本明細書で提供される方法は、ニッカーゼを使用して、（１）プライマーの伸長中に３’ブロッキング基の除去を可能にするためにプライマーを含む二本鎖ＤＮＡにニックを入れ、且つ（２）伸長中の鎖置換を可能にするために二本鎖ポリヌクレオチドにニックを入れる。ニック、ニッキング、及びニックが入れられたはすべて、二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、標的ポリヌクレオチド）の一本鎖をニッカーゼによって切断することを指す。本明細書で用いるニッカーゼは、特定のニッカーゼ認識配列にニックを入れることができる。同種ニッカーゼという用語は、対応するニッカーゼ認識配列と対をなすニッカーゼを説明するために使用される。例えば、Nb.BbvCIは、５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’と同種である。
【0059】
いくつかの実施形態では、組成物は、ニッカーゼをさらに含む。ニッカーゼは、二本鎖ポリヌクレオチドに結合し、一方の鎖だけをニッキング（即ち、切断）することができる酵素である。ニッカーゼは、当該技術分野において周知であり、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Zhang et al. Protein expression and purification 69.2 (2010): 226-234; Higgins et al. Nucleic acids research 29.12 (2001): 2492-2501; Morgan et al. (2000): 1123-1125; Xu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 98.23 (2001): 12990-12995; Heiter et al. Journal of molecular biology 348.3 (2005): 631-640; Zhu et al. Journal of molecular biology 337.3 (2004): 573-583; 及び Samuelson et al. Nucleic acids research 32.12 (2004): 3661-3671に記載されている。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、標的ポリヌクレオチド及び／又はプライマー上のニッカーゼ認識配列と同種である。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、二本鎖標的ポリヌクレオチド産物にニックを入れ、これが、ポリメラーゼによる鎖の低温（例えば、４～３０℃又は１２～３０℃）の等温置換（isothermal displacement）に寄与する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、及びNt.BsmAIからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、Nb.BbvCIである。ニッカーゼは、認識配列：５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’（Nb.BbvCI）、５’－ＧＣＴＣＴＴＣ－３’（Nt.BspQI）、５’－ＣＣＴ－３’、５’－ＣＣＧ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’（Nt.CviPII）、５’－ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.BstNBI）、５’－ＧＣＡＡＴＧＮＮ－３’（Nb.BsrDI）、５’－ＧＣＡＧＴＧＮＮ－３’（Nb.BtsI）、５’－ＧＧＡＴＣＮＮＮＮＮ－３’（Nt.AlwI）、５’－ＧＡＡＴＧＣＮ－３’（Nb.BsmI）、５’－ＣＡＣＧＡＧ－３’（Nb.BssSI）、及び５’－ＧＴＣＴＣＮＮ－３’（Nt.BsmAI）と関連し得る。
【0060】
いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列である。ニッカーゼ認識配列の完全配列は、ニッカーゼによって認識されてニックが入れられる配列である。ニッカーゼ認識配列の完全配列は、同種ニッカーゼに依存する。例えば、Nb.BbvCIがニッカーゼである場合、５’－ＣＣＴＣＡＧＣ－３’は、ニッカーゼ認識配列の完全配列となる。Nt.CviPIIがニッカーゼである場合、５’－ＣＣＴ－３’、５’－ＣＣＧ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’が認識配列となる。いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列は、ニッカーゼ認識配列の部分配列である。部分認識配列は、完全認識配列の一部を有する配列である。ニッカーゼ認識配列の部分配列は、ニッカーゼに依存する。例えば、Nb.BbvCIがニッカーゼである場合、５’－ＣＣＴ－３’はニッカーゼ認識配列の部分配列となる。しかしながら、Nt.CviPIIがニッカーゼである場合、５’－ＣＣＴ－３’は部分認識配列ではない。ニッカーゼ部分認識配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列からの連続したヌクレオチドを含み、部分認識配列は、完全認識配列における最初又は最後のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列の部分配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列に含まれる１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個の連続したヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列の部分配列は、完全認識配列に含まれる少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は少なくとも９つ）のヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列の部分配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列に含まれるヌクレオチドの１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、５～６、５～７、５～８、５～９、６～７、６～８、６～９、７～８、７～９、又は８～９個のヌクレオチドを含まない。
【0061】
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマーハイブリダイゼーション配列は、ニッカーゼ認識配列の部分配列を含み、プライマー結合配列は、ニッカーゼ認識配列の完全配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、第１のニッカーゼ認識配列の部分配列を含み、プライマー結合配列は、第２の部分認識配列を含み、第１のニッカーゼ認識配列の部分配列及び第２のニッカーゼ認識配列の部分配列は、伸長中に形成されるニッカーゼ認識配列の完全配列を一緒に形成する。例えば、いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、
（配列番号１）の配列を含み、この配列は、部分Nb.BbvCIニッカーゼ認識配列（太字）を含み、これらの実施形態では、プライマーは、
（配列番号１）の逆相補配列であるハイブリダイゼーション領域を含んでもよく、プライマーは、ニッカーゼ認識配列の残りの部分の逆相補配列（太字）（
（配列番号５））をさらに含む。したがって、標的ポリヌクレオチドの伸長は、いくつかの実施形態では、ニッカーゼ認識配列の完全配列をもたらす。
【化3】
【化4】
【化5】
【0062】
鎖置換ポリメラーゼ
本明細書で提供される方法は、鎖置換ポリメラーゼを使用して標的ポリヌクレオチドを増幅する。したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、鎖置換ポリメラーゼをさらに含む。鎖置換ポリメラーゼは、伸長中に下流のＤＮＡを置換することができる。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、低温（例えば、４～２５℃）で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、１３～２５℃、１３～２４℃、１３～２３℃、１３～２２℃、１３～２１℃、１３～２０℃、１３～１９℃、１３～１８℃、１３～１７℃、１３～１６℃、又は１３～１５℃で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換酵素は、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、又は３０℃で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、室温で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｓｕ）、phi29、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Klenow Large Fragment、Klenow Exo-、Bsu Large Fragment、Isopol、及びIsopol SD+、又はそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｕ又はその変異体である。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Klenow又はその変異体である。
本明細書で提供される方法は、鎖置換ポリメラーゼを使用して標的ポリヌクレオチドを増幅する。したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、鎖置換ポリメラーゼをさらに含む。鎖置換ポリメラーゼは、伸長中に下流のＤＮＡを置換することができる。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、低温（例えば、４～２５℃）で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、１３～２５℃、１３～２４℃、１３～２３℃、１３～２２℃、１３～２１℃、１３～２０℃、１３～１９℃、１３～１８℃、１３～１７℃、１３～１６℃、又は１３～１５℃で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換酵素は、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、又は３０℃で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、室温で伸長活性を有する。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｓｕ）、phi29、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Klenow Large Fragment、Klenow Exo-、Bsu Large Fragment、Isopol、及びIsopol SD+、又はそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｕ又はその変異体である。いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、Klenow又はその変異体である。
【0063】
一本鎖結合タンパク質
本明細書で提供される方法は、一本鎖結合タンパク質を使用して、伸長中に置換された鎖を安定化させる。一本鎖結合タンパク質及びその適用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kur et al. Acta Biochimica Polonica 52.3 (2005): 569-574にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、組成物は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、鎖置換ポリメラーゼによって置換されたＤＮＡ鎖に結合する。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、共に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kur et al. Acta Biochimica Polonica 52.3 (2005): 569-574及びAlberts et al. Nature 227, 1313-1318 (1970)に記載されているように、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）、EcoSSB、TaqSSB、及びTthSSBからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、T4gp32である。
本明細書で提供される方法は、一本鎖結合タンパク質を使用して、伸長中に置換された鎖を安定化させる。一本鎖結合タンパク質及びその適用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kur et al. Acta Biochimica Polonica 52.3 (2005): 569-574にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、組成物は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、鎖置換ポリメラーゼによって置換されたＤＮＡ鎖に結合する。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、共に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kur et al. Acta Biochimica Polonica 52.3 (2005): 569-574及びAlberts et al. Nature 227, 1313-1318 (1970)に記載されているように、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇｐ３２）、EcoSSB、TaqSSB、及びTthSSBからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＳＢＰは、T4gp32である。
【0064】
緩衝液
本明細書で提供される方法及び組成物は、標的ポリヌクレオチドの増幅及び／又は検出に適した反応条件を提供する緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＮＡ増幅のための緩衝液中に存在することを当業者が理解するであろう成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドの等温低温増幅が起こり得る緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリス又は酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、カリウムイオン（Ｋ＋）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸カリウム又は塩化カリウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ポリメラーゼ連鎖反応エンハンサー（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ウシ血清アルブミン、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、ゼラチン、トゥイーン２０、トリトンＸ－１００、又はＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン（ベタイン））を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ポリメラーゼは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、CutSmart緩衝液を含む。
本明細書で提供される方法及び組成物は、標的ポリヌクレオチドの増幅及び／又は検出に適した反応条件を提供する緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＮＡ増幅のための緩衝液中に存在することを当業者が理解するであろう成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドの等温低温増幅が起こり得る緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリス又は酢酸塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、カリウムイオン（Ｋ＋）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸カリウム又は塩化カリウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ポリメラーゼ連鎖反応エンハンサー（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ウシ血清アルブミン、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、ゼラチン、トゥイーン２０、トリトンＸ－１００、又はＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン（ベタイン））を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ポリメラーゼは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、緩衝液中で活性である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、CutSmart緩衝液を含む。
【0065】
増幅されたポリヌクレオチドの検出
いくつかの態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドを増幅し、次いでその複数のコピーを検出することによって標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、標的ポリヌクレオチドを増幅し、次いでその複数のコピーを検出することによって標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法を提供する。
【0066】
後述するように、検出は、ワンポット反応又はツーポット反応で行うことができる。ワンポット反応において、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅及び検出のための試薬は、インキュベーション全体を通して存在する。ワンポット反応において、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドのコピーは、ＲＮＡに転写され、次いでＲＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）によって検出される。Ｃａｓ１３は、検出中にＲＮＡを切断し、Ｃａｓ１３の二次活性も、検出器ポリヌクレオチドを切断する。Ｃａｓタンパク質の二次活性は、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ複合体がｃｒＲＮＡによって特定された標的（例えば、標的ポリヌクレオチド）を切断しているときに起こる核酸（例えば、検出器ポリヌクレオチド）の非特異的切断である。二次活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Varble et al. ”Trends in Genetics 35.6 (2019): 446-456に詳細に論じられている。ツーポット反応において、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド増幅用の試薬を、まず組成物に添加し、続いてインキュベーションを行う。インキュベーション（及び恐らく標的ポリヌクレオチドの増幅）後、検出用の試薬を組成物に添加する。いくつかの実施形態では、検出用の試薬は、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２）を含む。Ｃａｓ１２は、検出中に標的ポリヌクレオチドのコピーを切断する。したがって、Ｃａｓ１２は、増幅プロセスを中断しないように、インキュベーション及び増幅後に添加することができる。
【0067】
ワンポット反応
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅と標的ポリヌクレオチドのコピーの検出の両方が、同じ反応（例えば、ワンポット反応）で行われる。標的ポリヌクレオチドのコピーは、いくつかの実施形態では、ＲＮＡに転写され、次いでＲＮＡ結合分子（例えば、Ｃａｓ１３）によって検出される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子は、標的ポリヌクレオチドのコピーから転写されたＲＮＡ、又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列から転写されたＲＮＡを特異的に認識する。このような実施形態では、組成物は、ＲＮＡポリメラーゼ（上述した）をさらに含み、標的ポリヌクレオチドは、上述したようにＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子は、標的ポリヌクレオチドのコピーから転写されたＲＮＡを特異的に認識するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡに結合すると、検出可能な分子（以下に説明）を活性化するヌクレアーゼ二次活性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ１３である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、又はＣａｓ１３ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されるようなＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、又はＡｓＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＬｂｕＣａｓ１３ａである。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーから転写されたＲＮＡに相補的であるｃｒＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ１３ａ）と複合体を形成し、分解のためにＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをＲＮＡに誘導する。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅と標的ポリヌクレオチドのコピーの検出の両方が、同じ反応（例えば、ワンポット反応）で行われる。標的ポリヌクレオチドのコピーは、いくつかの実施形態では、ＲＮＡに転写され、次いでＲＮＡ結合分子（例えば、Ｃａｓ１３）によって検出される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子は、標的ポリヌクレオチドのコピーから転写されたＲＮＡ、又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列から転写されたＲＮＡを特異的に認識する。このような実施形態では、組成物は、ＲＮＡポリメラーゼ（上述した）をさらに含み、標的ポリヌクレオチドは、上述したようにＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子は、標的ポリヌクレオチドのコピーから転写されたＲＮＡを特異的に認識するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合分子はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡに結合すると、検出可能な分子（以下に説明）を活性化するヌクレアーゼ二次活性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ１３である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、又はＣａｓ１３ｄからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されるようなＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、又はＡｓＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＬｂｕＣａｓ１３ａである。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーから転写されたＲＮＡに相補的であるｃｒＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ１３ａ）と複合体を形成し、分解のためにＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをＲＮＡに誘導する。
【0068】
いくつかの実施形態では、組成物は、検出器ポリヌクレオチドを含む。検出器ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコピー及び／又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、検出器分子は、一方の末端（５’又は３’）にクエンチャー分子を含み、他方の末端に検出可能な分子（例えば、アイオワブラック－ＲＱ、ブラックホールクエンチャー－１、ブラックホールクエンチャー－２、及びアイオワブラック－ＺＥＮ ＦＱ）、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、６－ＦＡＭ、Ｔｙｅ５６３、Ｃｙ３、ＡＴＴＯ５５０、ＴＡＭＲＡ５８３、ＡＴＴＯ５６５、ＲＯＸ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＴＥＸ６１５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、ＴＹＥ６６５、又はＣｙ５）を含む検出器ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１３による標的ポリヌクレオチドの複数のコピーの結合及び切断を検出する。検出器ポリヌクレオチドは、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓガイドＲＮＡ複合体（即ち、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１２）が標的ポリヌクレオチドのコピーに結合して切断するときに、この複合体の二次活性によって切断される。いくつかの実施形態では、クエンチャー分子は、アイオワブラック－ＲＱ、ブラックホールクエンチャー－１、ブラックホールクエンチャー－２、及びアイオワブラック－ＺＥＮ ＦＱからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、Ｔｙｅ５６３、Ｃｙ３、ＡＴＴＯ５５０、ＴＡＭＲＡ５８３、ＡＴＴＯ５６５、ＲＯＸ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＴＥＸ６１５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、ＴＹＥ６６５、及びＣｙ５からなる群から選択され、クエンチャー分子は、アイオワブラック及びブラックホールクエンチャー－２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ．６－ＦＡＭ、ＡＴＴＯ４８８、ＴＥＴｉ５３９、ＪＯＥ、ＨＥＸ、及びＡＴＴＯ５３２からなる群から選択され、クエンチャー分子は、ブラックホールクエンチャー－１及びアイオワブラック－ＺＥＮ ＦＱからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、６－ＦＡＭフルオロフォア及びブラックホールクエンチャー－１を含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５～１０、５～１５、５～２０、１０～１５、１０～２０、又は１５～２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、ｐｏｌｙＵ（ポリウラシル）配列（例えば、５～２０個の連続したウラシルヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上の連続したウラシルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５～１０、５～１５、５～２０、１０～１５、１０～２０、又は１５～２０個の連続したウラシルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１３二次活性によって切断され得る。
【0069】
上述したように、ワンポット検出の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を含むか、又はこれを含むように修飾することができ、このＲＮＡポリメラーゼ結合配列を使用して、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）による検出のために標的ポリヌクレオチドの増幅コピーをＲＮＡに転写する。転写を行うために、いくつかの実施形態では、ワンポット反応は、ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、同種ＲＮＡポリメラーゼである。同種ＲＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド上のＲＮＡポリメラーゼ結合配列に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、細菌ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、ＲＮＡポリメラーゼＶ、Ｎｒ ｖｉｒｉｏｎ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
【0070】
ツーポット反応
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅及び標的ポリヌクレオチドのコピーの検出は、別個の反応又は連続的な反応で行われる。このような反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーは、ＤＮＡ結合分子を用いて直接検出することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドのコピー又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列を特異的に認識するＤＮＡ結合分子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合すると、検出器分子を切断するヌクレアーゼ二次活性を有する（後述）。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ１２である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、ＬｂａＣａｓ１２ａ又はＡｓＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド又はそのアンプリコンに相補的なガイドＲＮＡをさらに含む。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ１２ａ）と複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを標的ポリヌクレオチド又はそのアンプリコンに誘導して分解する。いくつかの実施形態では、ツーポット反応における検出は、検出試薬がインキュベーション後に組成物に添加されることを除いて、上述したようにＣａｓ１３を用いて達成することができる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅及び標的ポリヌクレオチドのコピーの検出は、別個の反応又は連続的な反応で行われる。このような反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーは、ＤＮＡ結合分子を用いて直接検出することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチドのコピー又は標的ポリヌクレオチドの逆相補配列を特異的に認識するＤＮＡ結合分子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合すると、検出器分子を切断するヌクレアーゼ二次活性を有する（後述）。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＣａｓ１２である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、ＬｂａＣａｓ１２ａ又はＡｓＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、組成物は、標的ポリヌクレオチド又はそのアンプリコンに相補的なガイドＲＮＡをさらに含む。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ１２ａ）と複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを標的ポリヌクレオチド又はそのアンプリコンに誘導して分解する。いくつかの実施形態では、ツーポット反応における検出は、検出試薬がインキュベーション後に組成物に添加されることを除いて、上述したようにＣａｓ１３を用いて達成することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、組成物は、５’又は３’末端のクエンチャー及び他方の末端のフルオロフォアを含む検出器ポリヌクレオチドを含む。検出器ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド又はそのアンプリコンの結合及び切断時に、ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓガイドＲＮＡ複合体によって切断される。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドのクエンチャーは、アイオワブラック－ＲＱ、ブラックホールクエンチャー－１、ブラックホールクエンチャー－２、及びアイオワブラック－ＺＥＮ ＦＱからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、Ｔｙｅ５６３、Ｃｙ３、ＡＴＴＯ５５０、ＴＡＭＲＡ５８３、ＡＴＴＯ５６５、ＲＯＸ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＴＥＸ６１５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、ＴＹＥ６６５、及びＣｙ５からなる群から選択され、クエンチャーは、アイオワブラック及びブラックホールクエンチャー－２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ、６－ＦＡＭ、ＡＴＴＯ４８８、ＴＥＴｉ５３９、ＪＯＥ、ＨＥＸ、及びＡＴＴＯ５３２からなる群から選択され、クエンチャーは、ブラックホールクエンチャー－１及びアイオワブラック－ＺＥＮ ＦＱからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、６－ＦＡＭフルオロフォア及びブラックホールクエンチャー－１を含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼが組成物に添加されるのと同時に組成物に添加される。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、５～１０、５～１５、５～２０、１０～１５、１０～２０、又は１５～２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２二次活性によって切断され得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、検出は、以下に説明するようにＳＨＥＲＬＯＣＫを用いて達成される。
【0073】
Sherlock検出
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されるように特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）システムを用いて検出される。ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムは、増幅された標的ポリヌクレオチドＤＮＡの存在がＣａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂ酵素のヌクレアーゼ二次活性を誘導するように、標的ポリヌクレオチドの複数のコピー内の配列を標的とするＣａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂ酵素のＲＮＡガイドを含み得る。ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムはまた、増幅された標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いるＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡの存在が、Ｃａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂ酵素のヌクレアーゼ二次活性を誘導するように、標的ポリヌクレオチドの複数のコピー内の配列を標的とするＣａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂ酵素のＲＮＡガイドを含み得る。いずれのシステムでも、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３ａ、又はＣａｓ１３ｂのヌクレアーゼ活性の検出は、検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた配列を含む標的ポリヌクレオチドの切断によって達成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ベースのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイをワンポット反応に使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２又はＣａｓ１３ベースのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイをツーポット反応に使用することができる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kellner et al. Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012に記載されるように特異的高感度酵素レポーターロック解除（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）システムを用いて検出される。ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムは、増幅された標的ポリヌクレオチドＤＮＡの存在がＣａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂ酵素のヌクレアーゼ二次活性を誘導するように、標的ポリヌクレオチドの複数のコピー内の配列を標的とするＣａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｂ酵素のＲＮＡガイドを含み得る。ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムはまた、増幅された標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いるＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡの存在が、Ｃａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂ酵素のヌクレアーゼ二次活性を誘導するように、標的ポリヌクレオチドの複数のコピー内の配列を標的とするＣａｓ１３ａ又はＣａｓ１３ｂ酵素のＲＮＡガイドを含み得る。いずれのシステムでも、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１３ａ、又はＣａｓ１３ｂのヌクレアーゼ活性の検出は、検出可能な分子とクエンチャー分子に挟まれた配列を含む標的ポリヌクレオチドの切断によって達成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ベースのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイをワンポット反応に使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２又はＣａｓ１３ベースのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイをツーポット反応に使用することができる。
【0074】
方法
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を用いて標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法を提供する。本明細書で使用される複数のコピーは、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピー（例えば、少なくとも２つ、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、又は少なくとも１０９個のコピー）を指す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を用いて検出するのに十分である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法は、指数関数的な増幅である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を用いて標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法を提供する。本明細書で使用される複数のコピーは、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピー（例えば、少なくとも２つ、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、又は少なくとも１０９個のコピー）を指す。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＳＨＥＲＬＯＣＫ）を用いて検出するのに十分である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製する方法は、指数関数的な増幅である。
【0075】
いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の組成物を緩衝液中でインキュベートして、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製することを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを作製するために標的ポリヌクレオチドの増幅を支持するのに十分である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの増幅は、少なくとも以下の成分が緩衝液に混合されたときに開始され得る：標的ポリヌクレオチド、プライマー、ＳＳＢＰ、ニッカーゼ、及び鎖置換ポリメラーゼ。
【0076】
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、等温条件（即ち、等温インキュベーション）である。等温条件は、インキュベーションの間、全く又はほとんど変化しない温度で行われる。いくつかの実施形態では、室温インキュベーションは等温条件である。いくつかの実施形態では、等温条件は、温度が摂氏約２度、３度、４度、５度、又は６度変化し得る。いくつかの実施形態では、等温インキュベーション中の温度の変動は、標的ポリヌクレオチドの増幅又は検出に必要ではない。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約１℃～約９９℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～３７℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～３０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～２０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～１５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４℃～１０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１２℃～３０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１６℃～３０℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１２℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１３℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１４℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１５℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１６℃～２５℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは１６℃～２２℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０℃である。
【0077】
いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１０分（例えば、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、又は少なくとも１２時間）である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、１０～３０分、１０～５０分、１０～６０分、３０～６０分、３０～９０分、３０～１２０分、３０～１８０分、３０～２４０分である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、１～２時間、１～３時間、１～４時間、１～６時間、２～３時間、２～４時間、２～５時間、２～６時間、３～４時間、３～５時間、３～６時間、４～５時間、又は４～６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約２時間である。
【0078】
いくつかの実施形態では、この方法は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ｃａｓ１２又はＣａｓ１３タンパク質、標的ポリヌクレオチドに相補的であるｃｒＲＮＡ、及び検出器ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、検出器ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２又はＣａｓ１３タンパク質が標的ポリヌクレオチドの複数のコピー又は標的ポリヌクレオチドの複数のコピーをコードするＲＮＡを切断するときに切断される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出するための試薬は、インキュベーションが開始されるときに組成物中に存在する（例えば、上述のワンポット反応）。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出するための試薬は、試料が添加されるときに組成物中に存在する（例えば、上述のワンポット反応）。
【0079】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを検出するための試薬は、指定時間のインキュベーション（例えば、上述したようなツーポット反応）の後に添加される。検出剤を添加するための指定時間は、上述のインキュベーション時間のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、検出試薬は、増幅後少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、又は少なくとも１２０分添加される。いくつかの実施形態では、検出剤は、約２時間のインキュベーション後に添加される。
【0080】
いくつかの実施形態では、検出は、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いて行われる。
【0081】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーの検出は、組成物の色の変化を識別することによって視覚的に決定される。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドの複数コピーの検出は、蛍光光度計を用いて決定される。
【実施例】
【0082】
実施例１：ＣＲＩＳＤＡプラットフォームは低温増幅ではロバストではない
Ｚｈｏｕらの主張に反して、ＣＲＩＳＤＡプラットフォームは、２５℃で２２０ａＭのｄｓＤＮＡ標的をロバストに増幅も検出もしない（Zhou et al. Nature Comm. vol. 9, no. 1, 2018, Supplementary Figure 4）。この単一の実験を再現する試みでは、ｓｓＤＮＡ標的の有効検出限界は、プライマー濃度及び一本鎖結合タンパク質濃度の両方の最適化にもかかわらず、主張されているよりも約３桁悪いことが判明した（図２）。
Ｚｈｏｕらの主張に反して、ＣＲＩＳＤＡプラットフォームは、２５℃で２２０ａＭのｄｓＤＮＡ標的をロバストに増幅も検出もしない（Zhou et al. Nature Comm. vol. 9, no. 1, 2018, Supplementary Figure 4）。この単一の実験を再現する試みでは、ｓｓＤＮＡ標的の有効検出限界は、プライマー濃度及び一本鎖結合タンパク質濃度の両方の最適化にもかかわらず、主張されているよりも約３桁悪いことが判明した（図２）。
【0083】
実施例２：低温使用のための鎖置換増幅
従来の鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応は、相反するニッカーゼ認識配列を含むｄｓＤＮＡ産物から始まる３段階のプロセスに依存していた。第１に、ニッカーゼが標的配列で切断し、遊離３’ＯＨ末端が利用可能になる。第２に、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、遊離３’ＯＨから伸長し、ｄｓＤＮＡ二本鎖の上の鎖をニックが入れられた配列以降を置換する。第３に、プライマーが、ニッカーゼ認識配列に逆相補的な方向に結合し、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーを伸長させ、初期ｄｓＤＮＡのコピーを生成する。このようにして、ｄｓＤＮＡが、後に再び二本鎖を形成し得るｓｓＤＮＡコピーを生成するニッキングと伸長の事象で指数関数的に増幅される。しかしながら、このＳＤＡ反応は、低温（例えば、約２５℃未満）ではロバストに行われない。
従来の鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応は、相反するニッカーゼ認識配列を含むｄｓＤＮＡ産物から始まる３段階のプロセスに依存していた。第１に、ニッカーゼが標的配列で切断し、遊離３’ＯＨ末端が利用可能になる。第２に、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、遊離３’ＯＨから伸長し、ｄｓＤＮＡ二本鎖の上の鎖をニックが入れられた配列以降を置換する。第３に、プライマーが、ニッカーゼ認識配列に逆相補的な方向に結合し、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーを伸長させ、初期ｄｓＤＮＡのコピーを生成する。このようにして、ｄｓＤＮＡが、後に再び二本鎖を形成し得るｓｓＤＮＡコピーを生成するニッキングと伸長の事象で指数関数的に増幅される。しかしながら、このＳＤＡ反応は、低温（例えば、約２５℃未満）ではロバストに行われない。
【0084】
低温でのＳＤＡ反応の故障モードは、すぐには明らかになったわけではない。当初は、関与する２つの酵素（ニッカーゼと鎖置換ポリメラーゼ、それぞれNb.BbvCI及びKlenow LF）の反応速度が遅くなりすぎて効率的な増幅が得られないのではないかと疑われていた。しかしながら、高温と比較して室温で行われたニッキングと鎖置換の割合を評価したところ、これだけでは観察された感度の劇的な低下を説明できなかった。代わりに、反応速度の幾分の低下が、十分なレベルの標的ポリヌクレオチドのコピーが作製され得る前にプライマー二量体生成物が形成される程度まで悪化させた（図３）。理論的には、反応中の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ、Ｔ４ｇｐ３２）は、核酸の融解温度を人為的に上昇させることによってこれを防ぐことを意図しているが、より高いＳＳＢタンパク質の濃度でも検出限界が改善されていないように観察された（図３）。
【0085】
より高い温度（通常は３７～５５℃、Zhou et al. Nature Comm. 2018 and Biolabs, New England. “Isothermal Amplification & Strand Displacement.”）のプライマー二量体の形成はそれほど重要ではなく、反応の低温性能の重要なボトルネックである可能性が高いと思われた。初期設計の反復では、プライマーの長さを短くすると、二量体のさらなる指数関数的な増幅を誘発する可能性がある正しく対になったニッカーゼ認識配列を含むプライマー二量体プール種が排除されるという仮説が立てられた。フォワード及びリバースＳＤＡプライマーの対の標準設計は、それらの長さが１４ｎｔを超える必要があり、典型的には２０～４０ｎｔの範囲である（図４）（Zhou et al. Nature Comm. 2018, Biolabs, New England. “Isothermal Amplification & Strand Displacement.” 及び Shi et al. Analytical Chemistry, vol. 86, no. 1, 2013, pp. 336-339）。わずか９ｎｔのハイブリダイゼーション配列を有する新規の短い単一プライマー設計（フォワード結合配列と逆結合配列の両方が同一である）を用いると、実験は、指数関数的ではなく直線的なプライマー二量体形成を示した（図５）。
【0086】
この最適化されたプライマーを使用すると、Ｃａｓ１２ａをアンプリコン検出器として用いた２時間の反応時間内にｓｓＤＮＡ標的の最大１桁のコピーが検出可能であった（図６Ａ及び図６Ｂ）。周囲温度で達成されたこの低アトモーラー（ａｔｔｏｍｏｌａｒ）ＬＯＤ（約２０ａＭ）は、著者が最初に報告したＲＩＳＤＡプラットフォームも、特に本明細書で言及したＣＲＩＳＤＡプラットフォームも上回った。アンプリコン検出器としてＬｂａＣａｓ１２ａをＬｗａＣａｓ１３ａに交換することにより、さらなる改良が行われた。Ｔ７ ＲＮＡＰ及びｒＮＴＰを反応に含めること、及び増幅プライマーの５’末端のＴ７プロモーター配列により、ｓｓＤＮＡトリガーのリアルタイム検出のためにＳＤＡ増幅ステップとＣａｓ１３検出ステップをワンポットにまとめることが可能になった（図７Ａ）。得られたアッセイは、１ｃｐ／μＬ（約２ａＭ）の濃度で常に検出することができた（図７Ｂ及び図７Ｃ）。
【0087】
新規の短いプライマーによって感度が劇的に向上したにもかかわらず、システムを最適化するさらなる機会があった。重要なことに、プライマー二量体は、よりゆっくりではあるが、不活性な非ニッキング種の形で形成され続けた。これは、ｓｓＤＮＡ標的の検出を妨げなかったが、特に他の「バックグラウンド」ｓｓＤＮＡオリゴを添加する場合に、システムのロバスト性を低下させた（図８）。この抑制性の相互作用の原因は完全には理解されなかったが、一般的には、たとえ形成されたプライマー二量体が指数関数的に増幅されていなくても、短いプライマーが非特異的に伸長する継続能力が、「ファウリング／バックグラウンド」遊離３’末端の存在によって悪化する標的外プロセスにつながるという仮説が立てられた。ここでも同様に、これは、低温で等温増幅を行うことの難しさを浮き彫りにしている。
【0088】
この障害を取り除くために、短いプライマーのさらに新規の反復が設計された。この設計では、３’ヘキサンジオールブロッキング分子を短いプライマーに添加した。このブロッキング基は、プライマーがポリメラーゼによって単独で伸長するのを防止するため、指数関数的にも非指数関数的にも標的外産物が形成され得ない。３’ブロッキング末端は、ニッカーゼによるニッキングを防げない。ニックが入れられると、３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できるプライマー内で内部的に解放され、プライマーのブロックを効果的に解除する。したがって、最初のニッキングに続いて、その後のニッキング及び鎖置換が可能な通常の二本鎖アンプリコンが、プライマーが最初にブロックされているにもかかわらず生成される。図８に示されているように、これにより、「ファウリング／バックグラウンド」オリゴの存在下でも低コピー数のｓｓＤＮＡ標的を増幅できるシステムが得られ、ロバスト性が飛躍的に向上する。
【0089】
周囲温度を下げるために等温増幅技術を適応させるという課題は、２０年以上前の最初の設計反復以来、ほとんど取り組まれて来なかった。酵素の触媒活性が、３７～５５℃の温度範囲と比較して周囲温度で低いと、増幅に悪影響を与え得るが、そのような温度で増幅を持続させるためのより大きなボトルネックは、プライマー二量体の生成であることが示されている。これを新規のプライマー設計によって改善することにより、検出限界が１桁のコピー数に近い低温でも増幅を持続させることができることが示された。
【0090】
実施例３：様々な鎖置換ポリメラーゼを用いた標的ポリヌクレオチドの増幅
様々なポリメラーゼを使用して、検出可能なレベルまでフェムトモル（ｆＭ）量の標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。試験したＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は、Klenow Exo-DNAP、Bsu DNAP、IsoPol DNAP、及びIsoPol SD+ DNAPであった。標的ポリヌクレオチドの開始濃度は、０ｆＭ、２ｆＭ、２０ｆＭ、及び２００ｆＭであった。検出は、Ｃａｓ１３ａフルオロフォアクエンチャー（ＦＱ）レポーターを使いて行った。その結果、各ポリメラーゼが、検出するのに十分なｆＭ濃度の標的ポリヌクレオチドを増幅できることが示された。Klenow Exo-DNAP、Bsu DNAP、及びIsoPol DNAPの増幅は、約９０～１２０分のインキュベーション後に２ｆＭの開始標的ポリヌクレオチドを検出するのに十分であった。図９を参照されたい。
様々なポリメラーゼを使用して、検出可能なレベルまでフェムトモル（ｆＭ）量の標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。試験したＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は、Klenow Exo-DNAP、Bsu DNAP、IsoPol DNAP、及びIsoPol SD+ DNAPであった。標的ポリヌクレオチドの開始濃度は、０ｆＭ、２ｆＭ、２０ｆＭ、及び２００ｆＭであった。検出は、Ｃａｓ１３ａフルオロフォアクエンチャー（ＦＱ）レポーターを使いて行った。その結果、各ポリメラーゼが、検出するのに十分なｆＭ濃度の標的ポリヌクレオチドを増幅できることが示された。Klenow Exo-DNAP、Bsu DNAP、及びIsoPol DNAPの増幅は、約９０～１２０分のインキュベーション後に２ｆＭの開始標的ポリヌクレオチドを検出するのに十分であった。図９を参照されたい。
【0091】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、及び特許出願は、それぞれ言及される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書全体が包含され得る。
【0092】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ（１つの）」及び「ａｎ（１つの）」は、特に明記しない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0093】
また、特段の記載がない限り、複数のステップ又は行為を含む本明細書で請求されるいかなる方法においても、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が列挙された順序に必ずしも限定されるものではないことを理解されるべきである。
【0094】
特許請求の範囲において、及び上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（carrying）」、「有する（having）」、５「含む（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、及び「から構成される（composed of）」などは、オープンエンド、即ち、含むがそれに限定されないことを意味することを理解されたい。「からなる」と「本質的にからなる」という移行句のみが、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03で定められているように、それぞれクローズ又はセミクローズの移行句である。
【0095】
数値の前にある「約」及び「実質的に」という用語は、列挙される数値の±１０％を意味する。
【0096】
値の範囲が示されている場合、範囲の上限と下限を含むそれらの間のそれぞれの値は、具体的に企図され、本明細書に記載される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】