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▶ シャンハイ インスティテュート オブ バイオロジカル プロダクツ カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20241128BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241128BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20241128BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241128BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20241128BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241128BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
C07K19/00
C07K14/725
C07K14/705
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/12
C12N5/10
C12N5/078
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61P35/00
A61K35/17
A61K47/04
A61K47/68
G01N33/53 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527759
(86)(22)【出願日】2022-11-11
(85)【翻訳文提出日】2024-07-16
(86)【国際出願番号】 CN2022131502
(87)【国際公開番号】W WO2023083327
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】202111333547.X
(32)【優先日】2021-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522127715
【氏名又は名称】シャンハイ インスティテュート オブ バイオロジカル プロダクツ カンパニー，リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】１２６２ Ｗｅｓｔ Ｙａｎ’ａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｎｇｎｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００５２， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュー，アイドン
(72)【発明者】
【氏名】リアン，ホンユェン
(72)【発明者】
【氏名】ヂャン，クンミン
(72)【発明者】
【氏名】ウー，リナ
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，ジンイェ
(72)【発明者】
【氏名】チウ，ジァンファ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA12
4C076CC27
4C076CC29
4C076CC41
4C076DD21
4C076EE59
4C076FF61
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC02
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA42
4H045DA01
4H045DA50
4H045DA76
4H045DA89
4H045EA28
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体及びその製剤を提供する。具体的に、本発明は、新規な抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体を提供する。本発明の抗体は高特異性で抗原に結合し、高親和力および高生物活性を有し、特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２抗原分子に結合し、体外と体内のいずれにおいても効率的に腫瘍を抑制することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の重鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：（１）アミノ酸配列が配列番号３で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１；
（２）アミノ酸配列が配列番号４または１６で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２；および
（３）アミノ酸配列が配列番号５または１７で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３
を含むことを特徴とする、前記重鎖可変領域。
【請求項2】
請求項１に記載の抗体の重鎖可変領域を有することを特徴とする、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体重鎖。
【請求項3】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の軽鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ’：（１）アミノ酸配列が配列番号８で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１’；
（２）アミノ酸配列’が配列番号９で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２’；および
（３）アミノ酸配列’が配列番号１０で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３’
を含むことを特徴とする、前記軽鎖可変領域。
【請求項4】
請求項３に記載の抗体の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体軽鎖。
【請求項5】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体であって、（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域
を有するか、または、請求項２に記載の重鎖、および／また請求項４に記載の軽鎖を有することを特徴とする、前記抗体。
【請求項6】
前記抗体は、配列番号１、１１、１２、または１３で示される重鎖可変領域；および／または配列番号６、１４または１５で示される軽鎖可変領域を有することを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
組み換えタンパク質であって、（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列
を有することを特徴とする、前記タンパク質。
【請求項8】
抗体製剤であって、（ａ）請求項５に記載の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体、ならびに
（ｂ）緩衝剤、無菌水、任意の界面活性剤を含むビヒクル
を含むことを特徴とする、前記抗体製剤。
【請求項9】
ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する結合領域であり、かつ前記ｓｃＦｖは、請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記ＣＡＲ構築物。
【請求項10】
外来の請求項９に記載のＣＡＲ構築物を発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
【請求項11】
抗体薬物複合体であって、（ａ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、抗体部分と、
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分と
を含有することを特徴とする、前記抗体薬物複合体。
【請求項12】
活性成分の使用であって、前記活性成分は、請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、請求項７に記載の組み換えタンパク質、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記活性成分は、（ａ）検出試薬またはキットの製造、
（ｂ）ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する薬物または製剤の製造、ならびに／あるいは
（ｃ）癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造
のために用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項13】
薬物組成物であって、（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、請求項７に記載の組み換えタンパク質、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含有することを特徴とする、前記組成物。
【請求項14】
以下の群から選ばれるポリペプチド：（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体；あるいは
（２）請求項７に記載の組み換えタンパク質；ならびに／あるいは
（３）請求項９に記載のＣＡＲ構築物
をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項15】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項16】
遺伝子操作された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１５に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに請求項１４に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項17】
体外でサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質を検出（診断的なものまたは非診断的なものを含む）する方法であって、以下の工程：（１）体外において、前記サンプルを請求項５に記載の抗体と接触させること；
（２）抗原－抗体複合体が形成されたかを検出すること、ここで、複合体が形成されたというのはサンプルにＣＬＤＮ１８．２タンパク質が存在することを意味する
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項18】
基板（支持プレート）およびテストストリップを含む検出プレートであって、前記テストストリップが請求項５に記載の抗体または請求項１１に記載の抗体薬物複合体を含有することを特徴とする、前記検出プレート。
【請求項19】
キットであって、（１）請求項５に記載の抗体を含有する第一の容器、および／または
（２）請求項５に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器
を含むか、または請求項１８に記載の検出プレートを含むことを特徴とする、前記キット。
【請求項20】
ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する方法であって、これを必要とする対象に請求項５に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを投与する工程を含むことを特徴とする、前記方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に関し、具体的に、抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化モノクローナル抗体およびその製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
密着結合（Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＴＪ）は上皮組織細胞間の透過性を調節する多分子複合体である。密着結合複合体において、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）は隣接する細胞間で密着チャネルを形成し、イオン、溶質などの物質の流通を調節する。
【0003】
ＣＬＤＮ１８は肺および胃の上皮細胞における密着結合の主な構成部分で、ＣＬＤＮ１８はＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２の２種類のサブタイプで、ＣＬＤＮ１８．１は主に肺で、ＣＬＤＮ１８．２は主に胃で発現される。
【0004】
研究では、ＣＬＤＮ１８．２は原発性胃癌および転移性胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、胆管癌、卵巣癌などの多くの腫瘍において高発現であることが見出された（Ｓａｈｉｎ Ｕら， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００８；１４（２３）：７６２４－３４）。腫瘍細胞は増殖が速い、侵襲・転移しやすいなどの特性によって密着結合の構造がなくなり、その表面のＣＬＤＮ１８．２分子が露出しやすく、ＣＬＤＮ１８．２は理想的な腫瘍治療の標的になっている（Ｈｅｗｉｔｔ ＫＪら， ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６； ６：１８６）。
【0005】
Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ社によって開発されたＣＬＤＮ１８．２に対するキメラ抗体ＩＭＡＢ３６２は既にＩＩＩ期の臨床研究に入っている。末期または再発性胃食道癌のＩＩ期臨床研究において、ＩＭＡＢ３６２は第一線の化学治療薬ＥＯＸ（エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン）との併用によりも単独の化学治療のほうが顕著に患者のＰＦＳおよびＯＳを延ばし、胃癌、食道癌などの疾患の治療の潜在的な薬物になっている（Ｌｏｒｄｉｃｋ Ｆら， Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ， ２０２１； ２４（３）： ７２１-７３０．）。
【0006】
ＣＬＤＮ１８．２の腫瘍治療における潜在力のため、高活性の抗体薬物の開発に大きい臨床の需要がある。
【0007】
ヒトＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２の高度の類似性はＣＬＤＮ１８．２特異的抗体の開発に挑戦をもたらす。また、マウスＣＬＤＮ１８．２はヒトＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１と配列が完全に一致し、マウス体内における特異性抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体のスクリーニングはマウスの免疫耐性を突破しなくてはならない。そのため、高活性の特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２抗体を認識する薬物の開発は多くの技術的難題を克服する必要がある。
【0008】
そのため、本分野では、高親和力および高生物活性のＣＬＤＮ１８．２抗体およびその使用の開発がまだ切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、高親和力および高生物活性のＣＬＤＮ１８．２抗体およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第一の側面では、抗体の重鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含む重鎖可変領域を提供する：
（１）アミノ酸配列が配列番号３で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１；
（２）アミノ酸配列が配列番号４または１６で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２；および
（３）アミノ酸配列が配列番号５または１７で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３。
（１）アミノ酸配列が配列番号３で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１；
（２）アミノ酸配列が配列番号４または１６で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２；および
（３）アミノ酸配列が配列番号５または１７で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３。
【0011】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＣＤＲの配列は配列番号３、４および５、あるいは３、１６および５、あるいは３、４および１７である。
【0012】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は以下の４つのフレームワーク領域ＦＲを含み、ここで、前記４つのフレームワーク領域ＦＲは配列番号１、１１、１２および１３に相応する４つのフレームワーク領域ＦＲ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域は配列番号１、１１、１２または１３で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域は配列番号１、１１、１２または１３で示されるアミノ酸配列を有する。
【0013】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載の抗体の重鎖可変領域を有する抗体重鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖の定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２などの重鎖定常領域である。
もう一つの好適な例において、前記重鎖の定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２などの重鎖定常領域である。
【0014】
本発明の第三の側面では、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ’を含む、抗体の軽鎖可変領域を提供する：
（１）アミノ酸配列が配列番号８で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１’；
（２）アミノ酸配列’が配列番号９で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２’；および
（３）アミノ酸配列’が配列番号１０で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３’。
（１）アミノ酸配列が配列番号８で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１’；
（２）アミノ酸配列’が配列番号９で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２’；および
（３）アミノ酸配列’が配列番号１０で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３’。
【0015】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は以下の４つのフレームワーク領域ＦＲを含み、ここで、前記４つのフレームワーク領域ＦＲは配列番号６、１４、および１５に相応する４つのフレームワーク領域ＦＲ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖可変領域は配列番号６、１４、または１５で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖可変領域は配列番号６、１４、または１５で示されるアミノ酸配列を有する。
【0016】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載の抗体の軽鎖可変領域を有する抗体軽鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖の定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖の定常領域はヒトκ、λなどの軽鎖定常領域である。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖の定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖の定常領域はヒトκ、λなどの軽鎖定常領域である。
【0017】
本発明の第五の側面では、
（１） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および／または
（２） 本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域
を有するか、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および／または本発明の第四の側面に記載の軽鎖を有する抗体を提供する。
（１） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および／または
（２） 本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域
を有するか、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および／または本発明の第四の側面に記載の軽鎖を有する抗体を提供する。
【0018】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、さらに、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号１、１１、１２または１３で示される重鎖可変領域、ならびに／あるいは配列番号６、１４、および１５で示される軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号１、１１、１２または１３で示される重鎖可変領域、ならびに／あるいはが配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号１、１１、１２または１３で示される重鎖可変領域、ならびに／あるいは配列番号６、１４、および１５で示される軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列番号１、１１、１２または１３で示される重鎖可変領域、ならびに／あるいはが配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する。
【0019】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、以下の群から選ばれる：
（Ｚ１）配列番号１で示される重鎖可変領域および配列番号６で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ２）配列番号１１で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ３）配列番号１１で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ４）配列番号１２で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ５）配列番号１２で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ６）配列番号１３で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ７）配列番号１３で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体。
（Ｚ１）配列番号１で示される重鎖可変領域および配列番号６で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ２）配列番号１１で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ３）配列番号１１で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ４）配列番号１２で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ５）配列番号１２で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ６）配列番号１３で示される重鎖可変領域および配列番号１４で示される軽鎖可変領域を有する抗体；
（Ｚ７）配列番号１３で示される重鎖可変領域および配列番号１５で示される軽鎖可変領域を有する抗体。
【0020】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖は配列番号１８、２０、２１または２２で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体はヒト化抗体である。
もう一つの好適な例において、前記抗体の軽鎖は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体はヒト化抗体である。
【0021】
もう一つの好適な例において、前記抗体は特異的にＣＬＤＮ１８．２に結合する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
【0022】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二重特異性抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
また、本発明は、６２４に相応する抗体であって、配列番号２３で示される重鎖可変領域および配列番号２４で示される軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
また、本発明は、６２４に相応する抗体であって、配列番号２３で示される重鎖可変領域および配列番号２４で示される軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。
【0023】
本発明の第六の側面では、組み換えタンパク質であって、
（ｉ） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有するタンパク質を提供する。
（ｉ） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有するタンパク質を提供する。
【0024】
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は６Ｈｉｓタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【0025】
本発明の第七の側面では、抗体製剤であって、
（ａ）本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ｂ）緩衝剤、無菌水、任意に界面活性剤を含むビヒクル
を含む製剤を提供する。
（ａ）本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ｂ）緩衝剤、無菌水、任意に界面活性剤を含むビヒクル
を含む製剤を提供する。
【0026】
もう一つの好適な例において、前記の製剤では、前記抗体の濃度は５－１００ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０－７０ ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２０－６０ ｍｇ／ｍＬである。
もう一つの好適な例において、前記緩衝剤は、クエン酸緩衝系、ヒスチジン緩衝系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記緩衝剤は、クエン酸緩衝系、ヒスチジン緩衝系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0027】
もう一つの好適な例において、前記の製剤のｐＨ範囲は５．０－７．５、好ましくは５．５－７である。
もう一つの好適な例において、前記の製剤は注射製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の製剤は注射製剤である。
【0028】
本発明の第八の側面では、本発明の第七の側面に記載の抗体製剤、ならびに前記抗体製剤の入った容器を含むキットを提供する。
【0029】
本発明の第九の側面では、ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は特異的にＣＬＤＮ１８．２に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有するＣＡＲ構築物を提供する。
【0030】
本発明の第十の側面では、組み換えの免疫細胞であって、外来の本発明の第九の側面に記載のＣＡＲ構築物を発現する免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はヒトまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はヒトまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
【0031】
本発明の第十一の側面では、抗体薬物複合体であって、
（ａ） 本発明第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明第二の側面に記載の重鎖、本発明第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明第四の側面に記載の軽鎖、または本発明第五の側面に記載の抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体部分と、
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分と
を含む複合体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
（ａ） 本発明第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明第二の側面に記載の重鎖、本発明第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明第四の側面に記載の軽鎖、または本発明第五の側面に記載の抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体部分と、
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分と
を含む複合体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
【0032】
本発明の第十二の側面では、活性成分の使用であって、前記活性成分は、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第十の側面に記載の免疫細胞、本発明の第十一の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記活性成分は、
（ａ）検出試薬またはキットの製造、
（ｂ）ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する薬物または製剤の製造、ならびに／あるいは
（ｃ）癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造
のためのものである使用を提供する。
（ａ）検出試薬またはキットの製造、
（ｂ）ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する薬物または製剤の製造、ならびに／あるいは
（ｃ）癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造
のためのものである使用を提供する。
【0033】
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0034】
もう一つの好適な例において、前記の固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳膠細胞腫、子宮内膜癌、またはからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２高発現の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２高発現の腫瘍である。
【0035】
もう一つの好適な例において、前記薬物または製剤はＣＬＤＮ１８．２（発現陽性）に関連する疾患を予防および／または治療する薬物または製剤の製造のためのものである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体（ＡＤＣ）の形態である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体（ＡＤＣ）の形態である。
【0036】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬またはキットはＣＬＤＮ１８．２関連疾患の診断のためのものである。
もう一つの好適な例において、前記検出試薬またはキットはサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質の検出のためのものである。
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は検出シートである。
もう一つの好適な例において、前記検出試薬またはキットはサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質の検出のためのものである。
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は検出シートである。
【0037】
本発明の第十三の側面では、薬物組成物であって、
（ｉ） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第十の側面に記載の免疫細胞、本発明の第十一の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体と
を含有する組成物を提供する。
（ｉ） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第十の側面に記載の免疫細胞、本発明の第十一の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体と
を含有する組成物を提供する。
【0038】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、さらに、抗腫瘍の第二活性成分を含む。
もう一つの好適な例において、前記の第二活性成分は、細胞毒性薬物、毒素、サイトカイン、酵素、抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の第二活性成分は、ＥＧＦＲを標的とする抗体、ＨＥＲ２を標的とする抗体を含む。
もう一つの好適な例において、前記の第二活性成分は、細胞毒性薬物、毒素、サイトカイン、酵素、抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の第二活性成分は、ＥＧＦＲを標的とする抗体、ＨＥＲ２を標的とする抗体を含む。
【0039】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は腫瘍の治療に使用される。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２高発現の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は腫瘍の治療に使用される。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２高発現の腫瘍である。
【0040】
本発明の第十四の側面では、以下の群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
（１） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
（２） 本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、ならびに／あるいは
（３） 本発明の第九の側面に記載のＣＡＲ構築物。
（１） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
（２） 本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、ならびに／あるいは
（３） 本発明の第九の側面に記載のＣＡＲ構築物。
【0041】
本発明の第十五の側面では、本発明の第十四の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【0042】
本発明の第十六の側面では、遺伝子操作された宿主細胞であって、本発明の第十五の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第十四の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
【0043】
本発明の第十七の側面では、体外でサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質を検出（診断的なものまたは非診断的なものを含む）する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） 体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＬＤＮ１８．２タンパク質が存在することを意味する。
（１） 体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにＣＬＤＮ１８．２タンパク質が存在することを意味する。
【0044】
本発明の第十八の側面では、基板（支持プレート）と、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第十一の側面に記載の抗体薬物複合体を含有するテストストリップとを含む検出プレートを提供する。
【0045】
本発明の第十九の側面では、キットであって、
（１） 本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および／または
（２） 本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十八の側面に記載の検出プレートを含有するキットを提供する。
（１） 本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および／または
（２） 本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十八の側面に記載の検出プレートを含有するキットを提供する。
【0046】
本発明の第二十の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する；
（ｂ） 培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する。
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する；
（ｂ） 培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する。
【0047】
本発明の第二十一の側面では、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を治療する方法であって、これを必要とする対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを投与する工程を含む方法を提供する。
【0048】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図2A】図２はフローサイトメトリーの検出結果を示す。図２Ａはキメラ抗体ｃｈ４２９の検出結果で、図２Ｂはキメラ抗体ｃｈ６２３の検出結果で、図２Ｃはキメラ抗体ｃｈ６２４の検出結果で、図２Ｄはキメラ抗体ｃｈ７８２の検出結果で、図２Ｅは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の検出結果である。
【図2B】図２はフローサイトメトリーの検出結果を示す。図２Ａはキメラ抗体ｃｈ４２９の検出結果で、図２Ｂはキメラ抗体ｃｈ６２３の検出結果で、図２Ｃはキメラ抗体ｃｈ６２４の検出結果で、図２Ｄはキメラ抗体ｃｈ７８２の検出結果で、図２Ｅは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の検出結果である。
【図2C】図２はフローサイトメトリーの検出結果を示す。図２Ａはキメラ抗体ｃｈ４２９の検出結果で、図２Ｂはキメラ抗体ｃｈ６２３の検出結果で、図２Ｃはキメラ抗体ｃｈ６２４の検出結果で、図２Ｄはキメラ抗体ｃｈ７８２の検出結果で、図２Ｅは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の検出結果である。
【図2D】図２はフローサイトメトリーの検出結果を示す。図２Ａはキメラ抗体ｃｈ４２９の検出結果で、図２Ｂはキメラ抗体ｃｈ６２３の検出結果で、図２Ｃはキメラ抗体ｃｈ６２４の検出結果で、図２Ｄはキメラ抗体ｃｈ７８２の検出結果で、図２Ｅは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の検出結果である。
【図2E】図２はフローサイトメトリーの検出結果を示す。図２Ａはキメラ抗体ｃｈ４２９の検出結果で、図２Ｂはキメラ抗体ｃｈ６２３の検出結果で、図２Ｃはキメラ抗体ｃｈ６２４の検出結果で、図２Ｄはキメラ抗体ｃｈ７８２の検出結果で、図２Ｅは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の検出結果である。
【図3A】図３は抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体の組み換え細胞との結合活性の検出結果を示す。図３Ａは抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞との結合活性の結果で、図３Ｂは抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合活性の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0050】
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、意外に、高親和力および高抗腫瘍活性の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体を得ることができた。具体的に、本発明者は、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて、複数株のヒトＣＬＤＮ１８．２に対して高い親和力を有するマウス由来抗体を得ることができた。本発明では、マウス由来抗体に基づき、さらに、キメラ抗体およびヒト化抗体を製造し、そして得られたヒト化抗体に対して突然変異のスクリーニングを行った。本発明の抗体、特に、突然変異後のヒト化抗体は、キメラ抗体に近い親和力を有し、さらに標的治療のヒト化モノクローナル抗体薬物に開発される将来性がある。本発明の抗体は、有効にヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、多くの腫瘍細胞の増殖を抑制し、ヌードマウス体内における腫瘍の生長を抑制することができ、優れた抗腫瘍活性がある。これに基づき、本発明を完成させた。
【0051】
具体的に、本発明者は複数の様態のｈＣＬＤＮ１８．２ ＤＮＡを構築して抗原として交代にマウスを免疫させ、そしてｈＣＬＤＮ１８．２を発現する組み換え細胞株で強化免疫させることで、ハイブリドーマ融合技術によって特異的にｈＣＬＤＮ１８．２を認識するマウスモノクローナル抗体ｍａｂ４２９、ｍａｂ６２３、ｍａｂ６２４、ｍａｂ７８２を得た。
【0052】
キメラ抗体ｃｈ７８２はｈＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、腫瘍細胞ＮＵＧＣ４の細胞表面のＣＬＤＮ１８．２分子を認識することができ、ＣＬＤＮ１８．２との親和力が参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも高い。ｃｈ７８２はｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対してＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび増殖抑制活性を有する。
【0053】
キメラ抗体ｃｈ７８２をヒト化させ、４種類のＩｇＧ１型ヒト化抗体の組み合わせｈｕ７８２Ｈ１．１Ｌ１、ｈｕ７８２Ｈ１．２Ｌ１、ｈｕ７８２Ｈ１．１Ｌ２、ｈｕ７８２Ｈ１．２Ｌ２を得たが、４種類のヒト化抗体は特異的にｈＣＬＤＮ１８．２を認識し、ｃｈ７８２に対して相当する親和力がある。
【0054】
ヒト化抗体の重鎖ｈｕ７８２Ｈ１．１に対してＳ６０Ａ部位の点突然変異を行うことによって潜在的なグルコシル化部位を除去し、同時にＶ１０１Ａ突然変異を行うことによってその発現量を増加させ、ヒト化抗体の重鎖ｈｕ７８２ Ｈ１．２－Ｖ１０１Ａを得た。上記Ｓ６０Ａ、Ｖ１０１Ａ部位はＫａｂａｔ番号付け規則によって定義されている。
【0055】
ヒト化抗体ｈｕ７８２（Ｈ１．２Ｌ２組み合わせ）、ｈｕ７８２－ＨＶ（Ｈ１．２－Ｖ１０１Ａ Ｌ２組み合わせ）は腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性が顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良い。
【0056】
ヒト化抗体ｈｕ７８２の重鎖定常領域の２３９番目、３３２番目のアミノ酸に対してＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異を行ってヒト化抗体ｈｕ７８２－ＤＥを得た。上記Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２ＥはＥＵ番号付けシステムによって定義されている。
【0057】
ヒト化抗体ｈｕ７８２－ＤＥは腫瘍細胞ＮＵＧＣ４に対するＡＤＣＣが顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良く、そのＥＣ５０値がＲｅｆ．ｃｈ１７５よるも２４倍低い。
【0058】
ヒト化抗体ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶはｈＣＬＤＮ１８．２標的細胞に対してＣＤＣ殺傷活性がある。
ヒト化抗体ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶはｈＣＬＤＮ１８．２標的細胞に対して増殖抑制活性を有し、その増殖抑制活性は投与量依存性があり、顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良い。
ヒト化抗体ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶはｈＣＬＤＮ１８．２標的細胞に対して増殖抑制活性を有し、その増殖抑制活性は投与量依存性があり、顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良い。
【0059】
エピトープ分析では、ヒト化抗体ｈｕ７８２の認識の主要部位はｈＣＬＤＮ１８．２分子のＥ５６、Ｇ４８部位を含むことが見出されたが、参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の認識の主要部位はＡ４２Ｓ、Ｎ４５Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｇ４８部位を含むことから、二つの抗体の結合エピトープにある程度の違いがあることが証明された。
【0060】
ヌードマウス腫瘍移植モデルにおいて、ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶ、ｈｕ７８２－ＤＥの三つの抗体はいずれも明らかに腫瘍生長を抑制することができ、かつ参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良く、とりわけ、ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＤＥの二つの抗体は腫瘍生長抑制効果が顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良い。ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＤＥの二つの抗体の治療群のいずれでも、マウスの腫瘍が完全に消退し、ｈｕ７８２－ＨＶ、ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＤＥの腫瘍抑制率が３４．６８％、６２．８８％および６５．０５％で、参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５は１５．５％である。
【0061】
用語
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるように、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有する。出願全体において、ほかの定義が記述されている。
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるように、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有する。出願全体において、ほかの定義が記述されている。
【0062】
用語「約」とは当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内にある値または組成で、それによって部分的にどのように値または組成を計量または測定するかというのが決まる。たとえば、本明細書で用いられるように、「約１００」という表示は９９と１０１およびその間の全部の値（たとえば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【0063】
本明細書で用いられるように、用語「含有」または「含む」は開放式、半閉鎖式および閉鎖式のものでもよい。言い換えれば、前記用語は「基本的に・・・で構成される」、または「・・・で構成される」も含む。
【0064】
配列同一性は、所定の比較ウィンドウ（参照のヌクレオチド配列またはタンパク質の長さの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％でもよい）に沿って２つの整列された配列を比較し、そして同様の残基が現れる位置の数によって確定する。通常、百分率で表示される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は当業者に熟知の方法である。
【0065】
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
【0066】
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
【0067】
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体、たとえば重鎖可変領域（たとえば配列番号１、１１、１２または１３のアミノ酸配列）および／または軽鎖可変領域（たとえば配列番号６、１４または１５のアミノ酸配列）を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。これらは、開始のメチオニンを含有してもよく、含有しなくてもよい。
【0068】
もう一つの好適な本発明の抗体は６２４に相応する特異的にＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体、たとえば重鎖可変領域（たとえば配列番号２３のアミノ酸配列）および／または軽鎖可変領域（たとえば配列番号２４のアミノ酸配列）を有するタンパク質またはポリペプチドである。
【0069】
ＣＬＤＮ１８．２
ヒトＣＬＤＮ１８は、全長が２６１のアミノ酸を含み、４回膜貫通タンパク質で、四つの膜貫通疎水領域を有し、細胞外は二つのループ状構造で、ループ１は膜貫通領域１と膜貫通領域２が環状に回ってなり、ループ２は膜貫通領域３と膜貫通領域４が環状に回ってなる。ヒトＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２のＮ末端、膜貫通領域１および細胞外ループ１のアミノ酸は構成において違いがあり、ほかの部分はいずれも完全に一致し、その配列類似度が９２％に達する。
ヒトＣＬＤＮ１８は、全長が２６１のアミノ酸を含み、４回膜貫通タンパク質で、四つの膜貫通疎水領域を有し、細胞外は二つのループ状構造で、ループ１は膜貫通領域１と膜貫通領域２が環状に回ってなり、ループ２は膜貫通領域３と膜貫通領域４が環状に回ってなる。ヒトＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２のＮ末端、膜貫通領域１および細胞外ループ１のアミノ酸は構成において違いがあり、ほかの部分はいずれも完全に一致し、その配列類似度が９２％に達する。
【0070】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」とは免疫グロブリンのことで、２本の同様の重鎖および２本の同様の軽鎖がジスルフィド結合を介して連結してなる４本ペプチド鎖の構造である。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」とは免疫グロブリンのことで、２本の同様の重鎖および２本の同様の軽鎖がジスルフィド結合を介して連結してなる４本ペプチド鎖の構造である。
【0071】
既存の抗体番号付けスキームは以下のものを含む。
１．Ｋａｂａｔスキーム（Ｋａｂａｔら、１９９１）は同ドメイン種類の配列の間の高配列変異領域の位置に基づくもので、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶλとＶκ）可変ドメインの番号が異なる。
２．Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、１９９７）はＫａｂａｔスキームと同様であるが、構造ループに相応するように、一番目のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）の周囲の注釈が挿入された位置を校正したものである。同様に、増強型Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、２００８）は挿入位置をさらに構造修正を行ったものである。
３．これらのＫａｂａｔに類似するスキームと逆で、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ、２００３）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌuｃｋｔｈｕｎ、２００１）はいずれも抗体およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（ＶαとＶβ）の可変ドメインを定義した独特なスキームである。そのため、容易にドメイン種類の間で同等効果の位置を比較することができる。ＩＭＧＴおよびＡＨｏは注釈の位置の数字（それぞれ１２８と１４９）およびｉｎｄｅｌ発生とされる位置において異なる。
１．Ｋａｂａｔスキーム（Ｋａｂａｔら、１９９１）は同ドメイン種類の配列の間の高配列変異領域の位置に基づくもので、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶλとＶκ）可変ドメインの番号が異なる。
２．Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、１９９７）はＫａｂａｔスキームと同様であるが、構造ループに相応するように、一番目のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）の周囲の注釈が挿入された位置を校正したものである。同様に、増強型Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ、２００８）は挿入位置をさらに構造修正を行ったものである。
３．これらのＫａｂａｔに類似するスキームと逆で、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ、２００３）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌuｃｋｔｈｕｎ、２００１）はいずれも抗体およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（ＶαとＶβ）の可変ドメインを定義した独特なスキームである。そのため、容易にドメイン種類の間で同等効果の位置を比較することができる。ＩＭＧＴおよびＡＨｏは注釈の位置の数字（それぞれ１２８と１４９）およびｉｎｄｅｌ発生とされる位置において異なる。
【0072】
免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸の構成および配列順序により、その抗原性が異なる。これにより、免疫グロブリンは５種類に分かれ、あるいは免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥで、その相応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、およびε鎖である。同一のＩｇはそのヒンジ領域のアミノ酸の組成および重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いにより、異なるサブタイプに分かれ、たとえばＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分かれる。軽鎖は定常領域によってκ鎖またはλ鎖に分かれる。５種類のＩｇのうち、いずれのＩｇもκ鎖またはλ鎖を有してもよい。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【0073】
本発明に記載の抗体の軽鎖はさらに軽鎖定常領域を含んでもよく、前記の軽鎖定常領域はヒト由来またはマウス由来のκ鎖、λ鎖またはそのバリアントを含む。
【0074】
本発明において、本発明に記載の抗体の重鎖はさらに重鎖定常領域を含んでもよく、前記の重鎖定常領域はヒト由来またはマウス由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントを含む。抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に近い約１１０のアミノ酸の配列は大きく異なり、可変領域（Ｆｖ領域）で、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定で、定常領域である。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）および４つの配列が相対的に保存的な骨格領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順で並ぶ。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指す。本発明の実施例１３において、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームを合わせ、ｃｈ７８２抗体の６つのＣＤＲを分割する。
【0075】
本発明において、用語「マウス由来抗体」は本分野の知識および技能によって製造される抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体である。製造時、ＣＬＤＮ１８．２抗原で試験対象に注射した後、必要な配列または機能の特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。本発明の一つの好適な実施形態において、前記のマウス由来ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、さらにマウス由来κ鎖、λ鎖またはそのバリアントの軽鎖定常領域を、あるいはさらにマウス由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはそのバリアントの重鎖定常領域を含んでもよい。
【0076】
用語「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させてなる抗体で、マウス由来抗体による免疫応答反応を減少することができる。
【0077】
用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域のフレームワーク、すなわち、異なる種類のヒト種抗体骨格配列に移植してなる抗体である。ヒト化抗体はキメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことで、異種性反応が誘導されることを克服することができる。このような骨格配列は、系列の抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から得ることができる。免疫原性の低下およびそれによる活性の低下を防止するには、前記のヒト抗体の可変領域のフレームワーク配列に最低限の逆向突然変異または復帰突然変異をさせることによって活性を維持することができる。
【0078】
用語「抗体の抗原結合断片」（または「抗体断片」と略す）とは抗体の特異的に抗原（たとえば、ＣＬＤＮ１８．２）に結合する能力を維持する一つまたは複数の断片である。全長抗体の断片で抗体の抗原結合機能を実現できることが示されている。用語「抗体の抗原結合断片」に含まれる結合断片の実例は以下のもの含む：
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片である、Ｆａｂ断片；
（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；
（ｉｖ）抗体の一方のアームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片。
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片である、Ｆａｂ断片；
（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；
（ｉｖ）抗体の一方のアームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片。
【0079】
Ｆｖ抗体は抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域がなく、かつすべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一般的に、Ｆｖ抗体はさらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、かつ抗原結合に必要な構造を形成することができる。
【0080】
用語「ＣＤＲ」とは抗体の可変ドメイン内における主に抗原の結合を促進する６つの超可変領域の１つである。前記６つのＣＤＲの最も用いられる定義の一つはＫａｂａｔ Ｅ．Ａら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２）によって提供される。
【0081】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは抗原における免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する部位（たとえば、ＣＬＤＮ１８．２分子における特定の部位）である。エピトープは、通常、独特な配座で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含む。
【0082】
用語「特異的な結合」、「選択的な結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは抗体の予め決定された抗原におけるエピトープに対する結合である。通常、抗体は約１０－７Ｍ未満、たとえば約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満あるいはそれよりも低い親和力（ＫＤ）で結合する。
【0083】
用語「競争的に結合する」とはＣＬＤＮ１８．２の細胞外領域における本発明のモノクローナル抗体と同様のエピトープ（抗原決定基とも呼ばれる）または同様のエピトープの一部を認識して前記抗原に結合する抗体である。本発明のモノクローナル抗体と同様のエピトープに結合する抗体とは本発明のモノクローナル抗体によって認識されるＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列を認識して結合する抗体である。
【0084】
用語「ＫＤ」または「Ｋｄ」とは特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数である。通常、本発明の抗体は約１０－７Ｍ未満、たとえば約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満あるいはそれよりも低い解離平衡定数（ＫＤ）でＣＬＤＮ１８．２に結合する。
【0085】
本明細書で用いられるように、用語「抗原決定基」とは抗原における不連続の、本発明の抗体または抗原結合断片によって認識される立体空間部位である。
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【0086】
本発明において、抗体は当業者に熟知の技術によって製造されるマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体を含む。組み換え抗体、たとえばキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの部分および非ヒトの部分を含み、本分野で熟知されるＤＮＡ組み換え技術によって製造することができる。
【0087】
本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体」とは単一の細胞由来のクローンから分泌される抗体である。モノクローナル抗体は、高度特異的で、単一のエピトープに対するものである。前記の細胞は、真核、原核またはファージのクローン細胞株でもよい。
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
【0088】
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的変異ポリペプチドは、好ましくは以下の表に基づいてアミノ酸置換を行うことにより生成される。
【表1】
【0089】
抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体（以下、ＣＬＤＮ１８．２抗体と略す）を提供する。具体的に、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に対して高特異性で高親和力のヒト化抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体（以下、ＣＬＤＮ１８．２抗体と略す）を提供する。具体的に、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に対して高特異性で高親和力のヒト化抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
【0090】
１９８６年に、Ｊｏｎｅｓらは、初めて、マウスモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲをヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に移植し、さらにマウスモノクローナル抗体の軽鎖と完全な抗体に組み立てて元のマウスモノクローナル抗体に類似する親和力を保ち、抗体のヒト化技術の発展に新しい発想を提供した。１９８９年に、ＱｕｅｅｎらはＣＤＲ移植の方法により、抗ＣＤ２５ヒト化抗体の構築に成功し、当該方法で使用されるのはヒト抗体フレームワーク領域によるヒト化で、フレームワーク領域の一部の部位においてマウス由来抗体のアミノ酸を残すことによって親和力を維持する。１９９２年に、Ｐｒｅｓｔａらは、ヒト抗体のサブグループのコンセンサス配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を鋳型としてＣＤＲ移植を行ってヒト化の構築に成功した方法を報告した。１９９４年に、Ｐｅｄｅｒｓｅｎらは、リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）の方法によって抗体をヒト化することを報告した。１９９４年に、Ｈｓｉａｏらは、ヒト抗体生殖細胞系列配列のフレームワーク領域でＣＤＲ移植を行うヒト化方法を報告した。１９９４年に、Ｊｅｓｐｅｒｓらは、ファージライブラリー（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ、シャッフリングライブラリー）の方法によってヒト化方法の構築に成功した。
【0091】
抗体のヒト化においてヒトフレームワーク領域の選択は、通常、２種類があるが、１種類は既知の成熟抗体で、もう１種類はヒト生殖細胞系列配列である。既知の成熟抗体のフレームワーク領域は、通常、体細胞の突然変異部位を含み、潜在的な免疫原性をもたらすことがある。成熟抗体と比べ、ヒト生殖細胞系列のフレームワーク領域は理論的に免疫原性がより低く、そして構造がより動きやすく、順応性が強く、異なるＣＤＲ領域が受け取りやすい。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子は人体における使用頻度にある程度の傾向があり、使用頻度の高い生殖細胞系列のフレームワーク領域でヒト化した抗体は免疫原性が低い、発現量が高い、構造が安定などの利点がある。
【0092】
本発明の一つの好適な実施形態において、ヒト化時、マウス由来抗体との類似度が最高の生殖細胞系列配列でなく、類似性および人体使用頻度を兼ね、大量の実験によってスクリーニングを行ったところ、最適化配列のフレームワーク領域を選んでヒト化する。ヒト抗体生殖細胞系列のフレームワーク領域でＣＤＲ移植を行い、このように構築されるヒト化抗体は構造がより安定で、発現量が高く、免疫原性が低く、薬らしさがより高い。
【0093】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域がヒト化の重鎖定常領域または軽鎖定常領域でもよい。より好ましくは、前記ヒト化の重鎖定常領域または軽鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２などの重鎖定常領域またはヒトκ、λ軽鎖定常領域である。
【0094】
もう一つの好適な例において、前記少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た配列は、好適に、相同性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列である。
本発明の抗体は二本鎖または一本鎖抗体でもよく、そして好ましくは全ヒト化抗体でもよい。
本発明の抗体は二本鎖または一本鎖抗体でもよく、そして好ましくは全ヒト化抗体でもよい。
【0095】
本発明に係る抗体の誘導体は、一本鎖抗体、およびまたは抗体断片、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、あるいは当該分野におけるほかの既知の抗体の誘導体など、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体またはほかのサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を標的とするヒト化抗体、ＣＤＲ接木および／または修飾の抗体でもよい。
本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を標的とするヒト化抗体、ＣＤＲ接木および／または修飾の抗体でもよい。
【0096】
本発明の上記内容において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸数は、好ましくは元のアミノ酸配列の合計アミノ酸数の４０％以下、より好ましくは３５％以下、より好ましくは１～３３％、より好ましくは５～３０％、より好ましくは１０～２５％、より好ましくは１５～２０％である。
【0097】
抗体の製造
モノクローナル抗体の生成に適する方法のいずれも本発明のＣＬＤＮ１８．２抗体の生成に使用することができる。たとえば、連接または天然に存在するＣＬＤＮ１８．２タンパク質またはその断片で動物を免疫させることができる。アジュバント、免疫刺激剤、重複免疫強化接種を含む、適切な免疫接種方法を使用してもよく、一つまたは複数の手段をしようしてもよい。
モノクローナル抗体の生成に適する方法のいずれも本発明のＣＬＤＮ１８．２抗体の生成に使用することができる。たとえば、連接または天然に存在するＣＬＤＮ１８．２タンパク質またはその断片で動物を免疫させることができる。アジュバント、免疫刺激剤、重複免疫強化接種を含む、適切な免疫接種方法を使用してもよく、一つまたは複数の手段をしようしてもよい。
【0098】
適切な様態のＣＬＤＮ１８．２のいずれも免疫原（抗原）とし、ＣＬＤＮ１８．２に特異的な非ヒト抗体を生成し、前記抗体の生物学活性を選別して使用することができる。免疫原は単独で使用してもよく、あるいは本分野で既知の一つまたは複数の免疫原性補強剤と組み合わせて使用してもよい。免疫原は天然由来の精製されたもの、あるいは遺伝的に修飾された細胞において生成したものでもよい。免疫原をコードするＤＮＡは、ゲノム由来のものまたは非ゲノム由来のもの（たとえばｃＤＮＡ）でもよい。適切な遺伝ベクターで免疫原をコードするＤＮＡを発現することができるが、前記ベクターはアデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび非ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【0099】
ヒト化抗体は、任意の種類の免疫グロブリンから選ばれてもよいが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む。同様に、何らの軽鎖も本明細書の化合物および方法において使用することができる。具体的に、κ鎖、λ鎖またはそのバリアントは本発明の化合物および方法において有用である。
【0100】
本発明の抗体またはその断片のＤＮＡ分子の配列は、通常の技術で、たとえば、ＰＣＲ増幅 あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
【0101】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。
【0102】
用語「核酸分子」とはＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子である。核酸分子は一本鎖または二本鎖のものでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸をもう一つの核酸配列と機能的な関係にした場合、核酸は「有効に連結している」。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響する場合、プロモーターまたはエンハンサーは前記コード配列と有効に連結している。
【0103】
用語「ベクター」とはそれに連結したもう一つの核酸を輸送することができる核酸分子である。一つの実施形態において、ベクターは「プラスミド」で、別のＤＮＡ断片をその中に連結することができる環状二本鎖ＤＮＡ環を指す。
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【0104】
用語「宿主細胞」とは既にその中に発現ベクターが導入された細胞である。宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば植物または動物細胞（たとえば哺乳動物細胞）でもよい。
【0105】
本発明に記載のＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換の工程は本分野で熟知の技術で行ってもよい。得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、通常の培地で適切な条件において培養する。
【0106】
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明の抗体を得る。
【0107】
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ））で測定することができる。
【0108】
抗体製剤
抗体は異なる製剤緩衝液において異なる安定性を有し、電荷異質性の変化、抗体分子の分解、多量体化などとして表れ、これらの質量的性質の変化は抗体自身の物理・化学的性質に関連するため、抗体薬物の開発過程において、異なる抗体の物理・化学的性質によってそれに適する製剤緩衝液をスクリーニングする必要がある。現在、よく使用される抗体製造の緩衝系はリン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液などがあり、同時に抗体の性質によって異なる濃度の塩イオンまたはソルビトール、トレハロース、ショ糖などの賦形剤、および適量のツインのような界面活性剤を添加することで、抗体の安定性を維持することがある。
抗体は異なる製剤緩衝液において異なる安定性を有し、電荷異質性の変化、抗体分子の分解、多量体化などとして表れ、これらの質量的性質の変化は抗体自身の物理・化学的性質に関連するため、抗体薬物の開発過程において、異なる抗体の物理・化学的性質によってそれに適する製剤緩衝液をスクリーニングする必要がある。現在、よく使用される抗体製造の緩衝系はリン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液などがあり、同時に抗体の性質によって異なる濃度の塩イオンまたはソルビトール、トレハロース、ショ糖などの賦形剤、および適量のツインのような界面活性剤を添加することで、抗体の安定性を維持することがある。
【0109】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質またはそのＡＤＣまたは相応するＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質またはそのＡＤＣまたは相応するＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
【0110】
本発明に係る抗体は、ヌクレオチド配列によって細胞内で発現されて細胞治療に使用してもよく、たとえば、前記抗体はキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ－Ｔ）などに使用することができる。
本発明の薬物組成物は直接ＣＬＤＮ１８．２タンパク質分子との結合に使用することができるため、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患の予防および治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
本発明の薬物組成物は直接ＣＬＤＮ１８．２タンパク質分子との結合に使用することができるため、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患の予防および治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
【0111】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはその複合体）と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。このようなビヒクルは、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【0112】
薬物組成物の使用時、安全有効量の薬物組成物を哺乳動物に投与するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内ある。
【0113】
検出用途およびキット
本発明の抗体は検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
本発明の抗体は検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
【0114】
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
【0115】
本発明の主な利点は以下の通りである。
１．本発明の抗体は典型的なトリプトファン、チロシンの埋め込みが良い構造で、スクリーニングされたヒトＶＨ、ＶＬフレームワーク領域の鋳型構造が安定で、そしてマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ領域との適応性が良く、軽・重鎖可変領域が好適にマッチし、親和力が高く、構造が安定である。
２．キメラ抗体と比べ、本発明のヒト化抗体は優れた生物活性、特異性を有し、ＣＬＤＮ１８．２に相当する親和力を維持しながら、より低い免疫原性およびより高い発現量を有する。
３．本発明のヒト化抗体は顕著な体外生物活性を有し、効率的に体外培養の腫瘍細胞増殖の活性を抑制することができ、活性は対照抗体よりも良い。
４．本発明のヒト化抗体は顕著な体内生物活性を有し、ヒト胃癌細胞などの腫瘍細胞に対して優れた抑制活性を有し、活性は対照抗体よりも良い。
１．本発明の抗体は典型的なトリプトファン、チロシンの埋め込みが良い構造で、スクリーニングされたヒトＶＨ、ＶＬフレームワーク領域の鋳型構造が安定で、そしてマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ領域との適応性が良く、軽・重鎖可変領域が好適にマッチし、親和力が高く、構造が安定である。
２．キメラ抗体と比べ、本発明のヒト化抗体は優れた生物活性、特異性を有し、ＣＬＤＮ１８．２に相当する親和力を維持しながら、より低い免疫原性およびより高い発現量を有する。
３．本発明のヒト化抗体は顕著な体外生物活性を有し、効率的に体外培養の腫瘍細胞増殖の活性を抑制することができ、活性は対照抗体よりも良い。
４．本発明のヒト化抗体は顕著な体内生物活性を有し、ヒト胃癌細胞などの腫瘍細胞に対して優れた抑制活性を有し、活性は対照抗体よりも良い。
【0116】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
特別に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料または試薬はいずれも市販品である。
【0117】
材料と方法
１．参照抗体
本発明の実験で使用された参照抗体は、配列が特許ＵＳ８１６８４２７における１７５Ｄ１０クローンの抗体配列由来のものである。１７５Ｄ１０抗体はＩＭＡＢ３６２とも呼ばれる。１７５Ｄ１０抗体の可変領域の配列は全遺伝子合成を行い、そしてＩｇＧ１キメラ抗体定常領域を含有する真核発現ベクターに構築し、発現させて精製した。本発明において、当該製造された参照抗体をＲｅｆ．ｃｈ１７５と略す。
１．参照抗体
本発明の実験で使用された参照抗体は、配列が特許ＵＳ８１６８４２７における１７５Ｄ１０クローンの抗体配列由来のものである。１７５Ｄ１０抗体はＩＭＡＢ３６２とも呼ばれる。１７５Ｄ１０抗体の可変領域の配列は全遺伝子合成を行い、そしてＩｇＧ１キメラ抗体定常領域を含有する真核発現ベクターに構築し、発現させて精製した。本発明において、当該製造された参照抗体をＲｅｆ．ｃｈ１７５と略す。
【0118】
参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５（またはＩＭＡＢ３６２）は特異的にＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１部分を認識し、ＣＬＤＮ１８．１と結合せず、主に抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）によって腫瘍細胞を殺傷する。
【0119】
実施例１：ＣＬＤＮ１８．１またはＣＬＤＮ１８．２安定発現細胞株の構築
本実施例において、安定してヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株を構築した。方法は以下の通りである。
本実施例において、安定してヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株を構築した。方法は以下の通りである。
【0120】
ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＮＰ＿０５７４５３．１）、ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＮＰ＿００１００２０２６．１）をコードする全長遺伝子断片を全遺伝子合成し、全長断片をＸｈｏｌ＋ＢａｍＨＩ酵素によって切断してそれぞれｐＥＧＦＰ－Ｎ２真核発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入）にクローニングし、それぞれｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ｈＣＬＤＮ１８．１およびｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ｈＣＬＤＮ１８．２と名付けた。
【0121】
ＨＥＫ２９３細胞（中国科学院細胞庫から購入、ＧＮＨｕ４３）を４×１０５個／ウェルで６ウェルプレートに接種し、翌日に、リポフェクション試薬ＬｉｐｏＭａｘでｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ｈＣＬＤＮ１８．１、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ｈＣＬＤＮ１８．２をそれぞれＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、形質移入の２４ｈ後に１：１０の比率で細胞を継代し、細胞が壁に付着すると最終濃度が３００μｇ／ｍｌになるようにＧ４１８（Ｇｉｂｃｏから購入）を入れてプレッシャースクリーニングを行い、サブクローニングによって安定してヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２膜タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を得たが、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２と名付けた。
【0122】
マウスＣＬＤＮ１８．１（ＮＰ＿０６２７８９．１）、マウスＣＬＤＮ１８．２（ＮＰ＿００１１８１８５０．１）をコードする全長遺伝子断片を全遺伝子合成し、ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩ酵素によって切断してｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ真核発現ベクター（南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入）にクローニングし、それぞれｐｃＤＮＡ３．１－ｍＣＬＤＮ１８．１およびｐｃＤＮＡ３．１－ｍＣＬＤＮ１８．１と名付けた。上記と同様の方法によってＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、安定してマウスＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２膜タンパク質を発現する細胞を得たが、それぞれＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１およびＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２と名付けた。
【0123】
＞ＮＰ＿０５７４５３．１ クローディン－１８アイソフォーム１前駆体［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］配列番号２５
ＭＳＴＴＴＣＱＶＶＡＦＬＬＳＩＬＧＬＡＧＣＩＡＡＴＧＭＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰＶＴＳＶＦＱＹＥＧＬＷＲＳＣＶＲＱＳＳＧＦＴＥＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ
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【0124】
＞ＮＰ＿００１００２０２６．１ クローディン－１８アイソフォーム２［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］配列番号２６
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ
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【0125】
＞ＮＰ＿０６２７８９．１ クローディン－１８アイソフォームＡ１．１前駆体［ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］配列番号２７
ＭＡＴＴＴＣＱＶＶＧＬＬＬＳＬＬＧＬＡＧＣＩＡＡＴＧＭＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰＶＴＡＶＦＱＹＥＧＬＷＲＳＣＶＱＱＳＳＧＦＴＥＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＶＩＧＩＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＤＤＳＡＫＡＫＭＴＬＴＳＧＩＬＦＩＩＳＧＩＣＡＩＩＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＳＧＭＧＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＴＰＤＤＳＮＦＫＡＶＳＹＨＡＳＧＱＮＶＡＹＲＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＲＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＤＥＱＳＨＰＴＫＹＤＹＶ
ＭＡＴＴＴＣＱＶＶＧＬＬＬＳＬＬＧＬＡＧＣＩＡＡＴＧＭＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰＶＴＡＶＦＱＹＥＧＬＷＲＳＣＶＱＱＳＳＧＦＴＥＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＶＩＧＩＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＤＤＳＡＫＡＫＭＴＬＴＳＧＩＬＦＩＩＳＧＩＣＡＩＩＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＳＧＭＧＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＴＰＤＤＳＮＦＫＡＶＳＹＨＡＳＧＱＮＶＡＹＲＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＲＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＤＥＱＳＨＰＴＫＹＤＹＶ
【0126】
＞ＮＰ＿００１１８１８５０．１ クローディン－１８アイソフォームＡ２．１［ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］配列番号２８
ＭＳＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＦＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＶＩＧＩＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＤＤＳＡＫＡＫＭＴＬＴＳＧＩＬＦＩＩＳＧＩＣＡＩＩＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＳＧＭＧＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＴＰＤＤＳＮＦＫＡＶＳＹＨＡＳＧＱＮＶＡＹＲＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＲＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＤＥＱＳＨＰＴＫＹＤＹＶ
ＭＳＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＦＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＶＩＧＩＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＤＤＳＡＫＡＫＭＴＬＴＳＧＩＬＦＩＩＳＧＩＣＡＩＩＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＳＧＭＧＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＴＰＤＤＳＮＦＫＡＶＳＹＨＡＳＧＱＮＶＡＹＲＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＲＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＤＥＱＳＨＰＴＫＹＤＹＶ
【0127】
実施例２：免疫原の調製
ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１（ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１）とマウスＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１のアミノ酸配列が完全に一致するため、ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１と結合する抗体を得ることが困難である。同時に、腫瘍細胞表面のＣＬＤＮ１８．２分子の配座は正常組織の細胞表面と異なる可能性があることを考慮し、本実施例において、複数の様態のＤＮＡプラスミドを抗原として設計して免疫耐性を突破することで、高親和力で腫瘍細胞を認識する抗体を得た。
ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１（ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１）とマウスＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１のアミノ酸配列が完全に一致するため、ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１と結合する抗体を得ることが困難である。同時に、腫瘍細胞表面のＣＬＤＮ１８．２分子の配座は正常組織の細胞表面と異なる可能性があることを考慮し、本実施例において、複数の様態のＤＮＡプラスミドを抗原として設計して免疫耐性を突破することで、高親和力で腫瘍細胞を認識する抗体を得た。
【0128】
ヒトＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１およびＣＬＤＮ１８．２の全長アミノ酸をコードするヌクレオチドをそれぞれテタノスパスミンのＰ２エピトープＴＴ８３０－８４４ 、Ｐ３０エピトープＴＴ９４７－９６７と直列に連結して真核発現ベクターＰＴＴ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）にクローニングし、それぞれＰＴＴ５－ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２、ＰＴＴ５－ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１と名付けた。
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｃ末端に融合し、ｈＦｃ－ＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１と名付けた。
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｃ末端に融合し、ｈＦｃ－ＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１と名付けた。
【0129】
ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２ ヌクレオチド配列 配列番号２９
ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＴＡＡ
ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＴＡＡ
【0130】
ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１ヌクレオチド配列：配列番号３０
ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＣＧＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＡ
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【0131】
ｈＦｃ－ＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１ ヌクレオチド配列：配列番号３１
ＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＧＣＴＧＡ
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【0132】
実施例３：抗ヒトＣＬＤＮ１８．２ハイブリドーマ細胞株の製造
実験用Ｂａｌｂ／ｃマウスは上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験室から購入、すべての免疫用マウスは４－６週齢の雌で、標準化無疾患で、健康な純血種マウスである。
ＣＬＤＮ１８．２は４回膜貫通タンパク質で、高親和力で腫瘍細胞を認識する特異性抗体を得るために、マウス免疫は複数種のプラスミドで交代免疫し、そして安定してヒトＣＬＤＮ１８．２膜タンパク質を発現する細胞でラッシュ免疫した。方法は以下の通りである。
実験用Ｂａｌｂ／ｃマウスは上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験室から購入、すべての免疫用マウスは４－６週齢の雌で、標準化無疾患で、健康な純血種マウスである。
ＣＬＤＮ１８．２は４回膜貫通タンパク質で、高親和力で腫瘍細胞を認識する特異性抗体を得るために、マウス免疫は複数種のプラスミドで交代免疫し、そして安定してヒトＣＬＤＮ１８．２膜タンパク質を発現する細胞でラッシュ免疫した。方法は以下の通りである。
【0133】
１日目および１４日目：５０μｇのヒトＣＬＤＮ１８．２全長遺伝子をコードする真核発現ベクタープラスミドｐＥＧＦＰ－Ｎ２－ｈＣＬＤＮ１８．２を、マウス四頭筋に注射し（ｉ．ｍ）、アジュバントはＩｎ ｖｉｖｏ－Ｊｅｔ ＰＥＩ－Ｍａｎ体内形質移入試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓから購入、２０３－１０Ｇ）である。２８日目に、５０μｇの真核発現プラスミドｈＦｃ－ＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ１ ＤＮＡをマウス四頭筋に注射し（ｉ．ｍ）、４２日目に、５０μｇの真核発現ベクタープラスミドＰＴＴ５－ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２をマウス四頭筋に注射し（ｉ．ｍ）、５６日目に、５０μｇの真核発現ベクタープラスミドＰＴＴ５－ＴＴ－ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１をマウス四頭筋に注射し（ｉ．ｍ）、７０日目に、５０μｇの真核発現ベクタープラスミドＰＴＴ５－ＴＴ－ｈＣＬＤＮ１８．２および５０μｇの真核発現ベクタープラスミドＰＴＴ５－ＴＴ－ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１をマウス四頭筋に注射した（ｉ．ｍ）。
【0134】
１４日後、マウス尾静脈から採血し、細胞に基づくＥＬＩＳＡ法によって血清抗体力価を測定し、融合の３日前に２×１０７個のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞／匹マウスで腹腔内注射によって抗体力価が最高の２匹のマウスを強化免疫した。融合の当日に、マウスの眼球から採血して脾臓を摘出し、単細胞懸濁液を調製し、ＳＰ２０細胞と電気融合の手段でハイブリドーマを得てプレートに敷いた。
【表2】
【0135】
実施例４：特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２に結合するがヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しないハイブリドーマ細胞のスクリーニング
本実施例において、細胞に基づくＥＬＩＳＡ法によってハイブリドーマのスクリーニングを行って特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２に結合するがヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しないハイブリドーマ細胞を得た。方法は以下の通りである。
本実施例において、細胞に基づくＥＬＩＳＡ法によってハイブリドーマのスクリーニングを行って特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２に結合するがヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しないハイブリドーマ細胞を得た。方法は以下の通りである。
【0136】
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞をトリプシンで消化した後、３×１０５個／ｍＬの細胞密度でそれぞれポリリジン（Ｐ４７０７、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで接種し、一晩培養した。細胞のコンフルエンスが９０％以上に達すると、上清を除去し、１０％中性ホルマリン溶液で室温で１５ ｍｉｎ固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、そして５％脱脂牛乳で４℃で一晩ブロッキングした。ハイブリドーマを検出する時、同一のウェルの上清をそれぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞で８０μｌ／ウェルでコーティングされたプレートに入れ、３７℃で１ｈインキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの１：５０００で希釈されたヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを入れ、３７℃で４５ ｍｉｎインキュベートし、３０ ｍｉｎ呈色させ、５０μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて呈色を停止し、マイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０を読み取った。
【0137】
１万以上のクローンをスクリーニングしたところ、数株のｈＣＬＤＮ１８．２特異的抗体を得たが、最適な４株を下記表に示す。
【表3】
【0138】
実施例５：マウスモノクローナル抗体のサブタイプの検出
サブタイプ検出キット（ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ ｋｉｔ、ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈから購入、５３００－０５）でＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するクローン株に対してサブタイプ検出を行った。
サブタイプ検出キット（ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ ｋｉｔ、ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈから購入、５３００－０５）でＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するクローン株に対してサブタイプ検出を行った。
【0139】
検出結果は以下の通りである。
【表4】
【0140】
実施例６：抗ヒトＣＬＤＮ１８．２マウス由来モノクローナル抗体可変領域コード配列のクローニングと同定
スクリーニングによって得られたマウスモノクローナル抗体にＩｇＭサブタイプ抗体が存在するため、さらにその活性を評価するために、ＲＡＣＥ－ＰＣＲ法によってマウスモノクローナル抗体の可変領域の配列を得、そしてキメラ抗体を構築した。
スクリーニングによって得られたマウスモノクローナル抗体にＩｇＭサブタイプ抗体が存在するため、さらにその活性を評価するために、ＲＡＣＥ－ＰＣＲ法によってマウスモノクローナル抗体の可変領域の配列を得、そしてキメラ抗体を構築した。
【0141】
ＲＮＡ抽出キットＴａｋａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，９７６７）で実施例４で得られたハイブリドーマの全ｍＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３４８５８）でＰＣＲによってマウス由来抗体の可変領域の配列を得たが、結果は以下の通りである。
【0142】
６２４抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２３）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＴＳＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
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【0143】
６２４抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２４）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
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【0144】
７８２抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２）：
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＧＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
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【0145】
７８２抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）：
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＤＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＤＮＴＮＹＳＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＹＹＧＮＳＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
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【0146】
７８２抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７）：
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ
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【0147】
７８２抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
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【0148】
実施例７：抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体の構築と発現
相同組換え法のプライマー設計原則に従ってプライマーを設計し、実施例６で得られたマウス由来抗体重・軽鎖可変領域の遺伝子断片を増幅させ、それぞれヒト重・軽鎖定常領域の配列に連結し、発現ベクターＰＴＴ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に構築した。
商業化プラスミドマキシキットでプラスミド抽出を行い、そしてＰＥＩ形質移入法によって２９３ＦＶ懸濁細胞に形質移入し、形質移入７日後、上清を収集し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによってキメラ抗体を得た。
相同組換え法のプライマー設計原則に従ってプライマーを設計し、実施例６で得られたマウス由来抗体重・軽鎖可変領域の遺伝子断片を増幅させ、それぞれヒト重・軽鎖定常領域の配列に連結し、発現ベクターＰＴＴ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に構築した。
商業化プラスミドマキシキットでプラスミド抽出を行い、そしてＰＥＩ形質移入法によって２９３ＦＶ懸濁細胞に形質移入し、形質移入７日後、上清を収集し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによってキメラ抗体を得た。
【0149】
実施例８：抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体の特異性分析
それぞれ安定してヒトＣＬＤＮ１８．２を形質移入したＨＥＫ２９３細胞および安定してヒトＣＬＤＮ１８．１を形質移入したＨＥＫ２９３細胞をトリプシンで消化した後、５×１０５個細胞／１００μｌでハイブリドーマ上清１００μｌに入れ、氷の上で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１：４００で希釈されたヒツジ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ二次抗体を入れ、氷の上で４５ ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、３００μｌの仕込み緩衝液を入れ、ＢＤフローサイトメトリー管に移し、ＢＤ ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトによって平均蛍光強度ＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を分析した。
それぞれ安定してヒトＣＬＤＮ１８．２を形質移入したＨＥＫ２９３細胞および安定してヒトＣＬＤＮ１８．１を形質移入したＨＥＫ２９３細胞をトリプシンで消化した後、５×１０５個細胞／１００μｌでハイブリドーマ上清１００μｌに入れ、氷の上で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１：４００で希釈されたヒツジ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ二次抗体を入れ、氷の上で４５ ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、３００μｌの仕込み緩衝液を入れ、ＢＤフローサイトメトリー管に移し、ＢＤ ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトによって平均蛍光強度ＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を分析した。
【0150】
【0151】
結果から、ｃｈ４２９、ｃｈ６２３、ｃｈ６２４、ｃｈ７８２はヒトＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合し、ヒトＣＬＤＮ１８．１と結合しないことが示された。中では、キメラ抗体ｃｈ７８２のＭＦＩは参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも高い。
【0152】
実施例９：抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体の組み換え細胞との結合活性の検出
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞をトリプシンで消化した後、一定の細胞密度でポリリジン（Ｐ４７０７、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた９６ウェルプレートに接種し、一晩培養した。細胞のコンフルエンスが９０％以上に達すると、上清を除去し、１０％ホルマリン溶液で室温で１５ ｍｉｎ固定した。ＰＢＳで１回洗浄した後、そして５％脱脂牛乳で４℃で一晩ブロッキングして使用に備えた。候補のキメラ抗体および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を１μｇ／ｍｌから３倍希釈で１０の勾配に希釈し、１００μｌ／ウェルで細胞でコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１：２０００で希釈されたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ呈色液で１５分呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０－ＯＤ６３０値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。結果は図３を参照し、ｃｈ４２９、ｃｈ６２３、ｃｈ６２４、ｃｈ７８２および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５はいずれもＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞と結合せず、ＨＥＫ２９３－ＨＣＬＤＮ１８．２細胞と特異的に結合することが示され、そしてｃｈ４２９およびｃｈ７８２は参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の相対結合活性に対してそれぞれ２５７．５％および１７９．９％であった。結果を下記表に示す。
ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１およびＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞をトリプシンで消化した後、一定の細胞密度でポリリジン（Ｐ４７０７、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた９６ウェルプレートに接種し、一晩培養した。細胞のコンフルエンスが９０％以上に達すると、上清を除去し、１０％ホルマリン溶液で室温で１５ ｍｉｎ固定した。ＰＢＳで１回洗浄した後、そして５％脱脂牛乳で４℃で一晩ブロッキングして使用に備えた。候補のキメラ抗体および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を１μｇ／ｍｌから３倍希釈で１０の勾配に希釈し、１００μｌ／ウェルで細胞でコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１：２０００で希釈されたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ呈色液で１５分呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０－ＯＤ６３０値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。結果は図３を参照し、ｃｈ４２９、ｃｈ６２３、ｃｈ６２４、ｃｈ７８２および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５はいずれもＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞と結合せず、ＨＥＫ２９３－ＨＣＬＤＮ１８．２細胞と特異的に結合することが示され、そしてｃｈ４２９およびｃｈ７８２は参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の相対結合活性に対してそれぞれ２５７．５％および１７９．９％であった。結果を下記表に示す。
【表6】
【0153】
実施例１０：抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体のＮＵＧＣ４細胞との結合活性の検出
実施例９と同様の方法によってＮＵＧＣ４細胞（南京科佰生物有限公司から購入）を９６ウェルプレートに敷き、候補のキメラ抗体および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を１００μｇ／ｍｌから３倍希釈で１０の勾配に希釈し、１００μｌ／ウェルで細胞でコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１：２０００で希釈されたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ呈色液で１５分呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０－ＯＤ６３０値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
実施例９と同様の方法によってＮＵＧＣ４細胞（南京科佰生物有限公司から購入）を９６ウェルプレートに敷き、候補のキメラ抗体および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を１００μｇ／ｍｌから３倍希釈で１０の勾配に希釈し、１００μｌ／ウェルで細胞でコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１：２０００で希釈されたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰを入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ呈色液で１５分呈色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０－ＯＤ６３０値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
【0154】
【0155】
キメラ抗体ｃｈ７８２およびｃｈ４２９のＥＣ５０はそれぞれ０．５７μｇ／ｍｌおよび５．２５μｇ／ｍｌで、そしてｃｈ７８２は高濃度の場合の読み値（ＯＤ４５０＝２．３）がｃｈ４２９の読み値（ＯＤ４５０＝１．２）よりも高かった。ｃｈ６２３、ｃｈ６２４よび参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５はいずれもＥＣ５０を算出することができなかった。
【0156】
これにより、ｃｈ７８２抗体は内因的にヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質を発現するＮＵＧＣ４細胞との結合活性が最も良く、明らかに参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも強いことが示された。
【0157】
実施例１１：抗ＣＬＤＮ１８．２ヒトマウスキメラ抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合活性の検出
実施例８における方法に従い、キメラ抗体ｃｈ４２９、ｃｈ６２４、ｃｈ７８２、Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を濃度１０μｇ／ｍｌから３倍勾配希釈を行い、フローサイトメトリー実験を行った。ＭＦＩを縦座標としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
実施例８における方法に従い、キメラ抗体ｃｈ４２９、ｃｈ６２４、ｃｈ７８２、Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を濃度１０μｇ／ｍｌから３倍勾配希釈を行い、フローサイトメトリー実験を行った。ＭＦＩを縦座標としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
【0158】
【0159】
本発明のキメラ抗体ｃｈ４２９、ｃｈ７８２および参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５はいずれもＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と結合することができ、ＥＣ５０はそれぞれ０．５２μｇ／ｍｌ、０．８１μｇ／ｍｌ、０．８５μｇ／ｍｌであるが、ｃｈ６２４の結合活性は明らかに弱い。
また、高濃度の場合、ｃｈ７８２はＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と結合するＭＦＩがＲｅｆ．ｃｈ１７５よりも高い。
また、高濃度の場合、ｃｈ７８２はＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と結合するＭＦＩがＲｅｆ．ｃｈ１７５よりも高い。
【0160】
実施例１２：レポーター遺伝子法による抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ヒトマウスキメラ抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対するＡＤＣＣ活性の検出
抗体Ｆｃ末端が仲介するＡＤＣＣ効果は抗体の抗腫瘍活性を評価する重要な指標である。ＡＤＣＣは抗体依存性細胞介在性細胞傷害で、その作用機序は抗体が腫瘍表面の抗原に結合すると、抗体Ｆｃ領域が免疫エフェクター細胞受容体と結合し、主にＮＫ細胞におけるＦｃ受容体を標的として認識し、直接腫瘍細胞を溶解させて殺傷する。
抗体Ｆｃ末端が仲介するＡＤＣＣ効果は抗体の抗腫瘍活性を評価する重要な指標である。ＡＤＣＣは抗体依存性細胞介在性細胞傷害で、その作用機序は抗体が腫瘍表面の抗原に結合すると、抗体Ｆｃ領域が免疫エフェクター細胞受容体と結合し、主にＮＫ細胞におけるＦｃ受容体を標的として認識し、直接腫瘍細胞を溶解させて殺傷する。
【0161】
本実施例では、レポーター遺伝子法によって抗体のＡＤＣＣ生物学活性を検出し、安定してＦｃγＲＩＩＩａ受容体を発現する工学的改変されたＪｕｒｋａｔ細胞をエフェクター細胞とし、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットでルシフェラーゼの化学発光信号を検出し、ＮＦＡＴシグナル経路の活性化を測定することで、定量的に抗体Ｆｃエフェクター因子の機能を検出した。
【0162】
実施例１で構築されたＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を消化した後、２．５×１０５／ｍｌになるように希釈し、さらに１００μｌ／ウェルで白色で不透明の細胞培養プレートに敷き、３７℃で２４ｈ静置培養した後、上清を捨て、２５μｌ／ウェルで０．１％ＢＳＡ含有分析培地を入れた。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ＋ＦｃγＲＩＩＩａ細胞を６×１０６ 个／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートを取り、各ウェルに２５ μｌのＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ＋ＦｃγＲＩＩＩａ細胞懸濁液を入れ、さらに各ウェルに２５μＬの抗体希釈液を最終濃度が６μｇ／ｍＬになるように入れて同濃度から３倍系列希釈し、計１０の希釈勾配にした。細胞プレートを恒温インキュベーターに置き、６ ｈ誘導培養した後、９６ウェルプレートを室温条件において置いて少なくとも１５ ｍｉｎ平衡化させ、連続仕込みピペットを使用し、全ての反応ウェルに７５ μＬ／ウェルでＢｉｏ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを入れ（染色液は光を避ける必要がある）、室温条件において５ ｍｉｎ反応させ、多機能プレートリーダーにセットしてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ光信号の数値を検出した。蛍光数値および抗体濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
【0163】
【0164】
結果から、ｃｈ７８２と参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５を勾配希釈した後、エフェクター標的比Ｅ：Ｔ＝６：１で、３７℃で６ｈインキュベートした後、ｃｈ７８２とＲｅｆ．ｃｈ１７５はいずれも強いＡＤＣＣ活性を誘導することができることがわかる。
【0165】
実施例１３：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｃｈ７８２のヒト化
抗体の免疫原性を低下させるために、抗体の体内への投与によるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）効果を減少し、好適な抗体ｃｈ７８２をヒト化した。具体的に、実施例６におけるｍａｂ７８２抗体可変領域の配列に対してヒト化配列設計を行った。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って重・軽鎖のアミノ酸配列を番号付けし、ＮＣＢＩＩｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって配列相同アラインメントを行い、相同性の高いヒト由来抗体の配列をフレームワークとし、マウス由来抗体ＣＤＲ移植を行い、そしてフレームワーク領域の一部の核心となるアミノ酸を回帰突然変異させた。
抗体の免疫原性を低下させるために、抗体の体内への投与によるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）効果を減少し、好適な抗体ｃｈ７８２をヒト化した。具体的に、実施例６におけるｍａｂ７８２抗体可変領域の配列に対してヒト化配列設計を行った。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って重・軽鎖のアミノ酸配列を番号付けし、ＮＣＢＩＩｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって配列相同アラインメントを行い、相同性の高いヒト由来抗体の配列をフレームワークとし、マウス由来抗体ＣＤＲ移植を行い、そしてフレームワーク領域の一部の核心となるアミノ酸を回帰突然変異させた。
【0166】
Ｂｌａｓｔで７８２抗体の重鎖およびヒト生殖細胞系列の相同配列を検索した。
【表10】
【0167】
Ｂｌａｓｔで７８２抗体の軽鎖およびヒト生殖細胞系列の相同配列を検索した。
【表11】
【0168】
７８２抗体の重鎖可変領域におけるＫａｂａｔで定義されたＦＲおよびＣＤＲの配列は以下の通りである。
【表12】
【0169】
７８２抗体の軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔで定義されたＦＲおよびＣＤＲの配列は以下の通りである。
【表13】
【0170】
本発明において、抗体重鎖のヒト化は相同性の高いＩＧＨＶ４－６１を鋳型としてＣＤＲ領域の置き換えを行い、重鎖ＣＤＲ１の移植時、同時にＣｈｏｔｈｉａで定義されたＣＤＲ１部位を含み、そしてＩ４８Ｍ／Ｖ６７Ｉ／Ｖ７１Ｒの３つの部位を回帰突然変異させてｈｕ７８２Ｈ１．１を得た。
【0171】
翻訳後修飾の分析によってＳ６０部位に潜在的なグルコシル化部位が存在し、点突然変異の手段によってＳ６０Ａに突然変異させ、ｈｕ７８２Ｈ１．２と名付け、そしてその１０１番目のアミノ酸のＶをＡに突然変異させることで、その発現量を最適化させ、そしてｈｕ７８２ Ｈ１．２－Ｖ１０１Ａと名付けた。
【0172】
本発明において、抗体軽鎖のヒト化はそれぞれＶκＩコンセンサス配列を鋳型としてＣＤＲ領域の置き換えを行い、ｈｕ７８２Ｌ１を、ＩＧＫＶ４－１を鋳型としてＣＤＲ領域の置き換えを行い、ｈｕ７８２Ｌ２を得た。
以上の配列をコドン最適化した後、全遺伝子合成を行い、そして重・軽鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングして発現・精製を行った。
以上の配列をコドン最適化した後、全遺伝子合成を行い、そして重・軽鎖定常領域を含有する発現ベクターにクローニングして発現・精製を行った。
【0173】
ｈｕ７８２Ｈ１．１ （配列番号１１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＤＮＴＮＹＳＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＹＹＧＮＳＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0174】
ｈｕ７８２Ｈ１．２ （配列番号１２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＤＮＴＮＹＡＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＹＹＧＮＳＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0175】
ｈｕ７８２Ｈ１．２－Ｖ１０１Ａ （配列番号１３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＤＮＴＮＹＡＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0176】
ｈｕ７８２Ｌ１ （配列番号１４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0177】
ｈｕ７８２Ｌ２ （配列番号１５）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0178】
実施例１４：ヒト化抗体のＣＬＤＮ１８．２に対する特異的結合活性の検出
上記実施例におけるキメラ抗体の結合活性の評価方法を使用し、ヒト化後の抗体のヒトＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２ならびにＮＵＧＣ４細胞との結合活性を検出した。
上記実施例におけるキメラ抗体の結合活性の評価方法を使用し、ヒト化後の抗体のヒトＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２ならびにＮＵＧＣ４細胞との結合活性を検出した。
【0179】
【0180】
結果から、ヒト化抗体はいずれもヒトＣＬＤＮ１８．２と特異的に結合することができ、そして結合活性がキメラ抗体ｃｈ７８２に対して明らかな低下が見られなかったことが示された。
また、意外に、４種類のヒト化抗体の腫瘍細胞ＮＵＧＣ４との細胞結合のＥＣ５０値は顕著にキメラ抗体ｃｈ７８２よりも良かった。
また、意外に、４種類のヒト化抗体の腫瘍細胞ＮＵＧＣ４との細胞結合のＥＣ５０値は顕著にキメラ抗体ｃｈ７８２よりも良かった。
【0181】
実施例１５：ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性の検出
本発明における抗体の体内活性の主な機序の一つはＡＤＣＣ機能活性で、ヒトＩｇＧ１抗体（ｈＩｇＧ１）は主に抗体のヒンジ領域およびＣＨ２領域を介してＦｃγＲと結合し、ＡＤＣＣ効果を発揮する。ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を増強するために、本実施例において、ヒト化抗体重鎖ｈｕ７８２Ｈ１．２のＦｃにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）突然変異を導入することにより、そのＦｃγＲに対する親和力を増強することで、ＡＤＣＣを増強する目的を実現させた。発現・精製後、レポーター遺伝子法によって野生型およびＤＥ突然変異型のヒト由来抗体のＡＤＣＣを評価した。
本発明における抗体の体内活性の主な機序の一つはＡＤＣＣ機能活性で、ヒトＩｇＧ１抗体（ｈＩｇＧ１）は主に抗体のヒンジ領域およびＣＨ２領域を介してＦｃγＲと結合し、ＡＤＣＣ効果を発揮する。ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を増強するために、本実施例において、ヒト化抗体重鎖ｈｕ７８２Ｈ１．２のＦｃにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）突然変異を導入することにより、そのＦｃγＲに対する親和力を増強することで、ＡＤＣＣを増強する目的を実現させた。発現・精製後、レポーター遺伝子法によって野生型およびＤＥ突然変異型のヒト由来抗体のＡＤＣＣを評価した。
【表15】
【0182】
方法は以下の通りである。実施例１２における具体的な操作工程に従い、標的細胞であるＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２およびＮＵＧＣ４細胞をそれぞれ２．５×１０５／ｍｌになるように希釈し、さらに１００μｌ／ウェルで白色で不透明の細胞培養プレートに敷き、３７℃で２４ｈ静置培養した後、上清を捨て、２５μｌ／ウェルで０．１％ＢＳＡ含有分析培地を入れた。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ＋ＦｃγＲＩＩＩａ細胞を６×１０６ 个／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートを取り、各ウェルに２５ μＬのＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ＋ＦｃγＲＩＩＩａ細胞懸濁液を入れ、さらに各ウェルに２５μＬの抗体希釈液を最終濃度が６μｇ／ｍＬになるように入れて同濃度から３倍系列希釈し、計１０の希釈勾配にした。細胞プレートを恒温インキュベーターに置き、６ ｈ誘導培養した後、９６ウェルプレートを室温条件において置いて少なくとも１５ ｍｉｎ平衡化させ、連続仕込みピペットを使用し、全ての反応ウェルに７５ μＬ／ウェルでＢｉｏ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを入れ（染色液は光を避ける必要がある）、室温条件において５ ｍｉｎ反応させ、多機能プレートリーダーにセットしてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ光信号の数値を検出した。蛍光数値および抗体濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０を算出した。
【表16】
【0183】
結果から、ヒトＣＬＤＮ１８．２高発現の組み換え細胞に対し、キメラ抗体ｃｈ７８２およびヒト化抗体ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶはいずれも有効に参照抗体に相当するＡＤＣＣ活性が生じ（ＥＣ５０はそれぞれ４７．６４ｎｇ／ｍｌ、６４．０３ ｎｇ／ｍｌ、７０．９４ ｎｇ／ｍｌ）、そしてＦｃプライマーＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異のｈｕ７８２－ＤＥはＡＤＣＣ活性が顕著に向上したことが示された（図８）。
【0184】
同様の結果は内因的にヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＮＵＧＣ４細胞においても観察され、そして本発明で得られた候補の抗体ｃｈ７８２およびｈｕ７８２のＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ活性が参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良かった。
【0185】
そして、安定してｈＣＬＤＮ１８．２を形質移入したＮＵＧＣ４細胞を標的細胞としてＡＤＣＣ活性の検出を行った結果、ｈｕ７８２－ＤＥ、ｈｕ７８２－ＨＶ－ＤＥはＡＤＣＣ活性が顕著に対照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良く、ＥＣ５０値がそれぞれ６．８７ｎｇ／ｍｌおよび１１．４８ｎｇ／ｍｌであったことがわかる（図８Ｃ）。
【0186】
実施例１６：ヒト化抗体のＣＤＣ活性の検出
ＣＤＣは補体依存性細胞傷害で、その作用機序は補体と結合した抗原抗体混合物が最終的に細胞膜に穴を開け、細胞の浸透圧を変化させ、最後に細胞分解につながる。本実施例において、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を標的細胞とし、幼児ウサギ補体血清で補体を提供し、ＣＣＫ－８細胞増殖－毒性検出キットによって抗体ＣＤＣ効果を検出した。
ＣＤＣは補体依存性細胞傷害で、その作用機序は補体と結合した抗原抗体混合物が最終的に細胞膜に穴を開け、細胞の浸透圧を変化させ、最後に細胞分解につながる。本実施例において、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を標的細胞とし、幼児ウサギ補体血清で補体を提供し、ＣＣＫ－８細胞増殖－毒性検出キットによって抗体ＣＤＣ効果を検出した。
【0187】
実施例１におけるＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を標的細胞とし、消化後、２．０×１０５個／ｍＬになるように希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェル光透過黒色培養プレートに敷き、細胞が完全に壁に付着するまで４ｈ程度静置培養した。生長培地を全部吸い取り、５０μＬ／ウェルで分析培地を入れた。反応ウェル内に５０μＬ／ウェルで希釈後の抗体を入れ、さらに５０μＬの１：１５で希釈された幼児ウサギ補体を入れ、各ウェルの最終体積が１５０μＬになるようにし、各ウェルのサンプルの体積が全体積の１／３で、初期濃度が目的標的の３倍で、目的濃度は６μｇ／ｍＬからであった。細胞プレートを恒温インキュベーターに入れ、１２ｈ誘導培養した後、培地を吸い取り、１００μＬ／ウェルで新鮮な分析培地を入れ、室温条件においてＣＣＫ－８溶液 を１０μＬ／ウェルで入れ、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、３７℃で光を避けて４ ｈ反応させた。多機能プレートリーダーにセットして波長４５０ ｎｍでＯＤ値を検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトでフィッティングしてグラフを作成してＥＣ５０値を算出した。
【0188】
結果は下記表に示す。
【表17】
【0189】
結果から、本発明におけるｃｈ７８２、ｈｕ７８２、ｈｕ７８２ＨＶはいずれもＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対して参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５に相当するＣＤＣ効果を誘導することができたことが示された（ＥＣ５０はそれぞれ３０．９ ｎｇ／ｍｌ、４９．４６ ｎｇ／ｍｌ、４７．５８ ｎｇ／ｍｌ、４０．８９ ｎｇ／ｍｌ）。
【0190】
実施例１７ ヒト化抗体のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する増殖抑制作用の検出
対数生長期のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を取った。標的細胞を消化し、計数後、細胞を１．０×１０５個／ｍＬになるように希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェル光透過黒色培養プレートに敷き、細胞が完全に壁に付着するまで４ｈ程度静置培養した。反応ウェル内に１００μＬ／ウェルで希釈後の抗体を入れ、各ウェルの最終体積が２００μＬで、９６ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で９６ｈ誘導培養した後、培地を吸い取り、１００μＬ／ウェルで新鮮な分析培地を入れ、室温条件においてＣＣＫ－８溶液 を１０μＬ／ウェルで入れ、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、３７℃で光を避けて４ ｈ反応させた。多機能プレートリーダーにセットして波長４５０ ｎｍでＯＤ値を検出した。結果は、細胞増殖抑制率＝１－（ＯＤ４５０抗体／ＯＤ４５０ブランク）で計算した。
対数生長期のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を取った。標的細胞を消化し、計数後、細胞を１．０×１０５個／ｍＬになるように希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で９６ウェル光透過黒色培養プレートに敷き、細胞が完全に壁に付着するまで４ｈ程度静置培養した。反応ウェル内に１００μＬ／ウェルで希釈後の抗体を入れ、各ウェルの最終体積が２００μＬで、９６ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で９６ｈ誘導培養した後、培地を吸い取り、１００μＬ／ウェルで新鮮な分析培地を入れ、室温条件においてＣＣＫ－８溶液 を１０μＬ／ウェルで入れ、５％ＣＯ２インキュベーターに置き、３７℃で光を避けて４ ｈ反応させた。多機能プレートリーダーにセットして波長４５０ ｎｍでＯＤ値を検出した。結果は、細胞増殖抑制率＝１－（ＯＤ４５０抗体／ＯＤ４５０ブランク）で計算した。
【0191】
結果から、本発明の抗体ｈｕ７８２は低濃度（１μｇ／ｍｌ）で標的細胞に対する増殖抑制効果が高濃度（３０μｇ／ｍｌ）の参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良く（１８．３ ％ｖｓ．７．３％）、そして抗体濃度の増加につれ、増殖抑制効果が強くなるような投与量依存傾向を示し、３０μｇ／ｍｌの濃度では、ｃｈ７８２、ｈｕ７８２、ｈｕ７８２－ＨＶの細胞増殖抑制率がそれぞれ６７．８％、７６％、６３．２％に達し、顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりもよかったことが示された。
【0192】
実施例１８：ヒト化抗体のｈＣＬＤＮ１８．２タンパク質との結合部位の解析
本発明における抗体のｈＣＬＤＮ１８．２タンパク質と結合するが、ｈＣＬＤＮ１８．１タンパク質と結合しない重要なアミノ酸部位を探求するために、本実施例において、点突然変異の手段によって実施例１で構築されたｐＥＦＧＰ－Ｎ２－ ｈＣＬＤＮ１８．２プラスミドにおいてｈＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１とｈＣＬＤＮ１８．１ ＥＣＬ１のアミノ酸相違部位およびその周囲のアミノ酸をアラニン突然変異させ、ここで、Ａ４２をｈＣＬＤＮ１８．１ ＥＣＬ１における対立アミノ酸Ｓに突然変異させた（Ｑ２９Ａ、Ｓ３１Ａ、 Ｎ３７Ａ、 Ａ４２Ｓ、 Ｎ４５Ａ 、Ｑ４７Ａ 、Ｇ４８Ａ、Ｓ５２Ａ、 Ｅ５６Ａ、 Ｇ６５Ａ、 Ｌ６９Ａ 、Ｇ７１Ａ）。突然変異できたプラスミドおよび野生型プラスミドを実施例１における方法によってそれぞれ２９３Ｆｖ細胞に形質移入し、４８時間後、細胞を取ってフローサイトメトリーの検出を行った。
本発明における抗体のｈＣＬＤＮ１８．２タンパク質と結合するが、ｈＣＬＤＮ１８．１タンパク質と結合しない重要なアミノ酸部位を探求するために、本実施例において、点突然変異の手段によって実施例１で構築されたｐＥＦＧＰ－Ｎ２－ ｈＣＬＤＮ１８．２プラスミドにおいてｈＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１とｈＣＬＤＮ１８．１ ＥＣＬ１のアミノ酸相違部位およびその周囲のアミノ酸をアラニン突然変異させ、ここで、Ａ４２をｈＣＬＤＮ１８．１ ＥＣＬ１における対立アミノ酸Ｓに突然変異させた（Ｑ２９Ａ、Ｓ３１Ａ、 Ｎ３７Ａ、 Ａ４２Ｓ、 Ｎ４５Ａ 、Ｑ４７Ａ 、Ｇ４８Ａ、Ｓ５２Ａ、 Ｅ５６Ａ、 Ｇ６５Ａ、 Ｌ６９Ａ 、Ｇ７１Ａ）。突然変異できたプラスミドおよび野生型プラスミドを実施例１における方法によってそれぞれ２９３Ｆｖ細胞に形質移入し、４８時間後、細胞を取ってフローサイトメトリーの検出を行った。
【0193】
ｈｕ７８２、Ｒｅｆ．ｃｈ１７５およびアイソタイプ対照（ＩｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌｈＩｇＧ１）を１０μｇ／ｍｌになるように希釈し、それぞれ以上の形質移入細胞と氷の上で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１：４００で希釈されたヒツジ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ二次抗体を入れ、氷の上で４５ ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、３００μｌの仕込み緩衝液を入れ、ＢＤフローサイトメトリー管に移し、ＢＤ ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトによって平均蛍光強度ＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の結果を分析し、結果の判定では、突然変異後の形質移入細胞のＭＦＩが野生型に対して５０％以上低下した場合、当該部位を抗体の結合に影響する重要なアミノ酸部位とした。
【0194】
結果から、図１１に示すように、本発明のＡ４２Ｓ、Ｎ４５Ａ、Ｅ５６Ａ突然変異は参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５の結合に影響が大きかったが、Ａ４２Ｓ突然変異はｈｕ７８２の結合に影響がなく、Ｎ４５Ａ突然変異はｈｕ７８２の結合に影響が小さく、Ｅ５６Ａ突然変異ははｈｕ７８２の結合に影響が大きかったことが示された。同時に、本発明では、意外に、ｈＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１とｈＣＬＤＮ１８．１ ＥＣＬ１の同様のアミノ酸部位Ｇ４８Ａが突然変異すると、参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５およびｈｕ７８２はいずれも結合できないことが見出された。
【0195】
実施例１９：ヒト化抗体の体内活性の評価
本実施例において、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへの腫瘍細胞の皮下移植によってＣＤＸ動物モデルを構築し、ヒト化抗体の体内薬効を評価した。
本実施例において、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへの腫瘍細胞の皮下移植によってＣＤＸ動物モデルを構築し、ヒト化抗体の体内薬効を評価した。
【0196】
実施例１の方法によって構築されたＮＵＧＣ４－ｈＣＬＤＮ１８．２安定形質移入細胞株を使用し、拡大培養を行った。４～６週齢の雌ＳＰＦ級ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを選び、３－４日の適応性飼育後、腫瘍接種を準備した。対数生長期の組み換えＮＵＧＣ４－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を、消化後、無血清１６４０培地で２回洗浄した後、２．５×１０７／ｍｌになるように希釈し、マウスの右側の脇下の皮下に０．２ｍｌ、計５×１０６個細胞／匹で接種した。接種１週間後、腫瘍が７０～１００ ｍｍ３に生長すると、６匹／群でランダムに群分けした。ブランクモデル群はＩｇＧ１アイソタイプ対照である。実験群では、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、投与頻度は週に２回で、交代に腹腔注射と静脈注射で投与し、毎回の投与前に腫瘍体積およびマウス体重のデータを記録した。
【0197】
腫瘍体積は、Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｗ２ｘ Ｌ）／２で計算され、Ｗは腫瘍の中線付近の短径で、Ｌは腫瘍の中線付近の長径である。
腫瘍体積が２０００ ｍｍ３超になるか、体重の減少が２０％超になるか、あるいは重要な生理機能への干渉または腫瘍性潰瘍・壊死が観察されると、頚椎脱臼法でマウスを殺処分した。
腫瘍体積が２０００ ｍｍ３超になるか、体重の減少が２０％超になるか、あるいは重要な生理機能への干渉または腫瘍性潰瘍・壊死が観察されると、頚椎脱臼法でマウスを殺処分した。
【0198】
腫瘍抑制率（ＴＧＩ）の計算式は以下の通りである。
Ｖｔ－Ｖ０＝（投与群のｔ日目の平均腫瘍体積）－（同群の群分けの当日の平均腫瘍体積）
Ｖｔ－Ｖｃ０＝（投与群のｔ日目の平均腫瘍体積）－（同群の群分けの当日の平均腫瘍体積）
【数1】
Ｖｔ－Ｖｃ０＝（投与群のｔ日目の平均腫瘍体積）－（同群の群分けの当日の平均腫瘍体積）
【0199】
ＮＵＧＣ４－ｈＣＬＤＮ１８．２マウス皮下移植腫瘍モデルにおいて、本発明のヒト化抗体およびその突然変異体の抗腫瘍生長活性が観察され、いずれもある程度の薬効が示された。終了時、各群の腫瘍体積は下記表に示す。
【表18】
【0200】
ヒト化抗体ｈｕ７８２およびその突然変異体ｈｕ７８２－ＨＶ、ｈｕ７８２－ＤＥ群では、腫瘍抑制率がいずれも顕著にＲｅｆ．ｃｈ１７５群よりも高く、特にｈｕ７８２およびそのＡＤＣＣ増強突然変異抗体ｈｕ７８２－ＤＥ群では、腫瘍抑制率がそれぞれ６２．８８％および６５．０５％に達した。また、ｈｕ７８２群における６匹のマウスのうち、１匹のマウスに腫瘍が完全に消退したのが観察され、ｈｕ７８２－ＤＥ群における６匹のマウスのうち、２匹のマウスに腫瘍が完全に消退したのが観察されたが、Ｒｅｆ．ｃｈ１７５群およびｈｕ７８２－ＨＶ群のいずれも、当該現象が観察されなかった。
【0201】
上記結果から、本発明の抗体（特にヒト化抗体）は体内薬効が顕著に参照抗体Ｒｅｆ．ｃｈ１７５よりも良いことが示された。
【0202】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の重鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：（１）アミノ酸配列が配列番号３で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１；
（２）アミノ酸配列が配列番号４または１６で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２；および
（３）アミノ酸配列が配列番号５または１７で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３
を含むことを特徴とする、前記重鎖可変領域。
【請求項2】
請求項１に記載の抗体の重鎖可変領域を有することを特徴とする、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体重鎖。
【請求項3】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の軽鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ’：（１）アミノ酸配列が配列番号８で示される、相補性決定領域ＣＤＲ１’；
（２）アミノ酸配列’が配列番号９で示される、相補性決定領域ＣＤＲ２’；および
（３）アミノ酸配列’が配列番号１０で示される、相補性決定領域ＣＤＲ３’
を含むことを特徴とする、前記軽鎖可変領域。
【請求項4】
請求項３に記載の抗体の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体軽鎖。
【請求項5】
抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体であって、（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域
を有するか、または、請求項２に記載の重鎖、および／また請求項４に記載の軽鎖を有することを特徴とする、前記抗体。
【請求項6】
前記抗体は、配列番号１、１１、１２、または１３で示される重鎖可変領域；および／または配列番号６、１４または１５で示される軽鎖可変領域を有することを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
組み換えタンパク質であって、（ｉ）請求項５に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列
を有することを特徴とする、前記タンパク質。
【請求項8】
抗体製剤であって、（ａ）請求項５に記載の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体、ならびに
（ｂ）緩衝剤、無菌水、任意の界面活性剤を含むビヒクル
を含むことを特徴とする、前記抗体製剤。
【請求項9】
ＣＡＲ構築物であって、前記ＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する結合領域であり、かつ前記ｓｃＦｖは、請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記ＣＡＲ構築物。
【請求項10】
外来の請求項９に記載のＣＡＲ構築物を発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
【請求項11】
抗体薬物複合体であって、（ａ）請求項５に記載の抗体を含む抗体部分と、
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分と
を含有することを特徴とする、前記抗体薬物複合体。
【請求項12】
活性成分の使用であって、前記活性成分は、請求項５に記載の抗体であり、前記活性成分は、（ａ）検出試薬またはキットの製造、
（ｂ）ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する薬物または製剤の製造、ならびに／あるいは
（ｃ）癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造
のために用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項13】
薬物組成物であって、（ｉ）請求項５に記載の抗体である活性成分と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含有することを特徴とする、前記組成物。
【請求項14】
請求項５に記載の抗体をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項15】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項16】
遺伝子操作された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１５に記載のベクターを含むことを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項17】
体外でサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質を検出する方法であって、以下の工程：（１）体外において、前記サンプルを請求項５に記載の抗体と接触させること；
（２）抗原－抗体複合体が形成されたかを検出すること、ここで、複合体が形成されたというのはサンプルにＣＬＤＮ１８．２タンパク質が存在することを意味する
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項18】
基板（支持プレート）およびテストストリップを含む検出プレートであって、前記テストストリップが請求項５に記載の抗体を含有することを特徴とする、前記検出プレート。
【請求項19】
キットであって、（１）請求項５に記載の抗体を含有する第一の容器、および／または
（２）請求項５に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器
を含むことを特徴とする、前記キット。
【請求項20】
ＣＬＤＮ１８．２関連疾患を予防および／または治療する方法に用いるための組成物であって、請求項５に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、前記組成物。
【国際調査報告】