特表 2024-545089 ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ切断産物を捕捉する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-05

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ切断産物を捕捉する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20241128BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241128BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241128BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALN20241128BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241128BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6869 Z ZNA

C12Q1/686 Z

C12Q1/6855 Z

C12N15/09 100

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024533973

(86)(22)【出願日】2022-12-05

(85)【翻訳文提出日】2024-06-06

(86)【国際出願番号】 US2022080938

(87)【国際公開番号】W WO2023107899

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】63/286,922

(32)【優先日】2021-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515251115

【氏名又は名称】カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】スコット・デーヴィッド・グラディア

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA20

4B063QQ01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR23

4B063QR62

4B063QS25

(57)【要約】

本発明は、増幅及び配列決定を含む下流分析のために、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ切断などのエンドヌクレアーゼ切断によって形成されるＤＮＡ末端を捕捉する方法である。
【選択図】図なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を捕捉する方法であって、
ａ．３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、前記標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、
ｂ．前記核酸を、第２の５’オーバーハングであって、前記第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、前記第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることと、
ｃ．第１の３’末端のうちの少なくとも１つを前記第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することによって標的核酸を捕捉することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記アダプターが、第２の陥凹型３’末端を更に含み、ステップｃ．における前記連結が、前記第１の５’末端を第２の３’末端と連結することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、平滑末端の一部である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、３’オーバーハングの一部である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた前記核酸の切断によって生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項５に記載の方法。

【請求項11】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記触媒が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満の存在下で示される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

ステップａ．における前記接触が、前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満と接触することを更に含み、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記４つ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つと同一のヌクレオチドで停止する、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満が、単一のｄＮＴＰであり、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記単一のｄＮＴＰと同一のヌクレオチドで停止する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記５’オーバーハングが、２～１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記アダプターが、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記バーコードが、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記アダプターが、ＵＭＩ及びＳＩＤを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記アダプターが、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記アダプターが、前記３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、前記５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記アダプターが、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記アダプターが、配列番号７～１１から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記連結が、ライゲーションによるものであり、前記核酸又は前記アダプターをリン酸化することが先行する、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記リン酸化が、ポリヌクレオチドキナーゼを用いたものである、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

捕捉された前記核酸を増幅することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

増幅プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記増幅プライマーが、配列番号１２～１６から選択される配列を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記増幅が、線形増幅である、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記増幅が、ＰＣＲによる指数関数的増幅である、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記ＰＣＲが、５、１０、２０、３０、又は４０サイクルを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記アダプターが、捕捉部位に連結され、前記方法が、前記適合核酸中の前記捕捉部位を捕捉し、それによって、前記核酸を捕捉することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

前記捕捉部位が、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記捕捉された核酸を配列決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項37】

配列決定プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記配列決定が、増幅後に生じる、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

配列決定プライマーが、前記増幅プライマーに存在するプライマー結合部位にアニールする、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記捕捉された核酸が、１、１０、又は１００ｋｂ長である、請求項１に記載の方法。

【請求項41】

ステップａ．とｂ．との間、又はａ．とｃ．との間に、精製ステップが実施されない、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

標的核酸及び非標的核酸を含む試料中の標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ．３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、前記標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、
ｂ．前記核酸を、第２の５’オーバーハングであって、前記第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、前記第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることと、
ｃ．第１の３’末端のうちの少なくとも１つを前記第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、
ｄ．前記適合核酸を配列決定することと、を含む、方法。

【請求項43】

前記アダプターが、第２の陥凹型３’末端を更に含み、ステップｃ．における前記連結が、前記第１の５’末端を第２の３’末端と連結することを更に含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項44】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、平滑末端の一部である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、３’オーバーハングの一部である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた前記核酸の切断によって生成される、請求項４３に記載の方法。

【請求項47】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載の方法。

【請求項48】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項４７に記載の方法。

【請求項52】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記触媒が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４３に記載の方法。

【請求項53】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである、請求項４３に記載の方法。

【請求項54】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する、請求項４３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

【請求項56】

前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満の存在下で示される、請求項４３に記載の方法。

【請求項57】

ステップａ．における前記接触が、前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満と接触することを更に含み、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記４つ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つと同一のヌクレオチドで停止する、請求項４３に記載の方法。

【請求項58】

前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満が、単一のｄＮＴＰであり、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記単一のｄＮＴＰと同一のヌクレオチドで停止する、請求項５８に記載の方法。

【請求項59】

前記５’オーバーハングが、２～１５ヌクレオチド長である、請求項４３に記載の方法。

【請求項60】

前記アダプターが、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項61】

前記バーコードが、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）から選択される、請求項６１に記載の方法。

【請求項62】

前記アダプターが、ＵＭＩ及びＳＩＤを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記アダプターが、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される、請求項４３に記載の方法。

【請求項64】

前記アダプターが、前記３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、前記５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する、請求項４３に記載の方法。

【請求項65】

前記アダプターが、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項66】

前記アダプターが、配列番号７～１１から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項67】

前記連結が、ライゲーションによるものであり、前記核酸又は前記アダプターをリン酸化することが先行する、請求項４３に記載の方法。

【請求項68】

前記リン酸化が、ポリヌクレオチドキナーゼを用いたものである、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

ステップｄの前に、前記捕捉された核酸を増幅することを更に含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項70】

増幅プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記増幅プライマーが、配列番号１１～１６から選択される配列を含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記増幅が、線形増幅である、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

前記増幅が、ＰＣＲによる指数関数的増幅である、請求項６９に記載の方法。

【請求項74】

前記ＰＣＲが、５、１０、２０、３０、又は４０サイクルを含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

配列決定プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項４３に記載の方法。

【請求項76】

配列決定プライマーが、前記増幅プライマーに存在するプライマー結合部位にアニールする、請求項６９に記載の方法。

【請求項77】

配列決定された前記核酸が、１、１０、又は１００ｋｂ長である、請求項４３に記載の方法。

【請求項78】

ステップａ．とｂ．との間、又はａ．とｃ．との間、又はａ．とｄ．との間に、精製ステップが実施されない、請求項４３に記載の方法。

【請求項79】

標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮する方法であって、
ａ．３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、前記標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、
ｂ．前記核酸を、第２の５’オーバーハングであって、前記第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、前記第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることであって、前記アダプターが、捕捉部分を更に含む、接触させることと、
ｃ．第１の３’末端のうちの少なくとも１つを前記第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、
ｄ．前記アダプター上の前記捕捉部位を捕捉し、それによって、前記試料から前記標的核酸を濃縮することと、を含む、方法。

【請求項80】

前記アダプターが、第２の陥凹型３’末端を更に含み、ステップｃ．における前記連結が、前記第１の５’末端を前記第２の３’末端と連結することを更に含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、平滑末端の一部である、請求項７９に記載の方法。

【請求項82】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、３’オーバーハングの一部である、請求項７９に記載の方法。

【請求項83】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた前記核酸の切断によって生成される、請求項７９に記載の方法。

【請求項84】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項８４に記載の方法。

【請求項87】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項８４に記載の方法。

【請求項88】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項８４に記載の方法。

【請求項89】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記触媒が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項７９に記載の方法。

【請求項90】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである、請求項７９に記載の方法。

【請求項91】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する、請求項７９に記載の方法。

【請求項92】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。

【請求項93】

前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満の存在下で示される、請求項７９に記載の方法。

【請求項94】

ステップａ．における前記接触が、前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満と接触することを更に含み、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記４つ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つと同一のヌクレオチドで停止する、請求項７９に記載の方法。

【請求項95】

前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満が、単一のｄＮＴＰであり、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記単一のｄＮＴＰと同一のヌクレオチドで停止する、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記５’オーバーハングが、２～１５ヌクレオチド長である、請求項７９に記載の方法。

【請求項97】

前記アダプターが、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項98】

前記バーコードが、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）から選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記アダプターが、ＵＭＩ及びＳＩＤを含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

前記アダプターが、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される、請求項７９に記載の方法。

【請求項101】

前記アダプターが、前記３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、前記５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する、請求項７９に記載の方法。

【請求項102】

前記アダプターが、配列番号７～１１から選択される配列を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項103】

前記アダプターが、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項104】

前記連結が、ライゲーションによるものであり、前記核酸又は前記アダプターをリン酸化することが先行する、請求項７９に記載の方法。

【請求項105】

前記リン酸化が、ポリヌクレオチドキナーゼを用いたものである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

濃縮された前記核酸を増幅することを更に含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項107】

増幅プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記増幅プライマーが、配列番号１２～１６から選択される配列を含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項109】

前記増幅が、線形増幅である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項110】

前記増幅が、ＰＣＲによる指数関数的増幅である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項111】

前記ＰＣＲが、５、１０、２０、３０、又は４０サイクルを含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記濃縮された核酸を前記試料から分離することを更に含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項113】

前記捕捉部位が、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される、請求項７９に記載の方法。

【請求項114】

前記濃縮された核酸を配列決定することを更に含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項115】

配列決定プライマーが、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールする、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記配列決定が、増幅後に生じる、請求項１１４に記載の方法。

【請求項117】

配列決定プライマーが、前記増幅プライマーに存在するプライマー結合部位にアニールする、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記濃縮された核酸が、１、１０、又は１００ｋｂ長である、請求項７９に記載の方法。

【請求項119】

ステップａ．とｂ．との間、又はａ．とｃ．との間に、精製ステップが実施されない、請求項７９に記載の方法。

【請求項120】

標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮するためのキットであって、
ａ．３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有し、核酸中に５’－オーバーハングを生成することが可能な触媒と、
ｂ．５’末端に５’オーバーハングを有するように操作されたアダプターであって、前記５’オーバーハングが、前記触媒を用いた処理時に標的核酸において予期される５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、
ｃ．ＤＮＡリガーゼと、を含む、キット。

【請求項121】

前記アダプターが、二本鎖であり、第２の陥凹型３’末端を更に含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項122】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記触媒が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２０に記載のキット。

【請求項123】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである、請求項１２０に記載のキット。

【請求項124】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する、請求項１２０に記載のキット。

【請求項125】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される、請求項１２０に記載のキット。

【請求項126】

ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つ以上を更に含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項127】

前記アダプター中の前記５’オーバーハングが、２～１５ヌクレオチド長である、請求項１２０に記載のキット。

【請求項128】

前記アダプターが、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項129】

前記バーコードが、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）から選択される、請求項１２８に記載のキット。

【請求項130】

前記アダプターが、ＵＭＩ及びＳＩＤを含む、請求項１２９に記載のキット。

【請求項131】

前記アダプターが、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される、請求項１２０に記載の方法。

【請求項132】

前記アダプターが、前記３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、前記５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する、請求項１２０に記載の方法。

【請求項133】

前記アダプターが、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項134】

前記アダプターが、配列番号７～１１から選択される配列を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項135】

前記アダプターが、捕捉部位に連結されている、請求項１２０に記載のキット。

【請求項136】

前記捕捉部位が、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

ポリヌクレオチドキナーゼを更に含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項138】

核酸を増幅するための試薬を更に含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項139】

前記増幅試薬が、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能な増幅プライマーを含む、請求項１３８に記載のキット。

【請求項140】

前記増幅プライマーが、配列番号１２～１６から選択される配列を含む、請求項１３８に記載のキット。

【請求項141】

核酸を配列決定するための試薬を更に含む、請求項１２０に記載のキット。

【請求項142】

前記配列決定試薬が、前記アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能な配列決定プライマーを含む、請求項１４１に記載のキット。

【請求項143】

標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮するための反応混合物であって、
ａ．３’末端を有する二本鎖標的核酸と、
ｂ．第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、前記標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することが可能な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と、
ｃ．第２の５’末端に第２の５’オーバーハングを有するアダプターであって、前記第２の５’オーバーハングが、前記第１の５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、を含む、反応混合物。

【請求項144】

ＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項145】

前記アダプターが、二本鎖であり、第２の陥凹型３’末端を更に含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項146】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、平滑末端の一部である、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項147】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、３’オーバーハングの一部である、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項148】

前記二本鎖標的核酸の前記３’末端が、配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた前記核酸の切断によって生成される、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項149】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４８に記載の反応混合物。

【請求項150】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項１４８に記載の反応混合物。

【請求項151】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項１４８に記載の反応混合物。

【請求項152】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項１４８に記載の反応混合物。

【請求項153】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、請求項１４８に記載の反応混合物。

【請求項154】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記触媒が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項155】

３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項156】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項157】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項158】

ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのうちの４つ未満を更に含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項159】

前記ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満が、単一のｄＮＴＰであり、前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が、前記単一のｄＮＴＰと同一のヌクレオチドで停止する、請求項１５８に記載の反応混合物。

【請求項160】

前記５’オーバーハングが、２～１５ヌクレオチド長である、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項161】

前記アダプターが、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項162】

前記バーコードが、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）から選択される、請求項１６１に記載の反応混合物。

【請求項163】

前記アダプターが、ＵＭＩ及びＳＩＤを含む、請求項１６１に記載の反応混合物。

【請求項164】

前記アダプターが、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項165】

前記アダプターが、配列番号７～１１から選択される配列を含む、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項166】

前記アダプターが、捕捉部位に連結されている、請求項１４３に記載の反応混合物。

【請求項167】

前記捕捉部位が、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される、請求項１６６に記載の反応混合物。

【請求項168】

前記捕捉された核酸が、１、１０、又は１００ｋｂ長である、請求項１４３に記載の反応混合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸及びエンドヌクレアーゼ関連方法の分野に関し、より具体的には、配列決定などの下流分析のために核酸を捕捉する方法に関する。

【0002】

連邦支援研究に関する記述
なし。

【0003】

配列表
プレースホルダー。

【背景技術】

【0004】

クローニングベクター又はアダプターによる核酸の捕捉は、ライゲーションに依拠する。より効率的なライゲーションは、ライゲーションされる核酸の適合性粘着末端を伴う、すなわち、核酸は、ライゲーションパートナーのオーバーハングにハイブリダイズすることが可能なオーバーハングを有する。粘着末端ライゲーションは、ライゲーションパートナーがライゲーションの前にいずれのハイブリッドも形成しない、平滑末端のライゲーションよりも動力学的に有利である。この理由により、好評なライゲーション方法は、ｄＡテーリングを介して１塩基粘着末端を生成することを伴う。酵素的又は化学的手段が、一方のライゲーションにｄＡオーバーハングを付加し、他方のライゲーションパートナーにｄＴオーバーハングを付加するために採用される。ｄＡテーリング又はＴＡクローニングは、ライブラリ形成のクローニング及び配列決定に使用される。

【0005】

ｄＡテーリング方法は、その単純性のために好まれるが、本方法は、いくつかの不利点を有する。第１に、挿入されたＡヌクレオチドは、捕捉された配列がコード配列又はコード配列の一部である場合、不要である。第２に、ｄＡテーリング捕捉は、非特異的である。アクセス可能な３’末端を有する試料中の全ての核酸は、３’末端Ａを受容するように末端トランスフェラーゼによって修飾され、それによって、所望の核酸及び望ましくない核酸の両方が、ライゲーション反応のための基質となる。

【0006】

制限エンドヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって切断された核酸を捕捉する正確かつ効率的な方法の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、５’オーバーハングを有するアダプターが効率的にライゲーションされ得るように、制御されたエキソヌクレアーゼ消化を介して５’オーバーハングを生成することによって、エンドヌクレアーゼ切断核酸末端を捕捉する方法を提供する。本方法は、より効率的かつより特異的であるｄＡテーリング方法の代替である。

【0008】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を捕捉する方法であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、核酸を、第２の５’オーバーハングであって、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることと、第１の３’末端のうちの少なくとも１つを第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することによって標的核酸を捕捉することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、アダプターは、第２の陥凹型３’末端を更に含み、連結は、第１の５’末端を第２の３’末端と連結することを更に含む。いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端は、平滑末端の一部である。いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端は、３’オーバーハングの一部である。いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端は、配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた核酸の切断によって生成される。

【0009】

いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である。いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である。いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒は、ＤＮＡポリメラーゼである。

【0010】

いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満の存在下で示され、接触は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満とのものであり、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、４つ未満のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つと同一のヌクレオチドで停止する。いくつかの実施形態では、単一のｄＮＴＰが使用され、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、単一のｄＮＴＰと同一のヌクレオチドで停止する。

【0012】

いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２～１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、アダプターは、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）又は両方から選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、アダプターは、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される。いくつかの実施形態では、アダプターは、３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する。いくつかの実施形態では、アダプターは、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、配列番号７～１１から選択される配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、連結は、ライゲーションによるものであり、すなわち、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、核酸又はアダプターをリン酸化することが先行する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、アダプター中のプライマー結合部位にアニールする増幅プライマーを用いて、捕捉された核酸を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマーは、配列番号１２～１６から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅は、線形増幅である。いくつかの実施形態では、増幅は、例えば、５、１０、２０、３０、又は４０サイクルを含む、ＰＣＲによる指数関数的増幅である。

【0016】

いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉部位に連結され、本方法は、適合核酸中の捕捉部位を捕捉し、それによって、核酸を捕捉することを更に含む。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される。

【0017】

いくつかの実施形態では、本方法は、捕捉された核酸を配列決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、アダプター中のプライマー結合部位にアニールする。いくつかの実施形態では、配列決定は、増幅後に生じる。いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、増幅プライマーに存在するプライマー結合部位にアニールする。いくつかの実施形態では、捕捉された核酸は、１、１０、又は１００ｋｂ長である。

【0018】

いくつかの実施形態では、本方法は、中間精製ステップを含まない。

【0019】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料中の標的核酸を配列決定する方法であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、核酸を、第２の５’オーバーハングであって、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることと、第１の３’末端のうちの少なくとも１つを第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、適合核酸を配列決定することと、を含む、方法である。

【0020】

いくつかの実施形態では、本方法は、配列決定の前に捕捉された核酸を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、配列決定された核酸は、１、１０、又は１００ｋｂ長である。

【0021】

いくつかの実施形態では、配列決定方法は、中間精製ステップを含まない。

【0022】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮する方法であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することと、核酸を、第２の５’オーバーハングであって、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることであって、アダプターが、捕捉部分を更に含む、接触させることと、第１の３’末端のうちの少なくとも１つを第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、アダプター上の捕捉部位を捕捉し、それによって、試料から標的核酸を濃縮することと、を含む、方法である。

【0023】

いくつかの実施形態では、濃縮された核酸は、１、１０、又は１００ｋｂ長である。

【0024】

いくつかの実施形態では、濃縮方法は、中間精製ステップを含まない。

【0025】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮するためのキットであって、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有し、核酸中に５’－オーバーハングを生成することが可能な触媒と、５’末端に５’オーバーハングを有するように操作されたアダプターであって、５’オーバーハングが、触媒を用いた処理時に標的核酸において予期される５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、ＤＮＡリガーゼと、を含む、キットである。

【0026】

いくつかの実施形態では、アダプターは、二本鎖であり、第２の陥凹型３’末端を更に含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒は、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される。

【0028】

いくつかの実施形態では、キットは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのうちの１つ以上を更に含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、アダプター中の５’オーバーハングは、２～１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、アダプターは、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）又は両方から選択される。いくつかの実施形態では、アダプターは、２つの核酸鎖のアニーリングによって形成される。いくつかの実施形態では、アダプターは、３’末端のエキソヌクレアーゼ消化によって形成されて、５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを生成する。いくつかの実施形態では、アダプターは、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、配列番号７～１１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉部分、すなわち、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列に連結される。

【0030】

いくつかの実施形態では、キットは、ポリヌクレオチドキナーゼと、核酸を増幅するための試薬（例えば、アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能な増幅プライマー）と、核酸を配列決定するための試薬（例えば、アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能な配列決定プライマー）と、を更に含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマーは、配列番号１２～１６から選択される配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮するための反応混合物であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸と、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することが可能な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と、第２の５’末端に第２の５’オーバーハングを有するアダプターであって、第２の５’オーバーハングが、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、任意選択的に、ＤＮＡリガーゼと、を含む、反応混合物である。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって切断された標的配列に適用される方法の図である。二本鎖ＤＮＡ切断、エキソヌクレアーゼ消化、及びアダプターライゲーションのステップが示されている。

【図2】エンドヌクレアーゼ切断部位の位置、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ認識配列（スペーサー配列）、及び増幅プライマー結合部位の位置を示す、標的ＤＮＡ遺伝子座の図である。

【図3】プラスミドＤＮＡ標的に適用され、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、ガイドｃｒＲＮＡ ＣｒＡ及びＣｒＢを含む、Ｔ／Ａアダプターライゲーション（従来技術）の実験結果を示す。

【図4】プラスミドＤＮＡ標的に適用され、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、ガイドｃｒＲＮＡ ＣｒＡ及びＣｒＢを含む、本発明の方法の実験結果を示す。

【図5】ゲノムＤＮＡ標的に適用され、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、ガイドｃｒＲＮＡ ＣｒＡ及びＣｒＢを含む、Ｔ／Ａアダプターライゲーション（従来技術）の実験結果を示す。

【図6】ゲノムＤＮＡ標的に適用され、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、ガイドｃｒＲＮＡ ＣｒＡ及びＣｒＢを含む、本発明の方法の実験結果を示す。

【図7】ゲノムＤＮＡ標的に適用され、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が、ガイドｃｒＲＮＡ ＣｒＣ及びＣｒＤを含む、本発明の方法の実験結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。

【0034】

以下の定義は、本開示の理解を助けるために提供される。

【0035】

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）内の２つのヌクレオシド残基間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指し、いずれのヌクレオシド残基も、末端のものではない。エンドヌクレアーゼは、一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することができる。一本鎖エンドヌクレアーゼは、「ニッカーゼ」と称される。二本鎖切断は、平滑（平滑末端が生成される）又はねじれ形（突出若しくは陥凹型末端が生成される）であり得る。

【0036】

「エキソヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）内の末端ヌクレオシド残基と最後から２番目のヌクレオシド残基との間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指す。エキソヌクレアーゼは、プロセッシブであるか、又は核酸鎖の末端から複数のヌクレオシド残基を段階的に除去することが可能である。

【0037】

「ＣＲＩＳＰＲ反復」又は「ＣＲＩＳＰＲ反復配列」という用語は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を指す。

【0038】

「エンドリボヌクレアーゼ」という用語は、ＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解が可能な酵素を指す。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼは、部位特異的ポリペプチドであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）のメンバーであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、タンパク質の反復関連未確認タンパク質（ＲＡＭＰ）スーパーファミリー（例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６、Ｃａｓ５ファミリー）を指し得る。エンドリボヌクレアーゼはまた、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーメンバー（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅ Ｎ）、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ１、ＲＮａｓｅ Ｖを含むこともできる。

【0039】

「阻害すること」という用語は、化学反応を部分的又は完全に阻害する化学構造の能力を指す。当業者は、阻害が部分的又は完全であるかどうかが、検出方法の感度に依存することを理解するであろう。ヌクレアーゼに関して「切断を阻害すること」という用語は、切断産物の量を検出可能に減少させる能力を指す。ヌクレアーゼに関して「切断を防止すること」という用語は、検出レベルを下回って切断産物の量を減少させる能力を指す。

【0040】

「ＮＡＴＮＡ」という用語は、核酸標的化核酸を指す。ＮＡＴＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系などのプログラム可能なエンドヌクレアーゼ系の一部であり得る。ＮＡＴＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、２つの核酸標的化ポリヌクレオチド（「二重ガイド」）からなり得る。ＮＡＴＮＡは、融合領域（リンカー）によって接続されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、単一の核酸標的化ポリヌクレオチド（「単一ガイド」）からなり得る。ｃｒＲＮＡは、標的化領域及び活性化領域を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの活性化領域にハイブリダイズすることが可能な領域を含み得る。「標的領域」という用語は、標的核酸中の配列にハイブリダイズすることが可能である領域を指す。「活性化領域」という用語は、ポリペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する領域を指す。

【0041】

「アダプター」という用語は、試料中の核酸に付加された核酸を指す。典型的には、同じアダプターが、試料中の複数の核酸に付加される。「同じアダプター」という用語は、異なるバーコード（以下に定義される）を除いて同じ配列を有するアダプターを含む。アダプターという用語は、一本鎖アダプター、部分的一本鎖（部分的二本鎖と交換可能）アダプター、及び二本鎖アダプターを包含する。核酸に関する「オーバーハング」という用語は、部分的二本鎖核酸の一本鎖末端部分を指す。核酸に関する「陥凹型」及び「陥凹型末端」という用語は、部分的二本鎖核酸の二本鎖部分を終端する末端を指す。部分的二本鎖核酸では、一方の鎖の陥凹型末端は、反対の鎖上のオーバーハングの開始を示す。

【0042】

「バーコード」という用語は、識別の目的のために別の配列に導入された核酸配列を指す。バーコードは、一般に、２以上で最大約５０ヌクレオチド長であり得る。バーコードは、試料中の他のバーコードと少なくとも最小数の差異を有するように設計されている。バーコードは、試料中の各分子に特有又は試料に特有であり、試料中の複数の分子によって共有され得る。「多重識別子」、「ＭＩＤ」、又は「試料識別子」、「ＳＩＤ」は、試料又は試料の供給源を識別するバーコードを指す。したがって、単一の供給源又は試料からの全て又は実質的に全てのＭＩＤバーコード付きポリヌクレオチドが、同じ配列のＭＩＤを共有するであろう一方で、異なる供給源又は試料からの全て又は実質的に全て（例えば、少なくとも９０％若しくは９９％）のＭＩＤバーコード付きポリヌクレオチドは、異なるＭＩＤバーコード配列を有するであろう。異なるＭＩＤを有する異なる供給源からのポリヌクレオチドは、ＭＩＤバーコードでコードされる試料情報を維持しながら、並行して混合及び配列決定することができる。「一意の分子識別子」、「ＵＭＩ」、又は「ＵＩＤ」という用語は、それが結合しているポリヌクレオチドを識別するバーコードを指す。いくつかの実施形態では、全て又は実質的に全て（例えば、少なくとも９０％若しくは９９％）のＵＭＩバーコードは、試料中のＵＭＩバーコード付きポリヌクレオチドの各々又は実質的に各々が一意のＵＭＩを有するように、一意である。他の実施形態では、試料中のポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第９，９０２，９９２号に記載されているように、試料中のポリヌクレオチドの１～５０％が、少なくとも１つの他のポリヌクレオチドによって共有されるＵＭＩを有するように、非一意的にタグ付けされる。

【0043】

「プライマー」という用語は、一本鎖テンプレート核酸分子の特異的領域に結合し、ポリメラーゼ媒介性酵素反応を介して核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは、約１００個未満のヌクレオチドを含み、好ましくは、約３０個未満のヌクレオチドを含む。標的特異的プライマーは、ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーション条件には、約４０℃～約７０℃の温度での等温増幅緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、２５℃でｐＨ８．８）中のハイブリダイゼーションが含まれるが、これに限定されない。標的結合領域に加えて、プライマーは、典型的には５’部分に追加の領域を有し得る。追加の領域は、ユニバーサルプライマー結合部位又はバーコードを含み得る。

【0044】

「ユニバーサルプライマー」という用語は、試料中の複数の異なる核酸に存在するユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズすることができるプライマーを指す。ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーとは異なり、いずれの配列バイアスもなく、試料中の全ての核酸の増幅をプライミングすることが可能である。ユニバーサルプライマー結合部位は、典型的には非標的特異的様式で標的配列に付加される天然又は人工配列であり得る。

【0045】

「標的」又は「標的核酸」という用語は、試料中の目的の核酸を指す。試料は、複数の標的、並びに各標的の複数のコピーを含有し得る。

【0046】

捕捉の最先端の方法及び核酸は、ｄＴテール付きアダプターのｄＡテーリング及びライゲーションを含む。ｄＡテーリング及び粘着ライゲーションプロセスは、Ａヌクレオチドを第１の核酸の３’末端（例えば、標的又は挿入物）に付加し、Ｔヌクレオチドを第２の核酸の３’末端（例えば、アダプター又はベクター）に付加することを伴う。ｄＡテーリング方法は、配列決定及びクローニングに採用される。例えば、ＰＣＲクローニングは、Ｔａｑポリメラーゼによる天然ｄＡテーリングを利用し、ｄＴテール付きベクターを利用して、粘着末端ライゲーションを可能にする。配列決定ライブラリを作製する際に、ｄＡテーリング方法は、ランダムに断片化されたＤＮＡ（例えば、超音波処理されたＤＮＡ又は自然に断片化された無細胞ＤＮＡ）に適用される。ｄＡテーリング方法はまた、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼによって切断された核酸にも適用されている。Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａｓ９－ｇｕｉｄｅｄ ａｄａｐｔｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４３３を参照されたい。加えて、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム修飾のゲノム配列決定の方法である、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）もまた、ｄＡテーリング方法を利用する。Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ，．（２０１７）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，１４（６），６００－６０６を参照されたい。

【0047】

ライゲーションのための粘着末端を生成する代替的方法は、エキソヌクレアーゼ消化を伴う。例えば、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリは、適合性又は半適合性ＤＮＡ末端を生成する限定されたヌクレアーゼ消化によってＤＮＡの広い伸長範囲を組み立てることを伴う。Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３－３４５、及びＧｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，５２－５６を参照されたい。以前に、タグ付きＰＣＲプライマー及び制御されたエキソヌクレアーゼ消化が、細菌細胞におけるＰＣＲ産物のライゲーション非依存性クローニングのための適合性末端を生成するために使用された。Ａｓｌａｎｉｄｉｓ，Ｃ．ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｐ．，（１９９０）Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＬＩＣ－ＰＣＲ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０６９を参照されたい。

【0048】

本発明は、ｄＡテーリングの代替であり、配列特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ）によって生成されたＤＮＡ末端を捕捉する改良された方法である。本方法は、制御されたエキソヌクレアーゼ活性を捕捉されるＤＮＡの末端に適用して、定義されたセグメントを３’末端から切除し、したがって、５’オーバーハングを生成する。アダプターは、捕捉されるＤＮＡ中の５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能な５’オーバーハングを伴って設計されている。アダプター（又は別の核酸パートナー）は、捕捉されるＤＮＡと特異的な安定したハイブリッドを形成する。次いで、アダプターは、リガーゼによって共有結合され得る。一般的に使用されている３’－Ａ－オーバーハングアダプターライゲーション（「ｄＡテーリング方法」）との本発明の直接比較は、ライゲーション特異性及び効率の改善を実証する。

【0049】

図１に示される図は、本方法の一実施形態を例証する。図１に示される実施例では、平滑末端を有する二本鎖切断が、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって標的ＤＮＡに生成される。末端は、制御された３’－５’エキソヌクレアーゼ活性で処理される。いくつかの実施形態では、制御されたエキソヌクレアーゼ活性は、ｄＮＴＰの非存在下で、又は４つ全て未満のｄＮＴＰの存在下で、例えば、エキソヌクレアーゼ消化が終了する位置を決定する単一のｄＮＴＰのみの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって示される。図１の実施例では、エキソヌクレアーゼは、ｄＧＴＰのみの存在下でのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。この実施例では、エキソヌクレアーゼ消化は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼが消化されている鎖中の最初のＧに遭遇するときに終了する。いくつかの実施形態では、ライゲーションされる３’末端における配列は、４つの塩基のうちの３つのみが存在する、連続した２～１５個のヌクレオチドを含む。このようにして、第４の塩基を有するｄＮＴＰを、エキソヌクレアーゼ反応に付加して、連続した２～１５個のヌクレオチドの末端でエキソヌクレアーゼ活性を停止させることができる。アダプターは、制御されたエキソヌクレアーゼ活性によって生成された５’オーバーハングにアニールするように設計されている。アニールされたアダプターは、リガーゼを使用してライゲーションされる。

【0050】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、最先端のｄＡテーリング方法と比較される。いくつかの実施形態では、選択された標的は、ヒトＴ細胞受容体遺伝子座（Ｔ細胞受容体アルファ定数又はＴＲＡＣ遺伝子座）である。いくつかの実施形態では、配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、反応混合物は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするｃｒＲＮＡが、配列特異的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをＴＲＡＣ遺伝子座に誘導するために付加される。いくつかの実施形態では、いくつかのｃｒＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座のために設計されている。遺伝子座のマップ、ｃｒＲＮＡ（Ｃｒ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）の位置、及び切断部位（矢印）が、図２に示されている。いくつかの実施形態では、各反応は、ｃｒＲＮＡ（例えば、図２のＣｒ－Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ）のうちの１つを含む。

【0051】

エキソヌクレアーゼ切断後、二本鎖切断部位の下流のＤＮＡ末端は、ライゲーションのために標的化される。本発明によるライゲーションのために、反応混合物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）及び４つ未満のｄＮＴＰ（例えば、図１に示される標的配列のためのｄＧＴＰである、単一のｄＮＴＰ）とともにインキュベートされる。

【0052】

ｄＡテーリング及びＴ／Ａライゲーションは、最先端技術に従って並行反応で実施される。

【0053】

アダプターライゲーション後、任意選択的に、ＰＣＲが、適合ＤＮＡを増幅するために実施される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、アダプターにアニールするプライマーを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、エンドヌクレアーゼ切断部位の下流の標的配列にハイブリダイズすることが可能な下流プライマーと対合される。いくつかの実施形態では、図２に示される逆プライマー（ｒｖ－１、２、３、又は４）のうちの１つが、ＴＲＡＣ遺伝子座に使用される。

【0054】

いくつかの実施形態では、増幅された適合ＤＮＡは、例えば、本明細書に例示されるゲル電気泳動によって可視化される。ゲル電気泳動によって評価される本明細書に記載される実施例の結果（図３～７）は、両方の方法が期待サイズのＰＣＲ産物の生成をもたらしたことを実証する。特に、従来技術のｄＡテーリング方法では、複数のアンプリコンが観察され（図３、レーン３、４、７、及び８）、標的ＤＮＡ末端にライゲーションする可能性の高い複数のアダプターを示す。多量体は、本発明の方法では観察されず（図２、６、及び７）、アダプターのより長い５’オーバーハングに起因する方法の特異性の増加を示す。更に、図５（ゲノムＤＮＡ、従来技術のｄＡテーリング）と図６及び７（ゲノムＤＮＡ、本発明）との比較は、より大量の特異的産物及びより少ない望ましくない種を明らかにし、本発明によって達成されるより高い特異性及び効率を示す。

【0055】

本発明は、試料からの核酸を操作する方法を伴う。いくつかの実施形態では、試料は、対象又は患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、生検による、対象又は患者に由来する固形組織又は固形腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、核酸を含有し得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液又は血液画分、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹膜液、胸膜液、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、又は糞便試料）も含み得る。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、核酸が単離され得る細胞及び流体を含有する組織培養物である。いくつかの実施形態では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそこから単離された核酸を含む。試料はまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分などの無細胞材料も含み得る。いくつかの実施形態では、試料中の目的の核酸は、試料の患者源に感染するウイルス、細菌、原虫、又は真菌などの感染性因子に由来する。試料は、ヒト対象、非ヒト対象、又は環境から収集することができる。いくつかの実施形態では、試料は、１つ以上のインビトロ生化学反応を受けた核酸を含有する反応混合物である。

【0056】

本発明は、試料から単離又は抽出された核酸を操作することを伴う。核酸抽出の方法は、当該技術分野で周知である。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”１９８９，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌ．）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ．）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）、Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌ．）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌ．）、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌ．）などからの製品を含む、様々な試薬及びキットが、生物学的試料から核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出するために市販されている。

【0057】

いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、未使用のプライマー及びアダプター、又はライゲーションされていない試料ＤＮＡを除去するために、中間精製又は分離ステップを含む。精製又は分離は、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択方法によって実施され得る。いくつかの実施形態では、サイズ選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，Ｃａｌ．）からの固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）技術を使用して実施することができる。

【0058】

いくつかの実施形態では、非適合性緩衝系を使用することは、陥凹型３’末端を形成するステップ、アダプターをライゲーションするステップ、並びに例えば、増幅及び／又は配列決定によって捕捉された核酸を更に処理するステップの間の精製又は分離ステップを省略することを可能にする。

【0059】

いくつかの実施形態では、本発明は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒（酵素）を利用する。そのような活性は、核酸ポリメラーゼに存在し、例えば、ＤＮＡ複製フォークにおいて活性なＤＮＡポリメラーゼでは、「校正活性」と称されることもある。この活性は、マグネシウムイオンの存在下及びｄＮＴＰの非存在下で示される。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼと比較して、加水分解の速度及び延長は、遅く、プログラム可能である。４つ全て未満のｄＮＴＰが存在する場合、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、切断されている鎖において、反応物中のｄＮＴＰと同一の第１のヌクレオチドに遭遇するまで進行する。図１に示される実施例では、配列３’－ＴＣＣＡＣＣ－５’をより長い配列３’－ＴＣＣＡＣＣＧＴＧ…－５’から除去することが所望される。反応混合物は、３’－５’校正エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及びｄＧＴＰのみを含む。エキソヌクレアーゼは、Ｇ（反応混合物中のｄＧＴＰに対応する）に遭遇するまで、６つのヌクレオチドＴＣＣＡＣＣを除去する。本実施例は、３’末端で加水分解される配列を把握して、３’－５’エキソヌクレアーゼ加水分解が所望の位置まで進行し、所望の５’末端突出が生成されるように、当業者がｄＮＴＰ又は複数のｄＮＴＰを省略することによって方法及び反応混合物を操作することができることを例証する。

【0060】

校正３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、ウイルス、細菌、及び真核生物起源の多くのＤＮＡポリメラーゼに存在する。いくつかの実施形態では、触媒は、ＤＮＡポリメラーゼである。３’－５’校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、及びファミリーＣポリメラーゼから選択され、ポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、及びファミリーＣポリメラーゼから選択され、ＤＮＡポリメラーゼを有するポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有する。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩ δ（デルタ）断片、真核生物ｐｏｌ ε（イプシロン）、真核生物ｐｏｌ δ（デルタ）、及びミトコンドリアｐｏｌ γ（ガンマ）から選択される。

【0063】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、増強された３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、変異ＤＮＡポリメラーゼは、Ｒ３３５Ｃ、Ｌ４１２Ｉ、Ｉ４１７Ｖ、Ｐ４２４Ｌ、Ｑ７３０Ｓ、Ａ７３７Ｖ、及びＡ７７７Ｖから選択される１つ以上の変異を有するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0064】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、低減した３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、変異ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ２１９Ａ、Ｄ１１２Ａ、及びＥ１１４Ａから選択される１つ以上の変異を有するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0065】

いくつかの実施形態では、二本鎖核酸の末端は、配列特異的エンドヌクレアーゼによって生成される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされる。ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物ゲノムで見出され、外来核酸の侵入に対する耐性を提供する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構造、命名法、及び分類は、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１１ Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７－４７７で概説されている。

【0066】

手短に言えば、典型的なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、スペーサーと規則的に間隔を置いたいくつかの短い反復を含む。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子のコード配列も含む。スペーサー反復配列単位は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。インビボでは、成熟ｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ又はｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイと称されるポリシストロニック転写物から処理される。ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイ内の反復は、成熟ｃｒＲＮＡを遊離させる反復に結合し、それを切断するＣａｓコードタンパク質によって認識される。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓタンパク質及びｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ｃｒＲＮＰ）を形成する、標的核酸の切断を実施する。ｃｒＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＰを標的核酸（例えば、細菌細胞に侵入する外来核酸）に誘導し、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸を切断する。

【0067】

Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥのサブユニットからなるカスケード（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれる多重タンパク質複合体を含む、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを処理するための手段を含む。カスケード－ｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡとの標的核酸のハイブリダイゼーションを通して標的核酸を認識する。結合核タンパク質複合体は、Ｃａｓ３ヘリカーゼ／ヌクレアーゼを動員して、標的核酸の切断を促進する。

【0068】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡ反復にハイブリダイズし、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを動員して、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを切断する。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と会合することができる。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体は、ｃｒＲＮＡとの標的核酸のハイブリダイゼーションを通して標的核酸を認識する。標的核酸へのｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断のためにＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化する。

【0069】

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲポリメラーゼ様タンパク質の助けを借りてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを切断する、エンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ６）のＲＡＭＰスーパーファミリーを含む。

【0070】

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ－ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系におけるＣａｓ遺伝子の遠隔相同体であるＣｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４を含む、Ｃａｓ様遺伝子の異なるセットを含む。

【0071】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡとしても知られている核酸標的化核酸（ＮＡＴＮＡ）を必要とする。エンドヌクレアーゼは、１つ以上のガイドＲＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＮＡＴＮＡは、米国特許第９，２６０，７５２号に記載される実施形態から選択される。手短に言えば、ＮＡＴＮＡは、５’から３’までの順序で、スペーサー伸長、スペーサー、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、単一ガイドコネクター、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を含むことができる。いくつかの事例では、核酸標的化核酸は、任意の順序で、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ、単一ガイドコネクター、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、スペーサー、及びスペーサー伸長を含むことができる。

【0073】

いくつかの実施形態では、ガイド核酸標的核酸は、単一ガイドＮＡＴＮＡを含むことができる。ＮＡＴＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズするように操作され得るスペーサー配列を含む。ＮＡＴＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる配列を含むＣＲＩＳＰＲリピートを更に含む。任意選択的に、ＮＡＴＮＡは、スペーサー伸長及びｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を有することができる。これらの要素は、ＮＡＴＮＡの安定性に寄与し得る要素を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、相互作用して、塩基対二本鎖構造を形成することができる。本構造は、ＮＡＴＮＡへのエンドヌクレアーゼの結合を促進することができる。

【0074】

いくつかの実施形態では、単一ガイドＮＡＴＮＡは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーション領域を含む、第１の二重鎖の５’に位置するスペーサー配列を含む。第１の二重鎖は、バルジによって中断され得る。バルジは、ＮＡＴＮＡへのエンドヌクレアーゼの動員を促進する。バルジの後に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を接続するリンカーを含む第１のステムが続くことができる。第１の二重鎖の３’末端における最後の対合ヌクレオチドは、第１の二重鎖をｍｉｄ－ｔｒａｃｒＲＮＡに接続する第２のリンカーに接続され得る。ｍｉｄ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ以上の追加のヘアピンを含むことができる。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＮＡＴＮＡは、二重ガイド核酸構造を含むことができる。二重ガイドＮＡＴＮＡは、スペーサー伸長、スペーサー、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を含む。二重ガイドＮＡＴＮＡは、単一ガイドコネクターを含まない。代わりに、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、３’ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含み、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、二重ガイドＮＡＴＮＡは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を介してハイブリダイズすることができる。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＮＡＴＮＡは、１つ以上のＤＮＡ残基（ＣＲＩＳＰＲハイブリッドＲＤＮＡ又はｃｈＲＤＮＡ）を含む、操作されたガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴＮＡは、米国特許第９，６５０，６１７号に記載されている実施形態から選択される。手短に言えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系とともに使用するためのいくつかのｃｈＲＤＮＡは、上部二重鎖領域、下部二重鎖領域、バルジ、標的化領域、ネクサス、及び１つ以上のヘアピンからなる活性化領域を含む二次構造を形成する２つの鎖からなり得る。標的化領域のすぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な割合のＤＮＡ及びＲＮＡを含み得る。他のｃｈＲＤＮＡは、標的化領域、並びに下部二重鎖領域、上部二重鎖領域、融合領域、バルジ、ネクサス、及び１つ以上のヘアピンからなる活性化領域を含む、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系とともに使用するための単一ガイドＤ（Ｒ）ＮＡであり得る。標的化領域のすぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な割合のＤＮＡ及びＲＮＡを含み得る。例えば、標的化領域は、ＤＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を含み得、活性化領域は、ＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を含み得る。

【0077】

いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、平滑末端を生成する。各エンドヌクレアーゼについて、本発明のアダプターは、捕捉される切除された核酸において本明細書に開示される方法に従って生成される５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能な５’オーバーハングを含む。

【0078】

実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉの切断ドメインにコンジュゲートされた触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、触媒不活性Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ａ）である。（例えば、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｔｏ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（６），５７７－５８２を参照されたい。

【0079】

二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、実施形態では、標的配列は、約２２～５２塩基長であり、４～１８ヌクレオチド長であるスペーサーによって分離された、各々９～１８ヌクレオチド長の一対のＺＦＮ認識配列を含む（例えば、Ｋｉｍ Ｙ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）．Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｏｋ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３（３）：１１５６－１１６０を参照されたい。

【0080】

二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合である、実施形態では、標的配列は、約４８～８５ヌクレオチド長であり、１２～２５塩基長であるスペーサーによって分離された、各々１８～３０塩基長の一対のＴＡＬＥＮ認識配列を含む（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１８６（２）：７５７－６１を参照されたい。

【0081】

図１に示されるように、本明細書に開示される方法及び組成物は、各エンドヌクレアーゼの認識部位及び切断部位と会合した配列を利用する。いくつかの実施形態では、認識配列及び切断部位は、同じである。例えば、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼについては、認識部位は、回文配列であり、切断は、回文配列内で生じる。いくつかの実施形態では、認識部位は、切断部位とは明確に異なる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＳＩＰＲエンドヌクレアーゼであり、認識部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む配列である一方で、切断部位は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする領域（スペーサー領域）内にある。ＰＡＭは、標的配列の既知の伸長範囲に隣接している。

【0082】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、固定配列を切断しないが、代わりに、上記に記載されるように核酸ガイドによって誘導される。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される追加の配列を認識する。本発明は、ＰＡＭ配列並びに標的核酸の既知の配列を利用して、切除された標的核酸の捕捉に影響を及ぼす。図１に示されるように、ＰＡＭ及び隣接する標的配列の短い伸長範囲が、アダプターオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ及びＰＡＭと切断部位との間の短い伸長範囲が、捕捉される切除された核酸において本明細書に開示される方法に従って生成される５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能な５’オーバーハングを設計するために使用される。

【0083】

いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’ ５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、及び５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなる。

【0084】

いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸の３’末端を生成するエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼであり、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、５′－ＮＧＧ－３′、５′－ＮＧＧＮＧ－３′、５′－ＮＮＡＡＡＡＷ－３′、５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３′、５′－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３′、及び５′－ＮＮＮＡＣＡ－３′、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’、並びに５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなる。

【0085】

いくつかの実施形態では、本発明は、核酸又は核酸鎖の少なくとも１つの末端に付加されたアダプターを利用する。アダプターは、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖アダプターであり得る。アダプターは、二本鎖部分が、本明細書に記載される方法に従って二本鎖核酸にライゲーションされる、二本鎖部分を含む。様々な形状及び機能のアダプターが、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，８２２，１５０号（Ｙ字型アダプター）、同第８，４５５，１９３号（ステムループ／ヘアピンアダプター）、及び同第１１，０８５，０８４号（部分的二本鎖アダプターの様々な形状）を参照されたい。いくつかの実施形態では、アダプターの機能は、ある特定の有用な要素を核酸に導入することである。アダプターが持つ要素の例としては、核酸バーコード、増幅プライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位、酵素認識部位、及びライゲーション実現部位が挙げられる。

【0086】

いくつかの実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成された人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成された天然に存在する配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、単離された天然に存在する分子又は単離された天然に存在しない分子である。

【0087】

本発明のいくつかの実施形態では、アダプターは、一本鎖であり、アダプターの５’配列は、標的核酸の５’オーバーハングにハイブリダイズし、アダプターの５’末端は、標的核酸の陥凹型３’末端にライゲーションされる。

【0088】

本発明のいくつかの実施形態では、アダプターは、少なくとも部分的に二本鎖であり、５’オーバーハングを含む。アダプターの５’オーバーハングは、標的核酸の５’オーバーハングにハイブリダイズし、アダプターの５’末端が、標的核酸の陥凹型３’末端にライゲーションされる一方で、アダプターの陥凹型３’末端は、標的核酸の５’末端にライゲーションされる。

【0089】

二本鎖アダプター（又は二本鎖部分を有するアダプター）の場合、アダプターの５’末端における５’オーバーハングは、標的核酸の５’オーバーハングにハイブリダイズすること、及び標的核酸の３’末端にライゲーションされるすることが可能である。

【0090】

いくつかの実施形態では、本発明は、アダプターを設計することを含む。「設計すること」という用語は、本明細書に記載されるアダプターで捕捉することができる標的核酸中の異なる配列の識別を指し、更に、そのような配列へのハイブリダイゼーションを可能にするようにアダプターオリゴヌクレオチドの５’オーバーハングを設計することを指す。本開示に詳述されるように、本方法は、標的核酸中の切断部位の付近に５’オーバーハングを生成することを含む。標的核酸中の切断部位の付近の配列には、既知及び未知の配列が含まれる。既知の配列は、切断部位の付近のエンドヌクレアーゼの認識配列の少なくとも一部分を含む。既知の配列は、エキソヌクレアーゼ消化プロトコルを設計するために使用される。既知の配列は、アダプターオリゴヌクレオチドを設計するために更に使用される。

【0091】

例えば、図１は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって切断された標的核酸を示し、核酸の末端に隣接する既知の配列は、標的配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、及び切断部位までのスペーサー配列の一部を含む。この実施例では、既知の配列５’－ＡＧＧＴＧＧ（Ｎ）_ｎ－３’（隣接する標的配列を含む）が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＧＴＰを含むエキソヌクレアーゼ反応を設計し、標的核酸上に５’－ＡＧＧＴＧＧオーバーハングを生成するために使用される。この実施例では、アダプターは、配列５’－ＣＣＡＣＣＴ－３を含む５’オーバーハングを有するように設計されている。

【0092】

図１に示される実施例では、切断は、ＰＡＭの５’にある第３のヌクレオチドと第４のヌクレオチドヌクレオチドとの間で生じ、これは、スペーサーの第１７のヌクレオチドと第１８のヌクレオチドとの間の位置に相当する。他の実施形態では、他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、スペーサー配列内の異なる位置で切断する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、切断部位を含むスペーサー配列の下流（３’側）にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、切断部位を含むスペーサー配列の上流（５’側）にある。

【0093】

多くの制限エンドヌクレアーゼは、適合性末端との容易なライゲーションを可能にする粘着末端を生成する。しかしながら、多くの制限エンドヌクレアーゼは、平滑末端を生成し、例えば、Ａｆｅ Ｉ、ＡｌｕＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｔｕＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、ＭｓｃＩ、ＮａｅＩＩ、ＮｌａＶＩ、ＮｒｕＩ、ＰｍｌＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳｃａＩ、ＳｆｏＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｗａＩ、及びＺｒａＩは、本方法とともに使用することができる平滑切断酵素のうちのいくつかである。平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼの場合、既知の配列は、標的配列及び回文認識配列を含み、これは、平滑末端カッターについては、回文の中央の二本鎖切断を介して切断される。既知の配列は、エキソヌクレアーゼ消化プロトコルを設計するために使用される。既知の配列は、アダプターオリゴヌクレオチドを設計するために更に使用される。例えば、ＥｃｏＲＶについては、認識配列は、標的配列５’－ＧＡＴＡＴＣ－３’に生じ得る５’－ＧＡＴＡＴＣ－３’である。ＥｃｏＲＶエンドヌクレアーゼ切断は、５’－ＡＴＣ（Ｎ）_ｎ－３’を有する核酸断片を残す。配列５’－ＡＴＣ－３’及び任意の既知の隣接配列が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＣに隣接するヌクレオチドを含むエキソヌクレアーゼ反応を設計し、標的核酸上に５’－ＡＴＣオーバーハングを生成するために使用される。この実施例では、アダプターは、少なくとも配列５’－ＧＡＴ－３’を含む５’オーバーハングを有するように設計されている。

【0094】

当業者は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションが、１００％の相補性又は１００％のワトソン・クリック塩基対合を必要としないことを認識するであろう。いくつかの実施形態では、アダプターの５’オーバーハングと標的核酸の５’オーバーハングとの間の安定したハイブリッドは、正準（ワトソン・クリック）塩基対並びに非正準塩基対及びミスマッチを伴う。いくつかの実施形態では、アダプターは、化学的に修飾された核酸を含有するように設計され、修飾は、安定したハイブリッドの形成を補助する。例えば、アダプターの５’オーバーハングは、二本鎖領域の融解温度を上昇させる化学修飾を含み得る。更に、当業者は、核酸鎖間の安定したハイブリッドの形成が、緩衝液のイオン強度及び温度を含む反応条件に依存することを認識するであろう。したがって、アダプター及び反応条件は、アダプターの５’オーバーハングが、選択された反応条件下で標的核酸の５’オーバーハングと安定したハイブリッドを形成するように、設計及び策定される。

【0095】

カスタム合成オリゴヌクレオチドは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ （Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌ．）、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｐｌａｎｏ，Ｔｅｘ．）、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉａ．）を含む、ホスホロアミダイト化学を利用する多くの商業供給業者から市販されている。他の合成方法が、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌ．）及びＣｕｓｔｏｍ Ａｒｒａｙ／ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈ．）によって採用されている。任意選択的に、本明細書に記載されるアダプターを形成するために使用されるカスタム合成オリゴヌクレオチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの任意の標準的方法によって更に精製され得る。任意選択的に、精製は、ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）などの保護基を利用し得る。例えば、粗オリゴヌクレオチド調製物は、ｐＨ７．１アセトニトリル勾配の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムを使用して、ＲＰ １８ ＨＰＬＣカラム（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ、８×２４０ｍｍ）によって精製することができる。ピーク時のＤＭＴが、収集され、透析を介して脱塩され、蒸発させられ、ｐＨ８．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓに溶解され得る。２６０ｎｍで測定されるＯＤが、収率を評価するために決定され得る。

【0096】

二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドは、好適な緩衝液（例えば、１倍ＴＥ又は１．５倍ＴＥ）を含む反応混合物中で２つの核酸鎖（オーバーハングを含む鎖及びオーバーハングを含まない鎖）を組み合わせることによって、調製され得る。いずれの望ましくない二次構造もない適切なアニーリングを確実にするために、反応混合物は、例えば、９０℃以上まで加熱され、ゆっくりと冷却され得る。いくつかの実施形態では、部分的二本鎖アダプターは、二次構造、例えば、ダンベル、ステムループ、又はヘアピンを成す一本鎖を含む。そのようなアダプターはまた、一本鎖に熱を受けさせ、続いて、適切な緩衝液（例えば、１倍ＴＥ又は１．５倍ＴＥ）中でゆっくりと冷却して、所望の二次構造の形成を確実にすることによって、形成され得る。

【0097】

いくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、アダプターの二本鎖領域の安定性の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、修飾は、エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性又はエキソヌクレアーゼの阻害を付与する。

【0098】

いくつかの実施形態では、修飾は、骨格修飾である。１つの種類の骨格修飾は、修飾ヌクレオシド間結合である。例えば、修飾には、ホスホロチオエート結合及びヘテロ原子ヌクレオシド間結合が含まれる。

【0099】

別の種類の骨格修飾は、糖部分の修飾である。いくつかの実施形態では、修飾は、リボース又はデオキシリボース環の代わりに６員モルホリノ環を組み込むことを伴う。別の骨格修飾は、リボース又はデオキシリボースの代わりにシクロヘキセニル環を組み込むこと（ｃｅＮＡ）を伴う。更に別の骨格修飾は、２’－ヒドロキシル基がリボースの４’炭素原子に連結され、それによって、２′－Ｃ，４′－Ｃ－オキシメチレン結合を有する二環式構造を形成する、ロック核酸（ＬＮＡ）の組み込みを伴う。ＬＮＡは、二重鎖安定性及び３’－５’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を特徴とする。

【0100】

いくつかの実施形態では、修飾は、窒素塩基修飾である。例えば、二本鎖核基質は、１つ以上の５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル、並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンを組み込み得る。修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）、７－デザ－アデニン、７－デアジアグアノシン、２－ピリジン、及び２－ピリドンなどのＧクランプを含むことができる。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を増加させるために有用であり得る。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンを含む、Ｎ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンが含まれ得る。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増加させることができ、好適な塩基置換であり得る（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせられた場合）。

【0101】

いくつかの実施形態では、アダプターの二本鎖部分は、二本鎖部分の融解温度を上昇させる修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、リボヌクレオチド、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチド、又はロック核酸を含む。別の態様では、アダプターは、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むことによって、ヌクレアーゼによる消化を阻害するように修飾される。

【0102】

いくつかの実施形態では、本発明は、バーコードの使用を含む。大規模並列配列決定によって個々の核酸分子を分析することは、典型的には、試料識別及び誤り訂正のために別個のレベルのバーコード化を必要とする。分子バーコードの使用は、例えば、米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、及び同第８，７２２，３６８号に記載されている。一意の分子識別バーコード（ＵＭＩ又はＵＩＤ）が、分子及びその子孫（例えば、元の分子及びＰＣＲによって生成されるそのアンプリコン）をマークするために、配列決定される各分子に付加される。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、増幅プライマーの５’部分に存在する。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、核酸にライゲーションされたアダプターに存在する。

【0103】

ＵＭＩは、試料中の元の標的分子の数の計数及び誤り訂正を含む、複数の用途を有する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。手短に言えば、単一の標的分子の子孫全体が、同じＵＭＩバーコードでマークされ、バーコード付きファミリーを形成する。バーコード付きファミリーのメンバーの全て（又は大部分）によって共有されていない配列のバリエーションは、アーチファクトとして破棄される。ＵＭＩバーコードはまた、ファミリー全体が元の試料中の単一の分子を表すため、位置重複排除及び標的定量化に使用することもできる（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。ＵＭＩバーコードを含むアダプターは、配列決定される核酸にコンジュゲートされ得る。

【0104】

試料識別バーコードが、多重配列決定に使用される。配列決定フローセルへの適用の前に、核酸の２つ以上の試料が混合される、核酸の供給源を識別するために使用される多重試料ＩＤ（ＭＩＤ又はＳＩＤ）バーコード。

【0105】

いくつかの実施形態では、配列決定される核酸分子は、ＵＭＩ及びＭＩＤである。いくつかの実施形態では、単一のバーコードは、ＵＭＩ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、バーコードは、いくつかの部分からなる。例えば、一意の識別情報は、バーコード配列及び核酸末端配列からなる。いくつかの実施形態では、バーコードは、米国特許出願公開第２０２００１０９３９７号「Ｍｏｄｕｌａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｄａｐｔｏｒｓ」に記載されているように、いくつかのサブバーコードからなる。

【0106】

いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。バーコードは、異なる一対の同一のバーコードを各々有する、９６～３８４個の異なるアダプターが、ヒトゲノム試料に付加され得るように、約４～２０塩基長である。いくつかの実施形態では、反応におけるＵＭＩの数は、標識される分子の数を超え得る。当業者は、バーコードの数が、試料の複雑性（すなわち、一意の標的分子の期待数）に依存することを認識し、各実験のために好適な長さの好適な数のバーコードを設計することができるであろう。

【0107】

いくつかの実施形態では、本発明は、ライゲーションステップを含む。当該技術分野で広く知られている方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に従って、リガーゼ酵素は、３′ヒドロキシ部分（３′末端）との５’リン酸塩部分（５′末端）の接合を触媒する。接合は、核酸の末端間にホスホジエステル結合と称される共有結合を形成する。ライゲーションは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡリガーゼ、例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．、若しくはＬｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃ．）などの一本鎖ＤＮＡリガーゼ、又はＴ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、若しくは２つの核酸間のホスホジエステル結合の形成を効率的に触媒することが可能な任意の他の酵素から選択される二本鎖ＤＮＡリガーゼによって触媒される。

【0108】

いくつかの実施形態では、５’リン酸塩部分は、標的核酸のエンドヌクレアーゼ消化の産物に天然に存在する。いくつかの実施形態では、５’リン酸塩部分は、エキソヌクレアーゼ切断標的核酸に、又はアダプターオリゴヌクレオチドに付加される。５’リン酸塩の付加は、酵素によって、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどのポリヌクレオチドキナーゼを用いて、断片上で達成され得る。

【0109】

いくつかの実施形態では、本方法は、試料から２つ以上の核酸を含むライブラリを形成することを伴う。例えば、ライブラリは、ユニバーサル増幅プライマー結合部位、ユニバーサル配列決定プライマー結合部位、一意のバーコード、又は試料識別バーコードを含む、ライブラリ操作のために必要とされる要素を含むアダプターにコンジュゲートされた複数の異なる核酸からなり得る。ライブラリ核酸は、配列決定又は別の種類の検出方法、例えば、ＰＣＲの準備ができている。ライブラリを貯蔵することができ、ライブラリのアリコートを複数回の分析に使用することができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、試料中の核酸は、生物、対象（例えば、患者）、又は環境から採取された試料中で本来見出される全ての核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料中の核酸は、濃縮される。いくつかの実施形態では、濃縮は、生物の（又は対象の）ゲノム（例えば、ヒトＡｌｕ配列、哺乳動物グロビン配列、又は全ての細胞生物に存在するｒＲＮＡ配列）からの減算、例えば、捕捉及び除去、又は反復配列、又は高存在量配列若しくは転写産物によるものである。いくつかの実施形態では、濃縮は、目的の配列の捕捉及び保持によるものである。いくつかの実施形態では、両方の濃縮方法が適用され、例えば、反復配列又は豊富な配列が、試料からの目的の配列の後続の捕捉を促進又は改善するために最初に除去される。濃縮のために、捕捉プローブは、溶液中に遊離するか、又は固体支持体に固定され得る。

【0111】

いくつかの実施形態では、捕捉による濃縮は、本明細書に記載されるように、標的核酸にライゲーションされたアダプターを利用する。本発明によれば、アダプターは、配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ）によって特異的に切除された標的核酸にライゲーションされる。アダプターは、標的核酸を捕捉し、試料から分離し、それによって、標的核酸を濃縮するための捕捉プローブとして機能する。

【0112】

いくつかの実施形態では、捕捉された核酸の長さは、１、１０、５０ｋｂ以上である。

【0113】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料から核酸を濃縮する方法であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端における第１の５’オーバーハング、及び第１の陥凹型３’末端を生成することと、核酸を、第２の５’オーバーハングであって、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることであって、アダプターが、捕捉部分を更に含む、接触させることと、第１の３’末端のうちの少なくとも１つを第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、アダプター上の捕捉部位を捕捉し、それによって、試料から標的核酸を濃縮することと、を含む、方法である。

【0114】

濃縮のために、捕捉プローブは、捕捉部位を含み得る。捕捉部位は、別の捕捉分子と特異的に相互作用することが可能な任意の部位であり得る。捕捉部分－捕捉分子対は、アビジン（ストレプトアビジン）－ビオチン、抗原－抗体、磁性（常磁性）粒子－磁石、又はオリゴヌクレオチド－相補性オリゴヌクレオチドを含む。捕捉分子は、捕捉部位が存在する任意の核酸が固体支持体上に捕捉され、試料又は反応混合物の残りの部分から分離されるように、固体支持体に結合され得る。いくつかの実施形態では、捕捉分子は、二次捕捉分子の捕捉部分を含む。例えば、捕捉部分は、捕捉オリゴヌクレオチド（捕捉分子）に相補的なオリゴヌクレオチドであり得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、ビオチン化され、ストレプトアビジンビーズ上に捕捉され得る。いくつかの実施形態では、アダプターがライゲーションされた核酸は、捕捉部分を捕捉し、アダプターがライゲーションされた標的核酸を試料中のライゲーションされていない核酸から分離することを介して濃縮される。

【0115】

いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法によって適合される核酸を配列決定することを含む。いくつかの配列決定技術又は配列決定アッセイのうちのいずれかもまた、利用することができる。本明細書で使用される場合の「次世代配列決定（ＮＧＳ）」という用語は、単一分子又はクローン的に増幅された単一分子の大規模並列配列決定を可能にする配列決定方法を指す。

【0116】

本明細書に開示される方法とともに使用するために好適である配列アッセイの非限定的な例としては、ナノポア配列決定（米国特許公開第２０１３／０２４４３４０号、同第２０１３／０２６４２０７号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１５／０１１９２５９号、及び同第２０１５／０３３７３６６号）、サンガー配列決定、キャピラリーアレイ配列決定、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析などの質量分析を用いた配列決定（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））、ハイブリダイゼーションによる配列決定（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、並びに合成による配列決定（例えば、各々Ｉｌｌｕｍｉｎａから入手可能である、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、又はＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体配列決定（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＳＭＲＴ（登録商標）配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むがこれらに限定されない、ＮＧＳ方法を含む。

【0117】

市販の配列決定技術には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）からのハイブリダイゼーションによる配列決定プラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）からの合成による配列決定プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）からのライゲーションによる配列決定プラットフォームが含まれる。他の配列決定技術には、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ（登録商標））配列決定（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）、及びナノポア配列決定（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．からのＧｅｎｉａ／Ｓｔｒａｔｏｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、並びにＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0118】

いくつかの実施形態では、配列決定ステップは、配列整合及びコンセンサスの決定を伴う。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、全て同一のＵＭＩを有する複数の配列から決定される。同一のＵＭＩを有する配列は、増幅を通して同じ元の分子に由来すると推定される。他の実施形態では、ＵＭＩは、アーチファクト、すなわち、（特定のＵＭＩを特徴とする）単一分子の子孫に存在するバリエーションを排除するために使用される。ＵＭＩを使用して、ＰＣＲエラー又は配列決定エラーに起因するそのようなアーチファクトを排除することができる。

【0119】

いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数又は表現は、同じ多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）を有する集団の中で各ＵＭＩを有する配列の相対数を定量化することによって定量化することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要なＵＭＩ当たりの配列リードの数（「配列深度」）を決定することができるであろう。いくつかの実施形態では、所望の深度は、ＵＭＩ当たり５～５０リードである。

【0120】

配列決定される核酸のライブラリに追加の要素を導入するためのアダプター及び増幅プライマーの有用性は、例えば、米国特許第９，４７６，０９５号、同第９，２６０，７５３号、同第８，８２２，１５０号、同第８，５６３，４７８号、同第７，７４１，４６３号、同第８，１８２，９８９号、及び同第８，０５３，１９２号に記載されている。

【0121】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸及び非標的核酸を含む試料中の標的核酸を配列決定する方法であって、３’末端を有する二本鎖標的核酸を、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と接触させ、それによって、第１の５’末端における第１の５’オーバーハング、及び第１の陥凹型３’末端を生成することと、核酸を、第２の５’オーバーハングであって、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズし、それによって、第１及び第２の５’オーバーハングの間にハイブリッドを形成することが可能である、第２の５’オーバーハングを第２の５’末端に有するアダプターと接触させることと、第１の３’末端のうちの少なくとも１つを第２の５’末端と連結し、それによって、適合核酸を形成することと、適合核酸を配列決定することと、を含む、方法である。

【0122】

いくつかの実施形態では、捕捉及び配列決定された核酸の長さは、１、１０、５０ｋｂ以上である。ナノポア配列決定の近年の進歩は、標的がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで切除され、ｄＡテーリング及びアダプターライゲーションによって捕捉されたときに、５～２０ｋｂ標的のリードを可能にする。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）からのＣａｓ９ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｂｒｏｃｈｕｒｅ，ｃａｔ．ＳＱＫ－ＣＳ９１０９を参照されたい。配列決定技術は、５０ｋｂを超える配列のリードが可能であるが、そのような配列は、ｄＡテーリング及びライゲーション方法を用いて捕捉されず、代わりに、アダプターのトランスポザーゼ誘導型挿入（タグメンテーション）を用いて捕捉される。Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅからのＵｌｔｒａ－Ｌｏｎｇ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｂｒｏｃｈｕｒｅ，ｃａｔ．ＳＱＫ－ＵＬＫ０００１を参照されたい。本発明は、ｄＡテーリング方法よりも効率的かつ特異的であることが実証されており、したがって、配列決定する短い配列決定テンプレート並びに２０ｋｂよりも長いテンプレートを供給することが可能である。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明は、増幅ステップを含む。本明細書に記載される方法によって形成される適合核酸は、例えば、配列決定又は任意の他の下流分析ステップの前に、増幅することができる。増幅ステップは、線形又は指数関数的増幅、例えば、ＰＣＲを含むことができる。増幅は、等温であるか、又は熱循環を伴い得る。いくつかの実施形態では、増幅は、指数関数的であり、ＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、エマルションＰＣＲ、及び同等物を含む、そのバリエーションのうちのいずれかを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー、すなわち、試料中の全ての核酸上に存在するユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズするプライマーが使用される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位が、本発明に従って調製されたアダプターに存在する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、アダプター又は標的核酸にハイブリダイズし、プライマーのハイブリダイズしない５’領域にユニバーサルプライマー結合部位を含む、プライマーを伸長することによって付加される。ユニバーサルプライマー結合部位を有する全ての核酸を、同じユニバーサルプライマーで増幅することができる。ユニバーサルプライマーが使用される増幅サイクルの数は、少なくあり得るが、また、後続のステップのために必要とされる増幅産物の量に応じて、１０、２０、又は３０以上ものサイクルであり得る。ユニバーサルプライマーを用いた増幅が、低減した配列バイアスを有するため、増幅サイクルの数は、増幅バイアスに対する懸念から制限される必要はない。

【0125】

いくつかの実施形態では、逆プライマーが、第１のユニバーサルプライマーと対合される。逆プライマーは、第１のユニバーサルプライマーがハイブリダイズする鎖の反対側の鎖への標的核酸にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、１つより多くの逆プライマーは、適合核酸の最適な増幅のために設計されている（４つの逆プライマーｒｖ－１、ｒｖ－２、ｒｖ－３、及びｒｖ－４を用いた実施例を示す図２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、逆プライマーは、第２のユニバーサルプライマーの結合部位を含む。第２のユニバーサルプライマーは、第１のユニバーサルプライマーと同じであるか、又は異なり得る。いくつかの実施形態では、逆プライマーを用いた単一回又は限定回数の増幅後、第１のユニバーサルプライマーと対合された第２のユニバーサルプライマーのみが、増幅に使用され得る。

【0126】

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明による方法によって試料から核酸を濃縮するためのキットである。キットは、少なくとも、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有し、核酸中に５’－オーバーハングを生成することが可能な触媒と、５’末端に５’オーバーハングを有するように操作されたアダプターであって、５’オーバーハングが、触媒を用いた処理時に標的核酸において予期される５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、ＤＮＡリガーゼと、を含む。キットは、ポリヌクレオチドキナーゼを更に含み得る。

【0127】

キット内のアダプターは、一本鎖（すなわち、単一の５’末端を保有する）又は二本鎖であり、５’オーバーハングを有する末端に陥凹型３’末端を有し得る。

【0128】

本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、若しくはファミリーＣポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、又はＥ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有するＤＮＡポリメラーゼであるか、又はＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマからなる群から選択される。

【0129】

いくつかの実施形態では、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの１つ以上を更に含む、キット。

【0130】

いくつかの実施形態では、アダプター中の５’オーバーハングは、２～１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、アダプターは、核酸バーコード、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つを含む。バーコードは、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）及び試料ＩＤ（ＳＩＤ）であり得る。アダプターは、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される捕捉部分に連結される。

【0131】

いくつかの実施形態では、キットは、アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能なプライマー（ユニバーサルプライマー）などの核酸を増幅するための試薬を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、キットは、アダプター中のプライマー結合部位にアニールすることが可能な配列決定プライマーなどの核酸を配列決定するための試薬を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法によって切除された核酸を捕捉する方法を実施することについての指示を更に含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、本発明は、試料から核酸を濃縮するための反応混合物である。反応混合物は、３’末端を有する二本鎖標的核酸と、第１の５’末端に第１の５’オーバーハングを生成し、標的核酸に第１の陥凹型３’末端を生成することが可能な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒と、第２の５’末端に第２の５’オーバーハングを有するアダプターであって、第２の５’オーバーハングが、第１の５’オーバーハングにハイブリダイズすることが可能である、アダプターと、を含む。反応混合物は、ＤＮＡリガーゼを更に含み得る。

【0135】

いくつかの実施形態では、二本鎖標的核酸は、１、１０、又は１００ｋｂ長である。

【0136】

反応混合物中の二本鎖標的核酸の３’末端は、平滑末端の一部であり得る。二本鎖標的核酸の３’末端は、３’オーバーハングの一部であり得る。二本鎖標的核酸の３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｆｏｋ Ｉに融合した触媒不活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、若しくはＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、若しくはＺＦＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合などの配列特異的エンドヌクレアーゼを用いた核酸の切断によって生成され得る。

【0137】

反応混合物中の３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する触媒は、ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片のＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、及びＥｘｏ ＩＩＩドメインを有する、ファミリーＡポリメラーゼ、ファミリーＢポリメラーゼ、又はファミリーＣポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片の残基Ｄ３５５、Ｄ４２４、及びＤ５０１に対応するアスパルテーム残基を有するＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ ＩＩＩデルタ断片、真核生物ｐｏｌイプシロン、真核生物ｐｏｌデルタ、及びミトコンドリアｐｏｌガンマであり得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、反応混合物はまた、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのうちの４つ未満、例えば、３つ、２つ、又は１つだけのｄＮＴＰも含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、アダプターは、二本鎖であり、第２の陥凹型３’末端を更に含む。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２～１５ヌクレオチド長である。反応混合物中のアダプターは、核酸バーコード（例えば、一意の分子ＩＤ（ＵＭＩ）又は試料ＩＤ（ＳＩＤ））、配列決定プライマー結合部位、及び増幅プライマー結合部位を含み得る。アダプターは、修飾を含む核酸二重鎖の融解温度を上昇させる核酸修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、ビオチン、捕捉抗体に結合することが可能な抗原、及び捕捉核酸にハイブリダイズすることが可能な捕捉配列から選択される捕捉部分に連結される。

【実施例】

【0140】

実施例１．試薬の調製
核酸：プラスミド及びゲノムＤＮＡ。
Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ，Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｓｈｏｐ，Ｓｔｏｃｋｂｒｉｄｇｅ，Ｇａ．から入手可能）を使用して、プラスミド１及び２を調製した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ．）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡをヒト末梢血単核細胞から調製した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）を使用して、ゲノムＤＮＡを脱リン酸化した。Ｑｕｉｃｋ ＣＩＰ（カタログ番号Ｍ０５２５）：５μｇのＤＮＡを、３μＬのＱｕｉｃｋＣＩＰとともに３７℃で１０分間、次いで、１倍ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液中で８０℃で２分間インキュベートした。ＤＮＡ標的のマップが、図２に示されている。

【0141】

プラスミドＰ１及びＰ２の配列は、１）Ｃｒ－Ｃ及びＣｒ－Ｄガイド又はｒｖ－３及びｒｖ－４プライマー結合部位によって認識される配列を含まないという点、並びに２）Ｃｒガイド部位と生成されたアンプリコンの長さを決定するｒｖプライマー部位との間に、それぞれ、５７４又は２１４７ｂｐの挿入物を含むという点で、ゲノム領域とは異なる。

【0142】

エンドヌクレアーゼ
Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の調製。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ１０７２５３２）を、ヌクレアーゼを含まない水に１００μＭで溶解させた。１μＬのｃｒＲＮＡ（Ｃｒ－Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤのいずれか）、１μＬのｔｒａｃｒＲＮＡ、及び８μＬのＩＤＴ二重緩衝液を組み合わせ、次いで、９５℃まで２分間加熱し、次いで、毎秒０．１℃で室温まで冷却ささせ、１０μＭのｃｒ：ｔｒａｃｒガイドストックをもたらした。次いで、１０μＬのＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液、７９．２μＬのヌクレアーゼを含まない水、１０μＬの１０μＭガイド、及び０．８μＬの１０ｍｇ／ｍＬ（６２μＭ）Ｃａｓ９タンパク質を組み合わせることによって、５００ｎＭ Ｃａｓ９：１０００ｎＭガイドＲＮＰストックを作製し、次いで、３７℃で１５分間インキュベートした。アリコートを－８０℃で保管した。

【0143】

アダプター
アダプターストックは、水中の５μＭの各オリゴからなった。１００μＬのアリコートを９５℃まで２分間加熱し、次いで、毎秒０．１℃で室温まで冷却させ、５μＭのアダプターストックをもたらした。ｄＡテーリングアダプターを、オリゴのｄＡ上部及びｄＡ底部から作製した。ＣＲＩＳＰＲ－ＬＥアダプターを、Ａ－ｂｏｔ、Ｂ－ｂｏｔ、Ｃ－ｂｏｔ、又はＤ－ｂｏｔと対合されたオリゴＡＢＣＤ上部から作製し、それぞれ、ガイドＣｒ－Ａ、Ｃｒ－Ｂ、Ｃｒ－Ｃ、又はＣｒ－Ｄを使用して、反応のための特異的アダプターを作製した。

【0144】

各実験のためのアダプター及び末端配列が、表１及び表２に列挙されている。表２は、エキソヌクレアーゼ消化の進行を阻止するエキソヌクレアーゼ消化反応に存在するｄＮＴＰを更に列挙する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【0145】

実施例２．プラスミド及びゲノムＤＮＡ試料に適用されるＲＮＰ切断及びｄＡテーリング（従来技術の方法）。
２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、合計２５μＬにおいて１倍ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液中で、５μＬのＲＮＰ（最終濃度１００ｎＭ）、１μＬの１０μＭ ｄＡＴＰ、１μＬのＮＥＢ Ｔａｑ（カタログ番号Ｍ０２７３）と組み合わせた。反応物を、（標的ＤＮＡからＣａｓ９を除去し、ｄＡテールのＴａｑ付加を可能にするために）３７℃で１５分間、次いで、７２℃で５分間インキュベートした。ライゲーションステップに進む前に、試料をＳＰＲＩで浄化した。本手順は、１μｇの脱リン酸化ゲノムＤＮＡが２００ｎｇのプラスミドＤＮＡに代用されたことを除いて、ゲノムＤＮＡ試料について同一であった。プラスミドＤＮＡの結果が、図３に示され、ゲノムＤＮＡの結果が、図５に示されている。

【0146】

実施例３．プラスミド及びゲノムＤＮＡ試料に適用されるＲＮＰ切断及びＣＲＩＳＰＲ－ＬＥ方法（発明）。
２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、合計２５μＬにおいて１倍ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液中で、５μＬのＲＮＰ（最終濃度１００ｎＭ）と組み合わせた。反応物を、（標的ＤＮＡからＣａｓ９を除去するために）３７℃で１５分間、次いで、７２℃で５分間インキュベートした。ＤＮＡを０．８倍ＳＰＲＩで精製し、１５μＬの水で溶出した。次いで、１５μＬ全てのＤＮＡを、２０μＬ体積中で、１μＬの０．０６７ｍｇ／ｍＬ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、２．５ｍＭの適切なｄＮＴＰ、ｐＨ８．０である１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴで処理し、２２℃で３０分間、次いで、７５℃で２０分間インキュベートした。ライゲーションステップに進む前に、ＤＮＡを０．８倍ＳＰＲＩで精製し、１５μＬの水で溶出した。本手順は、１μｇの脱リン酸化ゲノムＤＮＡが２００ｎｇのプラスミドＤＮＡに代用されたことを除いて、ゲノムＤＮＡ試料について同一であった。

【0147】

プラスミドＤＮＡの結果が、図４に示され、ゲノムＤＮＡの結果が、図６（ｃｒＲＮＡ ＣｒＡ及びＣｒＢ）並びに図７ （ｃｒＲＮＡ ＣｒＣ及びＣｒＤ）に示されている。

【0148】

実施例４．中間精製ステップ
ＳＰＲＩ浄化。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬キット（カタログ番号Ｂ２３３１７）を使用して、ＳＰＲＩ浄化を実施した。反応体積を、最初に水で１００μＬに調整し、次いで、０．８倍ＳＰＲＩビーズを添加した。ＤＮＡ－ＳＰＲＩ混合物を磁気スタンド上で４分間インキュベートし、次いで、上清を除去した。ビーズを８５％エタノールの添加によって２回洗浄し、次いで、１５μＬの水中で溶出した。

【0149】

実施例５．アダプターのライゲーション
ＳＰＲＩ浄化ＤＮＡ（１５μＬ）試料を、２０μＬ反応体積中で、１μＬのＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ（カタログ番号Ｍ２２００）及び１倍ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号Ｂ６０５８Ｓ）中の２５０ｎＭアダプターと組み合わせ、室温で２０分間インキュベートした。ＰＣＲステップに進む前に、０．８倍ＳＰＲＩを使用してライゲーションを洗浄し、２０μＬの水で溶出した。

【0150】

実施例６．増幅
２０μＬのＰＣＲは、１倍Ｑ５反応緩衝液中で、０．２μＬのＮＥＢ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｍ０４９３）、２μＬのアダプターがライゲーションされたＤＮＡ、５００ｎＭのフォワードプライマー（Ｆ）、５００ｎＭの適切な逆プライマー（ｒｖ－１、２、３、又は４）、２００ｎＭの各ＮＴＰからなった。熱循環条件は、以下の通りであった。９８°Ｃを３０秒、（９８°Ｃを１０秒、５８°Ｃを３０秒、７２°Ｃを４５秒）３２回、７２°Ｃを２分。

【0151】

実施例７．ゲル電気泳動。
１０μＬの各ＰＣＲを、１％アガロース－ＴＡＥゲル上で９０ボルトにおいて６０分間実行し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ上で撮像した。各構成の期待アンプリコンサイズ（ｂｐ単位）が、表３に列挙されている。

【表5】

【0152】

本発明は、具体的な実施例を参照して詳細に説明されているが、様々な修正が本発明の範囲内で行われ得ることが当業者に明白であろう。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載される実施例によってではなく、以下に提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。

【表6】

【表7】

【0153】

図２に示される配列番号２１ ＴＲＡＣゲノム配列（１６００ｂｐ）：
ＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＴＡＴＣＧＡＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＣＣＡＴＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＴＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＡＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＴＧＴＣＣＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＧＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＡＣＴ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-07-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】