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特表2024-545093細胞および組織に標的化するためのポリ（アミン－ＣＯ－エステル）ナノ粒子への表面コンジュゲーション
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】細胞および組織に標的化するためのポリ（アミン－ＣＯ－エステル）ナノ粒子への表面コンジュゲーション
(51)【国際特許分類】
A61K 47/69 20170101AFI20241128BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20241128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20241128BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241128BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
A61K47/69
A61K47/60
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K39/12
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K48/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024533994
(86)(22)【出願日】2022-12-08
(85)【翻訳文提出日】2024-08-01
(86)【国際出願番号】 US2022081189
(87)【国際公開番号】W WO2023108076
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/287,410
(32)【優先日】2021-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/290,042
(32)【優先日】2021-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/292,200
(32)【優先日】2021-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/301,942
(32)【優先日】2022-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/302,413
(32)【優先日】2022-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/418,744
(32)【優先日】2022-10-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】593152720
【氏名又は名称】イェール ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】２ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ ０６５１０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ピョトロフスキ－ダスピット， アレクサンドラ
(72)【発明者】
【氏名】アルバート， クレア
(72)【発明者】
【氏名】サルツマン， ダブリュー． マーク
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE06
4C076EE23
4C076EE59
4C084AA13
4C084MA38
4C084NA13
4C084ZB21
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA38
4C086NA13
4C086ZB21
(57)【要約】
薬物送達のために有用なナノ粒子を記載する。一態様では、ナノ粒子は、ポリ（エチレングリコール）で改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）（ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）を含有し、必要に応じて、末端基改変を必要に応じて含有する第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされ得る。別の態様では、ナノ粒子は、末端基改変を必要に応じて含有するＰＡＣＥポリマーを含有するコア、およびナノ粒子の表面に非共有結合的にコンジュゲートされたポリマー性界面活性剤を含有する。ナノ粒子は、それぞれ、スクシンイミドまたは置換スルホン部分を含有する、連結を介してＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーまたはナノ粒子の表面上の界面活性剤に共有結合的にコンジュゲートされている、ペプチドまたはタンパク質標的化部分を含有する。ナノ粒子を、核酸、例えば、ｍＲＮＡの送達のための多用途のプラットフォームとして提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造：（（Ａ）ｘ－（Ｂ）ｙ－（Ｃ）ｑ－（Ｄ）ｗ－（Ｅ）ｆ）ｈ
式Ｉａ’
を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）－またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）－ポリアルキレンオキシド（ＰＡＣＥ－ＰＡＯ）ポリマーを含むナノ粒子であって、
式中、
式Ｉａ’について、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立して、モノマー性ラクトン（例えば、ペンタデカラクトン）、多官能性分子（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン）、二酸もしくはジエステル（例えば、セバシン酸ジエチル）、またはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含み、ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、少なくともラクトン、多官能性分子、二酸またはジエステルモノマー単位、およびポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコールを含み、ｘ、ｙ、ｑ、ｗ、およびｆは、独立して、０～１０００の整数であるが、ただし合計（ｘ＋ｙ＋ｑ＋ｗ＋ｆ）は１より大きいことを条件とし、ｈは、１～１０００の整数である、
ナノ粒子。
【請求項2】
前記ＰＡＣＥ－ＰＡＯが、前記ナノ粒子の約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約９５％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約５０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約２０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約１０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約５％ｗｔ／ｗｔ、約１％ｗｔ／ｗｔ～約５％ｗｔ／ｗｔ、５％ｗｔ／ｗｔ～１０％ｗｔ／ｗｔ、または約１０％ｗｔ／ｗｔ～約２０％ｗｔ／ｗｔを構成する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項4】
式Ｉａ’が、構造：【化16】
式中、
式Ｉ’について、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、ｗは、独立して、１～１０００の整数であるが、ただし式Ｉ’において、ｗは０より大きいことを条件とし、
式Ｉ’について、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲおよびＲ’は、独立して、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
式Ｉ’について、Ｔは、独立して、存在しない、酸素、硫黄、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、アミン、置換アミン、カルボニル、置換カルボニルであり、
式Ｉ’について、Ｒ７は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
式Ｉ’について、ＴＭは、独立して、存在しないかまたは標的化部分である、
請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項5】
前記標的化部分が、存在する、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項6】
前記標的化部分が、タンパク質またはペプチドである、請求項４または５に記載のナノ粒子。
【請求項7】
前記標的化部分が、抗体もしくはその抗原結合性断片、抗体ドメイン、Ｔ細胞受容体、細胞表面受容体、細胞表面接着分子、主要組織適合性遺伝子座タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、規定の細胞に特異的に結合するファージディスプレイによって選択されたペプチド、またはそれらの組合せから選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項8】
式Ｉ’について、Ｔが、置換アミドである、請求項４～７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項9】
Ｒ７が、スクシンイミドである、請求項４～８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項10】
前記ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーが、５，０００ダルトン～５０ｋＤａ、または５，０００ダルトン～３０ｋＤａの重量平均分子量を有し、前記重量平均分子量が、前記標的化部分の分子量を含まない、請求項４～９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項11】
前記ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー、および第２のＰＡＣＥポリマーの混合物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項12】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、前記ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー中のＰＡＣＥポリマーと同じまたは異なる、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項13】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、構造：【化17】
式中、
式Ｉについて、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、Ｒｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、存在しないか、またはヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、もしくはそれらの組合せを含有する化学実体である、
請求項１１または１２に記載のナノ粒子。
【請求項14】
Ｒ１およびＲ２が、存在しない、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項15】
式Ｉについて、Ｒ１および／またはＲ２が、【化18】
【請求項16】
式Ｉが、構造：【化19】
式中、Ｊ１およびＪ２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
請求項１３または１５に記載のナノ粒子。
【請求項17】
Ｊ１が、－Ｏ－または－ＮＨであり、Ｊ２が、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－もしくは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、またはそれらの組合せである、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項18】
式Ｉが、構造：【化20】
【請求項19】
式Ｉについて、Ｚが、Ｚ’と同じである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項20】
式Ｉについて、ｎが、４、１０、１３、または１４である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項21】
式Ｉについて、Ｒｘが、置換もしくは無置換アルキルである、請求項１３～２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項22】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、約２，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１３～２１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項23】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、約１０％～約１００％、好ましくは、約３０％～約１００％のラクトン含有量を有する、請求項１３～２２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項24】
Ｒ３および／またはＲ４が、独立して、【化21-1】
【化21-2】
【請求項25】
約１％ｗｔ／ｗｔ～約１５％ｗｔ／ｗｔのＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー、および約９９％ｗｔ／ｗｔ～約１５％ｗｔ／ｗｔの第２のＰＡＣＥポリマー、例えば、約１０％ｗｔ／ｗｔのＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーおよび約９０％ｗｔ／ｗｔの第２のＰＡＣＥポリマーを含む、請求項１１～２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項26】
（ｉ）構造：【化22】
式中、
式Ｉについて、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、Ｒｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、存在しないか、またはヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、もしくはそれらの組合せを含有する化学実体である、
ポリマーを含むコア、ならびに
（ｉｉ）式Ｉの構造を有する前記ポリマーに非共有結合的にコンジュゲートされたナノ粒子の表面上の界面活性剤
を含むナノ粒子。
【請求項27】
Ｒ１およびＲ２が、存在しない、請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項28】
式Ｉについて、Ｒ１および／またはＲ２が、【化23】
【請求項29】
式Ｉが、構造：【化24】
式中、Ｊ１およびＪ２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
請求項２６または２８に記載のナノ粒子。
【請求項30】
Ｊ１が、－Ｏ－または－ＮＨであり、Ｊ２が、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－もしくは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、またはそれらの組合せである、請求項２９に記載のナノ粒子。
【請求項31】
式Ｉが、構造：【化25】
【請求項32】
式Ｉについて、Ｚが、Ｚ’と同じである、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項33】
式Ｉについて、ｎが、４、１０、１３、または１４である、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項34】
式Ｉについて、Ｒｘが、置換もしくは無置換アルキルである、請求項２６～３３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項35】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、約２，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項36】
前記第２のＰＡＣＥポリマーが、約１０％～約１００％、好ましくは、約３０％～約１００％のラクトン含有量を有する、請求項２６～３５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項37】
Ｒ３および／またはＲ４が、独立して、【化26-1】
【化26-2】
【請求項38】
前記界面活性剤が、構造：【化27】
式中、
それぞれのＡｆは、独立して、疎水性または親水性モノマー残基であり、
Ｂｆは、置換アルキル、置換アリール、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アミン、置換カルボニル、置換アミド、または置換スルホンであり、
Ｔｆは、独立して、存在しない、酸素、硫黄、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、アミン、置換アミン、カルボニル、置換カルボニルであり、
Ｒ７ｆは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
ＴＭは、標的化部分であり、
ａｘは、独立して、０～１０，０００、０～５，０００、または０～１，０００の整数であり、
ｂｘおよびｃｘは、独立して、１～１０，０００、１～５０００、または１～１，０００の整数である、
請求項２６～３７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項39】
前記界面活性剤が、構造：【化28-1】
【化28-2】
【請求項40】
治療剤、予防剤、診断剤、またはそれらの組合せを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項41】
核酸を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項42】
ｍＲＮＡを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項43】
前記薬剤が、前記ナノ粒子内に非共有結合的に封入されている、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項44】
前記ナノ粒子の表面上よりも高い割合の、前記ナノ粒子で封入された薬剤を有する、請求項４０～４３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項45】
前記薬剤が、前記ナノ粒子内に封入されており、前記ナノ粒子の表面上に存在しない、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年１２月８日に出願された米国出願第６３／２８７，４１０号；２０２１年１２月１５日に出願された米国出願第６３／２９０，０４２号；２０２１年１２月２１日に出願された米国出願第６３／２９２，２００号；２０２２年１月２１日に出願された米国出願第６３／３０１，９４２号；２０２２年１月２４日に出願された米国出願第６３／３０２，４１３号；および２０２２年１０月２４日に出願された米国出願第６３／４１８，７４４号の利益および優先権を主張し、これらは、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月８日に出願された米国出願第６３／２８７，４１０号；２０２１年１２月１５日に出願された米国出願第６３／２９０，０４２号；２０２１年１２月２１日に出願された米国出願第６３／２９２，２００号；２０２２年１月２１日に出願された米国出願第６３／３０１，９４２号；２０２２年１月２４日に出願された米国出願第６３／３０２，４１３号；および２０２２年１０月２４日に出願された米国出願第６３／４１８，７４４号の利益および優先権を主張し、これらは、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【0002】
連邦政府が支援した研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＨＬ１４７３５２、ＡＩ３２８９５、ＧＭ８６２８７、およびＨＬ１４２１４４の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＨＬ１４７３５２、ＡＩ３２８９５、ＧＭ８６２８７、およびＨＬ１４２１４４の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【0003】
発明の分野
本発明の分野は、一般に、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、診断剤、予防剤および／または治療剤の効率的な送達のための、ポリマー性ナノ粒子への分子（例えば、ペプチドおよびタンパク質）の改善されたコンジュゲーションのためのポリマー組成物および方法に関する。
本発明の分野は、一般に、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、診断剤、予防剤および／または治療剤の効率的な送達のための、ポリマー性ナノ粒子への分子（例えば、ペプチドおよびタンパク質）の改善されたコンジュゲーションのためのポリマー組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
遺伝子送達のための非ウイルスベクターは、限定的な免疫原性についてのそれらの可能性、大きなサイズの遺伝子材料を収容および送達する能力、ならびにそれらの表面構造の改変についての可能性に起因して、過去数十年にわたって多くの注目を集めてきた。非ウイルスベクターの主要なカテゴリーとしては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられる。Ｆｅｌｇｎｅｒおよび同僚によって開拓されたカチオン性脂質由来ベクターは、非ウイルス遺伝子送達のために最も広く調査されている系のいくつかを表している（Felgner, et al. PNAS, 84, 7413-7417 (1987)）（Templeton, et al. Nat. Biotechnol. 15, 647-652 (1997)）（Chen, et al. J. Invest. Dermatol. 130, 2790-2798 (2010)）。
遺伝子送達のための非ウイルスベクターは、限定的な免疫原性についてのそれらの可能性、大きなサイズの遺伝子材料を収容および送達する能力、ならびにそれらの表面構造の改変についての可能性に起因して、過去数十年にわたって多くの注目を集めてきた。非ウイルスベクターの主要なカテゴリーとしては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられる。Ｆｅｌｇｎｅｒおよび同僚によって開拓されたカチオン性脂質由来ベクターは、非ウイルス遺伝子送達のために最も広く調査されている系のいくつかを表している（Felgner, et al. PNAS, 84, 7413-7417 (1987)）（Templeton, et al. Nat. Biotechnol. 15, 647-652 (1997)）（Chen, et al. J. Invest. Dermatol. 130, 2790-2798 (2010)）。
【0005】
カチオン性ポリマー非ウイルスベクターは、それらの合成における柔軟性および特定の生物医学的適用のための構造改変を理由として、ますます注目を集めている。カチオン性脂質系およびカチオン性ポリマー系は両方とも、静電相互作用を通して負に帯電したＤＮＡとの凝縮複合体を形成することによって、遺伝子を送達し、複合体形成は、ＤＮＡを分解から保護し、その細胞取り込みおよび核への細胞内輸送を促進する。
【0006】
カチオン性ポリマーおよびＤＮＡの間で形成されるポリプレックスは、一般に、カチオン性脂質およびＤＮＡの間で形成されるリポプレックスよりも安定であるが、両方とも、血清構成要素および塩を含有する生理液中で不安定である場合が多く、複合体をばらばらにするか、または凝集させる傾向がある（Al-Dosari, et al. AAPS J. 11, 671-681 (2009)）（Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）。加えて、いくつかの研究は、アニオン性ポリマー、またはさらにネイキッドＤＮＡが、ある特定の条件下であるレベルのトランスフェクションを提供することができることを示しているが、脂質およびポリマーの両方によるトランスフェクションは、通常、表面に正味の正電荷を有するポリプレックスまたはリポプレックスをもたらす過剰な電荷を有する材料を必要とする（Nicol, et al. Gene. Ther. 9, 1351-1358 (2002)）（Schlegel, et al. J. Contr. Rel. 152, 393-401 (2011)）（Liu, et al, AAPS J. 9, E92-E104 (2007)）（Liu, et al. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999)）。ｉｎ ｖｉｖｏで循環系に注射されると、正の表面電荷は、負に帯電した血清分子または細胞構成要素の膜との複合凝集体の迅速な形成を開始し、次いで、これは、細網内皮系（ＲＥＳ）によって除去される。
【0007】
より重要なことに、これまでに開発された多くのカチオン性ベクターは、実質的な毒性を呈し、これが、それらの臨床適用性を制限している（Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Felgner, et al. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)）（Kafil, et al. BioImpacts 1, 23-30 (2011)）（Lv, et al. J Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)）。これはまた、電荷に依存すると思われ、複合体の表面上の過剰な正電荷は、細胞膜などの細胞構成要素と相互作用し、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、イオンチャネル、膜受容体、および酵素の活性、または細胞生存シグナル伝達などの正常な細胞プロセスを阻害し得る（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Felgner, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)）（Kafil, et al. Cytotoxic Impacts of Linear and Branched Polyethylenimine Nanostructures in A431 Cells. BioImpacts 1, 23-30 (2011)）。
【0008】
結果として、カチオン性脂質は、多くの場合、動物およびヒトにおいて急性炎症応答を引き起こす一方で、ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、赤血球の形質膜を不安定化し、細胞壊死、アポトーシスおよびオートファジーを誘導する（Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Lv, et al. J. Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)）。これらの望ましくない効果を理由として、より低い電荷密度を有する高効率の非ウイルスベクターに対する必要性が存在する。
【0009】
ジエステルとアミノ置換ジオールとの酵素共重合を経て形成される生分解性ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）のファミリーの合成はLiu, et al. J. Biomed. Mater. Res. A 96A, 456-465 (2011)およびJiang, Z. Biomacromolecules 11, 1089-1093 (2010)において議論されている。さまざまな鎖長を有するジエステル（例えば、スクシネートからドデカンジオエートまで）を、窒素上にアルキル（メチル、エチル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル）またはアリール（フェニル）置換基のいずれかを有するジエタノールアミンと共重合させた。リパーゼ触媒の高い耐性は、共重合反応をアミノ官能基の保護および脱保護なしで１ステップで完了させることを可能にした。弱酸性条件下でのプロトン化の際に、これらのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ＤＮＡを容易に凝縮し、ナノサイズのポリプレックスを形成する。スクリーニング研究は、これらの材料の１つであるポリ（Ｎ－メチルジエチレンアミンセバケート）（ＰＭＳＣ）が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００およびＰＥＩ１４などの主要な市販製品の効率に匹敵する効率で、ＨＥＫ２９３、Ｕ８７－ＭＧ、および９Ｌを含む各種の細胞をトランスフェクトしたことを明らかにした。ＰＭＳＣは、遺伝子送達のために以前に使用されていたが、酵素的に合成された材料の送達効率は、任意の以前に報告されたものよりもおよそ５桁高かった（Wang, et al. Biomacromolecules 8, 1028-1037 (2007)）（Wang, et al. Biomaterials 28, 5358-5368 (2007)）。しかしながら、これらのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸の全身送達には有効ではなかった。これらの制限に対処するために、安全で有効な核酸送達プラットフォームが必要とされている。
【0010】
したがって、本発明の目的は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）などの核酸のための、有効で、非毒性の持続放出送達システムを提供することである。
【0011】
本発明の目的はまた、ｍＲＮＡなどの核酸のための、有効で、非毒性の持続放出送達システムのための標的化ポリマー性ナノ粒子を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Felgner, et al. PNAS, 84, 7413-7417 (1987)
【非特許文献2】Templeton, et al. Nat. Biotechnol. 15, 647-652 (1997)
【非特許文献3】Chen, et al. J. Invest. Dermatol. 130, 2790-2798 (2010)
【非特許文献4】Al-Dosari, et al. AAPS J. 11, 671-681 (2009)
【非特許文献5】Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)
【非特許文献6】Nicol, et al. Gene. Ther. 9, 1351-1358 (2002)
【非特許文献7】Schlegel, et al. J. Contr. Rel. 152, 393-401 (2011)
【非特許文献8】Liu, et al, AAPS J. 9, E92-E104 (2007)
【非特許文献9】Liu, et al. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999)
【非特許文献10】Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)
【非特許文献11】Felgner, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)
【非特許文献12】Kafil, et al. Cytotoxic Impacts of Linear and Branched Polyethylenimine Nanostructures in A431 Cells. BioImpacts 1, 23-30 (2011)
【非特許文献13】Lv, et al. J Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)
【非特許文献14】Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)
【非特許文献15】Liu, et al. J. Biomed. Mater. Res. A 96A, 456-465 (2011)
【非特許文献16】Jiang, Z. Biomacromolecules 11, 1089-1093 (2010)
【非特許文献17】Wang, et al. Biomacromolecules 8, 1028-1037 (2007)
【非特許文献18】Wang, et al. Biomaterials 28, 5358-5368 (2007)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の概要
標的化薬物送達のために特に有用であるナノ粒子を記載する。一部の形態では、ナノ粒子は、ポリポリ（エチレングリコール）で改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）（ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）を含有する。ナノ粒子は、ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーと、ポリマーが末端基改変を必要に応じて含有する第２のＰＡＣＥポリマーとのブレンドを含有することもできる。末端基改変を有するＰＡＣＥポリマーを示す（ＰＡＣＥｎｇ）。
標的化薬物送達のために特に有用であるナノ粒子を記載する。一部の形態では、ナノ粒子は、ポリポリ（エチレングリコール）で改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）（ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）を含有する。ナノ粒子は、ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーと、ポリマーが末端基改変を必要に応じて含有する第２のＰＡＣＥポリマーとのブレンドを含有することもできる。末端基改変を有するＰＡＣＥポリマーを示す（ＰＡＣＥｎｇ）。
【0014】
一部の形態では、ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーは、好ましくは、スクシンイミドを含有する、連結を通してそれらに共有結合的にコンジュゲートされた、ペプチドまたはタンパク質標的化部分を含有する。
【0015】
一部の形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合的にコンジュゲートされた界面活性剤を含有する。好ましくは、界面活性剤は、ポリマー、例えば、ポリ（ビニルアルコールスルホン）ポリマーから形成されるポリマーである。これらの形態では、ナノ粒子は、末端基改変を必要に応じて含有するＰＡＣＥポリマーを含有する。これらの形態では、界面活性剤は、好ましくは置換スルホン部分を含有する、連結を介して界面活性剤に共有結合的にコンジュゲートされているペプチドまたはタンパク質を含有する。
【0016】
ＰＡＣＥポリマーは、ＰＥＧ改変または末端基改変されているかにかかわらず、ラクトン、多官能性分子、および二酸／ジエステルモノマー単位を含有する。好ましくは、ＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約３０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．３～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．３～約１である。
【0017】
ナノ粒子を、核酸、例えば、ｍＲＮＡの送達のための多用途のプラットフォームとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１Ａおよび１Ｂは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミド（ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ）の構造中のＰＥＧ－マレイミドの存在を確認する核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルである。図１Ａ、Kamaly, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USAから、ＮＭＲスペクトルにおける構造中のプロトンのそれぞれのピークへの帰属を示す化学構造を含んで、ジブロックポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－マレイミド（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＭＡＬ）のＮＭＲスペクトルを示す。重要なことに、マレイミド基についてのピークは、６．７ｐｐｍに現れる。図１Ｂは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドのＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーへのマレイミド基の導入を確認する（６．７ｐｐｍのピークを参照されたい）。
【図2】図２Ａは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬを介したナノ粒子の表面へのタンパク質のコンジュゲーション（例えば、共有結合性コンジュゲーション）を示す概略図である。図２Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗体で官能化された色素負荷ＰＥＧ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子で処理された細胞による増強され標的化された取り込みを示す線グラフである。細胞は、Ｗ１２８２Ｘナンセンス嚢胞性線維症変異についてホモ接合性のヒト気管支上皮細胞である。抗体は、上皮マーカーＥｐＣＡＭ（右にシフトしたヒストグラム）を標的にするか、またはアイソタイプ対照抗体（左にシフトしたヒストグラム）である。
【図3】図３Ａは、ナノ粒子上のＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬを介したタンパク質コンジュゲート化ナノ粒子のインキュベーションを示す概略図である。図３Ｂは、ＣＤ３１で官能化されたＰＥＧ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による標的化された取り込みの増加を示す棒グラフである。
【図4-1】図４Ａは、ある程度の酢酸ビニルモノマーの存在を伴う、ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）コポリマー（ＰＶＡ－ＶＳ）の化学合成を示す概略図である。図４Ｃおよび４Ｃは、ＰＶＡ－ＶＳの構造を確認するＮＭＲスペクトルである。
【図4-2】図４Ａは、ある程度の酢酸ビニルモノマーの存在を伴う、ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）コポリマー（ＰＶＡ－ＶＳ）の化学合成を示す概略図である。図４Ｃおよび４Ｃは、ＰＶＡ－ＶＳの構造を確認するＮＭＲスペクトルである。
【図5】図５Ａは、酢酸ビニルモノマーの存在なしでの、ＰＶＡ－ＶＳの化学合成を示す概略図である。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ－結合タンパク質（ＣＤ３１－Ｍｂ）ナノ粒子、ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ－対照（アイソタイプ－Ｍｂ）ナノ粒子、またはナノ粒子なしで処理されたＨＵＶＥＣによる取り込みの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す線グラフである。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＵＶＥＣに結合した蛍光結合タンパク質ＰＡＣＥ－ＮＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値の棒グラフである（エラーバーはＳＤを表す）。それぞれのデータ点は、３つのウェルからの平均を表す（ウェルあたり捕捉された１０，０００個のＨＵＶＥＣ）。統計学的有意性は、ボンフェローニ補正を伴う多重Ｔ検定を使用して、ｐ＜０．００１の場合「＊＊＊＊」、ｐ＜０．００１の場合「＊＊＊」、ｐ＜０．０１の場合「＊＊」、ｐ＜０．０５の場合「＊」、および有意差が見出されなかった場合「ｎｓ」の群の間で示す。
【図6-1】図６Ａ～６Ｆは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰモノボディおよび抗体コンジュゲーションプロセスの概略図（図６Ａ）；５分間、１２分間、３０分間、および１時間、アイソタイプ対照またはＣＤ４－標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション後のヒト血液由来のＮＰ＋ ＣＤ４＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｂ）；５分間、１２分間、３０分間、および１時間、アイソタイプ対照またはＣＤ４－標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション後のヒト血液由来のＮＰ＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｃ）；ラットにおけるクロドロネートリポソームデコイ事前処置を用いるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４＋Ｔ細胞のＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰ標的化実験の概略図（図６Ｄ；アイソタイプ対照またはＣＤ４標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内送達２時間後のラット血液由来のＮＰ＋ ＣＤ４＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｅ）；ならびにアイソタイプ対照またはＣＤ４標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内送達２時間後のラット血液由来のＮＰ＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｆ）である。
【図6-2】図６Ａ～６Ｆは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰモノボディおよび抗体コンジュゲーションプロセスの概略図（図６Ａ）；５分間、１２分間、３０分間、および１時間、アイソタイプ対照またはＣＤ４－標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション後のヒト血液由来のＮＰ＋ ＣＤ４＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｂ）；５分間、１２分間、３０分間、および１時間、アイソタイプ対照またはＣＤ４－標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション後のヒト血液由来のＮＰ＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｃ）；ラットにおけるクロドロネートリポソームデコイ事前処置を用いるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４＋Ｔ細胞のＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰ標的化実験の概略図（図６Ｄ；アイソタイプ対照またはＣＤ４標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内送達２時間後のラット血液由来のＮＰ＋ ＣＤ４＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｅ）；ならびにアイソタイプ対照またはＣＤ４標的化ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰのいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ静脈内送達２時間後のラット血液由来のＮＰ＋ＰＢＭＣ％のグラフ（図６Ｆ）である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
ナノ粒子は、１ｎｍ～１ミクロン未満の直径を有する粒子（ナノスフェアおよびナノカプセル）である。ナノ粒子は、球状または非球状であってもよく、規則的なまたは不規則な形状を有していてもよい。ある特定の実施形態では、ナノ粒子の集団は、約５００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、または１０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、粒子の平均直径は、約１００ｎｍ～約６００ｎｍ、約１００ｎｍ～５００ｎｍ、約１００ｎｍ～３００ｎｍ、約１００ｎｍ～２５０ｎｍ、約２００ｎｍ～５００ｎｍ、約２００ｎｍ～４００ｎｍ、または約２００ｎｍ～３５０ｎｍである。一部の実施形態では、平均直径は、約１００ｎｍ～２５０ｎｍである。一部の実施形態では、平均直径は、約２００ｎｍ～３５０ｎｍ、好ましくは、約２００～約５００ｎｍである。「直径」という用語は、本明細書では、物理的直径または流体力学的直径のいずれかを指すために使用される。本質的に球状の粒子の直径は、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球状粒子の直径は、流体力学的直径を優先的に指し得る。非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指し得る。複数の粒子を指す場合、粒子の直径は、典型的には、粒子の平均直径を指す。粒子直径は、限定されるものではないが動的光散乱を含む、当技術分野における各種の技法を使用して測定することができる。
Ｉ．定義
ナノ粒子は、１ｎｍ～１ミクロン未満の直径を有する粒子（ナノスフェアおよびナノカプセル）である。ナノ粒子は、球状または非球状であってもよく、規則的なまたは不規則な形状を有していてもよい。ある特定の実施形態では、ナノ粒子の集団は、約５００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、または１０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、粒子の平均直径は、約１００ｎｍ～約６００ｎｍ、約１００ｎｍ～５００ｎｍ、約１００ｎｍ～３００ｎｍ、約１００ｎｍ～２５０ｎｍ、約２００ｎｍ～５００ｎｍ、約２００ｎｍ～４００ｎｍ、または約２００ｎｍ～３５０ｎｍである。一部の実施形態では、平均直径は、約１００ｎｍ～２５０ｎｍである。一部の実施形態では、平均直径は、約２００ｎｍ～３５０ｎｍ、好ましくは、約２００～約５００ｎｍである。「直径」という用語は、本明細書では、物理的直径または流体力学的直径のいずれかを指すために使用される。本質的に球状の粒子の直径は、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球状粒子の直径は、流体力学的直径を優先的に指し得る。非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指し得る。複数の粒子を指す場合、粒子の直径は、典型的には、粒子の平均直径を指す。粒子直径は、限定されるものではないが動的光散乱を含む、当技術分野における各種の技法を使用して測定することができる。
【0020】
「生体適合性」という用語は、本明細書で使用される場合、それら自体が宿主（例えば、動物またはヒト）に対して毒性でもなく、宿主において毒性濃度でモノマー性もしくはオリゴマー性サブユニットまたは他の副産物を生成する速度で分解もしない（材料が分解する場合）、１つまたは複数の材料を指す。
【0021】
「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、材料が、その構成要素サブユニットに、または例えば、より小さな（例えば、非ポリマー性）サブユニットへの材料の生化学的プロセスによる消化で、分解または破壊されることを意味する。
【0022】
「持続放出」という語句は、物質の大部分が一度に生物学的に利用可能にされるボーラス型投与とは対照的に、長期間にわたる物質の放出を指す。
【0023】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、当技術分野で認識されている用語であり、典型的には注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を含み、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、皮内、腹腔内、経気管、および皮下の注射および注入が挙げられる。
【0024】
「界面活性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、液体の表面張力を低下させる薬剤を指す。
【0025】
「遺伝子」という用語は、その鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを通して、特定のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も指す。遺伝子という用語は、ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用される場合、介在する非コード領域および調節領域を含み、５’末端および３’末端を含むことができる。
【0026】
「ラクトン」および「ラクトン単位」という用語は、環状エステルを含む化合物、または環状エステルにおけるエステル結合の切断から生じる鎖式化学構造を記載するために使用される。例えば、ラクトンは、下記に示される環状エステル、および対応するラクトン由来鎖式構造：
［ｎは、整数である］
を記載するために使用される。鎖式構造は、限定されるものではないが、加溶媒分解、例えば、加水分解、および酵素的切断を含む、当技術分野において公知の方法を経て形成される。
【化1】
を記載するために使用される。鎖式構造は、限定されるものではないが、加溶媒分解、例えば、加水分解、および酵素的切断を含む、当技術分野において公知の方法を経て形成される。
【0027】
「アルキル」という用語は、飽和脂肪族基のラジカルを指し、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。
【0028】
好ましい実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０個またはそれよりも少ない炭素原子（例えば、直鎖についてＣ１～Ｃ３０、分枝鎖についてＣ３～Ｃ３０）、好ましくは、２０個またはそれよりも少ない、より好ましくは、１５個またはそれよりも少ない、最も好ましくは、１０個またはそれよりも少ない炭素原子を有する。１～３０の間の骨格炭素原子の数のすべての整数値が、直鎖または分枝鎖アルキルについて企図され、開示される。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造中に３～１０個の炭素原子を有し、より好ましくは、環構造中に５、６、または７個の炭素を有する。３～１０の間の環炭素原子の数のすべての整数値が、シクロアルキルについて企図され、開示される。
【0029】
「アルキル」（または「低級アルキル」）という用語は、本明細書、実施例、および特許請求の範囲の全体にわたって使用される場合、「無置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことが意図され、その後者は、炭化水素骨格の１個または複数の炭素上の水素を置き換える１個または複数の置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。
【0030】
炭素の数が他に明示されない限り、「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、上記で定義されるアルキル基を意味するが、その骨格構造中に１～１０個の炭素、より好ましくは、１～６個の炭素原子を有する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。本出願全体にわたって、好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい実施形態では、本明細書でアルキルとして指定される置換基は、低級アルキルである。
【0031】
炭化水素鎖上で置換される部分は、適切である場合、それら自体が置換され得ることが当業者に理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、チオール、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、－ＣＦ３、－ＣＮ等が挙げられ得る。シクロアルキルも同じ様式で置換され得る。
【0032】
「アリール」は、Ｃ５～Ｃ１０員の芳香族、複素環式、縮合芳香族、縮合複素環式、二芳香族、または二複素環式（bihetereocyclic）の環系を指す。一部の形態では、環系は、３～５０個の炭素原子を有する。広義の「アリール」は、本明細書で使用される場合、０～４個のヘテロ原子を含み得る５、６、７、８、９、１０および２４員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、クリセン、ピレン、コランニュレン、コロネン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「複素芳香族」とも称され得る。芳香環は、１つまたは複数の環位置で、限定されるものではないが、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ（または４級化アミノ）、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、－ＣＦ３、－ＣＮ；およびそれらの組合せを含む１個または複数の置換基で置換され得る。
【0033】
「アリール」という用語は、２個またはそれよりも多くの炭素が２つの隣接する環と共通である２つまたはそれよりも多くの環式環を有する多環式環系（すなわち、「縮合環」）も含み、ここで、環の少なくとも１つは芳香族であり、例えば、他の環式環または環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環であり得る。複素環式環の例としては、限定されるものではないが、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ－１，５，２－ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３－ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ－インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ－インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４－ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ－キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ－１，２，５－チアジアジニル、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルが挙げられる。環の１つまたは複数は、「アリール」について上記で定義されたように、置換され得る。
【0034】
「アルコキシ」は、酸素架橋を通して付着した示された炭素原子の数を有する上記で定義されたアルキル基を指す。アルコキシの例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｓ－ペントキシ、およびそれらの誘導体が挙げられる。
【0035】
第一級アミンは、アンモニア中の３個の水素原子のうちの１個が置換もしくは無置換アルキル基または置換もしくは無置換アリール基によって置き換えられる場合に生じる。第二級アミンは、１個の水素と一緒に、窒素に結合した２個の有機置換基（置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、またはそれらの組合せ）を有する。第三級アミンでは、窒素は３個の有機置換基を有する。
【0036】
「置換された」は、本明細書で使用される場合、モノマー上の１個もしくは複数の原子または原子の群が、置き換えられる原子または原子の群とは異なる１個もしくは複数の原子または原子の群で置き換えられていることを意味する。一部の実施形態では、モノマー上の１個または複数の水素は、１個または複数の原子または原子の群で置き換えられる。水素を置き換えることができる官能基の例は、定義において上記に列挙されている。一部の実施形態では、得られるモノマー／ポリマーの化学的および／または物理的性質、例えば、電荷または親水性／疎水性などを変える１個または複数の官能基を付加することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。
【0037】
「阻害する」または「低減する」という用語は、一般に、活性および量を低減または減少させることを意味する。これは、活性もしくは量の完全な阻害もしくは低減、または部分的な阻害もしくは低減であり得る。阻害または低減は、対照または標準レベルと比較され得る。阻害は、５、１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、もしくは１００％、またはそれらの間の整数であり得る。一部の実施形態では、阻害および低減は、ｍＲＮＡ、タンパク質、細胞、組織および／または臓器レベルで比較される。
【0038】
「防止する」、「防止」または「防止すること」という用語は、組成物または方法を、疾患もしくは障害によって引き起こされる１つもしくは複数の症状のリスクがあるもしくはその素因を有する対象に投与すること、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状を対象が発生する可能性を減少させること、または疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状の重症度、期間、もしくはその開始の時を低減することを意味する。
【0039】
ＩＩ．組成物
Ａ．ポリアルキレンオキシドとブレンドされたおよび／またはそれで改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）および／またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有するナノ粒子
治療剤、診断剤、および／または予防剤の標的化送達のために有用なナノ粒子を開示する。好ましくは、薬剤は、核酸、例えば、ｍＲＮＡである。
Ａ．ポリアルキレンオキシドとブレンドされたおよび／またはそれで改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）および／またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有するナノ粒子
治療剤、診断剤、および／または予防剤の標的化送達のために有用なナノ粒子を開示する。好ましくは、薬剤は、核酸、例えば、ｍＲＮＡである。
【0040】
１．ポリアルキレンオキシドで改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）および／またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）
一態様では、ナノ粒子は、ポリアルキレンオキシドで改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）および／またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）（ＰＡＣＥ－ＰＡＯ）を含有する。ＰＡＯは、部分－［Ｏ－Ｃｎａ－Ｏ］－［式中、ｎａは、少なくとも２、例えば、両端を含む２～８、好ましくは、両端を含む２～３である］を含有する。炭素原子は、独立して、無置換または置換であり得、例えば、ヒドロキシル基、カルビノール基、またはそれらの組合せで置換され得る。例示的な目的のために、ｎａが２であり、炭素原子が無置換である場合、ＰＡＯは、ポリ（エチレングリコール）であり；ｎａが２であり、炭素原子の少なくとも１つが、独立して、カルビノール部分で置換されている場合、ＰＡＯは、ポリ（グリセロール）であり；ｎａが２および／または３であり、炭素原子の少なくとも１つが、独立して、ヒドロキシル基および／またはカルビノール基で置換されている場合、ＰＡＯは、超分岐ポリグリセロールである。好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーは、必要に応じて、末端基改変を必要に応じて含有する第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされる。
一態様では、ナノ粒子は、ポリアルキレンオキシドで改変されたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）および／またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）（ＰＡＣＥ）（ＰＡＣＥ－ＰＡＯ）を含有する。ＰＡＯは、部分－［Ｏ－Ｃｎａ－Ｏ］－［式中、ｎａは、少なくとも２、例えば、両端を含む２～８、好ましくは、両端を含む２～３である］を含有する。炭素原子は、独立して、無置換または置換であり得、例えば、ヒドロキシル基、カルビノール基、またはそれらの組合せで置換され得る。例示的な目的のために、ｎａが２であり、炭素原子が無置換である場合、ＰＡＯは、ポリ（エチレングリコール）であり；ｎａが２であり、炭素原子の少なくとも１つが、独立して、カルビノール部分で置換されている場合、ＰＡＯは、ポリ（グリセロール）であり；ｎａが２および／または３であり、炭素原子の少なくとも１つが、独立して、ヒドロキシル基および／またはカルビノール基で置換されている場合、ＰＡＯは、超分岐ポリグリセロールである。好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーは、必要に応じて、末端基改変を必要に応じて含有する第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされる。
【0041】
一部の形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の総重量に対してＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーの重量の観点で表される、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約９５％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約５０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約２０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約１０％ｗｔ／ｗｔ、約０．１％ｗｔ／ｗｔ～約５％ｗｔ／ｗｔ、約１％ｗｔ／ｗｔ～約５％ｗｔ／ｗｔ、５％ｗｔ／ｗｔ～１０％ｗｔ／ｗｔ、または約１０％ｗｔ／ｗｔ～２０％ｗｔ／ｗｔのＰＡＣＥ－ＰＡＯ、例えば、ＰＡＣＥ－ＰＥＧを含有する。
【0042】
ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーは、一般式：
（（Ａ）ｘ－（Ｂ）ｙ－（Ｃ）ｑ－（Ｄ）ｗ－（Ｅ）ｆ）ｈ
式Ｉａ’
［式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立して、ラクトン（例えば、ペンタデカラクトン）、多官能性分子（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン）、二酸もしくはジエステル（例えば、セバシン酸ジエチル）、またはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）に由来するモノマー単位を含み、ここで、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーは、少なくともラクトン、多官能性分子、二酸またはジエステルモノマー単位、およびポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む］
を有する。一般に、多官能性分子は、１つもしくは複数のカチオン、１つもしくは複数の正にイオン化可能な原子、またはそれらの組合せを含有する。１つまたは複数のカチオンは、塩基性窒素原子のプロトン化から、または第四級窒素原子から形成される。
（（Ａ）ｘ－（Ｂ）ｙ－（Ｃ）ｑ－（Ｄ）ｗ－（Ｅ）ｆ）ｈ
式Ｉａ’
［式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立して、ラクトン（例えば、ペンタデカラクトン）、多官能性分子（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン）、二酸もしくはジエステル（例えば、セバシン酸ジエチル）、またはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）に由来するモノマー単位を含み、ここで、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーは、少なくともラクトン、多官能性分子、二酸またはジエステルモノマー単位、およびポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む］
を有する。一般に、多官能性分子は、１つもしくは複数のカチオン、１つもしくは複数の正にイオン化可能な原子、またはそれらの組合せを含有する。１つまたは複数のカチオンは、塩基性窒素原子のプロトン化から、または第四級窒素原子から形成される。
【0043】
一般に、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーについて、ｘ、ｙ、ｑ、ｗ、およびｆは、独立して、０～１０００の整数であるが、ただし、合計（ｘ＋ｙ＋ｑ＋ｗ＋ｆ）は１より大きいことを条件とする。ｈは、１～１０００の整数である。
【0044】
ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーの一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約１０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．１～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．１～約１である。好ましくは、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーの一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約３０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．３～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．３～約１である。好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１０～約２４であり、より好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１２～約１６である。最も好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は、１２（ドデカラクトン）、１５（ペンタデカラクトン）、または１６（ヘキサデカラクトン）である。
【0045】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧ含有ポリマーの構造は、下記：
好ましくは、式Ｉ’に示される。
［式中、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、ｗは、独立して、０～１０００の整数であるが、ただし式Ｉ’において、ｗは０より大きく、式ＩＩ’において、少なくとも１つのｗはゼロ（０）ではないことを条件とし、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｔは、独立して、存在しない、酸素、硫黄、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、アミン、置換アミン、カルボニル、置換カルボニルであり、
Ｒ７は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
【化2】
［式中、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、ｗは、独立して、０～１０００の整数であるが、ただし式Ｉ’において、ｗは０より大きく、式ＩＩ’において、少なくとも１つのｗはゼロ（０）ではないことを条件とし、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｔは、独立して、存在しない、酸素、硫黄、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、アミン、置換アミン、カルボニル、置換カルボニルであり、
Ｒ７は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
【0046】
ＴＭは、独立して、存在しないかまたは標的化部分である］
【0047】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、Ｚは、式Ｉ’または式ＩＩ’におけるＺ’と同じである。
【0048】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。
【0049】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚも、Ｏである。
【0050】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚも、Ｏである。
【0051】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚも、Ｏである。
【0052】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、Ｚも、Ｏである。
【0053】
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの一部の形態では、式Ｉ’または式ＩＩ’において、ｎは、１３（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。
【0054】
特定の実施形態では、ｘ、ｙ、ｑ、およびｗの値は、式Ｉ’または式ＩＩ’において、ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの重量平均分子量が、５，０００ダルトン超、例えば、５，０００ダルトン～５０ｋＤａ、５，０００ダルトン～３０ｋＤａであるようなものである。この重量平均分子量は、標的化部分の分子量を含まない。ＲおよびＲ’基の例としては、限定されるものではないが、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルの同族体および異性体、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、キシリルなどが挙げられる。
【0055】
ポリアルキレンオキシドのブロックは、ポリマーの末端（すなわち、ブロックされた１つのヒドロキシ基を有するＰＥＧを、例えば、メトキシ基と反応させることによる）、ポリマー骨格内（すなわち、どちらのヒドロキシル基もブロックされない）、またはそれらの組合せに位置し得る。
【0056】
一部の形態では、ナノ粒子は、上記に記載される式Ｉ’および／または式ＩＩ’のＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーを含有し、ここで、少なくとも標的化部分（ＴＭ）は、式Ｉおよび／または式ＩＩ’中に存在する。好ましくは、共有結合性コンジュゲーションは、Ｔ、Ｒ７、またはそれらの組合せを通して起こる。一部の形態では、例えば、標的化部分が、タンパク質またはペプチドである場合、コンジュゲーションは、標的化部分をポリマーのＰＥＧ末端に連結するスクシンイミド基を形成する、タンパク質またはペプチド上の反応性基（例えば、チオール）とポリマー上のマレイミド基との間の容易な「クリック」反応を介して進行する。
【0057】
２．第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされたＰＡＣＥ－ＰＡＯを含有するナノ粒子
一部の形態では、ナノ粒子は、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー（ＰＡＣＥ－ＰＡＯを含有するナノ粒子という表題のセクションで上記に記載された通り）および第２のＰＡＣＥポリマーのブレンドを含有する。好ましくは、第２のＰＡＣＥポリマーは、ＰＥＧ改変を含有しない。第２のＰＡＣＥポリマーは、ＰＡＣＥ－ＰＡＯ（例えば、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）ポリマー中のＰＡＣＥポリマーセグメントと同じまたは異なっていてもよく、類似性または相違は、重量平均分子量、またはＰＡＣＥポリマーにおける構成要素の組成モルパーセントに基づいて評価され得る。第２のＰＡＣＥポリマーは、必要に応じて、末端基改変を含有する。第２のＰＡＣＥポリマーが、末端基改変を含有しない場合、これは、「第２のＰＡＣＥａｂ」と示される。少なくとも１つの末端基改変が存在する場合、第２のＰＡＣＥポリマーは、「第２のＰＡＣＥｎｇ」と示される。
一部の形態では、ナノ粒子は、ＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー（ＰＡＣＥ－ＰＡＯを含有するナノ粒子という表題のセクションで上記に記載された通り）および第２のＰＡＣＥポリマーのブレンドを含有する。好ましくは、第２のＰＡＣＥポリマーは、ＰＥＧ改変を含有しない。第２のＰＡＣＥポリマーは、ＰＡＣＥ－ＰＡＯ（例えば、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）ポリマー中のＰＡＣＥポリマーセグメントと同じまたは異なっていてもよく、類似性または相違は、重量平均分子量、またはＰＡＣＥポリマーにおける構成要素の組成モルパーセントに基づいて評価され得る。第２のＰＡＣＥポリマーは、必要に応じて、末端基改変を含有する。第２のＰＡＣＥポリマーが、末端基改変を含有しない場合、これは、「第２のＰＡＣＥａｂ」と示される。少なくとも１つの末端基改変が存在する場合、第２のＰＡＣＥポリマーは、「第２のＰＡＣＥｎｇ」と示される。
【0058】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥポリマーは、式Ｉ：
［式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、存在しないかまたはヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、もしくはそれらの組合せを含有する化学実体である］に示される構造を有する。
【化3】
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、存在しないかまたはヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、もしくはそれらの組合せを含有する化学実体である］に示される構造を有する。
【0059】
第２のＰＡＣＥポリマーの一部の形態では、Ｒ１およびＲ２は、存在しない。第２のＰＡＣＥポリマーの一部の形態では、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、存在する。Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、第２のＰＡＣＥポリマーは、「第２のＰＡＣＥａｂポリマー」と示される。Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つが存在する場合、第２のＰＡＣＥポリマーは、「第２のＰＡＣＥｎｇポリマー」と示される。
【0060】
ＲｘおよびＲ’基の例としては、限定されるものではないが、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルの同族体および異性体、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、キシリルなどが挙げられる。
【0061】
特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、２，０００ダルトン超であるようなものである。一部の形態では、ＰＡＣＥｎｇポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、または約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである。
【0062】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）は、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）、トリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、またはヒドロキシ－ジアミン（Ｚ＝ＯかつＺ’＝ＮＲ’、またはＺ＝ＮＲ’かつＺ’＝Ｏ）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミン、アミン－ジオール、もしくはヒドロキシ－ジアミンモノマーが使用される実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る。
【0063】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約１０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．１～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．１～約１である。好ましくは、第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約３０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．３～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．３～約１である。好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１０～約２４であり、より好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１２～約１６である。最も好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は、１２（ドデカラクトン）、１５（ペンタデカラクトン）、または１６（ヘキサデカラクトン）である。
【0064】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚは、Ｚ’と同じである。
【0065】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。
【0066】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。
【0067】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。
【0068】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。
【0069】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。
【0070】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）の一部の形態では、ｎは、１３（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。
【0071】
一部の形態では、ナノ粒子は、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーを含有し、Ｒ１および／またはＲ２は、対応するナノ粒子に関連せず、Ｒ１および／またはＲ２は、
からなるかまたはそれを含む。
【化4】
【0072】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーを含有するナノ粒子は、Ｒ１および／またはＲ２が、
からなる、またはそれを含む対応するナノ粒子と比べて、核酸カーゴ、例えば、ＲＮＡ、より詳細には、ｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す。
【化5】
【0073】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、式ＩＩの構造を有する。
［式中、Ｊ１およびＪ２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方の分子量は、５００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満である。
【化6】
Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方の分子量は、５００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満である。
【0074】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｊ１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。
【0075】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｊ２は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。
【0076】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３は、Ｒ４と同一である。
【0077】
好ましくは、Ｒ３および／またはＲ４は、直鎖状である。
【0078】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、第一級アミン基を含有する。第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、第一級アミン基、および１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。
【0079】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。
【0080】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。
【0081】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、－無置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｂｑ（式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ５－であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ５は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）である。
【0082】
第２のＰＡＣＥｎｇポリマーの一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、
から選択される。
【化7-1】
【化7-2】
【0083】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーが式ＩＩＩの構造を有することを除いて、上記に記載される通りである。
【化8】
【0084】
モノマー単位は、１つまたは複数の位置で、１個または複数の置換基により置換することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、アルキル基、環状アルキル基、アルケン基、環状アルケン基、アルキン、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。
【0085】
第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）は、好ましくは、生体適合性である。さまざまな環のサイズの容易に利用可能なラクトンは、低い毒性を持つことが公知であり、例えば、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ｐ－ジオキサノン）などの小さなラクトンから調製されたポリエステルは、臨床適用において使用されている市販の生体材料である。大きな（例えば、Ｃ１６～Ｃ２４）ラクトンおよびそれらのポリエステル誘導体は、ハチなどの生物において特定されている天然産物である。１６～２４個の環炭素原子を含有するラクトンが、具体的に企図され、開示される。
【0086】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）は、温度制御された加水分解を経てさらに活性化され、それによって、１個または複数の活性化された末端基を露出させることができる。１個または複数の活性化された末端基は、例えば、ヒドロキシルまたはカルボン酸末端基であり得、これらは両方とも、ポリマー内のエステル結合の加水分解を経て生じ得る。活性化された第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）は、約５～２５ｋＤａ、好ましくは、約５～１０ｋＤａの重量平均分子量を有することができる。
【0087】
一部の形態では、ナノ粒子は、約１％ｗｔ／ｗｔ～約１５％ｗｔ／ｗｔのＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマー、および約９９％ｗｔ／ｗｔ～約１５％ｗｔ／ｗｔの第２のＰＡＣＥポリマー（すなわち、第２のＰＡＣＥａｂポリマーまたは第２のＰＡＣＥｎｇポリマー）、例えば、約１０％ｗｔ／ｗｔのＰＡＣＥ－ＰＡＯポリマーおよび約９０％ｗｔ／ｗｔの第２のＰＡＣＥポリマーを含有する。
【0088】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、許容されるパラメーター内のわずかな変動を意味する。明確性のために、「約」は、所与の値の±１０％を指す。一部の形態では、活性化された第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、一方の末端にＲ１またはＲ２（例えば、Ｒ３またはＲ４を示す非限定的な部分によって例示される、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体）を含有し、他方の末端に加水分解を介して生じたヒドロキシルまたはカルボン酸末端基を含有する。
【0089】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーが式ＩＶの構造を有することを除いて、上記に記載される通りである。
【化9】
【0090】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーが式Ｖの構造を有することを除いて、上記に記載される通りである。
【化10】
【0091】
一部の形態では、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーは、第２のＰＡＣＥｎｇポリマーが式ＶＩの構造を有することを除いて、上記に記載される通りである。
［式中、Ｘ’は、－ＯＨまたは－ＮＨＲ’である］
【化11】
【0092】
式ＶＩ、Ｖ、およびＶＩは、中間生成物の構造である。それらは、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つが存在する、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの構造を有する多種多様な第２のＰＡＣＥｎｇポリマーを合成するために使用することができる。
【0093】
３．必要に応じて標的化部分に結合した、表面上に非共有結合的にコンジュゲートされた界面活性剤を含有するナノ粒子
別の態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合的にコンジュゲートされた界面活性剤を含有する。これらの形態では、ナノ粒子は、第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされたＰＡＣＥ－ＰＡＯを含有するナノ粒子という表題のセクションで上記に記載された、第２のＰＡＣＥポリマーを含有する。好ましくは、界面活性剤は、ポリマー性界面活性剤である。
別の態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合的にコンジュゲートされた界面活性剤を含有する。これらの形態では、ナノ粒子は、第２のＰＡＣＥポリマーとブレンドされたＰＡＣＥ－ＰＡＯを含有するナノ粒子という表題のセクションで上記に記載された、第２のＰＡＣＥポリマーを含有する。好ましくは、界面活性剤は、ポリマー性界面活性剤である。
【0094】
好ましくは、これらの形態では、ナノ粒子の表面は、標的化部分が共有結合的にコンジュゲートされている、界面活性剤を含有する。標的化部分を含有する界面活性剤は、構造：
［式中、
それぞれのＡｆは、独立して、疎水性または親水性モノマー残基であり、
Ｂｆは、置換アルキル、置換アリール、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アミン、置換カルボニル、置換アミド、または置換スルホンであり、
Ｔｆは、独立して、酸素であるかまたは存在せず、
Ｒ７ｆは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
ＴＭは、標的化部分であり、
ａｘは、独立して、０～１０，０００、０～５，０００、または０～１，０００の整数であり、
ｂｘおよびｃｘは、独立して、１～１０，０００、１～５０００、または１～１，０００の整数である］
を含有する。
【化12】
それぞれのＡｆは、独立して、疎水性または親水性モノマー残基であり、
Ｂｆは、置換アルキル、置換アリール、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アミン、置換カルボニル、置換アミド、または置換スルホンであり、
Ｔｆは、独立して、酸素であるかまたは存在せず、
Ｒ７ｆは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アミド、置換アミド、置換スルホン、無置換スルホン、アリール、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、マレイミド、アミン、置換アミン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミド、アジド、アクリレート、メタクリレート、アルキン、ヒドロキシド、またはイソシアネートであり、
ＴＭは、標的化部分であり、
ａｘは、独立して、０～１０，０００、０～５，０００、または０～１，０００の整数であり、
ｂｘおよびｃｘは、独立して、１～１０，０００、１～５０００、または１～１，０００の整数である］
を含有する。
【0095】
一部の形態では、標的化部分を含有する界面活性剤は、界面活性剤が、構造：
を含有することを除いて、上記に記載される通りである。
【化13】
【0096】
ナノ粒子に標的化部分をコンジュゲートするいずれかのアプローチでは、標的化部分は、小分子（２００Ｄａ～２，５００Ｄａの分子量）、アプタマー、タンパク質、またはペプチドを含む。
【0097】
一部の形態では、ナノ粒子は、細胞型または細胞状態に特異的な標的化ドメインまたは標的化シグナルを含む。ナノ粒子に連結され得るか、または連結され得ない部分の例としては、例えば、特定の細胞への分子の送達を提供する標的化部分が挙げられる。標的化シグナルまたは配列は、宿主、組織、臓器、細胞、オルガネラ、非核オルガネラ、または細胞コンパートメントに特異的であり得る。また、本明細書の組成物は、他の特定の細胞間領域、コンパートメント、または細胞型に標的化され得る。
【0098】
一部の形態では、標的化シグナルは、ベクターおよび細胞膜を互いに十分に近づけて、ベクターの細胞への浸透を可能にするように、標的細胞の表面上に位置するそのリガンドまたは受容体に結合する。追加の実施形態は、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に特異的に送達することを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができるか、または異なるポリヌクレオチドの発現を妨げることができる。細胞に送達されるポリヌクレオチドは、細胞の機能を増強し得るか、またはそれに寄与し得るポリペプチドをコードすることができる。
【0099】
標的化部分は、抗体またはその抗原結合性断片、抗体ドメイン、抗原、Ｔ細胞受容体、細胞表面受容体、細胞表面接着分子、主要組織適合性遺伝子座タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、および規定の細胞に特異的に結合するファージディスプレイによって選択されたペプチドであり得る。
【0100】
一部の形態では、好ましくは、標的化部分は、タンパク質またはペプチドである。
【0101】
当業者は、記載されるナノ粒子の指向性が、単に標的化シグナルを変化させることによって変更することができることを認識するであろう。哺乳動物生物における組織中のほぼすべての細胞型が、ある固有の細胞表面受容体または抗原を持つことは当技術分野において公知である。そのため、細胞表面受容体または抗原に対するほぼあらゆるリガンドを標的化シグナルとして組み込むことが可能である。例えば、ペプチジルホルモンは、そのようなホルモンに対する受容体を持つ細胞への送達を標的化する標的化部分として使用することができる。ケモカインおよびサイトカインは、同様に、それらの標的細胞への複合体の送達を標的化する標的化シグナルとして用いることができる。ある特定の細胞または細胞状態において優先的に発現される遺伝子を特定するために各種の技術が開発されており、当業者は、そのような技術を用いて、目的の標的組織において優先的にまたは固有に発現される標的化シグナルを特定することができる。
【0102】
Ｂ．ナノ粒子に結合するおよび／またはその中に封入される材料
１．治療剤、予防剤および診断剤
活性薬剤には、合成および天然タンパク質（酵素、ペプチド－ホルモン、受容体、増殖因子、抗体、シグナル伝達分子を含む）、ならびに合成および天然核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、三重鎖ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、およびオリゴヌクレオチドを含む）、糖および多糖、小分子（典型的には、１０００ダルトン未満）、脂質およびリポタンパク質、ならびにそれらの生物学的に活性な部分が含まれる。好適な活性薬剤は、小ペプチドおよびポリペプチドについて約１，０００Ｄａ超、より典型的には、タンパク質について、少なくとも約５，０００Ｄａ、および多くの場合に１０，０００Ｄａまたはそれよりも大きいサイズを有する。核酸は、より典型的には、塩基対または塩基（まとめて「ｂｐ」）の観点で列挙される。
１．治療剤、予防剤および診断剤
活性薬剤には、合成および天然タンパク質（酵素、ペプチド－ホルモン、受容体、増殖因子、抗体、シグナル伝達分子を含む）、ならびに合成および天然核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、三重鎖ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、およびオリゴヌクレオチドを含む）、糖および多糖、小分子（典型的には、１０００ダルトン未満）、脂質およびリポタンパク質、ならびにそれらの生物学的に活性な部分が含まれる。好適な活性薬剤は、小ペプチドおよびポリペプチドについて約１，０００Ｄａ超、より典型的には、タンパク質について、少なくとも約５，０００Ｄａ、および多くの場合に１０，０００Ｄａまたはそれよりも大きいサイズを有する。核酸は、より典型的には、塩基対または塩基（まとめて「ｂｐ」）の観点で列挙される。
【0103】
代表的な抗がん剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびイホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、およびフロクスウリジン）、抗有糸分裂薬（タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（decetaxel）、ならびにビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンを含む）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、およびエピルビシン、ならびにアクチノマイシン、例えば、アクチノマイシンＤを含む）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、およびブレオマイシンを含む）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン類、例えば、カンプトテシン、イリノテカン、およびトポテカン、ならびにエピポドフィロトキシンの誘導体、例えば、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含む）、ダナゾール、およびそれらの組合せが挙げられる。他の好適な抗がん剤としては、血管新生阻害剤；受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、例えば、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、パゾパニブ、アキシチニブ、およびラパチニブ；ならびにトランスフォーミング増殖因子－αまたはトランスフォーミング増殖因子－β阻害剤が挙げられる。
【0104】
この技術を用いて送達され得る他の治療薬としては、抗生物質（抗細菌性、抗ウイルス性または抗真菌性）、および抗炎症薬（例えば、コルチゾンおよびプレドニゾンのようなステロイド、ならびに非ステロイド抗炎症薬、例えば、ナプロキセン）が挙げられる。
【0105】
画像化剤、例えば、放射線不透過性化合物も、配置または除去の時に局在化を容易にするために組み込まれ得る。
【0106】
例示的な診断材料としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種が挙げられる。好適な診断剤としては、限定されるものではないが、ｘ線画像化剤および造影媒体が挙げられる。放射性核種は、画像化剤として使用することもできる。他の好適な造影剤の例としては、放射線不透過性であるガスまたはガス発生化合物が挙げられる。ナノ粒子は、投与された粒子の場所を決定するために有用な薬剤をさらに含むことができる。この目的のために有用な薬剤としては、蛍光タグ、放射性核種および造影剤が挙げられる。
【0107】
２．負荷
負荷パーセントは、典型的には、約１重量％～約８０重量％、約１重量％～約５０重量％、約１重量％～約４０重量％、約１重量％～約２０重量％、または約１重量％～約１０重量％である。一部の実施形態では、薬物負荷パーセントは、約５％～約５０％、または約１０％～約４０％、または約１５％～約３０％である。具体的な実施形態では、薬物負荷は、約２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２０、または３０％である。
負荷パーセントは、典型的には、約１重量％～約８０重量％、約１重量％～約５０重量％、約１重量％～約４０重量％、約１重量％～約２０重量％、または約１重量％～約１０重量％である。一部の実施形態では、薬物負荷パーセントは、約５％～約５０％、または約１０％～約４０％、または約１５％～約３０％である。具体的な実施形態では、薬物負荷は、約２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２０、または３０％である。
【0108】
ＩＩＩ．作製する方法およびそのための試薬
（ｉ）ポリマー
（ａ）末端基改変またはポリ（エチレングリコール）を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）
ポリマーは、一般に、合成ポリマーから改変される。例示的な合成ポリマーとしては、ラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンから形成されるポリ（アミン－ｃｏ－エステル）が挙げられる。リパーゼなどの酵素触媒を使用するラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンからのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）の合成のための方法も提供する。例示的なラクトンは、米国特許公開第２０１７０１２１４５４号に開示されている。一部の形態では、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、スキーム１に示すようにして調製される。
（ｉ）ポリマー
（ａ）末端基改変またはポリ（エチレングリコール）を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）
ポリマーは、一般に、合成ポリマーから改変される。例示的な合成ポリマーとしては、ラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンから形成されるポリ（アミン－ｃｏ－エステル）が挙げられる。リパーゼなどの酵素触媒を使用するラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンからのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）の合成のための方法も提供する。例示的なラクトンは、米国特許公開第２０１７０１２１４５４号に開示されている。一部の形態では、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、スキーム１に示すようにして調製される。
【0109】
スキーム１：未改変ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）の調製
反応物としてＰＤＬ、ＤＥＳ、ＭＤＡ、およびＰＥＧを使用する本明細書に記載されるポリマーの合成を、スキーム２に示す。
【化14】
【0110】
スキーム２：ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬブロックコポリマーの酵素的合成
モノマーのモル比（例えば、ラクトン：アミノジオール：二酸）は、例えば、約１０：９０：９０～約９０：１０：１０で変わり得る。一部の実施形態では、比は、１０：９０：９０、２０：８０：８０、４０：６０：６０、６０：４０：４０、または８０：２０：２０である。重量平均分子量は、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するＧＰＣによって決定される場合、例えば、約２，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、好ましくは、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、最も好ましくは、約５０００ダルトン～約１０，０００ダルトンで変わり得る。
【化15】
【0111】
ポリマーの疎水性は、ラクトンのパーセンテージを、例えば、約１０％～約１００％（ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される）、または約３０％～約１００％で変えることによって調整することができる。ポリマーの分子量は、第２段階の反応時間、例えば、約８時間～約７２時間を調整することによって、調整することができる。
【0112】
酵素法は、多様な鎖構造および調整可能な疎水性を有するポリマーの合成を可能にする。一部の実施形態では、疎水性は、ラクトンモノマーの環サイズおよび／またはモル量を変えることによって変わる。広範囲の環サイズを有するラクトン（例：Ｃ４～Ｃ２４、好ましくは、Ｃ６～Ｃ２４、より好ましくは、Ｃ６～Ｃ１６）をコモノマーとして使用することができる。反応は、アミノ基の保護および脱保護なしで単一ステップで行うことができる。そのようなアミノ保有コポリエステルは、従来の有機金属触媒が、有機アミンに感受性であるか、またはそれによって不活性化する場合が多いので、そのような触媒を使用して調製することは極めて困難である。これらの触媒は、大きなラクトン環モノマーを重合するのに非効率的であることも公知である。酵素触媒は、酵素の高い活性および選択性、ならびに得られる金属を含まない高純度の生成物により、生物医学ポリマーを生成することについての明確な利点を有する。
【0113】
式ＩＶ、Ｖ、またはＶＩの構造を有するポリマーは、式ＶＩＩの未改変ポリマーを１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と、約１：１０～約１：６０、好ましくは、約１：４０のモル比で反応させることを介して合成することができる。
【0114】
式ＩまたはＩＩの構造を有するポリマーは、当技術分野において公知のカップリング反応を使用する式ＶＩＩの未改変ポリマーの末端基の改変を介して得ることができる。例えば、式ＩＩＩの構造を有するポリマーは、（１）式ＶＩＩの未改変ポリマーをＣＤＩと反応させて、式ＩＶのポリマーを得るステップ、および（２）式ＩＶのポリマーをＲ３－ＮＨ２およびＲ４－ＮＨ２と反応させるステップを介して合成することができる。一部の形態では、Ｒ３、Ｒ４、またはその両方は、図１に示されるものから選択される。好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、同じである。
【0115】
あるいは、式ＩＩＩの構造を有するポリマーは、（１）式ＶＩＩの未改変ポリマーをＣＤＩと反応させて、式ＶまたはＶＩのポリマーを得るステップ、（２）ステップ（１）からのポリマー中の－ＣＯＯＨ基または－Ｘ’基を保護するステップ、（３）ステップ（２）からの保護されたポリマーをＲ４－ＮＨ２またはＲ３－ＮＨ２と反応させるステップ、（４）ステップ（３）からのポリマー中の－ＣＯＯＨ基または－Ｘ’基を脱保護するステップ、および（５）ステップ（４）からの脱保護されたポリマーをＲ３－ＮＨ２またはＲ４－ＮＨ２と反応させるステップを介して合成することができる。
【0116】
式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのポリマーの加水分解媒介活性化は、最大で３０日間またはそれよりも長く、温度制御された様式で行うことができる。加水分解の長さは、活性化されるポリマーの分子量に応じて変わり得る。より大きい分子量のポリマー（例えば、約２０～２５ｋＤａ）は、より長い期間、例えば、約３０～４０日間、最適に加水分解される。より小さな分子量のポリマー（例えば、約５～７ｋＤａ）は、より短い期間、例えば、約４～１０日間、最適に加水分解される。
【0117】
一部の形態では、ポリマーは、約３０℃～４２℃、または最高で約１００℃の範囲のいずれかの温度で加水分解される。ＰＡＣＥポリマーは、約３５℃～４０℃、例えば、約３７℃の温度で加水分解することができる。
【0118】
一部の形態では、ポリマーは、例えば、約１ａｔｍで加水分解される。より高い圧力は、プロセスを加速する（例えば、約１～約１００ａｔｍの圧力）。プロセスについての速度は、作製される特定の製剤について、当業者によって決定されるであろう。
【0119】
得られる加水分解生成物の重量平均分子量は、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ、好ましくは、約５～約１０ｋＤａで変わり得る。
【0120】
好ましくは、ポリマー中のエステル結合の１つまたは複数が加水分解される。加水分解生成物は、一方の末端にＲ１またはＲ２、他方の末端に加水分解を介して生じたカルボキシルまたはヒドロキシル基を有し得る。
【0121】
（ｂ）ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）の合成
ＰＶＡ－ＶＳポリマーを、Raudszus, et al. (Raudszus, et al., Int. J. Pharm. 2018, 536(1), 211-221)に記載されるようにして調製した。さらなる詳細を実施例に提供する。
ＰＶＡ－ＶＳポリマーを、Raudszus, et al. (Raudszus, et al., Int. J. Pharm. 2018, 536(1), 211-221)に記載されるようにして調製した。さらなる詳細を実施例に提供する。
【0122】
（ｉｉ）ナノ粒子
粒子は、当技術分野において公知の各種の技法を使用して調製することができる。使用される技法は、ナノ粒子を形成するために使用されるポリマー、得られる粒子の所望のサイズ範囲、および封入される材料に対する適合性を含む各種の要因に依存し得る。
粒子は、当技術分野において公知の各種の技法を使用して調製することができる。使用される技法は、ナノ粒子を形成するために使用されるポリマー、得られる粒子の所望のサイズ範囲、および封入される材料に対する適合性を含む各種の要因に依存し得る。
【0123】
ナノ粒子を調製するために使用することができる当技術分野において公知の方法としては、限定されるものではないが、一重および二重エマルジョン；ナノ沈殿；ナノ粒子成形；静電的自己アセンブリー（例えば、ポリエチレンイミン－ＤＮＡまたはリポソーム）および高分子電解質濃縮（Suk et al., Biomaterials, 27, 5143-5150 (2006)を参照されたい）が挙げられる。好ましい形態では、ナノ粒子は、一重および二重エマルジョン蒸発手順を介して調製される。
【0124】
一部の形態では、負荷された粒子は、典型的には有機溶媒中で、ポリマーの溶液を目的の薬剤（例えば、ｍＲＮＡなどの核酸）と組み合わせることによって調製される。最初に、ポリマーの溶液は、ポリマーを溶解するのに好適な溶媒にポリマーを溶解または懸濁させることによって調製される。封入される核酸に悪影響を及ぼさない（例えば、不安定化または分解しない）溶媒が選択されなければならない。好適な溶媒としては、限定されるものではないが、ＤＭＳＯおよび塩化メチレン、すなわち、ジクロロメタン（ＤＣＭ）が挙げられる。溶媒中のポリマーの濃度は、必要により変えることができる。
【0125】
次に、ポリマー溶液を、ポリヌクレオチドなどの封入される薬剤と混合する。薬剤は、それをポリマー溶液と組み合わせる前に、溶媒に溶解して溶液を形成することができる。一部の実施形態では、薬剤は、それをポリマー溶液と組み合わせる前に、生理学的緩衝液に溶解する。ポリマー溶液体積の薬剤溶液体積に対する比は、１：１であり得る。ポリマーおよび薬剤の組合せは、典型的には、トランスフェクションなどのその所望の目的のために溶液を使用する前に、数分間インキュベートして、粒子を形成する。一部の形態では、ナノ粒子は、ポリマーを含有する溶液を、無溶媒のポリマーまたはポリマーの構成要素と接触させて、粒子を生成することによって形成される。ポリマー／ポリヌクレオチド溶液を、トランスフェクションのために溶液を使用する前に、２、５、１０、または１０分より長くインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温であり得る。
【0126】
（ａ）ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子の製造
ナノ粒子がＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬを含有する非限定的な場合では、標的化部分は、ナノ粒子の形成の前または後に、ポリマーにコンジュゲートすることができる。非限定的な例では、標的化部分が、タンパク質またはペプチドである場合、コンジュゲーションは、標的化部分をポリマーのＰＥＧ末端に連結するスクシンイミド基を形成する、タンパク質またはペプチド上の反応性基（例えば、チオール）とポリマー上のマレイミド基との間の容易な「クリック」反応を介して進行する。チオールは、タンパク質またはペプチド中のシステイン残基の側鎖由来であり得る。
ナノ粒子がＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬを含有する非限定的な場合では、標的化部分は、ナノ粒子の形成の前または後に、ポリマーにコンジュゲートすることができる。非限定的な例では、標的化部分が、タンパク質またはペプチドである場合、コンジュゲーションは、標的化部分をポリマーのＰＥＧ末端に連結するスクシンイミド基を形成する、タンパク質またはペプチド上の反応性基（例えば、チオール）とポリマー上のマレイミド基との間の容易な「クリック」反応を介して進行する。チオールは、タンパク質またはペプチド中のシステイン残基の側鎖由来であり得る。
【0127】
（ｂ）ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳの製造
ナノ粒子がＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳを含有する非限定的な場合では、標的化部分は、ナノ粒子の形成の前または後に、ＰＶＡ－ＶＳポリマーにコンジュゲートすることができる。非限定的な例では、標的化部分が、タンパク質またはペプチドである場合、コンジュゲーションは、タンパク質またはペプチド上の反応性基（例えば、チオール）と、ＰＡＣＥ－ＶＳポリマーに共有結合的にコンジュゲートされたビニルスルホンの遊離ビニル基との間の容易な「クリック」反応を介して進行する。チオールは、タンパク質またはペプチド中のシステイン残基の側鎖由来であり得る。非限定的な例では、ＰＡＣＥポリマーは、有機相に溶解され、次いで、ＰＶＡ－ＶＳ溶液に添加されて、エマルジョンを形成する。得られたエマルジョンは、次に、ＰＶＡの第２の溶液に移され、続いて、有機相を蒸発させて、ナノ粒子が形成され得る。
ナノ粒子がＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳを含有する非限定的な場合では、標的化部分は、ナノ粒子の形成の前または後に、ＰＶＡ－ＶＳポリマーにコンジュゲートすることができる。非限定的な例では、標的化部分が、タンパク質またはペプチドである場合、コンジュゲーションは、タンパク質またはペプチド上の反応性基（例えば、チオール）と、ＰＡＣＥ－ＶＳポリマーに共有結合的にコンジュゲートされたビニルスルホンの遊離ビニル基との間の容易な「クリック」反応を介して進行する。チオールは、タンパク質またはペプチド中のシステイン残基の側鎖由来であり得る。非限定的な例では、ＰＡＣＥポリマーは、有機相に溶解され、次いで、ＰＶＡ－ＶＳ溶液に添加されて、エマルジョンを形成する。得られたエマルジョンは、次に、ＰＶＡの第２の溶液に移され、続いて、有機相を蒸発させて、ナノ粒子が形成され得る。
【0128】
ＩＶ．使用する方法
粒子は、有効量の１つまたは複数の治療剤、診断剤、および／または予防剤をそのような処置を必要とする患者に送達するために使用することができる。投与される薬剤の量は、処方する医師によって容易に決定することができ、患者の年齢および体重、ならびに処置される疾患または障害に依存する。
粒子は、有効量の１つまたは複数の治療剤、診断剤、および／または予防剤をそのような処置を必要とする患者に送達するために使用することができる。投与される薬剤の量は、処方する医師によって容易に決定することができ、患者の年齢および体重、ならびに処置される疾患または障害に依存する。
【0129】
一部の形態では、薬剤としては、核酸、例えば、ｍＲＮＡが挙げられる。一部の形態では、薬剤は、ナノ粒子内に非共有結合的に封入されている。一部の形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面上よりも高い割合の、ナノ粒子で封入された薬剤を有する。一部の形態では、薬剤は、ナノ粒子内に封入されており、ナノ粒子の表面上に存在しない。
【0130】
ナノ粒子は、他の送達システムに対していくつかの利点を有する。ナノ粒子は、核酸の改善された負荷を有することができ、ナノ粒子の表面上の標的化薬剤（例えば、タンパク質およびペプチド）の制御された配向も示し得る。非限定的な例では、標的化薬剤（例えば、タンパク質およびペプチド）の配向は、タンパク質またはペプチド中に存在する特定のアミノ酸（例えば、システインのチオール基を含む）を介した共有結合性コンジュゲーションによって達成することができる。これらの性質は、望ましくない副作用、例えば、全身毒性の誘導なしで、薬剤、例えば、核酸を、標的化された組織に送達することを可能にする。したがって、ナノ粒子は、核酸の送達（例えば、制御された送達）のための多用途のプラットフォームとしての役割を果たす。
【0131】
粒子は、静脈内、皮下、もしくは筋肉内に投与することができ、鼻もしくは肺系に投与することができ、腫瘍環境内に注射することができ、粘膜表面（膣、直腸、頬側、舌下）に投与することができ、または経口送達のために封入することができる。粒子は、乾燥粉末として、水性懸濁物（水、食塩水、緩衝食塩水などの中）、ヒドロゲル、オルガノゲル、もしくはリポソーム、カプセル剤、錠剤、トローチ、または他の標準的な医薬賦形剤中で投与され得る。
【0132】
（ｉ）ワクチンプラットフォーム
ナノ粒子は、ワクチン送達プラットフォームとして使用することができ、ここで、それらは、抗原、または病原体に対する増強された免疫を提供するための抗原をコードする核酸を含む。非限定的な例では、対象の粘膜および上皮組織において外因性抗原に対する頑強な粘膜免疫を誘導または増強するための方法で使用することができるナノ粒子が提供される。方法は、レシピエントの組織常在Ｔ細胞およびＢ細胞の１つまたは複数の集団を効果的に生じさせる。一部の形態では、方法は、ワクチン接種抗原および／またはワクチン接種抗原が起源である元の宿主に対して防御的な組織常在性メモリーＴおよびＢ細胞の集団を提供する。一部の形態では、方法は、粘膜または上皮組織における抗体応答を誘導する。好ましくは、抗体応答は、主にＩｇＡ 抗体から構成される。細胞の粘膜免疫応答は、粘膜領域（例えば、呼吸管、または胃腸管）から、または粘膜領域（例えば、呼吸器領域または胃腸領域）から流出するリンパ節から単離されたリンパ球からのＴ細胞応答を測定することによって評価されてもよい。一部の形態では、方法は、感染性疾患に対する防御免疫を提供する。特に、方法は、１つまたは複数の呼吸器疾患に対する防御免疫を提供する。防御免疫が提供される疾患は、投与のための組成物内に提供される抗原によって決定される。
ナノ粒子は、ワクチン送達プラットフォームとして使用することができ、ここで、それらは、抗原、または病原体に対する増強された免疫を提供するための抗原をコードする核酸を含む。非限定的な例では、対象の粘膜および上皮組織において外因性抗原に対する頑強な粘膜免疫を誘導または増強するための方法で使用することができるナノ粒子が提供される。方法は、レシピエントの組織常在Ｔ細胞およびＢ細胞の１つまたは複数の集団を効果的に生じさせる。一部の形態では、方法は、ワクチン接種抗原および／またはワクチン接種抗原が起源である元の宿主に対して防御的な組織常在性メモリーＴおよびＢ細胞の集団を提供する。一部の形態では、方法は、粘膜または上皮組織における抗体応答を誘導する。好ましくは、抗体応答は、主にＩｇＡ 抗体から構成される。細胞の粘膜免疫応答は、粘膜領域（例えば、呼吸管、または胃腸管）から、または粘膜領域（例えば、呼吸器領域または胃腸領域）から流出するリンパ節から単離されたリンパ球からのＴ細胞応答を測定することによって評価されてもよい。一部の形態では、方法は、感染性疾患に対する防御免疫を提供する。特に、方法は、１つまたは複数の呼吸器疾患に対する防御免疫を提供する。防御免疫が提供される疾患は、投与のための組成物内に提供される抗原によって決定される。
【0133】
一部の形態では、方法は、呼吸器ウイルス疾患による感染、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の発生に関連するコロナウイルス、またはインフルエンザウイルスによる感染に対して対象をワクチン接種する。
【0134】
（ｉｉ）トランスフェクションプラットフォーム
ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの細胞トランスフェクションのためのものであり得る。トランスフェクションは、遺伝子治療および疾患処置を含む適用において適用することができる。ナノ粒子は、対照と比較した場合に、より効率的で、毒性が低く、またはそれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、対照は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの代替トランスフェクション試薬で処理された細胞である。
ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの細胞トランスフェクションのためのものであり得る。トランスフェクションは、遺伝子治療および疾患処置を含む適用において適用することができる。ナノ粒子は、対照と比較した場合に、より効率的で、毒性が低く、またはそれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、対照は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの代替トランスフェクション試薬で処理された細胞である。
【0135】
トランスフェクションは、細胞をナノ粒子を含有する溶液と接触させることによって行われる。ｉｎ ｖｉｖｏの方法について、接触は、典型的には、溶液が対象に投与された後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法について、溶液は、典型的には、細胞の培養物に添加され、数分間、数時間、または数日間、細胞に接触させる。その後、細胞を洗浄して、過剰なナノ粒子を移動させることができる。
【0136】
ナノ粒子によって送達される特定のポリヌクレオチドは、処置される状態または疾患に応じて当業者によって選択することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、目的の遺伝子もしくはｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、阻害性ＲＮＡなどの機能性核酸、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、あるいは目的の遺伝子もしくはｃＤＮＡ、機能性核酸、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡをコードする発現ベクターであり得る。一部の形態では、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドが、組み合わせて投与され得る。
【0137】
ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチドを細胞に送達する方法において使用することができる。例えば、ナノ粒子は、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのために使用することができる。方法は、典型的には、ポリヌクレオチドを細胞の細胞質に導入するための有効量でポリヌクレオチドを含むナノ粒子と細胞を接触させることを含む。一部の形態では、ポリヌクレオチドは、細胞の遺伝子型または表現型を変化させるための有効量で細胞に送達される。細胞は、対象から単離された初代細胞、または樹立された細胞系の細胞であり得る。細胞は、同種の細胞型のものであり得るか、または異なる細胞型の異種性混合物であり得る。例えば、ナノ粒子は、例えば、フィーダー細胞培養、またはさまざまな分化の状態の混合培養において、異なる型の細胞を持つ不均一細胞系由来の細胞の細胞質に導入することができる。細胞は、細胞培養において無期限に維持することができる形質転換細胞系であり得る。例示的な細胞系は、腫瘍細胞系を含むＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なものである。
【0138】
任意の真核細胞をトランスフェクトして、特定の核酸、例えば、代謝遺伝子を発現する細胞（初代細胞および樹立された細胞系を含む）を生成することができる。好適な型の細胞としては、限定されるものではないが、幹細胞、全能性細胞、多能性細胞、胚性幹細胞、内部細胞塊細胞（ｉｎｎｅｒ ｍａｓｓ ｃｅｌｌ）、成体幹細胞、骨髄細胞、臍帯血由来の細胞、および外胚葉、中胚葉、または内胚葉に由来する細胞を含む、未分化細胞または部分的に分化した細胞が挙げられる。好適な分化細胞としては、体細胞、神経細胞、骨格筋、平滑筋、膵臓細胞、肝細胞、および心臓細胞が挙げられる。一部の形態では、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含む）または阻害性ＲＮＡを、ナノ粒子を使用して、細胞にトランスフェクトすることができる。
【0139】
方法は、個別化治療の分野において、例えば、欠陥遺伝子を修復する、細胞を脱分化する、または細胞を再プログラミングするためにも有用である。例えば、標的細胞は、最初に、当技術分野において公知の方法を使用してドナーから単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）への変化を引き起こすポリヌクレオチドを含むナノ粒子と接触させ、それを必要とする患者に投与される。供給源または細胞は、患者またはアログラフィック（ａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ）ドナーから直接採取された細胞を含む。一部の形態では、対象に投与される標的細胞は、自家である、例えば、対象に由来するか、または同系である。同種異系細胞は、抗原的に一致した、遺伝的に無関係なドナー（国の登録を通じて特定される）から、あるいは遺伝的に関連する同胞もしくは親から得られるか、またはそれらに由来する標的細胞を使用することによって、単離することもできる。
【0140】
細胞は、陽性および／または陰性選択技法によって選択することができる。例えば、特定の細胞表面タンパク質に結合する抗体は、所望の細胞型を回収するために利用される磁気ビーズおよび免疫原性手順にコンジュゲートされ得る。一過性トランスフェクションの前に標的細胞を富化することが望ましくあり得る。特定の標的細胞について富化された組成物の文脈において本明細書で使用される場合、「富化された」は、天然の細胞の起源において見出されるものよりも高い所望のエレメント（例えば、標的細胞）の割合を示す。細胞の組成物は、細胞の天然起源よりも、少なくとも１桁、好ましくは、２桁または３桁、より好ましくは、１０、１００、２００、または１０００桁富化され得る。標的細胞が単離されたら、それらを、当技術分野において公知の確立された方法に従って好適な培地中で成長させることによって繁殖させてもよい。樹立された細胞系もまた、方法のために有用であり得る。細胞は、必要により、トランスフェクション前に凍結保存することができる。
【0141】
次に、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組成物と接触させて、細胞を、修復、脱分化、再分化、および／または再プログラミングする。細胞をモニタリングすることができ、所望の細胞型を、治療的投与のために選択することができる。
【0142】
修復、脱分化、および／または再分化および／または再プログラミングの後、細胞は、それを必要とする患者に投与される。最も好ましい実施形態では、細胞は、同じ患者から単離され、同じ患者に戻して投与される。代替の実施形態では、細胞は、１人の患者から単離され、第２の患者に投与される。方法はまた、後の使用のために長期間保存することができる変更細胞の凍結ストックを生成するために使用することができる。一部の形態では、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは造血幹細胞は、患者から単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで修復、脱分化、または再プログラミングされて、患者のための治療用細胞を提供する。
【0143】
一部のｉｎ ｖｉｖｏアプローチでは、ナノ粒子は、治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つまたは複数の症状を処置、阻害、または軽減するのに十分な投薬量、またはそうでなければ、所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、およびもたらされる処置などの各種の要因に従って変わる。
【0144】
医薬組成物は、非経口的（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮的（受動的に、またはイオントフォレーシスもしくは電気穿孔を使用するかのいずれか）、もしくは経粘膜的（鼻、膣、直腸、または舌下）な投与の経路によるか、または生体内分解性挿入物を使用する投与のためのものであり得、それぞれの投与の経路に適した剤形に製剤化することができる。
【0145】
一部の形態では、ナノ粒子は、全身的に、例えば、静脈内または腹腔内投与によって、標的化された細胞への組成物の送達に有効な量で投与される。他の可能な経路としては、経皮または経口が挙げられる。
【0146】
ある特定の形態では、ナノ粒子は、局所的に、例えば、処置される部位への直接注射によって投与される。一部の形態では、組成物は、１つまたは複数の腫瘍に、注射されるか、またはそうでなければ直接投与される。典型的には、局所注射は、全身投与によって達成され得るものよりも高いナノ粒子の増加した局所濃度を引き起こす。一部の形態では、ナノ粒子は、カテーテルまたはシリンジを使用することによって、適切な細胞に局所的に送達される。そのようなナノ粒子を細胞に局所的に送達する他の手段としては、注入ポンプ（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．製）を使用すること、または組成物をポリマー性インプラントに組み込むこと（例えば、P. Johnson and J. G. Lloyd-Jones, eds., Drug Delivery Systems (Chichester, England: Ellis Horwood Ltd., 1987を参照されたい）が挙げられ、これは、インプラントのすぐ近くの領域へのナノ粒子の持続放出をもたらし得る。
【0147】
ナノ粒子は、それを細胞と接触させることによるなどで直接的に、または任意の生物学的プロセスの作用を通じてなどで間接的に、細胞に提供することができる。例えば、ナノ粒子は、生理学的に許容される担体またはビヒクルにおいて製剤化され、細胞を取り囲む組織または流体に注射することができる。ナノ粒子は、単純な拡散、エンドサイトーシス、または任意の能動的なまたは受動的な輸送機構によって、細胞膜を通過することができる。
【0148】
ナノ粒子は、遺伝子関連疾患または障害の処置のための遺伝子治療プロトコールにおいて使用することができる。細胞機能障害は、組成物および方法を使用して処置または低減することもできる。一部の形態では、遺伝子治療に適した疾患が、特異的に標的化される。疾患は、小児、例えば、１８歳未満、典型的には、１２歳未満の個体、または成人、例えば、１８歳またはそれより年長の個体であり得る。そのため、本開示の実施形態は、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子の疾患に冒された細胞へのトランスフェクションによって、疾患と診断された宿主を処置することを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードする。一部の形態では、阻害性ＲＮＡは、タンパク質の発現を低減または排除するために特定の細胞型または状態に方向付けられ、それによって、治療効果を達成する。本開示は、遺伝子の欠陥または異常によって引き起こされる疾患を処置するための遺伝子を、操作すること、増大させること、または置き換えることを包含する。
【0149】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに理解されるであろう。
【実施例】
【0150】
（実施例１）
標的化されたＰＡＣＥ ＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナノ粒子を標的細胞に有効に方向付ける
直鎖状ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ターポリマーは、ｍＲＮＡを含む核酸のための効率的な送達システムを形成することができる。ここで、ＰＡＣＥから形成されたナノ粒子の表面へのペプチドおよびタンパク質の付着のための２つの異なる方法を設計し、これらのナノ粒子の増強された標的化について評価した。これらの方法は、細胞または組織の他の構成要素へのこれらのナノ粒子の効率的で多用途の標的化を可能にする。
標的化されたＰＡＣＥ ＮＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナノ粒子を標的細胞に有効に方向付ける
直鎖状ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ターポリマーは、ｍＲＮＡを含む核酸のための効率的な送達システムを形成することができる。ここで、ＰＡＣＥから形成されたナノ粒子の表面へのペプチドおよびタンパク質の付着のための２つの異なる方法を設計し、これらのナノ粒子の増強された標的化について評価した。これらの方法は、細胞または組織の他の構成要素へのこれらのナノ粒子の効率的で多用途の標的化を可能にする。
【0151】
材料および方法
（ｉ）コンジュゲーション方法１
（ａ）ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドの合成
ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドを、リパーゼ系酵素触媒（ＣＡＬＢ）を使用して、ジフェニルエーテル中の１５－ペンタデカノリド、Ｎ－メチルジエタノールアミン、セバシン酸ジエチルおよびマレイミド－ＰＥＧ－ＯＨの共重合を介して合成した。第１段階（オリゴマー化）では、反応物および溶媒を、１ａｔｍのアルゴンガス下、９０℃で、２５０ｒｐｍで１８～２０時間撹拌した。第２段階（重合）では、反応を、真空下、さらに４８～７２時間継続した。次いで、得られた粗ポリマーを、ヘキサン中で３回洗浄し、クロロホルムに溶解し、濾過した。次いで、添加されたクロロホルムを、ロータリーエバポレーターを介して除去した。
（ｉ）コンジュゲーション方法１
（ａ）ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドの合成
ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドを、リパーゼ系酵素触媒（ＣＡＬＢ）を使用して、ジフェニルエーテル中の１５－ペンタデカノリド、Ｎ－メチルジエタノールアミン、セバシン酸ジエチルおよびマレイミド－ＰＥＧ－ＯＨの共重合を介して合成した。第１段階（オリゴマー化）では、反応物および溶媒を、１ａｔｍのアルゴンガス下、９０℃で、２５０ｒｐｍで１８～２０時間撹拌した。第２段階（重合）では、反応を、真空下、さらに４８～７２時間継続した。次いで、得られた粗ポリマーを、ヘキサン中で３回洗浄し、クロロホルムに溶解し、濾過した。次いで、添加されたクロロホルムを、ロータリーエバポレーターを介して除去した。
【0152】
（ｂ）一重エマルジョン蒸発によるＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子の製造
ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子を、標準的な一重エマルジョン蒸発手順に従って合成した。
ＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子を、標準的な一重エマルジョン蒸発手順に従って合成した。
【0153】
（ｃ）ナノ粒子上のＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬへのシステイン末端結合タンパク質のコンジュゲーション、および色素負荷ナノ粒子の細胞取り込み
ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰを、ＮＰの表面上のマレイミド基とタンパク質の単一の末端システインのチオール基との間のチオール反応を使用して、Ｃｙｓ末端タンパク質とコンジュゲートした、図２Ａ。反応を、１０：１のＮＰ：タンパク質重量比で、穏やかな混合（Ｏｒｂｉｔ Ｓｈａｋｅｒ、２５０ｒｐｍ）により、室温で１時間行った。過剰のタンパク質を、遠心分離（１５分、２５０００ｒｐｍ、１７℃）によって除去し、ＮＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに再分散させた。結合タンパク質－ＮＰを、液体窒素中で急速凍結し、使用まで－８０℃で保存した。
ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰを、ＮＰの表面上のマレイミド基とタンパク質の単一の末端システインのチオール基との間のチオール反応を使用して、Ｃｙｓ末端タンパク質とコンジュゲートした、図２Ａ。反応を、１０：１のＮＰ：タンパク質重量比で、穏やかな混合（Ｏｒｂｉｔ Ｓｈａｋｅｒ、２５０ｒｐｍ）により、室温で１時間行った。過剰のタンパク質を、遠心分離（１５分、２５０００ｒｐｍ、１７℃）によって除去し、ＮＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに再分散させた。結合タンパク質－ＮＰを、液体窒素中で急速凍結し、使用まで－８０℃で保存した。
【0154】
Ｗ１２８Ｘナンセンス嚢胞性線維症変異についてホモ接合性のヒト気管支上皮細胞を、上皮マーカーＥｐＣＡＭを標的化する抗体またはアイソタイプ対照抗体で官能化された色素（ＤｉＤ）負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子で処理した。細胞取り込みを、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡によって測定した。
【0155】
ヒト臍帯静脈内皮細胞も、標的化されたナノ粒子、標的化されていないナノ粒子、および対照ナノ粒子の取り込みを評価するために使用した。図３Ａ。
【0156】
（ｉｉ）コンジュゲーション方法２
（ａ）ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）（ＰＶＡ－ＶＳ）の合成
ＰＶＡ－ＶＳポリマーを、Raudszus, et al. (Raudszus, et al., Int. J. Pharm. 2018, 536(1), 211-221)に記載されるようにして調製した。過剰のジビニルスルホンを、水に対する２４時間の透析によって除去した（Ｓｌｉｄｅ－ＡＬｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット、１００００ ＭＣＷＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。得られたＰＶＡ－ＶＳを、凍結乾燥し、Ｄ２Ｏにおける１Ｈ ＮＭＲによって特徴付けた（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２ ４００ ＭＨｚ）。ＰＶＡ－ＶＳの合成のための概略図を、図４Ａに示す。
（ａ）ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）（ＰＶＡ－ＶＳ）の合成
ＰＶＡ－ＶＳポリマーを、Raudszus, et al. (Raudszus, et al., Int. J. Pharm. 2018, 536(1), 211-221)に記載されるようにして調製した。過剰のジビニルスルホンを、水に対する２４時間の透析によって除去した（Ｓｌｉｄｅ－ＡＬｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット、１００００ ＭＣＷＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。得られたＰＶＡ－ＶＳを、凍結乾燥し、Ｄ２Ｏにおける１Ｈ ＮＭＲによって特徴付けた（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２ ４００ ＭＨｚ）。ＰＶＡ－ＶＳの合成のための概略図を、図４Ａに示す。
【0157】
（ｂ）一重エマルジョン蒸発によるＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳの製造
ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ ＮＰを、エマルジョン蒸発法に従って調製した。ポリマーを、５０ｍｇ／ｍＬでＤＣＭに溶解し、０．５％の色素：ポリマー重量比で、脂溶性蛍光色素（ＤｉＤ）と混合した。次いで、この有機相を、ガラスパスツールピペットを用いて、激しいボルテックス下の５％（ｗ／ｗ）のＰＶＡ－ＶＳ溶液に滴下添加した（１：２の有機相：水相の体積比）。次いで、得られたエマルジョンを、撹拌下、０．３％（ｗ／ｗ）のＰＶＡ溶液のその体積の３倍を含有するビーカーに移した。１分後、有機溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。過剰のＰＶＡおよびＰＶＡ－ＶＳを、２回の遠心分離（１８０００ｇ、４５分、４℃）によって洗浄した。ペレットを、ＤＩ水に再分散させ、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。ＮＰのサイズおよびゼータ電位を、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｈｅ－Ｎｅレーザー６３３ｎｍ、１７３°、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって測定した。
ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ ＮＰを、エマルジョン蒸発法に従って調製した。ポリマーを、５０ｍｇ／ｍＬでＤＣＭに溶解し、０．５％の色素：ポリマー重量比で、脂溶性蛍光色素（ＤｉＤ）と混合した。次いで、この有機相を、ガラスパスツールピペットを用いて、激しいボルテックス下の５％（ｗ／ｗ）のＰＶＡ－ＶＳ溶液に滴下添加した（１：２の有機相：水相の体積比）。次いで、得られたエマルジョンを、撹拌下、０．３％（ｗ／ｗ）のＰＶＡ溶液のその体積の３倍を含有するビーカーに移した。１分後、有機溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。過剰のＰＶＡおよびＰＶＡ－ＶＳを、２回の遠心分離（１８０００ｇ、４５分、４℃）によって洗浄した。ペレットを、ＤＩ水に再分散させ、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。ＮＰのサイズおよびゼータ電位を、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｈｅ－Ｎｅレーザー６３３ｎｍ、１７３°、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって測定した。
【0158】
（ｃ）ＰＶＡ－ＶＳの使用によるＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳナノ粒子へのタンパク質の表面付着、および色素負荷ナノ粒子の細胞取り込み
第１段階では、ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ ＮＰを、ＮＰの表面上のビニルスルホン基とタンパク質の単一の末端システインのチオール基との間のチオール反応を使用して、Ｃｙｓ末端タンパク質とコンジュゲートした。反応を、１０：１のＮＰ：タンパク質重量比で、穏やかな混合（Ｏｒｂｉｔ Ｓｈａｋｅｒ、２５０ｒｐｍ）により、室温で１時間行った。過剰のタンパク質を、遠心分離（１５分、２５０００ｒｐｍ、１７℃）によって除去し、ＮＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに再分散させた。
第１段階では、ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳ ＮＰを、ＮＰの表面上のビニルスルホン基とタンパク質の単一の末端システインのチオール基との間のチオール反応を使用して、Ｃｙｓ末端タンパク質とコンジュゲートした。反応を、１０：１のＮＰ：タンパク質重量比で、穏やかな混合（Ｏｒｂｉｔ Ｓｈａｋｅｒ、２５０ｒｐｍ）により、室温で１時間行った。過剰のタンパク質を、遠心分離（１５分、２５０００ｒｐｍ、１７℃）によって除去し、ＮＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに再分散させた。
【0159】
ヒト臍帯静脈内皮細胞を、標的化されたナノ粒子、対照ナノ粒子、およびナノ粒子なしの取り込みを評価するために使用した。細胞核を、ＤＡＰＩで染色した。
【0160】
【0161】
（ｂ）一重エマルジョン蒸発によるＤｉＤ負荷ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬナノ粒子の製造
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの組成およびナノ粒子の性質を、表１に示す。
ＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーの組成およびナノ粒子の性質を、表１に示す。
【表1】
【0162】
（ｃ）ナノ粒子上のＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬへのシステイン末端結合タンパク質のコンジュゲーション、および色素負荷ナノ粒子の細胞取り込み
図２Ａは、多用途のマレイミド化学を活用する、ナノ粒子表面官能化のための概略図を示す。ＥｐＣＡＭ標的化ナノ粒子は、図２Ｂに示されるように、アイソタイプ対照と比較して、増強された取り込みを呈した。
図２Ａは、多用途のマレイミド化学を活用する、ナノ粒子表面官能化のための概略図を示す。ＥｐＣＡＭ標的化ナノ粒子は、図２Ｂに示されるように、アイソタイプ対照と比較して、増強された取り込みを呈した。
【0163】
図３Ｂに示されるように、標的化されたナノ粒子（ＣＤ３１官能化）を形成するためのＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬを介したタンパク質の化学的コンジュゲーションは、標的化されていないナノ粒子、および対照ナノ粒子（ＣＤ３１アイソタイプで官能化）と比較して、ＨＵＶＥＣにおける標的化された取り込みを増加させた。
【0164】
【0165】
（ｂ）一重エマルジョン蒸発によるＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳの製造
ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳポリマーの組成およびナノ粒子の性質を、表２に示す。
ＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳポリマーの組成およびナノ粒子の性質を、表２に示す。
【表2】
【0166】
（ｃ）ナノ粒子上のＰＡＣＥ－ＰＶＡ－ＶＳへのシステイン末端結合タンパク質のコンジュゲーション、および色素負荷ナノ粒子の細胞取り込み
図５Ｂおよび５Ｃに示されるように、ＰＶＡ－ＶＳを介したＰＡＣＥナノ粒子へのタンパク質の化学的コンジュゲーションは、対照ナノ粒子（ＣＤ３１アイソタイプで官能化）と比較して、ＨＵＶＥＣにおける標的化されたナノ粒子（ＣＤ３１で官能化）の取り込みを増加させた。
図５Ｂおよび５Ｃに示されるように、ＰＶＡ－ＶＳを介したＰＡＣＥナノ粒子へのタンパク質の化学的コンジュゲーションは、対照ナノ粒子（ＣＤ３１アイソタイプで官能化）と比較して、ＨＵＶＥＣにおける標的化されたナノ粒子（ＣＤ３１で官能化）の取り込みを増加させた。
【0167】
要約すると、結果は、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドを、細胞および組織へのナノ粒子の効率的な標的化を可能にするように、ＰＡＣＥナノ粒子に製剤化することができることを示す。さらに、界面活性剤、例えば、ポリ（ビニルアルコール－ビニルスルホン）を、粒子形成の間に、ＰＡＣＥナノ粒子表面に添加することができ、次いで、細胞および組織へのナノ粒子の効率的な標的化のために、標的化タンパク質にコンジュゲートするために使用することができる。
【0168】
（実施例２）
表面改変ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ取り込み
材料および方法
同意した健康なドナー由来の血液試料を、Ｙａｌｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで収集した。すべての収集は、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコール下で行った。参加者は、その登録について補償しなかった。
表面改変ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ取り込み
材料および方法
同意した健康なドナー由来の血液試料を、Ｙａｌｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで収集した。すべての収集は、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコール下で行った。参加者は、その登録について補償しなかった。
【0169】
実施例１に記載したように、ＮＰを、ＤｉＤ色素を封入しているＰＡＣＥ－ＰＥＧポリマーおよびＰＡＣＥ－ＰＥＧ－マレイミドポリマーの５０：５０ブレンドを使用して製剤化した。これらのＮＰを、最初に、ＮＰの表面上のマレイミド基とモノボディ（Ｍｂ）の単一の末端システインのチオール基との間のチオール反応により、Ｍｂアダプター（クローンＦＣＭ１０１）にコンジュゲートした。ＮＰおよびＭｂは、１０ＮＰ：１Ｍｂの重量比である。この反応を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間行った。過剰のＭｂを、遠心分離（１５分、１８，０００×ｇ、１７℃）によって除去した。
【0170】
ＮＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに再分散させ、次いで、ヒトＣＤ４に対する抗体（クローン９Ｈ５Ａ８）またはラットＣＤ４に対する抗体（クローンＷ３／２５）と、１８ＮＰ：１Ａｂの重量比で、穏やかに混合しながら、室温で１時間、カップリングさせた。過剰のＡｂを、遠心分離（１５分、１８，０００×ｇ、１７℃）で除去した。得られたＮＰを、急速凍結し、使用まで－８０℃で保存した。抗体の成功裏のコンジュゲーションを、細胞に基づく結合アッセイを使用して検証した。
【0171】
表面にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ４抗体を用いて製剤化された５０：５０のＰＡＣＥ－ＰＥＧ：ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬから構成される色素負荷ＮＰを、アイソタイプ対照ＮＰと、ヒト全血とともに、５分間、１２分間、３０分間、または１時間インキュベートした後、ＰＢＭＣを単離し、フローサイトメトリーによって、さまざまな細胞型におけるＮＰの取り込みを評価した。
【0172】
次いで、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ系ＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ標的化の可能性を、アイソタイプ対照またはラットＣＤ４標的化ＮＰのいずれかのデコイ事前投与を伴う野生型ラットにおいて評価した。ＮＰを、クロドロネートリポソーム投与の２４時間後に野生型ラットに投与した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２時間後の末梢血試料から単離し、フローサイトメトリーによって、ＮＰの取り込みについて分析した。
【0173】
結果
結果を、ＣＤ４標的化ＰＡＣＥ ＮＰが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血液およびｉｎ ｖｉｖｏでのラットにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞において、選択的に蓄積することを示す、図６Ａ～６Ｆに示す。
結果を、ＣＤ４標的化ＰＡＣＥ ＮＰが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血液およびｉｎ ｖｉｖｏでのラットにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞において、選択的に蓄積することを示す、図６Ａ～６Ｆに示す。
【0174】
図６Ａは、ＣＤ４＋で官能化されたＮＰ表面を形成するための、システインを介してＮＰ表面にコンジュゲートされたモノボディ、次いで、モノボディへの抗体の結合を使用して、ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬから形成されたナノ粒子の表面官能化を示す。
【0175】
次いで、ＮＰを、ＰＢＭＣに添加した。５、１２、３０および６０分での結合を、アイソタイプおよびＣＤ４について、図６Ｂに示し、表面官能化なしの対照ＮＰの結合を、アイソタイプおよびＣＤ４について、図６Ｃに示す。
【0176】
図６Ｄは、ラットを、－２４時間においてクロドロネートリポソームで処置し、次いで、アイソタイプまたはＣＤ４結合ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ－Ａｂ ＮＰのいずれかをラットの尾静脈に注射する、手順を示す。図６Ｅは、アイソタイプおよびＣＤ４についてのＰＢＭＣに結合したＣＤ４＋ＮＰのパーセンテージを示し、図６Ｆは、アイソタイプおよびＣＤ４についてのＣＤ４で表面が改変されていない対照ＮＰのパーセンテージを示す。
【0177】
結果は、ＣＤ４官能化ＰＡＣＥ－ＰＥＧ－ＭＡＬ ＮＰとの結合の官能化および有効性を実証する。
【0178】
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、慣用的なものに過ぎない実験を使用して、認識するか、またはそれを確かめることができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【国際調査報告】