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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】変異ミオシリン疾患モデル及びその使用
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0278 20240101AFI20241128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241128BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241128BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0278 ZNA
C12N15/12
C12N15/113 Z
C12N15/09 Z
C12N15/09 110
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534253
(86)(22)【出願日】2022-12-08
(85)【翻訳文提出日】2024-06-26
(86)【国際出願番号】 US2022081149
(87)【国際公開番号】W WO2023108047
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/287,281
(32)【優先日】2021-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】パテル， ガウラン
(72)【発明者】
【氏名】ハント， チャーリーン
(72)【発明者】
【氏名】タン， ヤジュン
(72)【発明者】
【氏名】ファン， チン
(72)【発明者】
【氏名】ゴン， グオチュン
(72)【発明者】
【氏名】フー， イン
(72)【発明者】
【氏名】ロマーノ， カーメロ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR90
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS40
4B063QX01
4B063QX02
4B063QX10
(57)【要約】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物、並びにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物を作製及び使用する方法が提供される。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞又は非ヒト動物は、ヒトミオシリンタンパク質又はキメラミオシリンタンパク質を発現し、その断片は、ヒトミオシリンに由来する。ヒトミオシリン標的化試薬及び緑内障を治療するための試薬のインビボ有効性を評価するために、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を使用するための方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物であって、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、任意選択的に、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の前記領域が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む、非ヒト動物。
【請求項2】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、緑内障に関連する変異を含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項3】
前記ヒトＭＹＯＣ配列が、前記変異を含む、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項4】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、Ｙ４３７Ｈ変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項5】
前記ヒトＭＹＯＣ配列が、前記Ｙ４３７Ｈ変異を含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
【請求項6】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、内因性ＭＹＯＣプロモーターを含み、前記ヒトＭＹＯＣ配列が、前記内因性ＭＹＯＣプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項7】
前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の少なくとも１つのイントロン及び少なくとも１つのエキソンが、削除され、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、請求項１～６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項8】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、ヒトＭＹＯＣ ３’非翻訳領域を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項9】
内因性ＭＹＯＣ５’非翻訳領域が、削除されておらず、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられていない、請求項１～８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項10】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、ヒトミオシリンタンパク質をコードする、請求項１～９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項11】
ヒトミオシリンタンパク質配列が、配列番号４に記載される配列を含み、任意選択的に、前記ヒトミオシリンタンパク質配列が、配列番号５に記載される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項12】
前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座のＭＹＯＣコード配列全体が削除され、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項13】
ＭＹＯＣ開始コドンからＭＹＯＣ終止コドンまでの前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が、削除され、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項14】
前記ＭＹＯＣ開始コドンから前記ＭＹＯＣ終止コドンまでの前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列及びヒトＭＹＯＣ ３’非翻訳領域を含むヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、前記ヒトＭＹＯＣ配列が、Ｙ４３７Ｈ変異を含み、
前記内因性ＭＹＯＣ ５’非翻訳領域が、削除されておらず、前記ヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられておらず、
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、内因性ＭＹＯＣプロモーターを含み、前記ヒトＭＹＯＣ配列が、前記内因性ＭＹＯＣプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項15】
（ｉ）前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座における前記ヒトＭＹＯＣ配列が、配列番号８７に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を含み、かつ／又は（ｉｉ）前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、配列番号４に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を含むミオシリンタンパク質をコードし、かつ／又は
（ｉｉｉ）前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、配列番号５に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を含むミオシリンコード配列を含み、かつ／又は
（ｉｖ）前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、配列番号８８若しくは８９に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一の配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項16】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が、選択カセット又はレポーター遺伝子を含まない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項17】
前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項18】
前記非ヒト動物が、その生殖系列に前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項19】
前記非ヒト動物が、哺乳動物である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項20】
前記非ヒト動物が、ラット又はマウスである、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項21】
前記非ヒト動物が、前記マウスである、請求項２０に記載の非ヒト動物。
【請求項22】
前記非ヒト動物が、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、
（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項23】
１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを更に含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とし、
任意選択的に、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットが、小柱網内にある、請求項２２に記載の非ヒト動物。
【請求項24】
前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる、１つ以上のアダプター結合要素を各々含む、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする第２のゲノムに組み込まれた発現カセットを更に含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、請求項２２又は２３に記載の非ヒト動物。
【請求項25】
第１の発現カセットが、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に組み込まれ、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインされたときにＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａに対応する変異を含む、Ｃａｓ９タンパク質であり、
キメラＣａｓタンパク質における１つ以上の転写活性化因子ドメインが、ＶＰ６４を含み、
前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントを含み、
前記キメラアダプタータンパク質における１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５及びＨＳＦ１を含み、
前記非ヒト動物が、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを更に含み、
前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットが、小柱網内にあり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合要素を含み、
前記２つのアダプター結合要素が、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内の第１のアダプター結合要素、及び前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内の第２のアダプター結合要素を含み、
前記標的配列が、転写開始部位の２００塩基対上流及び前記転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項26】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項27】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項28】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項29】
前記非ヒト動物が、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項30】
前記非ヒト動物が、野生型非ヒト動物又は対照非ヒト動物に対して上昇した眼圧を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項31】
前記非ヒト動物が、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧を有する、請求項３０に記載の非ヒト動物。
【請求項32】
前記非ヒト動物が、前記対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する、請求項３０又は３１に記載の非ヒト動物。
【請求項33】
ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物細胞であって、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、任意選択的に、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の前記領域が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む、非ヒト動物細胞。
【請求項34】
前記非ヒト動物細胞が、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、
（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、請求項３３に記載の非ヒト動物細胞。
【請求項35】
１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを更に含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、請求項３４に記載の非ヒト動物細胞。
【請求項36】
ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、任意選択的に、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の前記領域が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む、非ヒト動物ゲノム。
【請求項37】
前記非ヒト動物ゲノムが、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、
（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、請求項３６に記載の非ヒト動物ゲノム。
【請求項38】
ヒト化非ヒトＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む、核酸であって、内因性ＭＹＯＣ遺伝子の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、任意選択的に、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子の前記領域が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む、核酸。
【請求項39】
ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられており、前記標的化ベクターが、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座における５’標的配列を標的とする５’相同性アーム及び前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座における３’標的配列を標的とする３’相同性アームが隣接する、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列を含む挿入核酸を含み、任意選択的に、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の前記領域が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、前記対応するヒトＭＹＯＣ配列が、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む、標的化ベクター。
【請求項40】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価する方法であって、（ａ）請求項１～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性を評価することと、を含む、方法。
【請求項41】
前記非ヒト動物が、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、前記ゲノムに組み込まれた発現カセットが、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、
（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記方法が、ステップ（ａ）の前に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを更に含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３に記載される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項46】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、レンチウイルス媒介送達を介して投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、硝子体内注射又は前房内注射を介して前記非ヒト動物に投与される、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、ステップ（ａ）の少なくとも１週間前又はステップ（ａ）の約１週間～約１０週間前に前記非ヒト動物に投与される、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の眼における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性を評価することを含む、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
ステップ（ａ）が、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるＭＹＯＣメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
ステップ（ａ）が、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質の発現を測定することを含む、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
ステップ（ａ）が、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含む、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座内の挿入又は欠失の頻度を測定することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、ヒトＭＹＯＣ遺伝子の領域を標的とするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質、及び前記ヒトＭＹＯＣ遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
ステップ（ａ）が、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトＭＹＯＣ遺伝子を標的とするように設計され、任意選択的に、前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶを介して送達される、請求項４０～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、抗原結合タンパク質である、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬が、小分子である、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記非ヒト動物における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性を評価することが、眼圧を評価することを含む、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記評価することが、未処置対照非ヒト動物との比較で行われる、請求項４０～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
ステップ（ａ）が、前記候補緑内障治療剤を投与することを含み、ステップ（ｂ）が、眼圧を評価することを含む、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記候補緑内障治療剤が、房水形成の抑制剤である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記候補緑内障治療剤が、房水の流出を増加させる、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
前記候補緑内障治療剤が、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬である、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬が、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
インビボでのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を最適化する方法であって、（Ｉ）請求項４０～６９のいずれか一項に記載の方法を第１の非ヒト動物で１回目に実施することと、
（ＩＩ）可変要素を変更し、前記変更された可変要素を用いてステップ（Ｉ）の方法を第２の非ヒト動物で２回目に実施することと、
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性を、ステップ（ＩＩ）における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含む、方法。
【請求項71】
請求項１～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子修飾された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することであって、前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
【請求項72】
ステップ（ａ）の前に、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むように非ヒト動物ＥＳ細胞のゲノムを修飾することを更に含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
請求項１～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）前記内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含むように非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを修飾し、それによって、非ヒト動物の遺伝子修飾された胚を生成することと、
（ｂ）前記非ヒト動物の遺伝子修飾された胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
【請求項74】
前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含む前記Ｆ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸を含み、かつ１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を更に含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む非ヒト動物と交配させることを更に含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
請求項２２～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）そのゲノムに、（ｉ）内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座と、（ｉｉ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットと、を含む、遺伝子修飾された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入することと、
（ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及び前記ゲノムに組み込まれた発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
【請求項76】
ステップ（ａ）の前に、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及び前記ゲノムに組み込まれた発現カセットを含むように非ヒト動物ＥＳ細胞のゲノムを修飾することを更に含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
請求項２２～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）そのゲノムに、（ｉ）内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座と、（ｉｉ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットと、を含む、非ヒト動物１細胞期胚を提供することと、
（ｂ）前記非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及び前記ゲノムに組み込まれた発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
【請求項78】
前記非ヒト動物が、マウス又はラットである、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記非ヒト動物が、前記マウスである、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
非ヒト動物におけるＭＹＯＣ発現を増加させる方法であって、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、方法。
【請求項81】
非ヒト動物における眼圧を上昇させる方法であって、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、方法。
【請求項82】
非ヒト動物における緑内障をモデル化する方法であって、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、
前記１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、前記ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする、方法。
【請求項83】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記非ヒト動物が、マウスであり、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項87】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、レンチウイルス媒介送達を介して投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項89】
前記ガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の発現カセットが、硝子体内注射又は前房内注射を介して前記非ヒト動物に投与される、請求項８０～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記方法が、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらし、任意選択的に、前記方法が、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす、請求項８０～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記方法が、上昇した眼圧をもたらし、任意選択的に、前記方法が、前記対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する前記非ヒト動物をもたらす、請求項８０～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
前記方法が、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧をもたらす、請求項８０～９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価する方法であって、（ａ）請求項３３～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞に前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤を投与することと、
（ｂ）前記非ヒト動物細胞における前記ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は前記候補緑内障治療剤の前記活性を評価することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月８日に出願された米国特許出願第６３／２８７，２８１号の利益を主張する。
本出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１２月８日に出願された米国特許出願第６３／２８７，２８１号の利益を主張する。
【0002】
ＥＦＳ Ｗｅｂを介したテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５８８７１４ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌに記載された配列表は、３０２キロバイトであり、２０２２年１２月１日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
ファイル５８８７１４ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌに記載された配列表は、３０２キロバイトであり、２０２２年１２月１日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ミオシリン（myocilin、ＭＹＯＣ）における変異は、常染色体優性家族性若年性開放隅角緑内障の症例の８～１０％、並びに原発性開放隅角緑内障（primary open-angle glaucoma、ＰＯＡＧ）の症例の２～３％を占める、緑内障の最も一般的な遺伝的原因に関与している。ＭＹＯＣ毒性機能獲得型変異タンパク質は、細胞内で凝集し、小柱網（trabecular meshwork、ＴＭ）応力、眼圧（intraocular pressure、ＩＯＰ）の上昇、及び緑内障につながる。より良好な動物モデルが、ＭＹＯＣによって引き起こされる緑内障表現型を再現するために必要とされる。
【発明の概要】
【0004】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノム、並びにそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムを作製及び使用する方法が提供される。また、ヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子、ヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子を含む核酸、非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子をヒト化する際に使用するための標的化ベクター、及びそのようなヒト化ＭＹＯＣ遺伝子を作製及び使用する方法も提供される。
【0005】
一態様では、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムが提供される。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、対応するヒトＭＹＯＣ配列は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む。
【0006】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、緑内障に関連する変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＭＹＯＣ配列は、変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、Ｙ４３７Ｈ変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＭＹＯＣ配列は、Ｙ４３７Ｈ変異を含む。
【0007】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、内因性ＭＹＯＣプロモーターを含み、ヒトＭＹＯＣ配列は、内因性ＭＹＯＣプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の少なくとも１つのイントロン及び少なくとも１つのエキソンは、削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、ヒトＭＹＯＣ ３’非翻訳領域を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、内因性ＭＹＯＣ ５’非翻訳領域が削除されておらず、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられていない。
【0008】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、ヒトミオシリンタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒトミオシリンタンパク質配列は、配列番号４に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトミオシリンタンパク質配列は、配列番号５に記載される配列を含むコード配列によってコードされる。
【0009】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座のＭＹＯＣコード配列全体が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ＭＹＯＣ開始コドンからＭＹＯＣ終止コドンまでの内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が、削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置換されている。
【0010】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ＭＹＯＣ開始コドンからＭＹＯＣ終止コドンまでの内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が、削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列及びヒトＭＹＯＣ ３’非翻訳領域を含むヒトＭＹＯＣ配列で置換されており、ヒトＭＹＯＣ配列は、Ｙ４３７Ｈ変異を含み、内因性ＭＹＯＣ ５’非翻訳領域は、削除されておらず、ヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられておらず、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、内因性ＭＹＯＣプロモーターを含み、ヒトＭＹＯＣ配列は、内因性ＭＹＯＣプロモーターに作動可能に連結されている。
【0011】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座におけるヒトＭＹＯＣ配列は、配列番号８７に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号４に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含むミオシリンタンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号５に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含むミオシリンコード配列を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号８８又は８９に記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。
【0012】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、選択カセット又はレポーター遺伝子を含まない。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座についてヘテロ接合性である。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含む。
【0013】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、哺乳動物である。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、ラット又はマウスである。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、マウスである。
【0014】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムは、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats、ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを更に含み、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。任意選択的に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、小柱網内にある。
【0015】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を各々含む、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする第２のゲノムに組み込まれた発現カセットを更に含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。
【0016】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、第１の発現カセットは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に組み込まれ、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインされたときにＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａに対応する変異を含むＣａｓ９タンパク質であり、キメラＣａｓタンパク質中の１つ以上の転写活性化因子ドメインは、ＶＰ６４を含み、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントを含み、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５及びＨＳＦ１を含み、非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを更に含み、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、小柱網内にあり、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合要素を含み、２つのアダプター結合要素は、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内の第１のアダプター結合要素、及び１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内の第２のアダプター結合要素を含み、標的配列は、転写開始部位の２００塩基対上流及び転写開始部位の１塩基対下流の領域内にある。
【0017】
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。
【0018】
いくつかのそのような非ヒト動物又は非ヒト動物細胞は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に対して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。いくつかのそのような非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。いくつかのそのような非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リング又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。いくつかのそのような非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リングにおいて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。いくつかのそのような非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、小柱網において少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。
【0019】
いくつかのそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、野生型非ヒト動物又は対照非ヒト動物に対して上昇した眼圧を有する。任意選択的に、非ヒト動物は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧を有する。任意選択的に、非ヒト動物は、対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する。
【0020】
別の態様では、内因性ＭＹＯＣ遺伝子の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子（すなわち、上記に記載されるヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子座）を含む、核酸が提供される。任意選択的に、内因性ＭＹＯＣ遺伝子の領域は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、対応するヒトＭＹＯＣ配列は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む。
【0021】
別の態様では、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座（すなわち、上記に記載されるヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座）を生成するための標的化ベクターが提供され、標的化ベクターは、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座における５’標的配列を標的とする５’相同性アーム及び内因性ＭＹＯＣ遺伝子座における３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する、対応するヒトＭＹＯＣ配列を含む挿入核酸を含む。任意選択的に、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含み、対応するヒトＭＹＯＣ配列は、ＭＹＯＣエキソン配列及びＭＹＯＣイントロン配列の両方を含む。
【0022】
別の態様では、上記に記載される非ヒト動物及び非ヒト動物細胞におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記の非ヒト動物のうちのいずれかにヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与することと、（ｂ）非ヒト動物におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価することと、を含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）上記の非ヒト動物細胞のうちのいずれかにヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与することと、（ｂ）非ヒト動物細胞におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価することと、を含む。
【0023】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、ゲノムに組み込まれた発現カセットをそのゲノムに更に含み、ゲノムに組み込まれた発現カセットは、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む。いくつかのそのような方法は、ステップ（ａ）の前に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを更に含み、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。
【0024】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。
【0025】
いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、レンチウイルス媒介送達を介して投与される。
【0026】
いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、硝子体内注射又は前房内注射を介して非ヒト動物に投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、ステップ（ａ）の少なくとも１週間前又はステップ（ａ）の約１週間～約１０週間前に非ヒト動物に投与される。
【0027】
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の眼におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価することを含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ａ）は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるＭＹＯＣメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ａ）は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質の発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ａ）は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座内の挿入又は欠失の頻度を測定することを含む。
【0028】
いくつかのそのような方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子の領域を標的とするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質及びヒトＭＹＯＣ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
【0029】
いくつかのそのような方法では、ステップ（ａ）は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬を投与することを含み、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、外因性ドナー核酸を含み、外因性ドナー核酸は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子を標的とするように設計され、任意選択的に、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達される。
【0030】
いくつかのそのような方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかのそのような方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、抗原結合タンパク質である。いくつかのそのような方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、小分子である。
【0031】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価することは、眼圧を評価することを含む。
【0032】
いくつかのそのような方法では、評価は、未処置対照非ヒト動物との比較で行われる。
【0033】
いくつかのそのような方法では、ステップ（ａ）は、候補緑内障治療剤を投与することを含み、ステップ（ｂ）は、眼圧を評価することを含む。いくつかのそのような方法では、候補緑内障治療剤は、房水形成の抑制剤である。いくつかのそのような方法では、候補緑内障治療剤は、房水の流出を増加させる。
【0034】
いくつかのそのような方法では、候補緑内障治療剤は、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬である。いくつかのそのような方法では、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0035】
別の態様では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を最適化する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、非ヒト動物及び非ヒト動物細胞におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価する上記の方法のうちのいずれかを、第１の非ヒト動物又は第１の非ヒト動物細胞で１回目に実施することと、（ＩＩ）可変要素を変更し、変更された可変要素を用いてステップ（Ｉ）の方法を第２の非ヒト動物又は第２の非ヒト動物細胞で２回目に実施することと、（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を、ステップ（ＩＩ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含む。
【0036】
別の態様では、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含む上記の非ヒト動物のうちのいずれかを作製する方法が提供される。
【0037】
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子修飾された非ヒト動物胚性幹（embryonic stem、ＥＳ）細胞を導入することであって、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、導入することと、（ｂ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。いくつかのそのような方法は、ステップ（ａ）の前に、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むように非ヒト動物ＥＳ細胞のゲノムを修飾することを更に含む。
【0038】
いくつかのそのような方法は、（ａ）内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座をそのゲノムに含むように非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを修飾し、それによって、非ヒト動物の遺伝子修飾された胚を生成することと、（ｂ）非ヒト動物の遺伝子修飾された胚を代理母において妊娠させることであって、代理母が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。
【0039】
いくつかのそのような方法は、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸を含み、かつ１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を更に含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む非ヒト動物と交配させることを含む。
【0040】
別の態様では、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットを含む上記の非ヒト動物のうちのいずれかを作製する方法であって、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、方法が提供される。
【0041】
いくつかのそのような方法は、（ａ）そのゲノムに、（ｉ）内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座と、（ｉｉ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットと、を含む、遺伝子修飾された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｂ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。いくつかのそのような方法は、ステップ（ａ）の前に、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットを含むように非ヒト動物ＥＳ細胞のゲノムを修飾することを更に含む。
【0042】
いくつかのそのような方法は、（ａ）そのゲノムに、（ｉ）内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の領域が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられている、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座と、（ｉｉ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットと、を含む、非ヒト動物１細胞期胚を提供することと、（ｂ）非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させることであって、代理母が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットを含むＦ０子孫の遺伝子修飾された非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。
【0043】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウス又はラットである。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスである。
【0044】
別の態様では、非ヒト動物におけるＭＹＯＣ発現を増加させる方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の非ヒト動物のうちのいずれか（ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットであって、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む）に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。
【0045】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。
【0046】
いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、レンチウイルス媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、硝子体内注射又は前房内注射を介して非ヒト動物に投与される。
【0047】
いくつかのそのような方法では、本方法は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リング又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リング又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リングにおけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リングにおいて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、小柱網において少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。
【0048】
いくつかのそのような方法では、本方法は、上昇した眼圧をもたらす。任意選択的に、本方法は、対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する非ヒト動物をもたらす。任意選択的に、本方法は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧をもたらす。
【0049】
別の態様では、非ヒト動物における眼圧を上昇させる方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の非ヒト動物のうちのいずれか（ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットであって、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む）に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。
【0050】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。
【0051】
いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、レンチウイルス媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、硝子体内注射又は前房内注射を介して非ヒト動物に投与される。
【0052】
いくつかのそのような方法では、本方法は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リング又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リング又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リングにおけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リングにおいて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、小柱網において少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。
【0053】
いくつかのそのような方法では、本方法は、上昇した眼圧をもたらす。任意選択的に、本方法は、対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する非ヒト動物をもたらす。任意選択的に、本方法は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧をもたらす。
【0054】
別の態様では、非ヒト動物におけるモデル化緑内障を増加させる方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の非ヒト動物のうちのいずれか（ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座及びゲノムに組み込まれた発現カセットであって、（ａ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含む、キメラのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸と、を含む、ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む）に、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを投与することを含み、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、それを標的遺伝子内の標的配列に誘導することが可能であり、１つ以上のＲＮＡのうちの少なくとも１つは、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする。
【0055】
いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４から選択される１つ以上のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、非ヒト動物は、マウスであり、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。
【0056】
いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、アデノウイルス媒介送達、レンチウイルス媒介送達、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、レンチウイルス媒介送達を介して投与される。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットは、硝子体内注射又は前房内注射を介して非ヒト動物に投与される。
【0057】
いくつかのそのような方法では、本方法は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、眼、輪部リング、網膜、毛様体、又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リング又は小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リング又は小柱網において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、輪部リングにおけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、輪部リングにおいて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。いくつかのそのような方法では、本方法は、小柱網におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加をもたらす。任意選択的に、本方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現カセットを含まない対照非ヒト動物に対して、小柱網において少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍増加したＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現をもたらす。
【0058】
いくつかのそのような方法では、本方法は、上昇した眼圧をもたらす。任意選択的に、本方法は、対照非ヒト動物の眼圧よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ高い眼圧を有する非ヒト動物をもたらす。任意選択的に、本方法は、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇの眼圧をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】野生型マウスＭｙｏｃ遺伝子座、野生型ヒトＭＹＯＣ遺伝子座、Ｙ４３７Ｈ変異を含み、自己欠失ネオマイシン（self-deleting neomycin、ＳＤＣ－Ｎｅｏ）選択カセット（ＭＡＩＤ ８５３３）を有するヒト化マウスＭＹＯＣ遺伝子座の標的対立遺伝子、及びＹ４３７Ｈ変異を含み、ＳＤＣ－Ｎｅｏ選択カセット（ＭＡＩＤ ８５３４）の除去からのｌｏｘＰ瘢痕を有するヒト化マウスＭＹＯＣ遺伝子座の標的対立遺伝子の概略図（正確な縮尺ではない）を示す。
【図2】対立遺伝子喪失アッセイ（７５７８ｍＴＵ及び７５７８ｍＴＤ）、対立遺伝子獲得アッセイ（７５７８ｈＴＵ、７５７８ｈＴＤ、Ｃｒｅ９０３、及びＨｙｇ）、並びに対立遺伝子識別アッセイ（８５３３ｈＡＳ２．ＷＴ及び８５３３ｈＡＳ２．Ｍｕｔ）を含む、ヒト化マウスＭＹＯＣ遺伝子座のスクリーニングのための方略の概略図（正確な縮尺ではない）を示す。
【図3】ヒト及びマウスミオシリンタンパク質のアラインメントを示す。
【図4A】５’から３’まで、３’スプライシング配列、第１のｌｏｘＰ部位、ネオマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナル、第２のｌｏｘＰ部位、ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４コード配列（ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４）、Ｔ２Ａペプチドコード配列、ＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１コード配列、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）を含む、ｌｏｘ－ｓｔｏｐ－ｌｏｘ（ＬＳＬ）ｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（synergistic activation mediator、ＳＡＭ）対立遺伝子（ＬＳＬ－ＳＡＭ対立遺伝子）を示す（正確な縮尺ではない）。
【図6】テトラループ及びステムループ２が、転写活性化ドメインに融合したキメラＭＳ２コートタンパク質（MS2 coat protein、ＭＣＰ）の動員を促進するためにＭＳ２結合アプタマーで置き換えられている、一般的なシングルガイドＲＮＡ（配列番号６８）の概略図を示す。
【図7】小柱網（ＴＭ）、毛様体（ciliary body、ＣＢ）、及び角膜内皮（corneal endothelium、ＣＥ）におけるＡｄ５、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ、及びレンチウイルス発現を示す。長方形のボックスは、ＴＭを示す。
【図8】マウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡ標的配列の位置を示す。
【図9】眼の解剖概略図を示す。
【図10A】対照ガイドＲＮＡに対する、マウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡの投与後の輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ）、図１０Ａ）、網膜（図１０Ｂ）、及び角膜（図１０Ｃ）におけるｑＰＣＲによって測定されるＧａｐｄｈ発現に対するマウスＭｙｏｃ発現を示す。
【図10B】対照ガイドＲＮＡに対する、マウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡの投与後の輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ）、図１０Ａ）、網膜（図１０Ｂ）、及び角膜（図１０Ｃ）におけるｑＰＣＲによって測定されるＧａｐｄｈ発現に対するマウスＭｙｏｃ発現を示す。
【図10C】対照ガイドＲＮＡに対する、マウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡの投与後の輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ）、図１０Ａ）、網膜（図１０Ｂ）、及び角膜（図１０Ｃ）におけるｑＰＣＲによって測定されるＧａｐｄｈ発現に対するマウスＭｙｏｃ発現を示す。
【図11】ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ５、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ＬａｃＺ対照で処置されたか、又は何も処置されていない（ナイーブ）、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示す。
【図12】ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたか、又は何も処置されていない（ナイーブ）、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、チモロール又はＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）のいずれかで処置された。
【図13】ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてヘテロ接合性又はホモ接合性のいずれかであるＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウスにおけるマウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡ ｇ４及びｇ５又はＳＡＭ ＬａｃＺ対照ｇＲＮＡの投与後にｑＰＣＲによって測定されるＧａｐｄｈ発現に対するヒトＭＹＯＣ発現を示す。
【図14】ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてヘテロ接合性又はホモ接合性のいずれかであるＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウスにおけるマウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡ ｇ４及びｇ５又はＳＡＭ ＬａｃＺ対照ｇＲＮＡの投与後にＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）によって測定されるヒトＭＹＯＣ発現を示す。
【図15A】ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４及びＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４の混合物で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）に対するヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１の効果を試験するための実験設定を示す。
【図15B】ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたか、又は何も処置されていない（ナイーブ）、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ又は対照ルシフェラーゼｓｉＲＮＡのいずれかで処置された。
【図16A】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）に対するヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、＃４、及び＃５の効果を試験するための実験設定を示す。
【図16B】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、＃４、又は＃５で処置された。
【図16C】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、＃４、又は＃５で処置された。
【図16D-1】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）由来の眼におけるヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２又は＃３で処置された。
【図16D-2】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）由来の眼におけるヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２又は＃３で処置された。
【図17A】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）に対するヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２及び＃３の効果を試験するための実験設定を示す。
【図17B】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２又は＃３で処置された。
【図17C】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２又は＃３で処置された。
【図18A】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示す。
【図18B】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するＡｎｇｐｔｌ７ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示す。
【図18C】ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたか、何も処置されていない（ナイーブ）、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示す。
【図18D】ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたか、何も処置されていない（ナイーブ）、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＡｎｇｐｔｌ７ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示す。
【図19A】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、１５μｇのＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１又は＃２で処置された。
【図19B】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、１５μｇのＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１又は＃２で処置された。
【図19C】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４又はＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するヒトＡｎｇｐｔｌ７ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、１５μｇのＡｎｇｐｔ７ ｓｉＲＮＡ＃１又は＃２で処置された。
【図20A】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）に対するＡｎｇｐｔｌ７ｓｉＲＮＡ＃１及び＃２の効果を試験するための実験設定を示す。
【図20B】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、７．５μｇのＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１若しくは＃２又はＰＢＳで処置された。
【図20C】ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子についてホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対するＡｎｇｐｔｌ７及びヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを示す、ｑＰＣＲ結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスは、その後、７．５μｇのＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１若しくは＃２又はＰＢＳで処置された。
【発明を実施するための形態】
【0060】
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化及び非コード化アミノ酸並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能又は構造を有するタンパク質又はポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化及び非コード化アミノ酸並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能又は構造を有するタンパク質又はポリペプチドの任意の部分を指す。
【0061】
タンパク質は「Ｎ末端」（アミノ末端）及び「Ｃ末端」（カルボキシ末端又はカルボキシル末端）を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に有する、タンパク質又はポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質又はポリペプチド）の末端部に関する。
【0062】
本明細書で互換的に使用される、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの類似体若しくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
【0063】
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’及び３’末端を有するとも言われ得る。線状又は環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」又は「下流」の５’若しくは３’要素であると称される。
【0064】
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルが使用され得る。
【0065】
「発現ベクター（expression vector）」又は「発現コンストラクト（expression construct）」又は「発現カセット（expression cassette）」という用語は、特定の宿主細胞又は生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含む組換え核酸を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列としては、通常、プロモーター、オペレータ（任意選択の）、及びリボソーム結合部位、並びに他の配列が挙げられる。真核細胞は、一般に、プロモーター、エンハンサー、並びに終結及びポリアデニル化シグナルを利用することが周知であり、必要な発現を犠牲にすることなく、いくつかの要素を削除し得、他の要素を追加し得る。
【0066】
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、又は任意の他の組換え手段によって、細胞のゲノム中の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。
【0067】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、又はそれを許容する要素を含む、組換え核酸を指す。ベクター及び／又は粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が知られている。
【0068】
細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、又は他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸を含み、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、並びにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有していない、化学的に合成されており、したがって、他の細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸が実質的に混入していないか、又はそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、又は細胞若しくは細胞外成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分又は生物成分）から分離若しくは精製されている、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸も含む。
【0069】
「野生型」という用語は、（変異体、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態又は状況で見出される構造及び／又は活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【0070】
「内因性配列」という用語は、ラット細胞又はラット内で天然に存在する核酸配列を指す。例えば、マウスの内因性Ｍｙｏｃ配列は、マウスにおけるＭｙｏｃ遺伝子座で天然に存在する天然のＭｙｏｃ配列を指す。
【0071】
「外因性」分子又は配列には、その形態で細胞に通常は存在しない分子又は配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子又は配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、又は細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子又は配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子又は配列を含む。
【0072】
核酸又はタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメント又はタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸又はタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、又は別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、又はタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、又はそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸又はタンパク質は、異種標識又は異種分泌又は局在化配列を含むことができる。
【0073】
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、ミオシリンタンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞又は真核細胞においてより高い使用頻度を有する代替コドンへと修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に利用可能である。これらの表は、様々な方法で適用することができる。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）もまた利用可能である。
【0074】
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（又は重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、又は生物のゲノムの染色体上の位置（position）の特定の位置（location）を指す。例えば、「ＭＹＯＣ遺伝子座」は、ＭＹＯＣ遺伝子の特定の位置、ＭＹＯＣ ＤＮＡ配列、ミオシリンコード配列、又はそのような配列が存在する場所に関して同定されている生物のゲノムの染色体上のＭＹＯＣ位置を指すことができる。「ＭＹＯＣ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び／若しくは３’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）、又はそれらの組み合わせを含む、ＭＹＯＣ遺伝子の調節要素を含み得る。
【0075】
「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と、少なくとも１つの非コーディング領域と、を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物及び／又はポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’及び３’非翻訳配列を含む）に対応するように、非コードイントロンで中断されたコード領域及び５’端と３’端との両方のコード領域に隣接して位置する配列を含むことができる。追加的に、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、及びマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、又は離れていてもよく、それらは遺伝子の転写及び翻訳のレベル又は速度に影響を及ぼす。
【0076】
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、又は遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。
【0077】
遺伝子の「コード領域」又は「コード配列」は、タンパク質をコードする、エキソンで構成される遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡの部分からなる。この領域は、５’末端の開始コドンで始まり、３’末端の終止コドンで終わる。
【0078】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。場合によっては、プロモーターは、追加的に、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域を含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型のうちの１つ以上（例えば、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、又はそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、又は空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的又は組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号において見出すことができる。
【0079】
「作動可能な連結」又は「作動可能に連結される」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分のうちの少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在又は非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が互いに近接していること、又はトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
【0080】
本明細書で提供される方法及び組成物は、様々な異なる成分を使用する。記載全体の一部の成分は、活性バリアント及び断片を有し得る。「機能性」という用語は、生物学的活性又は機能を示すタンパク質又は核酸（又はその断片、若しくはバリアント）の生来の能力を指す。機能的断片又はバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであり得るか、又は実際に変更され得る（例えば、それらの特異性又は選択性又は有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。
【0081】
「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、又は集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
【0082】
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、完全長タンパク質よりも短いか、又は少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、完全長核酸よりも短いか、又は少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。タンパク質断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、又は内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端及びＣ末端の各々の一部の除去）であり得る。核酸断片は、例えば、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、又は内部断片（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端の各々の一部の除去）であり得る。
【0083】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
【0084】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。
【0085】
特に明記しない限り、配列同一性／類似性値は、以下のパラメータを使用してＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む：ＧＡＰ重み５０及び長さ重み３、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列についての同一性％及び類似性％；ＧＡＰ重み８及び長さ重み２、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列についての同一性％及び類似性％；又はその任意の同等のプログラム。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【0086】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、又は極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、又はロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、又はグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。追加的に、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、若しくはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、若しくはリジンへの、及び／又は極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。
【0087】
【表1】
【0088】
「相同」配列（例えば、核酸配列）としては、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、又は実質的に同様である配列が挙げられる。相同配列は、例えば、オルソログ配列及びパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）又は遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
【0089】
「インビトロ」という用語は、人工環境、及び人工環境（例えば、試験管又は単離された細胞若しくは細胞株）内で生じるプロセス又は反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、生物若しくは身体、又は生物若しくは身体内の細胞若しくは組織）、及び天然環境内で生じるプロセス又は反応を指す。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、及びそのような細胞内で起こるプロセス又は反応を含む。
【0090】
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含むコンストラクトがプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（又は含むようにすることができる）細胞に導入される場合、容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【0091】
本明細書で使用される場合、「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、ここで、蛍光は、レポータータンパク質から直接、蛍光発生基質に対するレポータータンパク質の活性、又は蛍光タグ付き化合物への結合について親和性を有するタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、及びＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、及びＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、及びＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、及びＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ）、並びにフローサイトメトリー法によって細胞内の存在を検出することができる他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
【0092】
二本鎖切断（double-strand break、ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（homologous recombination、ＨＲ）及び非相同末端結合（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）を介して生じる。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２（８）：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
【0093】
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意の機構によって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（homology directed repair、ＨＤＲ）又は相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲ又はＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／若しくはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、並びに／又は関連するプロセスを伴うことができる。いくつかの場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。
【0094】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端の互いへ又は外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、又は転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能ではない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、及び相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入のために好ましくあり得る。加えて、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、又は切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’又は３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０２０７２２号、国際公開第２０１４／０３３６４４号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、及びＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的及び／又はドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。
【0095】
１つ以上の列挙された要素を「含む（comprising）」又は「含む（including）」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（comprises）」又は「含む（includes）」組成物は、タンパク質を単独で、又は他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、及び特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「本質的に～からなる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
【0096】
「任意選択の」又は「任意選択的に」は、それに続いて記載された事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことであって、その記載が、当該事象又は状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
【0097】
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を定義する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
【0098】
文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は、記載された値の±５％である値を包含する。
【0099】
「及び／又は」という用語は、関連する列挙される項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、並びに代替物（「又は」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
【0100】
「又は」という用語は、特定のリストのいずれか１つのメンバーを指す。
【0101】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」又は「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。
【0102】
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）
（発明を実施するための形態）
【0103】
Ｉ．概要
本明細書では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物、並びにそのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物を作製及び使用する方法が開示される。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、Ｙ４３７Ｈ変異などの緑内障に関連する変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター系成分を更に含む。例えば、本明細書では、クラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物、並びにそのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物を使用する方法が開示される。Ｙ４３７Ｈ変異を含むＭＹＯＣ遺伝子座は、Ｙ４３７Ｈ変異を含むか、又はコードされたミオシリンタンパク質がヒトミオシリンと最適にアラインされた（最大数の完璧に一致した残基）ときにヒトミオシリンにおけるＹ４３７Ｈ変異に対応する変異を含む、ミオシリンタンパク質をコードするＭＹＯＣ遺伝子座を指す。Ｙ４３７Ｈ変異のアミノ酸位置の命名法は、シグナルペプチドを含む完全ミオシリンタンパク質における変異の位置を指す。この命名法は、この変異を記載する刊行物で使用される命名法と一致する。
本明細書では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物、並びにそのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物を作製及び使用する方法が開示される。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、Ｙ４３７Ｈ変異などの緑内障に関連する変異を含む。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター系成分を更に含む。例えば、本明細書では、クラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物、並びにそのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物を使用する方法が開示される。Ｙ４３７Ｈ変異を含むＭＹＯＣ遺伝子座は、Ｙ４３７Ｈ変異を含むか、又はコードされたミオシリンタンパク質がヒトミオシリンと最適にアラインされた（最大数の完璧に一致した残基）ときにヒトミオシリンにおけるＹ４３７Ｈ変異に対応する変異を含む、ミオシリンタンパク質をコードするＭＹＯＣ遺伝子座を指す。Ｙ４３７Ｈ変異のアミノ酸位置の命名法は、シグナルペプチドを含む完全ミオシリンタンパク質における変異の位置を指す。この命名法は、この変異を記載する刊行物で使用される命名法と一致する。
【0104】
また、本明細書では、ヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子、ヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子を含む核酸、及び非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子をヒト化する際に使用するための標的化ベクターも開示される。
【0105】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞又は非ヒト動物は、ヒトミオシリンタンパク質、又はヒトミオシリンタンパク質の１つ以上の断片を含むキメラミオシリンタンパク質を発現する。そのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボでヒトミオシリン標的化剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集剤、ＲＮＡｉ剤、又はＡＳＯ剤）の送達又は有効性を評価するために使用することができ、かつインビトロ、エクスビボ、又はインビボでのそのような薬剤の有効性の送達を最適化する方法で使用することができる。ＳＡＭ発現カセットが存在する場合、それらは、例えば、より高いミオシリン発現レベルを達成するために、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子などの標的遺伝子の転写を上方制御するために使用することができる。そのようなモデルは、例えば、緑内障に対する候補治療試薬の送達若しくは有効性を評価するために、又は候補緑内障治療剤若しくは眼圧（ＩＯＰ）を低減するための試薬の送達若しくは有効性を評価するために使用することができる。
【0106】
本明細書に開示される非ヒト動物細胞及び非ヒト動物のうちのいくつかでは、ヒトＭＹＯＣゲノムＤＮＡのうちのいくつか若しくは大部分又は全ては、対応する非ヒト動物ヒトＭＹＯＣ遺伝子座に挿入される。本明細書に開示される非ヒト動物細胞及び非ヒト動物のうちのいくつかでは、非ヒト動物ゲノムＤＮＡのうちのいくつか若しくは大部分又は全ては、対応するヒトゲノムＤＮＡと１対１で置き換えられる。保存された調節要素は無傷のままである可能性が高く、ＲＮＡプロセシングを受けるスプライシング転写物はｃＤＮＡよりも安定しているため、ｃＤＮＡが挿入された非ヒト動物と比較して、イントロン－エキソン構造とスプライシング機構が維持されている場合、発現レベルは高くなるはずである。非ヒト動物ゲノム配列を対応するヒトゲノム配列で置き換えることは、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座からの導入遺伝子の忠実な発現をもたらす可能性が高い。同様に、内因性非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子座ではなくランダムなゲノム遺伝子座にヒトＭＹＯＣコード配列のトランスジェニック挿入を有するトランスジェニック非ヒト動物は、ＭＹＯＣ発現の内因性調節をそれほど正確には反映しない。非ヒト動物ゲノムＤＮＡの大部分又は全てを１対１で対応するヒトゲノムＤＮＡで置き換えること、又は対応する非ヒトＭＹＯＣ遺伝子座にヒトＭＹＯＣゲノム配列を挿入することから生じるヒト化ＭＹＯＣ対立遺伝子は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬（例えば、ヒトＭＹＯＣを標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬、ＲＮＡｉ試薬、又はＡＳＯ試薬）の真のヒト標的又は真のヒト標的の近似値を提供し、それによって、生きている動物におけるそのような薬剤の有効性及び作用機序の試験、並びにヒト化タンパク質及びヒト化遺伝子が存在するＭＹＯＣの唯一のバージョンである設定における薬物動態学及び薬力学研究を可能にする。
【0107】
本明細書に開示される方法及び組成物は、任意選択的に、成分が、構成的に利用可能であるか、又は例えば、組織特異的若しくは時間特異的様式で利用可能であり得るように、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、又は相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質配列）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物を採用することができる。カセットは、ゲノムに組み込むことができる。そのようなゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物はまた、本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、ＭＹＯＣガイドＲＮＡ発現カセット若しくはＭＹＯＣガイドＲＮＡアレイ発現カセット）及び／又はリコンビナーゼ発現カセットを含むこともできる。代替的に、１つ以上の成分（例えば、ガイドＲＮＡ及び／又はリコンビナーゼ）を、他の手段によって細胞及び非ヒト動物に導入して、標的遺伝子（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子）の転写活性化を誘導することができる。
【0108】
ガイドＲＮＡのみが、標的遺伝子の転写を活性化するために非ヒト動物に導入される必要があるため、ＳＡＭ発現カセットを含む非ヒト動物は、標的遺伝子（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子）の発現をインビボで上方制御するためのプロセスを簡略化する。非ヒト動物がまた、ガイドＲＮＡ発現カセットも含む場合、任意の更なる成分を導入することなく、標的遺伝子活性化又は上方制御の効果を研究することができる。加えて、ＳＡＭ発現カセット又はガイドＲＮＡ発現カセットは、任意選択的に、特定の組織又は発生段階において選択的に発現され得る条件付き発現カセットであり得、これは、例えば、インビボでＣａｓ媒介性毒性のリスクを低減することができる。代替的に、そのような発現カセットは、ありとあらゆる種類の細胞、組織、及び臓器における活性の試験を可能にするために構成的に発現され得る。
【0109】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に記載されるＹ４３７Ｈ変異を含む）、及びキメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、リコンビナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせをコードする１つ以上の核酸（そのようなＳＡＭ系核酸の任意の組み合わせ）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物が提供される。非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、雄又は雌であり得る。
【0110】
非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）についてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書に記載されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むことができる。
【0111】
ＳＡＭ核酸若しくは発現カセットは、非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物のゲノムに（すなわち、染色体に）安定的に組み込むことができるか、又は染色体の外側に位置することができる（例えば、ＤＮＡを染色体外に複製する）。ＳＡＭ核酸又は発現カセットは、非ヒト動物のゲノムにランダムに組み込むことができる（すなわち、トランスジェニックか、又は非ヒト動物のゲノムの所定の領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。ＳＡＭ核酸又は発現カセットが安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、核酸若しくは発現カセットについてヘテロ接合性、又は核酸若しくは発現カセットについてホモ接合性であり得る。本明細書に記載される安定的に組み込まれたＳＡＭ核酸又は発現カセットを含む非ヒト動物は、その生殖系列に核酸又は発現カセットを含むことができる。
【0112】
例えば、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、本明細書に開示されるキメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、又は相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質配列の両方を含む）を含むことができる。一例では、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質コード配列の両方を含む、ＳＡＭ発現カセットを含む。一例では、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、ゲノムに安定的に組み込まれる。安定的に組み込まれたＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、非ヒト動物のゲノムにランダムに組み込むことができる（すなわち、トランスジェニック）か、又は非ヒト動物のゲノムの所定の領域に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。一例では、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）は、セーフハーバー遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６）などのゲノムの所定の領域に安定的に組み込まれる。ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）が安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）についてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。
【0113】
任意選択的に、上記に記載される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ発現カセット又はガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、ガイドＲＮＡアレイ発現カセット）を更に含むことができる。ガイドＲＮＡ発現カセットは、非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物のゲノムに（すなわち、染色体に）安定的に組み込むことができるか、又は染色体の外側に位置することができる（例えば、ＤＮＡを染色体外に複製するか、又はＡＡＶ、ＬＮＰ、若しくは本明細書に開示される任意の他の手段を介して非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物に導入される）。ガイドＲＮＡ発現カセットは、非ヒト動物のゲノムにランダムに組み込むことができる（すなわち、トランスジェニック）か、又は非ヒト動物のゲノムの所定の領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。ガイドＲＮＡ発現カセットが安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、ガイドＲＮＡ発現カセットについてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。一例では、ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）及びガイドＲＮＡ発現カセットの両方を含む。一例では、両方のカセットが、ゲノムに組み込まれる。ガイドＲＮＡ発現カセットは、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）とは異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができるか、又は同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）にゲノムに組み込むことができる。例えば、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）及びガイドＲＮＡ発現カセットの各々についてヘテロ接合性であり得、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）を含む標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６）の１つの対立遺伝子、及びガイドＲＮＡ発現カセット発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６）の第２の対立遺伝子を有する。
【0114】
任意選択的に、上記に記載される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物のうちのいずれかは、リコンビナーゼ発現カセットを更に含むことができる。リコンビナーゼ発現カセットは、非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物のゲノムに（すなわち、染色体に）安定的に組み込むことができるか、又は染色体の外側に位置することができる（例えば、ＤＮＡを染色体外に複製するか、又はＡＡＶ、ＬＮＰ、ＨＤＤ、若しくは本明細書に開示される任意の他の手段を介して非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物に導入される）。リコンビナーゼ発現カセットは、非ヒト動物のゲノムにランダムに組み込むことができる（すなわち、トランスジェニック）か、又は非ヒト動物のゲノムの所定の領域（例えば、セーフハーバー遺伝子座）に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。リコンビナーゼ発現カセットが安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、リコンビナーゼ発現カセットについてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。リコンビナーゼ発現カセットは、本明細書に開示される他の発現カセットのうちのいずれかとは異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができるか、又は同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）にゲノムに組み込むことができる。
【0115】
本明細書に記載されるいくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座、ＳＡＭ発現カセット、及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ（又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ発現カセット）を含む、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞）は、対照非ヒト動物又は非ヒト動物細胞（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物又は非ヒト動物細胞）に対して、増加したヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を有する。いくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞では、発現の増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍）である。いくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞では、増加した発現は、少なくとも約２倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約３倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約４倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約５倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約６倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約７倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約８倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約９倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約２倍～少なくとも約２０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１０倍～少なくとも約１５倍である。対照非ヒト動物に対する増加したヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、小柱網、又は角膜にあり得る。具体的な例では、増加した発現は、輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ））にある。
【0116】
本明細書に記載されるいくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座、ＳＡＭ発現カセット、及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ（又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ発現カセット）を含む、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞）は、緑内障の１つ以上の兆候又は症状を有する。緑内障は、結果として生じる不可逆的な視力喪失を伴う、網膜神経節細胞（retinal ganglion cell、ＲＧＣ）軸索の進行性喪失を特徴とする慢性視神経症である。緑内障の主な危険因子は、眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。ＩＯＰの上昇は、小柱網（ＴＭ）の構造を通した房水流出に対する抵抗の増加によって引き起こされる。房水は、毛様体によって作製され、前房を循環し、ＴＭ網を通して流出する。ほとんどの緑内障症例では、ＴＭにおける房水に対する抵抗の増加がある。病原性ＭＹＯＣ変異タンパク質は、細胞内で凝集し、小柱網（ＴＭ）応力、ＩＯＰの上昇、及び緑内障につながる。ヒト緑内障ＴＭ細胞では、上昇したレベルのＥＲ応力誘導性タンパク質が検出されている。
【0117】
いくつかの非ヒト動物では、ＩＯＰは、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、若しくは少なくとも約２０、少なくとも約２１、又は少なくとも約２２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇ）である。一例では、ＩＯＰは、約１５～約２２、約１６～約２２、約１７～約２２、約１８～約２２、約１９～約２２、約１５～約２１、約１５～約２０、又は約１６～約２１ｍｍＨｇ（例えば、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、１５～２１、１５～２０、又は１６～２１ｍｍＨｇ）である。
【0118】
いくつかの非ヒト動物では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して増加する。一例では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物における対照ベースラインを少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ）上回る。一例では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物における対照ベースラインよりも約１～約７、約２～約７、約３～約７、約４～約７、約５～約７、約１～約６、約２～約６、約３～約６、約４～約６、又は約５～約６ｍｍＨｇ（例えば、１～６、２～６、３～６、４～６、又は５～６ｍｍＨｇ）高い。対照ベースラインは、例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、若しくは野生型非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、又は本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡの投与前の非ヒト動物におけるＩＯＰであり得る。
【0119】
いくつかの非ヒト動物では、小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）応力は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して増加する。いくつかの非ヒト動物は、パターン網膜電図（pattern electroretinogram、ＰＥＲＧ）によって測定される緑内障の兆候及び症状を示す。いくつかの非ヒト動物は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して網膜神経節細胞（ＲＧＣ）喪失を示す。いくつかの非ヒト動物は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して房水の流出抵抗の増加を示す。
【0120】
ヒトミオシリンＹ４３７Ｈのトランスジェニック過剰発現を有するＭＹＯＣ緑内障モデルは、わずか約２～３ｍｍＨｇのＩＯＰ上昇を示し、ＭＹＯＣは、どこでも発現される。加えて、ＩＯＰ表現型は、繁殖にわたって失われる。本明細書に記載されるモデルは、発現が疾患病理の標的組織である小柱網にほとんど限定されるという利点を有する。加えて、約５～６ｍｍＨｇのＩＯＰの更なる上昇が観察される。
【0121】
ＩＩ．ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される核酸、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書に記載されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む細胞又は非ヒト動物は、天然ミオシリンタンパク質の１つ以上の断片が、ヒトミオシリンからの対応する断片で置き換えられている、ヒトミオシリンタンパク質又は部分的にヒト化されたキメラミオシリンタンパク質を発現する。
本明細書に開示される核酸、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書に記載されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む細胞又は非ヒト動物は、天然ミオシリンタンパク質の１つ以上の断片が、ヒトミオシリンからの対応する断片で置き換えられている、ヒトミオシリンタンパク質又は部分的にヒト化されたキメラミオシリンタンパク質を発現する。
【0122】
Ａ．ミオシリン（ＭＹＯＣ）
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む。ミオシリン（小柱網誘導性グルココルチコイド応答タンパク質又はＭＹＯＣとしても知られる）は、ＭＹＯＣ遺伝子（ＧＬＣ１Ａ又はＴＩＧＲとしても知られる）によってコードされる。ミオシリンは、分泌性糖タンパク質（５５～５７ｋＤａ）である。ＭＹＯＣは、培養ヒト小柱網（ＴＭ）細胞におけるグルココルチコイド誘導性遺伝子及びタンパク質として最初に報告された。ミオシリンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質は、網膜、毛様体、及び小柱網を含む眼構造において発現される。それは、細胞質内で構造的機能を果たし得るか、又はおそらく分子シャペロンとして細胞内の他の分子と会合し得る。細胞外では、それは、他の細胞外分子又はＴＭ細胞の細胞膜に結合することによって、房水流出に対する抵抗を生成することに関与し得る。
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む。ミオシリン（小柱網誘導性グルココルチコイド応答タンパク質又はＭＹＯＣとしても知られる）は、ＭＹＯＣ遺伝子（ＧＬＣ１Ａ又はＴＩＧＲとしても知られる）によってコードされる。ミオシリンは、分泌性糖タンパク質（５５～５７ｋＤａ）である。ＭＹＯＣは、培養ヒト小柱網（ＴＭ）細胞におけるグルココルチコイド誘導性遺伝子及びタンパク質として最初に報告された。ミオシリンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質は、網膜、毛様体、及び小柱網を含む眼構造において発現される。それは、細胞質内で構造的機能を果たし得るか、又はおそらく分子シャペロンとして細胞内の他の分子と会合し得る。細胞外では、それは、他の細胞外分子又はＴＭ細胞の細胞膜に結合することによって、房水流出に対する抵抗を生成することに関与し得る。
【0123】
多くのＭＹＯＣ変異は、ミオシリンをＴＭの細胞に蓄積させ、緑内障を誘導する。ミオシリンにおける変異は、緑内障の最も一般的な形態である、原発性開放隅角緑内障の最も一般的な遺伝的原因である。しかしながら、ＭＹＯＣ関連緑内障の根底にある機構は、完全には理解されていない。緑内障の主な危険因子は、ＴＭの構造を通した房水流出に対する抵抗の増加によって引き起こされ得る、眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。ミオシリンは、ＴＭ細胞及び毛様体を含む、房水内にミオシリンを分泌することが可能である多くの眼組織において発現される。多くの異なるミオシリン変異が同定されている。Ｙ４３７Ｈ変異は、ＩＯＰの上昇及び緑内障の発症に関連する１つの変異である。
【0124】
ヒトＭＹＯＣは、第１染色体上の１ｑ２４．３（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４６５３、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３８．ｐ１３（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３９）、位置ＮＣ＿０００００１．１１（１７１６３５４１７．．１７１６５２６８８、補体））にマッピングする。この遺伝子は、３つのエキソンを有すると報告されている。野生型ヒトミオシリンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９９７２が割り当てられている。正準野生型アイソフォームミオシリンの配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００２５２．１）は、配列番号１に記載されている。正準アイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２６１．２が割り当てられており、配列番号２に記載されている。例示的なコード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＣＤＳ）は、配列番号３（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ１２９７．１）に記載されている。配列番号１に記載される完全長ヒトミオシリンタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～３２）及び成熟ミオシリン（アミノ酸３３～５０４）を含む５０４個のアミノ酸を有し、これは、小胞体においてアミノ酸２２６に続くＣＡＰＮ２による切断後にＮ末端断片（３３～２２６）及びＣ末端断片（２２７～５０４）を産生する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで指定される通りである。ヒトミオシリンの言及には、正準（野生型）形態並びに全ての対立遺伝子形態及びアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のヒトミオシリンは、野生型形態との最大アラインメントについて番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は、同じ番号で指定される。Ｙ４３７Ｈ変異を含む例示的なヒトミオシリンタンパク質は、配列番号４に記載されている。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒトミオシリンタンパク質の例示的なコード配列は、配列番号５に記載されている。
【0125】
マウスＭｙｏｃは、第１染色体上の１ Ｈ２．１；１ ７０．２９ ｃＭ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １７９２６、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｍ３９（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２７）、位置ＮＣ＿００００６７．７（１６２４６６７１９．．１６２４７７２６３））にマッピングする。この遺伝子は、３つのエキソンを有すると報告されている。野生型マウスミオシリンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ７０６２４が割り当てられている。正準アイソフォームの配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４９９５．３は、６に記載されている。正準アイソフォームをコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）アイソフォームには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０８６５．３が割り当てられ、配列番号７に記載されている。例示的なコード配列（ＣＤＳ）（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ１５４２２．１）は、配列番号８に記載されている。配列番号６に記載される完全長マウスミオシリンタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１８）及び成熟ミオシリン（アミノ酸１９～４９０）を含む４９０個のアミノ酸を有し、これは、小胞体においてアミノ酸２１２に続くＣＡＰＮ２による切断後にＮ末端断片（１９～２１２）及びＣ末端断片（２１３～４９０）を産生する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで指定される通りである。マウスミオシリンへの言及には、正準（野生型）形態並びに全ての対立遺伝子形態及びアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のマウスミオシリンは、野生型形態との最大アラインメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
【0126】
ラットＭｙｏｃは、第１３染色体上の１３ｑ２２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８１５２３、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍＲａｔＢＮ７．２（ＧＣＦ＿０１５２２７６７５．２）、位置ＮＣ＿０５１３４８．１（７４９７６７３０．．７４９８７１２８））にマッピングする。この遺伝子は、３つのエキソンを有すると報告されている。野生型ラットミオシリンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｒ１Ｊ４が割り当てられている。正準アイソフォームの配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１１０４９２．１は、配列番号９に記載されている。正準アイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０３０８６５．１が割り当てられ、配列番号１０に記載されている。正準アイソフォームをコードする例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１１に記載されている。別のアイソフォームの配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１１０４９２．２は、配列番号１２に記載されている。このアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０３０８６５．２が割り当てられ、配列番号１３に記載されている。このアイソフォームをコードする例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１４に記載されている。配列番号９に記載される正準完全長ラットミオシリンタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～３１）及び成熟ミオシリン（アミノ酸３２～５０２）を含む５０２個のアミノ酸を有し、これは、小胞体においてアミノ酸２２５に続くＣＡＰＮ２による切断後にＮ末端断片（３２～２２５）及びＣ末端断片（２２６～５０２）を産生する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで指定される通りである。ラットミオシリンへの言及には、正準（野生型）形態並びに全ての対立遺伝子形態及びアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のラットミオシリンは、野生型形態との最大アラインメントについて番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は、同じ番号で指定される。
【0127】
Ｂ．ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座
本明細書では、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列（例えば、対応するヒトＭＹＯＣゲノム配列）で置き換えられており、ヒト化ミオシリンタンパク質が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座から発現される、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が開示される。対応するヒトＭＹＯＣ配列は、緑内障に関連する変異（例えば、緑内障を引き起こす変異）などの変異を含み得る。そのような変異の一例は、Ｙ４３７Ｈ変異である。ほぼ１００個の異なる病原性ＭＹＯＣ変異が同定されており、その大部分は、オルファクトメジンドメインをコードするエキソン３にクラスター化される。そのような変異の例としては、Ｙ４３７Ｈ、Ｇ３６４Ｖ、及びＱ３６８Ｘが挙げられる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３（５２）：２０１３７－２０１５６、及びＪａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１４（４２）：１１１９９－１１２０４を参照されたい。
本明細書では、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＭＹＯＣ配列（例えば、対応するヒトＭＹＯＣゲノム配列）で置き換えられており、ヒト化ミオシリンタンパク質が、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座から発現される、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座が開示される。対応するヒトＭＹＯＣ配列は、緑内障に関連する変異（例えば、緑内障を引き起こす変異）などの変異を含み得る。そのような変異の一例は、Ｙ４３７Ｈ変異である。ほぼ１００個の異なる病原性ＭＹＯＣ変異が同定されており、その大部分は、オルファクトメジンドメインをコードするエキソン３にクラスター化される。そのような変異の例としては、Ｙ４３７Ｈ、Ｇ３６４Ｖ、及びＱ３６８Ｘが挙げられる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３（５２）：２０１３７－２０１５６、及びＪａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１４（４２）：１１１９９－１１２０４を参照されたい。
【0128】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、ＭＹＯＣ遺伝子全体が、対応するヒトＭＹＯＣ配列（例えば、対応するオルソログヒトＭＹＯＣ配列）若しくは対応するヒトトＭＹＯＣ配列のコドン最適化バージョンで置き換えられる、ＭＹＯＣ遺伝子座であり得るか、又はＭＹＯＣ遺伝子の一部のみが、対応するヒトＭＹＯＣ配列（すなわち、ヒト化）若しくは対応するヒトＭＹＯＣ配列のコドン最適化バージョンで置き換えられる、ＭＹＯＣ遺伝子座であり得るか、対応するヒトＭＹＯＣ遺伝子座の一部若しくは対応するヒトＭＹＯＣ遺伝子座の一部のコドン最適化バージョンが挿入される、ＭＹＯＣ遺伝子座であり得るか、又はＭＹＯＣ遺伝子の一部が削除され、対応するヒトＭＹＯＣ遺伝子座の一部若しくは対応するヒトＭＹＯＣ遺伝子座の一部のコドン最適化バージョンが挿入される、ＭＹＯＣ遺伝子座であり得る。挿入される対応するヒトＭＹＯＣ遺伝子座の一部は、例えば、内因性ＭＹＯＣ遺伝子座から削除されるよりも多くのヒトＭＹＯＣ遺伝子座を含むことができる。内因性ＭＹＯＣ配列の特定のセグメントに対応するヒトＭＹＯＣ配列は、ヒトＭＹＯＣ及び内因性ＭＹＯＣが最適にアラインされた（完璧に一致する残基の最大数）ときに、内因性ＭＹＯＣ配列の特定のセグメントとアラインするヒトＭＹＯＣの領域を指す。対応するヒト配列は、例えば、相補的ＤＮＡ（complementary DNA、ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡを含むことができる。任意選択的に、対応するヒトＭＹＯＣ配列のコドン最適化バージョンを使用することができ、非ヒト動物におけるコドン使用に基づいてコドン最適化されるように修飾される。置換又は挿入された（すなわち、ヒト化された）領域は、エキソンなどのコード領域、イントロンなどの非コード領域、非翻訳領域、若しくは調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、若しくは転写リプレッサー結合要素）、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。一例として、ヒトＭＹＯＣ遺伝子の１、２、又は３つ全てのエキソンに対応するエキソンをヒト化することができる。例えば、ヒトＭＹＯＣ遺伝子のエキソン１～３に対応するエキソンをヒト化することができる。代替的に、抗ヒトミオシリン抗原結合タンパク質によって認識されるエピトープをコードするＭＹＯＣの領域、又はヒトミオシリン標的化試薬（例えば、小分子）によって標的化される領域をヒト化することができる。同様に、ヒトＭＹＯＣ遺伝子の１つ若しくは２つ全てのイントロンに対応するイントロンは、ヒト化することができるか、又は内因性のままであり得る。例えば、ヒトＭＹＯＣ遺伝子のエキソン１と３との間のイントロン（すなわち、イントロン１～２）に対応するイントロンをヒト化することができる。
【0129】
調節配列を含む隣接する非翻訳領域もまた、ヒト化されるか、又は内因性のままであり得る。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、若しくは５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方は、ヒト化することができるか、又は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、若しくは５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方は、内因性のままであり得る。ヒト５’及び３’ＵＴＲの一方若しくは両方を挿入することができ、かつ／又は内因性の５’及び３’ＵＴＲの一方若しくは両方を削除することができる。具体的な例では、ヒト３’ＵＴＲは、挿入され、５’ＵＴＲは、内因性のままである。対応するヒト配列による置換の程度に応じて、プロモーターなどの調節配列は、内因性であるか、又は置換する対応するヒト配列によって供給することができる。例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、内因性非ヒト動物ＭＹＯＣプロモーターを含むことができる（すなわち、ヒト化ＭＹＯＣコード配列の挿入されたヒトＭＹＯＣ配列を、内因性非ヒト動物ＭＹＯＣプロモーターに作動可能に連結することができる）。
【0130】
シグナルペプチド、成熟ミオシリン、Ｎ末端断片、若しくはＣ末端断片のうちの１つ以上若しくは全てを、ヒト化することができるか、又はそのような領域のうちの１つ以上は、内因性のままであり得る。マウスミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリン、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号３１～３４に記載されている。ラットミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリン、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号３９～４２に記載されている。ヒトミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリン、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号２１～２４に記載されている。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト成熟ミオシリンの例示的なコード配列は、配列番号２５に記載されている。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒトミオシリンＣ末端断片の例示的なコード配列は、配列番号２６に記載されている。
【0131】
例えば、シグナルペプチドをコードするＭＹＯＣ遺伝子座の領域の全て若しくは一部をヒト化することができ、かつ／又はＣ末端断片をコードするＭＹＯＣ遺伝子座の領域の全て若しくは一部をヒト化することができ、かつ／又はＮ末端断片ドメインをコードするＭＹＯＣ遺伝子座の領域の全て若しくは一部をヒト化することができ、かつ／又は成熟ミオシリンタンパク質をコードするＭＹＯＣ遺伝子座の領域の全て若しくは一部をヒト化することができる。一例では、ミオシリンタンパク質をコードするＭＹＯＣ遺伝子座の領域の全て（シグナルペプチド及び成熟ミオシリンを含む）がヒト化される。任意選択的に、ヒトミオシリンタンパク質のＣＤＳは、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含む。任意選択的に、ヒトミオシリンタンパク質のＣＤＳは、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になる。任意選択的に、ヒトミオシリンタンパク質のＣＤＳは、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなる。ミオシリンタンパク質が発現され、天然ミオシリン及び／又はヒトミオシリンの活性を保持することができる。
【0132】
シグナルペプチド、成熟ミオシリンタンパク質、Ｎ末端断片、又はＣ末端断片をコードする領域のうちの１つ以上は、内因性のままであり得る。例えば、シグナルペプチドをコードする領域は、内因性のままであり得る。
【0133】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、ヒトミオシリンタンパク質に由来する１つ以上のドメイン、及び／又は内因性（すなわち、天然）ミオシリンタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含むことができる。マウスミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリンタンパク質、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２７～３０に記載されている。ラットミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリンタンパク質、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号３５～３８に記載されている。ヒトミオシリンシグナルペプチド、成熟ミオシリンタンパク質、Ｎ末端断片、及びＣ末端断片の例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１５～１８に記載されている。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト成熟ミオシリンタンパク質の例示的なコード配列は、配列番号１９に記載されている。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒトミオシリンＣ末端断片の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２０に記載されている。
【0134】
ミオシリンタンパク質は、ヒトミオシリンシグナルペプチド、ヒトミオシリンＣ末端断片、ヒトミオシリンＮ末端断片、及びヒト成熟ミオシリンタンパク質のうちの１つ以上又は全てを含むことができる。一例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、完全ヒトミオシリンタンパク質（すなわち、シグナルペプチド及び成熟ミオシリンタンパク質）であり得る。
【0135】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質はまた、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物ミオシリンタンパク質に由来する１つ以上のドメインを含むこともできる。
【0136】
ヒトミオシリンタンパク質に由来するキメラミオシリンタンパク質若しくは完全ヒトミオシリンタンパク質中のドメインは、完全ヒト化配列によってコードすることができる（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられる）か、又は部分的ヒト化配列によってコードすることができる（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられ、そのドメインをコードする残りの内因性（すなわち、天然）配列は、コードされたドメインがヒトミオシリンタンパク質中のそのドメインと同一であるように、対応するヒトＭＹＯＣ配列と同じアミノ酸をコードする）。同様に、内因性ミオシリンタンパク質に由来するキメラタンパク質中のドメインは、完全内因性配列によってコードすることができる（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が内因性ＭＹＯＣ配列である）か、又は部分的ヒト化配列によってコードすることができる（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えられるが、対応するヒトＭＹＯＣ配列は、コードされたドメインが内因性アルブミンタンパク質中のそのドメインと同一であるように、置き換えられた内因性ＭＹＯＣ配列と同じアミノ酸をコードする）。
【0137】
一例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、完全ヒトミオシリンタンパク質（すなわち、シグナルペプチド及び成熟ミオシリンタンパク質）を含むことができる。ミオシリンタンパク質が発現され、天然ミオシリン及び／又はヒトミオシリンの活性を保持する。
【0138】
例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含むことができる。別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になることができる。別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質は、配列番号４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなることができる。任意選択的に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のＭＹＯＣコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）同一である配列を含むことができる。任意選択的に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のＭＹＯＣコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）同一である配列から本質的になることができる。任意選択的に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のＭＹＯＣコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５（又はその縮退型）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）同一である配列からなることができる。いずれの場合も、ミオシリンタンパク質が発現され、天然ミオシリン及び／又はヒトミオシリンの活性を保持することができる。
【0139】
任意選択的に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、他の要素を含むことができる。そのような要素の例としては、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、又は他の要素を挙げることができる。代替的に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、他の要素を欠き得る（例えば、選択マーカー又は選択カセットを欠き得る）。好適なレポーター遺伝子及びレポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所に開示されている。好適な選択マーカーの例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neomycin phosphotransferase、ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygromycin B phosphotransferase、ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（puromycin-N-acetyltransferase、ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（blasticidin S deaminase、ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（xanthine/guanine phosphoribosyl transferase、ｇｐｔ）、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（herpes simplex virus thymidine kinase、ＨＳＶ－ｋ）が挙げられる。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を妨げる。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルを更に含み得る（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能し得るヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、並びにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、及びｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【0140】
レポーター遺伝子又は選択カセットなどの他の要素は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する自己欠失カセットであり得る。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国特許出願公開第２０１３／０３１２１２９号を参照されたい。例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）及びヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを採用することにより、Ｆ０動物の雄の生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。別の具体的な例として、自己欠失選択カセットは、１つ以上のプロモーター（例えば、ヒトユビキチン及びＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、続いてポリアデニル化シグナル、続いて１つ以上のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されたＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含むことができ、カセット全体がｌｏｘＰ部位に隣接している。
【0141】
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座はまた、条件付き対立遺伝子であり得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号に記載されているように、多機能対立遺伝子であり得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センス又はアンチセンス方向の薬物選択カセット（drug selection cassette、ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列（nucleotide sequence of interest、ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（conditional by inversion module、ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）を含み得る。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩ及びアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットを更に含むことができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。
【0142】
１つの例示的なヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、ヒト化マウスＭＹＯＣ遺伝子座）は、開始コドン及び終止コドンからの領域が、開始コドンから終止コドンまでの対応するヒト配列で置き換えられ、ヒトＭＹＯＣ ３’ＵＴＲを含むものである。図１並びに配列番号８８及び８９を参照されたい。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の例示的な配列は、配列番号８８及び８９に記載されている。
【0143】
１つの具体的な例では、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座におけるヒトＭＹＯＣ配列は、配列番号８７に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含むことができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号４に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含むタンパク質をコードすることができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含むコード配列を含むことができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号８８又は８９に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８８又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列を含むことができる。
【0144】
１つの具体的な例では、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座におけるヒトＭＹＯＣ配列は、配列番号８７に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になることができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号４に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になるタンパク質をコードすることができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になるコード配列を含むことができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号８８又は８９に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８８又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列から本質的になることができる。
【0145】
１つの具体的な例では、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座におけるヒトＭＹＯＣ配列は、配列番号８７に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなることができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号４に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなるタンパク質をコードすることができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなるコード配列を含むことができる。別の具体的な例では、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、配列番号８８又は８９に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である（例えば、配列番号８８又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である）配列からなることができる。
【0146】
Ｃ．ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるヒト化ミオシリンタンパク質を発現することができる。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、雄又は雌であり得る。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むことができる。
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるヒト化ミオシリンタンパク質を発現することができる。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、雄又は雌であり得る。ゲノム、細胞、又は非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合性であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性であると記載される。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むことができる。
【0147】
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノム又は細胞は、例えば、ＭＹＯＣ遺伝子座又はヒトＭＹＯＣ遺伝子座に相同若しくはオルソログのゲノム遺伝子座を含む、任意の非ヒト動物ゲノム又は細胞であり得る。ゲノムは、真核細胞に由来し得るか、又は真核細胞であり得、これらには、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、及びヒト細胞が含まれる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、及び虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、又はマウス細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類が含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
【0148】
細胞はまた、任意の種類の未分化又は分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、又はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞若しくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、又は非多能性細胞（例えば、非ＥＳ細胞）であり得る。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性及び／又は全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（induced pluripotent stem、ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞又はＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性又は多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することが可能である。
【0149】
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子又は卵母細胞）であり得る。細胞は、有糸分裂能力のある細胞又は有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞又は減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞又は初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、又は未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、小柱網細胞などの眼細胞であり得る。
【0150】
本明細書で提供される好適な細胞には、初代細胞も含まれる。初代細胞には、生物、臓器、又は組織から直接単離された細胞又は細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、又は以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、臓器、又は組織から得られた任意の細胞が含まれる。例えば、初代細胞は、小柱網細胞などの眼細胞であり得る。
【0151】
本明細書で提供される他の好適な細胞には、不死化細胞が含まれる。不死化細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異又は改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができる多細胞生物からの細胞も含まれる。そのような変異若しくは改変は、自然に発生し得るか、又は意図的に誘導され得る。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞又は初代細胞には、典型的には、培養又は組換え遺伝子若しくはタンパク質の発現に使用される細胞が含まれる。
【0152】
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞又は接合子）を含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスの場合はＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、又はそれらの組み合わせ）に由来し得、新鮮であり得るか、又は凍結することができ、自然繁殖又は体外受精に由来し得る。
【0153】
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であり得るか、又は罹患した細胞若しくは変異体を担持する細胞であり得る。
【0154】
本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、及び虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。具体的な例では、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、マウス及びラットなどのげっ歯類が含まれる。
【0155】
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景からのものであり得る。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、又はスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １０（８）：８３６を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統及び前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９及び５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種又は前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
【0156】
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４若しくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｈｅｒラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統又はＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹及び足、並びにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプとともに、黒いアグーチを有することを特徴としている。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコート及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。いくつかの好適なラットは、近交系ラット系統に由来し得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３号を参照されたい。
【0157】
本明細書に記載されるいくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞は、緑内障の１つ以上の兆候又は症状を有する。緑内障は、結果として生じる不可逆的な視力喪失を伴う、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索の進行性喪失を特徴とする慢性視神経症である。緑内障の主な危険因子は、眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。ＩＯＰの上昇は、小柱網（ＴＭ）の構造を通した房水流出に対する抵抗の増加によって引き起こされる。房水は、毛様体によって作製され、前房を循環し、ＴＭ網を通して流出する。ほとんどの緑内障症例では、ＴＭにおける房水に対する抵抗の増加がある。病原性ＭＹＯＣ変異タンパク質は、細胞内で凝集し、小柱網（ＴＭ）応力、ＩＯＰの上昇、及び緑内障につながる。ヒト緑内障ＴＭ細胞では、上昇したレベルのＥＲ応力誘導性タンパク質が検出されている。
【0158】
いくつかの非ヒト動物では、ＩＯＰは、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、又は少なくとも約２２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇ）である。一例では、ＩＯＰは、約１５～約２２、約１６～約２２、約１７～約２２、約１８～約２２、約１９～約２２、約１５～約２１、約１５～約２０、又は約１６～約２１ｍｍＨｇ（例えば、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、１５～２１、１５～２０、又は１６～２１ｍｍＨｇ）である。
【0159】
いくつかの非ヒト動物では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して増加する。一例では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物における対照ベースラインを少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ）上回る。一例では、ＩＯＰは、対照非ヒト動物における対照ベースラインよりも約１～約７、約２～約７、約３～約７、約４～約７、約５～約７、約１～約６、約２～約６、約３～約６、約４～約６、又は約５～約６ｍｍＨｇ（例えば、１～６、２～６、３～６、４～６、又は５～６ｍｍＨｇ）高い。対照ベースラインは、例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、若しくは野生型非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡの投与前の本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有する非ヒト動物におけるＩＯＰであり得る。
【0160】
いくつかの非ヒト動物では、小胞体（ＥＲ）応力は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して増加する。いくつかの非ヒト動物は、パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）によって測定される緑内障の兆候及び症状を示す。いくつかの非ヒト動物は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して網膜神経節細胞（ＲＧＣ）喪失を示す。いくつかの非ヒト動物は、対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は野生型非ヒト動物）に対して房水の流出抵抗の増加を示す。
【0161】
ＩＩＩ．相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含む非ヒト動物
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物はまた、インビトロ、エクスビボ、又はインビトロで本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子などの標的遺伝子の転写を活性化する方法で使用するためのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットも含む。本明細書に記載されるＳＡＭ系は、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質を含み、本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子などの標的遺伝子の転写を活性化するために、本明細書の他の場所に記載されるガイドＲＮＡとともに使用することができる。ガイドＲＮＡは、ゲノムに組み込まれた発現カセットによってコードすることができるか、又はＡＡＶ若しくは任意の他の好適な手段によって提供することができる。キメラＣａｓタンパク質（例えば、キメラＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、キメラＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質に由来するキメラＣａｓ９タンパク質などのキメラＣａｓタンパク質）、及びキメラアダプタータンパク質（例えば、ガイドＲＮＡ内のアダプター結合要素に特異的に結合するアダプタータンパク質、及び１つ以上の異種転写活性化ドメインを含む）は、本明細書の他の場所で更に詳細に記載される。
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物はまた、インビトロ、エクスビボ、又はインビトロで本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子などの標的遺伝子の転写を活性化する方法で使用するためのクラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）に基づく相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットも含む。本明細書に記載されるＳＡＭ系は、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質を含み、本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子などの標的遺伝子の転写を活性化するために、本明細書の他の場所に記載されるガイドＲＮＡとともに使用することができる。ガイドＲＮＡは、ゲノムに組み込まれた発現カセットによってコードすることができるか、又はＡＡＶ若しくは任意の他の好適な手段によって提供することができる。キメラＣａｓタンパク質（例えば、キメラＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、キメラＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質に由来するキメラＣａｓ９タンパク質などのキメラＣａｓタンパク質）、及びキメラアダプタータンパク質（例えば、ガイドＲＮＡ内のアダプター結合要素に特異的に結合するアダプタータンパク質、及び１つ以上の異種転写活性化ドメインを含む）は、本明細書の他の場所で更に詳細に記載される。
【0162】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現、又はその活性の指示に関与する転写産物及び他の要素が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、又はタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－Ａ又はサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、系の１つ以上の成分が、それらの天然に存在する状態から改変若しくは変異されている、それらが天然に関連する少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まない、又はそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の成分と関連するなど、人の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を一緒に含む、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を採用するか、天然に存在しないＣａｓタンパク質を採用するか、又は天然に存在しないｇＲＮＡを採用する。
【0163】
本明細書に開示される方法及び組成物は、インビボで標的ゲノム遺伝子座の転写活性化を誘導するためのＣＲＩＳＰＲ複合体（キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質と複合体を形成しているガイドＲＮＡ（guide RNA、ｇＲＮＡ）を含む）の能力を使用又は試験することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する。
【0164】
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質発現カセット及び／又はキメラアダプタータンパク質発現カセットを含む。例えば、本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、及び非ヒト動物は、キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質コード配列を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを含むことができる。
【0165】
ＳＡＭ発現カセットを含む、そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物は、標的ゲノム遺伝子座の転写活性化を誘導するためにガイドＲＮＡの送達のみを必要とするという利点を有する。いくつかのそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物はまた、標的遺伝子の転写活性化に必要とされる全ての成分がすでに存在しているように、１つ以上のガイドＲＮＡ発現カセット又はガイドＲＮＡ発現カセットも含む。ＳＡＭ系は、任意の所望の様式で標的遺伝子の発現の増加を提供するために、そのような細胞で使用することができる。例えば、１つ以上の標的遺伝子の発現は、構成的様式で、又は調節された（例えば、誘導性、組織特異的、一時的に調節されたなど）様式で増加し得る。
【0166】
Ａ．キメラＣａｓタンパク質
本明細書の他の場所に開示されているガイドＲＮＡと結合して標的遺伝子の転写を活性化することができるキメラＣａｓタンパク質が提供される。そのようなキメラＣａｓタンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的配列に結合することが可能である、クラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントであるＤＮＡ結合ドメイン、及び（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含むことができる。例えば、そのような融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の転写活性化ドメイン（例えば、２つ以上の異種転写活性化ドメイン又は３つ以上の異種転写活性化ドメイン）を含むことができる。一例では、キメラＣａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）及びＶＰ６４転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含むことができる。例えば、そのようなキメラＣａｓタンパク質は、配列番号４３に記載されるｄＣａｓ９－ＶＰ６４キメラＣａｓタンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、かつ／又はＣａｓタンパク質が他のＣａｓタンパク質（例えば、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）を含む、キメラＣａｓタンパク質も提供される。他の好適な転写活性化ドメインの例は、本明細書の他の場所に提供される。
本明細書の他の場所に開示されているガイドＲＮＡと結合して標的遺伝子の転写を活性化することができるキメラＣａｓタンパク質が提供される。そのようなキメラＣａｓタンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的配列に結合することが可能である、クラスター化して規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントであるＤＮＡ結合ドメイン、及び（ｂ）１つ以上の転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含むことができる。例えば、そのような融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の転写活性化ドメイン（例えば、２つ以上の異種転写活性化ドメイン又は３つ以上の異種転写活性化ドメイン）を含むことができる。一例では、キメラＣａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）及びＶＰ６４転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含むことができる。例えば、そのようなキメラＣａｓタンパク質は、配列番号４３に記載されるｄＣａｓ９－ＶＰ６４キメラＣａｓタンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、かつ／又はＣａｓタンパク質が他のＣａｓタンパク質（例えば、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）を含む、キメラＣａｓタンパク質も提供される。他の好適な転写活性化ドメインの例は、本明細書の他の場所に提供される。
【0167】
転写活性化ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置することができる。例えば、転写活性化ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質と最適にアラインされたときに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のＲｅｃ１ドメイン、Ｒｅｃ２ドメイン、ＨＮＨドメイン、若しくはＰＩドメイン、又はオルソログＣａｓ９タンパク質若しくは相同あるいはオルソログＣａｓタンパク質の任意の対応する領域と結合することができる。例えば、転写活性化ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質の５５３位のＲｅｃ１ドメイン、５７５位のＲｅｃ１ドメイン、１７５～３０６位内の任意の位置のＲｅｃ２ドメインと結合するか、又は１７５～３０６位内の領域の一部若しくは全体、７１５～９０１位内の任意の位置のＨＮＨドメインを置き換えるか、又は７１５～９０１位内の領域の一部若しくは全体、あるいは１１５３位のＰＩドメインを置き換えることができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０４９２５８号を参照されたい。転写活性化ドメインは、本明細書の他の場所に記載されるように、片側又は両側で１つ以上のリンカーに隣接し得る。
【0168】
キメラＣａｓタンパク質はまた、追加の異種ポリペプチドに作動可能に連結又は融合され得る。融合又は連結された異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はキメラＣａｓタンパク質の内部の任意の場所に位置し得る。例えば、キメラＣａｓ－タンパク質は、核局在化シグナルを更に含み得る。Ｃａｓタンパク質に対する好適な核局在化シグナル及び他の修飾の例は、本明細書の他の場所で更に詳細に記載される。
【0169】
（１）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用することができる少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質の機能的断片又は機能的バリアントは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的遺伝子の標的配列と結合する能力（例えば、標的遺伝子の転写を活性化する）を保持するものである。
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用することができる少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質の機能的断片又は機能的バリアントは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的遺伝子の標的配列と結合する能力（例えば、標的遺伝子の転写を活性化する）を保持するものである。
【0170】
本明細書の他の場所に記載される転写活性化ドメインに加えて、Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含むことができる。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然Ｃａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端又は付着末端を生成することができ、一本鎖又は二本鎖であり得る。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、典型的には、平滑端切断産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後及び標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じる、５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）を生成することができるか、又は標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を生成するニッカーゼであり得る。一例では、本明細書に開示されるキメラＣａｓタンパク質のＣａｓタンパク質部分は、減少したヌクレアーゼ活性を有するように（例えば、ヌクレアーゼ活性が、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％減少する）、又は実質的に全てのヌクレアーゼ活性を欠くように（すなわち、ヌクレアーゼ活性が、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％減少するか、又は野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約０％以下、約１％以下、約２％以下、約３％以下、約５％以下、若しくは約１０％以下を有する）修飾されている。ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質は、その触媒（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインに不活性化変異であることが知られている変異を有する（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインの変異を不活性化するか、若しくはＣａｓ９中のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインの両方の変異を不活性化する）か、又は野生型Ｃａｓタンパク質と比較して少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質である。ヌクレアーゼ活性を低減又は実質的に排除するための異なるＣａｓタンパク質変異の例が以下に開示される。
【0171】
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにそれらの相同体又は修飾バージョンが含まれる。
【0172】
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、又はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来の（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）又は代替ＰＡＭを認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これら及び他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。
【0173】
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物とともに含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１、割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
【0174】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性バリアント又は断片であり得る。触媒活性に関する活性バリアント又は断片は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質若しくはその一部と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがって、ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性のアッセイが公知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
【0175】
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアントである。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたい。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５Ａ及びＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これら及び他の修飾Ｃａｓタンパク質は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡大された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたい。
【0176】
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び酵素活性のうちの１つ以上を増加又は減少させるように修飾することができる。Ｃａｓタンパク質は、安定性などのタンパク質の他の活性又は特性を変更するように修飾することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを修飾、欠失、若しくは不活性化することができるか、又はＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去することができるか、又はＣａｓタンパク質の活性若しくは特性を最適化（例えば、増強若しくは低減）することができる。
【0177】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１を参照されたい。
【0178】
ヌクレアーゼドメインのうちの１つ以上又は全てを欠失又は変異させることができるため、それらは、もはや機能しなくなるか、又は低減したヌクレアーゼ活性を有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインのうちの１つが欠失又は変異している場合、結果として得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称され得、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断を生成することはできない（すなわち、相補的鎖又は非相補的鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失又は変異している場合、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌル又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、又は触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０におけるアラニンからアスパラギン酸への）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）、又はＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３におけるアスパラギンからアラニン）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対する対応する変異が挙げられる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照されたい。そのような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、又は全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号及び国際公開第２０１３／１４２５７８号において見出すことができ、それらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインの全てがＣａｓタンパク質で欠失又は変異している（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で欠失又は変異している）場合、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌル又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０ＡＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３ＡＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）の一例は、配列番号４４に記載されるｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0179】
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について上に記載されるものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）及びＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成し得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１０６２３６号を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ１６Ａ及びＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、及びＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ１０Ａ及びＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ８Ａ及びＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９及びＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
【0180】
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、及びＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の位置９０８、９９３若しくは１２６３あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、又はＬｂＣｐｆ１の位置８３２、９２５、９４７若しくは１１８０あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置における変異を含むことができる。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａ若しくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、又はＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、及びＤ１１８０Ａ若しくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号を参照されたい。
【0181】
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。例えば、転写活性化ドメインに加えて、Ｃａｓタンパク質は切断ドメイン又はエピジェネティック修飾ドメインに融合させることができる。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加又は減少を提供する異種ポリペプチドに融合することもできる。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
【0182】
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合され得る。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ ＮＬＳ及び／又は二部分アルファインポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含むことができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列又は双節型配列であり得る。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳ又は単節型ＮＬＳ）及びＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ又は双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳ及び／又はＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。
【0183】
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメイン又はタンパク質導入ドメインに作動可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０号及び国際公開第２０１３／１７６７７２号を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。
【0184】
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡又は精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase、ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（chitin binding protein、ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（thioredoxin、ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（tandem affinity purification、ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（hemagglutinin、ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（histidine、Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（biotin carboxyl carrier protein、ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
【0185】
Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸に係留され得る。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有結合性相互作用又は非共有結合性相互作用を通して達成することができ、係留は、直接的（例えば、タンパク質若しくはインテイン修飾上のシステイン若しくはリジン残基の修飾によって達成することができる、直接融合若しくは化学的コンジュゲーションを通して）であり得るか、又はストレプトアビジン若しくはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカー若しくはアダプター分子を通して達成することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、及びＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有方略には、ビオチン－ストレプトアビジン及びニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸及びタンパク質を接続することによって合成することができる。これらの化学物質のうちのいくつかは、タンパク質表面上のアミノ酸残基（例えば、リジンアミン又はシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を伴うが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾又は触媒若しくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジン又はシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、及び光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、又は内部領域に係留され得る。一例では、標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端又はＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端、３’末端、又は内部領域に係留され得る。すなわち、標識された核酸は、任意の方向及び極性で係留され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端又は３’末端に係留され得る。
【0186】
（２）転写活性化ドメイン
本明細書に開示されるキメラＣａｓタンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含むことができる。転写活性化ドメインには、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）と併せて、転写機構に直接又はコアクチベーターなどの他のタンパク質を介して接触することにより、プロモーターからの転写を活性化することができる、天然に存在する転写因子の領域が含まれる。転写活性化ドメインには、転写因子のそのような領域の機能的断片又はバリアント、及び天然の天然に存在する転写活性化ドメインに由来するか、又は標的遺伝子の転写を活性化するために人工的に生成若しくは合成される、操作された転写活性化ドメインも含まれる。機能的断片は、好適なＤＮＡ結合ドメインと作動可能に連結した場合に標的遺伝子の転写を活性化することができる断片である。機能的バリアントは、好適なＤＮＡ結合ドメインと作動可能に連結した場合に標的遺伝子の転写を活性化することができるバリアントである。
本明細書に開示されるキメラＣａｓタンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含むことができる。転写活性化ドメインには、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している触媒的に不活性なＣａｓタンパク質）と併せて、転写機構に直接又はコアクチベーターなどの他のタンパク質を介して接触することにより、プロモーターからの転写を活性化することができる、天然に存在する転写因子の領域が含まれる。転写活性化ドメインには、転写因子のそのような領域の機能的断片又はバリアント、及び天然の天然に存在する転写活性化ドメインに由来するか、又は標的遺伝子の転写を活性化するために人工的に生成若しくは合成される、操作された転写活性化ドメインも含まれる。機能的断片は、好適なＤＮＡ結合ドメインと作動可能に連結した場合に標的遺伝子の転写を活性化することができる断片である。機能的バリアントは、好適なＤＮＡ結合ドメインと作動可能に連結した場合に標的遺伝子の転写を活性化することができるバリアントである。
【0187】
本明細書に開示されるキメラＣａｓタンパク質で使用するための特定の転写活性化ドメインは、ＶＰ６４転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。ＶＰ６４は、単純ヘルペスＶＰ１６活性化ドメインからの最小活性化ドメインの四量体リピートである。例えば、転写活性化ドメインは、配列番号４５に記載されるＶＰ６４転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【0188】
転写活性化ドメインの他の例には、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメイン、ＶＰ６４（単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の４重タンデムリピート）、ＮＦ－κＢ ｐ６５（ＮＦ－κＢトランス活性化サブユニットｐ６５）活性化ドメイン、ＭｙｏＤ１トランス活性化ドメイン、ＨＳＦ１トランス活性化ドメイン（ヒト熱ショック因子１からのトランス活性化ドメイン）、ＲＴＡ（Ｅｐｓｔｅｉｎ ＢａｒｒウイルスＲトランス活性化ドメイン）、ＳＥＴ７／９トランス活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１、ｐ５３活性化ドメイン２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメイン、並びにそれらの機能的断片及びバリアントが含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２９８１２５号、米国特許出願公開第２０１６／０２８１０７２号、及び国際公開第２０１６／０４９２５８号を参照されたい。転写活性化ドメインの他の例には、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４、Ｌｅｕ３、並びにそれらの機能的断片及びバリアントが含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２９８１２５号を参照されたい。転写活性化ドメインの更に他の例には、Ｓｐｌ、Ｖａｘ、ＧＡＴＡ４、並びにそれらの機能的断片及びバリアントが含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１４９４８４号を参照されたい。他の例には、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、ＡＰ－２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ－２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、及びＴＲＡＢ１ＰＣ４からの活性化ドメイン、並びにそれらの機能的断片及びバリアントが含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２３７４５６号、欧州特許第３０４５５３７号、及び国際公開第２０１１／１４６１２１号を参照されたい。追加の好適な転写活性化ドメインも即知である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／１４６１２１号を参照されたい。
【0189】
Ｂ．キメラアダプタータンパク質
本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡと結合することができるキメラアダプタータンパク質も提供される。本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、標的遺伝子の転写を活性化するために標的遺伝子内の標的配列に指向する転写活性化ドメインの数及び多様性を増加させるために、ｄＣａｓ－相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）様系で有用である。キメラアダプタータンパク質をコードする核酸を、本明細書の他の場所に開示されるように、細胞若しくは非ヒト動物（例えば、ゲノムに組み込まれたキメラＣａｓタンパク質発現カセットを含む細胞若しくは非ヒト動物）にゲノムに組み込むことができるか、又はキメラアダプタータンパク質若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達若しくはＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような細胞及び非ヒト動物に導入することができる。
本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡと結合することができるキメラアダプタータンパク質も提供される。本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、標的遺伝子の転写を活性化するために標的遺伝子内の標的配列に指向する転写活性化ドメインの数及び多様性を増加させるために、ｄＣａｓ－相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）様系で有用である。キメラアダプタータンパク質をコードする核酸を、本明細書の他の場所に開示されるように、細胞若しくは非ヒト動物（例えば、ゲノムに組み込まれたキメラＣａｓタンパク質発現カセットを含む細胞若しくは非ヒト動物）にゲノムに組み込むことができるか、又はキメラアダプタータンパク質若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達若しくはＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような細胞及び非ヒト動物に導入することができる。
【0190】
そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ内のアダプター結合要素に特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメイン又はアダプタータンパク質）、及び（ｂ）１つ以上の異種転写活性化ドメインを含む。例えば、そのような融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の転写活性化ドメイン（例えば、２つ以上の異種転写活性化ドメイン又は３つ以上の異種転写活性化ドメイン）を含むことができる。一例では、そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ内のアダプター結合要素に特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメイン又はアダプタータンパク質）、及び（ｂ）２つ以上の異種転写活性化ドメインを含むことができる。例えば、キメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ中の１つ以上のＭＳ２アプタマー（例えば、ガイドＲＮＡ中の別個の位置にある２つのＭＳ２アプタマー）に特異的に結合するＭＳ２コートタンパク質アダプター、及び（ｂ）１つ以上（例えば、２つ以上の転写活性化ドメイン）を含むことができる。例えば、２つの転写活性化ドメインは、ｐ６５及びＨＳＦ１転写活性化ドメイン又はそれらの機能的断片若しくはバリアントであり得る。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、キメラアダプタータンパク質も提供される。
【0191】
１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに直接融合され得る。代替的に、１つ以上の転写活性化ドメインは、リンカー若しくはリンカーの組み合わせを介して、又は１つ以上の追加のドメインを介してアダプターに連結され得る。同様に、２つ以上の転写活性化ドメインが存在する場合、それらは互いに直接融合され得るか、又はリンカー若しくはリンカーの組み合わせを介して、あるいは１つ以上の追加のドメインを介して互いに連結され得る。これらの融合タンパク質で使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を干渉しない任意の配列を含み得る。例示的なリンカーは、短く（例えば、２～２０アミノ酸）、典型的には、柔軟である（例えば、グリシン、アラニン、及びセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。リンカーのいくつかの具体的な例は、ＧＧＧＳ（配列番号４６）又はＧＧＧＧＳ（配列番号４７）からなる１つ以上の単位、例えば、任意の組み合わせで、ＧＧＧＳ（配列番号４６）又はＧＧＧＧＳ（配列番号４７）の２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配列も使用することができる。
【0192】
１つ以上の転写活性化ドメイン及びアダプターは、キメラアダプタータンパク質内で任意の順序であり得る。１つの選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＣ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得る。しかしながら、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端になくても、アダプターのＣ末端であり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＣ末端にある場合）。同様に、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端になくても、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端であり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＮ末端にある場合）。別の選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＮ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＣ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得る。更に別の選択肢として、キメラアダプタータンパク質が２つ以上の転写活性化ドメインを含む場合、２つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに隣接し得る。
【0193】
キメラアダプタータンパク質はまた、追加の異種ポリペプチドに作動可能に連結又は融合され得る。融合又は連結された異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はキメラアダプタータンパク質の内部の任意の場所に位置し得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、核局在化シグナルを更に含み得る。そのようなタンパク質の具体的な例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）のｐ６５転写活性化ドメインのＣ末端、及びｐ６５転写活性化ドメインのＨＳＦ１転写活性化ドメインのＣ末端に（直接又はＮＬＳを介してのいずれかで）連結されたＭＳ２コートタンパク質（アダプター）を含む。そのようなタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＭＣＰ、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、及びＨＳＦ１転写活性化ドメインを含むことができる。例えば、キメラアダプタータンパク質は、配列番号４８に記載されるＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【0194】
キメラアダプタータンパク質はまた、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合又は連結することができる。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするためのＳＶ４０ ＮＬＳ及び／又はアルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含むことができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたい。ＮＬＳは、例えば、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列又は双節型配列であり得る。任意選択的に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファインポーチンＮＬＳ）及び／又はＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含む。
【0195】
キメラアダプタータンパク質はまた、細胞透過性ドメイン又はタンパク質導入ドメインに作動可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０号及び国際公開第２０１３／１７６７７２号を参照されたい。別の例として、キメラアダプタータンパク質を異種ポリペプチドに融合又は連結して、安定性の増加又は減少を提供することができる。
【0196】
キメラアダプタータンパク質はまた、追跡又は精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
【0197】
キメラアダプタータンパク質は、標識された核酸に係留され得る。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有相互作用若しくは非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質又はインテイン修飾上のシステイン又はリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合又は化学的結合を介して）、又はストレプトアビジン若しくはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカー又はアダプター分子を介して達成することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、及びＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有方略には、ビオチン－ストレプトアビジン及びニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸及びタンパク質を接続することによって合成することができる。これらの化学物質のうちのいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミン又はシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾又は触媒若しくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジン又はシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、及び光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸は、キメラアダプタータンパク質のＣ末端、Ｎ末端、又は内部領域に係留され得る。同様に、キメラアダプタータンパク質は、標識された核酸の５’末端、３’末端、又は内部領域に係留され得る。すなわち、標識された核酸は、任意の方向及び極性で係留され得る。
【0198】
（１）アダプタータンパク質又はアダプタードメイン
アダプター（すなわち、アダプタードメイン又はアダプタータンパク質）は、別個の配列を特異的に認識及び結合する（例えば、配列特異的様式でのアプタマーなどの別個のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列に結合する）核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＮＡ結合ドメイン）である。アプタマーには、特定の三次元立体配座を採用する能力を通じて、高い親和性及び特異性で標的分子に結合し得る核酸が含まれる。そのようなアダプターは、例えば、特定のＲＮＡ配列及び二次構造に結合し得る。これらの配列（すなわち、アダプター結合要素）は、ガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、ＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に特異的に結合するようにガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、アダプターは、配列番号４９に記載されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
アダプター（すなわち、アダプタードメイン又はアダプタータンパク質）は、別個の配列を特異的に認識及び結合する（例えば、配列特異的様式でのアプタマーなどの別個のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列に結合する）核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＮＡ結合ドメイン）である。アプタマーには、特定の三次元立体配座を採用する能力を通じて、高い親和性及び特異性で標的分子に結合し得る核酸が含まれる。そのようなアダプターは、例えば、特定のＲＮＡ配列及び二次構造に結合し得る。これらの配列（すなわち、アダプター結合要素）は、ガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、ＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に特異的に結合するようにガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、アダプターは、配列番号４９に記載されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【0199】
アダプター及び標的のいくつかの具体的な例には、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の中に存在するＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが含まれる。例えば、以下のアダプタータンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントを使用することができる：ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１ｌ、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、Φ Ｃｂ８ｒ、Φ Ｃｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０４９２５８号を参照されたい。アダプタータンパク質の機能的断片又は機能的バリアントは、特異的なアダプター結合要素と結合する能力（例えば、配列特異的な様式で特異的なアダプター結合配列と結合する能力）を保持するものである。例えば、アミノ酸６８～６９がＳＧに変異し、アミノ酸７０～７５が野生型タンパク質から削除されている、ＰＰ７ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバクテリオファージコートタンパク質バリアントを使用することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１０２（１２）：２９３６－２９４４、及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１）：１０３－１０５を参照されたい。同様に、Ｎ５５Ｋ変異などのＭＣＰバリアントを使用することもできる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｎｇｏｌａ ａｎｄ Ｐｅａｂｏｄｙ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１２）：９００６－９０１０を参照されたい。
【0200】
使用することができるアダプタータンパク質の他の例には、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４又はラムダＮタンパク質の全体又は一部（例えば、ＤＮＡ結合形態）が含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３１２１９８号を参照されたい。
【0201】
（２）転写活性化ドメイン
本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含む。そのような転写活性化ドメインは、天然に存在する転写活性化ドメインであり得るか、天然に存在する転写活性化ドメインの機能的断片若しくは機能的バリアントであり得るか、又は操作された転写活性化ドメイン若しくは合成転写活性化ドメインであり得る。使用することができる転写活性化ドメインには、本明細書の他の場所でキメラＣａｓタンパク質で使用するために記載されたものが含まれる。
本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含む。そのような転写活性化ドメインは、天然に存在する転写活性化ドメインであり得るか、天然に存在する転写活性化ドメインの機能的断片若しくは機能的バリアントであり得るか、又は操作された転写活性化ドメイン若しくは合成転写活性化ドメインであり得る。使用することができる転写活性化ドメインには、本明細書の他の場所でキメラＣａｓタンパク質で使用するために記載されたものが含まれる。
【0202】
本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質で使用するための特定の転写活性化ドメインは、ｐ６５及び／若しくはＨＳＦ１転写活性化ドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。ＨＳＦ１転写活性化ドメインは、ヒト熱ショック因子１（heat shock factor 1、ＨＳＦ１）の転写活性化ドメインであり得る。ｐ６５転写活性化ドメインは、ＲＥＬＡ遺伝子によってコードされる核因子ＮＦ－カッパ－Ｂ ｐ６５サブユニットとしても知られる、転写因子ｐ６５の転写活性化ドメインであり得る。一例として、転写活性化ドメインは、配列番号５０に記載されるｐ６５転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。別の例として、転写活性化ドメインは、配列番号５１に記載されるＨＳＦ１転写活性化ドメインタンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【0203】
Ｃ．ＳＡＭガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡアレイ
また、標的遺伝子の転写を活性化するために本明細書の他の場所に開示されるキメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質に結合することができる、ガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡアレイも提供される。ガイドＲＮＡをコードする核酸を、本明細書の他の場所に開示されるように、非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物（例えば、ＳＡＭ対応細胞若しくは非ヒト動物）においてゲノムに組み込むことができるか、又はガイドＲＮＡ若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達若しくはＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物に導入することができる。送達方法は、本明細書の他の場所に開示されるリコンビナーゼの組織特異的送達を提供するように選択され得る。
また、標的遺伝子の転写を活性化するために本明細書の他の場所に開示されるキメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質に結合することができる、ガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡアレイも提供される。ガイドＲＮＡをコードする核酸を、本明細書の他の場所に開示されるように、非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物（例えば、ＳＡＭ対応細胞若しくは非ヒト動物）においてゲノムに組み込むことができるか、又はガイドＲＮＡ若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達若しくはＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような非ヒト動物細胞及び非ヒト動物に導入することができる。送達方法は、本明細書の他の場所に開示されるリコンビナーゼの組織特異的送達を提供するように選択され得る。
【0204】
ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡアレイをコードする核酸は、１つ以上のガイドＲＮＡをコードすることができる（又はガイドＲＮＡが非ヒト動物細胞又は非ヒト動物に導入される場合、１つ以上のガイドＲＮＡを導入することができる）。例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のガイドＲＮＡをコード又は導入することができる。各ガイドＲＮＡコード配列を、同じプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）又は異なるプロモーターに作動可能に連結することができる（例えば、各ガイドＲＮＡコード配列が、その独自のＵ６プロモーターに作動可能に連結される）。ガイドＲＮＡのうちの２つ以上は、単一標的遺伝子における異なる標的配列を標的とすることができる。例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のガイドＲＮＡは各々、単一標的遺伝子中の異なる標的配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、複数の標的遺伝子（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の標的遺伝子）を標的とすることができる。ガイドＲＮＡ標的配列の例は、本明細書の他の場所に開示される。
【0205】
（１）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含むことができる。「セグメント」は、ＲＮＡ中の連続した一続きのヌクレオチドなどの分子のセクション又は領域を含む。Ｃａｓ９のものなどのいくつかのｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子：「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）含むことができる。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、国際公開第２０１４／０９９７５０号、国際公開第２０１３／１４２５７８号、及び国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡとトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせのいずれかを指す。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）として、又は２つの別個のＲＮＡ分子（二重ガイドＲＮＡ又はｄｇＲＮＡ）として関連付けることができる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１の場合、ｃｒＲＮＡのみが、標的配列への結合を達成するために必要とされる。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ又はその同等物である。
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含むことができる。「セグメント」は、ＲＮＡ中の連続した一続きのヌクレオチドなどの分子のセクション又は領域を含む。Ｃａｓ９のものなどのいくつかのｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子：「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）含むことができる。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、国際公開第２０１４／０９９７５０号、国際公開第２０１３／１４２５７８号、及び国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡとトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせのいずれかを指す。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）として、又は２つの別個のＲＮＡ分子（二重ガイドＲＮＡ又はｄｇＲＮＡ）として関連付けることができる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１の場合、ｃｒＲＮＡのみが、標的配列への結合を達成するために必要とされる。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。本明細書に開示される方法及び組成物のうちのいくつかでは、ｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ又はその同等物である。
【0206】
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成する一続きのヌクレオチドの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７３）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかを、配列番号７３の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
【0207】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーター－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一続きのヌクレオチドを含む。ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドと相補的であり、それとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号７４）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７５）、又はＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７６）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0208】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡであり得る。ｃｒＲＮＡは追加的に、標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内の修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に固有であるように設計することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９、及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたい。
【0209】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補的鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び生物に応じて異なるが、しばしば、２１～４６ヌクレオチド長の２つの直接反復（direct repeat、ＤＲ）に隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含む（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、それとハイブリダイズし、転じて、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合する。
【0210】
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、又は少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、又は約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、又は約１７、約１８、約１９、若しくは約２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００２４５２３号を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、又は１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長又は少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【0211】
一例では、ＤＮＡ標的化セグメントは、約２０ヌクレオチド長であり得る。しかしながら、より短い配列及びより長い配列も標的化セグメントに使用することができる（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長などの１５～２５ヌクレオチド長）。ＤＮＡ標的化セグメントと対応するガイドＲＮＡ標的配列との間の同一性の程度（又はＤＮＡ標的化セグメントとガイドＲＮＡ標的配列の他の鎖との間の相補性の程度）は、例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％であり得る。ＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１つ以上のミスマッチが含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１～４、１～３、１～２、１、２、３、又は４つのミスマッチが含まれ得る（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０以上のヌクレオチドである）。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、２０ヌクレオチドである、１～４、１～３、１～２、１、２、３、又は４つのミスマッチが含まれ得る。
【0212】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）でああり、かつ様々な長さであり得る。それらには、一次転写物又は処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、又は２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全て又は一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０個以上、約２６個以上、約３２個以上、約４５個以上、約４８個以上、約５４個以上、約６３個以上、約６７個以上、約８５個以上、又はそれ以上のヌクレオチド）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３４０）：６０２－６０７、国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。
【0213】
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで低くあり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長とみなされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある７つの連続するヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで低くあり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチド長とみなされ得る。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドがターゲットＤＮＡの相補的鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、２０ヌクレオチド長であり得、標的ＤＮＡの相補的鎖との１、２、又は３つのミスマッチを含むことができる。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif、ＰＡＭ）配列に対応する相補的鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、又はミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補的鎖の領域から少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、若しくは少なくとも１９塩基対離れている）。
【0214】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つの一続きのヌクレオチドを含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（double-stranded RNA duplex、ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは結合したＣａｓタンパク質をＤＮＡ標的化セグメントを介して標的化ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。
【0215】
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及び足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合又はＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号７７）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号７８）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号７９）、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号８０）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号８１）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号８２）、又はＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号８３）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のうちのいずれか（例えば、配列番号９０～９５のうちのいずれか）を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号９６～１０１のうちのいずれか）を含むことができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。具体的な例では、配列番号９３又は９４を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端上の配列番号９９又は１００のＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。別の具体的な例では、配列番号９３を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端上の配列番号９９のＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。
【0216】
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特徴（例えば、修飾若しくは調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質若しくはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾又は配列を含むことができる。ガイドＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又は正準Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、若しくはそれに加えて使用される１つ以上の天然に存在しない及び／若しくは天然に存在する成分若しくは構成を含むことができる。そのような修飾の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による安定性の制御及び／又は接近性の制御を可能にする）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾又は配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子などのＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する修飾又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３７６５８６号を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域及び最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成することができるヌクレオチドであり得る、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’、及び二重鎖の反対側に対になっていないヌクレオチド領域を含むことができる。
【0217】
修飾されていない核酸は分解されやすい可能性がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下のうちの１つ以上を含む、修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを含むことができる：（１）ホスホジエステル骨格結合における、非結合リン酸酸素の一方若しくは両方及び／又は結合リン酸酸素の１つ以上の改変又は置換、（２）リボース糖上の２’ヒドロキシルの改変又は置換などのリボース糖の成分の改変又は置換、（３）リン酸部分の脱リン酸化リンカーによる置換、（４）天然に存在する核酸塩基の修飾又は置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換又は修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、若しくは置換、又は部分のコンジュゲーション）、並びに（７）糖の修飾。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシル又はポリ－ウラシルトラクトの修飾又は置換が含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０４８５７７号及び米国特許出願公開第２０１６／０２３７４５５号を参照されたい。同様の修飾を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。
【0218】
上記のホースでのような化学修飾を組み合わせて、２、３、４、又はそれ以上の修飾を有することができる残基（ヌクレオシド及びヌクレオチド）を含む修飾ｇＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾された糖及び修飾された核酸塩基を有することができる。一例では、ｇＲＮＡの全ての塩基が修飾されている（例えば、全ての塩基は、ホスホロチオエート基などの修飾されたリン酸基を有する）。例えば、ｇＲＮＡの全て又は実質的に全てのリン酸基をホスホロチオエート基で置換することができる。代替的又は追加的に、修飾ｇＲＮＡは、５’末端又はその近くに少なくとも１つの修飾残基を含むことができる。代替的又は追加的に、修飾ｇＲＮＡは、３’末端又はその近くに少なくとも１つの修飾残基を含むことができる。
【0219】
いくつかのｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つ以上の修飾残基を含む。例えば、修飾ｇＲＮＡにおける少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の位置は、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドであり得る。
【0220】
修飾されていない核酸は分解されやすい可能性がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。本明細書に記載のいくつかのｇＲＮＡは、細胞内又は血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されているいくつかの修飾ｇＲＮＡは、細胞の集団に導入された場合、自然免疫応答の低減を示す可能性がある。
【0221】
本明細書に開示されるｇＲＮＡは、修飾残基のリン酸基が、酸素のうちの１つ以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る骨格修飾を含むことができる。修飾は、本明細書に記載されるように、修飾されていないリン酸部分を修飾されたリン酸基で大規模に置換することを含み得る。リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカー又は非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変化も含まれ得る。
【0222】
修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。修飾されていないリン酸基のリン原子は、アキラル性である。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子又は原子の基のうちの１つに置換すると、リン原子がキラルになる可能性がある。立体中心のリン原子は、「Ｒ」配置（Ｒｐ）又は「Ｓ」配置（Ｓｐ）のいずれかを有することができる。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合する酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾することができる。置換は、結合酸素又は結合酸素の両方で生じる可能性がある。
【0223】
リン酸基は、特定の骨格修飾でリンを含まないコネクタに置換することができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換することができる。リン酸基を置換することができる部分の例としては、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルマセタール、ホルマセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノが挙げられるが、これらに限定されない。
【0224】
核酸を模倣することができる足場はまた、リン酸リンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチド代用物によって置換させるように構築され得る。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代理骨格によってつながれ得る。例としては、モルフォリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0225】
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基への１つ以上の修飾（糖修飾）を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾することができる（例えば、いくつかの異なるオキシ又はデオキシ置換基で置換することができる）。２’－アルコキシドイオンを形成するためにヒドロキシルを脱プロトン化することができなくなるため、２’ヒドロキシル基への修飾は核酸の安定性を高めることができる。
【0226】
２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（又は、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、ポリエチレングリコール（polyethyleneglycol、ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲが挙げられ、式中、Ｒは、例えば、Ｈ又は任意選択的に置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であり得る。２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。同様に、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－フルオロ修飾であり得、これは２’ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える。２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１－６アルキレン又はＣ１－６ヘテロアルキレンブリッジによって、同じリボース糖の４’炭素に接続され得るロックされた核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）を含み得、例示的なブリッジは、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノブリッジ；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ、（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠いているアンロックされた核酸（unlocked nucleic acid、ＵＮＡ）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
【0227】
デオキシ２’修飾には、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にあるデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されるように）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、シアノメルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、これらは、任意選択的に、例えば、本明細書に記載のアミノで置換することができる。
【0228】
糖修飾は、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含み得る糖基を含むことができる。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子のうちの１つ以上で更に修飾することができる。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖（例えば、Ｌ－ヌクレオシド）を含み得る。
【0229】
修飾核酸に組み込むことができる、本明細書に記載の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（adenine、Ａ）、グアニン（guanine、Ｇ）、シトシン（cytosine、Ｃ）、及びウラシル（uracil、Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基を提供するために修飾され得るか、又は完全に置換され得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、又はピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する合成誘導体を含むことができる。
【0230】
二重ガイドＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの各々に修飾を含めることができる。そのような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの一端又は両端にあり得る。ｓｇＲＮＡでは、ｓｇＲＮＡの一端又は両端の１つ以上の残基が化学的に修飾され得、かつ／又は内部ヌクレオシドが修飾され得、かつ／又はｓｇＲＮＡ全体が化学的に修飾され得る。いくつかのｇＲＮＡは、５’末端修飾を含む。いくつかのｇＲＮＡは、３’末端修飾を含む。
【0231】
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１０７０２８（Ａｌ）号に開示される修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０１１４３３４号に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１３６７９４号、国際公開第２０１７／００４２７９号、米国特許出願公開第２０１８／０１８７１８６号、又は米国特許出願公開第２０１９／００４８３３８号に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。
【0232】
一例として、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含むことができる（例えば、塩基は、ホスホロチオアート基である修飾されたリン酸基を有することができる）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端の２、３、又は４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含むことができる。別の例として、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端（例えば、５’末端）の２、３、又は４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含むことができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１７３０５４（Ａ１）号、及びＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。具体的な例では、ガイドＲＮＡには、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が含まれる。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからガイドＲＮＡへのより優れた安定性及び保護を提供し、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に持続することを可能にする。そのような化学修飾はまた、例えば、ＲＮＡを積極的に分解し得るか又は細胞死につながる免疫カスケードを引き起こし得る自然細胞内免疫応答から保護することもできる。
【0233】
一例として、本明細書に記載のガイドＲＮＡのいずれも、少なくとも１つの修飾を含むことができる。一例では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（2’-O-methyl、２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（phosphorothioate、ＰＳ）結合、２’－フルオロ（2’-fluoro、２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。代替的又は追加的に、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むことができる。代替的又は追加的に、少なくとも１つの修飾は、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。一例では、本明細書に記載のガイドＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間の１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
【0234】
修飾は、ガイドＲＮＡの任意の場所に生じ得る。一例として、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含み、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、ガイドＲＮＡの最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、又はそれらの組み合わせを含むことができる。代替的又は追加的に、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むことができ、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【0235】
ヌクレオチド糖環に影響を与えることが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を高めることができる。脱塩基ヌクレオチドとは、窒素塩基を欠くヌクレオチドを指す。反転した塩基とは、通常の５’から３’への結合（すなわち、５’から５’への結合又は３’から３’への結合）から反転した結合を有するものを指す。
【0236】
脱塩基ヌクレオチドは、逆結合で結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合され得るか、又は脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合され得る。末端の５’又は３’ヌクレオチドのいずれかにある逆脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基エンドキャップとも呼ばれ得る。
【0237】
一例では、５’末端の最初の３、４、又は５ヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端の最後の３、４、又は５ヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。修飾は、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、逆塩基性ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、又は安定性及び／又は性能を高めることが周知である他のヌクレオチド修飾であり得る。
【0238】
別の例では、５’末端の最初の４ヌクレオチド、及び３’末端の最後の４ヌクレオチドをホスホロチオエート結合で連結することができる。
【0239】
別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、逆塩基性ヌクレオチドを含む。
【0240】
いくつかのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）では、ガイドＲＮＡの少なくとも１つのループ（例えば、２つのループ）は、１つ以上のアダプター（すなわち、アダプタータンパク質又はドメイン）に結合する明確に異なるＲＮＡ配列の挿入によって修飾される。そのようなアダプタータンパク質は、転写活性化ドメインなどの１つ以上の異種機能ドメインを更に動員するために使用され得る。そのようなアダプタータンパク質（すなわち、キメラアダプタータンパク質）を含む融合タンパク質の例が、本明細書の他の場所に開示される。例えば、ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＧＣＡＧｇｇｃｃ（配列番号５２）は、配列番号７７、７９、８１、若しくは８２に記載されるｓｇＲＮＡ足場（骨格）、又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３～＋１６及びヌクレオチド＋５３～＋５６に取って代わり得、これは、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０４９２５８号、及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８に記載されている。例えば、図６を参照されたい。本明細書で使用されるガイドＲＮＡの番号付けは、ガイドＲＮＡ足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの下流の配列）におけるヌクレオチドの番号付けを指す。例えば、ガイドＲＮＡ足場の第１のヌクレオチドは＋１であり、足場の第２のヌクレオチドは＋２である、などである。配列番号７７、７９、８１、又は８２中のヌクレオチド＋１３～＋１６と対応する残基は、本明細書ではテトラループと称される領域である、配列番号７７、７９、８１、又は８２中のヌクレオチド＋９～＋２１に及ぶ領域中のループ配列である。配列番号７７、７９、８１、又は８２中のヌクレオチド＋５３～＋５６と対応する残基は、本明細書ではステムループ２と称される領域である、配列番号７７、７９、８１、又は８２中のヌクレオチド＋４８～＋６１に及ぶ領域中のループ配列である。配列番号７７、７９、８１、又は８２中の他のステムループ配列は、ステムループ１（ヌクレオチド＋３３～＋４１）及びステムループ３（ヌクレオチド＋６３～＋７５）を含む。結果として得られる構造は、テトラループ及びステムループ２配列の各々が、ＭＳ２結合ループによって置き換えられている、ｓｇＲＮＡ足場である。テトラループ及びステムループ２は、ＭＳ２結合ループを追加することがいかなるＣａｓ９残基にも干渉すべきでないように、Ｃａｓ９タンパク質から突出する。追加的に、テトラループ及びステムループ２部位のＤＮＡへの近接は、これらの位置への局在化により、ＤＮＡと転写活性化因子などの任意の動員されたタンパク質との間に高度な相互作用がもたらされ得ることを示す。したがって、いくつかのｓｇＲＮＡでは、配列番号７７、７９、８１、又は８２に記載されるガイドＲＮＡ足場の＋１３～＋１６に対応するヌクレオチド及び／若しくは＋５３～＋５６に対応するヌクレオチド、又は対応する残基は、これらの足場／骨格のうちのいずれかと最適にアラインされたときに、１つ以上のアダプタータンパク質又はドメインに結合することが可能な明確に異なるＲＮＡ配列によって置き換えられる。代替的又は追加的に、アダプター結合配列は、ガイドＲＮＡの５’末端又は３’末端に付加され得る。テトラループ及びステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的なガイドＲＮＡ足場は、配列番号６６又は７１に記載される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。テトラループ及びステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的な一般的単一ガイドＲＮＡは、配列番号６８又は７２に記載される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。
【0241】
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）又は１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、及び任意選択的にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、又はそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
【0242】
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一過性に、条件付きで、又は構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、異種核酸を含むベクター内にあり得る。そのような発現コンストラクトにおいて使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。
【0243】
代替的に、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製することができる（例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０号及び国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。
【0244】
ガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上のガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、又は周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸若しくはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、又はインビボでの安定性を増加させる）担体と、を含む、組成物であり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（poly（lactic acid）、ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（poly（D，L-lactic-coglycolic-acid）、ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（cochleates）、及び脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、又はＣａｓタンパク質をコードする核酸を更に含み得る。
【0245】
（２）ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で公知である（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ぶことができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補的鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で公知である（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ぶことができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補的鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。
【0246】
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の配列と非相補的鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、特に、ガイドＲＮＡが相補的鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補的鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補的鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流又は５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補的鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補的鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補的鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
【0247】
標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含み得、例えば、細胞の核又は細胞質内、あるいはミトコンドリア又は葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性又は外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列又は非コード配列（例えば、制御性配列）であり得るか、又は両方を含み得る。
【0248】
それは標的配列が遺伝子の転写開始部位に隣接していることが好ましい場合がある。例えば、標的配列は、転写開始部位の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、若しくは１塩基対以内、転写開始部位の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、若しくは１塩基対上流以内、又は転写開始部位の１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、若しくは１塩基対下流以内であり得る。任意選択的に、標的配列は、転写開始部位の２００塩基対上流及び転写開始部位の１塩基対下流の領域内（－２００～＋１）にある。
【0249】
標的配列は、転写活性化の標的となることが所望される任意の遺伝子内にあり得る。いくつかの事例では、標的遺伝子は、非発現遺伝子又は弱発現遺伝子であり得る（例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、又は２倍など、バックグラウンドを超えて最小限にしか発現されない）。標的遺伝子はまた、対照遺伝子と比較して低レベルで発現されるものであり得る。標的遺伝子はまた、エピジェネティックにサイレンスされるものであり得る。「エピジェネティックにサイレンシングされる」という用語は、変異などの遺伝的変化以外の機構により、転写されていない、又は対照サンプル（例えば、正常細胞などの対応する対照細胞）における遺伝子の転写レベルに対して低下したレベルで転写されている遺伝子を指す。遺伝子サイレンシングのエピジェネティックな機構は周知であり、例えば、遺伝子転写が減少又は阻害されるような、遺伝子の５’調節領域のＣｐＧアイランドでのＣｐＧジヌクレオチドの高メチル化、及び例えば、ヒストンのアセチル化によるクロマチンの構造変化が含まれる。
【0250】
標的遺伝子には、特定の臓器又は組織で発現される遺伝子が含まれ得る。標的遺伝子は、疾患関連遺伝子を含み得る。疾患関連遺伝子とは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患発症組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生する任意の遺伝子を指す。それは、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、そこでは、改変された発現は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に関与する変異又は遺伝的バリエーションを所有する遺伝子を指す。転写又は翻訳された産物は、公知又は未知であり得、正常又は異常なレベルであり得る。
【0251】
そのような標的遺伝子の１つの具体的な例は、Ｍｙｏｃ遺伝子（例えば、本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座）である。マウスＭｙｏｃ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列（ＰＡＭを含まない）の例は、配列番号９０～９５に記載されている。配列番号９０～９５に記載されるガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡ ＤＮＡ標的化セグメントは、それぞれ、配列番号９６～１０１に記載されている。ガイドＲＮＡ標的配列の具体的な例は、配列番号９３又は９４（それぞれ、配列番号９９又は１００に記載される対応するＤＮＡ標的化セグメントを有する）である。ガイドＲＮＡ標的配列の別の具体的な例は、配列番号９３（配列番号９９に記載される対応するＤＮＡ標的化セグメントを有する）である。
【0252】
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合及び切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補的鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意選択的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流又は下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０又は約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補的鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であり得、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補的鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ１及びＮ２は、相補的であり得、Ｎ１－Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ、又はＮ１＝Ｔ及びＮ２＝Ａ）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲであり得、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであり得、Ｒは、Ｇ又はＡであり得る。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣ又はＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであり得、Ｒは、Ｇ又はＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流にあり得、配列５’－ＴＴＮ－３’を有することができる。
【0253】
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号８４）又はＮ２０ＮＧＧ（配列番号８５）である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１６５８２５号を参照されたい。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号８６）を含み、インビトロでＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にすることができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列及びＰＡＭは、４～２２ヌクレオチド長の、配列番号８４～８６（５’Ｇ又はＧＧ及び３’ＧＧ又はＮＧＧを含む）を有することができる。更に他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、１４～２０ヌクレオチド長の、配列番号８４～８６を有することができる。
【0254】
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の逆相補体）に対応する領域内又は領域の近くの標的ＤＮＡの一方又は両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）又は二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖の同じ位置（平滑末端を生成する、例えば、Ｃａｓ９）にあり得るか、又は各鎖の異なる部位（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成する、例えば、Ｃｐｆ１）にあり得る。付着末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を生成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が生成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を生成することができる。場合によっては、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位から、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、又は少なくとも１，０００塩基対分離される。
【0255】
Ｄ．リコンビナーゼ及びリコンビナーゼ欠失体非ヒト動物
キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ発現カセット）、又はカセットが本明細書に開示される部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位に隣接するポリアデニル化シグナル若しくは転写ターミネーターの下流にあるリコンビナーゼ発現カセットを含む、細胞又は非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼの発現を駆動するリコンビナーゼ発現カセットを更に含むことができる。リコンビナーゼをコードする核酸を、ゲノムに組み込むことができるか、又はリコンビナーゼ若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達又はＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような細胞及び非ヒト動物に導入することができる。送達方法は、本明細書の他の場所に開示されるリコンビナーゼの組織特異的送達を提供するように選択され得る。
キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ発現カセット）、又はカセットが本明細書に開示される部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位に隣接するポリアデニル化シグナル若しくは転写ターミネーターの下流にあるリコンビナーゼ発現カセットを含む、細胞又は非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼの発現を駆動するリコンビナーゼ発現カセットを更に含むことができる。リコンビナーゼをコードする核酸を、ゲノムに組み込むことができるか、又はリコンビナーゼ若しくは核酸を、本明細書の他の場所に開示される方法（例えば、ＬＮＰ媒介送達又はＡＡＶ媒介送達）を使用して、そのような細胞及び非ヒト動物に導入することができる。送達方法は、本明細書の他の場所に開示されるリコンビナーゼの組織特異的送達を提供するように選択され得る。
【0256】
部位特異的リコンビナーゼには、２つの組換え部位が単一の核酸内又は別個の核酸上で物理的に分離されているリコンビナーゼ認識部位間の組換えを促進し得る酵素が含まれる。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を妨げる。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルを更に含み得る（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能し得るヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、並びにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、及びｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【0257】
リコンビナーゼ発現カセットは、本明細書に開示される他の発現カセットとは異なる標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができるか、又は同じ標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれるなど、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）にゲノムに組み込むことができる。例えば、細胞又は非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（又はキメラＣａｓタンパク質発現カセット若しくはキメラアダプタータンパク質発現カセット）及びリコンビナーゼ発現カセットの各々についてヘテロ接合性であり得、ＳＡＭ発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子の１つの対立遺伝子、及びリコンビナーゼ標的カセット標的カセットを含む標的ゲノム遺伝子の第２の対立遺伝子を有する。同様に、細胞又は非ヒト動物は、ガイドＲＮＡ発現カセット（例えば、ガイドＲＮＡアレイ発現カセット）及びリコンビナーゼ発現カセットの各々についてヘテロ接合性であり得、ガイドＲＮＡ発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子の１つの対立遺伝子、及びリコンビナーゼ標的カセット標的カセットを含む標的ゲノム遺伝子の第２の対立遺伝子を有する。
【0258】
リコンビナーゼ発現カセット中のリコンビナーゼ遺伝子は、任意の好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。例えば、プロモーターは、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、所望の組織において、又は所望の発生段階においてのみ、標的遺伝子の転写を選択的に活性化することができるため有利である。例えば、Ｃａｓタンパク質の場合、これは、インビボでのＣａｓ媒介性毒性の可能性を低減することができる。マウスリコンビナーゼの例示的なプロモーターが公知であり、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号及び国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載されている。
【0259】
Ｅ．キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、相乗的活性化メディエーター、又はリコンビナーゼをコードする核酸
また、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、リコンビナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせをコードする核酸も提供される。キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、及びガイドＲＮＡは、本明細書の他の場所でより詳細に記載されている。例えば、核酸は、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質の両方をコードする核酸を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット、ガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡアレイ発現カセット、リコンビナーゼ発現カセット、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。そのような核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ））又はＤＮＡであり得、一本鎖又は二本鎖であり得、直鎖状又は環状であり得る。ＤＮＡは、発現ベクター又は標的化ベクターなどのベクターの一部であり得る。ベクターはまた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。本明細書に開示される核酸のうちのいずれかが細胞に導入されると、コードされたキメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、又はガイドＲＮＡは、細胞内で一過性に、条件付きで、又は構成的に発現され得る。
また、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、リコンビナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせをコードする核酸も提供される。キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、及びガイドＲＮＡは、本明細書の他の場所でより詳細に記載されている。例えば、核酸は、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質の両方をコードする核酸を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット、ガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡアレイ発現カセット、リコンビナーゼ発現カセット、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。そのような核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ））又はＤＮＡであり得、一本鎖又は二本鎖であり得、直鎖状又は環状であり得る。ＤＮＡは、発現ベクター又は標的化ベクターなどのベクターの一部であり得る。ベクターはまた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。本明細書に開示される核酸のうちのいずれかが細胞に導入されると、コードされたキメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、又はガイドＲＮＡは、細胞内で一過性に、条件付きで、又は構成的に発現され得る。
【0260】
任意選択的に、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のために、核酸がコドン最適化され得る。例えば、核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の目的の宿主細胞においてより高い使用頻度を有する代替コドンへと修飾することができる。
【0261】
核酸若しくは発現カセットは、細胞若しくは非ヒト動物のゲノムに（すなわち、染色体に）安定的に組み込むことができるか、又は染色体の外側に位置することができる（例えば、ＤＮＡを染色体外に複製する）。安定的に組み込まれた発現カセット又は核酸は、非ヒト動物のゲノムにランダムに組み込むことができる（すなわち、トランスジェニック）か、又は非ヒト動物のゲノムの所定の領域に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。一例では、核酸又は発現カセットは、本明細書の他の場所に記載されるように、セーフハーバー遺伝子座に安定的に組み込まれる。核酸又は発現カセットが安定的に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、核酸若しくは発現カセットについてヘテロ接合性、又は核酸若しくは発現カセットについてホモ接合性であり得る。例えば、標的ゲノム遺伝子座又は非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセットについてヘテロ接合性、かつガイドＲＮＡ発現カセットについてヘテロ接合性であり得、任意選択的に、各々が異なる対立遺伝子上の同じ標的ゲノム遺伝子座にある。
【0262】
本明細書に記載される核酸又は発現カセットは、非ヒト動物内のインビボ、又は細胞内のインビトロ若しくはエクスビボでの発現のための任意の好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載される任意の好適な動物であり得る。一例として、核酸又は発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、又はキメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質の両方をコードする核酸を含むＳＡＭカセット）は、Ｒｏｓａ２６プロモーターなどの標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、カセット核酸又は発現カセットは、外因性プロモーター、例えば、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター若しくはＵ６プロモーター）、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、又は空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的若しくは組織特異的プロモーター）に作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは周知であり、本明細書の他の場所で議論されている。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、又は接合子のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。
【0263】
例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、ヒトＵ６プロモーター又はマウスＵ６プロモーターなどのＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。好適なプロモーター（例えば、ガイドＲＮＡを発現するための）の特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。
【0264】
任意選択的に、プロモーターは、第１の遺伝子（例えば、キメラＣａｓタンパク質をコードする遺伝子）及び第２の遺伝子（例えば、ガイドＲＮＡ又はキメラアダプタータンパク質をコードする遺伝子）の発現を他の方向に駆動する双方向プロモーターであり得る。そのような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（distal sequence element、ＤＳＥ）、近位配列要素（proximal sequence element、ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、並びに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成することができる。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００７４５３５号を参照されたい。双方向プロモーターを使用して２つの遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
【0265】
核酸のうちの１つ以上は、マルチシストロン性発現コンストラクトにおいて一緒であり得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸及びキメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、バイシストロン性発現コンストラクトにおいて一緒であり得る。例えば、図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。マルチシストロン性発現ベクターは、同じｍＲＮＡ（すなわち、同じプロモーターから生成された転写物）から２つ以上の別々のタンパク質を同時に発現する。タンパク質のマルチシストロン発現のための好適な方略には、例えば、２Ａペプチドの使用及び内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）の使用が含まれる。例えば、そのようなコンストラクトは、（１）１つ以上のキメラＣａｓタンパク質及び１つ以上のキメラアダプタータンパク質をコードする核酸、（２）２つ以上のキメラアダプタータンパク質をコードする核酸、（３）２つ以上のキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸、（４）２つ以上のガイドＲＮＡ若しくは２つ以上のガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、（５）１つ以上のキメラＣａｓタンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、（６）１つ以上のキメラアダプタータンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、又は（７）１つ以上のキメラＣａｓタンパク質、１つ以上のキメラアダプタータンパク質、及び１つ以上のガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡアレイをコードする核酸を含むことができる。一例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にすることができる。別の例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つ以上の２Ａペプチドを使用することができる。これらのペプチドは、一般に１８～２２アミノ酸の長さを有する、小さな「自己切断」ペプチドであり、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子を産生する。リボソームは、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドの間の「切断」を引き起こす。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅ１８５５６を参照されたい。「切断」は、Ｃ末端にあるグリシンとプロリン残基との間で発生し、上流のシストロンが、その最後にいくつかの残基を付加し、下流のシストロンはプロリンで始まる。その結果、「切断された」下流ペプチドは、そのＮ末端にプロリンを有する。２Ａ媒介切断は、全ての真核細胞で普遍的な現象である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、及びＣ型ロタウイルスから同定されている。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（５）：６２７－６３８を参照されたい。使用することができる２Ａペプチドの例には、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Thoseaasigna virus 2A、Ｔ２Ａ）、ブタテッショウウイルス－１ ２Ａ（porcine teschovirus-1 2A、Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（equine rhinitis A virus、ＥＲＡＶ）２Ａ（ＥＲＡＶ ２Ａ、Ｅ２Ａ）、及びＦＭＤＶ ２Ａ（ＦＭＤＶ ２Ａ、Ｆ２Ａ）が含まれる。例示的なＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ配列には、以下が含まれる：Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、配列番号５３）、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、配列番号５４）、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号５５）、及びＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号５６）。ＧＳＧ残基は、これらのペプチドのいずれかの５’末端に付加して、切断効率を向上させることができる。
【0266】
核酸又は発現カセットのうちのいずれかは、コード配列の上流にポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターを含むことができる。ポリアデニル化シグナル配列という用語は、転写の終結及びｍＲＮＡ転写物へのポリＡテールの付加を指示する任意の配列を、指す。真核生物では、転写ターミネーターはタンパク質因子によって認識され、終結の後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）テールを追加するプロセスである、ポリアデニル化が続く。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、約４５ヌクレオチド長のコア配列で構成されており、切断及びポリアデニル化の効率を高めることに役立つ多様な補助配列が、隣接している場合がある。コア配列は、ポリＡ認識モチーフ又はポリＡ認識配列と称され、切断及びポリアデニル化特異性因子（cleavage and polyadenylation-specificity factor、ＣＰＳＦ）によって認識される、ｍＲＮＡ内の高度に保存された上流要素（ＡＡＴＡＡＡ又はＡＡＵＡＡＡ）、並びに定義が不十分であり、切断刺激因子（cleavage stimulation factor、ＣｓｔＦ）によって結合される下流領域（Ｕ又はＧ及びＵが豊富）で構成される。使用され得る転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（human growth hormone、ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、シミアンウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（bovine growth hormone、ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（phosphoglycerate kinase、ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、又は真核細胞における遺伝子発現の調節に好適であることが知られている任意の転写終結配列が、挙げられる。例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、又はリコンビナーゼ発現カセットは、発現カセット内のコード配列の上流にポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターを含むことができる。ポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターは、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位に隣接することができる。任意選択的に、リコンビナーゼ認識部位はまた、例えば、薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットに隣接する。任意選択的に、リコンビナーゼ認識部位は選択カセットに隣接しない。ポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターは、コード配列によってコードされるタンパク質又はＲＮＡ（例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、又はリコンビナーゼ）の転写及び発現を妨げる。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼに曝露すると、ポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターが切除されると、タンパク質又はＲＮＡを発現させることができる。
【0267】
発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット又はＳＡＭ発現カセット）のそのような構成は、ポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターが組織特異的又は発生段階特異的な様式で切除される場合、発現カセットを含む非ヒト動物における組織特異的発現又は発生段階特異的発現を可能にすることができる。例えば、キメラＣａｓタンパク質の場合、これは、細胞若しくは非ヒト動物におけるキメラＣａｓタンパク質の長期発現、又は非ヒト動物内の望ましくない発生段階若しくは望ましくない細胞あるいは組織型におけるキメラＣａｓタンパク質の発現に起因する毒性を低減し得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（１）：ｅ０１１６４８４を参照されたい。組織特異的又は発生段階特異的な様式でのポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターの切除は、発現カセットを含む非ヒト動物が、組織特異的又は発生段階特異的プロモーターに作動可能に連結された部位特異的リコンビナーゼのコード配列を更に含む場合に達成することができる。次いで、ポリアデニル化シグナル又は転写ターミネーターは、それらの組織又はそれらの発生段階でのみ切除され、組織特異的発現又は発生段階特異的発現を可能にする。一例では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質、又はガイドＲＮＡは、肝臓特異的な様式で発現され得る。非ヒト動物のそのような「リコンビナーゼ欠失体」株を開発するために使用されているそのようなプロモーターの例は、本明細書の他の場所に開示されている。
【0268】
任意の転写ターミネーター又はポリアデニル化シグナルを使用することができる。本明細書で使用される「転写ターミネーター」は、転写の終結を引き起こすＤＮＡ配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターはタンパク質因子によって認識され、終結の後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）テールを追加するプロセスである、ポリアデニル化が続く。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、約４５ヌクレオチド長のコア配列で構成されており、切断及びポリアデニル化の効率を高めることに役立つ多様な補助配列が、隣接している場合がある。コア配列は、ポリＡ認識モチーフ又はポリＡ認識配列と称され、切断及びポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）によって認識される、ｍＲＮＡ内の高度に保存された上流要素（ＡＡＴＡＡＡ又はＡＡＵＡＡＡ）、並びに定義が不十分であり、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）によって結合される下流領域（Ｕ又はＧ及びＵが豊富）で構成される。使用され得る転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、又は真核細胞における遺伝子発現の調節に適していることが周知の、任意の転写終結配列が、挙げられる。
【0269】
部位特異的リコンビナーゼには、２つの組換え部位が単一の核酸内又は別個の核酸上で物理的に分離されているリコンビナーゼ認識部位間の組換えを促進し得る酵素が、含まれる。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を妨げる。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルを更に含み得る（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能し得るヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、並びにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、及びｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【0270】
本明細書に開示される発現カセットは、他の成分も含むことができる。そのような発現カセット（例えば、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、ＳＡＭ発現カセット、ガイドＲＮＡ発現カセット、又はリコンビナーゼ発現カセット）は、発現カセットの５’末端にある３’スプライシング配列及び／又はコード配列（例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、若しくはリコンビナーゼをコードする）に続く第２のポリアデニル化シグナルを更に含むことができる。３’スプライシング配列という用語は、スプライシング機構によって認識及び結合され得る３’イントロン／エキソン境界における核酸配列を指す。発現カセットは、例えば、薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットを更に含むことができる。好適な選択マーカーの例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が挙げられる。任意選択的に、選択カセットは、部位特異的リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位に隣接し得る。発現カセットがまた、上記のようにコード配列の上流にポリアデニル化シグナルに隣接するリコンビナーゼ認識部位を含む場合、選択カセットは、同じリコンビナーゼ認識部位に隣接し得るか、又は異なるリコンビナーゼによって認識される異なるセットのリコンビナーゼ認識部位に隣接し得る。
【0271】
発現カセットはまた、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）などの１つ以上のレポータータンパク質をコードする核酸を含むことができる。任意の好適なレポータータンパク質が使用され得る。例えば、本明細書の他の場所で定義される蛍光レポータータンパク質を使用することができるか、又は非蛍光レポータータンパク質を使用することができる。蛍光レポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所で提供される。非蛍光レポータータンパク質には、例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、及びＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ）、及びベータ－グルクロニダーゼなどの組織化学的又は生物発光アッセイで使用することができるレポータータンパク質が含まれる。発現カセットには、フローサイトメトリーアッセイで検出できるレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光レポータータンパク質）及び／又は組織化学的アッセイで検出できるレポータータンパク質（例えば、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質）が含まれ得る。そのような組織化学的アッセイの一例は、Ｘ－Ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイル－ｂ－Ｄ－ガラクトピラノシド）の加水分解を通した組織化学的なインサイチュベータガラクトシダーゼ発現の可視化であり、これは、青色沈殿物を生じさせるか、又はベータ－メチルウンベリフェリルガラクトシド（methyl umbelliferyl galactoside、ＭＵＧ）及びフルオレセインジガラクトシド（fluorescein digalactoside、ＦＤＧ）などの蛍光発生基質を使用する。
【0272】
本明細書に記載の発現カセットは、任意の形態であり得る。例えば、発現カセットは、ウイルスベクターなどのベクター又はプラスミド内にあり得る。発現カセットは、タンパク質又はＲＮＡの発現を指示することができる発現コンストラクト中のプロモーターと作動可能に連結され得る（例えば、上流のポリアデニル化シグナルの除去時）。代替的に、発現カセットは、標的化ベクター内にあり得る。例えば、標的化ベクターは、発現カセットに隣接する相同性アームを含むことができ、相同性アームは、ゲノム組み込み及び／又は内因性配列の置換を容易にするために、所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを指示するために好適である。
【0273】
本明細書に記載される発現カセットは、インビトロであり得るか、エクスビボで細胞（例えば、胚性幹細胞）内にあり得る（例えば、ゲノムに組み込まれるか、若しくは染色体外である）か、又はインビボで生物（例えば、非ヒト動物）内にあり得る（例えば、ゲノムに組み込まれるか、若しくは染色体外である）。エクスビボである場合、発現カセットは、胚性幹細胞（例えば、マウス若しくはラット胚性幹細胞）又は人工多能性幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）などの全能性細胞などの任意の生物由来の任意の種類の細胞にあり得る。インビボである場合、発現カセットは、任意の種類の生物（例えば、本明細書の他の場所に更に記載される非ヒト動物）にあり得る。
【0274】
触媒的に不活性なＣａｓタンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号４４に記載されるｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。任意選択的に、核酸は、配列番号５７に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる（任意選択的に、配列は、配列番号４４に記載されるｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【0275】
キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号４３に記載されるＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。任意選択的に、核酸は、配列番号５８に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる（任意選択的に、配列は、配列番号４３に記載されるｄＣａｓ９タンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【0276】
アダプターをコードする核酸の具体的な例は、配列番号４９に記載されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。任意選択的に、核酸は、配列番号５９に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる（任意選択的に、配列は、配列番号４４に記載されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【0277】
キメラアダプタータンパク質をコードする核酸の具体的な例は、配列番号４８に記載されるキメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。任意選択的に、核酸は、配列番号６０に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる（任意選択的に、配列は、配列番号４８に記載されるキメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【0278】
転写活性化ドメインをコードする核酸の具体的な例は、それぞれ、配列番号４５、５０、又は５１に記載されるＶＰ６４、ｐ６５、又はＨＳＦ１配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、本質的になるか、又はそれからなることができる。任意選択的に、核酸は、それぞれ、配列番号６１、６２、又は６３に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる（任意選択的に、配列は、それぞれ、配列番号４５、５５、又は５１に記載されるＶＰ６４、ｐ６５、又はＨＳＦ１配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるタンパク質をコードする）。
【0279】
１つの例示的な相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットは、５’から３’まで、（ａ）３’スプライシング配列、（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｃ）薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）コード配列）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル、（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｆ）キメラＣａｓタンパク質コード配列（例えば、ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４融合タンパク質又はＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４融合タンパク質）、（ｇ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａコード配列）、及び（ｅ）キメラアダプタータンパク質コード配列（例えば、ＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含む。別の例示的な相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットは、５’から３’まで、（ａ）３’スプライシング配列、（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｃ）薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）コード配列）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＰＧＫポリアデニル化シグナル及び３つのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの組み合わせなどのＰＧＫポリアデニル化シグナル及び／又はＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）、（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、（ｆ）キメラＣａｓタンパク質コード配列（例えば、ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４融合タンパク質又はＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４融合タンパク質）、（ｇ）２Ａタンパク質コード配列（例えば、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａコード配列）、（ｅ）キメラアダプタータンパク質コード配列（例えば、ＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１）、（ｆ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、及び（ｇ）別のポリアデニル化シグナル（例えば、ＢＧＨポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、図４Ａ及び配列番号６４（配列番号６９に記載されるコード配列及び配列番号６７に記載されるコードタンパク質）を参照されたい。
【0280】
１つの例示的な一般ガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、５’から３’まで、（ａ）３’スプライシング配列、（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｒｏｘ部位）、（ｃ）薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）コード配列）、（ｄ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＰＧＫポリアデニル化シグナル及び３つのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとの組み合わせなどのＰＧＫポリアデニル化シグナル及び／又はＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）、（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｒｏｘ部位）、（ｆ）１つ以上のガイドＲＮＡ遺伝子を含むガイドＲＮＡアレイ（例えば、第１のＵ６プロモーターに続いて第１のガイドＲＮＡコード配列及び第１のターミネーター配列、第２のＵ６プロモーターに続いて第２のガイドＲＮＡコード配列及び第２のターミネーター配列、並びに第３のＵ６プロモーターに続いて第３のガイドＲＮＡコード配列及び第３のターミネーター配列）を含む。例えば、配列番号６５を参照されたい。プロモーター及びガイドＲＮＡコード配列を含む、配列番号６５の領域は、配列番号７０に記載されている。ガイドＲＮＡアレイ発現カセット中のリコンビナーゼ認識部位は、ＳＡＭ発現カセット中のリコンビナーゼ認識部位と同じであるか、又は異なり得る（例えば、同じリコンビナーゼ又は異なるリコンビナーゼによって認識され得る）。
【0281】
別の例示的な一般ガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、１つ以上のガイドＲＮＡ遺伝子（例えば、第１のＵ６プロモーターに続いて第１のガイドＲＮＡコード配列、第２のＵ６プロモーターに続いて第２のガイドＲＮＡコード配列、並びに第３のＵ６プロモーターに続いて第３のガイドＲＮＡコード配列）を含む。そのような一般ガイドＲＮＡアレイ発現カセットは、配列番号７０に記載されている。
【0282】
Ｆ．組み込みのためのゲノム遺伝子座
本明細書に記載される核酸及び発現カセットは、非ヒト動物細胞又は非ヒト動物における標的ゲノム遺伝子座においてゲノムに組み込むことができる。遺伝子を発現することが可能な任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
本明細書に記載される核酸及び発現カセットは、非ヒト動物細胞又は非ヒト動物における標的ゲノム遺伝子座においてゲノムに組み込むことができる。遺伝子を発現することが可能な任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
【0283】
本明細書に記載される核酸又はカセットを安定的に組み込むことができる標的ゲノム遺伝子座の例は、非ヒト動物細胞又は非ヒト動物のゲノム中のセーフハーバー遺伝子座である。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの間の相互作用は、組み込みの信頼性及び安全性を制限し得、標的遺伝子修飾に起因するものではなく、代わりに、周囲の内因性遺伝子に対する組み込みの意図しない影響に起因する、明白な表現型効果につながり得る。例えば、ランダムに挿入された導入遺伝子は、位置効果及びサイレンシングの影響を受けやすく、その発現が信頼できず、予測できないものになり得る。同様に、外因性ＤＮＡの染色体遺伝子座への組み込みは、周囲の内因性遺伝子及びクロマチンに影響を及ぼし、それによって、細胞の挙動及び表現型を改変し得る。セーフハーバー遺伝子座には、導入遺伝子又は他の外因性核酸挿入が、細胞の挙動又は表現型を明白に改変することなく（すなわち、宿主細胞にいずれの有害な影響も及ぼすことなく）、全ての目的の組織で安定的かつ確実に発現され得る、染色体遺伝子座が含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：５１－５８を参照されたい。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座であり得る。例えば、セーフハーバー遺伝子座には、内因性遺伝子の構造又は発現に悪影響を及ぼすことなく、外因性ＤＮＡが予測可能な方法で組み込まれて機能することができる、染色体遺伝子座が含まれ得る。セーフハーバー遺伝子座には、必須ではないか、不必要であるか、又は明白な表現型の結果なしに破壊され得る遺伝子内の遺伝子座などの遺伝子外領域又は遺伝子内領域が含まれ得る。
【0284】
例えば、ヒトにおけるＲｏｓａ２６遺伝子座及びその同等物は、全ての組織において開放クロマチン構成を提供し、胚発生中及び成体において遍在的に発現される。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３７８９－３７９４を参照されたい。加えて、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を高い効率で標的化することができ、Ｒｏｓａ２６遺伝子の破壊は、明白な表現型を産生しない。セーフハーバー遺伝子座の他の例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、及びアルブミンが挙げられる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、並びに米国特許公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／００２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１７７９６０号、及び同第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。Ｒｏｓａ２６遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座の二対立遺伝子標的化には負の結果がないため、異なる遺伝子又はレポーターを２つのＲｏｓａ２６対立遺伝子に標的化することができる。一例では、発現カセットが、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンなどのＲｏｓａ２６遺伝子座のイントロンに組み込まれる。例えば、図５を参照されたい。
【0285】
標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた発現カセットを、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結することができるか、又は標的ゲノム遺伝子座に対して異種である外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。一例では、キメラＣａｓタンパク質発現カセット、キメラアダプタータンパク質発現カセット、又は相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）に組み込まれ、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーター（例えば、Ｒｏｓａ２６プロモーター）に作動可能に連結される。別の例では、ガイドＲＮＡ発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座）に組み込まれ、１つ以上の異種プロモーター（例えば、各ガイドＲＮＡコード配列の上流の異なるＵ６プロモーターなどのＵ６プロモーター）に作動可能に連結される。
【0286】
ＩＶ．ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物及び非ヒト動物細胞を使用するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、ＭＹＯＣ発現を増加させる、眼圧を上昇させる、緑内障をモデル化する、又はインビボ若しくはエクスビボあるいはインビトロでヒトＭＹＯＣ標的化試薬（例えば、治療分子若しくは複合体）若しくは候補緑内障治療剤の送達若しくは有効性を評価若しくは最適化するためのものであり得る。非ヒト動物及び非ヒト動物細胞が、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むため、非ヒト動物及び非ヒト動物細胞は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬の有効性をより正確に反映する。本明細書に開示される非ヒト動物は、ランダムなゲノム遺伝子座でのヒトＭＹＯＣ配列のトランスジェニック挿入ではなく、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含み、かつヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、人工ｃＤＮＡ配列ではなく、コード領域及び非コード領域の両方からの（例えば、エキソン領域及びイントロン領域の両方からの）対応するヒトゲノムＭＹＯＣ配列を含むため、そのような非ヒト動物及び非ヒト動物細胞は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子を標的とするように設計されたゲノム編集試薬を試験するために特に有用である。そのような非ヒト動物はまた、本明細書に開示される非ヒト動物が、緑内障患者で観察される表現型を反映する眼圧の上昇の表現型を示すため、候補緑内障治療剤を試験するために特に有用である。
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物及び非ヒト動物細胞を使用するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、ＭＹＯＣ発現を増加させる、眼圧を上昇させる、緑内障をモデル化する、又はインビボ若しくはエクスビボあるいはインビトロでヒトＭＹＯＣ標的化試薬（例えば、治療分子若しくは複合体）若しくは候補緑内障治療剤の送達若しくは有効性を評価若しくは最適化するためのものであり得る。非ヒト動物及び非ヒト動物細胞が、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むため、非ヒト動物及び非ヒト動物細胞は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬の有効性をより正確に反映する。本明細書に開示される非ヒト動物は、ランダムなゲノム遺伝子座でのヒトＭＹＯＣ配列のトランスジェニック挿入ではなく、ヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座を含み、かつヒト化内因性ＭＹＯＣ遺伝子座は、人工ｃＤＮＡ配列ではなく、コード領域及び非コード領域の両方からの（例えば、エキソン領域及びイントロン領域の両方からの）対応するヒトゲノムＭＹＯＣ配列を含むため、そのような非ヒト動物及び非ヒト動物細胞は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子を標的とするように設計されたゲノム編集試薬を試験するために特に有用である。そのような非ヒト動物はまた、本明細書に開示される非ヒト動物が、緑内障患者で観察される表現型を反映する眼圧の上昇の表現型を示すため、候補緑内障治療剤を試験するために特に有用である。
【0287】
Ａ．ＭＹＯＣの発現を増加させるか、眼圧を上昇させるか、又は緑内障をモデル化する方法
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び本明細書の他の場所に記載されるＳＡＭ発現カセットを含む、非ヒト動物を使用して、ＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）の発現を増加させるか、眼圧を上昇させるか、又はインビボで緑内障をモデル化するために、様々な方法が提供される。ＭＹＯＣ発現を増加させるか、眼圧を上昇させるか、又は緑内障をモデル化するためのそのような方法は、本明細書の他の場所に記載される１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物に投与し、それによって、ＭＹＯＣの発現を増加させることを含むことができる。本方法は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現及び／又はタンパク質発現を増加させることができる。ＭＹＯＣ発現を増加させるためのそのような方法はまた、本明細書の他の場所に記載されるように、１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物細胞に投与することによって、非ヒト動物細胞におけるＭＹＯＣ発現を増加させるためのものであり得る。
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び本明細書の他の場所に記載されるＳＡＭ発現カセットを含む、非ヒト動物を使用して、ＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）の発現を増加させるか、眼圧を上昇させるか、又はインビボで緑内障をモデル化するために、様々な方法が提供される。ＭＹＯＣ発現を増加させるか、眼圧を上昇させるか、又は緑内障をモデル化するためのそのような方法は、本明細書の他の場所に記載される１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物に投与し、それによって、ＭＹＯＣの発現を増加させることを含むことができる。本方法は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現及び／又はタンパク質発現を増加させることができる。ＭＹＯＣ発現を増加させるためのそのような方法はまた、本明細書の他の場所に記載されるように、１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物細胞に投与することによって、非ヒト動物細胞におけるＭＹＯＣ発現を増加させるためのものであり得る。
【0288】
１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含むことができ、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらをヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座内の標的配列に誘導し、それによって、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を増加させる。
【0289】
そのような方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与した後に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるＭＹＯＣメッセンジャーＲＮＡの発現を測定すること、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質の発現を測定することを更に含むことができる。
【0290】
いくつかの方法では、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍）増加する。いくつかの方法では、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現は、少なくとも約２倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約３倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約４倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約５倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約６倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約７倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約８倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約９倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約２倍～少なくとも約２０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１０倍～少なくとも約１５倍増加する。ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、小柱網、又は角膜にあり得る。具体的な例では、発現の増加は、輪部リングにある。
【0291】
いくつかの方法では、非ヒト動物は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与後に、緑内障の１つ以上の兆候又は症状を発症する。緑内障は、結果として生じる不可逆的な視力喪失を伴う、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索の進行性喪失を特徴とする慢性視神経症である。緑内障の主な危険因子は、眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。ＩＯＰの上昇は、小柱網（ＴＭ）の構造を通した房水流出に対する抵抗の増加によって引き起こされる。房水は、毛様体によって作製され、前房を循環し、ＴＭ網を通して流出する。ほとんどの緑内障症例では、ＴＭにおける房水に対する抵抗の増加がある。病原性ＭＹＯＣ変異タンパク質は、細胞内で凝集し、小柱網（ＴＭ）応力、ＩＯＰの上昇、及び緑内障につながる。
【0292】
そのような方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与した後に、眼圧（ＩＯＰ）を測定することを更に含むことができる。一例では、本方法は、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、又は少なくとも約２２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇ）であるＩＯＰをもたらす。一例では、本方法は、約１５～約２２、約１６～約２２、約１７～約２２、約１８～約２２、約１９～約２２、約１５～約２１、約１５～約２０、又は約１６～約２１ｍｍＨｇ（例えば、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、１５～２１、１５～２０、又は１６～２１ｍｍＨｇ）であるＩＯＰをもたらす。
【0293】
いくつかの方法では、ＩＯＰは、１つ以上のガイドＲＮＡ若しくは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与前に対して、又は対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、若しくは野生型非ヒト動物）に対して、ある特定の量だけ増加する。一例では、ＩＯＰは、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ）増加する。一例では、ＩＯＰは、約１～約７、約２～約７、約３～約７、約４～約７、約５～約７、約１～約６、約２～約６、約３～約６、約４～約６、又は約５～約６ｍｍＨｇ（例えば、１～６、２～６、３～６、４～６、又は５～６ｍｍＨｇ）増加する。
【0294】
ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、任意の形態で、任意の送達ビヒクルで、かつ任意の投与経路によって投与する（細胞に導入するか、又はガイドＲＮＡ若しくはＤＮＡが非ヒト動物における細胞の内部へのアクセスを獲得するように動物に導入する）ことができる。例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与は、いくつかの方法では、アデノウイルス媒介送達（例えば、組換えアデノウイルス５型（adenovirus type 5、Ａｄ５））、レンチウイルス媒介送達、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、又は脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）媒介送達を含むことができる。一例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの用量で）ＬＮＰ媒介送達を介して投与される。別の例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＡＡＶ媒介送達を介して（例えば、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆなどの眼に送達するための血清型を有するＡＡＶを使用して）投与される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして投与することができるか、又はＤＮＡとして投与することができる。ＤＮＡとして投与される場合、各ガイドＲＮＡコード配列を、一例では、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結することができる。ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、任意の好適な投与経路によって投与することができる。一例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、硝子体内注入又は前房内注射を介して投与することができる。
【0295】
いくつかの方法では、ガイドＲＮＡの標的配列は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座内に調節配列を含むことができる。例えば、調節配列は、プロモーター又はエンハンサーを含むことができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡの標的配列は、遺伝子修飾された内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の転写開始部位の２００塩基対内にあり得るか、又は転写開始部位の２００塩基対上流及び転写開始部位の１塩基対下流の領域内にあり得る。
【0296】
いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは各々、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合要素を含む。例えば、第１のアダプター結合要素は、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり得、第２のアダプター結合要素は、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり得る。具体的な例では、各ガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり得、第１のループは、配列番号７７、７９、８１、又は８２の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号７７、７９、８１、又は８２の残基５３～５６に対応するステムループ２である。別の具体的な例では、アダプター結合要素は、配列番号５２に記載される配列を含む。別の具体的な例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、配列番号６６、６８、７１、又は７２に記載される配列を含む。
【0297】
一例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５のうちのいずれか１つに記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９６～１０１のうちのいずれか１つに記載される配列を含むことができる。別の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４のうちのいずれか１つに記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９９～１００のうちのいずれか１つに記載される配列を含むことができる。別の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９９に記載される配列を含むことができる。
【0298】
いくつかの方法では、１つ以上のガイドＲＮＡは、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする複数のガイドＲＮＡ（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする少なくとも２つ又は少なくとも３つのガイドＲＮＡ）を含む。
【0299】
Ｂ．ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の有効性を試験する方法
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物又は非ヒト動物細胞を使用して、インビボ又はエクスビボ若しくはインビトロでヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の送達又は有効性を評価するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物にヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を導入することと、（ｂ）ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補治療剤の活性を評価することと、を含むことができる。同様に、そのような方法は、（ａ）非ヒト動物細胞にヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を導入することと、（ｂ）ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補治療剤の活性を評価することと、を含むことができる。評価は、例えば、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤を投与されなかったヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む対照非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞と比較するか、又はヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の投与前の非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞と比較することができる。
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物又は非ヒト動物細胞を使用して、インビボ又はエクスビボ若しくはインビトロでヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の送達又は有効性を評価するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物にヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を導入することと、（ｂ）ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補治療剤の活性を評価することと、を含むことができる。同様に、そのような方法は、（ａ）非ヒト動物細胞にヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を導入することと、（ｂ）ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補治療剤の活性を評価することと、を含むことができる。評価は、例えば、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤を投与されなかったヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む対照非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞と比較するか、又はヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の投与前の非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞と比較することができる。
【0300】
非ヒト動物又は非ヒト動物細胞がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター系成分も含む方法では、そのような方法は、ステップ（ａ）の前に、本明細書の他の場所に記載される１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に投与することを更に含むことができ、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合要素を含み、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、キメラＣａｓタンパク質及びキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、それらをヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座内の標的配列に誘導し、それによって、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を増加させる。評価するステップが、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与されなかった対照非ヒト動物又は非ヒト動物細胞と比較して実施される場合、本方法は、本明細書の他の場所に記載される１つ以上のガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを対照非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に投与することを更に含むことができる。
【0301】
ステップ（ａ）の前に、本明細書の他の場所に記載される１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に投与することを更に含む、方法では、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡ又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与するステップと、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与するステップとの間に、任意の好適な時間量が生じ得る。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、又は少なくとも約３０日後に投与することができる。別の例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから約１日～約２日、約１日～約３日、約１日～約４日、約１日～約５日、約１日～約６日、約１日～約７日、約１日～約８日、約１日～約９日、約１日～約１０日、約１日～約１５日、約１日～約２０日、約１日～約２５日、又は約１日～約３０日後に投与される。別の例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから約１日～約３０日、約２日～約３０日、約３日～約３０日、約４日～約３０日、約５日～約３０日、約６日～約３０日、約７日～約３０日、約８日～約３０日、約９日～約３０日、約１０日～約３０日、約１５日～約３０日、約２０日～約３０日、又は約２５日～約３０日後に投与される。別の例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、又は少なくとも約１５週間後に投与することができる。別の例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから約１週間～約２週間、約１週間～約３週間、約１週間～約４週間、約１週間～約５週間、約１週間～約６週間、約１週間～約７週間、約１週間～約８週間、約１週間～約９週間、約１週間～約１０週間、又は約１週間～約１５週間後に投与される。別の例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与してから約１週間～約１５週間、約２週間～約１５週間、約３週間～約１５週間、約４週間～約１５週間、約５週間～約１５週間、約６週間～約１５週間、約７週間～約１５週間、約８週間～約１５週間、約９週間～約１５週間、又は約１０週間～約１５週間後に投与される。
【0302】
そのような方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与した後、かつヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与する前に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるＭＹＯＣメッセンジャーＲＮＡの発現を測定すること、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるミオシリンタンパク質の発現を測定することを更に含むことができる。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はミオシリンタンパク質の発現が増加するまで投与されない。
【0303】
いくつかの方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ若しくは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与前に対して、又は対照非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物若しくは非ヒト動物細胞）に対して、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の増加が観察されるまで、投与されない。いくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも約１５倍（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも約１４倍、又は少なくとも１５倍）増加するまで投与されない。いくつかの非ヒト動物又は非ヒト動物細胞では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現が少なくとも約２倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約３倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約４倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約５倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約６倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約７倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約８倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約９倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約１０倍～少なくとも約２５倍、少なくとも約２倍～少なくとも約２０倍、少なくとも約２倍～少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１０倍～少なくとも約１５倍増加するまで投与されない。対照非ヒト動物に対する増加したヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現は、眼、輪部リング、網膜、毛様体、小柱網、又は角膜にあり得る。具体的な例では、発現の増加は、輪部リングにある。
【0304】
いくつかの方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、緑内障の１つ以上の兆候又は症状が観察されるまで投与される。緑内障は、結果として生じる不可逆的な視力喪失を伴う、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索の進行性喪失を特徴とする慢性視神経症である。緑内障の主な危険因子は、眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。ＩＯＰの上昇は、小柱網（ＴＭ）の構造を通した房水流出に対する抵抗の増加によって引き起こされる。房水は、毛様体によって作製され、前房を循環し、ＴＭ網を通して流出する。ほとんどの緑内障症例では、ＴＭにおける房水に対する抵抗の増加がある。病原性ＭＹＯＣ変異タンパク質は、細胞内で凝集し、小柱網（ＴＭ）応力、ＩＯＰの上昇、及び緑内障につながる。
【0305】
そのような方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与した後、かつヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与する前に、眼圧（ＩＯＰ）を測定することを更に含むことができる。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ＩＯＰがある特定のレベルに達するまで投与されない。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ＩＯＰが少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、又は少なくとも約２２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２ｍｍＨｇ）になるまで投与されない。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ＩＯＰが約１５～約２２、約１６～約２２、約１７～約２２、約１８～約２２、約１９～約２２、約１５～約２１、約１５～約２０、又は約１６～約２１ｍｍＨｇ（例えば、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、１５～２１、１５～２０、又は１６～２１ｍｍＨｇ）になるまで投与されない。
【0306】
そのような方法は、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡを投与した後、かつヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤を投与する前に、眼圧（ＩＯＰ）を測定することを更に含むことができる。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、１つ以上のガイドＲＮＡ若しくは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与前に対して、又は対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、若しくは野生型非ヒト動物）に対して、ＩＯＰが上昇するまで投与されない。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ＩＯＰが対照ベースラインを少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６ｍｍＨｇ）上回るまで投与されない。一例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ＩＯＰが対照ベースライン（例えば、１～６、２～６、３～６、４～６、又は５～６ｍｍＨｇ）を約１～約７、約２～約７、約３～約７、約４～約７、約５～約７、約１～約６、約２～約６、約３～約６、約４～約６、又は約５～約６ｍｍＨｇ上回るまで投与されない。対照ベースラインは、例えば、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、若しくは野生型非ヒト動物におけるＩＯＰであり得るか、又は１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡの投与前の本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有する非ヒト動物におけるＩＯＰであり得る。
【0307】
ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、任意の形態で、任意の送達ビヒクルで、かつ任意の投与経路によって投与する（細胞に導入するか、又はガイドＲＮＡ若しくはＤＮＡが非ヒト動物における細胞の内部へのアックセスを獲得するように動物に導入する）ことができる。例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡの投与は、いくつかの方法では、アデノウイルス媒介送達（例えば、組換えアデノウイルス５型（Ａｄ５））、レンチウイルス媒介送達、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達を含むことができる。一例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの用量で）ＬＮＰ媒介送達を介して投与される。別の例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＡＡＶ媒介送達を介して（例えば、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆなどの眼に送達するための血清型を有するＡＡＶを使用して）投与される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして投与することができるか、又はＤＮＡとして投与することができる。ＤＮＡとして投与される場合、各ガイドＲＮＡコード配列を、一例では、異なるＵ６プロモーターに作動可能に連結することができる。ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、任意の好適な投与経路によって投与することができる。一例では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、硝子体内注入又は前房内注射を介して投与することができる。
【0308】
いくつかの方法では、ガイドＲＮＡの標的配列は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座内に調節配列を含むことができる。例えば、調節配列は、プロモーター又はエンハンサーを含むことができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡの標的配列は、遺伝子修飾された内因性ＭＹＯＣ遺伝子座の転写開始部位の２００塩基対内にあり得るか、又は転写開始部位の２００塩基対上流及び転写開始部位の１塩基対下流の領域内にあり得る。
【0309】
いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは各々、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合要素を含む。例えば、第１のアダプター結合要素は、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり得、第２のアダプター結合要素は、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり得る。具体的な例では、各ガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり得、第１のループは、配列番号７７、７９、８１、又は８２の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号７７、７９、８１、又は８２の残基５３～５６に対応するステムループ２である。別の具体的な例では、アダプター結合要素は、配列番号５２に記載される配列を含む。別の具体的な例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、配列番号６６、６８、７１、又は７２に記載される配列を含む。
【0310】
一例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９０～９５のうちのいずれか１つに記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９６～１０１のうちのいずれか１つに記載される配列を含むことができる。別の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９３～９４のうちのいずれか１つに記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９９～１００のうちのいずれか１つに記載される配列を含むことができる。別の例では、ガイドＲＮＡは、配列番号９３に記載される配列を含む、配列を標的とすることができる。同様に、ガイドＲＮＡは、配列番号９９に記載される配列を含むことができる。
【0311】
いくつかの方法では、１つ以上のガイドＲＮＡは、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする複数のガイドＲＮＡ（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする少なくとも２つ又は少なくとも３つのガイドＲＮＡ）を含む。
【0312】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトＭＹＯＣ標的化抗体若しくは抗原結合タンパク質、又はヒトミオシリンタンパク質を標的とする任意の他の大分子若しくは小分子であり得る。ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子座（ヒトＭＹＯＣ遺伝子）、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、又はヒトミオシリンタンパク質を標的とする任意の生物又は化学剤であり得る。同様に、候補緑内障治療剤は、抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は任意の他の大分子若しくは小分子であり得る。代替的に、候補緑内障治療剤は、任意の生物又は化学剤であり得る。ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の例は、本明細書の他の場所に開示されている。
【0313】
候補緑内障治療剤は、既知の緑内障治療剤、推定緑内障治療剤、又は緑内障治療活性についてスクリーニングされている薬剤であり得る。一例では、候補緑内障治療剤は、房水形成を抑制するか、又は房水の流出を増加させる薬剤であり得る。一例は、チモロール（房水形成を抑制するベータ遮断薬）である。別の例は、ＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）（房水の流出を増加させるＲＯＣＫ阻害剤）である。
【0314】
一例では、候補緑内障治療剤は、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬であり得る。ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬又はマウスＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬であり得る。ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、ＡＮＧＰＴＬ７タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ７遺伝子、又はＡＮＧＰＴＬ７ｍＲＮＡを標的とする任意の試薬であり得る。ヒトＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、例えば、既知のＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬であり得るか、推定ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬（例えば、ＡＮＧＰＴＬ７を標的とするように設計された候補試薬）であり得るか、又はＡＮＧＰＴＬ７標的化活性についてスクリーニングされている試薬であり得る。
【0315】
アンジオポエチン関連タンパク質７（アンジオポエチン様因子、アンジオポエチン様タンパク質７、角膜由来転写産物６タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ７、ＡＮＧＸ、及びＣＤＴ６としても知られている）は、ＡＮＧＰＴＬ７遺伝子（ＣＤＴ６としても知られている）によってコードされる。ＡＮＧＰＴＬ７は、細胞外マトリックスの形成及び組織化において役割を有する、角膜の間質層で最初に発見されたアンジオポエチン関連ファミリーの分泌性糖タンパク質（４９～５５ｋＤａ）である。ＡＮＧＰＴＬ７ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質は、角膜実質細胞において豊富に発現され、血管新生の負の調節因子として角膜の無血管性及び透明性を維持することに関与する。ＡＮＧＰＴＬ７発現は、房水流出能の調節に関連する眼組織であるヒト小柱網細胞（ＴＭ）においてデキサメタゾン（dexamethasone、ＤＥＸ）によって上方制御される。ゲノムワイド関連研究（genome-wide association study、ＧＷＡＳ）は、ＡＮＧＰＴＬ７におけるある特定の稀なタンパク質改変バリアント（Ｇｌｎ１７５Ｈｉｓ及びＡｒｇ２２０Ｃｙｓを含む）が、より低い緑内障リスクを有することを明らかにし、より低いＩＯＰによって付与される防御機構を示唆している。
【0316】
ヒトＡＮＧＰＴＬ７は、第１染色体上の１ｐ３６．２２にマッピングする（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０２１８、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３８．ｐ１４（ＧＣＦ＿０００００１４０５．４０）、位置ＮＣ＿０００００１．１１（１１１８９３５５．．１１１９５９８１））。野生型ヒトアンジオポエチン関連タンパク質７には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３８２７及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６６９６９．１が割り当てられている。
【0317】
マウスＡｎｇｐｔｌ７は、第４染色体上の４；４ Ｅ２にマッピングする（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ６５４８１２、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｍ３９（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２７）、位置ＮＣ＿００００７０．７（１４８５７９７３７．．１４８５８４９１９、補体））。野生型マウスアンジオポエチン関連タンパク質７には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８Ｒ１Ｑ３及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０３４６４３．１が割り当てられている。
【0318】
ラットＡｎｇｐｔｌ７は、第５染色体上の５ｑ３６にマッピングする（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０２５５２０５５、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍＲａｔＢＮ７．２（ＧＣＦ＿０１５２２７６７５．２）、位置ＮＣ＿０５１３４０．１（１５８９３２０９４．．１５８９３７５９７、補体））。野生型ラットアンジオポエチン関連タンパク質７タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｄ３ＺＤＫ４及びＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００６２３９４８６．１が割り当てられている。
【0319】
例えば、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、ＡＮＧＰＴＬ７タンパク質（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７タンパク質）のエピトープを標的とする抗原結合タンパク質であり得る。同様に、候補緑内障治療剤は、抗原結合タンパク質であり得る。「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原に結合する任意のタンパク質を含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、又はデイビスボディ（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号）が挙げられる。他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬には、ヒトミオシリンタンパク質を標的とする小分子が含まれる。同様に、他の候補緑内障治療剤には、任意の好適な標的を標的とする小分子が含まれる。
【0320】
他のＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬（例えば、ヒトＮＧＰＴＬ７標的化試薬）には、ＡＮＧＰＴＬ７遺伝子内の認識部位を切断するヌクレアーゼ剤（例えば、クラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nuclease、ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease、ＴＡＬＥＮ））などのゲノム編集試薬が含まれ得る。同様に、ＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬は、ＡＮＧＰＴＬ７遺伝子と再結合するように設計された外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（single-stranded oligodeoxynucleotide、ｓｓＯＤＮ））であり得る。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ヌクレアーゼ剤又は外因性ドナー核酸などのゲノム編集試薬が含まれる。
【0321】
他のＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬）には、ＲＮＡｉ剤が含まれ得る。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＲＮＡｉ剤が含まれ得る。「ＲＮＡｉ剤」は、配列特異的様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的ＲＮＡの翻訳の分解又は阻害を促進することが可能な小さい二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。ＲＮＡｉ剤のオリゴヌクレオチドは、結合したヌクレオシドのポリマーであり、各々を独立して修飾することも、修飾しないこともできる。ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉機構を介して機能する（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又はＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用される場合、主にＲＮＡ干渉機構を通して作動すると考えられているが、開示されたＲＮＡｉ剤は、いずれの特定の経路又は作用機序にも拘束又は限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、低分子干渉ＲＮＡ（short interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（micro RNA、ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡの配列（すなわち、標準的な命名法を使用して一連の文字で記載された核酸塩基又はヌクレオチドの連続又は順序）に少なくとも部分的に相補的である。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＲＮＡｉ剤が含まれ得る。
【0322】
他のＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬）には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）が含まれ得る。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＡＳＯが含まれ得る。一本鎖ＡＳＯ及びＲＮＡ干渉（RNA interference、ＲＮＡｉ）は、オリゴヌクレオチドがワトソン・クリック塩基対合を通して標的ＲＮＡに結合するという基本原理を共有する。理論に縛られることを望まないが、ＲＮＡｉの間に、低分子ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡｉ剤）がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex、ＲＩＳＣ）と結合し、一方の鎖（パッセンジャー鎖）が失われ、残りの鎖（ガイド鎖）が失われるＲＩＳＣと協力して相補的ＲＮＡに結合する。次に、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Argonaute 2、Ａｇｏ２）が標的ＲＮＡを切断する。ガイド鎖は、常に相補的センス鎖又はタンパク質（ＲＩＳＣ）のいずれかに関連付けられている。対照的に、ＡＳＯは生き残り、一本鎖として機能する必要がある。ＡＳＯは、標的ＲＮＡに結合し、リボソーム若しくはスプライシング因子などの他の因子がＲＮＡに結合するのを阻止するか、又はヌクレアーゼなどのタンパク質を動員する。異なる修飾及び標的領域が、所望の作用機序に基づいて、ＡＳＯに対して選択される。ギャップマーは、ＤＮＡの中央の８～１０塩基ギャップに隣接する各末端上に２～５つの化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ又は２’－ＭＯＥ）を含むＡＳＯオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡに結合した後、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ Ｈの基質として作用する。ヒトＭＹＯＣ標的化ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの例が公知である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ １：４３－４４、及びＣｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９（９）：８１９－８２９を参照されたい。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＡＳＯが含まれ得る。
【0323】
他のＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７標的化試薬）には、小分子試薬が含まれる。同様に、他の候補緑内障治療剤には、小分子試薬が含まれ得る。
【0324】
そのようなヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、任意の送達方法／ビヒクル（例えば、アデノウイルス（例えば、組換えＡｄ５）、レンチウイルス、ＡＡＶ、ＬＮＰ、又は注射）によって、かつ任意の投与経路（例えば、硝子体内注入又は前房内注射）によって投与することができる。複合体及び分子を送達する手段並びに投与経路は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。特定の方法では、試薬は、ＡＡＶ媒介送達を介して送達される。例えば、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆを使用して、眼を標的とすることができる。他の特定の方法では、試薬は、ＬＮＰ媒介送達によって送達される。用量は、任意の好適な用量であり得る。
【0325】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬の活性を評価するための方法が、周知であり、本明細書の他の場所で提供されている。活性の評価は、本明細書の他の場所に開示されるように、任意の細胞型、任意の組織型、又は任意の臓器型におけるものであり得る。いくつかの方法では、活性の評価は、眼細胞又は眼におけるものである。
【0326】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含むことができる。一例として、評価は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定することを含むことができる。これは、例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座内の挿入又は欠失の頻度を測定することを含むことができる。例えば、評価は、非ヒト動物から単離された１つ以上の細胞におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を配列決定すること（例えば、次世代シーケンシング）を含むことができる。評価は、非ヒト動物から標的臓器又は組織（例えば、眼）を単離すること、及び標的臓器又は組織におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含むことができる。評価はまた、標的臓器又は組織内の２つ以上の異なる細胞型におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含むことができる。同様に、評価は、非標的臓器又は組織（例えば、２つ以上の非標的臓器又は組織）を非ヒト動物から単離すること、及び非標的臓器又は組織におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することを含むことができる。候補緑内障治療剤がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法は、標的遺伝子座の修飾を評価することを含むことができる。
【0327】
そのような方法はまた、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によって産生されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することによるものを含むことができる。例えば、タンパク質レベルを、特定の細胞、組織、又は臓器型（例えば、眼）で測定することができる。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座から発現されるＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はミオシリンタンパク質の発現を評価するための方法が、本明細書の他の場所で提供され、周知である。
【0328】
１つの具体的な例として、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬がゲノム編集試薬（ヌクレアーゼ剤など）である場合、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座でのゲノム編集率（例えば、溶解した細胞のプールからＰＣＲ反応で読み取られた配列の総数に対して観察された挿入又は欠失の総数）を（例えば、眼細胞において）評価することができる。同様に、候補緑内障治療剤がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、標的遺伝子座での編集率（例えば、溶解した細胞のプールからＰＣＲ反応で読み取られた配列の総数に対して観察された挿入又は欠失の総数）を（例えば、眼細胞において）評価することができる。
【0329】
インビボで活性を評価するための上記で提供される様々な方法はまた、本明細書の他の場所に記載されるように、エクスビボで（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む眼において）、又はインビトロで（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含む細胞において）ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を評価するために使用することができる。
【0330】
いくつかの方法では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ剤などのヌクレアーゼ剤である。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒトＭＹＯＣ遺伝子を切断するように設計されたヌクレアーゼ剤（又はヌクレアーゼ剤をコードする核酸）（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質（又はＣａｓ９をコードする核酸）、及びヒトＭＹＯＣ遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ））を非ヒト動物に導入することと、（ｂ）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することと、を含むことができる。
【0331】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの場合、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＭＹＯＣｌ遺伝子座に誘導し、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、（例えば、ドナー配列が存在しない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して）細胞による修復を誘起するときに誘導される。
【0332】
任意選択的に、各々、ヒトＭＹＯＣ遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計された、２つ以上のガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入することができる。例えば、２つのガイドＲＮＡは、２つのガイドＲＮＡ標的配列の間のゲノム配列を切除するように設計することができる。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾は、第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座に誘導し、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座に誘導し、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断するときに誘導され、介在する配列の切除をもたらす。
【0333】
任意選択的に、ヒトＭＹＯＣ遺伝子と再結合し、かつそれを修飾することが可能な外因性ドナー核酸もまた、非ヒト動物に導入される。任意選択的に、ヌクレアーゼ剤又はＣａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に記載されているように、外因性ドナー核酸に係留され得る。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾は、例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座に誘導し、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座が外因性ドナー核酸と再結合して、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を修飾するときに誘導される。次いで、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座は、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）又はＮＨＥＪ媒介挿入を介して、外因性ドナー核酸で修復することができる。任意の種類の外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の場所に提供されている。
【0334】
Ｃ．ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の送達又は有効性を最適化する方法
非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物へのヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の送達を最適化するため、又はインビボでヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の活性若しくは有効性を最適化するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）上記に記載されるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の有効性を試験する方法を、第１の非ヒト動物又は第１の非ヒト動物細胞で１回目に実施することと、（ｂ）可変要素を変更し、変更された可変要素を用いて、当該方法を（すなわち、同じ種の）第２の非ヒト動物又は第２の細胞で２回目に実施することと、（ｃ）ステップ（ａ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を、ステップ（ｂ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含むことができる。
非ヒト動物細胞若しくは非ヒト動物へのヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の送達を最適化するため、又はインビボでヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤の活性若しくは有効性を最適化するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）上記に記載されるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の有効性を試験する方法を、第１の非ヒト動物又は第１の非ヒト動物細胞で１回目に実施することと、（ｂ）可変要素を変更し、変更された可変要素を用いて、当該方法を（すなわち、同じ種の）第２の非ヒト動物又は第２の細胞で２回目に実施することと、（ｃ）ステップ（ａ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を、ステップ（ｂ）におけるヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含むことができる。
【0335】
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の送達、有効性、又は活性を測定する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、そのような方法は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を測定することを含むことができる。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のより効果的な修飾は、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞内の望ましい効果に応じて異なることを意味し得る。例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のより効果的な修飾は、より高いレベルの修飾、より高い精度、より高い一貫性、又はより高い特異性のうちの１つ以上又は全てを意味し得る。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のより高いレベルの修飾（すなわち、より高い有効性）は、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、又は特定の標的臓器（例えば、眼）内で標的とされる細胞のより高いパーセンテージを指す。より高い精度は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のより正確な修飾（例えば、同じ修飾を有するか、又は余分な意図しない挿入及び欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）なしに所望の修飾を有する標的細胞のより高いパーセンテージ）を指す。より高い一貫性は、１つよりも多くの種類の細胞、組織、又は臓器が標的にされている（例えば、眼内のより多数の細胞型の修飾）場合、異なる種類の標的細胞、組織、又は臓器の間でヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座のより一貫した修飾を指す。特定の臓器が標的にされている場合、より高い一貫性はまた、臓器（例えば、眼）内の全ての位置の全体を通したより一貫性のある修飾を指し得る。より高い特異性は、標的とされるゲノム遺伝子座若しくは複数の遺伝子座に関するより高い特異性、標的とされる細胞型に関するより高い特異性、標的とされる組織型に関するより高い特異性、又は標的とされる臓器に関するより高い特異性を指すことができる。例えば、ゲノム遺伝子座の特異性の増加は、オフターゲットゲノム遺伝子座の修飾が少ないこと（例えば、標的ゲノム遺伝子座の修飾の代わりに、又はそれに加えて、意図しないオフターゲットゲノム遺伝子座に修飾を有する標的細胞のより低いパーセンテージ）を指す。同様に、細胞型、組織、又は臓器型の特異性の増加は、特定の細胞型、組織型、又は臓器型が標的にされている場合、オフターゲットの細胞型、組織型、又は臓器型の修飾が少ないことを指す。（例えば、特定の臓器（例えば、眼）が標的とされる場合、意図された標的ではない臓器又は組織の細胞の修飾が少ない）。
【0336】
代替的に、そのような方法は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はミオシリンタンパク質の発現を測定することを含むことができる。一例では、より効果的なヒトＭＹＯＣ標的化剤又は候補緑内障治療剤は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はミオシリンタンパク質発現の更なる低減をもたらす。代替的に、そのような方法は、ミオシリン活性を測定することを含むことができる。一例では、より効果的なヒトＭＹＯＣ標的化剤又は候補緑内障治療剤は、ミオシリン活性の更なる減少をもたらす。
【0337】
代替的に、そのような方法は、緑内障の１つ以上の兆候又は症状を測定することを含むことができる。一例では、より効果的なヒトＭＹＯＣ標的化剤又は候補緑内障治療剤は、緑内障の１つ以上の兆候又は症状の更なる減少をもたらす。例えば、そのような方法は、眼圧を測定することを含むことができる。一例では、より効果的なヒトＭＹＯＣ標的化剤又は候補緑内障治療剤は、眼圧の更なる減少をもたらす。
【0338】
変更される可変要素は、任意のパラメータであり得る。一例として、変更された可変要素は、１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤が細胞又は非ヒト動物に導入される、パッケージング又は送達方法／ビヒクルであり得る。ＬＮＰ及びＡＡＶなどの送達方法／ビヒクルの例は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、変更された可変要素は、ＡＡＶ血清型であり得る。代替的に、変更された変数は、送達されるＡＡＶの用量（例えば、約１０１１、約１０１２、約１０１３、又は約１０１４ｖｇ／ｋｇ体重）であり得る。同様に、投与は、ＬＮＰ媒介送達を含むことができ、変更された可変要素は、ＬＮＰ製剤であり得る。代替的に、投与は、ＬＮＰ媒介送達を含むことができ、変更された変数は、送達されるＬＮＰの用量（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。別の例として、変更された可変要素は、１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤を細胞又は非ヒト動物に導入するための投与経路であり得る。静脈内、硝子体内、実質内、及び鼻腔内注入などの投与経路の例は、本明細書の他の場所に開示されている。
【0339】
別の例として、変更された可変要素は、導入される１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤の濃度又は量であり得る。別の例として、変更された可変要素は、導入される別のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、又はＡＳＯ）の濃度又は量に対する、導入される１つのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、又はＡＳＯ）の濃度又は量であり得る。
【0340】
別の例として、変更された可変要素は、試薬の活性又は有効性を評価するタイミングに対する、１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤を導入するタイミングであり得る。別の例として、変更された可変要素は、１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤が導入される回数又は頻度であり得る。別の例として、変更された可変要素は、導入される別のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、又はＡＳＯ）の導入のタイミングに対する、導入される１つのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、又はＡＳＯ）の導入のタイミングであり得る。
【0341】
別の例として、変更された可変要素は、１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤が導入される形態であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態又はＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの形態、ＲＮＡの形態、又はタンパク質の形態（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している）で導入することができる。外因性ドナー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、線状、環状などであり得る。同様に、成分の各々は、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための修飾の様々な組み合わせを含むことができる。同様に、例えば、ＲＮＡｉ剤及びＡＳＯは、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどの修飾の様々な組み合わせを含むことができる。
【0342】
別の例として、変更された可変要素は、導入される１つ若しくは複数のヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は１つ若しくは複数の候補緑内障治療剤であり得る。例えば、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤がガイドＲＮＡを含む場合、変更された可変要素は、異なる配列（例えば、異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化する）を有する異なるガイドＲＮＡを導入することであり得る。同様に、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤がＲＮＡｉ剤又はＡＳＯを含む場合、変更された可変要素は、異なる配列を有する異なるＲＮＡｉ剤又はＡＳＯを導入することであり得る。同様に、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤がＣａｓタンパク質を含む場合、変更された可変要素は、異なるＣａｓタンパク質を導入すること（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、又は異なる配列（例えば、コドン最適化された）を有するが、同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入すること）であり得る。同様に、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤が外因性ドナー核酸を含む場合、変更された可変要素は、異なる配列を有する異なる外因性ドナー核酸（例えば、異なる挿入核酸又は異なる相同性アーム（例えば、より長い若しくはより短い相同性アーム、又はヒトＭＹＯＣ遺伝子の異なる領域を標的とする相同性アーム））を導入することであり得る。
【0343】
具体的な例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、Ｃａｓタンパク質、及びヒトＭＹＯＣ遺伝子中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを含む。そのような方法では、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ配列及び／又はガイドＲＮＡ標的配列であり得る。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡは各々、ＲＮＡの形態で投与することができ、変更された可変要素は、（例えば、ＬＮＰ製剤中の）ガイドＲＮＡに対するＣａｓ ｍＲＮＡの比であり得る。いくつかのそのような方法では、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ修飾パターンであり得る（例えば、修飾を含むガイドＲＮＡが、修飾を含まないガイドＲＮＡと比較される）。
【0344】
別の具体的な例では、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤は、ヒトＭＹＯＣを標的とするＲＮＡｉ剤又はＡＳＯ剤を含む。そのような方法では、変更された可変要素は、ＲＮＡｉ剤若しくはＡＳＯ剤配列、及び／又はＲＮＡｉ剤若しくはＡＳＯ剤標的配列であり得る。いくつかのそのような方法では、変更された変数は、ＲＮＡｉ剤又はＡＳＯ剤修飾パターンであり得る。
【0345】
Ｄ．ヒトＭＹＯＣ標的化試薬
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトミオシリンタンパク質、ヒトＭＹＯＣ遺伝子、又はヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡを標的とする任意の試薬であり得る。ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、例えば、既知のヒトＭＹＯＣ標的化試薬であり得るか、推定ヒトＭＹＯＣ標的化試薬（例えば、ヒトＭＹＯＣを標的とするように設計された候補試薬）であり得るか、又はヒトＭＹＯＣ標的化活性についてスクリーニングされている試薬であり得る。同様に、候補緑内障治療剤は、既知の緑内障治療剤、推定緑内障治療剤、又は緑内障治療活性についてスクリーニングされている薬剤であり得る。
ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトミオシリンタンパク質、ヒトＭＹＯＣ遺伝子、又はヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡを標的とする任意の試薬であり得る。ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、例えば、既知のヒトＭＹＯＣ標的化試薬であり得るか、推定ヒトＭＹＯＣ標的化試薬（例えば、ヒトＭＹＯＣを標的とするように設計された候補試薬）であり得るか、又はヒトＭＹＯＣ標的化活性についてスクリーニングされている試薬であり得る。同様に、候補緑内障治療剤は、既知の緑内障治療剤、推定緑内障治療剤、又は緑内障治療活性についてスクリーニングされている薬剤であり得る。
【0346】
例えば、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトミオシリンタンパク質のエピトープを標的とする抗原結合タンパク質であり得る。同様に、候補緑内障治療剤は、抗原結合タンパク質であり得る。「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原に結合する任意のタンパク質を含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、又はデイビスボディ（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号）が挙げられる。他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬には、ヒトミオシリンタンパク質を標的とする小分子が含まれる。同様に、他の候補緑内障治療剤には、任意の好適な標的を標的とする小分子が含まれる。
【0347】
他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬には、ヒトＭＹＯＣ遺伝子内の認識部位を切断するヌクレアーゼ剤（例えば、クラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））などのゲノム編集試薬が含まれ得る。同様に、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬は、ヒトＭＹＯＣ遺伝子と再結合するように設計された外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））であり得る。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ヌクレアーゼ剤又は外因性ドナー核酸などのゲノム編集試薬が含まれる。
【0348】
他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬にはＲＮＡｉ剤が含まれる。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＲＮＡｉ剤が含まれ得る。「ＲＮＡｉ剤」は、配列特異的様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的ＲＮＡの翻訳の分解又は阻害を促進することが可能な小さい二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。ＲＮＡｉ剤のオリゴヌクレオチドは、結合したヌクレオシドのポリマーであり、各々を独立して修飾することも、修飾しないこともできる。ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉機構を介して機能する（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又はＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用される場合、主にＲＮＡ干渉機構を通して作動すると考えられているが、開示されたＲＮＡｉ剤は、いずれの特定の経路又は作用機序にも拘束又は限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載されるＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡの配列（すなわち、標準的な命名法を使用して一連の文字で記載された核酸塩基又はヌクレオチドの連続又は順序）に少なくとも部分的に相補的である。
【0349】
他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれ得る。同様に、他の候補緑内障治療剤には、ＡＳＯが含まれ得る。一本鎖ＡＳＯ及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、オリゴヌクレオチドがワトソン・クリック塩基対合を通して標的ＲＮＡに結合するという基本原理を共有する。理論に縛られることを望まないが、ＲＮＡｉの間に、低分子ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡｉ剤）がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、一方の鎖（パッセンジャー鎖）が失われ、残りの鎖（ガイド鎖）が失われるＲＩＳＣと協力して相補的ＲＮＡに結合する。次に、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）が標的ＲＮＡを切断する。ガイド鎖は常に相補的センス鎖又はタンパク質（ＲＩＳＣ）のいずれかに関連付けられている。対照的に、ＡＳＯは生き残り、一本鎖として機能する必要がある。ＡＳＯは、標的ＲＮＡに結合し、リボソーム若しくはスプライシング因子などの他の因子がＲＮＡに結合するのを阻止するか、又はヌクレアーゼなどのタンパク質を動員する。異なる修飾及び標的領域が、所望の作用機序に基づいて、ＡＳＯに対して選択される。ギャップマーは、ＤＮＡの中央の８～１０塩基ギャップに隣接する各末端上に２～５つの化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ又は２’－ＭＯＥ）を含むＡＳＯオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡに結合した後、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ Ｈの基質として作用する。ヒトＭＹＯＣ標的化ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの例が公知である。例えば、各々、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ １：４３－４４、及びＣｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９（９）：８１９－８２９を参照されたい。
【0350】
他のヒトＭＹＯＣ標的化試薬には小分子試薬が含まれる。同様に、他の候補緑内障治療剤には、小分子試薬が含まれ得る。
【0351】
一例では、候補緑内障治療剤は、房水形成を抑制するか、又は房水の流出を増加させる薬剤であり得る。一例は、チモロール（房水形成を抑制するベータ遮断薬）である。別の例は、ＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）（房水の流出を増加させるＲＯＣＫ阻害剤）である。
【0352】
Ｅ．ヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤及び／若しくはＳＡＭガイドＲＮＡ並びに／又はリコンビナーゼ発現カセットを非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に投与すること
本明細書に開示される方法は、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に、核酸、タンパク質、核酸・タンパク質複合体、タンパク質複合体、又は小分子を含む、様々な分子（例えば、本明細書に記載される治療分子若しくは複合体及び／又はＳＡＭガイドＲＮＡ、又はＳＡＭガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ及び／若しくはリコンビナーゼあるいはリコンビナーゼをコードする核酸などのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤）を導入することを含むことができる。「導入すること」は、細胞の内部又は非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で、非ヒト動物細胞又は非ヒト動物に分子（例えば、核酸又はタンパク質）を提示することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、成分のうちの２つ以上（例えば、成分のうちの２つ、又は成分の全て）を、任意の組み合わせで同時に又は逐次的に細胞又は非ヒト動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞若しくは非ヒト動物に導入することができるか、又はガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入前に導入することができるか、又はＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、又は７２時間前又は後に投与することができる）。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０２４０２６３号及び米国特許出願公開第２０１５／０１１０７６２号を参照されたい。加えて、成分のうちの２つ以上を、同じ送達方法／ビヒクル又は異なる送達方法／ビヒクルによって細胞又は非ヒト動物に導入することができる。同様に、成分のうちの２つ以上を、同じ投与経路又は異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
本明細書に開示される方法は、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に、核酸、タンパク質、核酸・タンパク質複合体、タンパク質複合体、又は小分子を含む、様々な分子（例えば、本明細書に記載される治療分子若しくは複合体及び／又はＳＡＭガイドＲＮＡ、又はＳＡＭガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ及び／若しくはリコンビナーゼあるいはリコンビナーゼをコードする核酸などのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤）を導入することを含むことができる。「導入すること」は、細胞の内部又は非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で、非ヒト動物細胞又は非ヒト動物に分子（例えば、核酸又はタンパク質）を提示することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、成分のうちの２つ以上（例えば、成分のうちの２つ、又は成分の全て）を、任意の組み合わせで同時に又は逐次的に細胞又は非ヒト動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞若しくは非ヒト動物に導入することができるか、又はガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入前に導入することができるか、又はＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、又は７２時間前又は後に投与することができる）。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０２４０２６３号及び米国特許出願公開第２０１５／０１１０７６２号を参照されたい。加えて、成分のうちの２つ以上を、同じ送達方法／ビヒクル又は異なる送達方法／ビヒクルによって細胞又は非ヒト動物に導入することができる。同様に、成分のうちの２つ以上を、同じ投与経路又は異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
【0353】
いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分が、非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に導入される。ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ＲＮＡ）の形態で、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物又は細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物の細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下で、インビボで発現され得る。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現コンストラクト中にあり得る。例えば、そのような発現コンストラクトは、単一の核酸分子の成分であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の成分であり得る）。
【0354】
同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の目的の宿主細胞においてより高い使用頻度を有する代替コドンへと修飾することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が非ヒト動物に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一過性に、条件付きで、又は構成的に細胞内で発現され得る。
【0355】
Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現コンストラクトは、遺伝子又は他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在し得る。代替的に、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクター又はプラスミドであり得る。発現コンストラクトにおいて使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。任意選択的に、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質及び他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであり得る。そのような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、並びに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００７４５３５号を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
【0356】
非ヒト動物又は非ヒト動物細胞に導入された分子（例えば、Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡｉ剤あるいはＡＳＯ）は、導入された分子の安定性を増加させる担体（例えば、分解産物が閾値未満、例えば、出発核酸若しくはタンパク質の０．５重量％未満のままである、所与の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、若しくは周囲温度）での期間を延長するか、又はインビボでの安定性を増加させる）を含む、組成物で提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（cochleates）、及び脂質微小管が挙げられる。
【0357】
非ヒト動物細胞又は非ヒト動物への分子（例えば、核酸又はタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法及び組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法が公知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、及びウイルス媒介法が含まれる。
【0358】
トランスフェクションプロトコル、並びに分子を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション方法としては、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」７４（４）：１５９０－４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥ－デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、又はマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
【0359】
細胞への核酸又はタンパク質の導入はまた、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、又はヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改良されたエレクトロポレーション技術である。加えて、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションによる７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）系を使用して行われる。
【0360】
細胞（例えば、接合子）への分子（例えば、核酸又はタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。接合子（すなわち、１細胞期胚）では、マイクロインジェクションは母体及び／又は父方の前核又は細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、Ｃａｓタンパク質若しくはＣａｓタンパク質をコードするか又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核へのものが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核及び細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核／前核に導入し、最初の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい；またＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１５０２２－１５０２６及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１０９：９３５４－９３５９を参照されたい。
【0361】
分子（例えば、核酸又はタンパク質）を細胞又は非ヒト動物に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、又は埋め込み型デバイス媒介送達が含まれ得る。具体的な例としては、核酸又はタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、又は脂質微小管などの担体中で、細胞又は非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達のいくつかの具体的な例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達）、及び脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。
【0362】
核酸の導入はまた、アデノウイルス媒介送達（例えば、組換えＡｄ５）、ＡＡＶ媒介送達（例えば、組換えＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ）、又はレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によって達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、又は分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込むことができるか、又は代替的に宿主ゲノムに組み込まない。そのようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であり得、複製欠損性（例えば、ビリオン複製及び／又はパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠損がある）であり得る。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、又は３ヶ月）、又は永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）には、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、及び１０１６ベクターゲノム／ｍＬが含まれる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）には、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５、及び約１０１６ベクターゲノム（vector genome、ｖｇ）／ｋｇ体重が含まれる。
【0363】
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ及びＣａｐで構成され、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２つのＩＴＲの間に配置され、Ｒｅｐ及びＣａｐは、トランスで供給され得る。Ｒｅｐ及びＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、及びＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及びヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセル及び方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスに使用することができる。
【0364】
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、並びに、特にＡＡＶ８が含まれる。具体的な例では、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ血清型が使用される。
【0365】
指向性は、キャプシド及び異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによって更に洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが増強された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても修飾することができる。ＡＡＶ２の変異修飾の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、及びＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、及びＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異修飾の例には、Ｓ６６３Ｖ及びＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／修飾ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。
【0366】
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（self-complementary AAV、ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補的鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（single-stranded AAV、ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用することができる。
【0367】
パッケージング容量を増加させるために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスは、コンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増加させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子を２つのトランスファープラスミドに分割することができるが、共発現が相同組換え及び完全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
【0368】
核酸及びタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの組み合わせ、又はＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。そのような方法による送達は、一過性のＣａｓ発現をもたらし、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層及び多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、又は懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸又はタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電又は両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、及びナノ粒子がインビボで存在することができる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質の例は、本出願において、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０１０８４０（Ａ１）号に、見出され得る。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質及び１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質及びＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意選択の中性脂質、及びＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、又はＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
【0369】
ＬＮＰは、以下のうちの１つ以上又は全てを含有してもよい。（ｉ）カプセル化及びエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、及び（ｉｖ）ステルス脂質。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９及び国際公開第２０１７／１７３０５４（Ａ１）号を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。
【0370】
ＬＮＰの例示的な投与は、例えば、総ＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）カーゴ含有量に関して、約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８、又は約１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）を含む。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約１、約３、又は約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。
【0371】
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、又は筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口及び非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、及び腹腔内経路が含まれる。特定の例は、静脈内注入である。鼻腔内注入及び硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核又は被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回又はＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、又はニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、及び強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内又は硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減又は排除し得る。具体的な例では、インビボでの投与は、硝子体内注入又は前房内注射による。
【0372】
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、又は筋肉内を含む、任意の好適な経路によるものであり得る。具体的な例は、静脈内注入である。ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質（若しくはガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物は、１つ以上の生理学的及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
【0373】
投与の頻度及び投与回数は、いくつかある要因の中でもとりわけ、投与された分子の半減期及び投与経路に依存し得る。細胞又は非ヒト動物への、核酸又はタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回又は複数回、実施され得る。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、又はある期間にわたって少なくとも２０回、実施され得る。
【0374】
Ｆ．インビボ又はエクスビボでのヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の送達、活性、又は有効性の測定
本明細書に開示される方法は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を検出又は測定することを更に含むことができる。
本明細書に開示される方法は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤の活性を検出又は測定することを更に含むことができる。
【0375】
例えば、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤がゲノム編集試薬（例えば、ヒトＭＹＯＣ遺伝子座を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である場合、測定は、修飾についてヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を評価することを含むことができる。標的化遺伝子修飾を有する細胞を同定するために、様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子修飾（modification-of-allele、ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号、米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、米国特許出願公開第２０１６／０８１９２３号、及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ（quantitative PCR、ｑＰＣＲ）を介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（fluorescence-mediated in situ hybridization、ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、又はＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。次世代シーケンシング（next-generation sequencing、ＮＧＳ）もまた、スクリーニングに使用することができる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」又は「大規模並列シーケンシング」又は「ハイスループットシーケンシング」とも呼ばれ得る。標的化遺伝子修飾の正確な性質及びそれが細胞型又は組織型又は臓器型にわたって一貫しているかどうかを定義するために、ＭＯＡアッセイに加えてＮＧＳをスクリーニングツールとして使用することができる。
【0376】
非ヒト動物におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の修飾を評価することは、任意の組織又は臓器からの任意の細胞型におけるものであり得る。例えば、評価は、同じ組織若しくは臓器からの複数の細胞型、又は組織若しくは臓器内の複数の場所からの細胞におけるものであり得る。これは、標的組織若しくは臓器内のどの細胞型が標的とされているか、又は組織若しくは臓器のどのセクションがヒトＭＹＯＣ標的化試薬によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織又は複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、又は細胞型が標的とされている方法では、これは、その組織又は臓器がどれほど効果的に標的とされているか、及び他の組織又は臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
【0377】
試薬が、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を不活化するか、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現に影響を及ぼすか、ヒト化ＭＹＯＣ ｍＲＮＡの翻訳を防止するか、又はヒト化ミオシリンタンパク質を取り除くように設計されている場合、測定は、ヒト化ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を評価することを含むことができる。この測定は、例えば、眼内、又は眼内の特定の細胞型若しくは領域内におけるものであり得る。
【0378】
ヒト化ミオシリンタンパク質の産生を、任意の既知の手段によって評価することができる。例えば、既知のアッセイを使用して、非ヒト動物の眼におけるコードされたｍＲＮＡのレベル又は非ヒト動物の眼におけるコードされたタンパク質のレベルを測定することによって、発現を評価することができる。例えば、測定は、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤が非ヒト動物におけるミオシリンレベルを低減するかどうかを判定することであり得る。
【0379】
眼圧もまた、既知の手段によって評価することができ、緑内障の他の表現型もまた、既知の手段によって評価することができる。
【0380】
非ヒト動物における評価は、任意の組織又は臓器からの任意の細胞型におけるものであり得る。例えば、評価は、同じ組織若しくは臓器（例えば、眼）からの複数の細胞型、又は組織若しくは臓器内の複数の位置からの細胞におけるものであり得る。これは、標的組織若しくは臓器内のどの細胞型が標的とされているか、又は組織若しくは臓器のどのセクションがヒトＭＹＯＣ標的化試薬若しくは候補緑内障治療剤によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は、複数の種類の組織又は複数の臓器におけるものであり得る。特定の組織、臓器、又は細胞型が標的とされる方法では、これは、その組織又は臓器がどれほど効果的に標的とされるか、及び他の組織又は臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
【0381】
使用することができるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写産物を定量化することができる方法である、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（商標）及びＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（in situ hybridization、ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳ及びｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型及び編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性又はパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化することができる、単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供することができる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅するためのペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計及びシグナル増幅系により、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集及び変異を差次的に検出することができる。
【0382】
これらの表現型のうちのいずれかの評価は、月齢少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、又は少なくとも約１２ヶ月などの非ヒト動物の任意の年齢におけるものであり得る。
【0383】
これらの表現型のうちのいずれかの評価は、対照非ヒト動物と比較して行うことができる。対照非ヒト動物は、例えば、試験非ヒト動物と同じ年齢、及び／又は試験非ヒト動物と同じ性別であり得る。これらの表現型のうちのいずれかの評価はまた、ヒトＭＹＯＣ標的化試薬又は候補緑内障治療剤で治療されていないことを除いて、試験非ヒト動物と同一である対照非ヒト動物と比較して行うこともできる。
【0384】
これらの表現型のうちのいずれかの評価は、単一の非ヒト動物で行うことができ、その非ヒト動物の変化を評価することができる。代替的に、評価は、非ヒト動物の集団で行われ、例えば、特定の表現型を有する非ヒト動物のパーセンテージを比較することができる。
【0385】
Ｇ．インビボでのヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性上方制御の測定
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系によるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の上方制御を評価することを更に含むことができる。
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系によるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の上方制御を評価することを更に含むことができる。
【0386】
例えば、発現を評価する方法は、コードされたＭＹＯＣ ｍＲＮＡ及び／又はミオシリンタンパク質の発現又は活性を測定することを含むことができる。例えば、コードされたＭＹＯＣ ｍＲＮＡ又はミオシリンタンパク質のレベルを、眼で測定することができる。ＲＮＡ及びタンパク質のレベル及び活性を測定するためのアッセイが周知である。
【0387】
非ヒト動物におけるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を評価することは、任意の組織又は臓器からの任意の細胞型におけるものであり得る。例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を、同じ組織若しくは臓器からの複数の細胞型、又は組織若しくは臓器内の複数の場所からの細胞で評価することができる。これは、標的組織若しくは臓器内のどの細胞型が標的とされているか、又は組織若しくは臓器のどのセクションがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を、複数の種類の組織又は複数の臓器で評価することができる。特定の組織若しくは臓器が標的とされている方法では、これは、その組織若しくは臓器がどれほど効果的に標的とされているか、及び他の組織若しくは臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
【0388】
評価は、対照非ヒト動物と比較して行うことができる。対照非ヒト動物は、例えば、試験非ヒト動物と同じ年齢及び／又は試験非ヒト動物と同じ性別であり得る。対照非ヒト動物は、野生型動物、本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡを投与されていない非ヒト動物、又は本明細書に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を有するが、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を標的とする１つ以上のＳＡＭガイドＲＮＡの投与前の非ヒト動物であり得る。
【0389】
Ｖ．ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座及び／又は相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセットを作製する方法
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈを含む）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物を作製するために、様々な方法が提供される。同様に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子若しくは遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を作製するため、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物ゲノム若しくは非ヒト動物細胞を作製するために、様々な方法が提供される。同様に、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質発現コード配列を含む）及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む、非ヒト動物を作製するために、様々な方法が提供される。遺伝子修飾された生物を産生するための任意の便利な方法又はプロトコルは、そのような遺伝子修飾された非ヒト動物を産生するために好適である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９、米国特許第７，２９４，７５４号、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第８，８１６，１５０号、米国特許第９，４１４，５７５号、米国特許第９，７３０，４３４号、及び米国特許第１０，０３９，２６９号（遺伝子修飾されたマウスを作製するためのマウスＥＳ細胞及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を記載している）を参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８（Ａ１）号（ラットＥＳ細胞及び遺伝子修飾されたラットを作製するための方法を記載している）も参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」、４２：１９．１１．１－１９．１１．２２（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ１９１１ｓ４２）、及びＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９も参照されたい。そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、例えば、標的ＭＹＯＣ遺伝子座での遺伝子ノックインを通して生成することができる。
ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈを含む）を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、又は非ヒト動物を作製するために、様々な方法が提供される。同様に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子若しくは遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を作製するため、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物ゲノム若しくは非ヒト動物細胞を作製するために、様々な方法が提供される。同様に、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質発現コード配列を含む）及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む、非ヒト動物を作製するために、様々な方法が提供される。遺伝子修飾された生物を産生するための任意の便利な方法又はプロトコルは、そのような遺伝子修飾された非ヒト動物を産生するために好適である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９、米国特許第７，２９４，７５４号、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第８，８１６，１５０号、米国特許第９，４１４，５７５号、米国特許第９，７３０，４３４号、及び米国特許第１０，０３９，２６９号（遺伝子修飾されたマウスを作製するためのマウスＥＳ細胞及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を記載している）を参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８（Ａ１）号（ラットＥＳ細胞及び遺伝子修飾されたラットを作製するための方法を記載している）も参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」、４２：１９．１１．１－１９．１１．２２（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ１９１１ｓ４２）、及びＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９も参照されたい。そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、例えば、標的ＭＹＯＣ遺伝子座での遺伝子ノックインを通して生成することができる。
【0390】
例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む多能性細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）を提供することと、（２）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（３）宿主胚を代理母において妊娠させることと、を含むことができる。
【0391】
別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、多能性細胞（例えば、マウスＥＳ又はラットＥＳなどの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）宿主胚を代理母において妊娠させることと、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む（かつ生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である）Ｆ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【0392】
代替的に、本明細書の他の場所に記載される非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記に記載される方法を使用して、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、１細胞期胚のゲノムを修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、（３）遺伝子修飾された宿主胚を代理母において妊娠させることと、を含むことができる。生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。
【0393】
核移植技術もまた、非ヒト哺乳動物を生成するために使用することができる。簡潔に言えば、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、又は除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核した卵母細胞と組み合わせられるドナー細胞又は核を単離又は提供するステップと、（３）細胞又は核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に着床させて、胚を形成するステップと、（５）胚を発育させるステップと、を含むことができる。そのような方法では、卵母細胞は、一般に、死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかからも単離され得る。卵母細胞は、除核前に様々な周知の培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くの周知の方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、又はセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘導され得る。再構成された細胞は、核のドナー及びレシピエントの卵母細胞の融合の前、間、及び／又は後に、電気的及び／又は非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘導されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、及び卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、又は胚は、周知の培地で培養し、次いで、動物の子宮に移植することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／００９２２４９号、国際公開第１９９９／００５２６６号、米国特許出願公開第２００４／０１７７３９０号、国際公開第２００８／０１７２３４号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【0394】
修飾された細胞又は１細胞期胚は、例えば、（ａ）例えば、５’及び３’標的部位（例えば、挿入核酸による欠失及び置換のために意図された内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入することであって、挿入核酸が、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を生成するためのヒトＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、導入することと、（ｂ）内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む、少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む少なくとも１つの細胞を同定すること）とによって、組換えを通して生成することができる。同様に、修飾された非ヒト動物ゲノム又はヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）は、例えば、（ａ）ゲノム又は遺伝子を、５’及び３’標的部位（例えば、５’及び３’相同性アームに隣接するヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を生成するための挿入核酸（例えば、ヒトＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）による欠失及び置換のために意図された内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’及び３’相同性アームを含む、１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）と接触させることを含み、外因性ドナー核酸は、内因性非ヒト動物Ｍｙｏｃ遺伝子座のヒト化のために設計されている。
【0395】
代替的に、修飾された多能性細胞又は１細胞期胚は、（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座内の標的部位にニック又は二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤、並びに（ｉｉ）例えば、５’及び３’標的部位（例えば、挿入核酸による欠失及び置換のために意図された内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入核酸が、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を生成するためのヒトＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、外因性ドナー核酸を導入することと、（ｃ）内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む、少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む少なくとも１つの核酸を同定すること）とによって、生成することができる。同様に、ヒト化非ヒト動物ゲノム又はヒト化非ヒト動物ＭＹＯＣ遺伝子（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）は、ゲノム又は遺伝子を、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座又は遺伝子内の標的部位にニック又は二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤、並びに（ｉｉ）例えば、５’及び３’標的部位（例えば、挿入核酸による欠失及び置換のために意図された内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を生成するためのヒト化ＭＹＯＣ配列（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む））を含む、１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）と接触させることによって生成することができ、外因性ドナー核酸は、外因性Ｍｙｏｃ遺伝子座のヒト化（及び例えば、Ｙ４３７Ｈ変異の導入）のために設計されている。ニック又は二本鎖切断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及びクラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）又はそのような系の成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３０９６７０号及び米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７５号を参照されたい。一例では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含む。別の例では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、及び２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のガイドＲＮＡを含む。
【0396】
ゲノムを修飾するステップは、例えば、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を利用して、本明細書に開示されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むようにＭｙｏｃ遺伝子座を修飾することができる。一例として、標的化ベクターは、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物Ｍｙｏｃ遺伝子座）にヒト化ＭＹＯＣ遺伝子（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を生成するためのものであり得、標的化ベクターは、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座における５’標的配列を標的とする５’相同性アーム及び内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座における３’標的配列を標的とする３’相同性アームに隣接する、Ｍｙｏｃ遺伝子座に組み込まれるヒトＭＹＯＣ配列（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む核酸挿入を含む。Ｍｙｏｃ遺伝子座での核酸挿入の組み込みは、Ｍｙｏｃ遺伝子座での目的の核酸配列の付加、Ｍｙｏｃ遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、又はＭｙｏｃ遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座のセグメントを削除し、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置き換えること）をもたらし得る。
【0397】
外因性ドナー核酸は、非相同末端結合を介した挿入又は相同組換えのためのものであり得る。外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖又は二本鎖であり得、かつそれらは直線状又は環状の形態であり得る。例えば、ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。外因性ドナー核酸はまた、標的化されていない内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座に存在しない異種配列を含むこともできる。例えば、外因性ドナー核酸は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する選択カセットなどの選択カセットを含むことができる。
【0398】
１細胞期胚以外の細胞では、外因性ドナー核酸は、「大きな標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ（large targeting vector）」であり得、これには、細胞内で相同組換えを実施することを意図している他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同性アームを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号、国際公開第２０１３／１６３３９４号、米国特許第９，８３４，７８６号、米国特許第１０，３０１，６４６号、国際公開第２０１５／０８８６４３号、米国特許第９，２２８，２０８号、米国特許第９，５４６，３８４号、米国特許第１０，２０８，３１７号、及び米国特許出願公開第２０１９－０１１２６１９号を参照されたい。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸挿入を含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の修飾を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化可能ではないか、又はヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニック若しくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、若しくは有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’及び３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さであり得、典型的には、少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣの５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（bacterial homologous recombination、ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（large targeting vector、ＬＴＶＥＣ）の生成及び使用は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載されている。インビトロアセンブリ法を通したＬＴＶＥＣの生成は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３７６６２８号及び国際公開第２０１５／２００３３４号に記載されている。
【0399】
本方法は、修飾された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞又は動物を同定することを更に含むことができる。標的遺伝子修飾を有する細胞を同定するために、様々な方法を使用することができる。スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子修飾（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、各々、あらゆる目的のためのその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号、米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、国際公開第２０１６／０８１９２３号、及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、又はＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。
【0400】
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子修飾された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を有するＦ０動物内の細胞の数が変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介した、マウスからの前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入は、Ｆ０マウスの細胞集団のより大きいパーセンテージが、標的化遺伝子修飾を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％は、標的修飾を有する細胞集団を含むことができる。遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）についてヘテロ接合性であり得るか、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）についてホモ接合性であり得る。
【0401】
同様に、相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）発現カセット（キメラＣａｓタンパク質コード配列及びキメラアダプタータンパク質発現コード配列を含む）及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、本明細書の他の場所に開示されるＹ４３７Ｈ変異を含む）を含む、非ヒト動物を作製するために、様々な方法が提供される。遺伝子修飾された生物を産生するための任意の便利な方法又はプロトコルは、そのような遺伝子修飾された非ヒト動物を産生するために好適である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９、米国特許第７，２９４，７５４号、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第８，８１６，１５０号、米国特許第９，４１４，５７５号、米国特許第９，７３０，４３４号、及び米国特許第１０，０３９，２６９号（遺伝子修飾されたマウスを作製するためのマウスＥＳ細胞及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を記載している）を参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８（Ａ１）号（ラットＥＳ細胞及び遺伝子修飾されたラットを作製するための方法を記載している）も参照されたい。また、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」、４２：１９．１１．１－１９．１１．２２（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ１９１１ｓ４２）、及びＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９も参照されたい。そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む第１の非ヒト動物を生成し、ＳＡＭ発現カセット（例えば、ゲノムに組み込まれたＳＡＭ発現カセット）を含む第２の非ヒト動物を作製し、次いで、第１及び第２の非ヒト動物を交配させることによって、生成することができる。代替的に、そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を作製し、ＳＡＭ発現カセット（例えば、ゲノムに組み込まれたＳＡＭ発現カセット）を含むように多能性細胞を更に修飾し、次いで、多能性細胞から遺伝子修飾された非ヒト動物を作製することによって、生成することができる。同様に、そのような遺伝子修飾された非ヒト動物は、ＳＡＭ発現カセット（例えば、ゲノムに組み込まれた発現カセット）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を作製し、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように多能性細胞を更に修飾し、次いで、多能性細胞から遺伝子修飾された非ヒト動物を作製することによって、生成することができる。任意選択的に、細胞は、非ヒト動物であり、本明細書の他の場所に記載されるガイドＲＮＡ発現カセット及び／又はリコンビナーゼ発現カセットを含むように更に修飾することができる。
【0402】
例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセット（並びに任意選択的にガイドＲＮＡアレイ発現カセット）を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセット（並びに任意選択的にガイドＲＮＡアレイ発現カセット）をそのゲノムに含む、多能性細胞（例えば、マウスＥＳ又はラットＥＳなどの胚性幹（ＥＳ）細胞）を提供することと、（２）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（３）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。
【0403】
例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、多能性細胞（例えば、マウスＥＳ又はラットＥＳなどの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【0404】
同様に、ＳＡＭ発現カセット及び／又はガイドＲＮＡアレイ発現カセットを含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）発現カセットのうちの１つ以上又は全てを含むように、多能性細胞のゲノムを修飾することと、（２）発現カセットのうちの１つ以上又は全てを含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床又は妊娠させること）と、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、発現カセットのうちの１つ以上又は全てを含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。次いで、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む非ヒト動物を、ＳＡＭ発現カセット及び／又はガイドＲＮＡアレイ発現カセットを含む非ヒト動物と交配させることができる。
【0405】
別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセット（並びに任意選択的にガイドＲＮＡアレイ発現カセット）を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセット（並びに任意選択的にガイドＲＮＡアレイ発現カセット）を含むように、多能性細胞（例えば、マウスＥＳ又はラットＥＳなどの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセット（並びに任意選択的にガイドＲＮＡアレイ発現カセット）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（３）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【0406】
別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセットを含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、多能性細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを修飾することと、（２）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（３）ＳＡＭ発現カセットを含むように、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）遺伝子修飾された多能性細胞のゲノムを修飾することと、（４）ＳＡＭ発現カセット及びヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択することと、（５）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（６）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセットを含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【0407】
別の例として、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセットを含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ＳＡＭ発現カセットを含むように、多能性細胞のゲノムを修飾することと、（２）ＳＡＭ発現カセットを含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択すること、（３）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を更に含むように、ＳＡＭ発現カセットを含む遺伝子修飾された多能性細胞のゲノムを修飾すること、（４）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセットを含む遺伝子修飾された多能性細胞を同定又は選択すること、（５）遺伝子修飾された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（６）宿主胚を代理母において妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、修飾された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させ、妊娠させる前に胚盤胞段階までインキュベートすることができる。次いで、代理母は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及びＳＡＭ発現カセットを含むＦ０世代の非ヒト動物を産生することができる。
【0408】
本方法は、修飾された標的ゲノム遺伝子座（すなわち、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び／又はＳＡＭ発現カセット若しくはガイドＲＮＡ発現カセットを含む標的ゲノム遺伝子座）を有する細胞又は動物を同定することを更に含むことができる。標的遺伝子修飾を有する細胞を同定するために、様々な方法を使用することができる。
【0409】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子修飾（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号、米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、国際公開第２０１６／０８１９２３号、及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。
【0410】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、又はＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。
【0411】
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞）である。ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む修飾された多能性細胞は、例えば、（ａ）５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクター又は外因性ドナー核酸を細胞に導入することであって、挿入核酸が、ヒトＭＹＯＣ配列（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、導入することと、（ｂ）内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む、少なくとも１つの細胞を同定することとによって、組換えを通して生成することができる。代替的に、修飾された多能性細胞は、（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が、内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座内の標的配列にニック又は二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤、並びに（ｉｉ）標的配列と十分に近接して位置する５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、１つ以上の標的化ベクターであって、挿入核酸が、ヒトＭＹＯＣ配列（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含む、標的化ベクターを導入することと、（ｃ）内因性Ｍｙｏｃ遺伝子座に修飾（例えば、挿入核酸の組み込み）を含む、少なくとも１つの細胞を同定することとによって、生成することができる。ニック又は二本鎖切断を所望の標的配列に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及びクラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系又はそのような系の成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３０９６７０号及び米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７５号を参照されたい。
【0412】
同様に、ＳＡＭ発現カセット及び／又はガイドＲＮＡ発現カセットを含む、修飾された多能性細胞は、例えば、（ａ）５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の標的化ベクター又は外因性ドナー核酸を細胞に導入することであって、挿入核酸が、発現カセットを含む、導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む、少なくとも１つの細胞を同定することとによって、組換えを通して生成することができる。代替的に、修飾された能性細胞は、（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤が、標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニック又は二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤、並びに（ｉｉ）標的配列と十分に近接して位置する５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む、１つ以上の標的化ベクターであって、挿入核酸が、発現カセットを含む、標的化ベクターを導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に修飾（例えば、挿入核酸の組み込み）を含む、少なくとも１つの細胞を同定することとによって、生成することができる。ニック又は二本鎖切断を所望の標的配列に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及びクラスター化した規則的に散在する短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系又はそのような系の成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０３０９６７０号及び米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７５号を参照されたい。
【0413】
１細胞期胚以外の細胞を使用するいくつかのそのような方法では、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂ長における大きな標的化ベクター、又は５’及び３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂ長である大きな標的化ベクターであるが、他の種類の外因性ドナー核酸も使用することができ、周知である。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号、国際公開第２０１３／１６３３９４号、米国特許第９，８３４，７８６号、米国特許第１０，３０１，６４６号、国際公開第２０１５／０８８６４３号、米国特許第９，２２８，２０８号、米国特許第９，５４６，３８４号、米国特許第１０，２０８，３１７号、及び米国特許出願公開第２０１９－０１１２６１９号を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成及び使用は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載されている。インビトロアセンブリ法を通したＬＴＶＥＣの生成は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３７６６２８号及び国際公開第２０１５／２００３３４号に記載されている。５’及び３’相同性アームは、それぞれ、挿入核酸によって置き換えられている領域に隣接するか、又は挿入核酸が挿入される領域に隣接する、５’及び３’標的配列に対応することができる。外因性ドナー核酸若しくは標的化ベクターは、相同組換え修復を介して標的遺伝子座と再結合することができるか、又はＮＨＥＪ媒介挿入を介して挿入されて、修飾されたゲノム遺伝子座を生成することができる。
【0414】
ドナー細胞は、胚盤胞期又は桑実胚前期（すなわち、４細胞期又は８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【0415】
代替的に、本明細書の他の場所に記載される非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記に記載される方法を使用して、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、１細胞期胚のゲノム（例えば、すでにＳＡＭ発現カセットを含む）を修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、（３）遺伝子修飾された胚を代理母に妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。
【0416】
代替的に、本明細書の他の場所に記載される非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記に記載される方法を使用して、ＳＡＭ発現カセット（及び任意選択的にガイドＲＮＡ発現カセット）を含むように、１細胞期胚のゲノム（例えば、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）をすでに含む）を修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、（３）遺伝子修飾された胚を代理母に妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。
【0417】
代替的に、本明細書の他の場所に記載される非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を修飾するための上記に記載される方法を使用して、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）を含むように、１細胞期胚のゲノム（例えば、ガイドＳＡＭ発現カセット（及び任意選択的にガイドＲＮＡ発現）をすでに含む）を修飾することと、（２）遺伝子修飾された胚を選択することと、（３）遺伝子修飾された胚を代理母に妊娠させること（例えば、着床及び妊娠させること）と、を含むことができる。生殖細胞系列を通して遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。
【0418】
代替的に、本明細書の他の場所に記載される非ヒト動物を産生する方法は、（１）そのゲノムに、（ｉ）ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座、及び（ｉｉ）ＳＡＭ発現カセットを含む、非ヒト動物１細胞期胚を提供することと、（２）非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させることと、を含むことができる。
【0419】
核移植技術もまた、非ヒト哺乳動物を生成するために使用することができる。簡潔に言えば、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、又は除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核した卵母細胞と組み合わせられるドナー細胞又は核を単離又は提供するステップと、（３）細胞又は核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に着床させて、胚を形成するステップと、（５）胚を発育させるステップと、を含むことができる。そのような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管及び／又は卵巣からも単離され得る。卵母細胞は、除核前に様々な周知の培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くの周知の方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、又はセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘導され得る。再構成された細胞は、核のドナー及びレシピエントの卵母細胞の融合の前、最中、及び／又は後に、電気的及び／又は非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘導されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、及び卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、又は胚は、周知の培地で培養し、次いで、動物の子宮に移植することができる。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／００９２２４９号、国際公開第１９９９／００５２６６号、米国特許出願公開第２００４／０１７７３９０号、国際公開第２００８／０１７２３４号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【0420】
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子修飾された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び／又はＳＡＭ発現カセットを含む。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び／又はＳＡＭ発現カセットを有するＦ０動物内の細胞の数は、変化する。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介した、マウスからの前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入は、Ｆ０マウスの細胞集団のより大きいパーセンテージが、標的化遺伝子修飾を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、標的修飾を有する細胞集団を含むことができる。
【0421】
遺伝子修飾されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び／又はＳＡＭ発現カセット若しくはガイドＲＮＡ発現カセットについてヘテロ接合性であり得るか、又はヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座（例えば、Ｙ４３７Ｈ変異を含む）及び／又はＳＡＭ発現カセット若しくはガイドＲＮＡ発現カセットについてホモ接合性であり得る。
【0422】
上記又は下記で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各個々の項目が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前又は優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、又は態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解の目的に対し図表及び例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化及び修飾を実施することができることが明らかになろう。
【0423】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、及びアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補的鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
添付の配列表に列記されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、及びアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補的鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
【0424】
【表2-1】
【0425】
【表2-2】
【実施例】
【0426】
実施例１．Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むマウスの生成
緑内障は、世界中で不可逆的な視力喪失の主な原因である。眼圧（ＩＯＰ）の上昇は、進行性視神経損傷をもたらす。緑内障患者を治療するために使用されるＩＯＰ降下薬は、２つの機構：（１）房水の産生を減少させること、及び（２）房水流出を増加させることによって、機能する。ミオシリン（ＭＹＯＣ）は、常染色体優性家族性若年開放隅角緑内障及び原発性開放隅角緑内障に関連することが示された最初の遺伝子であった。Ｙ４３７Ｈは、早発性緑内障に関連するＭＹＯＣ変異である。細胞におけるＭＹＯＣの正常な機能は不明であるが、野生型ミオシリンタンパク質が分泌される一方で、変異ミオシリンタンパク質は小胞体（ＥＲ）で保持され、小柱網におけるＥＲ応力につながる。
緑内障は、世界中で不可逆的な視力喪失の主な原因である。眼圧（ＩＯＰ）の上昇は、進行性視神経損傷をもたらす。緑内障患者を治療するために使用されるＩＯＰ降下薬は、２つの機構：（１）房水の産生を減少させること、及び（２）房水流出を増加させることによって、機能する。ミオシリン（ＭＹＯＣ）は、常染色体優性家族性若年開放隅角緑内障及び原発性開放隅角緑内障に関連することが示された最初の遺伝子であった。Ｙ４３７Ｈは、早発性緑内障に関連するＭＹＯＣ変異である。細胞におけるＭＹＯＣの正常な機能は不明であるが、野生型ミオシリンタンパク質が分泌される一方で、変異ミオシリンタンパク質は小胞体（ＥＲ）で保持され、小柱網におけるＥＲ応力につながる。
【0427】
緑内障をモデル化するためのＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むマウスを生成するために、マウスＭｙｏｃ遺伝子座の１３４ｋｂを含む５’相同性アーム及びマウスＭｙｏｃ遺伝子座の８６ｋｂを含む３’相同性アームを含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を生成して、マウスＭｙｏｃ遺伝子由来の９．９ｋｂの領域をヒトＭＹＯＣ遺伝子の対応する配列の１７．２ｋｂで置き換えた。マウスＭｙｏｃ及びヒトＭＹＯＣ遺伝子についての情報が、表３に提供される。大きな標的化ベクターの生成の説明が、表４に提供される。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成及び使用は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載されている。インビトロアセンブリ法を通したＬＴＶＥＣの生成は、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３７６６２８号及び国際公開第２０１５／２００３３４号に記載されている。
【0428】
【表3】
【0429】
【表4】
【0430】
具体的には、マウスＭｙｏｃをヒトＭＹＯＣで置き換えた（マウスｃｈｒ１：１６２６３９０６４－１６２６４９２０２をヒトｃｈｒ１：１７１６５２４１２－１７１６５２６１１によって置き換えた）。欠失したマウス配列は、内因性５’及び３’ＵＴＲを残す、開始コドンから終止コドンまでの領域である。挿入されたヒト配列は、開始コドン（ＡＴＧ）から始まり、終止コドン及び３’ＵＴＲを通して継続し、全てのエキソン及びイントロンを含む。ヒトＭＹＯＣ配列は、Ｙ４３７Ｈ変異ミオシリンタンパク質をコードする。自己欠失選択カセットを、ヒト３’ＵＴＲの下流に挿入した。これは、ＭＡＩＤ ８５３３対立遺伝子（配列番号８８）である。図１を参照されたい。カセット欠失後、ｌｏｘＰ部位が、ヒト３’ＵＴＲの下流に残留した。これは、ＭＡＩＤ ８５３４対立遺伝子（配列番号８９）である。図１を参照されたい。
【0431】
マウスＭＹＯＣシグナルペプチドの配列は、配列番号２７に記載され、配列番号３１に記載される対応するコード配列を有する。ヒトＭＹＯＣシグナルペプチドの配列は、配列番号１５に記載され、配列番号２１に記載される対応するコード配列を有する。予期されるコードされたＭＹＯＣタンパク質は、完全にヒトであり、Ｙ４３７Ｈ変異を含む。図１を参照されたい。マウス及びヒトＭＹＯＣタンパク質のアラインメントが図３に示される。マウスＭｙｏｃ（野生型）及びヒトＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）コード配列は、それぞれ、配列番号８及び５に記載されている。マウスＭＹＯＣ（野生型）及びヒトＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）タンパク質配列は、それぞれ、配列番号６及び４に記載されている。予期されるヒト化ＭＹＯＣコード配列及び予期されるヒト化ＭＹＯＣタンパク質の配列は、それぞれ、配列番号５及び４に記載されている。
【0432】
変異対立遺伝子を生成するために、上記に記載される大きな標的化ベクターをＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配することによって産生されたハイブリッド胚に由来した。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５－０３７６６５１号及び国際公開第２０１５／２００８０５号を参照されたい。具体的には、２×１０６個のマウスＥＳ細胞（系統８０３７Ｂ－Ｆ７）を、大きな標的化ベクターでエレクトロポレーションした。７５μｇ／ｍＬの濃度でハイグロマイシンを使用して、抗生物質選択を実施した。抗生物質選択後、コロニーを採取し、拡大し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。図２を参照されたい。表５に記載されるプライマー及びプローブを使用して、内因性マウス対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを実施し、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを実施し、Ｙ４３７Ｈ変異を検出するために対立遺伝子識別アッセイを実施した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）確認後、サンガー配列決定によって変異を再確認した。
【0433】
【表5】
【0434】
対立遺伝子喪失（loss-of-allele、ＬＯＡ）及び対立遺伝子獲得（gain-of-allele、ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子修飾（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、国際公開第２０１６／０８１９２３号、及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７に記載されている。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを逆にし、変異が誘導された天然遺伝子座のゲノムＤＮＡサンプルのコピー数を定量化する。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞のクローンでは、ＬＯＡアッセイは、２つの天然の対立遺伝子（Ｘ又はＹ染色体上にない遺伝子の場合）のうちの一方を検出し、他方の対立遺伝子は、標的化された修飾によって破壊される。ゲノムＤＮＡサンプルにおける挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化するために、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと同じ原理を逆に適用することができる。
【0435】
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、Ｆ０マウスを修飾されたＥＳ細胞から生成した。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、上記に記載されるＭＯＡアッセイによって選択された上記に記載されるヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むマウスＥＳ細胞クローンを、８細胞期胚に注射した。例えば、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、米国特許出願公開第２００８／００７８０００号、及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法では、標的マウスＥＳ細胞を、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを効率的にもたらす前桑実胚期胚、例えば、８細胞期胚に、レーザ支援注射を通して注射する。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法では、注射された前桑実胚期胚を、胚盤胞期まで培養し、胚盤胞期胚を代理母に導入し、懐胎させて、Ｆ０世代マウスを産生する。標的修飾についてホモ接合性であるマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、標的修飾についてホモ接合性のＦ０マウスが産生される。標的修飾についてヘテロ接合性のマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、その後に育種を行って、標的修飾についてホモ接合性のマウスを産生することができる。
【0436】
実施例２．ＳＡＭマウスの生成及び検証
内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動される１つの転写物としてゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系成分（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４及びＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含むマウスを、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号及び国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載されるように生成した。最初に、ｄＣａｓ９ ＳＡＭ系の発現は、ｌｏｘＰを組み込んだネオマイシン停止カセットの存在によって阻止される。Ｃｒｅリコンビナーゼの導入時に、停止カセットが削除され、ｄＣａｓ９ ＳＡＭ発現がオンになる。次いで、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡアレイ（例えば、Ｕ６プロモーターから発現される）を、構成的活性化又はより一過性の活性のためのＬＮＰ／ＡＡＶ導入のために、他のＲｏｓａ２６対立遺伝子に導入することによって、それらを誘導することができる。ｄＣａｓ９ ＳＡＭ対立遺伝子を様々なＣｒｅ送達方法と対合することによって、遺伝子調節のタイミング及び組織特異性を制御することができる。
内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動される１つの転写物としてゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系成分（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４及びＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含むマウスを、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号及び国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載されるように生成した。最初に、ｄＣａｓ９ ＳＡＭ系の発現は、ｌｏｘＰを組み込んだネオマイシン停止カセットの存在によって阻止される。Ｃｒｅリコンビナーゼの導入時に、停止カセットが削除され、ｄＣａｓ９ ＳＡＭ発現がオンになる。次いで、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡアレイ（例えば、Ｕ６プロモーターから発現される）を、構成的活性化又はより一過性の活性のためのＬＮＰ／ＡＡＶ導入のために、他のＲｏｓａ２６対立遺伝子に導入することによって、それらを誘導することができる。ｄＣａｓ９ ＳＡＭ対立遺伝子を様々なＣｒｅ送達方法と対合することによって、遺伝子調節のタイミング及び組織特異性を制御することができる。
【0437】
発現カセット中のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｄＣａｓ９コード配列（ＣＤＳ）を、マウスでの発現のためにコドン最適化した。コードされたｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ不活性にするための以下の変異：Ｄ１０Ａ及びＮ８６３Ａを含む。ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４－Ｔ２Ａ－ＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１発現カセットは、図４Ａ及び配列番号６４に示される。相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）コード配列（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－Ｔ２Ａ－ＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１、又はより具体的にはＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４－Ｔ２Ａ－ＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１は、配列番号６９に記載され、配列番号６７に記載されるタンパク質をコードする。発現カセットは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の強力で普遍的な発現及びＲｏｓａ２６遺伝子座の標的化の容易性を利用するために、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに標的化された（図５を参照されたい）。発現カセットには、適切なスプライシングシグナル及び強力なポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを有するｌｏｘＰを組み込んだネオマイシン耐性カセット（ネオカセット）が先行した。５’から３’までのｄＣａｓ９ ＳＡＭ発現カセットの成分が、以下の表６に示される。
【0438】
【表6】
【0439】
Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるｌｏｘＰを組み込んだネオマイシン耐性カセット（ネオカセット）の除去の前に、ネオマイシン耐性遺伝子が転写及び翻訳されるが、ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＶＰ６４ ＣＤＳ及びＭＣＰ－ＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１ ＣＤＳは、一通りの転写を効果的に阻止する、強力なポリ（Ａ）領域の存在に起因して発現されない。図４Ａを参照されたい。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によるネオカセットの除去時に、ｄＣａｓ９及びＭＣＰ融合タンパク質のハイブリッドｍＲＮＡが、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって構成的に発現される。図４Ｂを参照されたい。ｄＣａｓ９及びＭＣＰ発現を、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号及び国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載されるように検証した。本系を、各々、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号及び国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載されるように、ＴｔｒガイドＲＮＡアレイを使用してインビボで検証した。ＭＳ２ステムループを含む、ＳＡＭガイドＲＮＡの構造の一般的概略図が、図６に示される。
【0440】
Ｍｙｏｃ遺伝子の発現を増加させるためのツールとしてＳＡＭマウスを検証するために、異なるウイルスベクターを、小柱網（ＴＭ）、毛様体（ＣＢ）、及び角膜内皮（ＣＥ）における発現について最初に試験した。図７は、Ａｄ５、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ、及びレンチウイルスからの発現を示す。各ウイルスは、ＧＦＰ（緑色で示される）を発現し、青色は、細胞を示すＤＡＰＩ染色である。試験された全てのベクターのうち、Ａｄ５は、硝子体内（intravitreal、ＩＶＴ）注射後にＴＭについて最も高い形質導入効率を有していたが、炎症を引き起こし、導入遺伝子発現は一過性であった。ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆは、前房内（intracameral、ＩＣ）注射後にＴＭ及びＣＢを形質導入した。レンチウイルスは、ＴＭ及びＣＥの両方を形質導入した。後続の研究は、レンチウイルスがＡＡＶ２．Ｙ３Ｆと比較してＴＭにより特異的であることを示した。
【0441】
次に、開始コドンの上流のマウスＭｙｏｃ配列を標的とするガイドＲＮＡを使用して、ＳＡＭマウスを検証した。６つのガイドＲＮＡによって標的とされる領域が、図８に示される。６つのガイドＲＮＡの標的配列が、表７に示される。
【0442】
【表7】
【0443】
最初の概念実証のために、ＳＡＭマウスに、前房内経路を介して１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬの力価で、ＡＡＶ．Ｙ３Ｆ中の１μＬ（１Ｅ＋１０ｖｇ注射）の６つのガイドＲＮＡを両側に注射した。４週間後、前部を図９に示されるように解剖し、ＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲのために抽出した。結果は、マウスＭｙｏｃ発現が、対照ガイドＲＮＡに対してマウスＭｙｏｃ ＳＡＭガイドＲＮＡの投与後に、ＳＡＭマウスでは、輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ）、図１０Ａ）、網膜（図１０Ｂ）、及び角膜（図１０Ｃ）において増加したことを示す。
【0444】
実施例３．Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むＳＡＭマウスの生成
実施例１に示されるように、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むマウスを生成した。実施例２に示されるように、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動される１つの転写物としてゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系成分（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４及びＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含むマウスを生成し、検証した。
実施例１に示されるように、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むマウスを生成した。実施例２に示されるように、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動される１つの転写物としてゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）系成分（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４及びＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含むマウスを生成し、検証した。
【0445】
次に、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座の発現を増加させるためにＳＡＭマウスを使用しようとした。Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウスを、実施例１に記載されるマウスを実施例２に記載のマウスと交配することによって生成した。
【0446】
実施例４．緑内障モデルとしてのＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むＳＡＭマウスの検証
Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス）を検証するために、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてホモ接合性又はヘテロ接合性のＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ５、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ＬａｃＺ対照で処置したか、又は何も処置しなかった（ナイーブ）。図１３（ｑＰＣＲ）及び図１４（ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標））に示されるように、ヒト化ＭＹＯＣＹ４３７Ｈ発現の遺伝子型依存性増加が、輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ））への注射後１２週間で観察され、これはまた、図１１に示されるように上昇した眼圧と相関した。これは、上昇したＩＯＰを有する好適なＭＹＯＣ疾患モデルとしてＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを検証した。
Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス）を検証するために、ヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座についてホモ接合性又はヘテロ接合性のＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ５、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ＬａｃＺ対照で処置したか、又は何も処置しなかった（ナイーブ）。図１３（ｑＰＣＲ）及び図１４（ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標））に示されるように、ヒト化ＭＹＯＣＹ４３７Ｈ発現の遺伝子型依存性増加が、輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、及び毛様体（ＣＢ））への注射後１２週間で観察され、これはまた、図１１に示されるように上昇した眼圧と相関した。これは、上昇したＩＯＰを有する好適なＭＹＯＣ疾患モデルとしてＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを検証した。
【0447】
次いで、緑内障患者を治療するために使用されるＩＯＰ降下薬を概念実証として試験して、それらがＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察されるＩＯＰを降下させ得るかどうかを決定した。２つのＩＯＰ降下薬：（１）チモロール（房水形成を抑制するベータ遮断薬）、及び（２）ＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）（房水の流出を増加させるＲＯＣＫ阻害剤）を試験した。０日目に、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４を投与した。約１０週間後、チモロール又はＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）を投与した。０時間で、ＩＯＰを測定し、各眼が、１滴のチモロール又はＲＨＯＰＲＥＳＳＡ（登録商標）のいずれかを受け、処置後２、４、６及び２４時間でＩＯＰを測定した。図１２に示されるように、各薬物は、ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを降下させることに効果的であった。
【0448】
次いで、ヒトＭＹＯＣを標的とするｓｉＲＮＡを試験して、それがＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察される高いＩＯＰを降下させ得るかどうかを決定した。実験設定が、図１５Ａに示される。ＳＡＭ－ｇ４を０日目に前房内（ＩＣ）注射によって投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。次いで、ＩＯＰを次の５週間にわたって測定した。５週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１（１μＬ、１５μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、後続の週にわたって様々な時点で測定した。３つの処置群：（１）ナイーブ対照マウス、（２）ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡで処置されたＳＡＭ－ｇ４処置マウス、及び（３）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡで処置されたＳＡＭ－ｇ４処置マウスが存在した。図１５Ｂに示されるように、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを降下させ、ｓｉＲＮＡ注射後Ｄ７から開始してＩＯＰを逆転させ、ベースラインレベルに戻した一方で、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、ＩＯＰに影響を及ぼさなかった。
【0449】
次いで、ヒトＭＹＯＣを標的とするいくつかの追加のｓｉＲＮＡを低用量で試験して、それらがレンチウイルスＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察されるＩＯＰを降下させ得るかどうかを決定した。マウスに、ＳＡＭ－ｇ４及びｓｉＲＮＡを両側に注射した。実験設定が、図１６Ａに示される。ＳＡＭ－ｇ４を０日目に前房内（ＩＣ）注射によって投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。次いで、ＩＯＰを次の５週間にわたって測定した。５週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃１、＃２、＃３、＃４、及び＃５（１μＬ、７．５μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、後続の週にわたって様々な時点で測定した。輪部リングにおけるｍＲＮＡノックダウンをｑＰＣＲによって試験し、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を行った。対照群は、ナイーブ対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、及びＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスを含んだ。図１６Ｂに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを降下させ、ｓｉＲＮＡ注射直後にＩＯＰを逆転させ、ベースラインレベルに戻した。図１６Ｃに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、輪部リングからのサンプルにおいてｑＰＣＲによって測定されるように、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４群に対してヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現を減少させた。ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析は、ｓｉＲＮＡが、ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡのノックダウンを媒介することを確認した（図１６Ｄ）。
【0450】
次いで、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２及び＃３を更に低用量で試験して、それらがレンチウイルスＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察されるＩＯＰを降下させ得るかどうかを決定した。マウスに、ＳＡＭ－ｇ４及びｓｉＲＮＡを両側に注射した。実験設定が、図１７Ａに示される。ＳＡＭ－ｇ４を０日目に前房内（ＩＣ）注射によって投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。次いで、ＩＯＰを次の５週間にわたって測定した。５週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ＃２及び＃３（１μＬ、３．７５μｇ用量又は１．８７μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、後続の週にわたって様々な時点で測定した。輪部リングにおけるｍＲＮＡノックダウンをｑＰＣＲによって試験し、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を行った。対照群は、ナイーブ対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、及びＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４処置マウスを含んだ。図１７Ｂに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、試験される各用量におけるＳＡＭ－ｇ４で処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを降下させ、ｓｉＲＮＡ注射直後にＩＯＰを逆転させ、ベースラインレベルに戻した。図１７Ｃに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、試験される各用量で輪部リングからのサンプルにおいてｑＰＣＲによって測定されるように、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４群に対してヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現を減少させた。
【0451】
ヒトミオシリンＹ４３７Ｈのトランスジェニック過剰発現を有する他のＭＹＯＣ緑内障モデルは、わずか約２～３ｍｍＨｇのＩＯＰ上昇を示し、ＭＹＯＣは、どこでも発現される。加えて、ＩＯＰ表現型は、繁殖にわたって失われる。本明細書に記載されるモデルは、発現が疾患病理の標的組織である小柱網にほとんど限定されるという利点を有する。加えて、約５～６ｍｍＨｇのＩＯＰの更なる上昇が観察される。
【0452】
実施例５．Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ミオシリン（ＭＹＯＣ）遺伝子座を含むＳＡＭマウスを用いた推定治療剤の試験
緑内障モデルとしてのＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスの検証時に、実験を実施して、追加の緑内障標的を試験するための緑内障モデルとしてＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを検証した。小柱網（ＴＭ）は、房水の排出に対して抵抗性であり、眼圧（ＩＯＰ）にとって重要である、眼の前房隅角に位置する組織である。分泌性糖タンパク質アンジオポエチン様７（angiopoietin-like 7、ＡＮＧＰＴＬ７）は、ＴＭ病理及びＩＯＰホメオスタシスで中心的役割を果たす。ステロイド曝露、並びに上方制御されたＭＹＯＣ及びＴＧＦ－Ｂ２発現を含む、緑内障に関与する様々な経路は、ＴＭ機能不全及びＩＯＰの上昇に関連するＡＮＧＰＴＬ７発現の増加につながり得る。したがって、ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＡＮＧＰＴＬ７の標的化を試験するための実験を設計した。
緑内障モデルとしてのＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスの検証時に、実験を実施して、追加の緑内障標的を試験するための緑内障モデルとしてＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを検証した。小柱網（ＴＭ）は、房水の排出に対して抵抗性であり、眼圧（ＩＯＰ）にとって重要である、眼の前房隅角に位置する組織である。分泌性糖タンパク質アンジオポエチン様７（angiopoietin-like 7、ＡＮＧＰＴＬ７）は、ＴＭ病理及びＩＯＰホメオスタシスで中心的役割を果たす。ステロイド曝露、並びに上方制御されたＭＹＯＣ及びＴＧＦ－Ｂ２発現を含む、緑内障に関与する様々な経路は、ＴＭ機能不全及びＩＯＰの上昇に関連するＡＮＧＰＴＬ７発現の増加につながり得る。したがって、ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＡＮＧＰＴＬ７の標的化を試験するための実験を設計した。
【0453】
本明細書に記載されるＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスモデルを使用して、Ａｎｇｐｔｌ７の発現は、ＭＹＯＣ過剰発現と相関してＳＡＭマウスにおいて増加することが観察された。図１８ＡのｑＰＣＲによって示されるように、ヒトＭＹＯＣ発現は、ＰＢＳ対照と比較して、Ｌｖ－ＳＡＭ－ｇ４を用いた前房内（ＩＣ）注射によって処置されたマウスでは３倍超増加した。Ａｎｇｐｔｌ７の発現は、図１８ＢのｑＰＣＲによって示されるように、Ｇａｐｄｈに対して対応する増加を受けた。同様に、ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスは、図１８ＣのｑＰＣＲによって示されるように、未処置ナイーブマウスと比較して、Ｇａｐｄｈに対してヒトＭＹＯＣ発現の顕著な増加を示した。Ａｎｇｐｔｌ７の発現はまた、図１８ＤのｑＰＣＲによって示されるように、未処置ナイーブマウスと比較して、ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスで増加した。
【0454】
ＭＹＯＣの標的化への相補的アプローチに従って、Ａｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１及び＃２を、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで試験して、Ａｎｇｐｔｌ７を標的化することもＩＯＰを減少させるかどうかを決定した。図１９Ａに示されるように、０日目にＩＣ注射を介してＳＡＭ－ｇ４を投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。次いで、ＩＯＰを次の５週間にわたって測定した。５週目に、Ａｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１及び＃２（１５μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、後続の週にわたって様々な時点で測定した。輪部リングにおけるｍＲＮＡノックダウンをｑＰＣＲによって試験した。図１９Ｂに示されるように、ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４及びＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１又は＃２のいずれかで処置されたＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスは、ＰＢＳで処置された対照マウスと比較して、Ｇａｐｄｈに対してヒトＭＹＯＣの実質的に増加した発現を示した。しかしながら、ＡＡＶ－ＳＡＭ－ｇ４及びＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１又は＃２のいずれかで処置されたこれらのマウスは、図１９Ｃに示されるように、ＰＢＳで処置された対照マウスと比較して、Ｇａｐｄｈに対してＡｎｇｐｔｌ７の著しく増加した発現を示さなかった。
【0455】
次いで、Ａｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１及び＃２の低減した用量（７．５μｇ用量）を試験して、より低い用量が、レンチウイルスＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察されるＩＯＰを降下させ得るかどうかを決定した。マウスに、Ｌｖ－ＳＡＭ－ｇ４及びｓｉＲＮＡを両側に注射した、実験設定が、図２０Ａに示される。図２０Ｂに示されるように、Ａｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１及び＃２（７．５μｇ用量）を注射したマウスは、未処置ナイーブマウスと同様にＩＯＰの回復とともに、ＰＢＳで処置されたマウスと比較してＩＯＰの大幅な減少を示した。ヒトＭＹＯＣ及びＡｎｇｐｔｌ７の発現を、図２０Ｃに示されるように、未処置ナイーブマウス、並びにＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４及びＰＢＳ又はＡｎｇｐｔｌ７ ｓｉＲＮＡ＃１若しくは＃２（７．５μｇ用量）で処置されたマウスについてｑＰＣＲによって決定した。これらの実験は更に、ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスが、緑内障の治療のための治療標的を評価するためのモデルとして首尾よく利用され得ることを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D-1】
【図16D-2】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【配列表】
【国際調査報告】