特表 2024-545136 がん治療のための抗ＴｆＲ１抗体ＭＡｂ１１－２２．１複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-05

(54)【発明の名称】がん治療のための抗ＴｆＲ１抗体ＭＡｂ１１－２２．１複合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20241128BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 31/537 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241128BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241128BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20241128BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

C12N15/13

C12N15/63 Z

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

A61K49/00

A61K39/395 L

A61K31/537

A61K45/00

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024534304

(86)(22)【出願日】2022-12-03

(85)【翻訳文提出日】2024-06-06

(86)【国際出願番号】 CN2022136411

(87)【国際公開番号】W WO2023103922

(87)【国際公開日】2023-06-15

(31)【優先権主張番号】17/542,948

(32)【優先日】2021-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524216439

【氏名又は名称】ノースイースト ファーマスーティカル グループ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨＥＡＳＴ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｋｕｎｍｉｎｇｈｕ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈｅｎｙａｎｇ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ １１００２７， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ メイソン

(72)【発明者】

【氏名】マ チンホン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA17

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C085AA26

4C085BB12

4C085BB31

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC02

4C085CC31

4C085DD62

4C085DD63

4C085EE01

4C085GG06

4C085KA04

4C085KA05

4C085KA36

4C085KB82

4C085LL18

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB22

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、細胞表面上でトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）及びその変異体を過剰発現する細胞に関連するがん（ＡＭＬ、ＡＬＬ、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、胃がん、神経膠芽腫、前立腺がん、尿路上皮がん（膀胱がん）、膵臓がん、食道がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肝臓がんを含むが、それらに限定されない）の治療、予防、及び診断のための治療剤を提供する。前記薬剤は、抗ＴｆＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＭＡｂ１１－２２．１の新規な軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列に基づくもので、前記抗ＴｆＲ１モノクローナル抗体は、腫瘍細胞に対して高度に特異的で、ＡＤＣの形態であり、いくつかのヒトがん細胞株の増殖及びマウスモデルにおけるＡＭＬ細胞株由来の異種移植腫瘍の成長を機能的に阻害できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

軽鎖可変領域を含み、抗腫瘍剤と結合された、ＴｆＲ１を標的とする結合剤であって、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７と少なくとも７０％同一の配列を有する、結合剤。

【請求項2】

前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１～ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７と同一の配列を有する、請求項１に記載の結合剤複合体。

【請求項3】

抗腫瘍剤と結合された、ＴｆＲ１を標的とする結合剤であって、配列番号２と少なくとも７０％同一の軽鎖可変領域を有する、結合剤。

【請求項4】

重鎖可変領域を含み、抗腫瘍剤と結合された、ＴｆＲ１を標的とする結合剤であって、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０と少なくとも７０％同一の配列を有する、結合剤。

【請求項5】

前記重鎖可変領域のＣＤＲ１～ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０と同一の配列を有する、請求項４に記載の結合剤複合体。

【請求項6】

抗腫瘍剤と結合された、ＴｆＲ１を標的とする結合剤であって、配列番号４と少なくとも７０％同一の重鎖可変領域を有する、結合剤。

【請求項7】

請求項２に記載の結合剤の軽鎖可変領域をコードする、分離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。

【請求項8】

配列番号１のヌクレオチド配列を有する、分離されたＤＮＡ分子。

【請求項9】

請求項５に記載の結合剤の重鎖可変領域をコードする、分離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。

【請求項10】

配列番号３のヌクレオチド配列を有する、分離されたＤＮＡ分子。

【請求項11】

前記結合剤がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合剤複合体。

【請求項12】

前記モノクローナル抗体がマウス、ヒト、ヒト化、キメラ、二重特異性又は多重特異性抗体である、請求項１１に記載の結合剤複合体。

【請求項13】

前記結合剤がダイアボディ、単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子、ＶＨ若しくはＶＬドメイン、又はＶＨＨドメインである、請求項１１に記載の結合剤複合体。

【請求項14】

前記モノクローナル抗体がＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖を有する、請求項１１に記載の結合剤複合体。

【請求項15】

前記結合剤がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｒＩｇＧ、Ｆｖ又はＦｄ断片である、請求項１に記載の結合剤複合体。

【請求項16】

前記結合剤がｓｃＦｖ又はｓｃ（Ｆｖ）_２である、請求項１に記載の結合剤複合体。

【請求項17】

前記モノクローナル抗体がクラスＩｇＤ、クラスＩｇＥ、クラスＩｇＧ、クラスＩｇＡ若しくはクラスＩｇＭ、又は前記クラスの１つのサブクラスである、請求項１１に記載の結合剤複合体。

【請求項18】

前記モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２である、請求項１７に記載の結合剤複合体。

【請求項19】

前記モノクローナル抗体がκ軽鎖を有する、請求項１７に記載の結合剤複合体。

【請求項20】

請求項８に記載の分離されたＤＮＡ分子を含む、ベクター。

【請求項21】

ＣＤＲ１～ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７と同一の配列を備える軽鎖可変領域を有する、ＴｆＲ１を標的とする結合剤。

【請求項22】

ＣＤＲ１～ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０と同一の配列を備える重鎖可変領域を有する、ＴｆＲ１を標的とする結合剤。

【請求項23】

配列番号２と同一の配列を備える軽鎖を有する、ＴｆＲ１を標的とする結合剤。

【請求項24】

配列番号４と同一の配列を備える重鎖を有する、ＴｆＲ１を標的とする結合剤。

【請求項25】

配列番号２と同一の配列を備える軽鎖を有する、請求項２４に記載の結合剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトがん細胞におけるトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）及びそのアイソフォームと結合し、その内在化及び活性を調節するための抗体の用途に関する。本発明は、また、ＴｆＲ１及びそのアイソフォームに関連する哺乳類細胞又は病的状態の生体外、原位置及び／又は生体内での診断及び／又は治療に使用される抗体又は小分子との複合体（抗体薬物複合体、ＡＤＣ）に関する。

【背景技術】

【0002】

トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１、ＣＤ７１）は、７６０個のアミノ酸からなるＩＩ型膜貫通糖タンパク質で、２つのジスルフィド結合によって結合されて１８０－ｋＤａのホモ二量体として形成され、鉄の取り込み及び細胞の生長の調節で重要な役割を果たす（ＢＯＭＦＯＲＤ ａｎｄ ＭＵＮＲＯ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．５：８７０－８７５，１９８５）。二鉄トランスフェリン（Ｔｆ）が細胞表面上のＴｆＲ１と結合すると、ホロＴｆ－ＴｆＲ１複合体はクラスリン被覆ピットによって内在化され、酸性エンドソームに送達され、そこで鉄Ｔｆ－ＴｆＲ１複合体は、低ｐＨによって引き起こされる立体構造変化を起こし、続いて鉄が放出されて細胞質に輸送される。次に、アポＴｆ／ＴｆＲ１複合体（ａｐｏ－Ｔｆ／ＴｆＲ１）が再循環により細胞表面に戻り、そこでアポＴｆ（ａｐｏ－Ｔｆ）は受容体から解離する（ＷＡＲＤ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｒａｄｉｏｌ．２２：７４－８３，１９８７；ＤＡＮＩＥＬＳ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：１４４－１５８，２００６）。ＴｆＲ１の発現は、血液細胞、肝細胞、角化細胞の前駆体など、ヘム合成に鉄が強く求められる、急速に増殖する細胞で増加するが、分裂していない細胞でその発現は減少するか全くない。ＴｆＲ１は、リンパ球、膵臓、胃、結腸、肺、乳房、膀胱、皮膚に由来する原発性及び転移性がん細胞で過剰発現している（ＧＡＴＴＥＲ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．３６：５３９－５４５，１９８３；ＦＡＵＬＫ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ．２：３９０－３９２，１９８０；ＳＵＴＨＥＲＬＡＮＤ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：４５１５－４５１９，１９８１；ＤＡＮＩＥＬＳ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：１４４－１５８，２００６；ＪＥＯＮＧ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．４７１：３７３－３７９，２０１６；ＰＥＥＲ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：７５１－７６０，２００７；ＱＩＡＮ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．５４：５６１－５８７，２００２；ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｇｅｎ Ｓｕｂｊ．１７９０：７０２－７１７，２００９）。がん細胞は、鉄欠乏（ｉｒｏｎ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）に対してより感受性があると考えられるため、その結合を遮断するか又はホロＴｆ／ＴｆＲ１複合体の内在化を妨害してＴｆ又はＴｆＲ１を標的とすることにより、鉄欠乏を引き起して、悪性細胞を死滅させる。

【0003】

過去３０年間の文献には、受容体の結合又は内在化の妨害においてＴｆと競合するために抗ヒトＴｆＲ１抗体又はＴｆＲ１結合ペプチドを開発することによる悪性疾患の治療に関する多くの試みが記述されている（概説については、ＴＯＲＴＯＲＥＬＬＡ ａｎｄ ＫＡＲＡＧＩＡＮＮＩＳ．Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２４７：２９１－３０７，２０１４；ＣＡＮＤＥＬＡＲＩＡ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７ Ｍａｒｃｈ ２０２１．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．６０７６９２を参照する）。ＴＲＯＷＢＲＩＤＧＥ ａｎｄ ＬＯＰＥＺ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７９，１１７５－１１７９，１９８２；米国特許第４，４３４，１５６号）には、非競合的メカニズムによりＴｆとＴｆＲ１の結合を遮断し、細胞周期のＳ期にあるヒトＴ細胞白血病細胞株の成長を生体外で阻害できる、４２／６と命名されたマウス抗ＴｆＲ１抗体が報告されている。４２／６は、第Ｉａ相臨床試験で患者の忍容性が良好であることが判明したが、マウスＩｇＡアイソタイプであるため、ヒト抗マウス抗体（ＨＳＭＳ）を誘導し、腎臓によって速やかに排除されるため、効力の欠如が起きた（ＢＲＯＯＫＳ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１２５９－１２６５，１９９５）。ＭＯＵＲＡ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９４，４１７－４２５，２００１）には、ＴｆＲ１と高い親和性（Ｋ_Ｄ＝２．７ｎＭ）で結合することによってＴｆと直接競合し、ＴｆＲの発現を低下させ、ＴｆＲの再循環を阻害することによりＴ細胞の増殖を阻害する、より強力な中和マウス抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ２ｂ抗体（Ａ２４）が報告されている。細胞周期のＳ期で細胞を阻害してその抗増殖効果を発揮する４２／６と対照的に、Ａ２４は、標的細胞のアポトーシスを誘導することによって作用し、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞の体外増殖を阻害した（Ｍｏｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ．１０３：１８３８－１８４５，２００４；ＣＡＬＬＥＮＳ ｅｔ ａｌ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２２：４２－４８，２００８；ＬＥＰＥＬＬＥＴＩＥＲ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：１１４５－１１５４，２００７）。

【0004】

近年、ヒトにおける有効性の欠如及びＨＡＭＡ応答を克服するために、いくつかのキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が開発された。例として、マウス－ヒトＩｇＧ３キメラ抗体ｃｈ１２８．１は、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）及びＡＩＤＳ関連非ホジキンリンパ腫（ＡＩＤＳ－ＮＨＬ）の細胞株由来異種移植（ＣＬＤＸ）モデルにおいて生体内抗がん活性を示しており（ＤＡＮＩＥＬＳ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：５００－５０８，２０１１；ＤＡＮＩＥＬＳ－ＷＥＬＬＳ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３８：３０７－３１０，２０１５．）、そのヒト化バージョンｈｕ１２８．１（ＩｇＧ１）も、ＡＩＤＳ－ＮＨＬ ＣＬＤＸモデルにおいて強力である（ＤＡＮＩＥＬＳ－ＷＥＬＬＳ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０（１６ Ｓｕｐｐｌ）：５６５５，２０２０．）。ｃｈ１２８．１及びｈｕ１２８．１の抗がん活性は、Ｆｃが媒介する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）に依存すると考えられる。ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト中和抗体が３つ記述されている。ＰＰＭＸ－Ｔ００３及びＨ７－ＩｇＧ１は、様々な白血病又はリンパ腫モデルにおいて腫瘍の成長を阻害しマウスの生存期間を延長させた（ＳＨＩＭＯＳＡＫＩ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．４８５：１４４－１５１，２０１７；ＺＨＡＮＧ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（１３ Ｓｕｐｐｌ）：５５８６，２０１７）。さらに驚くべきことに、ＮＡＧＡＩ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．３：１０８－１０９９，２０１４）において開発された抗ＴＦＲＣは、生体外及び生体内の両方で口腔扁平上皮がん（ＯＳＣＣ）細胞の増殖を阻害し（ＮＥＩＶＥＹＡＮＳ ｅｔ ａｌ． ＭＡｂｓ．１１：５９３－６０５，２０１９．）、これにより、ＴｆＲ１は、造血器悪性腫瘍に加え、固形腫瘍の治療にも使用できる見通しがあることが示唆される。

【0005】

分裂細胞におけるＴｆＲ１の遍在的な発現プロファイルにより、抗ＴｆＲ１抗体は、がん患者には耐えられない普遍的な抗増殖活性を有する可能性がある。動物モデルにおける赤血球（ＲＢＣ）前駆細胞及び骨髄前駆細胞に対する抗ＴｆＲ１抗体の軽度から中等度の毒性が報告されている（ＣＡＮＤＥＬＡＲＩＡ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７ Ｍａｒｃｈ ２０２１）。４２／６以外にも、多くの抗ヒトＴｆＲ１抗体は有望な前臨床結果を示しているが、抗ＴｆＲ１抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であるＣＸ－２０２９だけは、臨床段階まで進んでおり、第Ｉ相臨床試験において赤血球輸血で管理可能な用量依存的な血液毒性（貧血、好中球減少症、及び白血球減少症）を示している（ＪＯＨＮＳＯＮ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２７：４５２１－４５３０，２０２１）。したがって、がん治療のために、特異的にがん細胞を標的とし、正常な細胞との交差反応が最小限に抑えられる抗ＴｆＲ１抗体が必要となる。

【発明の概要】

【0006】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、複数の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）生細胞株で免疫化されたマウスから得られたハイブリドーマの１つによって産生されたモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、κ）であり、ＡＭＬ及び他のがん細胞で発現されたヒトＴｆＲ１に対する特異的ｍＡｂとして同定された。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとＴｆＲ１との間の親和性は非常に高い（Ｋ_Ｄ＜１×１０^－１２Ｍ）。生体外アッセイは、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂはがん細胞の増殖に対してわずかな阻害効果を有することを示した。ある生体内研究では、メルタンシン（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、ＤＭ１、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン）と結合した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）形態のＭＡｂ１１－２２．１キメラ抗体（ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１）はＯＣＩ／ＡＭＬ２異種移植腫瘍の成長を顕著に阻害した。

【0007】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの軽鎖の可変領域のコード配列は、以下の配列番号１に示すとおりである。
１ ｇａｃａｔｔｇｔｇａ ｔｇａｃａｃａｇｔｃ ｔｃｃａｔｃｃｔｃｃ ｃｔｇａｃｔｇｔｇａ ｃａｇｃａｇｇａｇａ ５０
５１ ｇａａｇｇｔｃａｃｔ ａｔｇａｇｃｔｇｃａ ａｇｔｃｃａｇｔｃａ ｇａｇｔｃｔｇｔｔａ ａａｔａｇｔｇｇａａ １００
１０１ ａｔｃａａａａｇａａ ｃｔａｃｔｔｇａｃｃ ｔｇｇｔａｃｃａｇｃ ａｇａａａｃｃａｇｇ ａｃａｇｃｃｔｃｃｔ １５０
１５１ ａａａｃｔｇｔｔｇａ ｔｃｔａｃｔｇｇｇｃ ａｔｃｃａｃｔｔｇｇ ｇａａｔｃｔａｇｇｇ ｔｃｃｃｔｇａｔｃａ ２００
２０１ ｃｔｔｃａｃａｇｇｃ ａｇｔｇｇａｔｃｔｇ ｇａａｃａｇａｔｔｔ ｃａｃｔｃｔｃａｃｃ ａｔｃａｇｃａｇｔｇ ２５０
２５１ ｔｇｃａｇｇｃｔｇａ ａｇａｃｃｔｇｇｃａ ｇｔｃｔａｔｔａｃｔ ｇｔｃａｇａａｔｇａ ｔｔａｔａｇｔｔａｔ ３００
３０１ ｃｃｔｃｔｃａｃｇｔ ｔｃｇｇｔｇｃｔｇｇ ｇａｃｃａａｇｃｔｇ ｇａｇｃｔｇａａａｃ ｇｇｇｃｔｇａｔｇｃ ３５０
３５１ ｔｇｃａ（配列番号１）

【0008】

軽鎖の可変領域における翻訳されたアミノ酸配列は、以下の配列番号２として予測され、３つの抗原決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３、左から右へ）が太字と下線で強調表示されている。
ＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬ ＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭ ＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮ ＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷ ＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫ ＬＬＩＹＷＡＳＴＷＥ ＳＲＶＰＤＨＦＴＧＳ ＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩ ＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶ ＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰ ＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥ ＬＫＲＡＤＡＡ（配列番号２）

【0009】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの重鎖の可変領域のコード配列は、以下の配列番号３に示すとおりである。
１ ｇａｇｇｔｃｃａｇｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔｇｇｔｇａａｇｃ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ５０
５１ ａｇｔｇａｇｇａｔｔ ｔｃｃｔｇｃａａｇａ ｃｔｔｃｔｇｇｃｔａ ｃａｃｃｔｔｃａｃａ ａａｃｔａｃｔａｔａ １００
１０１ ｔａｃａｃｔｇｇａｔ ｇａａｇｃａｇａｇｇ ｃｃｔｇｇａｃａｇｇ ｇａｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔｇｇ １５０
１５１ ａｔｔｔａｔｃｃｔｇ ｇａｇａｔｇｇｔａａ ｔｔｃｔｃａｔｔａｃ ａａｔｇａｇａａｇｔ ｔｃａａｇｇｇｃａａ ２００
２０１ ｇａｃｃａｃａｃｔｇ ａｃｔｇｃａｇａｃａ ａａｔｃｃｔｃｃａｇ ｃａｃａｇｇｃｔａｃ ａｔａｔｔｇｃｔｃａ ２５０
２５１ ｇｃａｇｃｃｔｇａｃ ｃｔｃｔｇａａｇａｃ ｔｃｔｇｃａｇｔｃｔ ａｔｔｔｃｔｇｔａｃ ａａｇａｇａｔｔａｔ ３００
３０１ ｇａｔａａｃｔａｃｇ ｇｇｇｇａｔｔｔｇｃ ｔｔａｃｔｇｇｇｇｃ ｃａａｇｇｇａｃｔｃ ｔｇｇｔｃａｃｔｇｔ ３５０
３５１ ｃｔｃｔ（配列番号３）

【0010】

重鎖の可変領域における翻訳されたアミノ酸配列は、以下の配列番号４として予測され、３つの抗原決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３、左から右へ）が太字と下線で強調表示されている。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥ ＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩ ＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴ ＮＹＹＩＨＷＭＫＱＲ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩ ＹＰＧＤＧＮＳＨＹＮ ＥＫＦＫＧＫＴＴＬＴ ＡＤＫＳＳＳＴＧＹＩ ＬＬＳＳＬＴＳＥＤＳ ＡＶＹＦＣＴＲＤＹＤ ＮＹＧＧＦＡＹＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４）

【0011】

本発明は、ＭＡｂ１１－２２．１と命名された抗ＴｆＲ１特異的ｍＡｂの軽鎖ＣＤＲ領域と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一である１つ以上の軽鎖ＣＤＲ領域を含み、配列番号２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一である軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体などの抗体（以下に定義される）、その断片及び誘導体を含む結合剤（以下に定義される）に関する。任意選択的に、結合剤の重鎖可変領域は、配列番号４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一である。前記結合剤は、配列ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号５）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一である、ＭＡｂ１１－２２．１の軽鎖ＣＤＲ１のような領域を含んでもよい。前記結合剤は、配列ＷＡＳＴＷＥＳＲ（配列番号６）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一であるＭＡｂ１１－２２．１の軽鎖ＣＤＲ２のような領域を含んでもよい。前記結合剤は、配列ＱＮＤＹＳＹＰＬＴ（配列番号７）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一であるＭＡｂ１１－２２．１の軽鎖ＣＤＲ３のような領域を含んでもよい。前記結合剤は、配列ＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＹＩＨ（配列番号８）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一であるＭＡｂ１１－２２．１の重鎖ＣＤＲ１のような領域を含んでもよい。前記結合剤は、配列ＷＩＹＰＧＤＧＮＳＨＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号９）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一であるＭＡｂ１１－２２．１の重鎖ＣＤＲ２のような領域を含んでもよい。前記結合剤は、配列ＴＲＤＹＤＮＹＧＧＦＡＹ（配列番号１０）と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一であるＭＡｂ１１－２２．１の重鎖ＣＤＲ３のような領域を含んでもよい。

【0012】

本願は、ＭＡｂ１１－２２．１及びＭＡｂ１１－２２．１に関連する結合剤（以下に定義される）を用いる、ＴｆＲ１を過剰発現する複数種のがんの治療に関し、前記結合剤は、ＭＡｂ１１－２２．１の軽鎖及び重鎖のＣＤＲの配列の１つ以上に由来し、又はＭＡｂ１１－２２．１の軽鎖及び重鎖のＣＤＲの配列の１つ以上と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）同一である部分を含む。ＭＡｂ１１－２２．１は、ヒトＴｆＲ１タンパク質と高い親和性で特異的に結合し、このタンパク質の内在化を誘導する。

【0013】

前記結合剤は、例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、神経膠芽腫、前立腺がん、尿路上皮がん（膀胱がん）、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肝臓がん、胃がん（胃の扁平上皮がん、胃腺がん、胃の小細胞がん、胃扁平上皮がん、胃カルチノイド腫瘍、及び胃・十二指腸がんを含む）である原発性及び転移性がんを含む腫瘍関連疾患の治療に優先的に使用される。

【0014】

前記結合剤複合体は、好ましくは、抗腫瘍剤を含み、例えば、細胞毒素（メイタンシン若しくはその誘導体、アウリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）若しくはその誘導体、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）若しくはその誘導体、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）若しくはその誘導体又はビンカアルカロイド化合物を含み、又はさらに、コンブレタスタチンＡ－４リン酸塩、コンブレタスタチンＡ－４若しくはその誘導体、インドール－サルファ化合物、ビンカアルカロイド化合物（ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、ビングリシナート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、無水ビンブラスチン（ａｎｈｙｄｒｏｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドラスタチン１０及びその類似体、ハリコンドリンＢ及びエリブリン（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、インドール－３－オキサリルアミド、置換インドール－３－オキサリルアミド、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、７－ジエチルアミノ－３－（２’－ベンゾオキサゾリル）－クマリン（ＤＢＣ）、ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）、ラウリマライド（Ｌａｕｌｉｍａｌｉｄｅ）など）；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）及びその誘導体、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）など）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ナイトロジェンマスタード類似体（クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロマファジン（Ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（Ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ムスチン（Ｍｕｓｔｉｎｅ）、ナイトロミン（Ｎｉｔｒｏｍｉｎ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベンビチン（Ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェナメット（Ｐｈｅｎａｍｅｔ）、フェネステリン（Ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（Ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（Ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラムスチン（Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）など）；ニトロソ尿素（カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（Ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（Ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）など）；抗生物質（エンジイン系抗生物質、ジネミシン（Ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、エスペラミシン（Ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、アクラシノマイシン（Ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アントロアマイシン（Ａｎｔｈｒｏａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＣ、カラビシン（Ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、カルジノフィリン（Ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、カルミノマイシン（Ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（Ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（Ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、Ｂｏｆｅｉｍｅｉｓｕ、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、アドリアマイシン－Ｆｅ、ロドルビシン（Ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（Ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（Ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（Ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（Ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）など）；葉酸類似体（デノプテリン（Ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、プテロプテリン（Ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート（Ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、エダトレキサート（Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）など）；プリン類似体（フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン（Ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）など）；ピリミジン類似体（アンシタビン（Ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、エノキサパリン（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）、アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン、カルモフール（Ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ジデオキシウリジン（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、デオキシフルオロウリジン（ｄｅｏｘｙ－ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、フルオロウリジン（Ｆｌｕｏｒｕｒｉｄｉｎｅ）など）；アンドロゲン（カルステロン（Ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール（Ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（Ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン（Ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）など）；副腎皮質刺激ホルモン化合物（アミノグルテチミド（Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）、トリロスタン（Ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）など）；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（Ｔ－２トキシン、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（Ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａ及びアングイジン（Ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）など）；アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）（ベンゾドパ（Ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（Ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドパ（Ｕｒｅｄｏｐａ）など）；白金類似体（シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ミリプラチン（Ｍｉｒｉｐｌａｔｉｎ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）など）；抗アンドロゲン薬（フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（Ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、リュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）及びゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）など）；プロテインキナーゼ及びプロテアソーム阻害剤）を含む。

【0015】

好ましくは、結合剤はリンカーによって抗腫瘍剤と結合される。結合は、以下のメルタンシン（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、ＤＭ１）の結合について記述したように、即ち、部位特異的結合を利用して結合剤のメルカプト基を抗腫瘍剤と結合することによって行われてもよい。他の多くの結合方法が利用できる。

【0016】

いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリンのような柔軟な残基（一つの実施例は、繰り返し出現する４つのグリシンと１つのセリン、又は単なるグリシン残基の繰り返し）によって構成されてもよく、複合体の結合に使用されてもよく、これにより、隣接するタンパク質ドメインは互いに対して自由に移動できる。ドメイン間の距離を維持してこれらが相互作用できないようにしたい場合は、剛性リンカーが好ましく、一つの実施例は、（繰り返し）：グルタミン酸、３つのアラニン残基、リジンである。別の剛性リンカーは、（繰り返し）：任意のアミノ酸残基及びプロリンである。リンカーは、非切断可能なリンカー（例えば、チオエーテル、ＳＭＣＣ、ＰＥＧリンカー）又は切断可能なリンカー（バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＶＣ）ジペプチド、グルタミン酸－バリン－シトルリン（Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＧＶＣ）トリペプチド、及びジスルフィドリンカー）であってもよい。米国特許第９，３１０，３７３号「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（分子複合体）」には、複数のヒドラジドチオールリンカー、及びそれらを用いた複合体の作製が開示されている。米国特許第８，５１８，８９１号には、アミノアリールメチル基（ａｍｉｎｏａｒｙｌｍｅｔｈｙｌ）又はアミノヘテロアリール基（ａｍｉｎｏｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）部分を有するリンカーが開示されている。二官能性リンカーも記述されている。米国特許第１１，０４０，０８４号を参照する。

【0017】

適切な投与量範囲及び投与計画は、本明細書に記載された生体内及び生体外試験の結果から推定できる。結合剤は、優先的に治療用の医薬製剤として送達されるが、他の結合剤を選択するための診断、精製、又はスクリーニングに使用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0018】

特許又は出願書類は、彩色で作成された図面を少なくとも１つ含有している。彩色図面を含むこの特許又は特許出願公開の副本は、要求され、必要な料金が支払われた場合、特許庁から提供される。

【0019】

【図1A-1C】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂはＡＭＬ細胞株と直接結合するが、健康なヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合しないことを示す。

【図1A】蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイで、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは９種のヒトＡＭＬ細胞株と細胞表面において相互作用したが、ヒトＰＢＭＣと相互作用しなかったことを示す（左のパネル）。このアッセイでは、アイソタイプ対照抗体が陰性対照として使用された（右のパネル）。検出には、１：８００希釈度のフルオレセイン標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体（抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が使用された。アッセイは４℃で行われた。ＭＦＩは平均蛍光強度である。

【図1B】ＮＢ４又はＴＨＰ－１細胞の表面と結合したＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイの画像を示し（上のパネル）、アイソタイプ対照抗体はこれらの細胞を染色しなかった（下のパネル）。ＡＭＬ細胞は、４％のパラホルムアルデヒドにおいてサイトスピンでガラススライドに固定された。抗原賦活化後、細胞は１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳＴにおいてブロックされ、次に一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）と共に１時間インキュベートされ、続いて１：１０００希釈されたペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間インキュベートされた。細胞は３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色され、ヘマトキシリンで対比染色された。

【図1C】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂがＡＬＬ細胞（Ｒａｊｉ）及びＡＭＬ細胞（ＮＢ４、ＯＣＩ／ＡＭＬ２、及びＴＨＰ－１）の全細胞溶解物に存在するタンパク質バンドとハイブリダイズしたことを示すウェスタンブロットである。この標的タンパク質は、非還元条件で約２５０ｋＤａ（左のパネル）、又は還元条件では１１０ｋＤａ（右のパネル）であった。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞溶解物は陰性対照として使用された。β－アクチンは、サンプルローディング対照として特異的マウスｍＡｂによって同時に検出された。検出には、１：１０，０００希釈度のペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγが使用された。

【図2A-2D】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的としてのトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）の同定と確認を示す。

【図2A】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとＡＭＬ全細胞溶解物の反応によって得られた免疫沈降（ＩＰ）サンプルの代表的な銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像である。ＩＰサンプルは還元され、レーン１及び２に均等ににロードされ、示されている約１１０ｋＤａの標的バンドはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用に切り出されたものである。還元されたＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、対照としてレーン４に８ｎｇロードされた。タンパク質バンドは、メーカーの手順書に従って、ＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ（商標）銀染色キット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で検出された。ＭＷは分子量マーカーであり、ＨＣは重鎖、ＬＣは軽鎖である。

【図2B】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及び抗β－アクチンｍＡｂを同時にプローブされた非還元ＡＬＬ及びＡＭＬ全細胞溶解物サンプルのウェスタンブロットを示す。左のレーンには、１．２μｇの組み換え発現されたＴｆＲ１細胞外ドメイン（ｒＴｆＲ１－ＥＣＤ、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が陽性対照としてロードされ、右の２つのレーンには、２つの濃度（１×及び２×）のＣＨＯ細胞溶解物が陰性対照としてロードされた。検出には、１：２０，０００希釈度のペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγが使用された。

【図2C】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとＴｆＲ１の細胞外ドメインとの直接相互作用をＥＬＩＳＡで確認したことを示す。プレートは、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを含有する０．１μｇ／ｍＬの精製されたｒＴｆＲ１－ＥＣＤでコーティングされた。マウス抗６×Ｈｉｓ ｍＡｂ及びアイソタイプ対照抗体はそれぞれ、陽性対照、陰性対照として使用された。全ての一次抗体は、３μｇ／ｍＬの開始濃度で３倍段階希釈された。検出には、１：６，０００希釈度のペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγが使用された。

【図2D】細胞膜上にヒトＴｆＲ１－ＧＦＰ融合タンパク質（ｒＴｆＲ１－ＧＦＰ）の組み換え発現がある又はないＣＨＯ細胞のＦＡＣＳアッセイの結果を示す。ＣＨＯ細胞は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ＃１若しくは＃２（２つの異なる精製バッチ）又は市販の抗ヒトＴｆＲ１対照ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と反応しなかった。ただし、細胞膜上にＴｆＲ１を再構成した後、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ＃１、＃２及び抗ＴｆＲ１対照ｍＡｂは細胞表面と結合できた。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、抗ＴｆＲ１対照ｍＡｂよりも高い親和性を有する。使用した二次抗体は、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、希釈度は１：８００であった。

【図3A-3C】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の親和性及び動力学を示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステムからのデータ出力である。

【図3A】ｆｏｒｔｅｂｉｏソフトウェアによって生データから抽出された、２０ｎＭ ｒＴｆＲ１－ＥＣＤ（左のパネル）又は３００ｎＭ ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂ（陽性対照、右のパネル）と結合するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの結合曲線及び解離曲線を示す整列したセンサーグラムトレースである。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステムには、１０ｎＭ又は５０ｎＭ ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂを固定化するための抗マウスＦｃ捕獲（ＡＭＣ）バイオセンサーが装備された。主要なステップの持続時間は、６０秒間の動力学緩衝液でのベースライン、４５０秒間のＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの固定化、１２０秒間の動力学緩衝液でのベースライン／洗浄、４５０秒間の抗原結合、続いて３０００秒間の動力学緩衝液での解離だけとなった。上の曲線は、１０ｎＭ ｍＡｂで、下の曲線は、５０ｎＭ ｍＡｂであった。

【図3B】２０ｎＭから２．５倍段階希釈されるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの結合の動力学データを示す。観察期間（３０００秒）内に、結合はすぐに起こり、解離は検出されなかった。

【図3C】装置の信頼性を検証するために、段階希釈におけるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと、陽性対照であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂとの結合の動力学データを示す。

【図4】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及びトランスフェリン（Ｔｆ）がｒＴｆＲ１－ＥＣＤ上の異なる部位と結合することを示す、競合ＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートは、０．１μｇ／ｍＬのｒＴｆＲ１－ＥＣＤでコーティングされ、２μｇ／ｍＬから４倍段階希釈された７つの濃度のＨＲＰ結合ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと個別に混合した５つの濃度の精製Ｔｆタンパク質（Ｘ軸）のアレイと、異なる濃度のＴｆ単独と共にインキュベートされた。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＨＲＰは、ｒＴｆＲ１－ＥＣＤと用量依存的に結合したが、Ｔｆの存在とは無関係であった。データは、重複サンプルの平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。

【図5A-5C】健康な成人のＰＢＭＣ及び骨髓（ＢＭ）細胞、及びＡＭＬ患者のＢＭ細胞に対するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの結合のＦＡＣＳ結果である。

【図5A】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、ｍＡｂの濃度のいかんに関わらず、正常なヒトのＰＢＭＣ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）又は正常なヒトのＢＭ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ（カリフォルニア州・フリーモント））と結合しなかったことを示す。アイソタイプ対照抗体は陰性対照として働いた。ｍＡｂは、２０μｇ／ｍＬから８倍段階希釈され、１：８００希釈された抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣで検出された。

【図5B】ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、ＡＭＬ患者からのＢＭ細胞と用量依存的に結合したことを示す。

【図5C】異なるｍＡｂで染色されたＰＢＭＣ及びＢＭ細胞の散布図である。細胞表面マーカーが陽性か陰性を判断するためのカットオフ値は実線で示され、グラフを４つの象限に分割している。造血幹細胞に特異的なＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３４ ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（マサチューセッツ州・ケンブリッジ））により、ＢＭサンプルに幹細胞が存在することが確認された（左下のパネル）。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及びアイソタイプ対照抗体は、ＢＭ細胞の粘着性により、少量の一部のＢＭ細胞を染色した。

【図5D】抗ヒトＣＤ２３３－ＰＥ ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色されたＰＢＭＣ及びＢＭ細胞集団に存在する赤血球は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体と反応しなかったことを示す。

【図5E】抗ヒトＣＤ２３５ａ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色されたＰＢＭＣ又はＢＭ細胞集団に存在する赤血球及び赤芽球は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体と反応しなかったことを示す。

【図6A-6C】がん細胞株を用いるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの内在化アッセイの結果である。

【図6A】ＦＡＣＳアッセイにおいて異なる条件下で、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ、マウス抗ヒトＣＤ２０ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体で個別に染色された３つの白血病細胞株（ＯＣＩ／ＡＭＬ２、ＮＢ４、及びＲａｊｉ）の細胞表面上の蛍光強度が比較される。細胞は、４℃で各ｍＡｂと共に１時間インキュベートされ、続いて冷ＰＢＳで洗浄され、４℃又は３７℃で培地においてインキュベートされた。細胞染色は、それぞれ、３０分間、１時間、及び２時間、抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣで行われた。４℃では、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは２つのＡＭＬ細胞株の表面と用量依存的に結合したが、Ｒａｊｉ細胞と結合せず、３７℃に移すと直ちに内在化された（左のパネル）。Ｒａｊｉ細胞と相互作用したがＡＭＬ細胞と相互作用しない抗ＣＤ２０ ｍＡｂは、３７℃でＲａｊｉ細胞によって部分的に内在化された（中間のパネル）。どちらの細胞株とも結合しないアイソタイプ対照抗体は陰性対照として使用された（右のパネル）。

【図6B】ＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞株と結合し、それによって内在化されるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの代表的な蛍光画像である。重複した９６ウェル培養プレートの細胞は、ＤＭＥＭ培地における異なる濃度のＣＦ４８８標識ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はＣＦ４８８標識アイソタイプ対照抗体と共に４℃で１時間インキュベートされ、続いてｍＡｂを除去するために氷冷ＰＢＳで洗浄された。１つのプレートの細胞は、Ｋｅｙｅｎｃｅ蛍光顕微鏡を用いる４００×倍率での撮影に備えて氷冷ＰＢＳに再懸濁され、重複プレートの細胞は、ｍＡｂの内在化ができるよう、温かいＳＦＭに再懸濁され、３７℃で１時間インキュベートされた。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８は、４℃でＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞の表面と結合したが、３７℃で１時間インキュベートした後は主として内在化された。対照として、ＣＦ４８８標識アイソタイプ対照ｍＡｂは細胞を染色せず、細胞によって内在化されてもいなかった（右のパネル）。画像は、いずれも同じ設定で撮影された。スケールバーは１００μｍを表す。

【図6C】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞によるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８の結合及び内在化の用量依存的な増加を示す代表的な画像である。アッセイの手順は、より高い濃度（５μｇ／ｍＬ）のｍＡｂを使用したことを除き、図６Ｂと同じであった。４℃では、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面に位置するだけでなく、細胞内にも存在することから、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株によるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８の内在化の傾向が高いことが示される。３７℃で１時間インキュベートした後、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８の大部分が内在化された。ＣＦ４８８標識アイソタイプ対照ｍＡｂ－ＣＦ４８８は細胞を染色せず、又は、細胞にも取り込まれなかった（右のパネル）。画像は、同じ露出時間で４００×の倍率で撮影された。スケールバーは１００μｍを表す。

【図7】ＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞の増殖に対するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの部分的な阻害効果を示す。細胞（２×１０^４個の細胞／ｍＬ）は、１００μｇ／ｍＬのＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体の存在下で、３７℃で加湿５％のＣＯ_２の雰囲気で培養された。４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ_４５０）で反映される細胞の生存率は、１０μＬのＣＣＫ－８溶液で４時間処理することにより、２４時間ごとに監視された。データは、３つの重複サンプルの平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５。

【図8A-8B】ＭＡｂ１１－２２．１キメラ抗体（ｃＡｂ）とｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の親和性及び動力学を示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステムからのデータ出力である。

【図8A】２．５倍段階希釈（５０、２０、８、３．２、及び１．２８ｎＭ）におけるＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の結合動力学に関する結合及び解離曲線のフィッティングビュー及びデータ表を示す。Ｏｃｔｅｔ ＱＫシステムには、５０ｎＭ又は１０ｎＭ ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂを固定化するための抗ヒトＦｃ捕獲（ＡＨＣ）バイオセンサーが装備された。主要なステップの持続時間は、６０秒間の動力学緩衝液でのベースライン、４５０秒間のＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの固定化、１２０秒間の動力学緩衝液でのベースライン／洗浄、４５０秒間の抗原と固定化ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂとの結合、続いて３６００秒間の動力学緩衝液での解離だけとなった。解離に許容される期間に結合シグナルの減衰が検出されなかったため、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤのＫ_Ｄは１ｐＭ未満であった。

【図8B】５０ｎＭ ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂへの結合における３倍段階希釈（３００、１００、３３．３、１１．１、及び３．７ｎＭ）に関する、陽性対照であるヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂの動力学解析のフィッティングビューである。計算されたＫ_Ｄは２．１８ｎＭであった。

【図9】生体外における、様々ながん細胞株の増殖に対するＳ２３９Ｃ変異がある又はないＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂ及びアイソタイプ対照抗体の影響を示す棒グラフである。ＯＣＩ／ＡＭＬ２、Ｒａｊｉ、ＨＣＣ３８及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、最適な量で個別の抗体と共に５日間培養された後、ＣＣＫ－８アッセイで解析された。２つの用量（１００及び３００μｇ／ｍＬ）のＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂ（斜線バー）及びＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ ｃＡｂ（灰色バー）がＤＭ１で処理され、Ｘ軸の下方に「＋」記号で示し、ＤＭ１処理を行わなかった抗体は「－」記号で示す。非結合アイソタイプ対照抗体（白色バー）は、各細胞株の増殖のベースラインを反映した。データは、３つの重複サンプルの平均±ＳＤを示す。

【図10】ＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞株由来異種移植（ＣＬＤＸ）マウスモデルにおける腫瘍の成長に対するＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１の生体内有効性を示す。ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇ（低用量、ｎ＝５）又は２０ｍｇ／ｋｇ（高用量、ｎ＝６）でＱ４×７のスケジュール（０日目から２４日目）で腹腔内に注射された（ｉ．ｐ．）。陰性対照群には、ＤＭ１で処理したアイソタイプ対照抗体（Ｓ２３９Ｃ変異なし）が２０ｍｇ／ｋｇ／Ｑ４×７／ｉ．ｐ．で投与された（ｎ＝５）。腫瘍体積は４日ごとに測定された。左のパネルは、各群の個別のマウスの腫瘍体積についてプロットしたもので、右のパネルは、異なる群の間の平均腫瘍体積±ＳＤを比較したものである。４回の抗体治療後の１６日目から、低用量群の平均腫瘍体積はアイソタイプ対照であるＤＭ１群と有意に異なった（＊Ｐ＜０．０５）。

【発明を実施するための形態】

【0020】

文脈で明確な断りがない限り、単数形の「１つ／１種（ａ／ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」には複数形が含まれることを理解されたい。モノクローナル抗体は「ｍＡｂ」と呼ばれることがある。用語「結合剤」及び「抗体」の単数形と複数形は、入れ替えて使用される。

【0021】

本発明の結合剤には、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３のζ鎖（ＣＤ３ζ）と融合した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、ＭＡｂ１１－２２．１様若しくはＭＡｂ１１－２２．１に由来する抗体、抗体断片、融合タンパク質、又は抗体に由来する若しくは改変されたキメラ抗体受容体（ＣＡＲ）が含まれる。ＣＡＲは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージを含むが、それらに限定されないＣＡＲ免疫エフェクター細胞において発現されることが好ましい。

【0022】

用語「結合剤」には、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって標的抗原、例えば、胃がん細胞上の抗原と結合できる免疫グロブリン分子である抗体が含まれる（両方とも複数形で入れ替えて使用される）。本明細書で使用される場合、用語「抗体」には、完全な（即ち、全長の）ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体だけでなく、それらの抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｒＩｇＧ、単鎖（ｓｃＦｖ）又はｓｃ（Ｆｖ）_２、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又はＶＨＨドメイン、及び必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の改変された配置が含まれ、前記改変された配置は、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、及び共有結合によって改変された抗体を含む。抗体薬物複合体も含まれる。

【0023】

抗体には、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などのあらゆるクラスの抗体が含まれ、抗体はいかなる特定のクラスである必要もない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、異なるクラスに割り当てられてもよい。５つの主要なクラスの免疫グロブリン、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭがあり、これらのクラスのうちのくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２に分けられる。

【0024】

本明細書に記述されている抗体は、マウス、ラット、ヒト又は任意の他の起源のものであってもよい（米国特許第７３１７０９１Ｂ２号に記述されている抗体などのキメラ抗体又はヒト化抗体が含まれ、親和性成熟によって生成されるこのような抗体も含まれる）。いくつかの実施例では、抗体は、例えば、補体媒介性溶解を誘発せず、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、免疫学的に不活性な定常領域など、改変された定常領域を含む。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示されている方法で評価してもよい。

【0025】

ヒト化抗体とは、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むその抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、マウス、ラット又はウサギなど、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列においても発見されないが、抗体の性能の更なる改良及び最適化のために含まれる残基を含んでもよい。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ただし、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらに対応する。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。抗体は、国際特許第ＷＯ９９／５８５７２号に記述されているような改変されたＦｃ領域を有してもよい。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に対して変化された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ及び／又は６つ）を有する。ヒト化抗体は、親和性成熟に関わる場合がある。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８）を参照する。

【0026】

別の実施例では、本明細書に記述されている抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含んでもよいキメラ抗体である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照する。キメラ抗体とは、第１の種からの可変領域又は可変領域の一部、及び、第２の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、それらのキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の可変領域は、いずれも、ある種の哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ラットなどの非ヒト哺乳動物）に由来する抗体の可変領域の模倣物であり、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体の配列と相同である。いくつかの実施形態では、可変領域及び／又は定常領域においてアミノ酸改変が行われてもよい。米国特許第４，８１６，５６７号を参照する。

【0027】

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、本明細書で記述又は請求されているより短い配列に対して、計数及び比較することよって、又はＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３において修正したように利用することによって算術的に決定してよい。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、対象のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実行されてもよい。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記述されているギャップＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を利用してもよい。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してもよい。

【0028】

（結合剤の作製）
ヒトの生体内治療用途向けに、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を作製するための多くの方法が開発されている。最もよく用いられる方法は、ハイブリドーマ法を利用してマウスｍＡｂを作製し、次にｍＡｂのＶＨ及びＶＬドメイン並びに定常ドメインのフレームワーク領域をヒトＶＨ及びＶＬドメインの相同なヒトフレームワーク領域並びに所望のヒトγ免疫グロブリンアイソタイプ及びサブクラスの定常領域に変換することによってｍＡｂをヒト化することである。米国特許第５，２２５，５３９号を参照する。

【0029】

モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））によって作製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウス又は、ハムスター若しくはウサギなど他の適切な宿主動物を上記のように免疫化して、免疫化のために用いるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する又は産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球を生体外で免疫化してもよい。

【0030】

モノクローナル抗体を作製するために、抗原で免疫化された哺乳動物から免疫細胞を収集し、上記のように血清における所望の抗体のレベルの増加を調べ、前記免疫細胞は細胞融合を受ける。細胞融合に用いる免疫細胞は、脾臓から得られることが好ましい。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞が含まれ、より好ましくは、薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞である。

【0031】

好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体を産生する細胞による安定的な高レベルの抗体産生に利用でき、ＨＡＴ培地などの培地に感受性のある骨髄腫細胞である。それらのうち、ＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来する細胞株（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（米国カリフォルニア州・サンディエゴ）から利用可能）、及びＳＰ－２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州・ロックビル）から利用可能）などのマウス骨髄腫細胞株が好ましい骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生のために使用されることも記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。

【0032】

上記の免疫細胞及び骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３－４６，１９８１）に従って融合させてもよい。ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。細胞融合により得られたハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）などの標準的な選択培地で培養して選択されてもよい。細胞培養は、典型的には、ＨＡＴ培地で数日間から数週間継続し、時間は所望のハイブリドーマ（非融合細胞）を除く全ての他の細胞が死亡するのに十分である。次に、標準的な限界希釈を実行して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、クローニングする。

【0033】

このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を適切な培地に接種し、成長させる。前記培地は、融合していない親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１種又は複数種の物質を含有することが好ましい。例えば、親骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシル基転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。ハイブリドーマ細胞が成長する培地には、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関するアッセイが行われる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又は生体外結合アッセイによって決定される。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び／又は免疫蛍光法における吸光度の測定は、抗体の抗原結合活性を測定するために利用できる。

【0034】

所望の特異性、親和性及び／又は活性のある抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によりクローンをサブクローニングし、標準的な方法で成長させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適する適切な培地として、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製方法、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、腹水又は血清から適切に分離される。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物、例えば、マウスの腹腔内で腹水腫瘍として体内で成長できる。

【0035】

得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、プロテインＡ又はプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又は本発明のタンパク質が結合するアフィニティーカラムにより精製してもよい。

【0036】

このようにして得られたモノクローナル抗体は、また遺伝子工学技術を利用して組換えで作製してもよい（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ，１９９０を参照する）。抗体を産生するハイブリドーマ又は免疫リンパ球などの免疫細胞から抗体をコードするＤＮＡをクローニングして、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入することによって組み換え抗体を作製してもよい。組み換え技術は、以下の文献に記述されている。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄuｂｅｌ，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１）などである。

【0037】

得られた抗体を治療のためにヒトに投与する場合、免疫原性を低下させるために、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましい。例えば、細胞全体又はヒト細胞タンパク質又はその溶解物から選択された抗原でヒト抗体遺伝子レパートリーを有する遺伝子組換え動物を免疫化してもよい。次に、動物から抗体を産生する細胞を収集し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得て、そこから前記抗原に対するヒト抗体を作製できる。あるいは、免疫リンパ球など、抗体を産生する免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の作製に使用してもよい。

【0038】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法で（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）簡単に分離及び配列決定できる。ハイブリドーマ細胞は、このようなｃＤＮＡの好ましい供給源となる。分離した後、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、次に、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は他の方式で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入して、組み換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を産生させてもよい。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組み換え発現に関する概説的な文章として、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０：１５１－１８８（１９９２）が挙げられる。

【0039】

通常の技術により、上記のハイブリドーマ細胞によって産生される抗体をコードするＤＮＡを遺伝学的に組み換えて、遺伝子改変抗体を産生させてもよい。従来の組み換え技術により、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体などの遺伝子改変抗体を産生させてもよい。次に、例えば、ヒト重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインをコード配列で置換することによって相同なマウス配列を置き換え（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体若しくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、ＤＮＡを改変してもよい。前記方法により、キメラ抗体又はヒト化抗体など、標的抗原の結合特異性を有する遺伝子改変抗体を作製してもよい。

【0040】

あるいは、特定の遺伝子組換え動物（例えば、マウス）は、内因性免疫グロブリンの産生がなくても免疫化によりヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる。例えば、キメラマウス及び生殖細胞変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合欠失により、内因性抗体の産生が完全に阻害されることが記述されている。このような生殖細胞変異マウスにヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると抗原刺激によりヒト抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照する。Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州・フリーモント）から提供される遺伝子組換えマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州・プリンストン）によって提供されるＨｕＭＡｂ－ＭｏｕｓｅＲ（商標）、ＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）も参照する。別の代替の実施形態では、ファージディスプレイ技術により、組み換えで抗体を作製してもよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；第６，２６５，１５０号；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５；（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）を参照する。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３）を利用して、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片を生体外で産生してもよい。

【0041】

Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ペプシンでの消化又は他のタンパク質での消化により完全な抗体から産生されてもよい（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）ａｎｄ Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照する）。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド結合を還元して生成されてもよい。現在、このような断片は、組み換え宿主細胞によって直接産生されてもよい。例えば、抗体ファージライブラリから抗体断片を分離させてもよい。あるいは、大腸菌からＦ（ａｂ’）_２－ＳＨ断片を直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）_２断片を形成させてもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別の手法によれば、組み換え宿主細胞の培養物からＦ（ａｂ’）_２断片を直接分離してもよい。

【0042】

米国特許第５，９３２，４４８号には、ロイシンジッパーによって結合されたＦａｂ’部分を有する二重特異性抗体の作製が開示され、米国特許第７，５３８，１９６号には、各部分がリンカーによって結合された二重特異性抗体の作製が開示され、米国特許第８，１４８，４９６号には、ペプチドリンカーを介して互いに接続された少なくとも４つの可変ドメインを有する多重特異性Ｆｖ抗体構築物が開示されている。

【0043】

米国特許公開第２０１７０３３５２８１号には、がん関連抗原と結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞の作製が記述されている。同じような一般的な技術は、Ｔ細胞又は他の免疫エフェクター細胞を改変して、ＭＡｂ１１－２２．１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１つ以上をがん治療のために抗原結合ドメインとして発現するために使用されてもよい。ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、任意の抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又はＶＨＨドメインを含んでもよい。

【0044】

単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）分子は、国際特許第ＷＯ９４０４６７８号及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８に開示されている。ｓｄＡｂ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。ｓｄＡｂの１つのタイプでは、可変ドメインが、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、グアナコなどのラクダ科の種に由来してもよい、天然に軽鎖を欠く重鎖分子に由来する。ラクダ科以外の他の種も、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生する場合がある。ｓｄＡｂ分子は、組換え体、ＣＤＲグラフトされたもの、ヒト化されたもの、ラクダ化されたもの、脱免疫化されたもの、及び／又は生体外で生成された（例えば、ファージディスプレイによって選択された）ものであってもよい。

【0045】

上記の結合剤はいずれも、がん細胞に対する細胞毒素と結合させることにより、がん細胞を標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）において使用することができる。米国特許第９７６４０４１号；米国特許公開第２０１７０１５１３４３号を参照する。

【0046】

（高親和性抗体変異体）
本明細書に記載されている配列の変異体を有する抗体は、本発明の範囲内である。変異体の１つのタイプは、以下に記載の高親和性変異体である。

【0047】

抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したままヒト化されるべきである。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化製品を分析するプロセスによってヒト化抗体を作製する。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能である。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな３次元立体配座構造を表示して説明するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割、即ち、候補免疫グロブリンのその抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにすれば、レシピエント配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択して組み合わせて、標的抗原に対する親和性の増加など、所望の抗体特性を実現できる。

【0048】

改変すべきフレームワーク領域残基の例としては、標的と非共有結合的に直接結合するもの（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７－７５３（１９８６））、ＣＤＲの立体配座と相互作用し又は前記立体配座に影響を与える残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、及び／又はＶＬ－ＶＨインタフェースに関与する残基（欧州特許第ＥＰ２３９４００Ｂ１号）が挙げられる。特定の実施形態では、このようなフレームワーク領域残基の１つ以上に対する改変は、対象の標的に対する抗体の結合親和性の向上につながる。

【0049】

アミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当分野で知られる様々な方法によって作製される。これらの方法には、オリゴヌクレオチドの媒介する（又は部位特異的）変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発、及び種依存性抗体の以前に作製された変異体又は非変異体形態のカセット変異誘発が含まれるが、それらに限定されない。変異体を生成するための好ましい方法は、オリゴヌクレオチドの媒介する合成である。特定の実施形態では、抗体変異体は、置換された単一の超可変領域残基だけを有し、例えば、約２種～約１５種の超可変領域置換を有する。

【0050】

変異体のライブラリを生成する方法の１つは、オリゴヌクレオチドの媒介する合成である。それぞれ約１００個のヌクレオチドを有する３種のオリゴヌクレオチドを、軽鎖又は重鎖可変領域全体にわたって合成してもよい。各オリゴヌクレオチドは、（１）トリプレット（ＮＮＫ）．ｓｕｂ．２０によって生成される６０個のアミノ酸のストレッチ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＫはＧ又はＴである）、（２）各末端における次のオリゴ又はベクター配列との約１５～３０個のヌクレオチドのオーバーラップを含んでもよい。ＰＣＲ反応でこれらの３種のオリゴヌクレオチドをアニーリングすると、ポリメラーゼが反対の鎖を埋めて、完全な二本鎖の重鎖又は軽鎖可変領域配列を生成する。トリプレットの数は、任意の長さの繰り返しに調整してもよく、オリゴヌクレオチドにおけるその位置は、特定のＣＤＲ又はフレームワーク領域内のアミノ酸だけを置換するように選択してもよい。（ＮＮＫ）を使用することにより、コード化された変異体の各位置で２０個のアミノ酸すべてが可能である。５～１０個のアミノ酸（１５～３０個のヌクレオチド）のオーバーラップ配列は置換されないが、フレームワークのスタッキング領域内に収まるように選択するか、又は単独な合成ラウンド若しくはその後の合成ラウンドによって置換されてもよい。オリゴヌクレオチドの合成方法は、当分野でよく知られており、市販されてもいる。これらのオリゴヌクレオチドから抗体変異体を生成する方法も、当分野でよく知られており、例えば、ＰＣＲである。

【0051】

配列内のランダムな位置が異なる重鎖及び軽鎖変異体のライブラリは、バクテリオファージなど、任意の発現ベクターにおいて構築してもよく、それぞれのベクターは特定の重鎖及び軽鎖変異体をコードするＤＮＡを含有する。

【0052】

抗体変異体の産生後、親抗体に対する変異体の生物学的活性を決定する。上述したように、これは、標的に対する変異体の結合親和性の決定に関する。対象の標的に対する抗体変異体の結合能力を速やかにスクリーニングするためのハイスループット方法は数多くある。

【0053】

次に、親抗体を上回る結合親和性を得るために、この初回のスクリーニングによって選択された１種以上の抗体変異体をスクリーニングしてもよい。結合親和性を決定するための通常の方法の１つは、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して結合及び解離速度定数を評価することである。メーカー（ＢＩＡｃｏｒｅ）の説明に従って、標的の共有結合のためにバイオセンサーチップを活性化させる。次に、標的を希釈してチップに注射し、固定化物質の応答単位（ＲＵ）でのシグナルを得る。ＲＵでのシグナルが固定化物質の質量に比例するため、これはマトリックス上の固定化標的の密度の範囲を表す。解離データを１サイトモデルにフィッティングさせてＫ_ｏｆｆ±Ｓ．Ｄ．（測定値の標準偏差）を得る。各結合曲線に対して擬似一次速度定数（Ｋｓ）を計算し、タンパク質濃度の関数としてプロットすることにより、Ｋ_ｏｎ±Ｓ．Ｄ．（フィッティングの標準誤差）を得る。ＳＰＲ測定により、結合の平衡解離定数Ｋ_ｄをＫ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎとして計算する。平衡解離定数Ｋ_ＤがＫ_ｏｆｆに反比例するため、結合速度（Ｋ_ｏｎ）がすべての変異体に対して定数であると仮定すると、親和性の向上が推定できる。

【0054】

任意選択的に、得られた高い親和性を有する候補は、向上した結合親和性を有する抗体変異体には依然として所望の治療特性が保持されていることを確認するために、例えば、以下の実施例で記述されているアッセイでテストするように、１種以上の更なる生物学的活性アッセイにかけられてもよい。最適な抗体変異体には、親抗体よりも顕著に高い結合親和性で標的と結合する能力が保持されている。

【0055】

このようにして選択された抗体変異体は、抗体の意図された用途に応じて、しばしば更なる改変を受ける場合がある。このような改変は、アミノ酸配列の更なる変化、異種ポリペプチドとの融合、及び／又は以下に詳述するような共有結合改変に関与するものであってもよい。例えば、抗体変異体の適切な立体配座の維持に関与しないいかなるシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、一般的にセリンによって置換されてもよい。逆に、システイン結合を抗体に添加してその安定性を向上させてもよい（特に、抗体はＦｖ断片などの抗体断片である場合はそうである）。

【0056】

（製剤）
適切な抗体を作製した後、対象に投与するための製剤として調製してもよい。凍結乾燥製剤は好ましく、そのために第１のステップとして、凍結乾燥前の配合物を調製する必要がある。凍結乾燥前の配合物における抗体の量は、所望の投与量、投与方式などを考慮して決定される。タンパク質は、一般的に溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨが約４～８、好ましくは約５～７のｐＨ緩衝溶液中に存在してもよい。例示的な緩衝液としては、ヒスチジン、リン酸、トリス（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、コハク酸塩、その他の有機酸が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液及び製剤（例えば、再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約３ｍＭ～約１５ｍＭであってもよい。好ましい緩衝液は、凍結保護特性を有するヒスチジンである。コハク酸塩も有用な緩衝液である。

【0057】

凍結乾燥前の配合物に凍結乾燥保護剤が添加される。好ましい実施形態では、凍結乾燥保護剤はスクロース、トレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前の配合物中の凍結乾燥保護剤の量は、一般的に、再構成の時に得られる製剤は等張性となるような量であることが好ましいが、高張性の再構成製剤も適切な場合はある。さらに、凍結乾燥保護剤の量は、凍結乾燥時に許容できない量のタンパク質の分解／凝集が起こるほど少なくしてはならない。

【0058】

凍結乾燥保護剤が糖（スクロース、トレハロースなど）であり、タンパク質が抗体である場合は、凍結乾燥前の配合物における例示的な凍結乾燥保護剤の濃度は、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ～約３００ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭ～約１００ｍＭである。

【0059】

凍結乾燥保護剤に対するタンパク質の比率は、タンパク質と凍結乾燥保護剤の組み合わせごとに選択される。高タンパク質濃度の等張再構成製剤を生成するために、抗体がタンパク質として選択され、糖（例えば、スクロース又はトレハロース）が凍結乾燥保護剤として使用される場合、抗体に対する凍結乾燥保護剤のモル比は、１モルの抗体に対して約１００～約１５００モルの凍結乾燥保護剤であってもよく、好ましくは、１モルの抗体に対して約２００～約１０００モルの凍結乾燥保護剤であり、１モルの抗体に対して約２００～約６００モルの凍結乾燥保護剤が含まれてもよい。

【0060】

好ましい実施形態では、凍結乾燥前の配合物に界面活性剤を添加することが望ましいことが分かった。あるいは、又はさらに、界面活性剤は、凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤に添加されてもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又は８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－、若しくはステアリル－スルホベタイン、ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－、若しくはステアリル－サルコシン、リノレイル－、ミリスチル－、若しくはセチル－ベタイン、ラウロアミドプロピル－、コカミドプロピル－、リノレアミドプロピル－、ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、若しくはイソステアラミドプロピル－ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピル－、パルミドプロピル－、若しくはイソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、若しくはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、及びＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州・パターソン））、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体（例えば、プルロニック(登録商標)（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＦ６８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、再構成タンパク質の凝集を減少させ、再構成後の粒子の形成を最小限にする量である。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前の配合物中に約０．００１～０．５％、好ましくは約０．００５～０．０５％の量で存在してもよい。

【0061】

凍結乾燥前の配合物の調製には、凍結乾燥保護剤（スクロース又はトレハロースなど）と増量剤（マンニトール又はグリシンなど）の混合物を使用してもよい。増量剤により、過剰なポケットのない均一な凍結乾燥ケーキを製造できる。

【0062】

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されているようなその他の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、凍結乾燥前の配合物（及び／又は凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤）に含まれてもよい。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される用量及び濃度ではレシピエンに対して無毒であり、別の緩衝剤、防腐剤、共溶媒、抗酸化剤（アスコルビン酸、メチオニンなど）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、生分解性ポリマー（ポリエステルなど）、及び／又は塩形成対イオン（ナトリウムなど）が含まれる。

【0063】

本明細書に記述されている医薬組成物及び製剤は、保存中に物理的及び化学的安定性及び完全性を保持するために安定しているものが好ましい。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術は当分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定されてもよい。

【0064】

体内投与に使用する製剤は無菌なものでなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌濾過膜で濾過することにより簡単に実現できることである。あるいは、タンパク質を除く成分に対して約１２０℃で約３０分間高圧滅菌をすることで、混合物全体の無菌性を実現できる。

【0065】

タンパク質、凍結乾燥保護剤、その他の任意選択的な成分を混合した後、配合物を凍結乾燥する。この目的には、Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、米国）又はＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ－Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）の凍結乾燥機など、様々な凍結乾燥機が利用できる。凍結乾燥は、配合物を凍結し、続いて、一次乾燥に適する温度で凍結内容物から氷を昇華させることによって行われる。この条件においては、製品の温度が製剤の共晶点又は崩壊温度より低い。

【0066】

典型的には、一次乾燥の棚温度は、適切な圧力（典型的には約５０～２５０ｍＴｏｒｒ）では約－３０～２５℃の範囲である（一次乾燥中、製品が凍結したままであると仮定する）。乾燥に必要な時間は、主にサンプルを入れる容器（例えば、ガラスバイアル）の中の配合物、そのサイズ、タイプ、及び液体の量によって決まり、数時間から数日（例えば、４０～６０時間）の範囲になる。二次乾燥段階は、主に容器のタイプとサイズ、使用するタンパク質のタイプによって、約０～４０℃で実行されてもよい。例えば、凍結乾燥の水分除去段階全体の棚温度は、約１５～３０℃（約２０℃）であってもよい。二次乾燥に必要な時間及び圧力は、例えば、温度、その他のパラメータなどに応じて、適切な凍結乾燥ケーキが生成される時間及び圧力である。二次乾燥時間は、製品に残留したい水分レベルによって決まり、典型的には少なくとも約５時間（例えば、１０～１５時間）がかかる。圧力は、一次乾燥ステップで採用される圧力と同じであってもよい。凍結乾燥の条件は、配合とバイアルのサイズによって異なってもよい。

【0067】

場合によっては、移送ステップを回避するために、タンパク質の再構成を行う容器内でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましいことがある。この場合に、容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０、又は１００ｃｃのバイアルであってもよい。一般的な提案として、凍結乾燥により、水分含有量が約５％未満、好ましくは約３％未満の凍結乾燥製剤が得られる。

【0068】

所望の段階において、典型的にはタンパク質を患者に投与するタイミングに、凍結乾燥製剤は希釈剤で再構成されてもよく、これにより、再構成された製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前の配合物のタンパク質濃度と同じようになることが好ましい。

【0069】

再構成は、完全な水和を確保するために一般的に約２５℃の温度で行われるが、所望により他の温度を採用してもよい。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤のタイプ、賦形剤及びタンパク質の量によって決まる。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば。リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、又はデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、任意選択的に防腐剤を含有する。例示的な防腐剤は上記で記述されており、ベンジルアルコール又はフェノールアルコールなどの芳香族アルコールが好ましい防腐剤である。使用される防腐剤の量は、タンパク質との適合性について異なる防腐剤濃度を評価し、防腐剤の有効性をテストすることによって決定される。例えば、防腐剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、約０．１～２．０％、好ましくは約０．５～１．５％、最も好ましくは約１．０～１．２％の量で存在してもよい。

【0070】

あるいは、結合剤と、任意の周知の担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤、補助剤、及び本明細書に記述されており当分野でよく知られるその他の添加剤を含む非凍結乾燥製剤が使用されてもよい。

【0071】

（用量と投与）
上述した製剤は、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、皮内、関節内、滑液包内、髄腔内、皮内、腫瘍内、節内、髄内、経口、吸入若しくは局所経路による投与などの適切な経路によって投与されてもよいし、又は、経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻腔、頬側、膣若しくは埋め込み型リザーバーによって投与されてもよく、いずれの場合も、大量瞬時投与として若しくは一定期間にわたる持続注入によって投与されてもよく、又は、１、３、若しくは６か月のデポ注射可能若しくは生分解性の材料及び方法を使用するなど、注射可能なデポ投与経路によって投与されてもよい。

【0072】

ジェットネブライザー、超音波ネブライザーなどの市販の液体製剤用ネブライザーは、投与に有用である。液体製剤は直接噴霧してもよく、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧してもよい。あるいは、抗体は、フルオロカーボン製剤と定量吸入器を使用してエアロゾル化されるか、凍結乾燥粉末及び粉砕された粉末として吸入されてもよい。ＣＡＲが本発明に使用される場合、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物を腫瘍、リンパ節、又は感染部位、又はその他の場所に直接注射してもよい。

【0073】

本明細書に記述されている方法によって治療される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであってもよい。哺乳動物には、家畜、競技動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）、愛玩動物、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。

【0074】

「有効量」とは、単独にせよ、１種以上の他の有効成分との組み合わせにせよ、対象に治療効果を与えるために必要な有効成分の量を指す。有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別、体重などの個別の患者のパラメータ、治療期間、並行治療（ある場合）の特性、特定の投与経路、及び類似する要因によって異なるが、これらがすべて当業者によく知られており、通常の試験だけでも対処できる。一般的に、個別の成分又はその組み合わせの最大用量、即ち、合理的な医学的判断による最大安全用量を使用することが好ましい。医学的理由、心理的理由、又はその他の理由により、より低い用量又は許容用量が適切な場合もある。

【0075】

抗体の半減期などの経験的考慮は、一般的に投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体などのヒト免疫系に適合する抗体は、抗体の半減期を延長させ、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐために使用されてもよい。投与頻度は、治療の過程において決定及び調整されてもよく、一般的には胃がんの治療及び／又は阻害及び／又は改善及び／又は遅延に基づいて決定されるが、必ずしもそうである必要はない。あるいは、抗体の持続放出製剤が適切な場合もある。持続放出を実現するための様々な製剤及び装置は当分野で知られている。

【0076】

一実施例では、本明細書に記述されている抗体の用量は、抗体を１回以上投与された個体において経験的に決定してもよい。個体には抗体の投与量を段階的に増やしていく。抗体の有効性を評価するために、通常の方法に従って疾患の指標（例えば、腫瘍の成長）を追跡してもよい。

【0077】

一般的に、本明細書に記述されているいずれかの抗体の投与については、以下に記述される試験から初期候補投与量を推定してもよい。数日間又はそれ以上の期間にわたる反復投与の場合、状態によっては、治療は、所望の症状の阻害が生じるまで、又はがんを軽減するのに十分な治療レベルに達するまで継続される。例示的な投与計画は、最初に高用量を投与し、続いてより低い維持用量を投与することを含む。しかし、医師の実現しようとする薬物動力学的減衰のパターンによっては、他の投与計画が有用な場合はある。例えば、週１回から４回の投与が考えられる。いくつかの実施形態では、投与頻度は、週１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、若しくは１０週間に１回、又は月１回、２か月に１回、若しくは３か月に１回、又はそれ以上の間隔である。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視できる。投与計画（使用する抗体を含む）は、時間の経過とともに変わることがある。

【0078】

治療の目標及びがんの部位によって、医薬組成物を対象に投与するために、医学分野の当業者に知られる従来の方法を用いてもよい。

【0079】

注射用組成物は、植物油、ジメチルアクタミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの様々な担体を含有してもよい。

【0080】

静脈内注射の場合、水溶性抗体は点滴法で投与されてもよく、その場合、抗体及び生理学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤としては、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩水、リンゲル液、又はその他の適切な賦形剤が挙げられる。

【0081】

筋肉内製剤、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％の生理食塩水、又は５％のグルコース溶液などの医薬品賦形剤に溶解して投与されてもよい。

【0082】

一実施形態では、抗体は、部位特異性又は標的化局所送達技術によって投与される。部位特異性又は標的化局所送達技術の例としては、抗体の様々な埋め込み型デポ源若しくは局所送達カテーテル（注入カテーテル、留置カテーテル、若しくは針カテーテルなど）、合成グラフト、外膜ラップ、シャント及びステント若しくはその他の埋め込み型装置、部位特異的キャリア、直接注射、又は直接使用が挙げられる。例えば、国際特許第ＷＯ００／５３２１１号及び米国特許第５，９８１，５６８号を参照する。

【0083】

本開示の別の実施形態では、本明細書に記述されている医薬組成物及び製剤のいずれか（例えば、抗体又は結合剤を含む）を含有し、その使用及び／又は再構成のための説明を提供する製造品が提供される。前記製造品は容器を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（例えば、デュアルチャンバーシリンジ）及び試験管が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は製剤を保持し、容器上の又は容器に付随するラベルには、再構成及び／又は使用の説明が示されてもよい。例えば、ラベルには、製剤が特定のタンパク質濃度に再構成されることが示されてもよい。製剤を保持する容器は、再構成された製剤を繰り返し投与（例えば、２～６回投与）することを可能にする、複数回使用のバイアルであってもよい。製造品はさらに、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ）を含む第２の容器を含んでもよい。希釈剤と凍結乾燥製剤を混合すると、再構成された製剤の最終的なタンパク質濃度は一般的に少なくとも５０ｍｇ／ｍＬである。製造品はさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、使用説明を含む添付文書など、商業的及びユーザーの観点から望ましいその他の材料を含んでもよい。

【0084】

（実施例）
以下の実施例は限定的なものではなく、単なる例である。特に断りがない限り、全ての細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州・マナサス）から購入され、検出用の全ての二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルベニア州・ウェストグローブ）から購入された。ＤＮＡ及びＲＮＡの操作には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記述されている標準的な方法を採用する。特に断りがない限り、市販の試薬及びキットはすべてメッカーの説明に従って使用された。

【0085】

がん治療のための標的特異的抗体を探索するために、生細胞免疫化（ＬＣＩ）及び生細胞ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術を使用して、ヒト腫瘍表面抗原を特異的に標的とする抗体を生成し、そしてプロテオミクス及び分子生物学的手法を組み合わせて標的を同定した。

【0086】

実施例１：ＡＭＬ細胞株を特異的に標的とするＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの生成と特性評価
細胞表面抗原上の立体配座エピトープに対するｍＡｂを得るために、以前にも記述されたように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２種のヒトＡＭＬ細胞株であるＭＶ４－１１とＴＨＰ－１の混合物をＬＣＩ及びＬＣ－ＨＴＳに使用した（国際特許第ＷＯ２０１４１４６４８７Ａ１号、国際特許第ＷＯ２０１７１１４２０４号、米国特許公開第２０２１０１３９６０２Ａ１号；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８：ｅ７７３９８を参照する）。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターとハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイで、ハイブリドーマ培養物上清をこの２種のＡＭＬ生細胞株の混合物との相互作用についてスクリーニングし、健康な成人（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（カリフォルニア州・パロアルト））から提供されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でカウンタースクリーニングし、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州・サンノゼ））でデータを分析した。ヒトＡＭＬ細胞株に強力で特異的な結合活性を示し、ヒトＰＢＭＣに結合活性を示さないハイブリドーマコロニーを、増幅、条件培地からの離脱、及び標準的な手順に従うサブクローニングのために選択した（Ｋｏｈｌｅｒ ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６：４９５－４９７；Ｗｉｎｔｅｒ ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３４９：２９３－２９９）。更なる特性評価のために、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標） ＳｕＲｅ（商標） ＬＸプロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（マサチューセッツ州・マールボロ））を用いてこれらのコロニーによって産生されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を精製した。

【0087】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと命名されたｍＡｂは、テストされた９種のヒトＡＭＬ細胞株のほぼ全てに対して高い結合能力を示したが、ヒトＰＢＭＣに示さなかった（図１Ａ、左のパネル）。ＡＭＬ Ｍ３サブタイプ細胞株であるＮＢ４細胞に対する結合シグナルが特に高く、次はＫａｓｕｍｉ－１細胞株及びＨＬ－６０細胞株であった。結合がｍＡｂとＡＭＬ細胞表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介されないことを確保するために、ＦＡＣＳアッセイでヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）Ｆｃ受容体ブロッキング・ソリューション（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州・サンディエゴ））を使用した。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂのアイソフォームはＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州・プレザントン））によって決定されたＩｇＧ１／κであるため、ＡＭＬ細胞株と相互作用しない無関係なＩｇＧ１ａ／κマウス抗体を陰性対照として使用し（アイソタイプ対照抗体、図１Ａ、右のパネル）、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとＡＭＬ細胞表面との相互作用はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの可変領域によって特異的に媒介されることを確認した。

【0088】

ＡＭＬ細胞の表面に対するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの結合を可視化するために、免疫細胞化学（ＩＣＣ）に基づく細胞表面抗体結合アッセイを行った。培養されたＡＭＬ細胞を、４％のパラホルムアルデヒドにおいてサイトスピン４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州・ウォルサム））によってガラススライドに固定した。加熱による抗原賦活化の後、ヤギ血清（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（ミズーリ州・セントルイス））で細胞をブロックし、次にＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体と共に１時間インキュベートし、続いて１：１０００希釈されたペルオキシダーゼ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的抗体（抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ ｐＡｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間インキュベートした。細胞は３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色され、ヘマトキシリンで対比染色された。図１Ｂに示すように、ＩＣＣアッセイにより、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的はＮＢ４細胞及びＴＨＰ－１細胞の表面に位置することが確認された。ＮＢ４細胞表面のＤＡＢ染色の強度はＴＨＰ－１細胞表面の強度よりはるかに高く、ＦＡＣＳアッセイにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）と相関していた（図１Ａ、左のパネル）。

【0089】

さらに、複数のＡＭＬ細胞溶解物をＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及びマウス抗ヒト／マウスβ－アクチンｍＡｂ（抗β－アクチンｍＡｂ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ（イリノイ州・ローズモント））各５μｇ／ｍＬで同時にプローブし、続いて抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ ｐＡｂの１：２０，０００希釈液で検出したウェスタンブロットでは、非還元条件下では約２５０ｋＤａの共通バンドが示され、還元条件下では約１１０ｋＤａのかすかなバンドが示された（図１Ｃ）。急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）細胞株であるＲａｊｉの全細胞溶解物でも、強度は低いものの、同じ位置にブロットが示された。対照的に、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、ウェスタンブロット法では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（図１Ｃ）又はヒトＰＢＭＣ細胞溶解物（データ未掲載）でバンドが一切検出されなかった。ＡＭＬ細胞におけるこれらのハイブリダイズタンパク質バンドの相対強度は、ＦＡＣＳアッセイのＭＦＩ（図１Ａ）及びＩＣＣ染色の強度（図１Ｂ）に一致しており、このタンパク質はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的である可能性が高いことを示した。

【0090】

実施例２：ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的としてのヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）の同定と検証
ＡＭＬ細胞溶解物は、メーカーの説明に従ってＩＰ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で調製された。免疫沈降用Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温（ＲＴ）で３０分間、ＰＢＳ中の５０μｇのＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした。抗体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を洗浄し、各細胞溶解物と共にＲＴで３０分間インキュベートし、次に０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ、ＰＢＳ緩衝液でこの順に洗浄した。２－メルカプトエタノールを含む４×Ｌａｅｍｍｌｉ変性サンプル緩衝液でビーズから免疫沈降（ＩＰ）タンパク質と抗体を分離し、９５℃で５分間加熱した。タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離し、メーカーの手順書に従ってＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ（商標）銀染色キット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で染色した。ＩＰサンプル中のウェスタンブロットと同じ分子量を持つ単一のタンパク質バンドが銀染色によって明らかにされた（図２Ａ）。バンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化した。ＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州・ケンブリッジ）による液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で、ゲルスライスに最も豊富なタンパク質としてＴｆＲ１が同定された（＃ＰＳＭ＝３２、カバレッジ＝２９．６％）。

【0091】

ＴｆＲ１がＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的であることを確認するために、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有する組み換え発現ヒトＴｆＲ１細胞外ドメイン（ｒＴｆＲ１－ＥＣＤ、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（デラウェア州・ニューアーク））を、ＡＭＬ及びＡＬＬ細胞の全細胞溶解物サンプル（陽性対照）及びＣＨＯ細胞溶解物（陰性対照）と共に、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、続いて一次抗体としてＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及び抗β－アクチンｍＡｂ各５μｇ／ｍＬと、１：２０，０００の抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ ｐＡｂを同時に用いてウェスタンブロットプローブした（図２Ｂ）。結果は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、ｒＴｆＲ１－ＥＣＤの計算分子量７７．０ｋＤａと相関する約８０ｋＤａの単一のバンドを検出できることを示した。図１Ｃに示すように、Ｒａｊｉ、ＮＢ４、ＯＣＩ／ＡＭＬ２、及びＣＨＯ細胞溶解物は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとの反応で一致している結果を示した。

【0092】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の相互作用を確認するために、直接ＥＬＩＳＡアッセイを行った。０．１μｇ／ｍＬのｒＴｆＲ１－ＥＣＤでコーティングされたＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ、６×Ｈｉｓ Ｈｉｓ－Ｔａｇモノクローナル抗体（抗Ｈｉｓ ｍＡｂ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）又はアイソタイプ対照抗体の段階希釈液とＲＴで１時間直接反応させ、続いて１：２，０００の抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ ｐＡｂと１時間反応させた。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ（カリフォルニア州・サンノゼ））を使用して、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。図２Ｃは、６Ｈｉｓタグ付きのｒＴｆＲ１－ＥＣＤとＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又は抗Ｈｉｓ ｍＡｂとの直接的な相互作用を示しているが、アイソタイプ対照抗体との相互作用は示されないことから、ＴｆＲ１はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの標的であることが証明された。

【0093】

ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂがヒトＴｆＲ１を認識することをさらに確認するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州・コーラルビル）に注文したプライマーのペア（配列番号１１及び配列番号１２）を使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によりＯＣＩ／ＡＭＬ２及びＴＨＰ－１細胞から、ＴｆＲ１タンパク質の全長をコードするＴＦＲＣ ｃＤＮＡを増幅した。ｃＤＮＡは、Ｃ末端に、ＧＦＰをコードするＤＮＡ断片とインフレーム融合され、次に、選択のためにヒトＣＭＶプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）を含有する社内発現ベクターにクローニングされた。ＦＡＣＳでＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂによって染色されなかったＣＨＯ－ＤＧ４４細胞にＴＦＲＣ－ＧＦＰ発現プラスミドを形質移入し、ピューロマイシンを添加したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ無血清培地（ＳＦＭ）で成長させた。高レベルのＥＧＦＰを安定的に発現するＣＨＯ細胞コロニーを分離し、サブクローニングした。４℃で、ＣＨＯ／ｒＴｆＲ１－ＧＦＰ細胞を、精製されたＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ、抗ヒトＴｆＲ１対照ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州・ミネアポリス））、及びアイソタイプ対照抗体の２つのバッチで３０分間染色し、続いてＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的ｐＡｂ（抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。結果は、ＦＬ１（ＧＦＰ）ゲーティングにおいて、ＣＨＯ／ｒＴｆＲ１－ＧＦＰ細胞はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及び抗ＴｆＲ１対照ｍＡｂの両方によって染色されたが、どちらの抗体も細胞表面にｒＴｆＲ－ＧＦＰ発現のないＣＨＯ細胞と結合できることを示した（図２Ｄ）。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂのＩＣ_５０値は、０．０３～０．０４μｇ／ｍＬで、約０．１μｇ／ｍＬである抗ＴｆＲ１対照ｍＡｂのＩＣ_５０値よりはるかに低かった。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂによる様々なＧＦＰ活性を持つＣＨＯ／ｒＴｆＲ－ＧＦＰ細胞の染色は、ＭＦＩ－ＰＥ値とＭＦＩ－ＦＩＴＣ値との間の正の相関関係を示し（データ未掲載）、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとヒトＴｆＲ１の細胞外ドメインとの直接的な相互作用を証明した。
フォワードプライマー：５’－ＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＧＡＴＣＡＧＣ－３’（配列番号１１）
リバースプライマー：５’－ＣＴＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＣ－３’（配列番号１２）

【0094】

実施例３：ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの結合親和性の測定
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）ラベルフリー技術を用い、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（カリフォルニア州・サンノゼ））を使用してＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとＴｆＲ１の細胞外ドメインとの結合親和性を決定した。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂを抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕獲（ＡＭＣ）バイオセンサーに４５０秒間固定化し、動力学緩衝液で１２０秒間洗浄し、続いて段階希釈液においてｒＴｆＲ１－ＥＣＤと４５０秒間結合させ、次に動力学緩衝液において解離した。ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとの結合の陽性対照として使用した。ｒＴｆＲ１－ＥＣＤの濃度を３００ｎＭから０．０８ｎＭまで段階希釈してアッセイを繰り返したところ、解離時間を６０分間に延長しても（図３Ａ、左のパネル）又は反応温度を３７℃に上げても（データ未掲載）、シグナルの減衰は見られなかった。したがって、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの相互作用親和性は非常に高く、計算されたＫ_Ｄ値は１ｐＭ未満であった（図３Ｂ）。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと抗マウス（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂとの結合は規則的な動力学曲線（図３Ａ、右のパネル）とかなり高い親和性（Ｋ_Ｄ＝１．０４～１．４５ｎＭ）（図３Ｃ）を示し、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の極めて高い親和性が人為的結果ではなかったことを示す。

【0095】

実施例４：ヒトＴｆＲ１との結合に関するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂとトランスフェリンの競合ＥＬＩＳＡ
ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂが、Ｔｆの結合部位と重なるヒトＴｆＲ１と結合するかどうかを決定するために、競合ＥＬＩＳＡを行った。メーカーの説明に従って、ＥＺ－Ｌｉｎｋマレイミド活性化ＨＲＰキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＨＲＰでＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂを直接標識した。Ｉｍｍｕｎｌｏｎマイクロタイタープレートを０．１μｇ／ｍＬのｒＴｆＲ１－ＥＣＤでコーティングし、２μｇ／ｍＬから２．５倍段階希釈したヒトＴｆ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と個別に混合された、２μｇ／ｍＬから４倍段階希釈したＨＲＰ結合ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと共に１時間インキュベートした。様々な濃度のＴｆを単独で陰性対照として加えた。徹底的に洗浄した後、ＨＲＰ結合ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの結合を検出するためにＴＭＢを加えた。停止溶液を添加した後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

【0096】

図４は、様々な濃度においてＴｆの存在とは無関係に、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＨＲＰが、ｒＴｆＲ１－ＥＣＤと用量依存的に結合することを示す。２μｇ／ｍＬ（２５μＭ）のＴｆまで添加しても、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＨＲＰのｒＴｆＲ１－ＥＣＤへの結合は有意に妨害されないことから、Ｔｆの結合部位はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの結合エピトープと重ならないことが示唆された。

【0097】

実施例５：ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂのＰＢＭＣ及び骨髓（ＢＭ）細胞への結合に関するＦＡＣＳ分析
他の研究者らは、殆どの抗ＴｆＲ１抗体はＴｆの取り込みを妨害し、患者において、貧血、好中球減少症、白血球減少症などの全身血液毒性を引き起こすことを報告した（ＣＡＮＤＥＬＡＲＩＡ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７ Ｍａｒｃｈ ２０２１）。治療候補としてのＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの安全性の問題を解決するために、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（カリフォルニア州・パロアルト）から、健康なドナーからの新鮮なＰＢＭＣの複数のバッチを購入し、ＨｕｍａｎＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州・フリーモント）から、健康なドナー又はＡＭＬ患者の凍結ＢＭ細胞を購入した。細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷ＰＢＳと１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。２０μｇ／ｍＬから段階希釈したＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及びアイソタイプ対照抗体を使用して４℃でそれらの細胞を染色し、続いて１：８００のＦＩＴＣ又はＰＥ結合ヤギ抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ ｐＡｂで検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。さらに、抗ヒトＣＤ３４－ＦＩＴＣ（ＲＥＡＬ４８７）、抗ヒトＣＤ２３３－ＰＥ（ＲＥＡ３６８）、抗ヒトＣＤ２３５ａ－ＰＥ（ＲＥＡ１０９２）をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（カリフォルニア州・サンノゼ）から購入し、細胞をＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂで同時に染色した。

【0098】

ＦＡＣＳの結果は、使用したｍＡｂの濃度に関わらず、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは正常なＰＢＭＣ又は正常なＢＭ細胞と結合しないことを示した（図５Ａ）。異なるバッチ（ドナー）のＰＢＭＣ及びＢＭ細胞において一致している結果が得られた（データ未掲載）。対照的に、ＡＭＬ患者からのＢＭ細胞はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと反応したが、アイソタイプ対照抗体と反応しなかった（図５Ｂ）ことから、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは健康なＢＭとＡＭＬ ＢＭ種を区別できることを示唆した。健康なＢＭサンプルでは、２０％を超える細胞は抗ヒトＣＤ３４ ｍＡｂ－ＦＩＴＣで染色できる造血幹細胞であったが（図５Ｃ、左のパネル）、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ及びアイソタイプ対照抗体と反応する細胞はわずかであった（図５Ｃ、中間のパネル及び右のパネル）。ＴｆＲ１は一般的に有核赤血球のマーカーであると考えられるが、ＣＤ２３３陽性赤血球又はＣＤ２３５ａ陽性赤血球及び赤芽球のいずれもＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと反応しなかった（図５Ｄ及び図５Ｅ、左のパネル）ことから、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは悪性細胞に発現されるＴｆＲ１だけを認識し、骨髓抑制を引き起こすリスクが低いことを示唆した。

【0099】

実施例６：腫瘍細胞によるＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの内在化アッセイ
１０％のＧｉｂｃｏウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ培地中のＯＣＩ／ＡＭＬ２、ＮＢ４又はＲａｊｉ細胞を２枚の９６ウェル培養プレートに１×１０^５個の細胞／ウェルで播種し、１０μｇ／ｍＬから１：１０段階希釈したＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はアイソタイプ対照ｍＡｂと共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を５００×ｇで遠心分離して氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、未結合のｍＡｂを除去した。１枚の９６ウェルプレートの細胞を温かい培地で再懸濁し、ｍＡｂの内在化ができるよう３７℃でインキュベートし、別のプレートの細胞を氷冷培地に再懸濁し、抗体の内在化を防ぐために４℃でインキュベートした。３０分間、１時間、２時間後に採取したサンプルを氷冷ＰＢＳ／１％のＢＳＡで２回洗浄し、続いて１：８００に希釈した抗Ｍｏ ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣと共に４℃で３０分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳ／１％のＢＳＡで３回洗浄した後、１％のパラホルムアルデヒドを含有する固定液１５０μＬに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ分析に備え、暗所で保存した。

【0100】

ＦＡＣＳの結果は、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは４℃で用量依存的に２種のＡＭＬ細胞株ＯＣＩ－ＡＭＬ２及びＮＢ４の表面と結合したが、３７℃ではすぐに内在化されたことを示した。Ｒａｊｉ細胞は細胞表面上にＴｆＲ１のコピー数が非常に低いように見えるが、それでも３７℃でＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂを内在化できた（図６Ａ、左のパネル）。対照的に、抗ＣＤ２０ ｍＡｂは、４℃ではＲａｊｉ細胞とだけ結合し、ＡＭＬ細胞と結合せず、３７℃ではＲａｊｉ細胞によって部分的に内在化された（図６Ａ、中間のパネル）。アイソタイプ対照抗体は、予想通りに３種の細胞株のいずれも染色しなかった（図６Ａ、右のパネル）。

【0101】

ＦＡＣＳベースの内在化アッセイでは、抗体抗原複合体のエンドサイトーシスの間接的な証拠しか提供できず、抗体の内在化と抗体のシェディングを区別できなかった。ｍＡｂの内在化を直接観察するために、蛍光標識ｍＡｂを使用して蛍光顕微鏡ベースの内在化分析を行った。簡単に説明すると、Ｍｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ（商標）抗体ラベリングキット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用し、メーカーの手順書に従ってＣＦ４８８色素でｍＡｂを標識した。細胞結合は、異なる濃度のｍＡｂのある９６ウェル培養プレートにおいて、氷冷ＤＭＥＭ培地中４℃で１時間行った。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１枚のプレートに温かいＤＭＥＭを加えて３７℃で１時間インキュベートし、もう１つのプレートの細胞を冷ＰＢＳに再懸濁して、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００オールインワン蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ（イリノイ州・アイタスカ））を使用して蛍光イメージングを行った。アイソタイプ対照抗体は、ＣＦ４８８で標識され、陰性対照として並行して細胞とインキュベートされた。

【0102】

４℃で１時間インキュベートした後、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８はＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞の表面と結合して、細胞の輪郭を描く高強度の蛍光環を形成した（図６Ｂ、上のパネル）。蛍光強度は、使用したｍＡｂの濃度に比例した。３７℃で１時間インキュベートした後、蛍光シグナルの大部分が細胞表面から細胞の内部空間に移動したことから、表面と結合したＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８分子は主にＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞によって内在化されたことを示唆した（図６Ｂ、下のパネル）。この現象は、ＮＢ４及びＴＨＰ－１を含む他のＡＭＬ細胞株において、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８の異なる濃度（１、０．５、０．１、及び０．０５μｇ／ｍＬ）で一貫して観察された（データ未掲載）。ＣＦ４８８標識アイソタイプ対照抗体は、どの被験細胞とも結合しなかった（図６Ｂ、右のパネル）。

【0103】

同様の用量依存的結合及び内在化の結果が、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で観察され、ＦＡＣＳ分析で明らかになるように、４℃でＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと強く反応した。しかし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の蛍光シグナルは、予想のとおり、ＡＭＬ細胞上の蛍光シグナルよりはるかに強かった（図６Ｃ）。さらに、部分的な内在化は４℃でも起こり、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ－ＣＦ４８８分子の大部分は３７℃で１時間インキュベートした後に内在化されたことから、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞膜上に発現されるＴｆＲ１タンパク質はＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂと結合すると内在化される傾向が高いことが示唆された。

【0104】

実施例７：ＡＭＬ細胞株の増殖に対するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの生体外作用
細胞ベースの生体外アッセイでＡＭＬ細胞株の増殖に対するＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの作用を評価した。メーカーの手順書に従って、セルカウンティングキット－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州・ロックビル））を使用して細胞生存率を決定した。簡単に説明すると、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ及び１００μｇ／ｍＬのＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はアイソタイプ対照抗体で増殖したＡＭＬ細胞を７枚の９６ウェル細胞培養プレートに５×１０^３個の細胞／ウェルで３通り播種し、３７℃で５％のＣＯ_２の加湿雰囲気下でインキュベートした。２４時間ごとに１０μＬ／ウェルのＣＣＫ－８溶液で４時間インキュベートし、続いてＯＤ_４５０を測定することで細胞生存率を評価した。

【0105】

図７に示すように、２群のＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞は成長を継続したが、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ処理細胞の増殖率はアイソタイプ対照抗体で処理された細胞の増殖率よりはるかに低かった（Ｐ＜０．０５）。同様のデータが他のＡＭＬ細胞株でも得られた（データ未掲載）。したがって、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂはＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞の増殖を部分的に阻害できたが、ｍＡｂ自体は強力な治療候補ではなかった。実際には、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは、ＣＬＤＸマウスモデルが用いられる予備的な生体内研究では何の効果も示さなかった。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂはヒトＴｆＲ１と極めて高い親和性を有し、がん細胞による内在化の傾向が強いことを示したため、がん療法用のＡＤＣとして開発される大きな可能性が示された。

【0106】

実施例８：ＭＡｂ１１－２２．１ハイブリドーマの可変領域ｃＤＮＡの配列決定
ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（カリフォルニア州・サンノゼ））を使用するｃＤＮＡ末端の５’－急速増幅（５’－ＲＡＣＥ）技術により、ＭＡｂ１１－２２．１ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡから、ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂの軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。５’－ＲＡＣＥのプライマーは、配列番号１３及び配列番号１４として示される。ｃＤＮＡ断片をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、メーカーの手順書に従ってｐＭｉｎｉＴ２．０ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州・イプスウィッチ））にクローニングした。高速ミニプラスミドキット（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（アイオワ州・ダビューク））及びサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｇｅｎｅｗｉｚ（カリフォルニア州・サウス・サンフランシスコ））によるプラスミド精製のために、各形質転換体の１０個の大腸菌コロニーをランダムに選択した。全ての配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉのＢＬＡＳＴ検索及びｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によりＶドメインの一意性を確認した。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂのＶＬ及びＶＨのコンセンサス配列は、発明の開示の部分でそれぞれ、配列番号１及び配列番号３として示されている。コードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号４として示されている。
軽鎖プライマー：５’－ＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ－３’（配列番号１３）
重鎖プライマー：５’－ＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１４）

【0107】

キメラＭＡｂ１１－２２．１ Ａｂ（ｃＡｂ）の構築と発現：
以下の配列番号１５～１８で示されるプライマーのペアを使用して、配列決定されたプラスミドからＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂのＶＬ及びＶＨ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＳｐｅＩ－ＮａｒＩ（ＶＬ）又はＸｂａＩ－ＮｈｅＩ（ＶＨ）制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、それぞれ軽鎖及び重鎖の発現を制御するマウスＣＭＶプロモーター及びヒトＣＭＶ ＩＥ１プロモーターを含有する社内発現ベクターに輸送されている、ヒトκ軽鎖（ＣＬ）又はヒトＩｇＧ１重鎖（ＣＨ１～ＣＨ３）の定常領域とそれぞれインフレーム接続した。
ＬＶ ＰＣＲフォワードプライマー：５’－ＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧ－３’（配列番号１５）
ＬＶ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ－３’（配列番号１６）
ＨＶ ＰＣＲフォワードプライマー：５’－ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧ－３’（配列番号１７）
ＨＣ ＰＣＲリバースプライマー：５’－ＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣ－３’（配列番号１８）

【0108】

ＤＮＡ配列決定による確認後、ＦｅｃｔｏＰｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ＳＡ（フランス・イルキルシュ））を使用し、メーカーの手順書に従って、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ ＳＦＭで高密度まで成長できる社内開発のＣＨＯ－ＤＧ４４誘導体であるＤｕｘ－１Ｓ－ＨＤ細胞に発現プラスミドを形質移入した。ＡＭＬ細胞株への結合に関するＦＡＣＳ分析、次にＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのアフィニティー精製により、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ ＳＦＭにおけるＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの一過性発現及び分泌を検証した。

【0109】

実施例９：ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの特性評価
精製されたｃＡｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの分析でそのｍＡｂ対応物と同様の特徴を示した（データ未掲載）。ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの間の結合動力学も、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステムによって決定された。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕獲（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用してＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂを４５０秒間固定化し、ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂへの結合のシステム対照として使用した。２．５倍段階希釈により、ｒＴｆＲ１－ＥＣＤの濃度は５０ｎＭ～１．２８ｎＭの範囲にあった。図３Ａ～図３Ｃに示したＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂに関しては、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの解離（Ｋ_ｏｆｆ）は観察後６０分間以内に検出されなかったため、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂとｒＴｆＲ１－ＥＣＤとの親和性は極めて高かった（Ｋ_Ｄ＜１ｐＭ、図８Ａ）。ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂと抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）Ｆａｂとの結合は、予想のとおり、規則的な動力学曲線を示しており、Ｋ_Ｄは２．１８ｎＭであった（図８Ｂ）。

【0110】

実施例１０：がん細胞株に対するＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１の生体外作用
ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂは強力な細胞傷害活性を持たなかったが、ヒトＴｆＲ１との非常に高い親和性と高い腫瘍特異性により、がん治療用の優れたＡＤＣ候補となった。ＡＤＣ薬として使用できるかどうかを調べるために、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの軽鎖及び重鎖定常領域の表面露出残基に対してシステインスキャンを実行し、様々なペイロードの部位特異的結合による抗腫瘍効果を調査した。部位特異的変異誘発により、以下の配列番号１９及び２０で示されるプライマーのペアを使用して、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂの重鎖Ｆｃ領域のセリン２３９コドン（ＴＣＣ）をシステインコドン（ＴＧＣ）に置き換えた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂を使用して、一過性発現ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２９３Ｃ ｃＡｂ変異体を精製した。ＪＵＮＵＴＵＬＡ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－９３２，２００８）に記述されているように、室温でＰＢＳ中の１０倍モル過剰のジチオトレイトール（ＤＴＴ）で処理することによって、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２９３Ｃ ｃＡｂのＣｙｓ２３９と結合されたシステイン又はグルタチオンを培地から除去した。抗体はＳ２３９Ｃの遊離チオール基を露出するように改めて折り畳まれ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりｃＡｂの完全性が分析された。室温下でゆっくりと１０～６０分間撹拌してＰＢＳにおいてＣｙｓ２３９の遊離チオール基とＤＭ１を反応させることにより部位特異的結合を行って、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２９３Ｃ－ＤＭ１を生成し、理論的な薬物抗体比（ＤＡＲ）が２であるＡＤＣ活性を付与した。３０－ｋＤａ ＮＭＷ限外濾過ディスク（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）が装備されたＡｍｉｃｏｎ（登録商標）撹拌セルリザーバーを使用して、１０倍容量のＰＢＳに対して３回透析濾過することによって遊離ＤＭ１を除去した。次に、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２９３Ｃ－ＤＭ１を０．２μｍシリンジフィルター（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ペンシルベニア州・ラドノール））で濾過滅菌した。非部位特異的結合の影響を排除するために、変異していないＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂ及びアイソタイプ対照抗体も、陰性対照として並行してＤＭ１で処理された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを用いて、ＤＭ１処理抗体の完全性及び結合能力を分析した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）発色性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でエンドトキシンを分析した。ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂ－ＤＭ１とＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１との間では、ＴｆＲ１及びがん細胞株に対する結合親和性に関して明らかな違いが見られなかった。予想のとおり、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１は、未処理のＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃと比べて、ゲル内遊走のわずかな遅延を示した。
Ｓ２３９Ｃフォワードプライマー：５’－ＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣ－３’（配列番号１９）
Ｓ２３９Ｃリバースプライマー：５’－ＡＡＣＡＣＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧ－３’（配列番号２０）

【0111】

ＯＣＩ／ＡＭＬ２（ＡＭＬサブタイプＭ４）、Ｒａｊｉ（ＡＬＬ）、ＨＣＣ３８（ＴＮＢＣ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）などの代表的ながん細胞株を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地において対数増殖期になるまで培養した。０日目には、ＣＣＫ－８アッセイでベースラインのＯＤ_４５０が約０．４になるよう、最適な量の各細胞株を個別の抗体と９６ウェル細胞培養プレートにおいて３通り混合した。３７℃で５％のＣＯ_２の雰囲気において細胞をインキュベートした。３日目及び５日目にそれぞれＣＣＫ－８アッセイで細胞増殖を監視した。ＤＭ１処理を行わないアイソタイプ対照抗体は、細胞増殖のベースラインを反映した。本研究では、ＤＭ１で処理した又は未処理のＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ及びＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂを比較した。

【0112】

図９に示すように、４種の細胞株の細胞増殖は、全てＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１によって阻害されたが、未処理のＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ ｃＡｂによって阻害されなかった。野生型ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂは、ＤＭ１処理に関係なく、細胞増殖に明らかな影響がなかった。ＡＭＬ及びＡＬＬ細胞株は、１００μｇ／ｍＬ及び３００μｇ／ｍＬの両方とも細胞増殖を完全に阻害したため、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１に対して非常に感受性があった。２種のＴＮＢＣ細胞株は、１００μｇ／ｍＬの濃度では部分的にしか阻害効果がないため、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１に対する感受性が低かった。

【0113】

実施例１１：ＡＭＬ異種移植マウスモデルを用いたＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１の生体内評価
ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１がＡＭＬ腫瘍の成長に与える影響を評価するために、ｎｕ／ｎｕマウスを使用して異種移植モデルを確立した。６週齢の雄の無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州・ウィルミントン））の右側腹部の皮下腔に、０．１ｍＬのＰＢＳに溶解した１．５×１０^６個のＯＣＩ／ＡＭＬ２細胞を注射した。全ての腫瘍結節が見えるようになったら、マウスを無作為に３群に分け（ｎ＝５又は６）、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１（低用量の場合は１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ、高用量の場合は２０ｍｇ／ｋｇ体重（ｂ．ｗｔ））又は同様にＤＭ１（２０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ）で処理されたアイソタイプ対照抗体（Ｓ２３９Ｃ変異なし）を４日ごとに１回、７回（Ｑ４×７）腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して治療した。薬物投与直前に、腫瘍の体積及び体重を４日ごとに測定した。体積＝１／２×（幅）^２×長さという式で腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えた場合は、又は腫瘍が壊死し若しくは皮膚を通して潰瘍になった場合は、動物の安楽死を実施した。

【0114】

ＯＣＩ／ＡＭＬ２異種移植は、侵襲的なＣＬＤＸマウスモデルである。ＭＡｂ１１－２２．１ ｍＡｂ又はＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂのいずれも単独ではＯＣＩ／ＡＭＬ２異種移植腫瘍の成長を有意に遅らせることができなった（Ｐ＞０．０５、データ未掲載）。現在の研究では、１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ（低用量）のＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１は、１回又は２回の投与後に完全な退縮と永続的な応答をもたらした（図１０）。２０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ（高用量）ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１治療群（ｎ＝６）のマウスは異なる応答を示した。３匹のマウスは、低用量群と同様に、４日目又は８日目以降に腫瘍体積が１００％減少し、別のマウスは、４日目及び８日目に腫瘍退縮を示したが、その後腫瘍が再び成長し、残りの２匹のマウスはＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１に応答せず、しかも１匹は腫瘍の進行のため２４日目に安楽死を実施した。アイソタイプ対照群（ｎ＝５）では、全ての腫瘍が継続的に成長し、２匹のマウスは腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えたため２０日目に安楽死を実施した。非常に高用量のＡＤＣが使用されたにも関わらず、研究中に、バイタルサインの変化、運動能力、食欲の低下又は総体重の減少などの全身的な副作用は観察されなかった。

【0115】

腫瘍の成長に対するＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１の効果は、アイソタイプ対照群と比べて明らかであることから、ＭＡｂ１１－２２．１ ｃＡｂは、がん治療用ＡＤＣとして良好な候補になれることが確認された。ヒトＴｆＲ１に対する高い親和性と特異性により、循環するＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９ＣはＴｆＲ１陽性腫瘍細胞に蓄積し、エンドサイトーシスによりＤＭ１を細胞内に送達する。腫瘍細胞内に高濃度のグルタチオン（ＧＳＨ）が存在すると、ＤＭ１はＡＤＣから放出され、異種移植腫瘍内の周囲の細胞にバイスタンダー殺傷効果を与える可能性があり、このことからＭＡｂ１１－２２．１ ＡＤＣは血液悪性腫瘍だけでなく、固形腫瘍にも適用できることが示唆された。

【0116】

高用量群における有効性のばらつきの原因となるメカニズムは不明である。サンプルサイズが小さいこと、及び、腫瘍細胞表面上のＴｆＲ１の発現レベルが異なるため化合物に対する応答に個体差があることが原因だと考えられる。高用量のＡＤＣ薬剤はすぐに排除され又は薬剤耐性を引き起こすことがあるため、ＭＡｂ１１－２２．１－Ｓ２３９Ｃ－ＤＭ１の用量域を最適化する必要がある。それにもかかわらず、腫瘍特異性が高く抗腫瘍効力データがあることから、ＭＡｂ１１－２２．１はＡＤＣの開発に理想的な抗ＴｆＲ１抗体である。一貫したＤＡＲとがん治療のための最適な用量域を実現するためには、ＭＡｂ１１－２２．１ ＡＤＣ用の強力なペイロードと理想的なリンカーの結合技術は現在、研究中である。

【0117】

本明細書に記述されている特定の方法及び組成物は、好ましい実施形態の代表例であり、例示的であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者であれば、本明細書を検討すれば他の目的、態様、実施形態に想到するだろうし、それらは、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の範囲に含まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている発明に様々な代替及び改変を加えてもよいということは当業者に自明であろう。本明細書に例示的に記述されている発明は、本明細書に必須として具体的に開示されていない要素又は制限がない場合でも適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書の各例、本発明の実施形態又は実施例において、用語「含む」「含んでいる」「含有する」「有している（ｈａｖｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｅ）」のいずれも同義語として、拡張的かつ制限なしに読み取られるものとする。本明細書に例示的に記載されている方法及びプロセスは、異なるステップの順序で適切に実施してもよく、本明細書又は特許請求の範囲に示されているステップの順序に必ずしも限定されるわけではない。

【0118】

いかなる状況においても、本発明は、本明細書に具体的に開示されている特定の実施例又は実施形態又は方法に限定されると解釈されない。いかなる状況においても、本発明は、特許商標庁の審査官又はその他の職員又は従業員による声明によって限定されると解釈されないが、そのような声明が、出願人による応答書面において、具体的にかつ制限なく全体として明示的に採用されている場合は除く。

【0119】

本明細書において、本発明が広範かつ一般的に記述されている。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜属分類のそれぞれも、本発明の一部をなす。本明細書で使用される用語及び表現は、限定ではなく記述のために使用され、そのような用語及び表現の使用には、示され記述されている特徴又はその一部の同等物を排除する意図はないが、請求される本発明の範囲内に様々な改変が可能であることには想到できよう。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変及び変更を採用することができ、そのような改変及び変更は添付の請求項によって定義される本発明の範囲内にあると見なされることが理解される。

【0120】

（参照による組み込み）
本明細書に引用されている全ての特許及び特許出願は参照によりここに組み込まれ、引用される他の全ての参考文献も同様である。

【0121】

一般的に言及されている抗体関係の特許は、次のとおりである。
米国特許第７３１７０９１Ｂ２号
米国特許第５，５００，３６２号
米国特許第４，８１６，５６７号
米国特許第５，２２５，５３９号
米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；及び第６，２６５，１５０号
米国特許第５，９３２，４４８号
米国特許第７，５３８，１９６号
米国特許第８，１４８，４９６号
米国特許第８，５１８，８９１号
米国特許第９，３１０，３７３号
米国特許第９７６４０４１号
米国特許第１１，０４０，０８４号
欧州特許第ＥＰ２３９４００Ｂ１号
国際特許第ＷＯ００／５３２１１号及び米国特許第５，９８１，５６８号
国際特許第ＷＯ２０１４１４６４８７Ａ１号
米国特許公開第２０１７０１５１３４３号
米国特許公開第２０１７０３３５２８１号
国際特許第ＷＯ２０１７１１４２０４号
米国特許公開第２０２１０１３９６０２Ａ１号

【0122】

明細書に引用されている非特許文献は、以下に、著者名順にリストされている。
Ｂｏｍｆｏｒｄ ＡＢ ａｎｄ Ｍｕｎｒｏ ＨＮ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（１９８５）５：８７０－８７５．
Ｂｒｏｏｋｓ Ｄ，Ｔａｙｌｏｒ Ｃ，Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｂ，Ｌｉｎｄｅｎ Ｈ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ａ，Ｈｅｃｈｔ ＴＴ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９５）１：１２５９－１２６５．
Ｃａｌｌｅｎｓ，Ｃ，Ｍｏｕｒａ ＩＣ，Ｌｅｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｙ，Ｃｏｕｌｏｎ Ｓ，Ｒｅｎａｎｄ Ａ，Ｄｕｓｓｉｏｔ Ｍ，Ｇｈｅｚ Ｄ，Ｂｅｎｈａｍｏｕ Ｍ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ＲＣ，Ｂａｚａｒｂａｃｈｉ Ａ，ａｎｄ Ｈｅｒｍｉｎｅ Ｏ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．（２００８）２２：４２－４８．
Ｃａｎｄｅｌａｒｉａ ＰＶ，Ｌｅｏｈ ＬＳ，Ｐｅｎｉｃｈｅｔ ＭＬ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ－Ｗｅｌｌｓ ＴＲ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７ Ｍａｒｃｈ ２０２１．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．６０７６９２
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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】