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特表2024-545142溶解度の高いＦＯＸＹ－５ヘキサペプチドの安定な組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】溶解度の高いＦＯＸＹ－５ヘキサペプチドの安定な組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20241128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20241128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20241128BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20241128BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241128BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20241128BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20241128BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 111
A61K9/14
A61K9/20
A61K47/18
A61K9/19
C07K7/06 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534336
(86)(22)【出願日】2022-12-08
(85)【翻訳文提出日】2024-08-07
(86)【国際出願番号】 EP2022084940
(87)【国際公開番号】W WO2023104952
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】21213698.0
(32)【優先日】2021-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520144543
【氏名又は名称】ウントレサーチ・エービー
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヘンリクセン、デニス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA29
4C076AA36
4C076BB13
4C076CC27
4C076DD31
4C076DD51
4C076DD54
4C076FF01
4C076FF06
4C076GG05
4C076GG06
4C076GG09
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA17
4C084CA59
4C084DC50
4C084MA34
4C084MA44
4C084MA66
4C084NA02
4C084NA03
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA30
(57)【要約】
本開示は、ＷｎｔヘキサペプチドＦｏｘｙ-５の新規で溶解性の高い組成物に関する。さらに、本開示は、その組成物の製造方法及び安定性評価に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）及び窒素塩基を含む固形組成物であって、前記窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、前記固形組成物が、場合により水を含む、固形組成物。
【請求項2】
Ｆｏｘｙ-５に対して０．５～３．１モル当量の前記窒素塩基を含有する、請求項１に記載の固形組成物。
【請求項3】
前記窒素塩基が、アミノ酸、アンモニア、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の固形組成物。
【請求項4】
前記窒素塩基が、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン、N-メチル-D-グルカミン及びトロメタミンから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の固形組成物。
【請求項5】
Ｆｏｘｙ-５、並びに１．５０～２．４９当量、例えば１．７～２．１当量、例えば１．９～２．０３当量、例えば１．９５～２．０１当量、例えば２．０当量の、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン及びトロメタミンから選択される窒素塩基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の固形組成物。
【請求項6】
Ｆｏｘｙ-５、並びに２．５～３．１当量、例えば２．９～３．０３当量、例えば２．９５～３．０１当量、例えば３．０当量の、L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンから選択される窒素塩基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の固形組成物。
【請求項7】
Ｆｏｘｙ-５のジ－アンモニウム塩、ジ-L-ヒスチジン塩、トリ-L-ヒスチジン塩、ジ-L-リシン塩、ジ-N-メチル-D-グルカミン塩、トリ-N-メチル-D-グルカミン塩及びジ－トロメタミン塩から選択され、前記塩が非晶質であり、場合によりＦｏｘｙ-５に対して０～５当量の水を含む、請求項１に記載の固形組成物。
【請求項8】
前記窒素塩基がL-ヒスチジンである、請求項２に記載の固形組成物。
【請求項9】
Ｆｏｘｙ-５及び１．５０～２．４９当量、例えば１．７～２．１当量のL-ヒスチジンを含む、請求項８に記載の固形組成物。
【請求項10】
Ｆｏｘｙ-５及び２．５～３．１当量のL-ヒスチジンを含む、請求項８に記載の固形組成物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の固形組成物の製造方法であって、ａ） ｉ．溶媒中の懸濁液としての、又は、
ｉｉ．粉末としての
遊離酸形態のＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）を、
ｉｉｉ．０．５～１．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のモノ塩を製造する工程、
ｉｖ．１．５０～２．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のジ塩を製造する工程、又は
ｖ．２．５～３．１当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のトリ塩を製造する工程、
ｂ） 反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌する工程、並びに
ｃ） 溶液を沈殿、結晶化させて、又は、溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥して、固形組成物を単離する工程、を含み、
前記窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、ａ）～ｃ）の全ての工程を、必要に応じて不活性雰囲気下で行う、固形組成物の製造方法。
【請求項12】
水を溶媒として用いる、請求項１１に記載の固形組成物の製造方法。
【請求項13】
前記反応混合物のｐＨを６．０より低く保ちながら、前記窒素塩基をＦｏｘｙ-５に徐々に添加する、請求項１１～１２のいずれか一項に記載の固形組成物の製造方法。
【請求項14】
工程ｂ）で得た透明な溶液を凍結乾燥する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の固形組成物の製造方法。
【請求項15】
得られた固形組成物を、さらに、ｉ．凍結乾燥又は噴霧乾燥した生成物の溶媒又は溶媒混合物中の懸濁液を準備すること、
ｉｉ．前記懸濁液に、５℃±２℃～５０℃±２℃の１～３サイクルを含むサーマルサイクリング工程を行い、続いて、前記懸濁液を５℃±２℃で１～３日間熟成させること、
ｉｉｉ．例えばろ過又は遠心分離によってサーマルサイクリング後の生成物を単離すること、
を含むサーマルサイクリング工程にかけ、
前記サーマルサイクリング工程では、前記懸濁液を、５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で加熱し、その後、前記懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却し、その後、前記懸濁液を、単離前に５℃±２℃で１～３日間撹拌することにより熟成させる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の固形組成物の製造方法。
【請求項16】
有機溶媒が、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル／水（９０／１０）及び酢酸エチルから選択される、請求項１５に記載の固形組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ＷｎｔヘキサペプチドＦｏｘｙ-５の新規で溶解性の高い組成物に関する。さらに、本開示は、前記組成物の製造方法及びその安定性評価に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｆｏｘｙ-５は、複数の一般的ながんにおける腫瘍の拡散及び再発の防止のための薬物候補として現在開発中の、潜在的な抗転移活性を有するホルミル化されたＷＮＴ５Ａ由来のヘキサペプチド及びＷＮＴ５Ａ模倣物である。Ｆｏｘｙ-５は、式Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、図１）を有する。
【0003】
静脈内投与されると、Ｆｏｘｙ-５は、主にＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの、ＷＮＴ５Ａを介したシグナル伝達を活性化するＷＮＴ５Ａ受容体に結合し、活性化する。
【0004】
Ｆｏｘｙ-５は、転移のリスクを減らすために、ＷＮＴ５Ａリガンドががん抑制因子として作用するがん患者の腫瘍組織において、タンパク質ＷＮＴ５Ａの欠失を補うことが意図される。ステージＩＩＩの大腸がん患者を対象とした近年の後ろ向き研究のサブ解析により、ＷＮＴ５Ａの発現が少ない患者の割合が、ステージＩＩの大腸がん（ＣＲＣ）患者を対象とした以前の研究で観察されたものよりも顕著に高いことが示されている。ＣＲＣステージＩＩＩ腫瘍の患者は、主に、原発巣の近傍のリンパ節に腫瘍細胞が存在し、それによってより侵攻性でより速く進行する点でステージＩＩとは異なる。より進行していない腫瘍ステージの患者では約４５パーセントであるのと比べて、ステージＩＩＩの患者の７０パーセント近くにおいて、低いレベルのＷＮＴ５Ａが観察された。同様の知見が乳がん組織において見られ、より侵攻性でない乳がんの種類では約４５％であるのと比べて、侵攻性のトリプルネガティブ乳がんの７０％において、ＷＮＴ５Ａの欠如又は低いレベルが観察された。乳がん、結腸がん、前立腺がん及び肝細胞がんを含むいくつかの種類のがんでは、原発巣におけるＷＮＴ５Ａの欠如又は低いレベルが、ＷＮＴ５Ａタンパク質の発現が正常又は正常に近い腫瘍と比べた場合、より速い再発と関連することが実証された。このことは、ＷＮＴ５Ａレベルが疾患の経過に大きく影響を与えるという仮説を裏付ける。
【0005】
第２相のための薬物候補の安全性プロファイル、薬物動態及び用量決定を記録することを目的としたＦｏｘｙ-５による終了した第１ｂ相研究に基づき、Ｆｏｘｙ-５は現在、第２相臨床試験研究であるＮｅｏＦｏｘ研究を受けており、これは、診断時に、原発巣が外科的に切除された後、高い再発のリスクを有すると考えられたステージＩＩ／ＩＩＩの結腸がん患者を含む。確立した評価基準に従って再発のリスクの評価が行われる。研究の目的は、Ｆｏｘｙ-５が、主にＷＮＴ５Ａの発現が少ない患者において、再発のリスクを減らすことを実証することである。研究は、スペイン（１６）及びハンガリー（１２）の２８の病院で現在進行中である。
【0006】
Ｆｏｘｙ-５それ自体、及びその製造のための古典的な固相（ＳＰＳＳ）法がInternational Pat. Publication No. WO 2006/130082 (A PEPTIDE LIGAND TO IMPAIR CANCER CELL MIGRATION)に記載されている。前臨床及び初期臨床研究のための医薬品有効成分（ＡＰＩ）は、この経路により製造された。出願人により開発されたＦｏｘｙ-５の液相経路は、International Patent Publication No. WO 2020/038878 (Solution phase routes for Wnt hexapeptides) and WO 2020/120198 (Linear solution phase synthesis for Wnt hexapeptides)に開示されている。
【0007】
Ｆｏｘｙ-５の現在の製造方法は、塩ではない原薬（ＤＳ）の水への溶解度が限られているため、凍結乾燥最終製品の濃度は３ｇ／Ｌである。これは、Ｆｏｘｙ-５の商業的製造の生産量を大幅に限定する障害になっている。
【0008】
この問題を克服する初期の試みは、溶媒として（水に換えて）３０％アセトニトリル水溶液を使用した代替的な凍結乾燥過程の開発をもたらした。開発された過程が７ｇ／ＬまでのＤＳ濃度に適用されること、すなわち＞１００％の生産性の向上が、スケールの小さい実験で実証され、３５ｇスケールについて検証された。この成果は印象的であるが、それでもなお、最終工程がそのような高希釈を必要とする場合に商業スケールでＦｏｘｙ-５を製造するのには問題が残る。
【0009】
結果として、溶媒極性の調節よりむしろ他の可溶化技術によるバッチサイズの増大が提案された。医薬品（ＤＰ）剤形の研究から、Ｆｏｘｙ-５の塩を含まない形態からナトリウム塩への変化が、ＤＳ溶解度を少なくとも２０ｇ／Ｌのレベルに上昇させることが知られていた。
【0010】
これに関して、Ｆｏｘｙ-５は、末端アミノ基がホルミル化されていることから、３つのカルボン酸部分を含有し遊離のアミノ基は含有しないことが知られている（図１）。したがって、Ｆｏｘｙ-５の塩基性／アルカリ性化合物との塩を製造することのみが可能である。いくつかのファインケミカル供給元は、「Ｆｏｘｙ-５のトリフルオロ酢酸塩」として市場に出されている化合物を提供することが知られており、これは実際には遊離のトリフルオロ酢酸を含有する単なる凍結乾燥物である。
【0011】
Ｆｏｘｙ-５のそのナトリウム塩への変換が出願人により調査された。Ｆｏｘｙ-５は３つのカルボン酸基（Ａｓｐ２、Ｇｌｕ５、及びＣ－末端カルボン酸）を含有することから、Ｆｏｘｙ-５の水性スラリー（２５ｇ／Ｌ）を１当量、２当量、及び３当量の水酸化ナトリウムで処理することにより、一、二、及び三ナトリウム塩が生成された。出発物質として、非常に少量の２つの公知の不純物であるアスパルチミド（＜０．１％）及び二量体（＜０．１％）を含有するＦｏｘｙ-５の遊離酸のバッチを使用した（構造は図２を参照）。
【0012】
Ｆｏｘｙ-５の一ナトリウム塩は完全には溶解できず、ＮａＯＨの添加（１当量、ｐＨ＝３．８４）後すぐにゲル形成が観察された。
【0013】
二ナトリウム塩は、ＮａＯＨ（２当量、ｐＨ＝４．５７）添加の１０分以内に完全に溶解できた。溶液のＨＰＬＣ分析は、アスパルチミド不純物の含有量の増加を示したが、一方で二量体形成は、無視できるほどのレベルで検出されたのみであった。凍結乾燥後、０．０７％の二量体及び０．７９％のアスパルチミドが検出された。
【0014】
三ナトリウム塩は、ＮａＯＨ（３当量、ｐＨ＝６．７６）の添加後５分以内に溶解し、アスパルチミド不純物の上昇は最低限であったが、二量体形成の上昇が観察された。凍結乾燥後、０．４１％の二量体及び０．１７％のアスパルチミドが検出された。
【0015】
３つの塩のうち、三ナトリウム塩は＞１００ｇ／Ｌという最も高い溶解度を有することが分かり、したがって、当初は期待できる新たな原薬候補となるように思われた。
【0016】
しかし、４０℃での安定性検査において、Ｆｏｘｙ-５の三ナトリウム塩は、相当な量のこれまでに検討した不純物をすぐに発現させ（図３）、４０℃で４週間後に１５～２０％のレベルに達することが質量分析により発見された。
【0017】
異なるｐＨ値でのＦｏｘｙ-５の水溶液の更なる研究は、ｐＨ９では、アスパルチミドの含有量が完全に溶解した直後に顕著に減少することを明らかにした。ｐＨ９で２時間、Ｆｏｘｙ-５溶液を撹拌した後（図４を参照）、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるアスパルチミドのピークは完全に消失した（＜ＬＯＤ）。高ｐＨではアスパルチミドの開環が起こり、親化合物並びにβ-Ａｓｐ及びD-Ａｓｐ誘導体のいずれかの形成を引き起こすことが知られている。しかし、顕著な二量体形成が観察された（ｐＨ＝９で２時間後に２．５％）。クロマトグラムにおける二量体の同定は、別々に合成された参照物質による共溶出により裏付けられた。２つの公知の不純物（アスパルチミド及び二量体）に加えて、驚くべきことに、少量ではあるが、Ｆｏｘｙ-５の脱硫されたＣｙｓ→Ａｌａアナログ（図２及び３を参照）として三ナトリウム塩の第３の不純物が同定された。
【0018】
要約すると、Ｆｏｘｙ-５を三ナトリウム塩に変換することにより水への溶解度を上昇させることができるが、この化合物は、原薬としての資格を与えるにはあまりに不安定すぎる。したがって、更なる臨床試験への供給と将来の商業目的のために満足のいく溶解度及び安定性を有する、Ｆｏｘｙ-５の異なるＤＳ形態が依然として求められている。
【0019】
定義
本明細書では、用語「窒素塩基」は、少なくとも１つの窒素原子を含む塩基性化合物を意味する。
本明細書では、用語「窒素塩基」は、少なくとも１つの窒素原子を含む塩基性化合物を意味する。
【0020】
本明細書では、用語「モノ塩」又は「モノ－塩」は、明細書で定義した、１当量のＦｏｘｙ-５及び０．５～１．４５当量の窒素塩基を含む組成物を意味する。
【0021】
本明細書では、用語「ジ塩」又は「ジ－塩」は、明細書で定義した、１当量のＦｏｘｙ-５及び１．５０～２．４９当量の窒素塩基を含む組成物を意味する。
【0022】
本明細書では、用語「トリ塩」又は「トリ－塩」は、明細書で定義した、１当量のＦｏｘｙ-５及び２．５～３．１当量の窒素塩基を含む組成物を意味する。
【0023】
本明細書では、用語ＨＴ－ＸＲＰＤは、ハイスループット粉末Ｘ線回折を意味する。
【0024】
本明細書では、用語ＨＰＬＣ－ＣＡＤとは、荷電化粒子検出器を備えたＨＰＬＣを言う。
【0025】
本明細書では、用語ＵＰＬＣ－ＭＳとは、質量分析検出器を備えた超高速液体クロマトグラフィーを言う。
【0026】
本明細書では、用語「サーマルサイクリング」とは、本発明の固形組成物を、溶媒又は溶媒混合物に懸濁し、得られた懸濁液を、それぞれのサイクルで５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で撹拌しながら加熱し、その後、懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する１～３サイクルを行う工程を言う。最後に、懸濁液を、５℃±２℃で１～３日間撹拌することにより熟成させる。温度プロファイルを図１１で説明する。
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する１～３サイクルを行う工程を言う。最後に、懸濁液を、５℃±２℃で１～３日間撹拌することにより熟成させる。温度プロファイルを図１１で説明する。
【発明の概要】
【0027】
Ｆｏｘｙ-５は、既に述べられたように、３つのカルボン酸基：Ａｓｐ２、Ｇｌｕ５、及びＣ－末端カルボン酸基を含有する、式Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨからなるホルミル化されたヘキサペプチドであり、したがって、塩基性化合物とモノ－、ジ－及びトリ－塩を形成できる。Ｆｏｘｙ-５が、１：１、１：２及び１：３（Ｆｏｘｙ-５：塩基）の適切な比でさまざまな窒素塩基（本明細書では、少なくとも１つの窒素原子を含有する塩基性化合物として定義される）と溶解性の高い組成物を形成することが判明した。これらの組成物は、非晶質凍結乾燥物として単離した組成物が全て塩として適切に（化学量論的に）特徴付けられなかったとしても、便宜上、以降、Ｆｏｘｙ-５のモノ－、ジ－及びトリ－塩という。
【0028】
驚くべきことに、４０℃で測定した場合のこれらの組成物の安定性は大幅に変化することが判明し、これは以下で検討する。本発明の全ての組成物及びそれらの不純物プロファイルの概要を図１０に示す。
【0029】
第１の側面では、本発明は、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）、並びにアンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される窒素塩基を含む固形組成物を提供する。
【0030】
第２の側面では、本発明は、第１の側面に従う組成物の製造方法であって、以下の工程：
ａ） ｉ．溶媒中の懸濁液としての、又は、
ｉｉ．粉末としての
遊離酸形態のＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）を、
ｉｉｉ．０．５～１．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のモノ塩を製造する工程、
ｉｖ．１．５０～２．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のジ塩を製造する工程、又は
ｖ．２．５～３．１当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のトリ塩を製造する工程、
ｂ） 反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌する工程、並びに
ｃ） 溶液を沈殿させて、又は、溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥して、固形組成物を単離する工程、を含み、
窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、ａ～ｃの全ての工程を、必要に応じて不活性雰囲気下で行う、組成物の製造方法を提供する。
ａ） ｉ．溶媒中の懸濁液としての、又は、
ｉｉ．粉末としての
遊離酸形態のＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）を、
ｉｉｉ．０．５～１．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のモノ塩を製造する工程、
ｉｖ．１．５０～２．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のジ塩を製造する工程、又は
ｖ．２．５～３．１当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のトリ塩を製造する工程、
ｂ） 反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌する工程、並びに
ｃ） 溶液を沈殿させて、又は、溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥して、固形組成物を単離する工程、を含み、
窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、ａ～ｃの全ての工程を、必要に応じて不活性雰囲気下で行う、組成物の製造方法を提供する。
【0031】
本発明の第３の側面では、第２の側面の工程ｃ）で得た固形組成物を、さらに、
ｉ．凍結乾燥又は噴霧乾燥した生成物の溶媒又は溶媒混合物中の懸濁液を準備すること、
ｉｉ．懸濁液に、５℃±２℃～５０℃±２℃の１～３サイクルを含むサーマルサイクリング工程を行い、続いて、懸濁液を５℃±２℃で１～３日間熟成させること、
ｉｉｉ．例えばろ過又は遠心分離によってサーマルサイクリング後の生成物を単離すること、
を含むサーマルサイクリング工程にかけ、
サーマルサイクリング工程では、懸濁液を、５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で加熱し、その後、懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する。最後に、懸濁液を、例えばろ過又は遠心分離による単離前に５℃±２℃で１～３日間撹拌することで熟成させる。
ｉ．凍結乾燥又は噴霧乾燥した生成物の溶媒又は溶媒混合物中の懸濁液を準備すること、
ｉｉ．懸濁液に、５℃±２℃～５０℃±２℃の１～３サイクルを含むサーマルサイクリング工程を行い、続いて、懸濁液を５℃±２℃で１～３日間熟成させること、
ｉｉｉ．例えばろ過又は遠心分離によってサーマルサイクリング後の生成物を単離すること、
を含むサーマルサイクリング工程にかけ、
サーマルサイクリング工程では、懸濁液を、５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で加熱し、その後、懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する。最後に、懸濁液を、例えばろ過又は遠心分離による単離前に５℃±２℃で１～３日間撹拌することで熟成させる。
【0032】
サーマルサイクリング工程の温度プロファイルを図１１で説明する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】図は、Ｆｏｘｙ-５（配列１）の化学構造を示す。Ｆｏｘｙ-５は、ホルミル化されたＮ末端を有する６つのアミノ酸からなる直鎖ペプチドである。全ての光学活性なアミノ酸残基はL-配置にある。Ｆｏｘｙ-５の分子式はＣ２６Ｈ４２Ｎ６Ｏ１２Ｓ２、分子量は６９４．８ｇ／ｍｏｌ（平均質量）である。
【図2】図は、Ｆｏｘｙ-５の主な３つの不純物の化学構造を示す： Ａ）Ｆｏｘｙ-５のアスパルチミド誘導体 Ｂ）Ｆｏｘｙ-５のＣｙｓ－Ｃｙｓ二量体誘導体 Ｃ）Ｆｏｘｙ-５のＣｙｓ→Ａｌａ－アナログ
【図3】図は、三ナトリウム塩の３つの公知の不純物：「アスパルチミド」、「二量体」及び「Ａｌａ－アナログ」の４０℃での０、２及び４週間の保管での純度（ＨＰＬＣ面積％）を示す。詳細については詳細な説明を参照。
【図4】図は、ＨＰＬＣによるＦｏｘｙ-５の高ｐＨ処理の追跡調査を示す：出発物質（下）、溶解後（中央）及びｐＨ９で２時間後（上）。ＨＰＬＣの結果は、比較の目的でｙ方向にずらして示している。
【図5】図は、本発明のトリ塩（上の図）及びジ塩（下の図）の４０℃での０、２及び４週間の保管での純度（ＨＰＬＣ面積％）を示す。図から理解できるように、ジ塩よりもトリ塩で４週間での安定性に大きな変動がある。
【図6】上の図は、アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ）対他の塩形成体（コリン、ジエチルアミン、アンモニア、N-Ｍｅ-グルカミン及びトロメタミン）で製造したトリ塩の、４０℃での０、２及び４週間の保管での純度（ＨＰＬＣ面積％）を比較する。下の図は、ジ塩についての同様の比較を示す。図から理解できるように、アミノ酸で製造し塩は、他の塩形成体で製造した塩よりも高い安定性を有するという一般的な傾向がある。
【図7】図は、４０℃で４週間保管した後に少なくとも９０％のＨＰＬＣ（面積％）による純度を有する、本発明の塩のうち選択されたものの４０℃での０、２及び４週間の保管での純度（ＨＰＬＣ面積％）を示す。
【図8】図は、１）添加中、ｐＨを６未満に保ちながら、Ｆｏｘｙ-５の水性懸濁液に塩基をゆっくりと添加するか、又は、２）塩基の全量を一度に添加するかのいずれかの方法で製造した、凍結乾燥した直後のＦｏｘｙ-５のトリ－アンモニウム（ＮＨ３）、トリ－トロメタミン（ＴＲＯ）及びトリ-N-メチル－グルカミン（ＮＭＧ）塩の純度（ＨＰＬＣ面積％）を示す。図から理解できるように、トリ－アンモニウム塩の純度は添加の方法に非常に強く影響を受け、一方でトリ－ＴＲＯ及びトリ－ＮＭＧ塩の純度は比較的影響を受けない。
【図9】図は、Ｆｏｘｙ-５の３価の塩の凍結乾燥物の粉末Ｘ線回折結果（ＰＸＲＤ）を示す：（下から上へ）：アンモニア トリ塩、N-メチル-D-グルカミン トリ塩、トロメタミン トリ塩及びヒスチジン トリ塩。回折結果は、比較の目的でｙ方向にずらしている。
【図10】図は、「ジ塩」及び「トリ塩」に分けた、単離した本発明の固形組成物をもたらす全ての実施した実験の概要の表である。それぞれの組成物及び出発物質（Ｆｏｘｙ-５の遊離酸）の経時（４０℃での０、２及び４週間の保管）での不純物プロファイルの変化を示す。
【図11】図は、Ｆｏｘｙ-５組成物であるＨＩＳ－ＧＥＮ１４、ＨＩＳ－ＧＥＮ１５（L-ヒスチジン１：２及び１：３）及びＮＭＧ－ＧＥＮ１６（N-メチル-D-グルカミン（１：２））の「サーマルサイクリング」に使用する温度プロファイルを示す。試料を有機溶媒中に懸濁し、５±２℃～５０℃±２℃で撹拌した。サーマルサイクリングプロファイルは、５±２℃～５０℃±２℃での３サイクル、及び５℃±２℃での３日間の熟成を含んでいた。したがって、試料を、５０℃±２℃に達するまで１０℃／時で加熱し、次いで、５℃±２℃に達するまで２０℃／時（第１サイクル）、１０℃／時（第２サイクル）及び５℃／時（第３サイクル）で冷却した。最後に、懸濁液を、５℃±２℃で３日間撹拌することにより熟成させた。
【図12】図１２は、２つの表を含む：上の表は、Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩のＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析の結果を示す。下の表は、Ｆｏｘｙ-５のN-メチル-D-グルカミン塩のＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析の結果を示す。図から理解できるように、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して決定した比は全て１：１、１：２及び１：３の予測比に近かった。観察されたわずかな偏差は、おそらく、試料の吸湿性に起因する。
【図13】図１３は、下から上に、実験ＩＤ ＧＥＮ５、実験ＩＤ ＴＣＰ７（アセトン中でサーマルサイクリングを行ったもの）、実験ＩＤ ＴＣＰ９（アセトニトリル／水（９０／１０）中でサーマルサイクリングを行ったもの）Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン（１：２）のＨＴ－ＸＲＰＤパターンの重ね合わせを示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
詳細な説明
概要の項で述べたように、塩を含まない原薬（ＤＳ）の水への限定された溶解度に起因したわずか３ｇ／Ｌの最終凍結乾燥用の生成物濃度に関する、Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチド（この明細書では、Ｆｏｘｙ-５ともいう）のための線形液相製造法が出願人のinternational patent application WO 2020/120198に公開されている。更に既に述べられたように、この問題を克服するための初期戦略はＦｏｘｙ-５の三ナトリウム塩の生成をもたらし、これは良好な水溶解度を有するが、三ナトリウム塩を新たな原薬候補として使用不可能にする極めて低い安定性を有することが分かった。
概要の項で述べたように、塩を含まない原薬（ＤＳ）の水への限定された溶解度に起因したわずか３ｇ／Ｌの最終凍結乾燥用の生成物濃度に関する、Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチド（この明細書では、Ｆｏｘｙ-５ともいう）のための線形液相製造法が出願人のinternational patent application WO 2020/120198に公開されている。更に既に述べられたように、この問題を克服するための初期戦略はＦｏｘｙ-５の三ナトリウム塩の生成をもたらし、これは良好な水溶解度を有するが、三ナトリウム塩を新たな原薬候補として使用不可能にする極めて低い安定性を有することが分かった。
【0035】
Ｆｏｘｙ-５がさまざまな窒素塩基と共に溶解性の高い組成物を形成することが判明した。驚くべきことに、これらの組成物のうちの多くは、Ｆｏｘｙ-５の三ナトリウム塩よりも大幅に安定であり、これは潜在的に、Ｆｏｘｙ-５の商業的な製造のための生産量の相当な上昇を可能にする。
【0036】
この発見は、以下の潜在的な「塩形成体」：水酸化アンモニウム、L-アルギニン、水酸化カルシウム、コリン水酸化物、ジエチルアミン、L-リシン、L-ヒスチジン、水酸化マグネシウム、N-メチル-D-グルカミン及びトロメタミンを使用して、Ｆｏｘｙ-５の塩についてスクリーニングを行う際になされた。Ｆｏｘｙ-５のナトリウム塩と関連する公知の問題を考慮すると、塩形成体のこの選択は、薬学的な成分及び賦形剤の規制上の要件をも最終的には満たす、化学的に異なる候補の十分な広がりを提供すると考えられた。したがって、選択された「塩形成体」は、ＧＲＡＳ認証及び／又はＳｔａｈｌ第１種又は第２種指定を有する化合物から選択される（P. H. Stahl and C. G. Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Second Edition, Wiley-VCH: Zuerich (2011)参照）。
【0037】
これまでに説明したように、塩のスクリーニング研究で得られた組成物は、非晶質凍結乾燥物として単離した組成物が塩として適切に（化学量論的に）特徴付けられなかったとしても、便宜上、以降、Ｆｏｘｙ-５のモノ－、ジ－及びトリ－塩ともいう。
【0038】
Ｆｏｘｙ-５のトリ塩は、２つの異なるアプローチ：Ｆｏｘｙ-５の遊離酸の水性懸濁液に計算量の塩基を一度に添加、又は、添加中、懸濁液のｐＨを６．０未満に保ちながら、塩基をゆっくりと添加して、Ｆｏｘｙ-５の遊離酸の２０～３０ｍｇ／ｍＬの水性懸濁液に約３当量の塩基を添加することで製造した。
【0039】
懸濁液のままであったカルシウム及びマグネシウム塩以外の全てについて透明な溶液が得られ、これはカルシウム及びマグネシウム塩以外の全てについて、少なくとも２０ｇ／Ｌの溶解度が得られたことを示す。透明な溶液は凍結乾燥され、固形の凍結乾燥物は、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性が評価された（全ての組成物の概要は実施例の項及び図１０を参照）。全てが非晶質であることが判明した（例示したＰＸＲＤ図は図９を参照）。いくつかの塩形成体については、約５０ｇ／Ｌの溶解度を有するトリ塩を製造する成功した試みがなされ、いくつかのトリ塩では溶解度が１００ｇ／Ｌを超えた。
【0040】
既に研究されている溶解性の高い三ナトリウム塩（背景技術欄を参照）もまた比較のために生成された。
【0041】
３価の塩の実験において透明な溶液をもたらした全ての塩形成体、すなわち水酸化アンモニウム、L-アルギニン、コリン水酸化物、ジエチルアミン、L-リシン、L-ヒスチジン、N-メチル-D-グルカミン及びトロメタミンにより、ジ塩も製造された。この場合も、全ての場合で透明な溶液が得られ、これはＦｏｘｙ-５のジ塩も、２０ｍｇ／ｍＬ以上の水への溶解度を有していたことを示す。溶液は凍結乾燥され、固形の凍結乾燥物は、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性が評価された（実施例の項を参照）。全てが非晶質であることが判明した。いくつかの塩形成体については、約５０ｇ／Ｌの溶解度を有するジ塩を製造する成功した試みがなされた。モノ塩が同様の方法で製造された。
【0042】
得られた凍結乾燥物は、ＰＸＲＤ分析により証明されたように全て非晶質固形物であった。多くの場合、固形物はわずかに吸湿性であった。
【0043】
第１の側面では、本発明は、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）及び窒素塩基を含む固形組成物であって、窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物である、固形組成物を提供する。
【0044】
第１の側面の態様では、固形組成物は、０．５～３．１当量のアンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される窒素塩基を含有する。
【0045】
第１の側面の好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ、配列１）、並びに２．５～３．１当量のアンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される窒素塩基を含む「トリ塩」を提供する。
【0046】
第１の側面の別の好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ、配列１）、並びに１．５０～２．４９当量のアンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される窒素塩基を含む「ジ塩」を提供する。
【0047】
第１の側面の別の態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ、配列１）、並びに０．５～１．４９当量のアンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される窒素塩基を含む「モノ塩」を提供する。
【0048】
背景技術欄で述べたように、Ｆｏｘｙ-５の三ナトリウム塩は高い水溶解度を有するが、驚くべきことに、遊離酸形態と比較して不安定であることが判明した。ナトリウム塩の主な不純物は、
Ｆｏｘｙ５のＣｙｓジスルフィド（二量体）、
Ｆｏｘｙ５のＣｙｓ→Ａｌａ置換、すなわち脱硫誘導体、及び
Ａｓｐアスパルチミド誘導体
であることが判明した（図２参照）。
Ｆｏｘｙ５のＣｙｓジスルフィド（二量体）、
Ｆｏｘｙ５のＣｙｓ→Ａｌａ置換、すなわち脱硫誘導体、及び
Ａｓｐアスパルチミド誘導体
であることが判明した（図２参照）。
【0049】
本発明の第１の側面の組成物の安定性分析は、これらの組成物が、量は変化するものの公知のナトリウム塩と同じ不純物を含有することを実証した。経時での前記不純物の変化はまた、組成物間で大幅に変わる。
【0050】
４０℃での２及び４週間の第１の側面に従う組成物（及び既に製造された三ナトリウム塩）の安定性研究が行われた。いくつかの一般的な傾向が判明した。図５から理解できるように、凍結乾燥の直後に分析された場合（０週間）、並びに４０℃で２及び４週間観察された場合の組成物の絶対純度は、実質的に異なることが判明した。トリ塩の純度は、ジ塩の純度よりも変化した（トリ塩の４週間でのＨＰＬＣ純度７８～９５％対ジ塩の４週間での８７～９６％）。さらに、図６から理解できるように、アミノ酸を含む組成物の絶対純度は、一般的に、他の塩形成体を含む組成物と比較した場合、４０℃での４週間後により高かった（４週間での値：トリ塩について約９０％対約８５％、ジ塩について約９５％対約９０％）。
【0051】
ある態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５及び２．５～３．１当量のアミノ酸、例えば２．８～３．０５当量のアミノ酸、例えば２．９～３．０２当量のアミノ酸、例えば２．９５～３．０１当量のアミノ酸、例えば３．０当量のアミノ酸を含む組成物を提供する。
【0052】
別の態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５及び１．５０～２．４９当量のアミノ酸、例えば１．７～２．１当量のアミノ酸、例えば１．８～２．０５当量のアミノ酸、例えば１．９～２．０３当量のアミノ酸、例えば１．９５～２．０１当量のアミノ酸、例えば２．０当量のアミノ酸を含む組成物を提供する。
【0053】
好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５、及びリシン、アルギニン、又はヒスチジンから選択されるアミノ酸を含む組成物を提供する。
【0054】
本発明の組成物の多くは、既に述べられたように、ある程度吸湿性であり、多くは、湿度の高い空気に晒された場合に粘着性になることが判明した。しかし、元素分析と組み合わせたアッセイ分析は、本発明の組成物のうちのいくつかは、粘着性ではない二水和物及び四水和物といった水和物を形成した、適切な塩として特徴付けることができることを明らかにした（実施例欄を参照）。本発明の組成物は凍結乾燥した非晶質固形物（凍結乾燥物）として単離されたため、そのような水和物は、結晶性水和物ほど正確に定義することはできないが、そうは言っても、組成物のうちの多くは、Ｆｏｘｙ-５と、塩を形成する塩基の１：２（「ジ塩」）又は１：３（「トリ塩」）のおおよその比を有する塩のように非常に明確に定義されることが判明した。
【0055】
最後に、図７は、４０℃で４週間保管した後に少なくとも９０％のＨＰＬＣ（面積％）により測定された純度を有する組成物を示す。図から理解できるように、高い安定性の本発明の組成物は特定の塩形態に限定されない。
【0056】
第１の側面の別の態様では、したがって、本発明は、窒素塩基が、アミノ酸、アンモニア、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物である、組成物を提供する。
【0057】
第１の側面の好ましい態様では、用いられる窒素塩基が、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン、N-メチル-D-グルカミン及びトロメタミンから選択される。
【0058】
他の好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５、並びに１．５０～２．４９当量、例えば１．７～２．１当量、例えば１．９～２．０３当量、例えば１．９５～２．０１当量、例えば２．０当量の、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン及びトロメタミンから選択される窒素塩基を含む組成物を提供する。
【0059】
他の好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５、並びに２．５～３．１当量、例えば２．９～３．０３当量、例えば２．９５～３．０１当量、例えば３．０当量、例えば２．５～３．１当量の、L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンから選択される窒素塩基を含む組成物を提供する。
【0060】
他の好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５のジ－アンモニウム塩、ジ－ヒスチジン塩、トリ－ヒスチジン塩、ジ－リシン塩、ジ-N-メチル-D-グルカミン塩、トリ-N-メチル-D-グルカミン塩及びジ－トロメタミン塩を含み、それらの塩が、場合によりＦｏｘｙ-５に対して０～５当量の水を含む組成物を提供する。
【0061】
特に好ましい態様では、本発明は、Ｆｏｘｙ-５及び１．５～３．１当量、例えば１．７～２．４９当量、例えば１．７～２．１当量、又は、例えば２．５～３．１当量のL-ヒスチジンを含む組成物を提供し、それらの組成物は、場合によりＦｏｘｙ-５に対して０～５当量の水を含む。
【0062】
本発明の第２の側面は、第１の側面に従う組成物の製造方法であって、以下の工程：
ａ） ｉ．溶媒中の懸濁液としての、又は、
ｉｉ．粉末としての
遊離酸形態のＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）を、
ｉｉｉ．０．５～１．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のモノ塩を製造する工程、
ｉｖ．１．５０～２．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のジ塩を製造する工程、又は
ｖ．２．５～３．１当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のトリ塩を製造する工程、
ｂ） 反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌する工程、及び
ｃ） 溶液を沈殿させて、又は、溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥して、固形組成物を単離する工程、を含み、
窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、ａ）～ｃ）の全ての工程を、必要に応じて不活性雰囲気下で行う、組成物の製造方法を提供する。
ａ） ｉ．溶媒中の懸濁液としての、又は、
ｉｉ．粉末としての
遊離酸形態のＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列１、Ｆｏｘｙ-５）を、
ｉｉｉ．０．５～１．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のモノ塩を製造する工程、
ｉｖ．１．５０～２．４９当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のジ塩を製造する工程、又は
ｖ．２．５～３．１当量の窒素塩基と混合してＦｏｘｙ-５のトリ塩を製造する工程、
ｂ） 反応混合物を透明な溶液が得られるまで撹拌する工程、及び
ｃ） 溶液を沈殿させて、又は、溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥して、固形組成物を単離する工程、を含み、
窒素塩基が、アンモニア、水酸化第四級アンモニウム、アルキル化グアニジン、アミノ酸、並びに第一級及び第二級アミンから選択される化合物であり、ａ）～ｃ）の全ての工程を、必要に応じて不活性雰囲気下で行う、組成物の製造方法を提供する。
【0063】
第２の側面の好ましい態様では、工程ｉｉｉ）、ｉｖ）又はｖ）で塩形成に用いる窒素塩基は、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン、N-メチル-D-グルカミン及びトロメタミンから選択される。
【0064】
好ましい態様では、工程ｉ）におけるＦｏｘｙ-５の濃度は、水中で約２０～３０ｍｇ／ｍＬである。他の好ましい態様では、工程ｖｉ）で塩形成に用いる窒素塩基は、１．５０～２．４９当量、例えば１．７～２．１当量、例えば１．９～２．０３当量、例えば１．９５～２．０１当量、例えば２．０当量の、アンモニア、L-リシン、L-ヒスチジン及びトロメタミンから選択される窒素塩基である。
【0065】
他の好ましい態様では、工程ｖ）で塩形成に用いる窒素塩基は、２．５～３．１当量、例えば２．９～３．０３当量、例えば２．９５～３．０１当量、例えば３．０当量の、L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンから選択される窒素塩基である。
【0066】
これまでに説明したように、第１の側面に従う組成物の製造において２つの異なるアプローチを使用した：Ｆｏｘｙ-５の遊離酸の水性懸濁液に計算量の塩基を一度に添加するか、又は、添加の間、反応混合物のｐＨを６．０未満に保ちながら、塩基をゆっくりと添加する。
【0067】
凍結乾燥した直後の組成物のＨＰＬＣ分析では、図８から理解できるように、「ゆっくりと」滴定することが、「素早い」アプローチを使用して製造された組成物よりも低いレベルの不純物を含有する組成物を製造することが判明した。図から理解できるように、影響はアンモニアの「トリ塩」で最も大きく、純度が約９８％から９５％に低下する（ゆっくりと添加→素早い添加）。これと比較して、トロメタミン及びトリ-N-メチル－グルカミンの「トリ塩」の純度は、これらの塩が素早い添加により形成される場合にわずかに低いだけである。理論に縛られることはないが、本発明者らは、この現象は塩を形成する塩基のｐＫａに関連するかもしれないと考えている：水酸化アンモニウムは３つの塩基のうちで最も強く、９．３のｐＫａを有し、一方でトロメタミンとN-メチルグルカミンの両者は８．０のｐＫａを有する。
【0068】
第２の側面の態様では、工程ｂ）で塩形成に用いる窒素塩基を、Ｆｏｘｙ-５の遊離酸の水性懸濁液に一度に添加する。第２の側面の他の態様では、工程ｂ）で塩形成に用いる窒素塩基を、添加の間、反応混合物のｐＨを６未満に保ちながら、Ｆｏｘｙ-５の遊離酸の水性懸濁液に徐々に添加する。
【0069】
第２の側面の更に他の態様では、工程ｂの最終的な透明な溶液を、凍結乾燥して本発明の固形組成物を得る。第２の側面の他の態様では、固形組成物を、結晶化を含む沈殿により工程ｂにおいて最終的な透明な溶液から得る。いくつかの態様では、沈殿又は結晶化を、１つ以上の貧溶媒の添加、蒸発、冷却又はそれらの組合せにより達成する。
【0070】
本発明の組成物のうちのいくつかが、スケールアップのために選択された。この一部として、最初に単離した非晶質生成物をサーマルサイクリング工程に供し、その工程では、非晶質生成物の有機溶媒中の懸濁液を、５℃±２℃～５０℃±２℃の加熱及び冷却を交互に行う１～３サイクルにかけ、その後、懸濁液を５℃±２℃で１～３日間撹拌する熟成工程を行った。驚くべきことに、サーマルサイクリングが行われた物質は、凍結乾燥した物質よりも綿毛状ではなく静電気を帯びにくく、取り扱いが容易であることが判明した。
【0071】
本発明の第３の側面では、第２の側面の工程ｃ）で得た固形組成物を、さらに、
ｉ．凍結乾燥又は噴霧乾燥した生成物の溶媒又は溶媒混合物中の懸濁液を準備すること、
ｉｉ．懸濁液に、５℃±２℃～５０℃±２℃の１～３サイクルを含むサーマルサイクリング工程を行い、続いて、懸濁液を５℃±２℃で１～３日間熟成させること、
ｉｉｉ．例えばろ過又は遠心分離によってサーマルサイクリング後の生成物を単離すること、
を含むサーマルサイクリング工程にかけ、
サーマルサイクリング工程では、懸濁液を、５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で加熱し、その後、懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する。最後に、懸濁液を、例えばろ過又は遠心分離による単離前に５℃±２℃で１～３日間撹拌することで熟成させる。
ｉ．凍結乾燥又は噴霧乾燥した生成物の溶媒又は溶媒混合物中の懸濁液を準備すること、
ｉｉ．懸濁液に、５℃±２℃～５０℃±２℃の１～３サイクルを含むサーマルサイクリング工程を行い、続いて、懸濁液を５℃±２℃で１～３日間熟成させること、
ｉｉｉ．例えばろ過又は遠心分離によってサーマルサイクリング後の生成物を単離すること、
を含むサーマルサイクリング工程にかけ、
サーマルサイクリング工程では、懸濁液を、５０℃±２℃に達するまで１０℃±２℃／時で加熱し、その後、懸濁液を、５℃±２℃に達するまで、
ａ．第１サイクルでは２０℃±２℃／時、
ｂ．第２サイクルでは１０℃±２℃／時、及び
ｃ．第３サイクルでは５℃±２℃／時
で冷却する。最後に、懸濁液を、例えばろ過又は遠心分離による単離前に５℃±２℃で１～３日間撹拌することで熟成させる。
【0072】
サーマルサイクリング工程の温度プロファイルを図１１で説明する。
【0073】
第３の側面の好ましい態様では、有機溶媒を、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル／水（９０／１０）及び酢酸エチルから選択する。
【0074】
第３の側面の好ましい態様では、サーマルサイクリングが行われた生成物は、１：２及び１：３の比のＦｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩、又は１：２の比のＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミン塩である。代表的なＨＴ－ＸＲＰＤ図形を図１３～１５に見ることができる。
【実施例】
【0075】
Ｆｏｘｙ-５のｐＫａの決定
Ｆｏｘｙ-５の遊離酸（ロット：１０５８２６３）のｐＫａを、SiriusT3Control Vers. 2.0.0.0ソフトウェアを備えたSirius T3を使用して、２５℃での電位差滴定により測定した。自動化水性滴定法を使用し、１．５ｍＬのＩＳＡ水に溶解させた１．０ｍｇの固体ＡＰＩを初期値とし、同じ試料について連続して３回滴定した。全ての滴定では、試料溶液の開始ｐＨを０．５Ｍ ＫＯＨで１２に調整し、最終ｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌで２までゆっくりと滴定した。
Ｆｏｘｙ-５の遊離酸（ロット：１０５８２６３）のｐＫａを、SiriusT3Control Vers. 2.0.0.0ソフトウェアを備えたSirius T3を使用して、２５℃での電位差滴定により測定した。自動化水性滴定法を使用し、１．５ｍＬのＩＳＡ水に溶解させた１．０ｍｇの固体ＡＰＩを初期値とし、同じ試料について連続して３回滴定した。全ての滴定では、試料溶液の開始ｐＨを０．５Ｍ ＫＯＨで１２に調整し、最終ｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌで２までゆっくりと滴定した。
【0076】
SiriusT3Refine Vers. 2.0.0.0ソフトウェアを使用して滴定曲線をフィッティングさせ、対応するｐＫａ値を計算した。理論的に予測される４か所の酸性部位の全てのｐＫａの値が実験的にアクセスできる範囲で測定され、ＲＭＳＤは０．０７１であった。フィッティングの結果を表１に示す。
【0077】
ACD/Percepta 14.51.0（ビルド3382）の古典的モード及びＧＡＬＡＳモード、並びにSirius T3 Vers. 2.0.0.0ソフトウェア内のACD_Prediction Vers. 2.0.0.0パッケージにより、理論的なｐＫａ値も計算した。後者はｐＫａの測定に使用するプログラムである。計算した値の分子上の特定部位への割り当てをソフトウェアで行った。表１に示すように、３つの予測法で、０．１～０．５単位で互いに一致する値が得られた。実験値は予測値にかなり近く、システイン基のチオール及びL-アスパラギン酸のカルボン酸の測定値は、対応する予測範囲のほぼ中央にあり、末端カルボン酸及びL-グルタミン酸基のカルボン酸の測定値は、予測範囲の上限をわずかに外れている。
【0078】
【表1】
【0079】
以下に、「トリ塩」、すなわち約３当量の窒素塩基を含有するＦｏｘｙ-５組成物、「ジ塩」、すなわち約２当量の窒素塩基を含有するＦｏｘｙ-５組成物、及び「モノ塩」、すなわち約１当量の窒素塩基を含有するＦｏｘｙ-５組成物に分けて、本発明に従って製造した組成物について、詳しく説明する。
【0080】
形成された全ての組成物及び出発物質（Ｆｏｘｙ-５遊離酸）自体の安定性試験のデータを、４０℃における０、２及び４週間の保管で測定し、図１０に含める。
【0081】
安定性測定の分析条件
安定性試料の純度測定には、物質固有のＵＰＬＣ法の以下のパラメーターを使用した。
安定性試料の純度測定には、物質固有のＵＰＬＣ法の以下のパラメーターを使用した。
【0082】
【表2】
【0083】
Ｆｏｘｙ-５塩の比の決定
単離したいくつかのＦｏｘｙ-５塩、すなわちアンモニアのジ塩及びトリ塩、並びにヒスチジンのジ塩及びトリ塩（以下の実施例を参照）について、元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）を最初に行った。これらの塩では、測定値は塩のさまざまな水和物と合理的に一致しただけであったことから、本明細書に開示した方法でＦｏｘｙ-５の１：１、１：２及び１：３塩が製造されたことを明白に証明するために、比を決定する他の分析法を検討することを決定した。
単離したいくつかのＦｏｘｙ-５塩、すなわちアンモニアのジ塩及びトリ塩、並びにヒスチジンのジ塩及びトリ塩（以下の実施例を参照）について、元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）を最初に行った。これらの塩では、測定値は塩のさまざまな水和物と合理的に一致しただけであったことから、本明細書に開示した方法でＦｏｘｙ-５の１：１、１：２及び１：３塩が製造されたことを明白に証明するために、比を決定する他の分析法を検討することを決定した。
【0084】
そこで、９つの異なるＦｏｘｙ-５塩（１：１、１：２及び１：３の比の、L-ヒスチジン、アンモニウム及びN-メチル-D-グルカミン）の比の決定を、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ及び１Ｈ－ＮＭＲで試みた。
【0085】
水への溶解度
定量的溶解度法を使用して９種の塩の溶解度を決定した。物質を２４時間水に懸濁させ、その後、母液の一部をＵＰＬＣで分析する。２４時間後に物質が溶解した場合、溶解度は、より大きい（＞）とした。
定量的溶解度法を使用して９種の塩の溶解度を決定した。物質を２４時間水に懸濁させ、その後、母液の一部をＵＰＬＣで分析する。２４時間後に物質が溶解した場合、溶解度は、より大きい（＞）とした。
【0086】
溶解度の結果の概要を表３に示す。
【0087】
【表3】
【0088】
製造した１：２及び１：３塩は全て２０ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を示し、１：１塩は約２０ｍｇ／ｍｌの溶解度を示した。比較として、遊離のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドの溶解度は約３ｍｇ／ｍｌである。
【0089】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤ
Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩及びＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミン塩の比の決定のためにＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を開発した。しかし、アンモニウム塩が移動相に含まれることから、この方法はＦｏｘｙ-５のアンモニウム塩には適していない。
Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩及びＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミン塩の比の決定のためにＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を開発した。しかし、アンモニウム塩が移動相に含まれることから、この方法はＦｏｘｙ-５のアンモニウム塩には適していない。
【0090】
濃度０．１ｍｇ／ｍｌの原液及び１０種の注入量（１μｌ～５．５μｌを０．５μｌ刻み）を使用して、L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンの検量線を作成した。対イオンの濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌとなるように、分析に使用するＦｏｘｙ-５塩の量を計算した。次いで、予測面積対実測面積を用いて比を計算した（L-ヒスチジンは図１２の上の表、N-メチル-D-グルカミンは図１２の下の表を参照）。ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法で決定した比は全て１：１、１：２及び１：３の予測比に近いものであった。したがって、ＨＰＬＣ－ＣＡＤは、Ｆｏｘｙ-５とそのそれぞれの対イオンの比を決定するのに十分に適している。このＨＰＬＣ法は、Ｆｏｘｙ-５のアンモニウム塩の比を決定できないが、ＨＰＬＣ移動相を適切に変更することでこの問題を回避できる。
【0091】
１
Ｈ－ＮＭＲ
１Ｈ－ＮＭＲは、共形成体が有機物で１Ｈ－ＮＭＲを測定できる場合、塩のスクリーニングにおいてＡＰＩとその共形成体の比を決定する標準的な方法である。L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンは１Ｈ－ＮＭＲを測定できるプロトンを含有する。アンモニアはプロトンを含有するが、それは通常１Ｈ－ＮＭＲを測定できないので、定量化できない。
１Ｈ－ＮＭＲは、共形成体が有機物で１Ｈ－ＮＭＲを測定できる場合、塩のスクリーニングにおいてＡＰＩとその共形成体の比を決定する標準的な方法である。L-ヒスチジン及びN-メチル-D-グルカミンは１Ｈ－ＮＭＲを測定できるプロトンを含有する。アンモニアはプロトンを含有するが、それは通常１Ｈ－ＮＭＲを測定できないので、定量化できない。
【0092】
したがって、１Ｈ－ＮＭＲにより、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジン及びＦｏｘｙ-５とN-メチル-D-グルカミンの比を決定することを試みた。N-メチル-D-グルカミンのメチル基は塩形成前の２．２６ｐｐｍから塩形成後の２．４８ｐｐｍにシフトしたことから、Ｆｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミンの１：２塩の比の決定は順調に進んだ。メチル基の積分により、ＧＥＮ１６で１：２．１５、ＴＣＰ１８で１：２．０１、ＴＣＰ２０で１：２．０２の比が示された。このように、１Ｈ－ＮＭＲはＦｏｘｙ-５－L-ＮＭＧ塩の比を決定する優れた方法である。
【0093】
しかし、Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩の比の決定は困難であった。ＧＥＮ１４は、予測した１：２の比であると決定された。一方、他の試料の比は、約１：０．１と決定され、これはL-ヒスチジンのＤＭＳＯ－ｄ６への溶解度が低いことによって説明できる。L-ヒスチジンは、おそらく、しばらくするとＮＭＲ溶媒中で結晶化を開始し、そのため、測定中に検出されなかった。
【0094】
新たな試料をＤ２Ｏ中で製造し、実際、L-ヒスチジンのプロトンは非常に強力なシグナルを示したが、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジンの比は予測よりも低く、すなわち１：２の試料では１：１．４、１：３の試料では１：２．１であった。ペプチド自体の積分値も、分子構造から逸脱していた。したがって、緩和遅延がより長い「ｑＮＭＲ」と名付けられたＮＭＲ法で測定することにした。１：３の比のＦｏｘｙ-５－L-ヒスチジン塩であるＧＥＮ１５及びＴＣＰ１１について試験した。ｑＮＭＲ法により、ペプチドの分子式と良好に一致するプロトン積分値が得られ、L-ヒスチジンとの比は１：３に近いことが判定された。
【0095】
結論として、比を決定する上記分析法から、水溶性が良好なＦｏｘｙ-５の１：１、１：２及び１：３の塩を、この明細書で開示した方法により製造できることが示されたと言うことができる。溶解度の測定により、遊離Ｆｏｘｙ-５ペプチドの低い溶解度（３ｍｇ／ｍｌ）から、１：１の塩の上昇した溶解度（約２０ｍｇ／ｍｌ）を経て、１：２及び１：３の塩の大幅に上昇した溶解度（最大で１５０ｍｇ／ｍｌ）への明らかな傾向が示されている。
【0096】
Ｆｏｘｙ-５塩のスケールアップ及びサーマルサイクリング
スケールアップのために３つの塩、すなわち１：２及び１：３の比のＦｏｘｙ-５－ヒスチジン、並びに１：２の比のＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミンを選択した。これらの塩は、溶解度が３１ｍｇ／ｍｌを超え、製造中にｐＨ＜６を維持できることから選択した。水酸化アンモニウムの１：２塩もこれらの要件を満たすが、現在のところ、この塩の比の決定に利用できる正確な分析法が存在しないことから、現時点ではスケールアップには選択しなかった。
スケールアップのために３つの塩、すなわち１：２及び１：３の比のＦｏｘｙ-５－ヒスチジン、並びに１：２の比のＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミンを選択した。これらの塩は、溶解度が３１ｍｇ／ｍｌを超え、製造中にｐＨ＜６を維持できることから選択した。水酸化アンモニウムの１：２塩もこれらの要件を満たすが、現在のところ、この塩の比の決定に利用できる正確な分析法が存在しないことから、現時点ではスケールアップには選択しなかった。
【0097】
選択した全ての塩について３００ｍｇスケールにスケールアップした。全ての場合（Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン（１：２）、Ｆｏｘｙ-５－L-ヒスチジン（１：３）及びＦｏｘｙ-５－N-メチル-D-グルカミン（１：２））で固形物を得た。１Ｈ－ＮＭＲ、ＵＰＬＣ－ＭＳ、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ及びＴＧＭＳを使用して固形物を分析した。
【0098】
得られた固形物を５種の溶媒中で温度プロファイルにかけた（図１１参照）。サーマルサイクリング実験の結果を表４に示す。
【0099】
【表4】
【0100】
サーマルサイクリングを行った試料のＸＲＰＤ図を図１３～１５に示す。スケールアップ及びサーマルサイクリングの結果、大部分は非晶質物質となったが、いくつかの試料はサーマルサイクリングの前後で潮解性であることが判明した。ＨＩＳ １：３塩では、ＸＲＰＤ図に結晶化を示すいくつかのピークが含まれていた。詳しく調べたところ、ピークは、単斜晶系として沈殿した純粋なL-ヒスチジンのわずかな過剰に由来することが判明した。
【0101】
驚くべきことに、サーマルサイクリングを行った物質は、綿毛状のものが少なく、静電気を帯びにくいため、凍結乾燥した物質よりも取り扱いが容易であることが判明した。
【0102】
「トリ塩」の形成
Ｆｏｘｙ-５のトリ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。
Ｆｏｘｙ-５のトリ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。
【0103】
アルギニン トリ塩
実験 ＡＲＧ－Ｐ１
８９．７ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；６７．７ｍｇ（３当量）のL-アルギニンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ７．３１の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ７．２７の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．４７面積％及び９６．４０面積％である。
実験 ＡＲＧ－Ｐ１
８９．７ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；６７．７ｍｇ（３当量）のL-アルギニンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ７．３１の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ７．２７の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．４７面積％及び９６．４０面積％である。
【0104】
カルシウム トリ塩
実験 Ｃａ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２８．８ｍｇ（３当量）のＣａ（ＯＨ）２を添加して、ｐＨ１２．３６の希薄白色懸濁液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ１２．３４の希薄白色懸濁液を得た；室温で一晩撹拌して、白色懸濁液を得た；最低限の溶解度に達しなかったため実験を終了した。
実験 Ｃａ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２８．８ｍｇ（３当量）のＣａ（ＯＨ）２を添加して、ｐＨ１２．３６の希薄白色懸濁液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ１２．３４の希薄白色懸濁液を得た；室温で一晩撹拌して、白色懸濁液を得た；最低限の溶解度に達しなかったため実験を終了した。
【0105】
コリン トリ塩
実験 ＣＨＯ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色懸濁液を得た；９５．４μＬ（３当量）の４６％コリン水酸化物（水溶液）（密度＝１．０７３ｇ／Ｌ）をＮ２下で添加して、ｐＨ８．５１のベージュ色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ８．４３のベージュ色溶液を得た；ＰＶＤＦ０．２μｍのシリンジフィルターで１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；溶液を凍らせ、凍結乾燥し、ベージュ色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９２．１４面積％及び９２．０８面積％である。
実験 ＣＨＯ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色懸濁液を得た；９５．４μＬ（３当量）の４６％コリン水酸化物（水溶液）（密度＝１．０７３ｇ／Ｌ）をＮ２下で添加して、ｐＨ８．５１のベージュ色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ８．４３のベージュ色溶液を得た；ＰＶＤＦ０．２μｍのシリンジフィルターで１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；溶液を凍らせ、凍結乾燥し、ベージュ色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９２．１４面積％及び９２．０８面積％である。
【0106】
ジエチルアミン トリ塩
実験 ＤＥＡ－Ｐ１
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；４０．２μＬ（３当量）のジエチルアミン（密度＝０．７０７ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ５．４３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ５．４５の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣにより試験した；４０℃での２週間及び４週間の保管でガラス質の外観を有することが観察された。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．２６面積％及び９７．２２面積％である。
実験 ＤＥＡ－Ｐ１
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；４０．２μＬ（３当量）のジエチルアミン（密度＝０．７０７ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ５．４３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ５．４５の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣにより試験した；４０℃での２週間及び４週間の保管でガラス質の外観を有することが観察された。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．２６面積％及び９７．２２面積％である。
【0107】
リシン トリ塩
実験 ＬＹＳ－Ｐ１
９０．３ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；５６．８ｍｇ（３当量）のL-リシンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ６．３９の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ６．４６の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．４４面積％及び９７．３９面積％である。
実験 ＬＹＳ－Ｐ１
９０．３ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；５６．８ｍｇ（３当量）のL-リシンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ６．３９の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ６．４６の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１８時間１５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、１４日後にＨＰＬＣで特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．４４面積％及び９７．３９面積％である。
【0108】
マグネシウム トリ塩
実験 Ｍｇ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２２．７ｍｇ（３当量）のＭｇ（ＯＨ）２を添加して、濃い白色懸濁液を得た（濃厚なためｐＨを測定できなかった）；室温で２時間撹拌して、ｐＨ９．０６の白色懸濁液を得た；室温で一晩撹拌して、白色懸濁液を得た；最低限の溶解度に達しなかったため実験を終了した。３０ｇ／Ｌを超える溶解度の塩が得られなかったため、特性評価を行わなかった。
実験 Ｍｇ－Ｐ１
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２２．７ｍｇ（３当量）のＭｇ（ＯＨ）２を添加して、濃い白色懸濁液を得た（濃厚なためｐＨを測定できなかった）；室温で２時間撹拌して、ｐＨ９．０６の白色懸濁液を得た；室温で一晩撹拌して、白色懸濁液を得た；最低限の溶解度に達しなかったため実験を終了した。３０ｇ／Ｌを超える溶解度の塩が得られなかったため、特性評価を行わなかった。
【0109】
ナトリウム トリ塩
実験 Ｎａ－Ｐ１
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３８８．６μＬ（３当量）の１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ８．２３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ８．１７の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．４５μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；２４時間０５分凍結乾燥し、白色固体を得た；冷凍庫で保管し、５日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；試料は、極めて吸湿性であったため秤量が困難であった；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した；４週間の試料は、吸湿性のために秤量が困難であった。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；微量のＮａＣｌが存在する可能性がある；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９５．１１面積％である。
実験 Ｎａ－Ｐ１
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３８８．６μＬ（３当量）の１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ８．２３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ８．１７の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．４５μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；２４時間０５分凍結乾燥し、白色固体を得た；冷凍庫で保管し、５日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；試料は、極めて吸湿性であったため秤量が困難であった；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した；４週間の試料は、吸湿性のために秤量が困難であった。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；微量のＮａＣｌが存在する可能性がある；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９５．１１面積％である。
【0110】
アンモニア トリ塩
実験 ＮＨ３－Ｐ８
１００．３ｍｇ（０．１４４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを１５ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の懸濁液を得た。懸濁液を５００ｒｐｍで撹拌し、ｐＨ電極を挿入した。０．１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、ｐＨを測定するために定期的に休止しながら０．０５ｍＬ／分で投入した。１５分で０．５０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．８４であった；４５分で合計１．３４ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．０９であった；１時間０６分で合計２．３７ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．４２であった；１時間１４分で合計２．７４ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．６４であった；透明無色溶液を得た；１時間４５分で合計３．７４ｍＬの塩基が添加され（２．５９当量と同じ）、ｐＨは５．８１であった；投入を休止した；３時間４０分でｐＨは６．００であった；残りの０．５８ｍＬの塩基は添加しなかった；実験を終了した。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、ドライアイスとイソプロパノールの混合物中で凍らせ、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．０８面積％及び９８．０５面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６８．７６％及び６８．７１％である。窒素の硫黄含有量に対する比は、トリ塩では完全には適合しないが、（重量計算に基づく）添加量が、わずか２．５９当量であったため、これは驚くべきことではない。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、２．６当量のアンモニア及び２当量の水を含む塩と良好に一致する。
実験 ＮＨ３－Ｐ８
１００．３ｍｇ（０．１４４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを１５ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の懸濁液を得た。懸濁液を５００ｒｐｍで撹拌し、ｐＨ電極を挿入した。０．１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、ｐＨを測定するために定期的に休止しながら０．０５ｍＬ／分で投入した。１５分で０．５０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．８４であった；４５分で合計１．３４ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．０９であった；１時間０６分で合計２．３７ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．４２であった；１時間１４分で合計２．７４ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．６４であった；透明無色溶液を得た；１時間４５分で合計３．７４ｍＬの塩基が添加され（２．５９当量と同じ）、ｐＨは５．８１であった；投入を休止した；３時間４０分でｐＨは６．００であった；残りの０．５８ｍＬの塩基は添加しなかった；実験を終了した。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、ドライアイスとイソプロパノールの混合物中で凍らせ、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．０８面積％及び９８．０５面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６８．７６％及び６８．７１％である。窒素の硫黄含有量に対する比は、トリ塩では完全には適合しないが、（重量計算に基づく）添加量が、わずか２．５９当量であったため、これは驚くべきことではない。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、２．６当量のアンモニア及び２当量の水を含む塩と良好に一致する。
【0111】
【表5】
【0112】
N-メチル-D-グルカミン トリ塩
実験 ＮＭＧ－Ｐ５
９０．３ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６６であることを確認した。Ｎ２パージを行い、７００ｒｐｍで撹拌した。０．７８ｍＬのN-メチル-D-グルカミンの０．５Ｍ水溶液（５０ｍＬの水に４．８８０３ｇ）を、薬量計を用いてゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．２５ｍＬの０．５Ｍ ＮＭＧ（水溶液）を添加した後、いくらかの物質が反応容器の底に存在する濁った溶液が観察された。ｐＨは４．０１であった。０．７０ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは５．５１であった。合計０．７４ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した（２．８５当量と同じ）；ｐＨは５．９９であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは６．０１であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、ドライアイス中で凍らせた；一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性を評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．９０面積％及び９６．６９面積％である。
実験 ＮＭＧ－Ｐ５
９０．３ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６６であることを確認した。Ｎ２パージを行い、７００ｒｐｍで撹拌した。０．７８ｍＬのN-メチル-D-グルカミンの０．５Ｍ水溶液（５０ｍＬの水に４．８８０３ｇ）を、薬量計を用いてゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．２５ｍＬの０．５Ｍ ＮＭＧ（水溶液）を添加した後、いくらかの物質が反応容器の底に存在する濁った溶液が観察された。ｐＨは４．０１であった。０．７０ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは５．５１であった。合計０．７４ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した（２．８５当量と同じ）；ｐＨは５．９９であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは６．０１であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、ドライアイス中で凍らせた；一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性を評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．９０面積％及び９６．６９面積％である。
【0113】
トロメタミン トリ塩
実験 ＴＲＯ－Ｐ３
９０．０ｍｇ（０．１２９５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６９であることを確認した。Ｎ２パージを行い、７００ｒｐｍで撹拌した。懸濁液が観察された。０．３９ｍＬのトロメタミンの０．５Ｍ水溶液（２０ｍＬの水に１．２１１５ｇ）を、薬量計を用い、３０分かけててゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．２９ｍＬ（１．１２当量）の０．５Ｍ ＴＲＯ（水溶液）を添加した後、ほぼ全ての固形物が溶解し、ｐＨは４．０４であった。０．５９ｍＬの０．５Ｍ ＴＲＯ溶液（２．２８当量）を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは４．９９であった。合計０．７１ｍＬの０．５Ｍ ＴＲＯ溶液を添加した（２．７４当量と同じ）；ｐＨは５．９５であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは５．９７であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れた；冷凍庫中で凍らせた；一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤにより特性を評価した。次いで、試料を冷凍庫で保管し、５日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．３４面積％及び９８．３５面積％である。
実験 ＴＲＯ－Ｐ３
９０．０ｍｇ（０．１２９５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６９であることを確認した。Ｎ２パージを行い、７００ｒｐｍで撹拌した。懸濁液が観察された。０．３９ｍＬのトロメタミンの０．５Ｍ水溶液（２０ｍＬの水に１．２１１５ｇ）を、薬量計を用い、３０分かけててゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．２９ｍＬ（１．１２当量）の０．５Ｍ ＴＲＯ（水溶液）を添加した後、ほぼ全ての固形物が溶解し、ｐＨは４．０４であった。０．５９ｍＬの０．５Ｍ ＴＲＯ溶液（２．２８当量）を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは４．９９であった。合計０．７１ｍＬの０．５Ｍ ＴＲＯ溶液を添加した（２．７４当量と同じ）；ｐＨは５．９５であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは５．９７であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れた；冷凍庫中で凍らせた；一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤにより特性を評価した。次いで、試料を冷凍庫で保管し、５日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．３４面積％及び９８．３５面積％である。
【0114】
ヒスチジン トリ塩
実験 ＨＩＳ－Ｐ２
１００．４ｍｇ（０．１４５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色ゲル状固形物の懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入して、ｐＨが２．６４であることを確認した；０．０９８５ＭのL-ヒスチジン（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．１ｍＬ／分で投入した；２分で０．３０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．５０であった；９分で合計１．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．５０であった；１９分で合計２．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．２３であった；少しのゲル状固形物の塊があるほぼ透明な溶液が観察された；２９分で合計３．００ｍＬが添加され、ｐＨは４．６１であった；３９分で合計４．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは５．１１であった；透明無色溶液が観察された；４３分で合計４．３８ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは５．２９であった；数時間撹拌した；投入開始後３時間２３分にｐＨを測定すると５．２７であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、１９時間０５分凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た；ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された（図８）。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．２５面積％及び９８．２１面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６２．１２％及び６１．９５％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、トリ塩四水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
実験 ＨＩＳ－Ｐ２
１００．４ｍｇ（０．１４５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色ゲル状固形物の懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入して、ｐＨが２．６４であることを確認した；０．０９８５ＭのL-ヒスチジン（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．１ｍＬ／分で投入した；２分で０．３０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．５０であった；９分で合計１．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．５０であった；１９分で合計２．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．２３であった；少しのゲル状固形物の塊があるほぼ透明な溶液が観察された；２９分で合計３．００ｍＬが添加され、ｐＨは４．６１であった；３９分で合計４．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは５．１１であった；透明無色溶液が観察された；４３分で合計４．３８ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは５．２９であった；数時間撹拌した；投入開始後３時間２３分にｐＨを測定すると５．２７であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、１９時間０５分凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た；ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された（図８）。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．２５面積％及び９８．２１面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６２．１２％及び６１．９５％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、トリ塩四水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
【0115】
【表6】
【0116】
ヒスチジン トリ塩の溶解度の決定
１２．９ｍｇの上記ヒスチジン塩を、撹拌速度５００ｒｐｍ及び水投入速度０．０１ｍＬ／分で水に注意深く再溶解させた。合計０．０８ｍＬの水の添加後に完全に溶解したこと観察され、これは少なくとも１６１ｇ／Ｌの溶解度に相当する。
１２．９ｍｇの上記ヒスチジン塩を、撹拌速度５００ｒｐｍ及び水投入速度０．０１ｍＬ／分で水に注意深く再溶解させた。合計０．０８ｍＬの水の添加後に完全に溶解したこと観察され、これは少なくとも１６１ｇ／Ｌの溶解度に相当する。
【0117】
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ８
７０．１ｍｇ（０．１０１ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約２．９７～２．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは５．４５であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９６．０面積％である。
７０．１ｍｇ（０．１０１ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約２．９７～２．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは５．４５であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９６．０面積％である。
【0118】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：３のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：L-ヒスチジン塩であることが確認された。
【0119】
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ１５
実験ＨＩＳ－Ｐ２を以下のようにスケールアップした：１９９．７ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の１３４．２ｍｇのL-ヒスチジンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは５．４１であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＨＰＬＣ－ＣＡＤでは、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジンの比は１：３．１９であったが、Ｄ２Ｏ中でのｑＮＭＲにより、１：３（Ｆｏｘｙ-５：L-ヒスチジン）と正確に決定された。ＵＰＬＣ分析では、化学的純度は９８．９面積％である。
実験ＨＩＳ－Ｐ２を以下のようにスケールアップした：１９９．７ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の１３４．２ｍｇのL-ヒスチジンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは５．４１であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＨＰＬＣ－ＣＡＤでは、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジンの比は１：３．１９であったが、Ｄ２Ｏ中でのｑＮＭＲにより、１：３（Ｆｏｘｙ-５：L-ヒスチジン）と正確に決定された。ＵＰＬＣ分析では、化学的純度は９８．９面積％である。
【0120】
実験ＨＩＳ－ＧＥＮ１５で得た固形物の５つの試料（それぞれ約５０ｍｇ）を、１０００μＬのエタノール（実験ＴＣＰ１１）、１０００μＬのアセトン（実験ＴＣＰ１２）、１０００μＬのＴＨＦ（実験ＴＣＰ１３）、２００μＬのアセトニトリル／水（９０：１０）（実験ＴＣＰ１４）及び２０００μＬの酢酸エチル（実験ＴＣＰ１５）に懸濁した。サーマルサイクリングを行い、約５℃で３日間熟成させた（図１１の温度プロファイルを参照）。熟成期間の終了後、固形物を遠心分離により回収し、湿潤試料及び真空乾燥試料をＨＴ－ＸＲＰＤで分析した。サーマルサイクリング実験で得た物質は非晶質であったが、酢酸エチルから得たものは、特に凍結乾燥物と比較して、物質の取り扱いの特性が改善したことが判明した。凍結乾燥したＦｏｘｙ-５は、それ自体でも、窒素塩基との組成物でも、静電気を帯びやすいという顕著な傾向があり、微細でかさばる物質であることがよくあり、そのため（例えば秤量の間に）取り扱いが困難である。
【0121】
「ジ塩」の形成
Ｆｏｘｙ-５のジ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。
Ｆｏｘｙ-５のジ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。
【0122】
アルギニン ジ塩
実験 ＡＲＧ－Ｐ２
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；４５．１ｍｇ（２当量）のL-アルギニンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．５７の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５５の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．７０面積％及び９７．６７面積％である。
実験 ＡＲＧ－Ｐ２
９０．５ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；４５．１ｍｇ（２当量）のL-アルギニンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．５７の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５５の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．７０面積％及び９７．６７面積％である。
【0123】
コリン ジ塩
実験 ＣＨＯ－Ｐ２
８９．１ｍｇ（０．１２８ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；６３．６μＬ（２当量）の４６％コリン水酸化物（水溶液）（密度＝１．０７３ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．７８のベージュ色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．７８のベージュ色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９４．４２面積％及び９４．２７面積％である。
実験 ＣＨＯ－Ｐ２
８９．１ｍｇ（０．１２８ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；６３．６μＬ（２当量）の４６％コリン水酸化物（水溶液）（密度＝１．０７３ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．７８のベージュ色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．７８のベージュ色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；ＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９４．４２面積％及び９４．２７面積％である。
【0124】
ジエチルアミン ジ塩
実験 ＤＥＡ－Ｐ２
９０．１ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２６．８μＬ（２当量）のジエチルアミン（密度＝０．７０７ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．６８の希薄白色懸濁液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５４の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．３０面積％及び９７．４１面積％である。
実験 ＤＥＡ－Ｐ２
９０．１ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；２６．８μＬ（２当量）のジエチルアミン（密度＝０．７０７ｇ／Ｌ）をＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．６８の希薄白色懸濁液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５４の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．３０面積％及び９７．４１面積％である。
【0125】
リシン ジ塩
実験 ＬＹＳ－Ｐ２
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３７．０ｍｇ（２当量）のL-リシンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．５３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５２の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．６９面積％及び９７．７３面積％である。
実験 ＬＹＳ－Ｐ２
８９．６ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３７．０ｍｇ（２当量）のL-リシンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．５３の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．５２の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣにより特性を評価した；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．６９面積％及び９７．７３面積％である。
【0126】
アンモニア ジ塩
実験 ＮＨ３－Ｐ６
１００．７ｍｇ（０．１４５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ゲル状の白色懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入して、ｐＨが２．６３であることを確認した；１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．０５ｍＬ／分で投入した；２分で０．１０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１９であった；４分で合計０．２０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１１であった；白色懸濁液の上部に無色溶液が観察された；５分で０．２９ｍＬの塩基（ジ塩化学量論）が添加され、ｐＨは３．１８であった；７分でｐＨは５．４９で、溶液はほぼ透明であった；１２分でｐＨは４．６０で、溶液は透明であった；２時間１２分でｐＨを測定すると４．５６であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、冷凍庫で５日間保管した；次いで、２７時間３５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．６２面積％及び９７．６６面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ８９．３２％及び８９．０８％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、ジ塩二水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
実験 ＮＨ３－Ｐ６
１００．７ｍｇ（０．１４５ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬの超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ゲル状の白色懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入して、ｐＨが２．６３であることを確認した；１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．０５ｍＬ／分で投入した；２分で０．１０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１９であった；４分で合計０．２０ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１１であった；白色懸濁液の上部に無色溶液が観察された；５分で０．２９ｍＬの塩基（ジ塩化学量論）が添加され、ｐＨは３．１８であった；７分でｐＨは５．４９で、溶液はほぼ透明であった；１２分でｐＨは４．６０で、溶液は透明であった；２時間１２分でｐＨを測定すると４．５６であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、冷凍庫で５日間保管した；次いで、２７時間３５分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＨＰＬＣ（２回）及び元素分析を行った。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．６２面積％及び９７．６６面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ８９．３２％及び８９．０８％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ）（下の表）は、ジ塩二水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
【0127】
【表7】
【0128】
実験 ＮＨ３－ＧＥＮ６
８１．３ｍｇ（０．１１７ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．３６であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９３．７面積％である。
８１．３ｍｇ（０．１１７ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．３６であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９３．７面積％である。
【0129】
ＨＰＬＣ移動相中のアンモニアの存在のため、単離した化合物が１：２のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：ＮＨ３塩であることの確認は不可能であった。
【0130】
N-メチル-D-グルカミン ジ塩
実験 ＮＭＧ－Ｐ６
９０．２ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６７であることを確認した。上部の空間をＮ２パージし（Ｎ２雰囲気）、７００ｒｐｍで撹拌した。懸濁液が観察された。０．５２ｍＬのN-メチル-D-グルカミンの０．５Ｍ水溶液（５０ｍＬの水に４．８８０３ｇ）を、薬量計を用いてゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．３５ｍＬの０．５Ｍ ＮＭＧ（水溶液）を添加した後、ほぼ全ての固形物が溶解し、いくらか塊のある溶液が観察された。ｐＨは４．１３であった。０．５０ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは４．５７であった。合計０．５２ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した（２．０当量に相当）；ｐＨは４．６４であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは４．６３であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れた；得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性を評価した。この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した；４０℃で２週間保管した後、粘着性のガラス質の外観を有することが観察された。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．６４面積％及び９６．５８面積％である。
実験 ＮＭＧ－Ｐ６
９０．２ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加した（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）。ｐＨ計を挿入し、ｐＨが２．６７であることを確認した。上部の空間をＮ２パージし（Ｎ２雰囲気）、７００ｒｐｍで撹拌した。懸濁液が観察された。０．５２ｍＬのN-メチル-D-グルカミンの０．５Ｍ水溶液（５０ｍＬの水に４．８８０３ｇ）を、薬量計を用いてゆっくりと添加し、複数の時点でｐＨを測定した。０．３５ｍＬの０．５Ｍ ＮＭＧ（水溶液）を添加した後、ほぼ全ての固形物が溶解し、いくらか塊のある溶液が観察された。ｐＨは４．１３であった。０．５０ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した後、透明溶液を得た；ｐＨは４．５７であった。合計０．５２ｍＬの０．５Ｍ N-メチル-D-グルカミン溶液を添加した（２．０当量に相当）；ｐＨは４．６４であった。２時間撹拌した後、溶液のｐＨは４．６３であった。透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れた；得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＰＸＲＤ及びＨＰＬＣにより特性を評価した。この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣで２回試験した；４０℃で２週間保管した後、粘着性のガラス質の外観を有することが観察された。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９６．６４面積％及び９６．５８面積％である。
【0131】
実験 ＮＭＧ－ＧＥＮ７
７９．３ｍｇ（０．１１４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．５ＭのN-メチル-D-グルカミン溶液（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．７３であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９５．０面積％である。
７９．３ｍｇ（０．１１４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．５ＭのN-メチル-D-グルカミン溶液（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．７３であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９５．０面積％である。
【0132】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：２のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：N-メチル-D-グルカミン塩であることが確認された。
【0133】
実験 ＮＭＧ－ＧＥＮ１６
実験ＮＭＧ－Ｐ６を以下のようにスケールアップした：２００．３ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の１１３．５ｍｇのN-メチル-D-グルカミンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは４．６８であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＵＰＬＣ、ＴＧＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ及びＨＰＬＣ－ＣＡＤにより特性を評価した。ＵＰＬＣによれば化学的純度は９９．０％（面積％）である。
実験ＮＭＧ－Ｐ６を以下のようにスケールアップした：２００．３ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の１１３．５ｍｇのN-メチル-D-グルカミンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは４．６８であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＵＰＬＣ、ＴＧＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ及びＨＰＬＣ－ＣＡＤにより特性を評価した。ＵＰＬＣによれば化学的純度は９９．０％（面積％）である。
【0134】
ＮＭＧ－ＧＥＮ１６の１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：２のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：N-メチル-D-グルカミン塩であることが確認された。
【0135】
得られた固形物を以下のようにサーマルサイクリングを行った。
【0136】
実験ＮＭＧ－ＧＥＮ１６で得た固形物の５つの試料（それぞれ約５０ｍｇ）を、１０００μＬのエタノール（実験ＴＣＰ１６）、１０００μＬのアセトン（実験ＴＣＰ１７）、１０００μＬのＴＨＦ（実験ＴＣＰ１８）、２００μＬのアセトニトリル／水（９０：１０）（実験ＴＣＰ１９）及び２０００μＬの酢酸エチル（実験ＴＣＰ２０）に懸濁した。サーマルサイクリングを行い、約５℃で３日間熟成させた（図１１の温度プロファイルを参照）。熟成期間の終了後、固形物を遠心分離により回収し、湿潤試料及び真空乾燥試料をＨＴ－ＸＲＰＤで分析した。サーマルサイクリング実験で得た物質は非晶質であったが、酢酸エチルから得たものは、特に凍結乾燥物と比較して、物質の取り扱いの特性が改善したことが判明した。凍結乾燥したＦｏｘｙ-５は、それ自体でも、窒素塩基との組成物でも、静電気を帯びやすいという顕著な傾向があり、微細でかさばる物質であることがよくあり、そのため（例えば秤量の間に）取り扱いが困難である。
【0137】
トロメタミン ジ塩
実験 ＴＲＯ－Ｐ２
９０．１ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３１．４ｍｇ（２当量）のトロメタミンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．８８の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．８６の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．７７面積％及び９７．７８面積％である。
実験 ＴＲＯ－Ｐ２
９０．１ｍｇ（０．１３０ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを４ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３ｍＬの脱気した超純水を添加して（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、ガラス質の白色懸濁液を得た；３１．４ｍｇ（２当量）のトロメタミンをＮ２パージ下で添加して、ｐＨ４．８８の透明無色溶液を得た；室温で２時間撹拌して、ｐＨ４．８６の透明無色溶液を得た；シリンジフィルター（直径１３ｍｍ、ＰＶＤＦ０．２μｍ）で１０ｍＬ丸底フラスコにろ過した；得られた溶液をドライアイス中で凍らせた；１９時間３０分凍結乾燥し、白色固体を得た；ＰＸＲＤにより特性を評価した；冷凍庫で保管し、６日後にＨＰＬＣで特性を２回評価した。ＰＸＲＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９７．７７面積％及び９７．７８面積％である。
【0138】
ヒスチジン ジ塩
実験 ＨＩＳ－Ｐ３
９９．２ｍｇ（０．１４３ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬ（すなわち３０ｍｇ／ｍｌ）の超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色ゲル状固形物の懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入してｐＨが２．６５であることを確認した；０．０９８５ＭのL-ヒスチジン（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．１ｍＬ／分で投入した；１分で０．１７ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１０であった；１０分で合計１．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．９０であった；２０分で合計２．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．４０であった；ゲル状固形物の塊が少しあるほぼ透明な溶液が観察された；２８分で合計２．８２ｍＬが添加され、ｐＨは４．７３であった；１時間１０分では透明無色溶液が観察された；投入開始後２時間２８分でｐＨを測定すると４．５０であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、１９時間０５分凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た；ＨＰＬＣ及び元素分析を行った；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣにより試験した；試料を４０℃で２週間及び４週間保管した後に綿毛状の白色固体のままであることを観察した。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．０２面積％及び９８．００面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６７．８８％及び６７．８６％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ、下の表）は、ジ塩二水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
実験 ＨＩＳ－Ｐ３
９９．２ｍｇ（０．１４３ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍＬのSupelcoバイアルに量り取った；３．３３ｍＬ（すなわち３０ｍｇ／ｍｌ）の超純水をＮ２パージ下で添加し（抵抗率≧１８．２ＭΩｃｍ）、白色ゲル状固形物の懸濁液が観察された；５００ｒｐｍで撹拌し、電極を挿入してｐＨが２．６５であることを確認した；０．０９８５ＭのL-ヒスチジン（水溶液）を、ｐＨを測定するために休止しながら０．１ｍＬ／分で投入した；１分で０．１７ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．１０であった；１０分で合計１．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは３．９０であった；２０分で合計２．００ｍＬの塩基が添加され、ｐＨは４．４０であった；ゲル状固形物の塊が少しあるほぼ透明な溶液が観察された；２８分で合計２．８２ｍＬが添加され、ｐＨは４．７３であった；１時間１０分では透明無色溶液が観察された；投入開始後２時間２８分でｐＨを測定すると４．５０であり、実験を終了させた；透明無色溶液を２０ｍＬ丸底フラスコに入れ、得られた溶液をドライアイス中で凍らせ、１９時間０５分凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た；ＨＰＬＣ及び元素分析を行った；この試料の一部を４０℃で２週間及び４週間、密閉容器に保管し、ＨＰＬＣにより試験した；試料を４０℃で２週間及び４週間保管した後に綿毛状の白色固体のままであることを観察した。ＨＰＬＣでは、２回の注入の純度は９８．０２面積％及び９８．００面積％であり、対応するアッセイ値はそれぞれ６７．８８％及び６７．８６％である。生成物の元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ及びＳ、下の表）は、ジ塩二水和物である非晶質生成物と良好に一致する。
【0139】
【表8】
【0140】
ヒスチジン ジ塩の溶解度の決定
Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチドの最初のスラリー化に半分の量の水（６０ｍｇ／ｍｌ）を使用して上記実験を繰り返した。５．８２のｐＨでヒスチジン ジ塩の３１．６ｇ／Ｌの最終濃度を得た。ヒスチジン溶液をそのまま（固形物）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドに添加して実験を再度繰り返し、５．７８のｐＨで４９．３ｇ／Ｌの最終濃度を得た。両者の場合とも、最終溶液を凍らせ、２５時間凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た。
Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチドの最初のスラリー化に半分の量の水（６０ｍｇ／ｍｌ）を使用して上記実験を繰り返した。５．８２のｐＨでヒスチジン ジ塩の３１．６ｇ／Ｌの最終濃度を得た。ヒスチジン溶液をそのまま（固形物）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドに添加して実験を再度繰り返し、５．７８のｐＨで４９．３ｇ／Ｌの最終濃度を得た。両者の場合とも、最終溶液を凍らせ、２５時間凍結乾燥し、綿毛状の白色固体を得た。
【0141】
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ５
７８．４ｍｇ（０．１１３ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．６１であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９３．９面積％である。
７８．４ｍｇ（０．１１３ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約１．９７～１．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは４．６１であった。実験を終了し、無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９３．９面積％である。
【0142】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：２のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：L-ヒスチジン塩であることが確認された。
【0143】
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ１４
実験ＨＩＳ－Ｐ３を以下のようにスケールアップした：２２０．１ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の９８．５ｍｇのL-ヒスチジンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは４．６５であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＨＰＬＣ－ＣＡＤでは、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジンの比は１：２．１０であったが、１Ｈ ＮＭＲにより、１：２．０３と正確に決定された。ＵＰＬＣ分析では、化学的純度は９８．９面積％である。
実験ＨＩＳ－Ｐ３を以下のようにスケールアップした：２２０．１ｍｇのＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを７ｍｌの脱気水中の９８．５ｍｇのL-ヒスチジンと合わせ、出発物質が完全に溶解するまで撹拌した。ｐＨは４．６５であった。その後、溶液を一晩凍結乾燥した。白色固体が得られ、ＨＰＬＣ－ＣＡＤでは、Ｆｏｘｙ-５とL-ヒスチジンの比は１：２．１０であったが、１Ｈ ＮＭＲにより、１：２．０３と正確に決定された。ＵＰＬＣ分析では、化学的純度は９８．９面積％である。
【0144】
実験ＨＩＳ－ＧＥＮ１４で得た固形物の５つの試料（それぞれ約５０ｍｇ）を、１０００μＬのエタノール（実験ＴＣＰ６）、１０００μＬのアセトン（実験ＴＣＰ７）、１０００μＬのＴＨＦ（実験ＴＣＰ８）、２００μＬのアセトニトリル／水（９０：１０）（実験ＴＣＰ９）及び２０００μＬの酢酸エチル（実験ＴＣＰ１０）に懸濁した。サーマルサイクリングを行い、約５℃で３日間熟成させた（図１１の温度プロファイルを参照）。熟成期間の終了後、固形物を遠心分離により回収し、湿潤試料及び真空乾燥試料をＨＴ－ＸＲＰＤで分析した。サーマルサイクリング実験で得た物質は非晶質であったが、酢酸エチルから得たものは、特に凍結乾燥物と比較して、物質の取り扱いの特性が改善したことが判明した。凍結乾燥したＦｏｘｙ-５は、それ自体でも、窒素塩基との組成物でも、静電気を帯びやすいという顕著な傾向があり、微細でかさばる物質であることがよくあり、そのため（例えば秤量の間に）取り扱いが困難である。
【0145】
「モノ塩」の形成
Ｆｏｘｙ-５のモノ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。次いで、反応混合物は、出発物質が溶解するまで撹拌する。モノ塩の最終溶液は、必要に応じてろ過し、次いで、凍結乾燥又は噴霧乾燥する。
Ｆｏｘｙ-５のモノ塩は、一般的に、Ｆｏｘｙ-５の水又は他の適切な溶媒中の懸濁液に、塩基を添加することで製造する。塩基は、調製中にｐＨを６未満に保ちながら、そのまま又は溶液中の状態で、一度に又は徐々に添加できる。次いで、反応混合物は、出発物質が溶解するまで撹拌する。モノ塩の最終溶液は、必要に応じてろ過し、次いで、凍結乾燥又は噴霧乾燥する。
【0146】
ヒスチジン モノ塩
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ２
９０．６ｍｇ（０．１３１ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約０．９７～０．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは３．８８であった。実験を終了し、わずかに乳白色の無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９５．２面積％である。
実験 ＨＩＳ－ＧＥＮ２
９０．６ｍｇ（０．１３１ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．１Ｍのヒスチジン（水溶液）を、約０．９７～０．９８モル当量となるまで撹拌しながらゆっくりと添加した。ｐＨは３．８８であった。実験を終了し、わずかに乳白色の無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９５．２面積％である。
【0147】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：１のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：L-ヒスチジン塩であることが確認された。
【0148】
アンモニア モノ塩
実験 ＮＨ３－ＧＥＮ３
９２．６ｍｇ（０．１３４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、約０．９９モル当量となるまで撹拌しながら０．０５ｍＬ／分で投入した。ｐＨは３．８７であった。実験を終了し、わずかに乳白色の無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９４．４面積％である。
実験 ＮＨ３－ＧＥＮ３
９２．６ｍｇ（０．１３４ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、１ＭのＮＨ４ＯＨ（水溶液）を、約０．９９モル当量となるまで撹拌しながら０．０５ｍＬ／分で投入した。ｐＨは３．８７であった。実験を終了し、わずかに乳白色の無色溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９４．４面積％である。
【0149】
ＨＰＬＣ移動相中のアンモニアの存在のため、単離した化合物が１：１のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：ＮＨ３塩であることの確認は不可能であった。
【0150】
N-メチル-D-グルカミン モノ塩
実験 ＮＭＧ－ＧＥＮ４
８９．５ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．２６ｍｌ（１モル当量）のN-メチル-D-グルカミン（５０ｍＬの水に４．８８ｇ）の０．５Ｍ水溶液を撹拌しながらゆっくりと添加した。約２時間後、ほぼ透明なわずかに乳白色の溶液を得た。ｐＨはこの時点で３．９１であった。実験を終了し、溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９４．３面積％である。
実験 ＮＭＧ－ＧＥＮ４
８９．５ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを５ｍｌの水に室温でスラリー化し、０．２６ｍｌ（１モル当量）のN-メチル-D-グルカミン（５０ｍＬの水に４．８８ｇ）の０．５Ｍ水溶液を撹拌しながらゆっくりと添加した。約２時間後、ほぼ透明なわずかに乳白色の溶液を得た。ｐＨはこの時点で３．９１であった。実験を終了し、溶液を上述のとおりに凍結乾燥した。ＨＴ－ＸＲＰＤにより試料が非晶質であることが確認された；ＵＰＬＣでは純度は９４．３面積％である。
【0151】
ＨＰＬＣ－ＣＡＤにより、試料が１：１のＦｏｘｙ-５ヘキサペプチド：ＮＭＧ塩であることが確認された。
【図1】
【図2A)】
【図2B)】
【図2C)】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】