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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】Ｃ末端Ａ－アミド化への光化学的アプローチ
(51)【国際特許分類】
C07K 1/02 20060101AFI20241128BHJP
C07K 2/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241128BHJP
C07K 14/575 20060101ALN20241128BHJP
【ＦＩ】
C07K1/02
C07K2/00
A61K38/16
C07K14/575 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024534351
(86)(22)【出願日】2022-12-09
(85)【翻訳文提出日】2024-06-07
(86)【国際出願番号】 EP2022085255
(87)【国際公開番号】W WO2023105074
(87)【国際公開日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/288,071
(32)【優先日】2021-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】22152378.0
(32)【優先日】2022-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】マイケル・リチャード・ハリス
(72)【発明者】
【氏名】シドニー・ウォン
(72)【発明者】
【氏名】デヴィッド・トーマス・ヒメル
(72)【発明者】
【氏名】ヴォウター・フレデリク・ヨハン・ホーゲンドルフ
(72)【発明者】
【氏名】フェリックス・ヴォイチク
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス・レイモンド・コックス
(72)【発明者】
【氏名】ベンジャミン・マシュー・ウィリアムズ
(72)【発明者】
【氏名】アスムス・リングルビョーグ・モートゥンスン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA06
4C084BA01
4C084CA59
4C084ZC80
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045BA20
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA45
4H045DA47
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA61
(57)【要約】
本発明は、全ての生体関連ペプチドホルモンの最大で半分に相当する化合物のクラスであるＣ末端α－アミドを製造するための光化学的プロセスに関する。本発明により、大規模製造に好適な、易しく、対象範囲が広く、経済効率の良いプロセスが得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スキーム１に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、【化1】
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、前記光標識（Ｒ１）とカップリングして、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．前記式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを照射して、光化学的変換により式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．得られた前記式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
【請求項2】
Ｒ３が、水素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｒ２が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
Ｒ２が、配列番号３～１４および１６～１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、２－ブロモ－１，４－ナフトキノン、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、および４－フルオロ－７－スルファモイルベンゾフラザンから成る群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）または４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：化学式１：
【化2】
【化3】
【請求項7】
前記光標識剤が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）：化学式１：
【化4】
【請求項8】
前記光標識剤が、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：化学式２：
【化5】
【請求項9】
前記方法の工程（ａ）が、水性反応緩衝液中で行われ、前記水性緩衝液が、ビス－トリスメタン、トリス、トリエタノールアミン、およびホスフェートから成る群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～５００ｎｍの波長を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記方法の少なくとも一部が、流通式反応器で実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程（ｂ）の前に、前記ペプチドＲ２のシステインを前記光標識Ｒ１とカップリングして、光標識で保護されたシステインを形成する工程と、工程（ｂ）の後に、前記光標識で保護されたシステインを前記ペプチドＲ２から放出する工程と、をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
求核性硫化物および酸化パートナーが提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、【化6】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフルパザンとカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩ－ａの前記ペプチド－光標識コンジュゲートを、４００～４５０ｎｍの波長を有する光で照射して、光化学的変換により式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．式ＩＩＩの前記Ｃ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項の記載による、医薬組成物を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ末端α－アミドを製造するための光化学的プロセスに関し、より具体的には、光化学的プロセスを用いてＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃ末端α－アミド化は、全ての生物学的に活性なペプチドホルモンおよび神経ペプチドの半分超で発生し、しばしば完全な生物活性に必要とされる、一般的な翻訳後修飾である。
【0003】
化学的Ｃ末端α－アミド化は、Ｃ末端の選択的な官能基化を必要とする。アミド化ペプチドの生成は、完全合成アプローチ（非特許文献１）および組み換え発現させたＣ末端グリシン延長前駆体のインビトロ酵素酸化（非特許文献２）による。しかしながら、これらのアプローチは複雑かつ高価である。例えば、ペプチジルグリシンα－アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）および関連するアミド化酵素は、基質特異的であるだけでなく、哺乳動物培養物中で発現されなければならず、これは製造プロセスにコストを上乗せする。
【0004】
Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．は、ブロモマレイミドを用いたシステインの選択的修飾のための方法を提供し、システインマレイミドコンジュゲートの光分解修飾のための方法を開示することを趣旨としている（非特許文献３および非特許文献４）。
【0005】
光分解工程を含む、選択的Ｃ末端官能基化およびα－アミド化への酵素的アプローチは、特許文献１および非特許文献５でさらに提示されている。Ｍａｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．は、その主張によれば、選択的Ｃ末端修飾およびα－アミド化への電気化学的アプローチを開示する（非特許文献６）。
【0006】
それでも、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドの製造規模の調製に適合する、低コストかつ選択的であり、拡張可能なプロセスを提供することには、依然として課題がある。常に改善の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】ＵＳ５５８０７５１
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６，４５０－４５６（１９９４）
【非特許文献2】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，６４－７０（１９９３）
【非特許文献3】Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６５８３－６５８５（２００９）
【非特許文献4】Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４，４５５－４５９（２０１６）
【非特許文献5】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４１，１６９－１８０（１９９３）
【非特許文献6】Ｍａｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４３，１１８１１－１１８１９（２０２１）
【発明の概要】
【0009】
本研究の１つの目的は、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質の生成のための光化学的プロセスを提供することである。従来のアミド化方法の欠点のうちの少なくともいくつかを克服しながら、様々なペプチドに適用することができる選択的で低コストのＣ末端ペプチドおよびタンパク質アミド化プロセスを提供することが目的である。
【0010】
総合的な光化学反応を以下のスキーム１に示し、さらに図１に示す。スキーム１に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識（Ｒ１）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法が本明細書に開示される。
【化1】
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識（Ｒ１）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法が本明細書に開示される。
【0011】
本発明の第１の態様では、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するためのスキーム１に従う方法が提供される。これは、Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉとして示される）を含むペプチドまたはタンパク質から開始し、それを光標識剤（Ｒ１－Ｘとして示される）と反応させて、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得ることによって達成される。続いて、ペプチド－光標識コンジュゲートを光に曝し、光化学的変換を受けさせて、ペプチドまたはタンパク質エナミド（式ＩＩＩ）を得た後、結果として得られるＣ末端α－アミド（式ＩＶ）に変換する。
【0012】
Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法は、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、２－ブロモ－１，４－ナフトキノン、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、および４－フルオロ－７－スルファモイルベンゾフラザンから成る群から選択される光標識剤（Ｒ１－Ｘ）を含んでもよい。Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、３，６－ジフェニル－１，２，４，５－テトラジン、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される切断試薬の使用を含んでもよい。
【0013】
Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、または１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドＲ２を含んでもよい。
【0014】
以下に見られ、さらに図２に示されるスキーム２に従う、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法。
【化2】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法。
【0015】
第２の態様による本発明は、式ＩのＣ末端システインを含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤としての４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンと反応させて、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得ることによって行われる。続いて、コンジュゲートを光化学反応によって式ＩＩＩのエナミドに変換し、これを切断によって式ＩＶの所望のＣ末端α－アミドに変換する。
【0016】
Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法は、照射（工程（ｂ））前にペプチドＲ２のシステインを光標識Ｒ１とカップリングして光標識で保護されたシステインを形成する工程と、照射（工程（ｂ））後に光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出する工程と、をさらに含んでもよい。本方法は、光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加える工程をさらに含んでもよい。
【0017】
本光化学的アミド化法は、易しく、対象範囲が広く、経済効率が良く、大規模な製造に好適である。本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかとなるさらなる問題も解決し得る。
【0018】
配列表
配列番号１は、Ｃ末端システインの直前のＲ２（スキーム１または２）として提供され得る非限定的で例示的なペプチドのアミノ酸配列を表し、光アミド化プロセス（すなわち、スキーム１および２の式Ｉ）の前のペプチドの最後から二番目のアミノ酸（ポリペプチドのＮ末端からＣ末端）は、変化し得、
配列番号２は、Ｒ２（スキーム１または２）を形成することができるペプチドの例示的な実施形態のアミノ酸配列を表し、
配列番号３は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号４は、パンクレアスタチン（ＰＳＴ）阻害剤、より具体的には、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号５は、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号６は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号７は、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号８は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、より具体的には、コシントロピンを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号９は、ＱＲＦ－アミドペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１０は、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬ＥＰ４５を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１１は、侵入阻害剤、より具体的には、ブレビルチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１２は、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１３は、抗レトロウイルス薬剤、より具体的には、エンフビルチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１４は、アミリン受容体作動薬、より具体的には、プラムリンチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１５は、Ｒ２（スキーム１または２）として提供され得る非限定的で例示的なペプチドのアミノ酸配列を表し、これについて、ジスルフィド結合がその中に所望され、
配列番号１６は、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１７は、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬を生成するための、アミド化およびＮ末端延長部用のペプチドから成る出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１８は、ペプチド部分（Ｒ２）の一部を形成し得る例示的なＮ末端延長部のアミノ酸配列を表す。
配列番号１は、Ｃ末端システインの直前のＲ２（スキーム１または２）として提供され得る非限定的で例示的なペプチドのアミノ酸配列を表し、光アミド化プロセス（すなわち、スキーム１および２の式Ｉ）の前のペプチドの最後から二番目のアミノ酸（ポリペプチドのＮ末端からＣ末端）は、変化し得、
配列番号２は、Ｒ２（スキーム１または２）を形成することができるペプチドの例示的な実施形態のアミノ酸配列を表し、
配列番号３は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号４は、パンクレアスタチン（ＰＳＴ）阻害剤、より具体的には、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号５は、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号６は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号７は、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号８は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、より具体的には、コシントロピンを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号９は、ＱＲＦ－アミドペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１０は、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬ＥＰ４５を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１１は、侵入阻害剤、より具体的には、ブレビルチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１２は、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１３は、抗レトロウイルス薬剤、より具体的には、エンフビルチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１４は、アミリン受容体作動薬、より具体的には、プラムリンチドを生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１５は、Ｒ２（スキーム１または２）として提供され得る非限定的で例示的なペプチドのアミノ酸配列を表し、これについて、ジスルフィド結合がその中に所望され、
配列番号１６は、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬を生成するための出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１７は、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬を生成するための、アミド化およびＮ末端延長部用のペプチドから成る出発材料のペプチド部分（Ｒ２）のアミノ酸配列を表し、
配列番号１８は、ペプチド部分（Ｒ２）の一部を形成し得る例示的なＮ末端延長部のアミノ酸配列を表す。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
治療用製品、例えば、アミリンペプチド（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ．Ｊ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｉｎ，ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９６６２－９６６６（１９８９））、ＮＰＹ（Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎ－ ｏｒ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｒ Ｄ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，５９７－６０１（１９８９））、および他のもの（Ｎｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｂａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ？ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６１，１３８２－１４１４（２０１８））の構造活性研究により、Ｃ末端アミド化が完全な生物活性にしばしば必要とされることが明らかとなった。しかしながら、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドの製造規模の調製は、特に困難である。このため、Ｃ末端アミドを含むペプチドを製造するための選択的かつ低コストであり、拡張可能な半組み換え技術が必要とされている。
【0021】
本発明は、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を製造するための光化学的プロセスに関する。本方法は、Ｃ末端α－アミドを有する多種多様な生物学的に活性なペプチドを生成するために利用され得るように、対象範囲が広いという利点を提供する。明らかとなるように、本明細書に開示のＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を製造するためのプロセスは、タンパク質の特定のペプチド（Ｒ２）に縛られず、光化学的プロセスにおけるその目的を考慮して、本明細書ではＣ末端システインアミド化タグと呼ばれ得るＣ末端システインを介した広範なペプチドまたはタンパク質のアミド化のための方法を提供する。本方法は、ペプチドおよびタンパク質のＣ末端アミド化を、ペプチドおよびタンパク質がその中に２つ以上のシステイン（すなわち、Ｃ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質の製造に使用するＣ末端システインアミド化タグに加えた、ペプチドＲ２内のシステイン）を含む場合でも可能にするのに十分に特異的である。同様に、または代替として、本発明の別の利点は、本方法が、容易にかつ商業的に入手可能な出発材料および単純な反応セットアップに起因して、経済効率が良いことであり、これにより、プロセスが、バッチ製造または流通製造に好適となり、大規模製造の役に立つようになる。
【0022】
本発明は、Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質から開始し、それを光標識剤（Ｒ１－Ｘ）と反応させてペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得た後、ペプチド－光標識コンジュゲートを光に曝露してペプチドまたはタンパク質エナミド（式ＩＩＩ）を得て、次いで得られたエナミドをＣ末端α－アミド（式ＩＶ）に変換することによって、スキーム１（図１）に示されるように行われる。
【0023】
上記の光化学的アミド化反応は、３つの一般的な反応工程：
工程（ａ）：Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る工程と、
工程（ｂ）：得られたペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を光化学的に変換して、Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）：Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、に分けられる。
工程（ａ）：Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る工程と、
工程（ｂ）：得られたペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を光化学的に変換して、Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）：Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、に分けられる。
【0024】
これらの工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）はまた、スキーム１に、およびスキーム２の例示的な実施形態内に概して示される。各工程は、以下に定義されるように、それ自体の反応物質および条件を特徴とし得る。
【0025】
本明細書に開示のＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を製造するためのプロセスは、生物学的に活性なペプチドの合成の様々な戦略的時点で実施され得ることが理解される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示のＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を製造するためのプロセスは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）濾過などの濾過工程の前に、追加のライゲーション工程の前に、および／またはペプチド延長部の切断の前に、前駆体を含むがこれらに限定されない中間生成物に対して使用することができる。ここでの延長部という用語は、例えば前駆体の場合にあり得るような、所望のペプチドのＮ末端から延長する少なくとも１つのアミノ酸を指す。こうしたペプチドＲ２は、以下の構造を有してもよい。
【0026】
（延長部）－（所望のペプチド）
こうした実施形態では、組み合わせられた延長部と所望のペプチドとは、本開示の光化学的プロセス中にペプチドＲ２の一部を形成し、延長部は、後続の工程でペプチドＲ２から切断されることを意味し得る。
こうした実施形態では、組み合わせられた延長部と所望のペプチドとは、本開示の光化学的プロセス中にペプチドＲ２の一部を形成し、延長部は、後続の工程でペプチドＲ２から切断されることを意味し得る。
【0027】
生物学的に活性なペプチドの合成の早い段階で光化学的アミド化プロセスを進めることは有利であると考えられ得る。本明細書に記載の光化学方法による大規模なＣ末端アミド化は、最終活性医薬成分に辿り着くために必要なプロセス工程の完了を必要とするかなり前に行うことができ、合成のプロセスにおいて使用された材料および／または投資された労働力の観点から、よりコストがかかり得る下流中間生成物の損失を最小化することができる。
【0028】
本光化学的アミド化反応は、例示的な実施形態の開示から明らかになるさらなる問題も解決し得る。
【0029】
以下において、ギリシャ文字は、それらの記号または対応する記述名称によって表されてもよく、例えば、αはアルファであり、βはベータであり、εはイプシロンであり、γはガンマであり、ωはオメガであるといった具合である。また、μのギリシャ文字は「ｕ」によって表されてもよく、例えば、μＬはｕＬであるか、またはμＭはｕＭである。
【0030】
一般的な反応工程
工程（ａ）－Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る
光化学的アミド化反応の第１の工程（工程（ａ））は、Ｃ末端システイン残基（式Ｉとも呼ばれる）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識（Ｒ１）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩとも呼ばれる）を得ることと呼ばれてもよい。
工程（ａ）－Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得る
光化学的アミド化反応の第１の工程（工程（ａ））は、Ｃ末端システイン残基（式Ｉとも呼ばれる）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識（Ｒ１）とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩとも呼ばれる）を得ることと呼ばれてもよい。
【0031】
Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）
式Ｉは、ポリペプチド部分（Ｒ２）およびＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含むペプチドまたはタンパク質である。ポリペプチド部分Ｒ２はまた、タンパク質またはペプチドとも呼ばれる場合がある。式Ｉの化合物は、Ｃ末端システイン（Ｃｙｓ）アミド化タグを有するペプチドと呼ばれてもよい。式Ｉの化合物はまた、ポリペプチド、またはＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含むポリペプチドとも呼ばれる場合がある。Ｃ末端システイン残基は、対応するペプチドまたはタンパク質のＣ末端で置換されたアミノ酸システインの残基であってもよい。
式Ｉは、ポリペプチド部分（Ｒ２）およびＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含むペプチドまたはタンパク質である。ポリペプチド部分Ｒ２はまた、タンパク質またはペプチドとも呼ばれる場合がある。式Ｉの化合物は、Ｃ末端システイン（Ｃｙｓ）アミド化タグを有するペプチドと呼ばれてもよい。式Ｉの化合物はまた、ポリペプチド、またはＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含むポリペプチドとも呼ばれる場合がある。Ｃ末端システイン残基は、対応するペプチドまたはタンパク質のＣ末端で置換されたアミノ酸システインの残基であってもよい。
【0032】
Ｒ２に言及するとき、これは、Ｃ末端システインアミド化タグを含まず、最終的に本方法による式ＩＶに従ってＣ末端アミドが提供されることになる、式Ｉのペプチドまたはタンパク質のポリペプチド部分として理解される。
【0033】
本明細書に開示の光化学反応は、最後から二番目のアミノ酸が異なるペプチドに対して試験されている（実施例３、表４、エントリー１～２０）。この目的で、最後から二番目のアミノ酸が異なる配列ＩＷＴＫＤＨＥＥＶＹＥＸ（配列番号１）を有する例示的なペプチドＲ２（配列番号１のＲ２がスキーム１の式Ｉの一部を形成するとき、Ｃ末端はシステインアミド化タグである）を提供した。一実施形態では、ＸはＡｌａである。一実施形態では、ＸはＡｓｐである。一実施形態では、ＸはＧｌｕである。一実施形態では、ＸはＰｈｅである。一実施形態では、ＸはＧｌｙである。一実施形態では、ＸはＨｉｓである。一実施形態では、ＸはＩｌｅである。一実施形態では、ＸはＬｙｓである。一実施形態では、ＸはＬｅｕである。一実施形態では、ＸはＭｅｔである。一実施形態では、ＸはＡｓｎである。一実施形態では、ＸはＰｒｏである。一実施形態では、ＸはＧｌｎである。一実施形態では、ＸはＡｒｇである。一実施形態では、ＸはＳｅｒである。一実施形態では、ＸはＴｈｒである。一実施形態では、ＸはＶａｌである。一実施形態では、ＸはＴｒｐである。一実施形態では、ＸはＴｙｒである。例えば、ＩＷＴＫＤＨＥＥＶＹＥＸ（配列番号１）のＸがアラニン（Ａｌａ）である場合、得られるペプチドＲ２は、ＩＷＴＫＤＨＥＥＶＹＥＡ（配列番号２）であり、本出願の光化学的アミド化反応を受けた後にアミドと同じアミノ酸配列を有するペプチドを形成する。
【0034】
光化学的アミド化反応は、生物学的に活性なペプチドの異なる中間体（実施例５、表５、エントリー１～１２に示されるとおり）、より具体的には、所与の生物学的に活性なペプチドのアミド化された前駆体を調製するためにさらに使用されている。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号３～１４および１６～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、および１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号３、４、５、１６、および１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号３、４、５、１６、および１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【0035】
いくつかの実施形態では、本光化学的アミド化反応を使用して、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、プラムリンチド（Ｓｙｍｌｉｎ（商標）中の活性医薬成分）などのアミリン受容体作動薬またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、チルゼパチドなどのＧＩＰおよびＧＬＰ－１受容体共作動薬またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチドなどのコルチコトロピン放出因子（ＣＦＲ）ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドなどのパンクレアスタチン（ＰＳＴ）阻害剤またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、コシントロピン（Ｃｏｒｔｒｏｓｙｎ（商標）の活性医薬成分）などの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ＱＲＦ－アミドペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ＥＰ４５などのＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ブレビルチド（Ｈｅｐｃｌｕｄｅｘ（商標）の活性医薬成分）などの侵入阻害剤またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、オステオクリン（ＯＳＴＮ）などのナトリウム利尿ペプチドまたはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、エンフビルチドなどの抗レトロウイルス薬剤またはその前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬またはその前駆体、例えば、配列番号１６または１７によって表されるものを調製してもよい。
【0036】
本光化学的アミド化反応を使用して、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、プラムリンチド（Ｓｙｍｌｉｎ（商標）の活性医薬成分）などのアミリン受容体作動薬、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチド、チルゼパチドなどのＧＬＰ－１受容体共作動薬、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチドなどのコルチコトロピン放出因子（ＣＦＲ）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドなどのパンクレアスタチン（ＰＳＴ）阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピン（Ｃｏｒｔｒｏｓｙｎ（商標）の活性医薬成分）などの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＥＰ４５などのＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬、ブレビルチド（Ｈｅｐｃｌｕｄｅｘ（商標）の活性医薬成分）などの侵入阻害剤、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドなどのナトリウム利尿ペプチド、エンフビルチドなどの抗レトロウイルス薬剤、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むものなどのＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはその前駆体を調製してもよい。
【0037】
本光化学的アミド化反応を使用して、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、プラムリンチド（Ｓｙｍｌｉｎ（商標）の活性医薬成分）などのアミリン受容体作動薬、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドなどのパンクレアスタチン（ＰＳＴ）阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬および拮抗薬、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピン（Ｃｏｒｔｒｏｓｙｎ（商標）の活性医薬成分）などの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＥＰ４５などのＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬、ブレビルチド（Ｈｅｐｃｌｕｄｅｘ（商標）の活性医薬成分）などの侵入阻害剤、オステオクリン、エンフビルチドなどの抗レトロウイルス薬剤、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を含むものなどのＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはその前駆体を調製してもよい。
【0038】
本光化学的アミド化反応を使用して、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤（ＰＳＴ）、例えば、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、例えば、配列番号１６のアミノ酸配列を含むもの、またはその前駆体を調製してもよい。
【0039】
本光化学的アミド化反応を使用して、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、およびＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、例えば、配列番号１６のアミノ酸配列を含むもの、またはその前駆体を調製してもよい。
【0040】
本明細書に開示のＧＬＰ－１ペプチドの調製には、天然のヒトＧＬＰ－１（７－３６）－アミド（例えば、開始ペプチドＲ２は、ＧＬＰ－１（７－３６）、配列番号３であってもよい）およびその類似体（ＧＬＰ－１類似体））が含まれる。本光化学的アミド化反応を使用して、ＧＬＰ－１（７－３６）－アミドを調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬を調製してもよい。本明細書に開示のＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む共作動薬の調製を含む。
【0041】
本光化学的アミド化反応のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬またはアミリン受容体作動薬などの生物活性ペプチド生成物の前駆体に対応する配列を含んでもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、配列番号１６に示されるアミノ酸配列から成るＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬前駆体を調製してもよい。本光化学的アミド化反応を使用して、配列番号１７に示されるアミノ酸配列から成るＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬前駆体を調製してもよい。
【0042】
本光化学的アミド化反応のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｎ末端延長部を有するペプチドであってもよい。延長部は、アミノ酸のいずれの組み合わせであってもよい。延長部は、１～６０アミノ酸であってもよい。延長部は、１～５０アミノ酸であってもよい。延長部は、１～４０アミノ酸であってもよい。延長部は、１～２０アミノ酸であってもよい。延長部は、１～１５アミノ酸であってもよい。延長部は、５～１５アミノ酸であってもよい。延長部は、１４アミノ酸であってもよい。
【0043】
いくつかの実施形態では、光化学的アミド化反応を使用して、Ｎ末端延長部を有するＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬前駆体を調製してもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、任意のタイプのＮ末端延長部とを有するペプチドであってもよい。Ｒ２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する任意のタイプのＮ末端延長部を有するペプチドであってもよい。Ｒ２は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＮ末端延長部とを有するペプチドであってもよい。Ｒ２は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【0044】
光化学的アミド化反応のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、配列番号３～１４、１６～１７のいずれか１つのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでもよい。Ｒ２は、配列番号３～１４、１６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、Ｎ末端延長部とを含んでもよい。Ｒ２は、配列番号３～１４、１６～１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列であってもよい。Ｒ２は、配列番号３～１４、１６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、Ｎ末端延長部と、であってもよい。
【0045】
光化学的アミド化反応のいくつかの実施形態では、Ｃ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質は、光標識剤（Ｒ１－Ｘ）と反応してもよい。別の実施形態では、式Ｉの化合物は、光標識（Ｒ１）にカップリングされてもよい。
【0046】
光標識剤（Ｒ１－Ｘ）
光標識剤（本明細書ではＲ１－Ｘとしても特定される）は、光励起性部分を含み、ペプチドにカップリングすることができる化合物として定義されてもよい。光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、光化学反応を受けることができる化合物として定義されてもよい。
光標識剤（本明細書ではＲ１－Ｘとしても特定される）は、光励起性部分を含み、ペプチドにカップリングすることができる化合物として定義されてもよい。光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、光化学反応を受けることができる化合物として定義されてもよい。
【0047】
光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、Ｒ１として本明細書で定義される光標識、およびＸとして本明細書で定義される脱離基を含む。本明細書では、光標識（Ｒ１）は、本明細書に記載の条件下でペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）と反応させることによって、Ｃ末端システイン（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質にカップリングされてもよい。
【0048】
光化学的アミド化反応の一実施形態では、光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、２－ブロモ－１，４－ナフトキノン、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、および４－フルオロ－７－スルファモイルベンゾフラザンから成る群から選択されてもよい。
【0049】
３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンはまた、２－ブロモマレイミドとも呼ばれる場合があり、化学式１として定義されてもよい。
【0050】
化学式１：
４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンはまた、ＮＢＤ－Ｃｌとも呼ばれる場合があり、化学式２として定義されてもよい。
【化3】
【0051】
化学式２：
いくつかの実施形態では、光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）または４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）であってもよい。光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）であってもよい。光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）であってもよい。
【化4】
【0052】
いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して１～５当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して１～３当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して１．５～２．５当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して１．８～２．２当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して約２当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が提供されてもよい。
【0053】
Ｃ末端システイン残基を含むペプチドまたはタンパク質の光標識剤との反応条件
本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応は、ビス－トリスメタン（ビス－トリスと呼ばれてもよい）、トリス、トリエタノールアミン、およびホスフェートから成る群から選択される水性緩衝液などの水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ４～９の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ４～９の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～８の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～８のビス－トリスメタンを含む水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～７の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６．３～７の水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３～７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４の水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４の約２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３の２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。
本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応は、ビス－トリスメタン（ビス－トリスと呼ばれてもよい）、トリス、トリエタノールアミン、およびホスフェートから成る群から選択される水性緩衝液などの水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ４～９の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ４～９の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～８の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～８のビス－トリスメタンを含む水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～７の水性緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６～７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、ｐＨ６．３～７の水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３～７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４の水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ７のビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．４の約２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約ｐＨ６．３の２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。
【0054】
本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、グリシンを有する水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約５０ｍＭのグリシンを有する水性反応緩衝液中で行われてもよい。
【0055】
別の実施形態では、本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約５０ｍＭのグリシンを有する約ｐＨ６．４の約２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約５０ｍＭのグリシンを有する約ｐＨ６．３の約２５ｍＭのビス－トリスメタンを含む水性反応緩衝液中で行われてもよい。
【0056】
いくつかの実施形態では、本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、本明細書では１５～２５℃と定義される室温で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、４～８０℃の温度で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、１０～６０℃の温度で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、１０～４０℃の温度で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、１０～３０℃の温度で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、１５～３０℃の温度で行われてもよい。本光化学的アミド化反応の工程（ａ）は、約２０℃の温度で行われてもよい。
【0057】
界面活性剤は、光化学的変換の前に反応緩衝液に加えられてもよい（以下の工程（ｂ）で説明する）。この界面活性剤は、光標識中間体の溶解度を改善するために使用されてもよい。例えば、ジスルフィド含有ペプチドとの反応に関して以下で考察するように、界面活性剤は、ＮＢＤ－Ｃｌ光標識剤を使用してペプチド（Ｒ２）内の全てのシステインを全体的にアルキル化する場合、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｃｌ、化学式２）アルキル化中間体の溶解度を改善し得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デスオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２８３１４、８５１１１、８５１１２）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２８３２０、８５１１３、８５１１５）、水酸化テトラプロピルアンモニウム（ＴＡＰＨ－４０）、およびオクタン酸ナトリウムから成る群から選択される界面活性剤を、反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、デスオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）を反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、オクタン酸ナトリウムを反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２８３１４、８５１１１、８５１１２）を反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２８３２０、８５１１３、８５１１５）を反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、水酸化テトラプロピルアンモニウム（ＴＡＰＨ－４０）を反応緩衝液に加えてもよい。
【0059】
界面活性剤は、４０～８０ｍＭの濃度で反応緩衝液に加えてもよい。界面活性剤は、５０～７０ｍＭの濃度で反応緩衝液に加えてもよい。界面活性剤は、５５～６５ｍＭの濃度で反応緩衝液に加えてもよい。界面活性剤は、約６０ｍＭの濃度で反応緩衝液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、界面活性剤を反応緩衝液に加えない場合がある。
【0060】
工程（ｂ）－得られたペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を光化学的に変換して、Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る
反応の第２の工程（工程（ｂ））は、コンジュゲート（式ＩＩとも呼ばれる）のＣ末端エナミド（式ＩＩＩとも呼ばれる）への光化学的変換と呼ばれてもよい。工程（ｂ）はまた、Ｃ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの変換とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、ペプチド－光標識コンジュゲートは、コンジュゲートと呼ばれてもよい。
反応の第２の工程（工程（ｂ））は、コンジュゲート（式ＩＩとも呼ばれる）のＣ末端エナミド（式ＩＩＩとも呼ばれる）への光化学的変換と呼ばれてもよい。工程（ｂ）はまた、Ｃ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの変換とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、ペプチド－光標識コンジュゲートは、コンジュゲートと呼ばれてもよい。
【0061】
工程（ｂ）の光化学的変換は、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを光に供することによって得られてもよい。別様に述べると、工程（ｂ）の光化学的変換は、ペプチド－光標識コンジュゲートを照射することによって得られてもよい。式ＩＩのコンジュゲート上に照らされた光は、光標識によって吸収され、本明細書では概して光化学的変換と呼ばれ得る光によって促進される化学反応をもたらし、最終的に式ＩＩＩのＣ末端エナミドを形成し得る。工程（ｂ）の光化学的変換は、Ｃ末端のラジカル脱炭酸による光分解切断と呼ばれてもよい。式ＩＩＩのエナミドは、一置換であると言うことができる。
【0062】
この光化学的変換の有効波長は、ａ部においてＣ末端システイン残基（式Ｉ）にカップリングされた光標識Ｒ１に基づいて変化し得ることが理解される。さらに、光化学的反応を起こすのに望ましい光スペクトルを生成するために、様々な光源を使用できることが理解される。光源は、蛍光ランプ、発光ダイオード、水銀ランプ、レーザーなどから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、光源は、日光によって提供される光などの周囲光であってもよい。いくつかの実施形態では、光源は、電球型蛍光ランプ（ＣＦＬ）であってもよい。光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。ＬＥＤは、単色ＬＥＤであってもよい。いくつかの実施形態では、式ＩＩのコンジュゲートを均一に光に照射するために、２つ以上の光源を使用してもよい。光源は、２つ以上のＣＬＦであってもよい。光源は、２つ以上のＬＥＤであってもよい。光源は、コンジュゲートを照射するように均一に配設された一連のＬＥＤであってもよい。光源は、ＬＥＤのアレイであってもよく、これは、一列に配設された場合、ＬＥＤのストリップと呼ばれ得る。
【0063】
提供される光は、白色光であってもよい。提供される光の波長は、可視光スペクトル内であってもよい。提供される光の波長は、３００～７００ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、３６５～５５０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、３６５～５００ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、３６５～４５０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、約３６５ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４００～５００ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４００～４７０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４００～４５０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４０５～４３０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、３６５ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４０５ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４３０ｎｍであってもよい。提供される光の波長は、４５０ｎｍであってもよい。光源は、３６５ｎｍの波長を有する光を提供するＬＥＤであってもよい。光源は、白色光を提供するＣＦＬであってもよい。光源は、４０５ｎｍの波長を有する光を提供するＬＥＤであってもよい。光源は、４３０ｎｍの波長を有する光を提供するＬＥＤであってもよい。光源は、４５０ｎｍの波長を有する光を提供するＬＥＤであってもよい。光源は、３６５ｎｍの波長を有する光を提供する単色ＬＥＤのアレイであってもよい。光源は、４０５ｎｍの波長を有する光を提供する単色ＬＥＤのアレイであってもよい。光源は、４３０ｎｍの波長を有する光を提供する単色ＬＥＤのアレイであってもよい。光源は、４５０ｎｍの波長を有する光を提供する単色ＬＥＤのアレイであってもよい。
【0064】
当然のことながら、単一の波長が本明細書で言及されるとき、当該波長を概して中心とするスペクトル幅を有する光のスペクトルに対する言及がなされる。例えば、光源によって提供される光が４０５ｎｍの波長である場合、これは、４０５ｎｍの波長の光に厳密に限定されるものとして解釈されるべきではなく、４０５ｎｍの波長を包含する所与の幅を有するスペクトルに向けられることが理解される。４０５ｎｍの波長を有する光の場合、および例えば５０ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）については、コンジュゲートを照射する有効波長は、３８０～４３０ｎｍに延びることが理解される。
【0065】
光源は、光源の一部を形成するとみなされ得る、高域フィルター、低域フィルター、および／またはバンドギャップフィルターなどのスペクトルフィルターと組み合わされてもよく、コンジュゲートを照射するスペクトル範囲をさらに制限してもよい。
【0066】
いくつかの実施形態では、光のスペクトル幅は、５０ｎｍのＦＷＨＭを有してもよい。光のスペクトル幅は、４０ｎｍのＦＷＨＭを有してもよい。光のスペクトル幅は、３０ｎｍのＦＷＨＭを有してもよい。光のスペクトル幅は、２０ｎｍのＦＷＨＭを有してもよい。光のスペクトル幅は、１０ｎｍのＦＷＨＭを有してもよい。
【0067】
ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を光化学的に変換してＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得るための反応条件は、上記工程（ａ）でＣ末端システイン残基（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を光標識剤（Ｒ１－Ｘ）とカップリングしてペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ）を得るために提供される条件に対応してもよい。例えば、工程（ｂ）は、工程（ａ）と同じ水性反応緩衝液中で行われてもよい。同様に、工程（ｂ）は、工程（ａ）の温度に対応する温度で行われてもよい。
【0068】
工程（ｃ）－Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る
反応の三番目であり最後の工程（工程（ｃ））は、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶとも呼ばれる）を得るための得られたＣ末端エナミド（式ＩＩＩとも呼ばれる）の切断と呼ばれてもよい。いくつかの実施形態では、切断は、Ｃ末端エナミドの変換と呼ばれてもよい。Ｃ末端エナミドは、エナミドと呼ばれてもよい。Ｃ末端α－アミドは、Ｃ末端アミドと呼ばれてもよい。
反応の三番目であり最後の工程（工程（ｃ））は、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶとも呼ばれる）を得るための得られたＣ末端エナミド（式ＩＩＩとも呼ばれる）の切断と呼ばれてもよい。いくつかの実施形態では、切断は、Ｃ末端エナミドの変換と呼ばれてもよい。Ｃ末端エナミドは、エナミドと呼ばれてもよい。Ｃ末端α－アミドは、Ｃ末端アミドと呼ばれてもよい。
【0069】
エナミドのＣ末端α－アミドへの切断は、異なる切断方法を使用して行われてもよい。切断は、酸分解を使用して行われてもよい。いくつかの実施形態では、切断は、強酸として分類され得る酸を用いた酸分解を使用して行われてもよく、ここで、強酸は、ｐＫａが４以下の酸として定義される。いくつかの実施形態では、切断試薬は、ｐＫａが４以下であってもよい。いくつかの実施形態では、切断試薬は、ｐＫａが３以下であってもよい。いくつかの実施形態では、切断は、弱酸（すなわち、ｐＫａが４超の酸）を用いた酸分解を使用して、酸分解を加速させるためにルイス酸を加えて行われてもよい。
【0070】
切断は、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）を使用して行われてもよい。いくつかの実施形態では、エナミドは、酸媒介性加水分解によって切断されてもよい。エナミドは水素化されてもよい。エナミドは、酸触媒性加水分解、酸化剤媒介性加水分解によって、または逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断されてもよい。エナミドは、酸触媒性加水分解によって、または酸化剤媒介性加水分解によって切断されてもよい。エナミドは、酸触媒性加水分解によって切断されてもよい。エナミドは、酸化剤媒介性加水分解によって切断されてもよい。エナミドは、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断されてもよい。
【0071】
いくつかの実施形態では、ビニルアミドが、Ｎ－エチルアミドに還元されてもよい。いくつかの実施形態では、ビニルアミドは、チオール－エン反応などのコンジュゲーションに使用され得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、添加剤が工程に加えられてもよい。添加剤は、メチオニン、インドール、またはカフェイン酸から成る群から選択されてもよいが、これらに限定されない。
【0073】
エナミド切断の反応条件
上で示したように、異なる切断方法は、異なる切断試薬および温度などの異なる反応条件を必要とし得る。いくつかの実施形態では、切断試薬は、式ＩＩＩの中間体との反応に加えられる。
上で示したように、異なる切断方法は、異なる切断試薬および温度などの異なる反応条件を必要とし得る。いくつかの実施形態では、切断試薬は、式ＩＩＩの中間体との反応に加えられる。
【0074】
反応条件のいくつかの変数は、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）全体を通して一定に保たれ得ることが理解される。例えば、いくつかの実施形態では、光化学的アミド化反応は、一定の温度で行われる。他の実施形態では、温度は、工程（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の間で変化してもよい。他の実施形態では、工程（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）での光化学的反応の条件は、互いに異なってもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、切断試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、３，６－ジフェニル－１，２，４，５－テトラジン、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択されてもよい。切断試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択されてもよい。切断試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択されてもよい。切断試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であってもよい。切断試薬は、塩酸（ＨＣｌ）であってもよい。切断試薬は、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）であってもよい。切断試薬は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。切断試薬は、トシル酸（ＴｓＯＨ）であってもよい。切断試薬は、６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸であってもよい。
【0076】
いくつかの実施形態では、切断試薬は、２～８％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であってもよい。切断試薬は、４～６％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であってもよい。切断試薬は、５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であってもよい。
【0077】
いくつかの実施形態では、切断試薬は、０．５～２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。切断試薬は、０．５～１．５Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。切断試薬は、０．７～１．３Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。切断試薬は、０．８～１．２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。切断試薬は、約１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）であってもよい。
【0078】
いくつかの実施形態では、エナミド切断は、０～８０℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、２０～６０℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、２０～４０℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、３０～４０℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、３７℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、２０～２６℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、２０～２３℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、約２０℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、約２３℃の温度で実施されてもよい。エナミド切断は、室温で実施されてもよく、室温は、周囲温度とも呼ばれる場合がある。
【0079】
反応条件は、反応が行われる手順に応じて変化し得る。
【0080】
バッチ手順
本明細書に記載の光化学的アミド化反応は、バッチ手順で実施されてもよい。バッチ手順は、バッチスケール反応とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、光化学的アミド化プロセスは、同じ反応容器内で実施されてもよく、これは「シングルポット」反応と呼ばれてもよい。当然のことながら、反応は単一の反応容器内で起こり得るが、それにおける反応条件が一定に保たれるべきであると述べていると解釈されるべきではない。例えば、本明細書に記載の光化学的アミド化反応の工程（ａ）および（ｂ）は、反応容器中、室温で起こってもよい一方で、工程（ｃ）について、温度は、例えば約３７℃に調整されてもよく、それにもかかわらず、同じ反応容器内で起こってもよい。
本明細書に記載の光化学的アミド化反応は、バッチ手順で実施されてもよい。バッチ手順は、バッチスケール反応とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、光化学的アミド化プロセスは、同じ反応容器内で実施されてもよく、これは「シングルポット」反応と呼ばれてもよい。当然のことながら、反応は単一の反応容器内で起こり得るが、それにおける反応条件が一定に保たれるべきであると述べていると解釈されるべきではない。例えば、本明細書に記載の光化学的アミド化反応の工程（ａ）および（ｂ）は、反応容器中、室温で起こってもよい一方で、工程（ｃ）について、温度は、例えば約３７℃に調整されてもよく、それにもかかわらず、同じ反応容器内で起こってもよい。
【0081】
他の実施形態では、工程（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）は、異なる反応容器中で実施されてもよい。反応条件は、上記のように、光標識剤（Ｒ１－Ｘ）および使用される切断試薬に応じて変化し得る。
【0082】
フォトフロー手順
光化学的アミド化反応は、フォトフロー手順で実施されてもよく、この手順では、溶液が、光源によって照射されている間に回路を通してポンプ注入される。反応は、これらの条件を提供する流通式反応器中で実施されてもよい。流通式反応器は、フォトフロー反応器、光化学反応器、またはより一般的には反応器と呼ばれてもよい。
光化学的アミド化反応は、フォトフロー手順で実施されてもよく、この手順では、溶液が、光源によって照射されている間に回路を通してポンプ注入される。反応は、これらの条件を提供する流通式反応器中で実施されてもよい。流通式反応器は、フォトフロー反応器、光化学反応器、またはより一般的には反応器と呼ばれてもよい。
【0083】
いくつかの実施形態では、流通式反応器中で実施される反応は、フォトフロープロセスまたは反応とも呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、流通式反応器中で実施される反応は、フォトフロー手順とも呼ばれる場合がある。
【0084】
流通式反応器は、１０～１００℃の温度で動作してもよい。流通式反応器は、２０～６０℃の温度で動作してもよい。流通式反応器は、２０～４０℃の温度で動作してもよい。流通式反応器は、２０～３０℃の温度で動作してもよい。流通式反応器は、２５～３０℃の温度で動作してもよい。流通式反応器は、約２６℃の温度で動作してもよい。
【0085】
光化学的アミド化反応は、異なる流量で実施されてもよい。ここでの流量は、時間単位当たりのシステムを通過する流体の体積として定義され得る体積流量を指す。
【0086】
流量は、０．２００～５０．００ｍＬ／分であってもよい。流量は、１．００～２５．００ｍＬ／分であってもよい。流量は、５．００～１０．００ｍＬ／分であってもよい。流量は、６．００～９．００ｍＬ／分であってもよい。流量は、約８．００ｍＬ／分であってもよい。流量は約１０ｍＬ／分であってもよい。流量は約２０ｍＬ／分であってもよい。
【0087】
流通式反応器体積は、１～１０ｍＬであってもよい。流通式反応器体積は、２～５ｍＬであってもよい。流通式反応器体積は、約２ｍＬであってもよい。流通式反応器体積は、約２．７ｍＬであってもよい。ここでの流通式反応器体積は、流通式反応器の光源による任意の所与の時間での照射に供され得る体積とみなされてもよい。
【0088】
反応はまた、異なる滞留時間を使用して行われてもよい。ここでの滞留時間は、流体が流通式反応器中にどのくらい長く留まるかの尺度として定義され得る。別様に述べると、これは、溶液が流通式反応器に入り、流通式反応器体積の一部を形成し、流通式反応器によって照射されることができるようになった瞬間と、溶液が流通式反応器を出て、流通式反応器体積の一部を形成しなくなり、それ以上流通式反応器によって照射されなくなる瞬間との間の時間の測定値である。これはまた、流通式反応器体積と全体流量との比によって与えられてもよい。
【0089】
流通式反応器中の滞留時間は、０．０４～５０分であってもよい。流通式反応器中の滞留時間は、０．１～１０分であってもよい。流通式反応器中の滞留時間は、０．１～１分であってもよい。流通式反応器中の滞留時間は、０．１～０．５分であってもよい。流通式反応器中の滞留時間は、約０．２５分であってもよい。
【0090】
流通式反応器は、Ｖａｐｏｕｒｔｅｃ ＵＶ－１５０光化学反応器であってもよい。流通式反応器は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｌａｂ Ｐｈｏｔｏ Ｒｅａｃｔｏｒであってもよい。当然のことながら、工程（ｂ）に記載されるように、光化学的変換の目的で循環溶液の照射を可能にする任意の同等の光化学反応器が、本開示から逸脱することなく使用されてもよい。
【0091】
いくつかの実施形態では、流通式反応器光源は、３００ｎｍ～７００ｎｍの波長で照射してもよい。流通式反応器光源は、３６５～５２５ｎｍの波長で照射する一連のＬＥＤであってもよい。流通式反応器光源は、４００～４５０ｎｍの波長で照射する一連の単色ＬＥＤであってもよい。流通式反応器光源は、４３０ｎｍの波長で照射する一連の単色ＬＥＤであってもよい。流通式反応器光源は、３９０～４２０ｎｍの波長で照射する一連の単色ＬＥＤであってもよい。流通式反応器光源は、４０５ｎｍの波長で照射する一連の単色ＬＥＤであってもよい。
【0092】
いくつかの実施形態では、流通式反応器光源は、３～１５０ワットの放射力で照射してもよい。流通式反応器光源は、５～１００ワットの放射力で照射してもよい。流通式反応器光源は、１０～８０ワットの放射力で照射してもよい。反応器光源は、９～２４ワットの放射力で照射してもよい。
【0093】
バッチ－フォトフローハイブリッド手順
光化学的アミド化反応は、バッチ－フォトフローハイブリッド手順で実施されてもよく、この手順では、光化学的アミド化反応の一部のみが、フォトフロー手順を介して完了され得る。別様に述べると、いくつかの実施形態では、反応の工程の一部のみが流通式反応器中で生じ、残りの工程は、例えば反応容器中の、バッチ手順で生じてもよい。光化学的アミド化反応の単一の工程のみまたは一部の工程のみがフォトフロー反応器中で生じる場合、反応は、概して、ハイブリッド手順で完了すると言及され得る。
光化学的アミド化反応は、バッチ－フォトフローハイブリッド手順で実施されてもよく、この手順では、光化学的アミド化反応の一部のみが、フォトフロー手順を介して完了され得る。別様に述べると、いくつかの実施形態では、反応の工程の一部のみが流通式反応器中で生じ、残りの工程は、例えば反応容器中の、バッチ手順で生じてもよい。光化学的アミド化反応の単一の工程のみまたは一部の工程のみがフォトフロー反応器中で生じる場合、反応は、概して、ハイブリッド手順で完了すると言及され得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、反応のＣ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの光化学的変換は、流通式反応器中で実施されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ末端システイン残基を含むペプチドを光標識とカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲートを得ること、および反応のＣ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの光化学的変換を、流通式反応器中で実施してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの光化学的変換、および反応のＣ末端α－アミドを得るためのＣ末端エナミドの切断を、流通式反応器中で実施してもよい。いくつかの実施形態では、反応のＣ末端エナミドを得るためのペプチド－光標識コンジュゲートの光化学的変換のみを、流通式反応器中で実施してもよい。いくつかの実施形態では、流通式反応器中で実施されない光化学的アミド化反応工程は、バッチ手順を介して実施されてもよい。いくつかの実施形態では、流通式反応器中で実施されない光化学的アミド化反応工程は、反応器中のバッチ手順を介して実施されてもよい。
【0095】
ジスルフィド結合含有ペプチドの光化学的反応
本出願の光化学的アミド化反応は、中にシステイン残基を含有するペプチドＲ２を用いて行われてもよい。言い換えれば、スキーム１または２の式Ｉは、光化学的アミド化反応のためのＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基に加えて、少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むペプチドを含有する。ペプチドＲ２内のシステインは、ジスルフィド結合を形成し得る。
本出願の光化学的アミド化反応は、中にシステイン残基を含有するペプチドＲ２を用いて行われてもよい。言い換えれば、スキーム１または２の式Ｉは、光化学的アミド化反応のためのＣ末端システイン（Ｃｙｓ）残基に加えて、少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むペプチドを含有する。ペプチドＲ２内のシステインは、ジスルフィド結合を形成し得る。
【0096】
こうした実施形態では、光化学的アミド化プロセスは、概して上記したように進行し、同時に以下のものにさらに供されてもよい。
【0097】
光標識剤の全体的なカップリング
光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、上の工程（ａ）に記載したように、Ｃ末端システイン残基、およびペプチドＲ２に存在する追加のシステイン残基にカップリングされてもよい。これは、システインの全体的なカップリングと呼ばれてもよい。光標識Ｒ１とカップリングされたペプチドＲ２の一部を形成するシステインは、概して、光標識で保護されたシステインと呼ばれてもよい。
光標識剤（Ｒ１－Ｘ）は、上の工程（ａ）に記載したように、Ｃ末端システイン残基、およびペプチドＲ２に存在する追加のシステイン残基にカップリングされてもよい。これは、システインの全体的なカップリングと呼ばれてもよい。光標識Ｒ１とカップリングされたペプチドＲ２の一部を形成するシステインは、概して、光標識で保護されたシステインと呼ばれてもよい。
【0098】
光標識剤は、光標識剤とカップリングされるシステインの量に比例する様式で加えられてもよい。光標識剤の当量は、アミド化ペプチド内に形成されるジスルフィド結合の数に比例して増加してもよい。
【0099】
いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して０．５～３追加当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、ペプチド（Ｒ２）中に形成される各ジスルフィド結合について提供されてもよい。ペプチド（式Ｉ）に対して１～２．５追加当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、ペプチド（Ｒ２）中に形成される各ジスルフィド結合について提供されてもよい。ペプチド（式Ｉ）に対して１．５～２．５追加当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、ペプチド（Ｒ２）中に形成される各ジスルフィド結合について提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して約２追加当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、ペプチド（Ｒ２）中に形成される各ジスルフィド結合について提供されてもよい。本明細書における追加という用語は、ペプチドＲ２が形成されるジスルフィド結合を有しない場合、工程（ａ）の一般的反応で提供され得る光標識剤当量に合算される光標識剤当量を指す。
【0100】
いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して３～５合計当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、工程ａのために提供されてもよい。ペプチド（式Ｉ）に対して３．５～４．５合計当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、工程ａのために提供されてもよい。ペプチド（式Ｉ）に対して３．８～４．２合計当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、工程ａのために提供されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（式Ｉ）に対して約４合計当量の光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、工程ａのために提供されてもよい。合計という用語は、光化学的アミド化反応の工程（ａ）の間に反応において提供される、光標識当量の得られた量を指す。
【0101】
いくつかの実施形態では、ペプチドに対して約４合計当量の４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｃｌ）が、工程ａのために提供されてもよい。
【0102】
選択的Ｃ末端光化学的変換
ペプチド－光標識コンジュゲートは、工程ｂで概して開示される様式で照射されてもよい。コンジュゲートのＣ末端に見られる光標識は、Ｃ末端エナミドを得るように、光化学的変換を経てもよく、一方、残りのシステインカップリングされた光標識は、影響を受けないままであってもよい。
ペプチド－光標識コンジュゲートは、工程ｂで概して開示される様式で照射されてもよい。コンジュゲートのＣ末端に見られる光標識は、Ｃ末端エナミドを得るように、光化学的変換を経てもよく、一方、残りのシステインカップリングされた光標識は、影響を受けないままであってもよい。
【0103】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の光化学的変換工程（ｂ）は、ペプチド－光標識コンジュゲートのＣ末端に対して選択的であると言うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の光化学的変換工程（ｂ）は、光標識とカップリングされたペプチドのＣ末端システインに対して選択的であると言うことができる。
【0104】
放出および酸化
Ｃ末端エナミドを切断してＣ末端α－アミドを得ることは、工程（ｃ）に記載のように行ってもよい。
Ｃ末端エナミドを切断してＣ末端α－アミドを得ることは、工程（ｃ）に記載のように行ってもよい。
【0105】
さらに、ペプチドＲ２の光標識で保護されたシステインにおける光標識の放出を行ってもよい。ペプチドＲ２中の光標識で保護されたシステインの放出は、工程（ｃ）でＣ末端エナミドを切断してＣ末端α－アミドを得る前に行ってもよい。ペプチドＲ２中の光標識で保護されたシステインの放出は、工程（ｃ）でＣ末端エナミドを切断してＣ末端α－アミドを得るのと同時に行ってもよい。
【0106】
求核性硫化物を提供して、光標識で保護されたペプチドシステインから光標識を放出させてもよい。いくつかの実施形態では、システアミン、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）、２－メルカプトエタノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびアセチルシステインから成る群から選択される求核性硫化物が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、システアミンは、求核性硫化物として提供されてもよい。
【0107】
いくつかの実施形態では、酸化パートナーをさらに提供して、ジスルフィド酸化をもたらしてもよい。シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）およびシスチンから成る群から選択される酸化パートナーが提供されてもよい。いくつかの実施形態では、シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）が、酸化パートナーとして提供されてもよい。
【0108】
総合的な反応
本発明の第１の態様では、上記の定義に従い、スキーム１に従って式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインを含むペプチドまたはタンパク質を、光標識（Ｒ１）とカップリングして、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）：得られた式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを光化学的に変換して、式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．得られた式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、
を含む方法が提供されてもよい。
本発明の第１の態様では、上記の定義に従い、スキーム１に従って式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
【化5】
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインを含むペプチドまたはタンパク質を、光標識（Ｒ１）とカップリングして、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）：得られた式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを光化学的に変換して、式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．得られた式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、
を含む方法が提供されてもよい。
【0109】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、水素およびエチルから成る群から選択されてもよい。別の実施形態では、Ｒ３は、水素であってもよい。
【0110】
同様に、または代替として、本発明の第２の態様では、スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）とカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）：得られた式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを光化学的に変換して、式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．得られた式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、
を含む方法が提供されてもよい。
【化6】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）とカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）：得られた式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを光化学的に変換して、式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．得られた式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、
を含む方法が提供されてもよい。
【0111】
さらに別の態様では、スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端αアミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を、４００～４５０ｎｍの波長を有する光で照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法。
【化7】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．Ｃ末端システインアミド化タグ（式Ｉ）を含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を得る工程と、
工程（ｂ）．ペプチド－光標識コンジュゲート（式ＩＩ－ａ）を、４００～４５０ｎｍの波長を有する光で照射して、光化学的変換によりＣ末端エナミド（式ＩＩＩ）を得る工程と、
工程（ｃ）．Ｃ末端エナミド（式ＩＩＩ）を切断して、Ｃ末端α－アミド（式ＩＶ）を得る工程と、を含む、方法。
【0112】
精製および特性評価
Ｃ末端α－アミドの精製は、バッチ手順で実施されてもよい。精製は、連続析出によって実施されてもよい。
Ｃ末端α－アミドの精製は、バッチ手順で実施されてもよい。精製は、連続析出によって実施されてもよい。
【0113】
反応は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によってモニターされてもよい。
【0114】
Ｃ末端α－アミドの精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施されてもよい。Ｃ末端α－アミドの精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して実施されてもよい。Ｃ末端α－アミドの精製は、限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施されてもよい。
【0115】
反応試料は、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析によって分析されてもよい。いくつかの実施形態では、反応試料は、抽出イオンクロマトグラフィーを使用して分析されてもよい。いくつかの実施形態では、反応は、ＬＣ－ＭＳによってモニターされてもよい。
【0116】
別段の指示がない限り、本明細書において単数形で示される用語は、複数の場合も含む。
【0117】
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、それ故に「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小限の要素以外の異なる構造的要素を有してもよい。
【0118】
本明細書にはまた、化合物および方法が記載されており、これにおいて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような非限定的な用語と、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」およびこれに類するものなどの限定的な用語とが使用され得る。
【0119】
複数形が化合物、出発材料、中間体、塩およびこれに類するものに使用される場合、１つ（好ましい）またはそれ以上の単一の化合物、塩、中間体などを意味することを意図し、単数形または不定冠詞（「ａ」、「ａｎ」）が使用される場合、これは、複数形を排除することを意図せず、「１つ」を意味することが好ましいに過ぎない。
【0120】
特定の実施形態
１．スキーム１に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、光標識（Ｒ１）とカップリングして、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを照射して、光化学的変換を介して式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、を含む、方法。
２．Ｒ３が、水素およびエチルから成る群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３．Ｒ３が、水素である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４．Ｒ２が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５．Ｒ２が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から成る、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６．Ｒ２が、配列番号３～１４および１６～１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７．Ｒ２が、配列番号３、４、５、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８．Ｒ２が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９．Ｒ２が、Ｎ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０．Ｒ２が、１～６０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１．Ｒ２が、１～５０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．Ｒ２が、１～４０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１３．Ｒ２が、１～２０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．Ｒ２が、１～１５アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５．Ｒ２が、５～１５アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６．Ｒ２が、１４アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７．Ｒ２が、配列番号１８に従うＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８．Ｒ２が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１９．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドの調製に使用される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２０．方法が、アミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２１．アミリン受容体作動薬が、プラムリンチドである、実施形態２０に記載の方法。
２２．方法が、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２３．方法が、ＧＩＰおよびＧＬＰ－１受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２４．ＧＩＰおよびＧＬＰ－１受容体共作動薬が、チルゼパチドである、実施形態２３に記載の方法。
２５．方法が、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２６．方法が、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２７．方法が、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２８．方法が、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２９．方法が、ガストリン放出ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３０．方法が、コシントロピンの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３１．方法が、ＱＲＦ－アミドペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３２．方法が、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３３．ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬が、ＥＰ４５である、実施形態３２に記載の方法。
３４．方法が、ブレビルチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３５．方法が、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３６．方法が、エンフビルチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３７．方法が、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３８．方法が、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用され、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１８および３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬が、配列番号１６によって表される、実施形態１～１８および３７～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、プラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチド、チルゼパチドなどのＧＬＰ－１受容体共作動薬、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピンなどの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＥＰ４５などのＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬、ブレビルチドなどの侵入阻害剤、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドなどのナトリウム利尿ペプチド、エンフビルチドなどの抗レトロウイルス薬剤、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬などのＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
４１．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピン、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬ＥＰ４５、ブレビルチド、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチド、エンフビルチド、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはプラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはプラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．方法が、プラムリンチドの調製に使用される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４４．方法が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４２のいずれか１つに記載の方法。
４５．方法が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む前駆体ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４２のいずれか１つに記載の方法。
４６．光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、２－ブロモ－１，４－ナフトキノン、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、および４－フルオロ－７－スルファモイルベンゾフラザンから成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４７．光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）または４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：
化学式１：
である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
化学式２：
から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４８．光標識剤が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）：
化学式１：
である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４９．光標識剤が、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：
化学式２：
である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５０．方法が、水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５１．方法の工程（ａ）が、水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５２．方法の工程（ａ）が、水性反応緩衝液中で行われ、水性緩衝液が、ビス－トリスメタン、トリス、トリエタノールアミン、およびホスフェートから成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５３．方法の工程（ａ）が、ビス－トリスメタンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５４．方法の工程（ａ）が、約２５ｍＭのビス－トリスメタンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５５．方法の工程（ａ）が、トリスの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５６．方法の工程（ａ）が、トリエタノールアミンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５７．方法の工程（ａ）が、ホスフェートの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５８．方法の工程（ａ）が、ｐＨ４～９の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５９．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６～８の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６０．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６～７の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６１．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６．３～７の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６２．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６．３～６．４の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６３．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ６．４の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６４．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ６．３の水性反応緩衝液中で行われる、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
６５．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ７の水性反応緩衝液中で行われる、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
６６．方法の工程（ａ）が、グリシンを有する水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６７．方法の工程のうちの工程（ａ）が、約５０ｍＭのグリシンを有する水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６８．工程（ａ）のペプチドに対して１～５当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６９．工程（ａ）のペプチドに対して１～３当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７０．工程（ａ）のペプチドに対して１．５～２．５当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７１．工程（ａ）のペプチドに対して１．８～２．２当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７２．工程（ａ）のペプチドに対して２当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７３．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、電球型蛍光ランプ（ＣＦＬ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７４．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、少なくとも１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７５．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７６．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、単色ＬＥＤである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７７．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、白色光を提供する波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７８．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３００～７００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７９．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～５５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８０．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～５００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８１．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８２．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８３．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、４００～５００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８４．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、４００～４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８５．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４０５ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８６．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４３０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８７．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８８．エナミドが、酸媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８９．エナミドが、水素化される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９０．エナミドが、酸触媒性加水分解、酸化剤媒介性加水分解によって、または逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９１．エナミドが、酸触媒性加水分解によって、または酸化剤媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９２．エナミドが、酸触媒性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９３．エナミドが、酸化剤媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９４．エナミドが、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９５．エナミドを切断するための切断試薬を加える工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９６．エナミドを切断するための切断試薬を加える工程をさらに含み、切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９７．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９８．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９９．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１００．切断試薬が、２～８％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０１．切断試薬が、４～６％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０２．切断試薬が、５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０３．切断試薬が、塩酸（ＨＣｌ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０４．切断試薬が、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０５．切断試薬が、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０６．切断試薬が、０．５～２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０７．切断試薬が、０．５～１．５Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０８．切断試薬が、０．７～１．３Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０９．切断試薬が、０．８～１．２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１０．切断試薬が、約１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１１．切断試薬が、トシル酸（ＴｓＯＨ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１２．切断試薬が、６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１３．方法の少なくとも一部が、バッチ手順で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１４．エナミド切断が、摂氏０～８０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１５．エナミド切断が、摂氏２０～６０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１６．エナミド切断が、摂氏２０～４０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１７．エナミド切断が、摂氏２０～２６度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１８．エナミド切断が、摂氏２０～２３度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１９．エナミド切断が、摂氏２０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２０．エナミド切断が、摂氏２３度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２１．エナミド切断が、室温で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２２．エナミド切断が、摂氏３０～４０度の温度で実施される、実施形態１～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１２３．エナミド切断が、摂氏約３７度の温度で実施される、実施形態１～１１６および１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．方法の少なくとも一部が、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２５．照射工程が、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２６．照射工程のみが、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２７．流通式反応器の温度が、摂氏２０～６０度である、実施形態１２４～１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．流通式反応器の温度が、摂氏２０～４０度である、実施形態１２４～１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．流通式反応器の温度が、摂氏２０～３０度である、実施形態１２４～１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．流通式反応器の温度が、摂氏２５～３０度である、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．流通式反応器の温度が、摂氏約２６度である、実施形態１２４～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．流通式反応器の流量が、０．２００～５０．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．流通式反応器の流量が、１．００～２５．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．流通式反応器の流量が、５．００～１０．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３５．流通式反応器の流量が、６．００～９．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．流通式反応器の流量が、約８．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３７．流通式反応器の反応器体積が、１～１０ｍＬである、実施形態１２４～１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．流通式反応器の反応器体積が、２～５ｍＬである、実施形態１２４～１３７のいずれか１つに記載の方法。
１３９．流通式反応器の反応器体積が、１～３ｍＬである、実施形態１２４～１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．流通式反応器の反応器体積が、約２ｍＬである、実施形態１２４～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．流通式反応器の反応器体積が、約２．７ｍＬである、実施形態１２４～１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．流通式反応器中の滞留時間が、０．０４～５０分である、実施形態１２４～１４１のいずれか１つに記載の方法。
１４３．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～１０分である、実施形態１２４～１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～１分である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～０．５分である、実施形態１２４～１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．流通式反応器中の滞留時間が、約０．２５分である、実施形態１２４～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．流通式反応器が、Ｖａｐｏｕｒｔｅｃ ＵＶ－１５０光化学反応器である、実施形態１２４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．流通式反応器が、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｌａｂ Ｐｈｏｔｏ Ｒｅａｃｔｏｒである、実施形態１２４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４９．光源が、３～１５０ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１４８のいずれか１つに記載の方法。
１５０．光源が、５～１００ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．光源が、１０～８０ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１５０のいずれか１つに記載の方法。
１５２．光源が、９～２４ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１５１のいずれか１つに記載の方法。
１５３．反応が、単一の反応容器中で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５４．界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５５．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デスオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、水酸化テトラプロピルアンモニウム（ＴＡＰＨ－４０）、およびオクタン酸ナトリウムから成る群から選択される界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５６．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５７．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤が３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５８．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤がオクタン酸ナトリウムである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５９．４０～８０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６０．５０～７０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６１．５５～６５ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６２．約６０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６３．工程（ｂ）の前に、ペプチドＲ２のシステインを光標識Ｒ１とカップリングして、光標識で保護されたシステインを形成する工程と、
工程（ｂ）の後に、光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出する工程と、をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６４．求核性硫化物および酸化パートナーが提供される、実施形態１６３に記載の方法。
１６５．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６４のいずれか１つに記載の方法。
１６６．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含み、求核性硫化物が、システアミン、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）、２－メルカプトエタノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびアセチルシステインから成る群から選択される、実施形態１６３～１６５のいずれか１つに記載の方法。
１６７．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含み、求核性硫化物がシステアミンである、実施形態１６３～１６６のいずれか１つに記載の方法。
１６８．光標識で保護されたシステインを放出した後に、ジスルフィド結合をペプチドＲ２中で形成することをさらに含む、実施形態１６３～１６７のいずれか１つに記載の方法。
１６９．酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６８のいずれか１つに記載の方法。
１７０．シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）およびシステインから成る群から選択される酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６９のいずれか１つに記載の方法。
１７１．シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）およびシステインから成る群から選択される酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７２．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して０．５～３追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７１のいずれか１つに記載の方法。
１７３．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して１～２．５追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７２のいずれか１つに記載の方法。
１７４．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して１．５～２．５追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７３のいずれか１つに記載の方法。
１７５．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して約２追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７４のいずれか１つに記載の方法。
１７６．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、バッチ手順で、または連続析出によって実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７７．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７８．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７９．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８０．スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端αアミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、ポリペプチドであり、
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを照射して、光化学的変換を介して式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．前記式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
１８１．スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
（式中、Ｒ２は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを、４００～４５０ｎｍの波長を有する光で照射して、光化学的変換により式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．前記式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
１８２．実施形態１～１８１のいずれかに記載の医薬組成物を生成する方法。
１８３．医薬組成物を生成する方法であって、
ａ．実施形態１～１８１のいずれかに従い、式ＩＶの化合物を生成する工程と、
ｂ．該医薬組成物を、ａで得られた式ＩＶの化合物を使用して調製する工程と、を含む、方法。
１．スキーム１に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
【化8】
Ｒ１－Ｘは、光標識剤であり、Ｒ１は、光標識であり、Ｘは、脱離基であり、
Ｒ３は、水素、メチル、およびエチルから成る群から選択される）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、光標識（Ｒ１）とカップリングして、式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩのペプチド－光標識コンジュゲートを照射して、光化学的変換を介して式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、式ＩＶのＣ末端αアミドを得る工程と、を含む、方法。
２．Ｒ３が、水素およびエチルから成る群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３．Ｒ３が、水素である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４．Ｒ２が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５．Ｒ２が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列から成る、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６．Ｒ２が、配列番号３～１４および１６～１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７．Ｒ２が、配列番号３、４、５、１６、１７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８．Ｒ２が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９．Ｒ２が、Ｎ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０．Ｒ２が、１～６０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１．Ｒ２が、１～５０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．Ｒ２が、１～４０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１３．Ｒ２が、１～２０アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．Ｒ２が、１～１５アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５．Ｒ２が、５～１５アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６．Ｒ２が、１４アミノ酸を有するＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７．Ｒ２が、配列番号１８に従うＮ末端延長部をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８．Ｒ２が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１９．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチドの調製に使用される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２０．方法が、アミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２１．アミリン受容体作動薬が、プラムリンチドである、実施形態２０に記載の方法。
２２．方法が、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２３．方法が、ＧＩＰおよびＧＬＰ－１受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２４．ＧＩＰおよびＧＬＰ－１受容体共作動薬が、チルゼパチドである、実施形態２３に記載の方法。
２５．方法が、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２６．方法が、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２７．方法が、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２８．方法が、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２９．方法が、ガストリン放出ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３０．方法が、コシントロピンの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３１．方法が、ＱＲＦ－アミドペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３２．方法が、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３３．ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬が、ＥＰ４５である、実施形態３２に記載の方法。
３４．方法が、ブレビルチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３５．方法が、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３６．方法が、エンフビルチドの調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３７．方法が、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
３８．方法が、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用され、ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１８および３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬が、配列番号１６によって表される、実施形態１～１８および３７～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、プラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチド、チルゼパチドなどのＧＬＰ－１受容体共作動薬、ウロコルチン－２（ＵＣＮ２）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピンなどの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＥＰ４５などのＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬、ブレビルチドなどの侵入阻害剤、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチドなどのナトリウム利尿ペプチド、エンフビルチドなどの抗レトロウイルス薬剤、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬などのＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
４１．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）ペプチド、コシントロピン、ＱＲＦ－アミドペプチド、ＧＬＰ－１受容体－神経ペプチドＹ受容体２共作動薬ＥＰ４５、ブレビルチド、オステオクリン（ＯＳＴＮ）ペプチド、エンフビルチド、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはプラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．方法が、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）ペプチド、膵ｐＹＹ（３－３６）ペプチド、パンクレアスタチン阻害剤ペプチド－８（ＰＳＴｉ８）ペプチド、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬、またはプラムリンチドなどのアミリン受容体作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．方法が、プラムリンチドの調製に使用される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４４．方法が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４２のいずれか１つに記載の方法。
４５．方法が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む前駆体ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬の調製に使用される、実施形態１～１８および４０～４２のいずれか１つに記載の方法。
４６．光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、２－ブロモ－１，４－ナフトキノン、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、および４－フルオロ－７－スルファモイルベンゾフラザンから成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４７．光標識剤（Ｒ１－Ｘ）が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）または４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：
化学式１：
【化9】
化学式２：
【化10】
４８．光標識剤が、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）：
化学式１：
【化11】
４９．光標識剤が、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）：
化学式２：
【化12】
５０．方法が、水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５１．方法の工程（ａ）が、水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５２．方法の工程（ａ）が、水性反応緩衝液中で行われ、水性緩衝液が、ビス－トリスメタン、トリス、トリエタノールアミン、およびホスフェートから成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５３．方法の工程（ａ）が、ビス－トリスメタンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５４．方法の工程（ａ）が、約２５ｍＭのビス－トリスメタンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５５．方法の工程（ａ）が、トリスの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５６．方法の工程（ａ）が、トリエタノールアミンの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５７．方法の工程（ａ）が、ホスフェートの水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５８．方法の工程（ａ）が、ｐＨ４～９の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５９．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６～８の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６０．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６～７の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６１．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６．３～７の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６２．方法の工程（ａ）が、ｐＨ６．３～６．４の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６３．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ６．４の水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６４．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ６．３の水性反応緩衝液中で行われる、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
６５．方法の工程（ａ）が、約ｐＨ７の水性反応緩衝液中で行われる、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
６６．方法の工程（ａ）が、グリシンを有する水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６７．方法の工程のうちの工程（ａ）が、約５０ｍＭのグリシンを有する水性反応緩衝液中で行われる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６８．工程（ａ）のペプチドに対して１～５当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６９．工程（ａ）のペプチドに対して１～３当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７０．工程（ａ）のペプチドに対して１．５～２．５当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７１．工程（ａ）のペプチドに対して１．８～２．２当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７２．工程（ａ）のペプチドに対して２当量の光標識が提供される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７３．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、電球型蛍光ランプ（ＣＦＬ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７４．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、少なくとも１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７５．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７６．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、単色ＬＥＤである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７７．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、白色光を提供する波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７８．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３００～７００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７９．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～５５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８０．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～５００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８１．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５～４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８２．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、３６５ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８３．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、４００～５００ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８４．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、４００～４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８５．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４０５ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８６．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４３０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８７．ペプチド－光標識コンジュゲートを照射するための光源が、約４５０ｎｍの波長を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８８．エナミドが、酸媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８９．エナミドが、水素化される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９０．エナミドが、酸触媒性加水分解、酸化剤媒介性加水分解によって、または逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９１．エナミドが、酸触媒性加水分解によって、または酸化剤媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９２．エナミドが、酸触媒性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９３．エナミドが、酸化剤媒介性加水分解によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９４．エナミドが、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によって切断される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９５．エナミドを切断するための切断試薬を加える工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９６．エナミドを切断するための切断試薬を加える工程をさらに含み、切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９７．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、シュウ酸、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９８．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、トシル酸（ＴｓＯＨ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、および６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸から成る群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９９．切断試薬が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１００．切断試薬が、２～８％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０１．切断試薬が、４～６％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０２．切断試薬が、５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０３．切断試薬が、塩酸（ＨＣｌ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０４．切断試薬が、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０５．切断試薬が、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０６．切断試薬が、０．５～２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０７．切断試薬が、０．５～１．５Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０８．切断試薬が、０．７～１．３Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１０９．切断試薬が、０．８～１．２Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１０．切断試薬が、約１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１１．切断試薬が、トシル酸（ＴｓＯＨ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１２．切断試薬が、６，６’－（１，２，４，５－テトラジン－３，６－ジイル）ジニコチン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１３．方法の少なくとも一部が、バッチ手順で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１４．エナミド切断が、摂氏０～８０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１５．エナミド切断が、摂氏２０～６０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１６．エナミド切断が、摂氏２０～４０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１７．エナミド切断が、摂氏２０～２６度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１８．エナミド切断が、摂氏２０～２３度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１９．エナミド切断が、摂氏２０度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２０．エナミド切断が、摂氏２３度の温度で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２１．エナミド切断が、室温で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２２．エナミド切断が、摂氏３０～４０度の温度で実施される、実施形態１～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１２３．エナミド切断が、摂氏約３７度の温度で実施される、実施形態１～１１６および１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．方法の少なくとも一部が、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２５．照射工程が、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２６．照射工程のみが、流通式反応器で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２７．流通式反応器の温度が、摂氏２０～６０度である、実施形態１２４～１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．流通式反応器の温度が、摂氏２０～４０度である、実施形態１２４～１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．流通式反応器の温度が、摂氏２０～３０度である、実施形態１２４～１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．流通式反応器の温度が、摂氏２５～３０度である、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．流通式反応器の温度が、摂氏約２６度である、実施形態１２４～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．流通式反応器の流量が、０．２００～５０．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．流通式反応器の流量が、１．００～２５．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．流通式反応器の流量が、５．００～１０．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３５．流通式反応器の流量が、６．００～９．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．流通式反応器の流量が、約８．００ｍＬ／分である、実施形態１２４～１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３７．流通式反応器の反応器体積が、１～１０ｍＬである、実施形態１２４～１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．流通式反応器の反応器体積が、２～５ｍＬである、実施形態１２４～１３７のいずれか１つに記載の方法。
１３９．流通式反応器の反応器体積が、１～３ｍＬである、実施形態１２４～１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．流通式反応器の反応器体積が、約２ｍＬである、実施形態１２４～１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．流通式反応器の反応器体積が、約２．７ｍＬである、実施形態１２４～１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．流通式反応器中の滞留時間が、０．０４～５０分である、実施形態１２４～１４１のいずれか１つに記載の方法。
１４３．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～１０分である、実施形態１２４～１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～１分である、実施形態１２４～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．流通式反応器中の滞留時間が、０．１～０．５分である、実施形態１２４～１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．流通式反応器中の滞留時間が、約０．２５分である、実施形態１２４～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．流通式反応器が、Ｖａｐｏｕｒｔｅｃ ＵＶ－１５０光化学反応器である、実施形態１２４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．流通式反応器が、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｌａｂ Ｐｈｏｔｏ Ｒｅａｃｔｏｒである、実施形態１２４～１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４９．光源が、３～１５０ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１４８のいずれか１つに記載の方法。
１５０．光源が、５～１００ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．光源が、１０～８０ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１５０のいずれか１つに記載の方法。
１５２．光源が、９～２４ワットの放射力で照射する、実施形態１２４～１５１のいずれか１つに記載の方法。
１５３．反応が、単一の反応容器中で実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５４．界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５５．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デスオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、水酸化テトラプロピルアンモニウム（ＴＡＰＨ－４０）、およびオクタン酸ナトリウムから成る群から選択される界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５６．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５７．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤が３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５８．界面活性剤を加えることをさらに含み、界面活性剤がオクタン酸ナトリウムである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１５９．４０～８０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６０．５０～７０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６１．５５～６５ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６２．約６０ｍＭの界面活性剤を加えることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６３．工程（ｂ）の前に、ペプチドＲ２のシステインを光標識Ｒ１とカップリングして、光標識で保護されたシステインを形成する工程と、
工程（ｂ）の後に、光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出する工程と、をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１６４．求核性硫化物および酸化パートナーが提供される、実施形態１６３に記載の方法。
１６５．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６４のいずれか１つに記載の方法。
１６６．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含み、求核性硫化物が、システアミン、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）、２－メルカプトエタノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびアセチルシステインから成る群から選択される、実施形態１６３～１６５のいずれか１つに記載の方法。
１６７．光標識で保護されたシステインをペプチドＲ２から放出するために、求核性硫化物を加えることをさらに含み、求核性硫化物がシステアミンである、実施形態１６３～１６６のいずれか１つに記載の方法。
１６８．光標識で保護されたシステインを放出した後に、ジスルフィド結合をペプチドＲ２中で形成することをさらに含む、実施形態１６３～１６７のいずれか１つに記載の方法。
１６９．酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６８のいずれか１つに記載の方法。
１７０．シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）およびシステインから成る群から選択される酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１６９のいずれか１つに記載の方法。
１７１．シスタミングルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）およびシステインから成る群から選択される酸化パートナーを加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７０のいずれか１つに記載の方法。
１７２．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して０．５～３追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７１のいずれか１つに記載の方法。
１７３．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して１～２．５追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７２のいずれか１つに記載の方法。
１７４．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して１．５～２．５追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７３のいずれか１つに記載の方法。
１７５．形成される各ジスルフィド結合について、工程（ａ）でペプチドに対して約２追加当量の光標識を加えることをさらに含む、実施形態１６３～１７４のいずれか１つに記載の方法。
１７６．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、バッチ手順で、または連続析出によって実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７７．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７８．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７９．Ｃ末端α－アミドを精製する工程をさらに含み、Ｃ末端α－アミドの精製が、限外濾過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を介して実施される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８０．スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端αアミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
【化13】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを照射して、光化学的変換を介して式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．前記式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
１８１．スキーム２に従って、式ＩＶのＣ末端α－アミドを含むペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、
【化14】
Ｒ３は、水素である）
工程（ａ）．式ＩのＣ末端システインアミド化タグを含むペプチドまたはタンパク質を、４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザンとカップリングして、式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを得る工程と、
工程（ｂ）．式ＩＩ－ａのペプチド－光標識コンジュゲートを、４００～４５０ｎｍの波長を有する光で照射して、光化学的変換により式ＩＩＩのＣ末端エナミドを得る工程と、
工程（ｃ）．前記式ＩＩＩのＣ末端エナミドを切断して、前記式ＩＶのＣ末端α－アミドを得る工程と、を含む、方法。
１８２．実施形態１～１８１のいずれかに記載の医薬組成物を生成する方法。
１８３．医薬組成物を生成する方法であって、
ａ．実施形態１～１８１のいずれかに従い、式ＩＶの化合物を生成する工程と、
ｂ．該医薬組成物を、ａで得られた式ＩＶの化合物を使用して調製する工程と、を含む、方法。
【0121】
方法および実施例
略語リスト
Ａｑ．、ａｑ． 水性
Ａｃ アセチル
ＣＦＬ 電球型蛍光ランプ
ＣＬＮＤ 化学発光窒素検出
ＤＩＣ ジイソプロピル－カルボジイミド
ＤＯＤＴ ３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＩＣ 抽出イオンクロマトグラム
Ｅｔ エチル
Ｅｑ． 当量
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル保護基
ｈ 時間
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＣｌ 塩酸
ｉ－Ｐｒ イソプロピル
ＩＥＤＤＡ 逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＥＤ 発光ダイオード
Ｍｅ メチル
Ｍｉｎ 分
ＭＷＣＯ 分子量カットオフ
ＮＢＤ－Ｃｌ ４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン
ＮＨＳ Ｎ－ヒドロキシスクシミド
ＮＭＰ Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＲＰ－ＨＰＬＣ逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ 固相ペプチド合成
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー
ＵＰＬＣ－ＭＳ超高速液体クロマトグラフィー質量分析
実施例において、化合物１などの化合物の番号は、単に系列的に明確にするための（Ｉ）または（ＩＩ）などの本明細書および特許請求の範囲の化合物を表す番号とは異なることに留意されたい。
略語リスト
Ａｑ．、ａｑ． 水性
Ａｃ アセチル
ＣＦＬ 電球型蛍光ランプ
ＣＬＮＤ 化学発光窒素検出
ＤＩＣ ジイソプロピル－カルボジイミド
ＤＯＤＴ ３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＩＣ 抽出イオンクロマトグラム
Ｅｔ エチル
Ｅｑ． 当量
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル保護基
ｈ 時間
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＣｌ 塩酸
ｉ－Ｐｒ イソプロピル
ＩＥＤＤＡ 逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＥＤ 発光ダイオード
Ｍｅ メチル
Ｍｉｎ 分
ＭＷＣＯ 分子量カットオフ
ＮＢＤ－Ｃｌ ４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン
ＮＨＳ Ｎ－ヒドロキシスクシミド
ＮＭＰ Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＲＰ－ＨＰＬＣ逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ 固相ペプチド合成
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシラン
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー
ＵＰＬＣ－ＭＳ超高速液体クロマトグラフィー質量分析
実施例において、化合物１などの化合物の番号は、単に系列的に明確にするための（Ｉ）または（ＩＩ）などの本明細書および特許請求の範囲の化合物を表す番号とは異なることに留意されたい。
【0122】
一般的な調製方法
α－アミド化ペプチドの合成を、スクリーニングスケール手順、バッチ手順、または連続フォトフロープロセスのいずれかを介して、３つの異なる方法で実施した。
α－アミド化ペプチドの合成を、スクリーニングスケール手順、バッチ手順、または連続フォトフロープロセスのいずれかを介して、３つの異なる方法で実施した。
【0123】
試薬
全ての試薬および溶媒を商業的に購入し、供給時のまま使用した。直交保護されたＦｍｏｃ－アミノ酸を、予め計量されたカートリッジとしてＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、ＳＰＰＳ樹脂は、ＮｏｖａＢｉｏＣｈｅｍから購入した。
全ての試薬および溶媒を商業的に購入し、供給時のまま使用した。直交保護されたＦｍｏｃ－アミノ酸を、予め計量されたカートリッジとしてＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、ＳＰＰＳ樹脂は、ＮｏｖａＢｉｏＣｈｅｍから購入した。
【0124】
自動ＳＰＰＳの一般的な方法
自動ＳＰＰＳを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｘペプチド合成器（Ｇｙｒｏｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で行った。ペプチドを、予め充填されたＦｍｏｃ－アミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（約０．３４ｍｍｏｌ／ｇ充填）上で、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して合成した。ＤＭＦ中の５当量のＦｍｏｃアミノ酸、１０当量のジイソプロピル－カルボジイミド（ＤＩＣ）、５当量の２，４，６－コリジン、および５当量のシアノヒドロキシ－イミノ酢酸エチル（オキシマ）を使用して、カップリングを行った。カップリング反応は、混合のためにＮ２をバブリングしながら室温で１．５～４時間進行させた。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ脱保護を実施した。
自動ＳＰＰＳを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｘペプチド合成器（Ｇｙｒｏｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で行った。ペプチドを、予め充填されたＦｍｏｃ－アミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（約０．３４ｍｍｏｌ／ｇ充填）上で、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して合成した。ＤＭＦ中の５当量のＦｍｏｃアミノ酸、１０当量のジイソプロピル－カルボジイミド（ＤＩＣ）、５当量の２，４，６－コリジン、および５当量のシアノヒドロキシ－イミノ酢酸エチル（オキシマ）を使用して、カップリングを行った。カップリング反応は、混合のためにＮ２をバブリングしながら室温で１．５～４時間進行させた。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ脱保護を実施した。
【0125】
切断の一般的な方法
ペプチド切断を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／水／チオアニソール／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）の９０／２．５／２．５／２．５／２．５溶液中で行った。溶出した切断溶液を氷冷したジエチルエーテル中で析出させた。遠心分離を使用してペプチド析出物をペレット化し、ペレットを追加の氷冷したエーテルで洗浄した。
ペプチド切断を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／水／チオアニソール／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）の９０／２．５／２．５／２．５／２．５溶液中で行った。溶出した切断溶液を氷冷したジエチルエーテル中で析出させた。遠心分離を使用してペプチド析出物をペレット化し、ペレットを追加の氷冷したエーテルで洗浄した。
【0126】
精製および定量のための一般的な方法
洗浄したペプチドペレットを、１：１のアセトニトリル／水または純粋なＤＭＳＯのいずれかに再溶解させた後、０．２μｍフィルターを通して濾過した。得られた溶液を、分取ＲＰ－ＨＰＬＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ １５０ ＬＣシステムまたはＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ａｕｔｏｓｃａｌｅのいずれかに充填した。分取ＬＣ／ＭＳＤシステム。両方のシステムに、２０ｍＬ／分の流量のＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１９×２５０ｍｍ、５μｍ）を装備した〔緩衝液Ａ：０．１％のＴＦＡを含む８９．９％の水／１０％のアセトニトリル、緩衝液Ｂ：０．１％のＴＦＡを含む８９．９％のアセトニトリル／１０％の水〕。ペプチドを、適切な溶媒勾配を使用して分解させた。純粋な画分をプールし、純度／同一性についてはＵＰＬＣ／ＬＣＭＳによって、ペプチド含有量については化学発光窒素検出（ＣＬＮＤ）によって評価し、凍結乾燥粉末にした。
洗浄したペプチドペレットを、１：１のアセトニトリル／水または純粋なＤＭＳＯのいずれかに再溶解させた後、０．２μｍフィルターを通して濾過した。得られた溶液を、分取ＲＰ－ＨＰＬＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ １５０ ＬＣシステムまたはＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ａｕｔｏｓｃａｌｅのいずれかに充填した。分取ＬＣ／ＭＳＤシステム。両方のシステムに、２０ｍＬ／分の流量のＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１９×２５０ｍｍ、５μｍ）を装備した〔緩衝液Ａ：０．１％のＴＦＡを含む８９．９％の水／１０％のアセトニトリル、緩衝液Ｂ：０．１％のＴＦＡを含む８９．９％のアセトニトリル／１０％の水〕。ペプチドを、適切な溶媒勾配を使用して分解させた。純粋な画分をプールし、純度／同一性についてはＵＰＬＣ／ＬＣＭＳによって、ペプチド含有量については化学発光窒素検出（ＣＬＮＤ）によって評価し、凍結乾燥粉末にした。
【0127】
検出および特性評価の一般的な方法
分析用ＵＰＬＣを、０．４ｍＬ／分の流量のＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）を装備したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで行った〔緩衝液Ａ：０．０５％のＴＦＡを含む９９．９５％の水、緩衝液Ｂ：０．０５％のＴＦＡを含む９９．９５％のアセトニトリル、勾配：９５／５ Ａ：Ｂで０．５分間保持し、１６分かけて９５／５ Ａ：Ｂから５／９５ Ａ：Ｂに勾配、続いて洗浄および再平衡化〕。ＵＶ吸光度を２１４ｎｍで測定した。ＬＣＭＳおよびＨＲＭＳ分析のために、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏＦ質量分光計をＥＳＩ＋モードで使用して、ＭＳ検出を得た。
分析用ＵＰＬＣを、０．４ｍＬ／分の流量のＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）を装備したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで行った〔緩衝液Ａ：０．０５％のＴＦＡを含む９９．９５％の水、緩衝液Ｂ：０．０５％のＴＦＡを含む９９．９５％のアセトニトリル、勾配：９５／５ Ａ：Ｂで０．５分間保持し、１６分かけて９５／５ Ａ：Ｂから５／９５ Ａ：Ｂに勾配、続いて洗浄および再平衡化〕。ＵＶ吸光度を２１４ｎｍで測定した。ＬＣＭＳおよびＨＲＭＳ分析のために、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏＦ質量分光計をＥＳＩ＋モードで使用して、ＭＳ検出を得た。
【0128】
Ｃ末端α－アミド化の一般的反応プロトコル
本発明で実施される反応は、概して、以下に示すスキーム１に従う。
上記の式における可変置換基の意味は、スキーム（１）と同じである。
本発明で実施される反応は、概して、以下に示すスキーム１に従う。
【化15】
【0129】
本発明のα－アミド化反応は、３つの異なるプロトコルである、スクリーニングスケール、バッチスケール、およびフロー手順に従って行った。これらについては、以下でさらに詳細に説明する。
【0130】
スクリーニングスケール反応の一般的プロトコル：
反応を、まず、スキーム１に従ってスクリーニングスケールで行った。個々の工程（（ａ）、（ｂ）、および（ｃ））の手順を以下でさらに詳細に説明する。
反応を、まず、スキーム１に従ってスクリーニングスケールで行った。個々の工程（（ａ）、（ｂ）、および（ｃ））の手順を以下でさらに詳細に説明する。
【0131】
工程（ａ）－Ｃ末端システイン残基を含むペプチドまたはタンパク質の光標識とのカップリング
非特異的酸化を最小限に抑えるために、５０ｍＭのグリシンを有する２５ｍＭのビス－トリスメタンｐＨ６．４を含有する水性反応緩衝液を、窒素ガスで１５分間バブリングすることによって脱気した。Ｃ末端Ｃｙｓ修飾ペプチドを反応緩衝液中に溶解させて、１ｍＭストック溶液を生成した。２５μＬの１ｍＭストックを、６５μＬの追加のアッセイ緩衝液とともに、９６ウェルＶ底アッセイプレートのウェルに加えた。２－ブロモマレイミド（３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、ＣＡＳ：９８０２６－７９－０）またはＮＢＤ塩化物（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のいずれかをアセトニトリルに溶解させて、５ｍＭストック溶液を得た。１０μＬの５ｍＭ光コンジュゲート試薬をウェルに加え（５００μＭの最終濃度、２当量）、振盪しながら室温で１時間インキュベートさせた。所望の場合、ＬＣ－ＭＳによって変換をモニターしてもよい。
非特異的酸化を最小限に抑えるために、５０ｍＭのグリシンを有する２５ｍＭのビス－トリスメタンｐＨ６．４を含有する水性反応緩衝液を、窒素ガスで１５分間バブリングすることによって脱気した。Ｃ末端Ｃｙｓ修飾ペプチドを反応緩衝液中に溶解させて、１ｍＭストック溶液を生成した。２５μＬの１ｍＭストックを、６５μＬの追加のアッセイ緩衝液とともに、９６ウェルＶ底アッセイプレートのウェルに加えた。２－ブロモマレイミド（３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、ＣＡＳ：９８０２６－７９－０）またはＮＢＤ塩化物（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のいずれかをアセトニトリルに溶解させて、５ｍＭストック溶液を得た。１０μＬの５ｍＭ光コンジュゲート試薬をウェルに加え（５００μＭの最終濃度、２当量）、振盪しながら室温で１時間インキュベートさせた。所望の場合、ＬＣ－ＭＳによって変換をモニターしてもよい。
【0132】
工程（ｂ）－得られたペプチド－光標識コンジュゲートを光化学的に変換して、Ｃ末端エナミドを得る：
１時間後、プレートを、Ｃ末端エナミドを生成するために利用した光アリール基に従って照射した。２－ブロモマレイミドについては、３６５ｎｍのＬＥＤの１．５メートルのストリップを照射源として用い、変換を４時間進行させた。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＮＢＤ塩化物については、手持ち式の白色ＣＦＬランプまたは４５０ｎｍのＬＥＤのストリップを用いて照射を行ってもよい。変換を１時間室温で進行させた。所望の場合、ＬＣ－ＭＳによって変換をモニターしてもよい。
１時間後、プレートを、Ｃ末端エナミドを生成するために利用した光アリール基に従って照射した。２－ブロモマレイミドについては、３６５ｎｍのＬＥＤの１．５メートルのストリップを照射源として用い、変換を４時間進行させた。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＮＢＤ塩化物については、手持ち式の白色ＣＦＬランプまたは４５０ｎｍのＬＥＤのストリップを用いて照射を行ってもよい。変換を１時間室温で進行させた。所望の場合、ＬＣ－ＭＳによって変換をモニターしてもよい。
【0133】
工程（ｃ）－得られたＣ末端エナミドを切断して、Ｃ末端α－アミドを得る：
エナミドからＣ末端α－アミド生成物への酸分解：
様々な強酸を使用して、エナミドの酸分解を進行させた（表２）。概して、酸を１０倍の水性ストック溶液からの反応混合物に加えた。試験条件の大部分にトリフルオロ酢酸を使用した。ＴＦＡについては、１０μＬのＴＦＡ／水の５０／５０溶液を反応ウェルに加え（５％の最終ＴＦＡ濃度は）、プレートを室温で最大２４時間振盪した。メチオニン、インドール、またはカフェイン酸などの添加剤を利用したときは、酸を加える前に、添加剤試薬を５０倍または１００倍のストック溶液から反応物にスパイクした。変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
エナミドからＣ末端α－アミド生成物への酸分解：
様々な強酸を使用して、エナミドの酸分解を進行させた（表２）。概して、酸を１０倍の水性ストック溶液からの反応混合物に加えた。試験条件の大部分にトリフルオロ酢酸を使用した。ＴＦＡについては、１０μＬのＴＦＡ／水の５０／５０溶液を反応ウェルに加え（５％の最終ＴＦＡ濃度は）、プレートを室温で最大２４時間振盪した。メチオニン、インドール、またはカフェイン酸などの添加剤を利用したときは、酸を加える前に、添加剤試薬を５０倍または１００倍のストック溶液から反応物にスパイクした。変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
【0134】
逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）を使用したエナミド切断
エナミドは、ジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）を用いたＩＥＤＤＡ化学を使用して切断することもできる。ジピリジル－テトラジンを、８０％のアセトニトリルと２０％の１２５ｍＭの水性ＨＣｌとの混合物に溶解させて、１２．５ｍＭのストック溶液（ＨＣｌの最終濃度＝２５ｍＭ、テトラジン濃度に基づいて２当量）を得た。ジピリジル－テトラジンの溶解度はアセトニトリル単独では不良であり、ピリジル基をプロトン化し、溶解度を改善するためには酸を加える必要があった。このストック溶液１０μＬを反応ウェルに加え（１．２５ｍＭの最終テトラジン濃度、ペプチド濃度に基づいて５当量）、反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
エナミドは、ジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）を用いたＩＥＤＤＡ化学を使用して切断することもできる。ジピリジル－テトラジンを、８０％のアセトニトリルと２０％の１２５ｍＭの水性ＨＣｌとの混合物に溶解させて、１２．５ｍＭのストック溶液（ＨＣｌの最終濃度＝２５ｍＭ、テトラジン濃度に基づいて２当量）を得た。ジピリジル－テトラジンの溶解度はアセトニトリル単独では不良であり、ピリジル基をプロトン化し、溶解度を改善するためには酸を加える必要があった。このストック溶液１０μＬを反応ウェルに加え（１．２５ｍＭの最終テトラジン濃度、ペプチド濃度に基づいて５当量）、反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
【0135】
ＵＰＬＣ－ＭＳによる変換の分析
反応試料を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析によって直接分析した（勾配：９５／５ Ａ／Ｂで０．５分間保持し、７分かけて９５／５ Ａ／Ｂから５５／４５ Ａ／Ｂに勾配、続いて洗浄および再平衡化）。いくつかの事例では、２１４ｎｍでの積分ＵＶデータを使用して変換を定量化するのに十分なクロマトグラフィー分解能を達成することはできなかった。変換を定量化するために、全てのペプチド出発材料、中間体、副生成物、および所望の生成物の計算された質量を入力して、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を生成した。これらのＥＩＣの積分ピークを合計し、１００％に対して正規化し、正規化した積分に基づいて所望の生成物への変換を計算した。
反応試料を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析によって直接分析した（勾配：９５／５ Ａ／Ｂで０．５分間保持し、７分かけて９５／５ Ａ／Ｂから５５／４５ Ａ／Ｂに勾配、続いて洗浄および再平衡化）。いくつかの事例では、２１４ｎｍでの積分ＵＶデータを使用して変換を定量化するのに十分なクロマトグラフィー分解能を達成することはできなかった。変換を定量化するために、全てのペプチド出発材料、中間体、副生成物、および所望の生成物の計算された質量を入力して、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を生成した。これらのＥＩＣの積分ピークを合計し、１００％に対して正規化し、正規化した積分に基づいて所望の生成物への変換を計算した。
【0136】
バッチスケール反応のプロトコル：
攪拌棒または１２．５ｍＬ容量の比色計キュベット（カタログ番号７６０１６－３５６）を装備したバイアル内で、Ｃ末端システイン残基を含む１．０当量のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを、ビス－トリスメタン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．３）に溶解させ、最終ペプチド濃度を２５０ｕＭとした。（３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、ＣＡＳ：９８０２６－７９－０）またはＮＢＤクロリド（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のストック溶液を、１：１のＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中で調製し、システインカップリングのために、ペプチドに対して２当量を反応容器に加えた。反応物を、１時間、またはＬＣ／ＭＳによる反応完了まで攪拌させた。次いで、反応容器を、３６５ｎｍのＬＥＤ、手持ち式白色ＣＦＬ作業灯、または４５０ｎｍの青色ＬＥＤのストリップで０．２５～４時間にわたって照射した。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＬＣ／ＭＳによって反応が完了したら、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え（５％の最終ＴＦＡ濃度）、反応物を周囲温度で１２～２４時間攪拌させた。あるいは、５当量のジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）をストック溶液から加え、１．２５ｍＭのテトラジン（２．５ｍＭのＨＣｌ、８０：２０のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏに溶解）の最終濃度を得て、反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。Ｃ末端α－アミドへの変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
攪拌棒または１２．５ｍＬ容量の比色計キュベット（カタログ番号７６０１６－３５６）を装備したバイアル内で、Ｃ末端システイン残基を含む１．０当量のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを、ビス－トリスメタン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．３）に溶解させ、最終ペプチド濃度を２５０ｕＭとした。（３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、ＣＡＳ：９８０２６－７９－０）またはＮＢＤクロリド（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のストック溶液を、１：１のＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中で調製し、システインカップリングのために、ペプチドに対して２当量を反応容器に加えた。反応物を、１時間、またはＬＣ／ＭＳによる反応完了まで攪拌させた。次いで、反応容器を、３６５ｎｍのＬＥＤ、手持ち式白色ＣＦＬ作業灯、または４５０ｎｍの青色ＬＥＤのストリップで０．２５～４時間にわたって照射した。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＬＣ／ＭＳによって反応が完了したら、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え（５％の最終ＴＦＡ濃度）、反応物を周囲温度で１２～２４時間攪拌させた。あるいは、５当量のジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）をストック溶液から加え、１．２５ｍＭのテトラジン（２．５ｍＭのＨＣｌ、８０：２０のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏに溶解）の最終濃度を得て、反応物を３７℃で２４時間インキュベートした。Ｃ末端α－アミドへの変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
【0137】
ジスルフィド結合を含有するペプチドのバッチスケール反応のプロトコル：
攪拌棒または１２．５ｍＬ容量の比色計キュベット（カタログ番号７６０１６－３５６）を装備したバイアル内で、Ｃ末端システイン残基を含む１．０当量のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを、ビス－トリスメタン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．３）に溶解させ、最終ペプチド濃度を２５０ｕＭとした。界面活性剤を溶液に加えて、中間体の溶解度を改善してもよい。６０ｍＭの界面活性剤の濃度が好ましい場合がある。ＮＢＤ塩化物（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のストック溶液を、１：１のＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中で調製し、全体的システインカップリングのために、ペプチドに対して４当量を反応容器に加えた。反応物を、２時間、またはＬＣ／ＭＳによる反応完了まで攪拌させた。次いで、反応容器を、手持ち式白色ＣＦＬ作業灯、または４５０ｎｍの青色ＬＥＤのストリップで０．２５～４時間にわたって照射した。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＬＣ／ＭＳによって反応が完了したら、Ｈ２Ｏ中の求核性硫化物、例えば、システアミン（８当量）およびシステアミン（１．２当量）の溶液を加え、周囲温度で２時間攪拌させて、骨格システインチオールを遊離させ、ジスルフィドに酸化させる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え（５％の最終ＴＦＡ濃度）、反応物を周囲温度で１２～２４時間攪拌させた。あるいは、５当量のジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）をストック溶液から加え、１．２５ｍＭのテトラジン（２．５ｍＭのＨＣｌ、８０：２０のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏに溶解）の最終濃度を得てもよく、反応物を３７℃で２４時間インキュベートし得る。Ｃ末端α－アミドへの変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
攪拌棒または１２．５ｍＬ容量の比色計キュベット（カタログ番号７６０１６－３５６）を装備したバイアル内で、Ｃ末端システイン残基を含む１．０当量のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを、ビス－トリスメタン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６．３）に溶解させ、最終ペプチド濃度を２５０ｕＭとした。界面活性剤を溶液に加えて、中間体の溶解度を改善してもよい。６０ｍＭの界面活性剤の濃度が好ましい場合がある。ＮＢＤ塩化物（４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン、ＣＡＳ：１０１９９－８９－０）のストック溶液を、１：１のＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中で調製し、全体的システインカップリングのために、ペプチドに対して４当量を反応容器に加えた。反応物を、２時間、またはＬＣ／ＭＳによる反応完了まで攪拌させた。次いで、反応容器を、手持ち式白色ＣＦＬ作業灯、または４５０ｎｍの青色ＬＥＤのストリップで０．２５～４時間にわたって照射した。冷却ファンを使用して、反応混合物を室温で維持した。ＬＣ／ＭＳによって反応が完了したら、Ｈ２Ｏ中の求核性硫化物、例えば、システアミン（８当量）およびシステアミン（１．２当量）の溶液を加え、周囲温度で２時間攪拌させて、骨格システインチオールを遊離させ、ジスルフィドに酸化させる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え（５％の最終ＴＦＡ濃度）、反応物を周囲温度で１２～２４時間攪拌させた。あるいは、５当量のジピリジル－テトラジン（３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジン、ＣＡＳ：１６７１－８７－０）をストック溶液から加え、１．２５ｍＭのテトラジン（２．５ｍＭのＨＣｌ、８０：２０のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏに溶解）の最終濃度を得てもよく、反応物を３７℃で２４時間インキュベートし得る。Ｃ末端α－アミドへの変換をＬＣ－ＭＳによってモニターした。
【実施例】
【0138】
［実施例１：光標識実験］
バッチスケールα－アミド化について概説した一般的な手順に従って、様々な化学骨格および吸収波長を網羅する様々な光標識を評価した。反応を、光標識コンジュゲーションおよび適切な光源を用いた照射後に、Ｃ末端エナミドへの変換について上で概説したように、ＵＰＬＣ－ＭＳによって直接分析した。結果を表１に提示する。
バッチスケールα－アミド化について概説した一般的な手順に従って、様々な化学骨格および吸収波長を網羅する様々な光標識を評価した。反応を、光標識コンジュゲーションおよび適切な光源を用いた照射後に、Ｃ末端エナミドへの変換について上で概説したように、ＵＰＬＣ－ＭＳによって直接分析した。結果を表１に提示する。
【表1】
【0139】
Ｃ末端システインを含む配列番号２に示されるアミノ酸配列のＲ２を有するペプチドのＣ末端エナミドへの光標識および変換について、変換が観察された。構造的に多様な光標識剤を用いて反応を実施し、光標識コンジュゲートの変換を、３６５ｎｍで、可視光を使用して達成した。
【0140】
［実施例２：エナミド切断実験］
スクリーニングスケールα－アミド化の一般的なプロトコルに従って、対応するＣ末端α－アミドへのエナミドの切断（工程（ｃ））について、広範な酸およびテトラジンを評価した。結果を表２に提示する。
スクリーニングスケールα－アミド化の一般的なプロトコルに従って、対応するＣ末端α－アミドへのエナミドの切断（工程（ｃ））について、広範な酸およびテトラジンを評価した。結果を表２に提示する。
【表2】
【0141】
エナミドからＣ末端α－アミドへの酸分解を、様々な酸について達成した。反応は、強酸で効率的であることが示された。ＩＥＤＤＡ反応によるエナミドの切断は、ジ－２－ピリジル置換テトラジンでさらに効率的であり、Ｃ末端α－アミドを高い収率で提供した。
【0142】
［実施例３：最後から二番目のＡＡ位置に変動がある場合の反応性能］
例示的なペプチドの最後から二番目のＡＡ位置に関する反応の性能を、４セットの条件について調査した。スクリーニングスケールα－アミド化について概説した一般的なプロトコルを、これらの実験に使用した。
例示的なペプチドの最後から二番目のＡＡ位置に関する反応の性能を、４セットの条件について調査した。スクリーニングスケールα－アミド化について概説した一般的なプロトコルを、これらの実験に使用した。
【0143】
反応における詳細な分析のために、３－ブロモ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（化学式１）および４－クロロ－７－ニトロベンゾフラザン（化学式２）の２つの光標識剤を選択し、これらは、典型的には、それぞれＵＶ源および可視光源下で、コスト、高いコンジュゲーション収率、および容易な光分解の最良の組み合わせを提供するものであった。最終のエナミド切断工程を、酸分解経路については５％ｖ／ｖのＴＦＡを用いて、ＩＥＤＤＡ媒介性エナミド切断については３，６－ジ－２－ピリジル－１，２，４，５－テトラジンを用いて実施した。一般的な反応条件および結果を以下の表３および４に提示する。
【表3】
【表4】
【0144】
Ｃ末端α－アミド化反応の範囲を、ジェネリックペプチドの最後から二番目のアミノ酸位置に関して調査した。反応は、最後から二番目の位置にあるいずれのアミノ酸についても良好から優良な収率で進行し、この位置での側鎖官能基に対する広範な耐性が示される。２－ブロモマレイミドまたはＮＢＤ－Ｃｌのいずれかを光標識工程で利用する場合、反応は高効率で進行する。エナミドが酸性分解によってまたはＩＥＡＤＤＡ反応によって切断されるときに、Ｃ末端α－アミドの高収率が観察され、酸性または中性条件下でそれぞれ実施することができる２つの相補的反応の選択が可能になる。
【0145】
［実施例４：ジスルフィド含有ペプチド］
本発明を、ジスルフィド結合を含有するＣ末端α－アミドを有するペプチドの調製に使用した。上で特定したジスルフィド結合を含有するペプチドのバッチスケール反応のプロトコルを、界面活性剤を使用しなかったことを除いて、スキーム１に概して示される反応の後でこの実験に使用した。Ｈ２Ｏ中のシステアミンの求核性硫化物（８当量）およびシスタミンの酸化パートナー（１．２当量）を使用した。システインリッチ骨格を、第１の工程において光標識で全体的にアルキル化した。Ｃ末端アルキル化システインの選択的光分解が、光への曝露時に発生した。残りのアルキル化システインを求核性硫化物で除去し、酸化させてシステイン硫化物を遊離させ、ジスルフィド結合を含有する所望のペプチドを形成した。次に、反応を、ＴＦＡを用いたエナミド切断について概説した条件に従って進行させて、以下の表５に示される結果を得た。
本発明を、ジスルフィド結合を含有するＣ末端α－アミドを有するペプチドの調製に使用した。上で特定したジスルフィド結合を含有するペプチドのバッチスケール反応のプロトコルを、界面活性剤を使用しなかったことを除いて、スキーム１に概して示される反応の後でこの実験に使用した。Ｈ２Ｏ中のシステアミンの求核性硫化物（８当量）およびシスタミンの酸化パートナー（１．２当量）を使用した。システインリッチ骨格を、第１の工程において光標識で全体的にアルキル化した。Ｃ末端アルキル化システインの選択的光分解が、光への曝露時に発生した。残りのアルキル化システインを求核性硫化物で除去し、酸化させてシステイン硫化物を遊離させ、ジスルフィド結合を含有する所望のペプチドを形成した。次に、反応を、ＴＦＡを用いたエナミド切断について概説した条件に従って進行させて、以下の表５に示される結果を得た。
【表5】
【0146】
アミド化状態でジスルフィド結合を含有するモデルペプチド（ＩＥＣＴＫＳＥＧＣＥＥＶＹＥＡＤＨＧＥＰ、配列番号１５）の効率的なアミド化は、骨格システインを含有するペプチドが、所望のＣ末端α－アミドへの選択的転換を容易に受けることを示す。
【0147】
［実施例５：生物学的に活性なペプチドの調製］
本発明を使用して、生体関連ペプチドおよび市販のペプチド治療薬を合成した。スクリーニングスケールα－アミド化について概説したプロトコルをこれらの実験に使用し、反応は、概して、表３に概説したスキーム１および条件ＣまたはＤに従った。結果を表６に提示する。
本発明を使用して、生体関連ペプチドおよび市販のペプチド治療薬を合成した。スクリーニングスケールα－アミド化について概説したプロトコルをこれらの実験に使用し、反応は、概して、表３に概説したスキーム１および条件ＣまたはＤに従った。結果を表６に提示する。
【表6】
【0148】
生物学的に活性なペプチドおよび市販のペプチド治療薬のＣ末端システイン延長前駆体を調製し、Ｃ末端α－アミド化プロセスに供した。全ての実施例で、対応する生体関連Ｃ末端α－アミドの良好な収率が得られ、本発明の易しい反応条件および広い対象範囲が浮き彫りとなった。Ｃ末端α－アミド化プロセスは、ペプチドのサイズおよび組成にかかわらず良好に実施し、いずれのペプチドまたはタンパク質に対しても化学作用の適用性が実証された。
【0149】
［実施例６：ＧＬＰ－１受容体－アミリン受容体共作動薬中間体のアップスケール調製］
本発明を、以下で詳細に説明するハイブリッドバッチ－フォトフロー手順を使用して、より大きな規模で適用した。
本発明を、以下で詳細に説明するハイブリッドバッチ－フォトフロー手順を使用して、より大きな規模で適用した。
【0150】
本実施例は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＮ末端延長部とを含む、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドＲ２に対して行った。
【0151】
０．２～０．３ｍＭの水性ＴＣＥＰ（７８０ｍｌ、ｐＨ７）中のＣ末端システインアミド化タグ（１２．４ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を有する配列番号１７によるペプチドＲ２の溶液を含む、窒素雰囲気下にあるアルミ箔で包んだ１リットルのガラス反応器に、ＭｅＣＮ（５．２ｍｌ）中のＮＢＤ－Ｃｌ（５１９ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。周囲温度で８０分間攪拌した後、ＨＰＬＣ分析により反応完了が示された。
【0152】
得られた溶液を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）Ｌａｂ Ｐｈｏｔｏ Ｒｅａｃｔｏｒ（２．７ｍＬの流体モジュール体積、１０ｍＬ／分の流量、２０℃の反応器熱交換温度）中で４０５ｎｍ（青色ＬＥＤ、６１Ｗの入力電力）で照射し、反応器を、追加の５０ｍｌの水でフラッシュした。ＨＰＬＣ分析により、出発材料の少なくとも８０％の消費が示した。
【0153】
６Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４、１６０ｍＬ）を、得られた溶液に加えた。１６時間攪拌した後、Ｌ－ヒスチジン（７．４５ｇ）を加え、混合物を周囲温度で１０分間攪拌した。次に、温度を４０℃未満に維持しながら溶液がｐＨ８．５に達するまで、６Ｍの水性ＫＯＨを慎重に加えた。得られた混合物を、限外濾過（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）によって１．０Ｌに濃縮し、一定残余体積（連続モード）を０．８～１Ｌに維持しながら、３．０Ｌの２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８でダイアフィルトレーション（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ）した。最終混合物（８００ｍＬ）をＨＰＬＣによって分析した。変換結果を以下に示す。
【表7】
【0154】
反応試料を１：１ｖ／ｖのＭｅＣＮ／水で１０倍希釈し、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析によって分析した（Ｋｉｎｅｔｅｘ １，７μｍ Ｃ１８ １００Å １００×２，１ｍｍ、溶離液Ａ：水中の１０％のＭｅＣＮ＋０．１％のＴＦＡ、溶離液Ｂ：水中の９０％のＭｅＣＮ＋０．１％のＴＦＡ。勾配：１２分で２０～５０％のＢ、２１４ｎｍおよび４２０ｎｍの両方でＵＶ検出。変換収率を、外部ＨＰＬＣ標準を使用して計算した。
【0155】
本実施例は、Ｃ末端アミドを有するペプチドのより大規模な生成を示し、それぞれのペプチドアミドは、光化学的Ｃ末端α－アミド化法を使用して高収率で生成された。加えて、本実施例により、本光化学法は、光化学的変換工程（スキーム１または２の工程（ｂ））のみをフローセットアップで実施したハイブリッドセットアップで完了できることが示される。実施例により、概して、本方法の堅牢性およびスケーラビリティが浮き彫りになる。
【0156】
本発明のある特定の特徴を本明細書に例証し記載してきたところで、多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には想到されるであろう。したがって、当然のことながら、添付の実施形態が、本発明の真の趣旨の範囲内に含まれる全ての修正および変更を包含するよう意図されている。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】