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特表2024-545209骨欠損、骨変形、及び骨癒合不全の再建のための生体活性インプラント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】骨欠損、骨変形、及び骨癒合不全の再建のための生体活性インプラント
(51)【国際特許分類】
A61L 27/18 20060101AFI20241128BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/56 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/52 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/40 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/12 20060101ALI20241128BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20241128BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/34 20060101ALI20241128BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20241128BHJP
A61F 2/28 20060101ALN20241128BHJP
【ＦＩ】
A61L27/18
A61L27/58
A61L27/54
A61L27/56
A61L27/52
A61L27/40
A61L27/12
A61K38/18
A61P19/08
A61L27/34
A61L27/22
A61F2/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024535308
(86)(22)【出願日】2022-12-09
(85)【翻訳文提出日】2024-07-10
(86)【国際出願番号】 US2022052412
(87)【国際公開番号】W WO2023114104
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/289,447
(32)【優先日】2021-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/304,207
(32)【優先日】2022-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/289,431
(32)【優先日】2021-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/304,216
(32)【優先日】2022-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516231051
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001379
【氏名又は名称】弁理士法人大島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、ユンジ
(72)【発明者】
【氏名】リン、シイン
(72)【発明者】
【氏名】モインザデ、セイェドシナ
(72)【発明者】
【氏名】ルイ、イレイン
【テーマコード（参考）】
4C081
4C084
4C097
【Ｆターム（参考）】
4C081AB04
4C081BA12
4C081BA16
4C081BB06
4C081CA082
4C081CA171
4C081CD042
4C081CD062
4C081CD152
4C081CD28
4C081CF021
4C081DA16
4C081DB03
4C081DC03
4C081DC04
4C081DC05
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DB60
4C084MA67
4C084NA12
4C084ZA961
4C097AA01
4C097MM04
4C097MM05
(57)【要約】
本開示によれば、整形外科用の生物活性インプラントが提供される。本開示の生物活性インプラントは、表面特性を改質するために処理された表面を有するロッドと、ロッドの表面に荷電ポリマー及び塩イオンを介して物理的に架橋された、凍結乾燥した親水性ヒドロゲルネットワークと、親水性ヒドロゲルネットワークに捕捉され、担持された生物学的物質と、親水性ヒドロゲルネットワーク自体、及び、ロッドの表面に対する親水性ヒドロゲルネットワークの物理的な架橋を強化するために、親水性ヒドロゲルネットワークに化学的に架橋された共有結合反応性マクロモノマーと、を含む。ロッドの表面は、共有結合性分子でコーティングされており、共有結合性分子は、ロッドの表面に化学的及び物理的に架橋された親水性ヒドロゲルネットワークのロッドに対する接着性を高めるために、共有結合反応性マクロモノマーに化学的に架橋されている。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨欠損、骨変形、または骨癒合不全を再建する方法であって、（ａ）生体活性整形外科用インプラントであって、
（ｉ）表面特性を改質するために処理された表面を有するロッドと、
（ｉｉ）前記ロッドの前記表面に荷電ポリマー及び塩イオンを介して物理的に架橋された、凍結乾燥した親水性ヒドロゲルネットワークと、
（ｉｉｉ）前記親水性ヒドロゲルネットワークに捕捉され、それによって、該ヒドロゲルネットワークに担持された生物学的物質と、
（ｉｖ）前記親水性ヒドロゲルネットワーク自体、及び、前記ロッドの前記表面に対する前記親水性ヒドロゲルネットワークの物理的な架橋を強化するために、前記親水性ヒドロゲルネットワークに化学的に架橋された共有結合反応性マクロモノマーと、を含む、該生体活性整形外科用インプラントを用意するステップと、
（ｂ）前記生体活性整形外科用インプラントを、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位に移植するステップであって、前記生体活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への移植に適合する大きさを有する、該ステップと、を有する、方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、前記生体活性整形外科用インプラントは、（ｖ）１以上のコーティング層をさらに含む、方法。
【請求項3】
請求項１に記載の方法であって、前記ロッドは、相互接続された多孔性ロッドであり、
前記生物学的物質は、前記相互接続された多孔性ロッドの細孔に担持される、方法。
【請求項4】
請求項１に記載の方法であって、前記生体活性整形外科用インプラントは、前記２つの骨セグメント間、前記骨トンネル内、または前記骨折部位への髄内移植に適合する大きさを有する、方法。
【請求項5】
生物活性整形外科用インプラントであって、（ｉ）表面特性を改質するために処理された表面を有するロッドと、
（ｉｉ）前記ロッドの前記表面に荷電ポリマー及び塩イオンを介して物理的に架橋された、凍結乾燥した親水性ヒドロゲルネットワークと、
（ｉｉｉ）前記親水性ヒドロゲルネットワークに捕捉され、それによって、該ヒドロゲルネットワークに担持された生物学的物質と、
（ｉｖ）前記親水性ヒドロゲルネットワーク自体、及び、前記ロッドの前記表面に対する前記親水性ヒドロゲルネットワークの物理的な架橋を強化するために、前記親水性ヒドロゲルネットワークに化学的に架橋された共有結合反応性マクロモノマーと、を含む、生体活性整形外科用インプラント。
【請求項6】
請求項５に記載の生物活性整形外科用インプラントであって、前記ロッドの前記表面は、共有結合性分子でコーティングされており、
前記共有結合性分子は、前記ロッドの前記表面に化学的及び物理的に架橋された前記親水性ヒドロゲルネットワークの前記ロッドに対する接着性を高めるために、前記共有結合反応性マクロモノマーに化学的に架橋されている、生物活性整形外科用インプラント。
【請求項7】
請求項５に記載の生物活性整形外科用インプラントであって、前記ロッドは、相互接続された多孔性ロッドであり、
前記生物学的物質は、前記相互接続された多孔性ロッドの細孔に担持される、生物活性整形外科用インプラント。
【請求項8】
請求項５に記載の生物活性整形外科用インプラントであって、当該生体活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への髄内移植に適合する大きさを有する、生物活性整形外科用インプラント。
【請求項9】
請求項５に記載の生物活性整形外科用インプラントであって、当該生体活性整形外科用インプラントは、１以上のコーティング層をさらに含む、生物活性整形外科用インプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本出願は、２０２１年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６３／２８９、４３１号、２０２２年１月２８日出願の米国特許仮出願第６３／３０４、２１６号、２０２１年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６３／２８９、４４７号、及び、２０２２年１月２８日出願の米国特許仮出願第６３／３０４、２０７号に基づく優先権を主張するものである。上記の各出願の開示内容の全体は、参照により本明細書中に援用される。
本出願は、２０２１年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６３／２８９、４３１号、２０２２年１月２８日出願の米国特許仮出願第６３／３０４、２１６号、２０２１年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６３／２８９、４４７号、及び、２０２２年１月２８日出願の米国特許仮出願第６３／３０４、２０７号に基づく優先権を主張するものである。上記の各出願の開示内容の全体は、参照により本明細書中に援用される。
【0002】
（技術分野）
本発明は、骨欠損、骨変形、及び骨癒合不全の再建のための生体活性インプラントに関する。
本発明は、骨欠損、骨変形、及び骨癒合不全の再建のための生体活性インプラントに関する。
【背景技術】
【0003】
高エネルギー外傷、デブリードマン処置、または腫瘍切除に起因する分節性骨欠損は、依然として、整形外科の分野における大きな課題である。機械的支持と骨再建との複合機能により、自家骨移植または同種骨移植が、分節性骨欠損を再建するための伝統的な方法と見なされてきた。しかしながら、これらの処置は、通常、患者の可動性を低下させ、複数回の手術を必要とし、限られた程度の骨欠損の再建にしか効果がない。
【0004】
骨折の固定または再建のための近代的な患肢救済手術は、何十年もの間、大きな骨欠損の治療に用いられてきた。特に、仮骨延長術（ＤＯ）とも呼ばれるイリザロフ法は、大きな骨欠損の治療における比較的成熟した患肢救済手術である。この手術は、骨切りした後、外固定器または内固定器を介して骨を延長する。治療の種類に応じて、イリザロフ法は、急性短縮術及び延長術（単焦点アプローチ）、一重レベル骨輸送（二重焦点アプローチ）、及び、二重レベル骨輸送（三重焦点アプローチ）の３つのカテゴリーに分類される。小さな骨欠損（通常＜２ｃｍ）の治療では、骨延長の前に骨欠損を直接閉鎖する単焦点アプローチが推奨されている。しかしながら、骨欠損の大きさが３ｃｍを超える場合、急性短縮は軟部組織に影響を及ぼし、血管系を損傷し、四肢虚血をもたらす恐れがある。二焦点アプローチは、欠損部位から離れた部位での骨切り術を用いる。その後、節間セグメントを皮質骨切除部位から離れる方向に移動させ、欠損部位で圧迫して最適な骨長を維持する。三焦点アプローチでは、欠損部位での圧迫に加えて、２回の延長骨切り術を行う。二焦点アプローチまたは三焦点アプローチは、四肢の不一致や軟部組織の収縮を伴わないより大きな骨欠損の治療において、いくつかの利点を示している。しかしながら、骨輸送術には、ピントラック感染、ドッキング部位での癒合不全、及び、不十分な骨硬化などの欠点が依然として存在する。これらの欠点のうちで、ドッキング部位での癒合不全は、骨輸送術を施したほぼすべての患者に認められた。ドッキング部位での不活発な骨接触及び軟部組織の侵入は、偽関節を形成する傾向がある。ドッキング部位での最終的な骨再建を達成するためには、二次的なデブリードマン処置及び骨移植手術が常に不可欠である。近年、外固定期間を短縮する方法としての、金属製の髄内釘（intramedullary nail：ＩＭ釘）を使用した骨輸送を取り上げた報告が増加している。しかしながら、金属製のＩＭ釘が、早期骨硬化を達成したり、ドッキング部位の癒合不全を低下させたりすることを示唆する信頼できるエビデンスは存在しない。また、金属製のＩＭ釘を使用した場合には、金属製のＩＭ釘を除去するために追加の手術が必要となる。
【0005】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨の修復や再建に重要な役割を果たす最も強力な骨誘導因子の１つである。ＤＯ動物モデルでは、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、及びＢＭＰ－７が、骨延長期に骨再建部位で高度に発現し、骨硬化期には徐々に減少することが示された。組換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰ－２またはＢＭＰ－７の局所注射は、多くのＤＯモデルにおいて骨形成を促進することが示されている。本発明者らは、生分解性の髄内釘（ＩＭ釘）を用いることにより、１回の手術でＢＭＰの送達を維持し、二次的な手術、移植、または重篤な合併症を伴うことなく、骨治癒を促進し、骨輸送における偽関節を減少させることができるのではないかと考えた。本発明は、上記の問題点の少なくともいくつかを解決するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一実施形態では、本開示によれば、骨欠損、骨変形、または骨癒合不全を再建する方法が提供される。また、本開示によれば、生体活性インプラントであって、スキャフォールドと、スキャフォールドに物理的及び化学的に架橋され、かつスキャフォールドに化学的に結合された、凍結乾燥したヒドロゲルネットワーク層と、凍結乾燥したヒドロゲルネットワーク層内に分散して担持された生物学的物質と、を含む、生体活性インプラントが提供される。一実施形態では、生体活性インプラントは、コーティングされている。
【0007】
生体活性インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への移植に適合する大きさを有し、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位移植される。生体活性インプラントが髄内生体活性インプラントとして使用される場合には、生体活性インプラントは、２つの骨セグメント間への髄内移植に適合する大きさを有する。生体活性インプラントが、足、足首、肩、腰、または関節の外傷及び障害を治療するために外科的に形成された骨トンネルに使用される場合には、生体活性インプラントは、治療が意図される解剖学的位置に外科的に形成された骨トンネル内への圧入に適合する大きさ、またはそれよりも若干大きい大きさを有する。
【0008】
別の実施形態では、スキャフォールドは、相互接続された多孔性スキャフォールドである。凍結乾燥ヒドロゲルネットワーク層は、相互接続された多孔性スキャフォールドに物理的及び化学的に架橋され、かつ化学的に結合されている。そして、生物学的物質は、相互接続された多孔性スキャフォールドの表面上及び細孔内に担持された凍結乾燥ヒドロゲル層内に分散して保持される。
【0009】
さらに別の実施形態では、本開示によれば、整形外科用の生体活性インプラントが提供される。本開示の生体活性インプラントは、スキャフォールドと、スキャフォールドに物理的及び化学的に架橋され、かつスキャフォールドに化学的に結合された、凍結乾燥したヒドロゲルネットワーク層と、凍結乾燥したヒドロゲルネットワーク層内に分散して担持された生物学的物質と、を含む。生体活性インプラントは、２つの骨セグメント間または骨折部位への移植に適合する大きさを有する。生体活性インプラントが髄内生体活性インプラントとして使用される場合には、生体活性インプラントは、２つの骨セグメント間への髄内移植に適合する大きさを有する。一実施形態では、生体活性インプラントは、コーティングされている。
【0010】
さらに別の実施形態では、スキャフォールドは、相互接続された多孔性スキャフォールドであり、凍結乾燥したヒドロゲルネットワーク層は、相互接続された多孔性スキャフォールドに物理的及び化学的に結合され、生物学的物質は、相互接続された多孔性スキャフォールドの表面上及び細孔内に分散して担持される。
【0011】
さらに別の実施形態では、本開示は、長骨欠損の改善された治療、骨変形の矯正、または骨癒合不全を治療のための、生体活性（髄内（ＩＭ））インプラントデバイスに基づく治療を提供する。生体活性インプラントデバイスは、コアスキャフォールドと、生体活性ヒドロゲルコーティングとを含む。コアスキャフォールドは、ポリマー、セラミック、金属、または複合材料から作製される。コアスキャフォールドは、多孔性または非多孔性であり、また、分解性または非分解性である。ヒドロゲルは、物理的に架橋されたゲルと、共有結合的に架橋されたゲルとの相互貫通ネットワークであり得る。ヒドロゲルの例としては、ゼラチンメタクリロイル－アルギン酸ベース（ＧｅｌＭＡ－アルギン酸）ゲルが挙げられる。架橋密度を高めるために、低分子量の架橋剤をヒドロゲルに添加することができる。生物学的物質としては、成長因子及び薬剤が挙げられる。成長因子としては、ＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ２が挙げられる。成長因子は、ヒドロゲルに担持され、調節可能なまたは徐放性の放出パターンを示す。本開示の生体活性インプラントデバイスは、仮骨延長術や、他の整形外科的な外傷及び障害に対する補助療法に使用することができる（図１Ａ～Ｄ）。
（１）ＩＭインプラントによる骨輸送、
（２）ＩＭインプラントによる骨延長、
（３）ＩＭインプラント、または、骨癒合不または骨障害の治療のための骨トンネルへの移植に適合する大きさを有するインプラントによる骨治療、または、
（４）ＩＭインプラントによる骨欠損治療。
（１）ＩＭインプラントによる骨輸送、
（２）ＩＭインプラントによる骨延長、
（３）ＩＭインプラント、または、骨癒合不または骨障害の治療のための骨トンネルへの移植に適合する大きさを有するインプラントによる骨治療、または、
（４）ＩＭインプラントによる骨欠損治療。
【0012】
生体活性インプラントデバイスは、髄内空間でなくても、骨や骨欠損部間の通常の骨移植部位でも使用することができ、髄内用途に限定されないことに留意されたい。スキャフォールド（またはＩＭ釘）は、中実ロッドまたは多孔性スキャフォールドであり得、とりわけ、金属製のロッドは耐荷重性を有する。
【0013】
本開示の生体活性インプラントデバイスは、患者が骨輸送術を受けるときに、骨延長における骨硬化を効果的に促進し、それにより、ドッキング部位の癒合不全を防止することができる。また、本開示の生体活性インプラントデバイスは、癒合不全の治療において、骨癒合を効果的に促進することもできる。図１Ａ～Ｄは、３つの異なる条件下での骨治癒のための、本開示の生体活性インプラントデバイスの概略設計を示す。
【0014】
別の実施形態では、本開示は、スキャフォールド及びコーティング材料を含むインプラントデバイスを提供する。コアスキャフォールド材料は、ポリマー、セラミック、金属、または複合材料、例えば、ポリカプロラクトン－リン酸三カルシウム（ＰＣＬ－ＴＣＰ）や、ポリ乳酸－グリコール酸共重合体－ＴＣＰ（ＰＬＧＡ／ＴＣＰ）など、から作製される。重量比８０：２０（ｗ／ｗ）のＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントは、１００μｍ～ｍｍの範囲の細孔径を有する３次元多孔性スキャフォールドに印刷することができる。コアスキャフォールド材料は、チタン合金、コバルトクロム合金、マグネシウム合金、亜鉛合金などの金属材料であり得る。コアスキャフォールドは、多孔性または非多孔性であり得る。ヒドロゲルコーティング層は、コアスキャフォールドの全体または一部を覆うことができる。
【0015】
移植に関しては、３つの用途に応じて４つの異なる方法がある（図１Ａ～Ｄ）。（１）（大きな）骨欠損の治療では、本開示のインプラントデバイスは、骨輸送術中に、骨欠損部の隙間から、または低侵襲的な方法で、遠位骨セグメントと近位骨セグメントとの間に挿入される。ヒドロゲルコーティング層は、再建部位からドッキング部位までの長さを覆うべきである。インプラントデバイスの両端部は、遠位固定ピン及び近位固定ピンによって固定される。注目すべきことには、中間の骨セグメントを輸送するためのピンは、ＩＭデバイスと接触しないようにする必要がある。（２）骨延長では、本開示のインプラントデバイスは、低侵襲的な方法で、長骨に前方または後方から挿入される。ヒドロゲルコーティング層は、再建部位の長さを覆うべきである。インプラントデバイスは、遠位固定ピンまたは近位固定ピンによって固定される。（３）癒合不全の治療では、本開示のインプラントデバイスは、外科的デブリードマン処置中に低侵襲的な方法で、長骨に前方または後方から挿入される。ヒドロゲルコーティング層は、癒合不全の隙間の長さを覆うべきである。インプラントデバイスは、遠位固定ピンまたは近位固定ピンによって固定される。（４）骨欠損の治療では、本開示のインプラントデバイスは、骨欠損部の隙間から、遠位骨セグメント及び近位骨セグメントに挿入される。ヒドロゲルコーティング層は、骨欠損部の隙間の長さを覆うべきである。インプラントデバイスは、遠位固定ピン及び近位固定ピン、またはプレートやＩＭ釘などの内固定具もしくは外固定具で固定される。
【0016】
生物学的に担持されたヒドロゲルコーティングの例を以下に示す。ヒドロゲルコーティングは、脱イオン水中に、メタクリル酸ゼラチン（ＧｅｌＭＡ；１５％）、アルギン酸塩（１．２５％）、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリル酸（ＰＥＧＤＭＡ；２％）、メタクリル酸ヘパリン（ＨｅｐＭＡ；１％）、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２；２００μｇ／ｍＬ）、及び光開始剤（０．３％）を含有する。ＧｅｌＭＡマクロモノマーを合成するために、ゼラチンを５０°Ｃの脱イオン水（１０％ｗ／ｖ）に溶解させた。メタクリル酸ヘパリン（ＨｅｐＭＡ）を合成するために、１ｇのヘパリンを１００ｍＬのＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）に溶解させた。続いて、４５ｍｇのＥＤＣ及び３０ｍｇのＮＨＳを含有する５ｍＬのＭＥＳ緩衝液をヘパリン溶液に加えて、カルボン酸基を活性化させた。その溶液を室温で１時間反応させた後、１ｍＬのＭＥＳ中の２５ｍｇのＡＰＭＡを加え、室温で２時間反応させた。次に、ＨｅｐＭＡ溶液を、６～８ｋＤａの分子量カットオフを有する透析チューブ（米国カリフォルニア州ランチョ・ドミンケス、スペクトラム・ラボラトリーズ社（Spectrum Laboratories））を使用して、脱イオン水に対して室温で３日間透析した。その後、凍結乾燥させ、－８０°Ｃで保存した。
【0017】
生体活性インプラントデバイスの例を以下に示す。例えば、ＢＭＰ－２含有ヒドロゲルを担持するポリカプロラクトン－β－リン酸三カルシウム（ＰＣＬ－ＴＣＰ）フィラメントを、図２Ａ～Ｐに示すようにして作製した。重量比８０：２０（ｗ／ｗ）、直径０．９ｍｍのＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントを上述のようにして合成し、手作業で切断して１５ｍｍのフィラメントを作製し、５ＮのＮａＯＨ溶液に６時間浸漬させた。続いて、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄し、表面のカルボン酸基を活性化させるために、ＥＤＣ（５ｍｇ／ｍＬ）及びＮＨＳ（５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）中で、室温で３０分間インキュベートした。次に、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄し、ＭＥＳ緩衝液中のメタクリル酸ゼラチン（ＧｅｌＭＡ）２％溶液中で、３７°Ｃで１時間インキュベートした。次いで、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄して未反応のＧｅｌＭＡを除去し、ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣ／ＮＨＳ（５ｍｇ／ｍＬ）中で、室温で１５分間インキュベートした。続いて、ＧｅｌＭＡでコーティングしたフィラメントを、脱イオン水で３回洗浄し、真空下で乾燥させた。次に、ＧｅｌＭＡでコーティングしたフィラメントを、６０°Ｃの脱イオン水（１００ｍｇ／ｍＬ）中のＣａＳＯ４懸濁液に浸漬させ、３０秒間超音波処理した。次いで、フィラメントを２４ウェルプレートのウェルに移し、真空下で乾燥させた。乾燥したフィラメントを、脱イオン水中にＧｅｌＭＡ（１５％）、アルギン酸（１．２５％）、ＰＥＧＤＭＡ（２％）、ＨｅｐＭＡ（１％）、タンパク質（ＢＭＰ－２、２００μｇ／ｍＬ）、及び光開始剤（０．３％）を含有する９６ウェルプレートのウェルに、３７°Ｃで２分間浸漬させた。ヒドロゲル担持フィラメントを溶液から取り出し、別の９６ウェルプレートの乾燥したウェル中に５分間放置した。その後、ヒドロゲル担持フィラメントに可視光を１５分間照射して、ＧｅｌＭＡ、ＰＥＧＤＭＡ、及びＨｅｐＭＡを共有結合的に架橋させた。架橋したヒドロゲル担持フィラメントを、凍結乾燥させ、－８０°Ｃで保存した。
【0018】
ラット骨輸送モデルを用いた、骨再建を促進するための生体活性インプラントデバイスのインビトロでの検証の一例を、図３Ａ～Ｈ、図４Ａ～Ｃ、図５Ａ～Ｃ、図６Ａ～Ｆ、及び、図７に示す。図３Ａ～Ｈは、カスタマイズされた金属製の仮骨延長術用の固定器による骨輸送のエクスビボ及びインビトロでの実証を示す。図４Ａ～Ｃは、術後３４日目（ＰＯＤ３４）または術後５５日目（ＰＯＤ５５）に採取した大腿骨試料の肉眼的観察及び癒合率を示す。図５Ａ～Ｃは、マイクロＣＴ分析で測定した、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における、患部大腿骨の３Ｄ再構成画像及び定量的骨量データを示す。図６は、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における、３点曲げ試験によって測定した患部大腿骨の機械的特性を、その対側の部分で正規化して示す。図７は、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における、患部大腿骨の代表的な組織学的結果を示す。
【0019】
機械的特性は、６μｇのＢＭＰ２を担持した髄内釘（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、ＰＯＤ３４において、ブランク対照（ＢＬＫ）群と比較した場合は、正規化した最大担持率で２６．６％（Ｐ＜０．００１）、正規化したヤング率で１１．６％（Ｐ＜０．００１）、正規化したエネルギー吸収率で３１％（Ｐ＜０．００１）であり、髄内釘（ＩＭＮ）群と比較した場合は、正規化した最大担持率で２６．１％（Ｐ＜０．００１）、正規化したヤング率で１１．３％（Ｐ＜０．００１）、正規化したエネルギー吸収率で３０．５％（Ｐ＜０．００１）であった（図６Ａ～Ｆ）。しかしながら、ＰＯＤ３４において、２μｇのＢＭＰ２を担持した髄内釘（ＩＭＮ＋Ｂ２）群と比較した場合、（ＩＭＮ＋Ｂ６）群の機械的特性に有意差は見られなかった（図６Ａ～Ｆ）。
【0020】
組織学的データは、ドッキング部位及び再建部位を含む患部大腿骨の縦断像を示す（図７）。結果から、ＢＬＫ群及びＩＭＮ群では、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、ドッキング部位に軟部組織の介在が認められた（図７）。しかしながら、（ＩＭＮ＋Ｂ２）及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、ドッキング部位に骨癒合が認められ、軟部組織の介在は認められなかった（図７）。すべての群において、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、再建部位に新生骨が認められたた（図７）。ＢＬＫ及びＩＭＮ群の試料のいくつかで、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ３５において、ピントラック感染が認められた（図７）。（ＩＭＮ＋Ｂ２）群では、ＰＯＤ５５において、ドッキング部位だけでなく、再建部位でも皮質骨及び骨梁が明瞭に認められ、骨再形成の促進が示された（図７）。また、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、移植部位に、非常に多量の新生骨が認められた（図７）。
【0021】
本開示の実施形態は、骨の治療のために成長因子を送達するための髄内インプラントデバイスとして適用することができる。例を以下に示す。
・骨輸送術の補助として、長骨欠損の治療のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、
・骨延長術の補助として、骨変形の矯正のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、
・癒合不全の治療または予防のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、または、
・骨輸送または骨延長のための抗生物質を担持した金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント。
・骨輸送術の補助として、長骨欠損の治療のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、
・骨延長術の補助として、骨変形の矯正のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、
・癒合不全の治療または予防のために成長因子を送達するための金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント、または、
・骨輸送または骨延長のための抗生物質を担持した金属、ポリマー、または複合材料製のインプラント。
【0022】
本開示の実施形態は、整形外科の分野において依然として大きな課題である高エネルギー外傷、デブリードマン処置、または腫瘍切除に起因する分節性骨欠損の分野において有益である。機械的支持と骨再建との複合機能により、自家骨移植または同種骨移植が、分節性骨欠損を再建するための伝統的な方法と見なされてきた。しかしながら、これらの処置は、通常、患者の可動性を低下させ、複数回の手術を必要とし、限られた程度の骨欠損の再建にしか効果がない。骨折の固定または再建のための近代的な患肢救済手術は、何十年もの間、大きな骨欠損の治療に用いられてきた。特に、仮骨延長術（ＤＯ）とも呼ばれるイリザロフ法は、大きな骨欠損の治療における比較的成熟した患肢救済手術である。この手術は、骨切りした後、外固定器または内固定器を介して骨を延長する。治療の種類に応じて、イリザロフ法は、急性短縮術及び延長術（単焦点アプローチ）、一重レベル骨輸送（二重焦点アプローチ）、及び、二重レベル骨輸送（三重焦点アプローチ）の３つのカテゴリーに分類される。小さなサイズの骨欠損（通常＜２ｃｍ）の治療では、骨延長の前に骨欠損を直接閉鎖する単焦点アプローチが推奨されている。
【0023】
しかしながら、骨欠損の大きさが３ｃｍを超える場合、急性短縮は軟部組織に影響を及ぼし、血管系を損傷し、四肢虚血をもたらす恐れがある。二焦点アプローチは、欠損部位から離れた部位での骨切り術を用いる。その後、中節間セグメントを皮質骨切除部位から離れる方向に移動させ、欠損部位で圧迫して最適な骨長を維持する。三焦点アプローチでは、欠損部の圧迫に加えて、２回の延長骨切り術を行う。二焦点アプローチまたは三焦点アプローチは、四肢の不一致や軟部組織の収縮を伴わないより大きな骨欠損の治療において、いくつかの利点を示している。しかしながら、骨輸送術には、ピントラック感染、ドッキング部位の癒合不全、及び、不十分な骨硬化などの欠点が依然として存在する。これらの欠点のうちで、ドッキング部位の癒合不全は、骨輸送術を施したほぼすべての患者に認められた。ドッキング部位の不活発な骨接触及び軟部組織の侵入は、偽関節を形成する傾向がある。ドッキング部位での最終的な骨再建を達成するためには、二次的なデブリードマン処置及び骨移植手術が常に不可欠である。近年、外固定期間を短縮する方法としての、金属製の髄内釘（ＩＭ釘）を使用した骨輸送を取り上げた報告が増加している。
【0024】
しかしながら、金属製のＩＭ釘が、早期骨硬化を達成したり、ドッキング部位の癒合不全を低下させたりすることを示唆する信頼できるエビデンスは存在しない。また、金属製のＩＭ釘を使用した場合には、金属製のＩＭ釘を除去するために追加の手術が必要となる。
【0025】
本開示による生体活性インプラントデバイスは、ドッキング部位の癒合不全や骨硬化の遅延などの重大な臨床的課題に対処するために、利用可能な調節経路、製造プロセス、流通、及び臨床的適用性を考慮して開発された。第１に、本開示の生体活性インプラントデバイスは、ＦＤＡの認可を受けた材料及び成長因子をベースとしており、迅速な５１０（Ｋ）調節経路に適用可能である。第２に、本開示の生体活性インプラントデバイスは、現在の外科的治療と互換性があり、エンドユーザである整形外科医が容易に適応できる。第３に、本開示の生体活性インプラントデバイスは、長骨欠損、骨変形、または骨癒合不全の治療のための骨切りや骨折固定に必要とされる１回の手術で移植することができる。髄内デバイスは、骨セグメントの近位端部や遠位端部に挿入してもよいし、または、骨トンネルを介して低侵襲的な方法で挿入してもよい。本開示の生体活性インプラントデバイスは、固定ピンによって、原位置に固定することができる。第４に、骨癒合不全部位の組織を除去し、骨輸送ＤＯに同種移植片を移植するための二次的手術が不要である。骨癒合不全のための手術中に、同種移植は必要としない。生分解性生体材料から作製した場合、本開示の生体活性インプラントデバイスは、生分解性である。金属材料から作製した場合、本開示の生体活性インプラントデバイスは、機械的支持を提供することができる。第５に、本開示の生体活性インプラントデバイスの保管及び輸送条件は良好であり、製造業者、流通業者、及びエンドユーザである外科医にとって便利である。
【0026】
本開示の生体活性インプラントデバイスのスキャフォールドは、ポリマー、金属、または複合材料から作製することができる。本開示の生体活性インプラントデバイスは、様々な表面処理を施した後、用途に応じて、様々な用量の様々な成長因子を担持したヒドロゲルでコーティングすることができる。
【0027】
一実施形態では、治療薬の放出を遅らせるために、生体活性インプラント（例えば、ＨｙＴＥＣ構築物）を、吸収性ポリエステル（例えば、ＰＣＬ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ）、または他の吸収性ポリマー（例えば、ポリウレタン）でコーティングすることができる。ＨｙＴＥＣは、ハイブリッド組織工学的構築物（hybrid tissue engineered construct）の略称であり、生体活性インプラントである。ＨｙＴＥＣ構築物のコーティングに用いられる方法の概略図を図８に示す。例えば、タンパク質担持ＨｙＴＥＣを、－８０°Ｃで一晩凍結させ、次いで、－２０°Ｃで１０分間凍結させた後、アセトンまたはクロロホルム（２％～２０％）中のＰＣＬ溶液に浸漬させて、ＨｙＴＥＣの表面にＰＣＬ層を堆積させ、修飾されたＨｙＴＥＣ（ｍＨｙＴＥＣ）を作製する。その後、ＰＣＬでコーティングされたＨｙＴＥＣを、０～４°Ｃで風乾させる。ＰＣＬ溶液の濃度や、堆積させるＰＣＬ層の数を変えることにより、ｍＨｙＴＥＣ構築物の物理的性質とタンパク質の放出速度を調節することができる。１層のＰＣＬコーティング（ｍＨｙＴＥＣ（１Ｌ））または３層のＰＣＬコーティング（ｍＨｙＴＥＣ（３Ｌ））を施したｍＨｙＴＥＣの代表的な画像を図９に示す。コーティングなしのＢＳＡ担持ＨｙＴＥＣでは、１４日後に、カプセル化されたＢＳＡの９２％が該ＨｙＴＥＣから放出されたが、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して１層または３層の保護ＰＣＬコーティングを形成すると、ＢＳＡ放出率は、７０日後の９２％または９１日後の８０％に減少した（図１０）。また、ＰＢＳ中で２８日後にＢＭＰ２担持ＨｙＴＥＣ構築物から放出された骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）タンパク質の量は、１層または３層のＰＣＬコーティングを堆積させた場合には、８４％から、６２％または２４％に減少した（図１１）。
【0028】
別の特徴付けでは、本発明は、以下のように説明することができる。仮骨延長術は、大きな分節性骨欠損の治療に対する最も成功した外科的アプローチの１つである。しかしながら、顕著な合併症として、特に骨輸送術を伴う場合には、骨硬化の長期化、及び、ドッキング部位の癒合不全が挙げられる。後者の場合、骨架橋を達成するために、骨移植の二次的手術が常に必要となる。そのため、本発明者らは、上記の骨輸送術の臨床的課題に対処するための補助療法として、生分解性インプラントから骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を溶出させることによって、骨誘導性の生分解性髄内（ＩＭ）釘を作製した。概念実証のために、本発明者らはＩＭ釘を作製し、ラット長骨輸送モデルで試験した。まず、ポリカプロラクトン－リン酸三カルシウム（ＰＣＬ－ＴＣＰ）フィラメントを、ＢＭＰ－２（２μｇまたは６μｇ）を担持したゼラチンメタクリロイル－アルギン酸（ＧｅｌＭＡ－アルギン酸）ヒドロゲルでコーティングして、ＩＭ釘を作製した。ＩＭ釘におけるＢＭＰ－２の放出特性を、凍結乾燥及び滅菌後に測定した。次に、ＩＭ釘の有効性を、ラット大腿骨骨輸送モデルで評価した。治癒過程を、毎週、Ｘ線で観察した。術後３４日目または術後５５日目に、試料を採取し、ピントラック感染及びセグメント架橋を肉眼的に観察し、ドッキング部位での新骨形成の機械的特性、微細構造、及び形態などを評価した。その結果、ＢＭＰ－２は、２１日間にわたって、ＩＭ釘から持続的に放出されることが分かった。大腿骨輸送モデルでは、ドッキング部位及び再建部位の両方で、ピントラック感染と不十分な骨硬化が首位よく認められた。ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群の骨量及び３点曲げ機械的強度は、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、外科的対照群と比較して有意に大きかった。また、ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘は、ピントラック感染が減少し、ドッキング部位の骨癒合が促進された。組織学的データでも、ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群はミネラル付着率が高く、ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘の優れた効果が確認された。骨癒合効果については、２つのＢＭＰ－２含有量の間に、有意差は認められなかった。全体として、生分解性ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘インプラントは、二次的手術が不要であり、仮骨延長術（ＤＯ）において、骨硬化を有意に促進し、ピン感染を減少させ、ドッキング部位の癒合率を改善し、荷重能力を高め、かつ、外固定器の早期除去をもたらすことが、実験により実証された。この補助療法技術は、将来、大きい骨欠損の治療及び患肢救済手術における骨輸送術を活性化させ、革命を起こすことが大いに期待される。
【0029】
本開示によれば、骨欠損、骨変形、または骨癒合不全を再建する方法が提供される。本開示の方法は、生体活性整形外科用インプラントを用意するステップを有する。生体活性整形外科用インプラントは、（ｉ）表面特性を改質するために処理された表面を有するロッドと、（ｉｉ）ロッドの表面に荷電ポリマー及び塩イオンを介して物理的に架橋された、凍結乾燥した親水性ヒドロゲルネットワークと、（ｉｉｉ）親水性ヒドロゲルネットワークに捕捉され、それによって、該ヒドロゲルネットワークに担持された生物学的物質と、（ｉｖ）親水性ヒドロゲルネットワーク自体、及び、ロッドの表面に対する親水性ヒドロゲルネットワークの物理的な架橋を強化するために、親水性ヒドロゲルネットワークに化学的に架橋された共有結合反応性マクロモノマーと、を含む。また、本開示の方法は、生体活性整形外科用インプラントを、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位に移植するステップを有する。生体活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への移植に適合する大きさを有する。あるいは、生体活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への髄内移植に適合する大きさを有する。ロッドは、相互接続された多孔性ロッドであり得、その場合、相互接続された多孔性ロッドは、多孔性スキャフォールド／ロッドにおける中央または内部チャネルの実施形態を含む。生体活性整形外科インプラントのコーティングは、ロッドの全体または部分的に施すことができる。したがって、ロッドの異なるセグメントに対して、異なるコーティングを施すこともできる。これらはすべて、所望される再建のタイプに依存することは、当業者であれば容易に理解できるであろう。加えて、生体活性整形外科用インプラントは、１以上の（追加の）コーティング層をさらに含むことができる。さらなる実施形態では、ロッドは、相互接続された多孔性ロッドであり、生物学的物質は、相互接続された多孔性ロッドの細孔に担持される。
【0030】
また、本開示によれば、生物活性整形外科用インプラントが提供される。本開示の生物活性整形外科用インプラントは、（ｉ）表面特性を改質するために処理された表面を有するロッドと、（ｉｉ）ロッドの表面に荷電ポリマー及び塩イオンを介して物理的に架橋された、凍結乾燥した親水性ヒドロゲルネットワークと、（ｉｉｉ）親水性ヒドロゲルネットワークに捕捉され、それによって、該ヒドロゲルネットワークに担持された生物学的物質と、（ｉｖ）親水性ヒドロゲルネットワーク自体、及び、ロッドの表面に対する親水性ヒドロゲルネットワークの物理的な架橋を強化するために、親水性ヒドロゲルネットワークに化学的に架橋された共有結合反応性マクロモノマーと、を含む。生体活性整形外科インプラント（ロッド）の表面は、共有結合性分子でコーティングされており、共有結合性分子は、ロッドの表面に化学的及び物理的に架橋された親水性ヒドロゲルネットワークのロッドに対する接着性を高めるために、共有結合反応性マクロモノマーに化学的に架橋されている。ロッドは、相互接続された多孔性ロッドであり、生物学的物質は、相互接続された多孔性ロッドの細孔に担持される。生物活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への移植に適合する大きさを有する。あるいは、生体活性整形外科用インプラントは、２つの骨セグメント間、骨トンネル内、または骨折部位への髄内移植に適合する大きさを有する。生体活性整形外科インプラントのコーティングは、ロッドの全体または部分的に施すことができる。したがって、ロッドの異なるセグメントに対して、異なるコーティングを施すこともできる。これらはすべて、所望される再建のタイプに依存することは、当業者であれば容易に理解できるであろう。加えて、生体活性整形外科用インプラントは、１以上の（追加の）コーティング層をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
必要に応じて、図面中のグレースケールのさらなる解釈のために、読者は各図に関する優先権書類を参照されたい。
【0032】
【図1A】図１Ａ～Ｄは、本発明の例示的な実施形態による、３つの条件下での骨治癒のための生体活性インプラントデバイスの概略図を示す。「青色」は、ヒドロゲルコーティングを表す。インプラントデバイスにおける「白い点」は、多孔性構造を表す。図１Ａは、インプラント上の骨輸送を示す。インプラントの両端部は、２本の固定ピンで固定される。
【図2J】図２Ｊは、ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの引張弾性率に対する、凍結／解凍または超音波処理を伴わない化学処理（ｃｈｅｍ；Ｂｌ）、凍結／解凍を伴うが超音波処理は伴わない化学処理（ｃｈｅｍ＋ＦＴ；Ｇ）、または、凍結／解凍及び超音波処理を伴う化学処理（ｃｈｅｍ＋ＦＴ＋ｓｏｎｉｃ；Ｒ）の影響を示す。対照群は、何も処理しない（未処理、Ｂ）のＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントであった。
【図2K】図２Ｋは、ヒドロゲルコーティングなしのＰＣＬ－ＴＣＰフィラメント（ロッド；Ｂｒ）、ヒドロゲルコーティングを有するがＢＭＰ－２を含有しないフィラメント（ロッド＋ゲル；Ｂｌ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルコーティングを有するフィラメント（ロッド＋ゲル／２μｇＢＭＰ－２；Ｇ）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルコーティングを有するフィラメント（ロッド＋ゲル／６μｇＢＭＰ－２；Ｒ）の重量（図２Ｋ）を示す。
【図2L】図２Ｌは、ヒドロゲルコーティングなしのＰＣＬ－ＴＣＰフィラメント（ロッド；Ｂｒ）、ヒドロゲルコーティングを有するがＢＭＰ－２を含有しないフィラメント（ロッド＋ゲル；Ｂｌ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルコーティングを有するフィラメント（ロッド＋ゲル／２μｇＢＭＰ－２；Ｇ）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルコーティングを有するフィラメント（ロッド＋ゲル／６μｇＢＭＰ－２；Ｒ）の重量パーセンテージの変化を示す。
【図2P】図２Ｐは、２μｇのＢＭＰ－２を含有する保存した（Ｂｌ）または未処理（Ｇ）の凍結乾燥ヒドロゲルを担持したインプラントから２８日間に放出されたＢＭＰ－２の量を示す。図２Ｋ及び図２Ｌのデータについては、１群当たり８つの試料であった。図２Ｊ、図２Ｏ及び図２Ｐのデータについては、１群当たり３つの試料があった。図２Ｊ、図２Ｏ、図２Ｐに示すデータは、平均±ＳＤに対応する。図２Ｋ及び図２Ｌに示すデータは、平均及び９５％信頼区間に対応する。
【図3A】図３Ａ～Ｈは、本発明の例示的な実施形態による、カスタマイズされた金属製の創外固定器による骨輸送のエクスビボ及びインビボでの実証を示す。図３Ａは、片側創外固定器フレームの概略設計を示す（縦断面または側面図）。
【図4A】図４Ａ～Ｃは、本発明の例示的な実施形態による、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５に採取した大腿骨試料の肉眼的観察及び癒合率を示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘単独群（ＩＭＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇｍのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。図４Ａは、大腿骨試料の肉眼図である。白色の矢印は、ドッキング部位を指す。２本の白色の破線は、再建部位を示す。
【図4C】図４Ｃは、屠殺前に、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５で評価したピントラック染率を示す（ｎ＝８）。ピントラック感染は、Ｃｈｅｃｋｅｔｔｓ－Ｏｔｔｅｒｂｕｒｎ分類にしたがって分類した。屠殺前の数匹では、１匹に１～２本のピンの緩みを含む軽微なピントラック感染のみが認められた。
【図5A】図５Ａ～Ｃは、本発明の例示的な実施形態による、マイクロＣＴ分析によって測定した、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における患部大腿骨の３Ｄ再構成画像及び定量的骨量データを示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘単独群（ＩＭＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。図５Ａは、患部大腿骨の代表的な３Ｄ画像（縦半分カット）を示す。ドッキング部位または再建部位の２つの関心領域（ＲＯＩ）は、緑色の破線の長方形または黄色の破線の長方形で強調表示した。
【図5C】図５Ｃは、ＰＯＤ５５におけるドッキング部位または再建部位の骨量（ＢＶ／ＴＶ）の定量的データを示す。データは、ＢＶ／ＴＶ及びＳＤの正規化平均値で示す（各時点につき、ｎ＝８）。ａＰ＜０．０５、ａａＰ＜０．０１、ａａａＰ＜０．００１、対ＢＬＫ群；ｂＰ＜０．０５、ｂｂＰ＜０．０１、ｂｂｂＰ＜０．００１、対ＩＭＮ群。
【図6A】図６Ａ～６Ｆは、本発明の例示的な実施形態による、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５において、患部大腿骨の３点曲げ試験によって測定した機械的特性を、対側の部分で正規化して示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘単独群（ＩＭＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。正規化した最大荷重率、ヤング率、エネルギー吸収率などの機械的パラメータを示す。図６Ａは、ＰＯＤ３４における機械的特性の結果を示す。
【図6F】図６Ｆは、ＰＯＤ５５における機械的特性の結果を示す。データは、平均値及び標準偏差で示す（各時点につき、ｎ＝８）。ａＰ＜０．０５、ａａＰ＜０．０１、ａａａＰ＜０．００１、対ＢＬＫ群；ｂＰ＜０．０５、ｂｂＰ＜０．０１、ｂｂｂＰ＜０．００１、対ＩＭＮ群。
【図7】図７は、本発明の例示的実施形態による、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における患部大腿骨の代表的な組織学的結果を示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘のみの群（ＩＭＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。赤色の破線の長方形は、ドッキング部位を示す。黄色の破線の長方形は、再建部位を示す。この図の組織学には、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及びマッソントリクローム染色が含まれる。
【図9】図９は、本発明の例示的な実施形態による、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を用いて作製した、１層のＰＣＬコーティング（ｍＨｙＴＥＣ（１Ｌ））または３層のＰＣＬコーティング（ｍＨｙＴＥＣ（３Ｌ））を有するｍＨｙＴＥＣの画像を示す。
【図10】図１０は、本発明の例示的な実施形態による、ＰＣＬ保護コーティングなしの場合（対照）、ＰＣＬ／クロロホルム（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された１層のＰＣＬコーティングを有する場合（ＰＣＬ／クロロホルム：１Ｌ）、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された１層のＰＣＬコーティングを有する場合（ＰＣＬ／アセトン：１Ｌ）、ＰＣＬ／クロロホルム（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された３層のＰＣＬコーティングを有する場合（ＰＣＬ／クロロホルム：３Ｌ）、及び、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された３層のＰＣＬコーティングを有する場合（ＰＣＬ／アセトン：３Ｌ）における、ＨｙＴＥＣ構築物からのＢＳＡの放出動態を示す。
【図11】図１１は、本発明の例示的な実施形態による、ＰＣＬ保護コーティングなしの場合、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された１層のＰＣＬコーティングを有する場合（ｍＨｙＴＥＣ（１Ｌ））、及び、ＰＣＬ／アセトン（１０％ｗｔ／ｖ）溶液を使用して作製された３層のＰＣＬコーティングを有する場合（ｍＨｙＴＥＣ（３Ｌ））における、ＨｙＴＥＣ構築物（ＨｙＴＥＣ）からのｒｈＢＭＰ２の放出動態を示す。
【図12】図１２は、本発明の例示的な実施形態による、ＰＯＤ５からＰＯＤ３４までの患部大腿骨のインビボ動的Ｘ線画像を示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘単独群（ＩＭＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。白色の矢印は、ＰＯＤ５における骨輸送前の骨欠損部位を示す。赤色の矢印は、ＰＯＤ１３～３４（３週間後の強化後）における骨輸送後の骨欠損部位を示す。
【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、本発明の例示的な実施形態による、ＰＯＤ３４における患部大腿骨の組織形態計測の結果を示す。動物群には、ブランク対照群（ＢＬＫ）、ＩＭ釘単独群（ＩＭＩＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６）が含まれる。白色の矢印は、緑色蛍光色素と赤色蛍光色素との間の距離を示し、屠殺前の１０日間のミネラル付着を表している。
【図13B】データは、平均値及び標準偏差で示した（ｎ＝３）。ａｐ＜０．０５、ａａｐ＜０．０１、ａａｐ＜０．００１、対ＢＬＫ群；ｂｐ＜０．０５、ｂｂｐ＜０．０１、ｂｂｐ＜０．００１、対ＩＭＮ群。
【図14】図１４は、本発明の例示的な実施形態による、ＰＯＤの患部大腿骨のドッキング部位の骨膜における、オステオカルシン（ＯＣＮ）、骨形成タンパク質受容体ＩＩ（ＢＭＰＲＩＩ）、または、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現を示す。動物群には、ＩＭ釘のみの群（ＩＮ）、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ２）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＮ＋Ｂ６）が含まれる。白色の矢印は、免疫蛍光で染色した骨形成マーカーＯＣＮ、ＢＭＰＲＩＩ、または骨膜幹細胞マーカーα－ＳＭＡの陽性発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
定義
【0034】
以下の詳細な説明は、組織工学的構築物を作製／製造する方法、及び組織工学的構築物の構造的特徴の例示的な実施形態である。一般に、以下の用語の定義は、本発明の範囲内で指針として用いることができる。
・スキャフォールドとは、ポリマー、セラミック、金属、または複合材料から作製される多孔性または非多孔性の３次元構築物として定義される。
・表面の処理としては、塩基（例えば、ＮａＯＨ）処理、酸処理、プラズマ処理、凍結／融解などの方法が挙げられる。
・表面特性を改質するために処理された表面とは、化学的または物理的な処理（例えば、塩基、酸、血漿、凍結／融解などの処理）によって、表面粗さを増大させた表面として定義される。
・表面への化学的架橋を促進にする共有結合性分子とは、表面に結合するための官能基、及び、他の分子に結合することができる別の官能基を有する分子である。例としては、アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、メタクリル酸ゼラチン（ＧｅｌＭＡ）、及びＮ－ヒドロキシコハク酸イミドエステルジアジンなどが挙げられる。
・塩とは、正に荷電したイオン、及び負に荷電したイオンなどを含む化学物質として定義される。例としては、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムなどが挙げられる。表面開始型の物理的架橋を促進（誘起）するために、インプラント（移植片）の表面に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）または硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）を堆積させる。二価カチオンの他の塩（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｒ２＋）、または多価カチオンの他の塩（例えば、Ｔｉ４＋、Ａｌ３＋）を、表面開始型の物理的架橋に使用してもよい。
・ヒドロゲル前駆体溶液とは、架橋性ポリマー及び開始剤を含有する溶液として定義される。
・荷電ポリマーとは、アルギン酸やポリグルタミン酸などの、負または正の電荷を有するポリマーとして定義される。
・共有結合反応性マクロモノマーとは、化学反応性基を有するポリマー分子として定義される。
・開始剤とは、化学反応を開始させる化学物質として定義される。例としては、光開始剤（例えば、フェニル－２、４、６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム）、及び化学開始剤（例えば、過硫酸アンモニウム）などが挙げられる。
・生物学的物質とは、インビトロで相互作用することができる任意の分子または生物と定義される。例としては、タンパク質、ペプチド、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬物、抗生物質などが挙げられる。
・１層以上のコーティングとは、１０～１０００μｍの範囲の厚さを有する単一の層のコーティング、または、それぞれ１０～１０００μｍの範囲の厚さを有する複数の層のコーティングとして定義される。
・組織工学とは、骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉、心臓、心臓弁などの硬組織または軟組織のエンジニアリングまたは再建（再生）と定義される。
・スキャフォールドとは、ポリマー、セラミック、金属、または複合材料から作製される多孔性または非多孔性の３次元構築物として定義される。
・表面の処理としては、塩基（例えば、ＮａＯＨ）処理、酸処理、プラズマ処理、凍結／融解などの方法が挙げられる。
・表面特性を改質するために処理された表面とは、化学的または物理的な処理（例えば、塩基、酸、血漿、凍結／融解などの処理）によって、表面粗さを増大させた表面として定義される。
・表面への化学的架橋を促進にする共有結合性分子とは、表面に結合するための官能基、及び、他の分子に結合することができる別の官能基を有する分子である。例としては、アミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、メタクリル酸ゼラチン（ＧｅｌＭＡ）、及びＮ－ヒドロキシコハク酸イミドエステルジアジンなどが挙げられる。
・塩とは、正に荷電したイオン、及び負に荷電したイオンなどを含む化学物質として定義される。例としては、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムなどが挙げられる。表面開始型の物理的架橋を促進（誘起）するために、インプラント（移植片）の表面に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）または硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）を堆積させる。二価カチオンの他の塩（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｒ２＋）、または多価カチオンの他の塩（例えば、Ｔｉ４＋、Ａｌ３＋）を、表面開始型の物理的架橋に使用してもよい。
・ヒドロゲル前駆体溶液とは、架橋性ポリマー及び開始剤を含有する溶液として定義される。
・荷電ポリマーとは、アルギン酸やポリグルタミン酸などの、負または正の電荷を有するポリマーとして定義される。
・共有結合反応性マクロモノマーとは、化学反応性基を有するポリマー分子として定義される。
・開始剤とは、化学反応を開始させる化学物質として定義される。例としては、光開始剤（例えば、フェニル－２、４、６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム）、及び化学開始剤（例えば、過硫酸アンモニウム）などが挙げられる。
・生物学的物質とは、インビトロで相互作用することができる任意の分子または生物と定義される。例としては、タンパク質、ペプチド、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬物、抗生物質などが挙げられる。
・１層以上のコーティングとは、１０～１０００μｍの範囲の厚さを有する単一の層のコーティング、または、それぞれ１０～１０００μｍの範囲の厚さを有する複数の層のコーティングとして定義される。
・組織工学とは、骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉、心臓、心臓弁などの硬組織または軟組織のエンジニアリングまたは再建（再生）と定義される。
【0035】
以下の例示的な説明は、二次的手術、移植、または重篤な合併症なしに、１回の手術で、ＢＭＰを持続的に放出することができる生分解性ＩＭ釘を導入することによって、骨治癒を促進し、骨輸送における癒合不全を低減できるかどうかという問題に取る組んだものである。トランスレーショナル・リサーチ及び本発明の目的は、臨床的に利用可能な外科的アプローチである仮骨延長術と、新規な生体工学的ソリューションである骨誘導性の生分解性ＩＭインプラントデバイスとを組み合わせた単一の治療により、大きな骨欠損の治療における、骨硬化の長期化や不十分さ、及び、骨癒合不全の高い割合などの臨床的課題を解決することである。この目的のために、本発明者らは、第１に、カスタマイズした外固定器を開発することによって、臨床的に意義のあるラット骨輸送モデルを確立した。第２に、本発明者らは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から認証された材料及び成長因子から作製された新規のＢＭＰ－２溶出性の生分解性ＩＭインプラントデバイスを開発し、エクスビボでの徐放効率を調べた。第３に、本発明者らは、確立したラット骨輸送モデルにおいて、骨硬化と、ドッキング部位の癒合とに対する、新規のＢＭＰ－２溶出性ＩＭ釘の効果を調べた。
【0036】
結果
【0037】
髄内釘インプラントの合成及び特性評価
【0038】
骨誘導性の生分解性髄内釘インプラントの作製手順を図２Ａに概略的に示す。ポリカプロラクトン－β－リン酸三カルシウム（ＰＣＬ－ＴＣＰ、重量比８０：２０）のフィラメント（長さ１８．０ｍｍ、各直径１．１ｍｍ）を押出成形した後、図２Ａに示すように、３つの連続したステップによって、ＢＭＰ－２含有ヒドロゲルをフィラメント表面に担持させた。各ステップに対応するＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの表面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を図２Ｂ～Ｉに示す。結果が示すように、ＮａＯＨ処理及び凍結／解凍後のフィラメント表面（図２Ｄ～Ｅ）は、押出成形の直後のフィラメント表面（図２Ｂ～Ｃ）と比較して、粗さ及び微細孔性が高かった。ＧｅｌＭＡコーティング、及びＣａＳＯ４懸濁液中での超音波処理後に、ＣａＳＯ４微小粒子を、フィラメントの表面上に堆積させた（図２Ｆ～Ｇ）。アルギン酸塩の表面開始型の物理的架橋と、それに続く、ＧｅｌＭＡ及びＰＥＧＤＭＡの共有結合架橋とにより、平均孔径８μｍの多孔性ＢＭＰ－２含有ヒドロゲル層を、ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの表面に形成した（図２Ｈ～Ｉ）。ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの引張弾性率に対する、凍結／解凍または超音波処理を伴わない化学処理（ｃｈｅｍ）（ＮａＯＨ処理及びＧｅｌＭＡコーティング）、凍結／解凍を伴うが超音波処理は伴わない化学処理（ｃｈｅｍ＋ＦＴ）、及び、凍結／解凍及び超音波処理を伴う化学処理（ｃｈｅｍ＋ＦＴ＋ｓｏｎｉｃ）の影響を図２Ｊに示す。いずれの処理フィラメント群（ｃｈｅｍ、ｃｈｅｍ＋ＦＴ、ｃｈｅｍ＋ＦＴ＋ｓｏｎｉｃ）と未処理フィラメント群（未処理）との間にも、引張弾性率において、有意差は認められなかった。ヒドロゲルの担持及びＢＭＰ－２の含有が、インプラントの重量に与える影響を、図２Ｋに示す。フィラメントの平均重量は、ヒドロゲル担持により、１５．９ｍｇから３２．３ｍｇに増加した。フィラメント上のヒドロゲルの平均担持率は１１２．５％であり、ヒドロゲルのＢＭＰ－２の含有量が２μｇの場合でも６μｇの場合でも、有意な変化は認められなかった（図２Ｌ）。湿潤または凍結乾燥させた、ＢＭＰ－２含有ヒドロゲルを担持したインプラントの代表的な画像を、図２Ｍ～Ｎにそれぞれ示す。ヒドロゲル層は、凍結乾燥後も無傷であった（図２Ｎ）。凍結乾燥後のヒドロゲル層でコーティングすると、フィラメントの直径は、平均０．９ｍｍから１．２ｍｍに増加した。凍結乾燥ヒドロゲル担持インプラントからの、２μｇまたは６μｇのＢＭＰ－２の、２８日間にわたる放出動態を、図２Ｏに示す。ＢＭＰ－２は、２１日間にわたって持続的にインプラントから放出された。２μｇまたは６μｇのＢＭＰ－２を担持したインプラントから２１日間にわたって放出されたＢＭＰ－２の総量は、１．６μｇ（８０％）または４．３μｇ（７１．７％）であり、２１日目以降は有意な変化は認められなかった。各時点において、６μｇのＢＭＰ－２を担持したインプラントから放出されたタンパク質の量は、２μｇのＢＭＰ－２を担持したインプラントから放出されたタンパク質の量と比べて有意に高かった。凍結乾燥させたＢＭＰ－２担持インプラントの保存性を評価するために、４°Ｃで２ヵ月保存した後の凍結乾燥インプラントからのＢＭＰ－２の放出動態を測定し、未処理の凍結乾燥インプラントからのＢＭＰ－２の放出動態と比較した（図２Ｐ）。２８日間のどの時点においても、未処理のインプラントから放出されたＢＭＰ－２の総量と、保存したインプラントから放出されたＢＭＰ－２の総量との間に、統計的な有意差は認められなかった。
【0039】
骨輸送における髄内釘（ＩＭ釘）のエクスビボ移植またはインビトロ移植
【0040】
創外固定器の動作性能を、成体ＳＤラットの大腿試料を用いて、エクスビボで調べた。まず、基本的な創外固定器をベースにして、２つの固定端部と、その間に設けられた１つの可動部とを有する骨延長フレームを設計した（図３Ａ）。金属製の創外固定器は、片側フレームと、５つの固定ピンとから構成される（図３Ｂ）。続いて、この固定器を使用して、大腿骨試料の近位端及び遠位端を固定し、両端間でＩＭ釘を介して、骨スライスを順方向または逆方向のいずれかに輸送した（図３Ｃ～Ｆ）。カスタマイズしたドリルガイドによって、大腿骨の外側部位に５本のピンを刺入した。大腿骨骨幹部で８ｍｍの骨切りを行った。骨輸送のために、４ｍｍの皮質切開も行った。次に、４ｍｍの骨スライスを、第１皮質層に刺入した固定ピンで固定した。ＩＭ釘を髄管に挿入し、ＩＭ釘の両端を２つの近接した固定ピンで固定し、４ｍｍの骨スライスの髄管に貫通させた。なお、中間のピンは、髄管内のＩＭ釘と接触することなく挿入されることに留意されたい。手術中、ＢＭＰ－２コーティングの有無にかかわらず、ＩＭ釘を動物に移植した（図３Ｇ～Ｈ）。手術後、動物に、ＤＯ処置を施した。ＤＯ処置の治療期間は、５日間の待機期間、８日間の延長期間、及び、２１日間（３週間）または４２日間（６週間）の硬化期間の３つの段階からなる。
【0041】
ＰＯＤ５５（６週間の硬化期間後）に記録した歩行能力から、本発明者らは、ＢＭＰ－２を含有しないＩＭ釘を移植した動物は歩行能力が不良であり、その１週間前（ＰＯＤ４８）に固定具を取り外した後に麻痺性歩行さえ示したことを見出した。驚くべきことに、ＢＭＰ－２（２μｇ）でコーティングしたＩＭ釘を移植し、ＰＯＤ４８に固定器を除去すると、動物は速く滑らかに動いた。ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５に、固定器に連結した大腿骨試料を慎重に採取し、さらなる評価のために保存した（図４Ａ）。
【0042】
採取後の試料を肉眼的に観察した。図４Ａ～Ｂに示すように、大腿骨試料の大部分で、ブランク対照（ＢＬＫ）及びＩＭ釘のみ（ＩＭＮ）群ではドッキング部位で癒合不全を示し、ＢＬＫ群ではＰＯＤ３４の１２．５％からＰＯＤＳ５の２５％に癒合率が増加し、ＩＭＮ群ではＰＯＤ３４の０％からＰＯＤ５５の３７．５％に癒合率が増加した。また、ＢＬＫ及びＩＭＮ群のいくつかの試料で、ドッキング部位に偽関節が認められた（図４Ａ）。驚くべきことに、すべての大腿骨試料において、２μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＩＮ＋Ｂ２、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５）、及び、６μｇのＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘群（ＩＭＮ＋Ｂ６、ＰＯＤ３４）では、ドッキング部位で１００％の癒合を示した（図４Ａ～Ｂ）。また、すべての試料における骨輸送後の再建部位は、１００％の癒合を達成したことが分かった。試料の癒合率は、マイクロコンピューター断層撮影（ＣＴ）分析によって二重に確認した。
【0043】
３週間または６週間の硬化期間後、動物はピン部位で軽微な感染を示したが、重大な感染は見られなかった（図４Ｃ）。しかしながら、本発明者らは、ＢＭＰ－２コーティングなしの（ＢＭＰ－２を含有しない）ＩＭ釘を移植した場合、多くの動物に軽微なピントラック感染が見られた。ピントラック感染は、屠殺前の固定器の解体工程中に測定した。一部の動物でピンの緩みが認められたが、試験期間中は外固定を継続することができた。その結果、ＢＬＫ群ではＰＯＤ３４で２５％またはＰＯＤ５５で５０％、ＩＭＮ群ではＰＯＤ３４で３７．５％またはＰＯＤ５５で５０％のピントラック感染率が認められた（図４Ｃ）。興味深いことに、ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘を移植した場合、ＢＭＰ－２の含有量や屠殺時点にかかわらず、感染は生じなかった（図４Ｃ）。
【0044】
骨治癒の２Ｄ及び３Ｄでの放射線学的評価
【0045】
動的Ｘ線イメージングを行い、骨の治癒過程を観察した。図１２に示すように、５日間の待機期間の後（ＰＯＤ５）、８ｍｍの骨欠損が、各動物で認められた。８日間の延長期間の後（ＰＯＤ１３）、８ｍｍの骨欠損が、各動物の他の部位で認められた。一週間の硬化期間の後（ＰＯＤ２０）、（ＩＭＩＮ＋Ｂ２）群及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）群の欠損部位で、仮骨が認められた（図１２）。ＢＭＰ－２を含有する２つの群における仮骨のミネラル密度は、硬化期間（ＰＯＤ２０～ＰＯＤ１２）を通じて徐々に増加した（図１２）。一方、ブランク対照群またはＩＭ釘のみの群では、ＰＯＤ３４まで、ごく限られた程度の仮骨形成しか認められなかった（図１２）。
【0046】
マイクロＣＴ分析を行い、患部大腿骨の３Ｄ画像を再構成し、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５における２つの関心領域（ＲＯＩ）、すなわち骨欠損部位及びドッキング部位における定量的骨量を測定した。結果が示すように、ＢＬＫ群及びＩＭＮ群では、ＰＯＤ３４とＰＯＤ５５において、ドッキング部位に癒合不全が認められた（図５Ａ～Ｃ）。対照的に、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群（正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋３０．１％、ＰＯＤ３４でＰ＜０．００１；正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋５３．４％、ＰＯＤ５５でＰ＜０．０５）、及び、（ＩＭＩＮ＋Ｂ６）群（正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋３５．２％、ＰＯＤ３４でＰ＜０．００１）では、ＩＭＮ群と比較して、ドッキング部位での明らかな骨融合及び骨量の顕著な増加が認められた（図５Ｂ～Ｃ）。ＢＬＫ群と比較すると、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５において、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群では、正規化ＢＶ／ＴＶにおいて３６．８％（Ｐ＜０．００１）または３０．５％（Ｐ＜０．００１）の顕著な増加が認められ、（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、正規化ＢＶ／ＴＶにおいて４１．９％（Ｐ＜０．００１）または５７．０％（Ｐ＜０．００１）の有意な増加が認められた（図５Ｂ～Ｃ）。また、すべての群で、再建部位に新生骨が認められた（図５Ａ）。（ＩＭＮ＋Ｂ２）群（正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋１６．１％、ＰＯＤ３４でＰ＜０．０５；正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋２６．１％、ＰＯＤ５５でＰ＜０．０５）、及び、（ＩＭＮ＋Ｂ６）群（正規化ＢＶ／ＴＶにおいて＋１３．２％、ＰＯＤ３４でＰ＜０．０５）では、ＩＭＮ群（図５Ｂ～Ｃ）と比較して、再建部位で骨量の有意な増加が認められた。再建部位では、ＰＯＤ３４において、ＢＬＫ群とＢＭＰ－２含有群との間に有意な差は認められなかった（図５Ｂ）。また、２つのＢＭＰ－２含有ＩＭ釘群間の２つのＲＯＩでは、骨量に有意な差は認められなかった（図５Ｂ）。
【0047】
患部大腿骨の機械的特性
【0048】
大腿骨試料の機械的特性を測定するために３点曲げ機械的試験を行った（図６Ａ）。患部大腿骨の最大荷重率、ヤング率、エネルギー吸収率などのパラメータは、対側の無傷の対照骨のパラメータによって正規化した。ＢＬＫ群及びＩＭＮ群では癒合不全の比率が高いため、すべての機械的試験を完了するために利用可能な大腿骨試料の数は非常に限られていた。癒合不全の試料については、試験の失敗として機械的パラメータは０に設定した。結果が示すように、ＰＯＤ５５でのＩＭＮ群におけるエネルギー吸収率の増加を除いて、ＢＬＫ群とＩＭ釘群との間では、他の機械的パラメータに有意差は認められなかった（図６Ａ～Ｆ）。また、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群では、ＢＬＫ群と比較して、機械的特性が顕著に向上し、正規化した最大荷重率、ヤング率、及びエネルギー吸収率は、ＰＯＤ３４ではそれぞれ、２２．７％（Ｐ＜０．０１）、７．６％（Ｐ＜０．０５）、１８．６％（Ｐ＜０．０５）増加し（図６Ａ～Ｃ）、ＰＯＤ５５ではそれぞれ、３４．１％（Ｐ＜０．００１）、３０．４％（Ｐ＜０．０１）、１８．９％（Ｐ＜０．００１）増加した（図６Ｄ～Ｆ）。加えて、（ＩＭＩＮ＋Ｂ２）群でも、ＩＭ群と比較して、機械的特性が有意に向上し、正規化した最大荷重率、ヤング率、及びエネルギー吸収率は、ＰＯＤ３４ではそれぞれ、２２．２％（Ｐ＜０．０１）、７．３％（Ｐ＜０．０５）、２０．１％（Ｐ＜０．０５）増加し（図６Ａ～Ｃ）、ＰＯＤ５５ではそれぞれ、２９．４％（Ｐ＜０．００１）、３１．０％（Ｐ＜０．０１）、７．５％（Ｐ＞０．０５）増加した（図６Ｄ～Ｆ）。
【0049】
また、（ＩＭＮ＋Ｂ６）群でも、機械的特性が有意に向上し、正規化した最大荷重率、ヤング率、及びエネルギー吸収率は、ＰＯＤ３４において、ＢＬＫ群と比較して、それぞれ、２６．６％（Ｐ＜０．００１）、１１．６％（Ｐ＜０．００１）、３１％（Ｐ＜０．００１）増加し、また、ＩＭＮ群と比較して、２６．１％（Ｐ＜０．００１）、１１．３％（Ｐ＜０．００１）、３０．５％（Ｐ＜０．００１）増加した（図６Ａ～Ｃ）。しかしながら、ＰＯＤ４３では、（ＩＭＮ＋Ｂ６）と（ＩＭＮ＋Ｂ２）群と比較した場合、機械的特性に有意な差は認められなかった（図６Ａ～Ｃ）。
【0050】
組織学的分析
【0051】
組織学的データは、ドッキング部位及び再建部位を含む患部大腿骨の縦断像を示す（図７）。結果から、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、ＢＬＫ群及びＩＭＮ群のドッキング部位に軟部組織が介在している証拠が示された（図７）。しかしながら、ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、ドッキング部位で骨癒合が達成され、軟部組織の介在は認められなかった（図７）。ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、すべての群の再建部位で、新生骨が認められた（図７）。ＰＯＤ３４及びＰＯＤ５５において、ＢＬＫ群及びＩＭＮ群のいくつかの試料に、ピントラック感染が認められた（図７）。ＰＯＤ５５において、（ＩＭＩＮ＋Ｂ２）群では、ドッキング部位だけでなく、再建部位でも、皮質骨及び骨梁骨が明確に識別され、動物における骨再形成が促進されたことが分かった（図７）。また、（ＩＭＮ＋Ｂ２）及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、移植部位に、非常に多くの量の新生骨が認められた（図７）。
【0052】
ＰＯＤ３４での患部大腿骨のドッキング部位及び再建部位における動的な骨石灰化速度を測定するために、組織学的形態計測を行った。インビトロ蛍光標識の画像及び定量データから、石灰化速度（ＭＡＲ）は、（ＩＭＩＮ＋Ｂ２）及び（ＩＭＮ＋Ｂ６）では、ＢＬＫ群と比較して、再建部位ではそれぞれ、１２８．１％（Ｐ＜０．００１）、１２６．０％（Ｐ＜０．００１）、ドッキング部位ではそれぞれ、２１．０％（Ｐ＞０．０５）、２７．０％（Ｐ＜０．０５）の有意な増加が認められた（図１３Ａ～Ｂ）。同様に、石灰化速度（ＭＡＲ）は、（ＩＭＮ＋Ｂ２）及び（ＭＮ＋Ｂ６）では、ＩＭＮ群と比較して、ドッキング部位ではそれぞれ、１４２．６％（Ｐ＜０．００３）、１４０．４％（Ｐ＜０．００１）、再建部位ではそれぞれ、３３．０％（Ｐ＜０．０５）、３９．６％（Ｐ＜０．０１）の有意な増加が認められた（図１３Ａ～Ｂ）。
【0053】
基本的メカニズムを理解するために、免疫蛍光染色及び免疫組織化学染色を行った。図１４から、（ＩＭＮ＋Ｂ２）群及び（ＩＭＮ＋Ｂ）群において、骨形成マーカー（オステオカルシン；ＯＣＮ）、ＢＭＰ－２受容体ＩＩ（ＢＭＰＲＩ；ＢＩ）、及び骨膜幹細胞マーカー（α－ＳＭＡ）の高発現レベルが認められた。これらのデータは、ドッキング部位での骨形成が活発であり、骨膜幹細胞がドッキング部位の治癒過程に関与することを示している。ＢＭＰＲＩＩの高発現レベルは、ＢＭＰ－２の骨形成前駆細胞への結合を促進する。
【0054】
考察
【0055】
長骨輸送ＤＯモデル
【0056】
本発明者らは、一般的に再建部位では正常な骨再建を示すが、ドッキング部位での癒合不全やピントラック感染の罹患率が高い、骨輸送手術を受けたヒト患者の臨床環境と転帰を模倣した、ラットを用いた新規の長骨輸送ＤＯモデルの確立に成功した。過去の研究では、ヒツジやウサギなどの比較的大型の動物を用いた長骨輸送モデルが報告されている。イヌやウサギの骨輸送モデルも、下顎組織再建の分野で見られる。本発明者らの知る限りでは、ラット骨輸送モデルの報告はこれが初めてである。げっ歯類モデルは、より大型の動物モデルにおけるその後の実験及び臨床研究の前に、入手のしやすさや費用対効果などの利点から、整形外科研究におけるインビトロ試験の第１選択肢として従来用いられている。しかしながら、げっ歯類は体の大きさが小さいため、限られたスペースでの手術及び長期にわたる延長を可能にする特殊なハードウェアや専門的な外科的専門知識を必要とする従来の骨輸送実験ではほとんど使用されていなかった。本発明者らは、本発明の研究の実験を容易にするために、ラットの長骨の手術用の独自の新規な創外固定器及びドリルガイドを特注で設計及び製造した。
【0057】
ＢＭＰ－２送達のための担体としてのＩＭ釘
【0058】
ワッサースタイン１世（Wasserstein I）は、ＩＭインプラント、及び、ＩＭインプラントと創外固定器との併用を考案したパイオニアの１人と目されている。彼は、１９６３年から、この方法を用いて手術を行っている。しかしながら、仮骨延長術の直後に、二次的な長管骨同種移植が必要であった。ペーリー（Paley）は、１９９７年に、創外固定器の装着期間を短縮するために、創外固定器とＩＭ釘とをその場で組み合わせるという概念を初めて発表した。ＩＭ釘は通常、ステンレス鋼製またはチタン合金製である。このような金属製のＩＭ釘の利点は、患者の満足度が高いことであり、これは、１つには、社会心理学的な懸念が少ないことが原因である。欠点は、ＩＭ釘に追加費用がかかること、及び、骨硬化後にＩＭ釘の除去が必要なことである。
【0059】
早くも１９９２年には、ポリグリコール酸とポリ乳酸との共重合体から作製された生分解性ＩＭ釘が髄内固定用に開発された。関節外骨折の固定にキルシュナーワイヤーを用いた対照群と、生分解性ＩＭ釘群と間で、骨治癒に有意差は認められなかった。その後、開放創が細菌や他の感染性微生物にさらされるため、骨折の固定や他の骨再建術のために、様々な種類の抗生物質溶出性ＩＭ釘が開発された。最近の臨床研究によると、抗生物質を含有するポリメチルメタクリレートセメントをコアとする金属製ＩＭ釘は、脛骨開放骨折の治療において、標準的な釘と比較して、感染が少なく、骨硬化が速く、合併症が少ないことが示された。しかしながら、本発明者らは、骨輸送に生分解性ＩＭ釘を使用した患者モデル及び動物モデルのいずれにおいても、そのような報告は見つけていない。本発明では、ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントにＢＭＰ－２含有ヒドロゲル層を担持させるための新規な技術を用いて、骨誘導性の生分解性ＩＭ釘インプラントを作製した。ＰＣＬ－ＴＣＰ複合材料は、生体適合性、機械的安定性、生体吸収性、及び骨伝導性を有する。しかしながら、ＰＣＬ－ＴＣＰ構築物は、骨形成を誘起して骨治癒を促進する骨誘導因子を欠いている。
【0060】
表面コーティングが、組織工学用途のスキャフォールドの表面にタンパク質を固定するために用いられてきた。しかしながら、表面コーティングによってスキャフォールドの表面に担持できるタンパク質の量は、一般的に少なく、また、タンパク質の放出速度も速い。例えば、交互積層法（ＬＢＬ：layer-by-layer）によってキトサン及びヒアルロン酸ナトリウムをコーティングしたヒドロキシアパタイト系スキャフォールドの表面でのウシ血清アルブミンの担持量は、コーティングしていないスキャフォールドよりも低く、また、放出速度も速かった。高含水量及び多孔性微細構造を有するヒドロゲルは、タンパク質の十分な担持及び持続的放出のためのプラットフォームを提供する。しかしながら、硬質の構築物の表面に軟質のヒドロゲルを担持させることは、界面での機械的特性の不整合に起因して困難である。さらに、従来の技術を用いてタンパク質含有ヒドロゲルを担持したスキャフォールドは、ヒドロゲルからの水分蒸発及びタンパク質変性を避けるために、ヒドロゲルの担持直後に使用する必要があった。本開示のＩＭ釘インプラントでは、ＢＭＰ－２含有ヒドロゲル層は、ＰＣＬ－ＩＣＰフィラメント自体よりも重く、硬いフィラメント表面と完全に一体化する。重量比８０：２０のＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントは、ＩＭ釘のコアとして硬いフィラメント形状を維持し、エクスビボ及びインビトロの両方の試験で、固定ピンと連結したときにも安定性を維持した。押出成形によりＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントを作製した後、親水性を増加させ、ヒドロゲル接着性を向上させ、表面開始型架橋を促進するために、フィラメントを連続的に処理した。ＮａＯＨ処理及び凍結／融解はそれぞれ、カルボキシル基及び水酸基へのエステル結合の切断及び表面上への微細孔形成により、ポリエステルの表面に親水性を付与する。ＧｅｌＭＡで表面をコーティングすると、ヒドロゲルと共有結合するための二重結合が表面に形成された。ＰＣＬの融点（Ｓ）に近い温度（６０°Ｃ）で、ＣａＳＯ４懸濁液中で超音波処理することにより、ＣａＳＯ微小粒子をＧｅｌＭＡ修飾フィラメントの軟質表面上に堆積させ、担持させた。その結果、いずれの処理ステップも、フィラメントの引張剛性に対して悪影響を与えなかった。ＣａＳＯ４で処理したスキャフォールドをヒドロゲル前駆体溶液に浸漬させると、カルシウムイオンがスキャフォールドの表面から溶液中に拡散して、表面の近傍でアルギン酸を架橋し、これにより、スキャフォールドの表面にヒドロゲル層が形成された。物理的に架橋されたヒドロゲル中のＧｅｌＭＡ及びＰＥＧＤＭＡマクロモノマーを、次のステップで共有結合的に架橋させて、堅固な相互貫通ネットワークを形成した。また、ＢＭＰ－２に対するヘパリンの親和性は高いため、ＢＭＰ－２の放出を延長するためにヒドロゲルにＨｅＭＡを組み込んだ。アルギン酸塩ベースのヒドロゲルにＨｅＭＡを添加すると、ＢＭＰ－２の放出期間が延長され、マウスの皮下骨形成が改善されることが示された。ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントに担持されたヒドロゲルは、フィラメント自体よりも重かった。したがって、本開示の方法は、インビボでの骨再建を促進するのに十分な量のＢＭＰ－２を担持するのに用いることができる。さらに、ヒドロゲルネットワークは、凍結乾燥後も、ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントと一体化したままであった。２μｇまたは６μｇのＢＭＰ－２を担持した凍結乾燥ＢＭＰ－２担持インプラントからの放出データによると、２１日後には、最初に担持したＢＭＰ－２の８０．０％または７１．７％が放出された。ＢＭＰ－２担持インプラントを２ヵ月間保存しても、ＢＭＰ－２の活性及び放出動態に影響はなかった。したがって、本開示の方法は、保存可能な骨誘導性の生分解性髄内釘インプラントの作製に用いることができる。
【0061】
臨床的観点からは、本発明者らは、ＰＣＬ、ＴＣＰ、アルギン酸塩、生物活性因子ｔｈ－ＢＭＰ－２、食品加工用ゼラチンなどの、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって臨床応用が認可された材料を用いて、生分解性ＩＭ釘を作製することに成功しており、これらの組み合わせは、将来の臨床応用において、多くの障害を伴わない有望な医療デバイスを形成する可能性がある。これらの材料の中で、ＰＣＬ－ＴＣＰ複合材料は、高い生体適合性、長期分解性、適切な機械的特性、及び骨伝導性を有することから、骨組織工学において広く注目されている。本発明では、重量比８０：２０のＰＣＬ－ＴＣＰ複合体は、ＩＭ釘のコアとして硬いフィラメント形状を維持し、エクスビボ及びインビトロの両方の試験で、固定ピンと連結したときにも安定性を維持した。ＧｅｌＭＡ／アルギン酸塩複合ヒドロゲルは、調節節能な機械的特性、及び優れた生体適合性を有するため、薬物や細胞の送達にも頻繁に適用されている。結果が示すように、ＰＣＬ－ＴＣＰコアとの優れた一体化により、凍結乾燥後に形成されたＧｅｌＭＡ／アルギン酸塩シェルは、ヘパリンの補助により２８日間にわたってｒｈＢＭＰ－２を徐放する能力を有しており、ＢＭＰ－２を分解から保護し、徐放特性を維持するのに役立つ。さらに、生分解性ＩＭ釘は、動物において優れた生体適合性を示し、ピントラック感染及びドッキング部位での癒合不全において、ブランク対照群とほぼ同じ比率を示し、このＩＭ釘移植の安全なアプローチを示した。骨膜幹細胞がＤＯ補助骨欠損治癒において主要な役割を果たすことが、より多くの研究によって明らかになっている。ＩＭ釘は移植後に髄管を占有することによって、骨髄を危険にさらす可能性があるが、本研究では骨膜が骨セグメント上に無傷のまま残っている場合、骨治癒は維持される。臨床研究からのエビデンスにより、金属製のＩＭ釘は、骨輸送処置中に、骨治癒を遅らせることなく機械的支持を発揮することがすでに示されている。
【0062】
ＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７は、長骨の開放骨折、癒合不全、及び脊椎固定での臨床使用が認可されている。しかしながら、満足のいく臨床結果を達成し、かつ潜在的な副作用を避けるためには、ＢＭＰを適切に投与する必要がある。ＢＭＰの送達システムの主な役割は、骨損傷部位に成長因子を長時間保持するとともに、最適な生分解性及び組織内部成長のための機械的支持を提供することである。４５０人の患者を対象とした前向き無作為化対照単盲検臨床試験により、ＢＭＰ－２インプラント（ＢＭＰ－２は吸収性コラーゲン担体に担持される）は、脛骨開放骨折患者における二次介入の減少、骨折及び創傷治癒の促進、感染率の低下において、標準治療（髄内釘固定及び日常的な軟部組織管理）よりも優れていることが明らかになった。ＢＭＰ－２（ウサギ１匹当たり２５～７５０μｇ）またはＢＭＰ－７（ラット１匹当たり２０μｇ）を注射またはスポンジ担体によって局所的に適用して、ウサギまたはラットの骨延長モデルにおける骨硬化を促進した。デンシトメトリー法の結果から用量依存的な効果が示された。
【0063】
本発明はさらに、非常に低い用量（ラット当たり２μｇ）のＢＭＰ－２を組み込んでも、ＩＭ釘は骨治癒を促進し、早ければＰＯＤ４８（５週間の骨硬化期間後）の時点で固定具を早期に除去するのに有効であることを実証した。これは、生分解性ＩＭ釘を介した髄内送達によるＢＭＰ－２の特異的送達の最初の報告であり、現在の診療に適合し、ＤＯ処置の中断を最小限に抑えるとともに、局所的な骨治癒を促進する効果を固定化することができる。
【0064】
ドッキング部位及び再建部位における骨硬化
【0065】
ドッキング部位の癒合不全は、治癒過程の実質的な延長、骨移植の二次手術、及び固定器除去の遅延をもたらす、骨輸送における頻繁な問題として認識されている。ドッキング部位の癒合不全は、骨接触が不活発であること、及び、軟部組織がかなり介在していることが原因であると考えられている。骨輸送が完了すると、輸送された骨セグメントが標的セグメントに接触する前に空洞が存在するため、血腫は徐々に線維軟骨組織に置換される。輸送されたセグメントの先端部、及び標的セグメントのドッキング端部も、線維軟骨組織によってシールされる。肉眼的観察及び画像診断の結果、ＩＭ釘インプラントの使用の有無にかかわらず、骨輸送動物モデルは、ドッキング部位での癒合率が非常に低く（０～３７．５％）、偽関節を形成することさえあり、このことは、従来の臨床転帰と一致した。これらの結果は、ＩＭ釘自体が、ドッキング部位の骨硬化に影響を与えないことも示している。癒合不全試料では、ドッキング部位での軟部組織の介在、あるいは、偽関節さえも観察された。
【0066】
上述のように、ドッキング部位の骨硬化は、治療プロセス全体における律速段階となる。ドッキング部位の骨硬化を改善する戦略としては、急性短縮、骨移植、圧迫、交互圧迫－延長、または、脱灰骨マトリックスと組み合わせた骨髄移植などの外科的処置に焦点が当てられてきた。本開示により得られた素晴らしい結果によると、２μｇまたは６μｇのＢＭＰ－２を組み込んだＩＭ釘を使用して治療したすべての動物において、ＰＯＤ３４という早い段階でドッキング部位の癒合が達成され、二次的な手術や移植を行うことなく、両方の時点で機械的特性が改善された。免疫蛍光法及び免疫組織化学の結果から、骨形成マーカー（ＯＣＮ）、骨膜幹細胞マーカー（α－ＳＭＡ）、及び、ＢＭＰＲＩＩが、ドッキング部位の骨膜で高度に発現したことが明らかになった。本発明者らは、ＩＭ釘から放出されたＢＭＰ－２が、セグメントの先端部及びドッキング端部における活発な骨形成を維持し、両端部が接する位置において骨融合を促進することによって、ドッキング部位に対して好影響を与えると考えた。このような持続的ＢＭＰ－２溶出性の活性化骨形成は、ドッキング部位への軟部組織の侵入を防止したり、遊走する線維芽細胞を骨組織に変換したりするのにも役立つと考えられる。本発明者らは、ＩＭ釘インプラントから放出されたＢＭＰ－２が、その受容体であるＢＭＰＲＩｌに結合することによって、ドッキング部位の両端に存在する骨膜幹細胞の遊走及び骨形成が有意に促進されるという仮説を立てた。しかしながら、ドッキング部位で持続的に放出されたＢＭＰ－２がどのようなメカニズムで作用するのかについては、さらなる研究が必要である。
【0067】
ＢＭＰ－２含有群では、ドッキング部位での十分な骨硬化に加えて、再建部位での早期の骨硬化も達成された。このことは、ＰＯＤ５５でのマイクロＣＴ及び機械的試験で分析した、より高いＢＶ／ＴＶ比によって示されている。機械的特性が完全には回復していないことが機械的試験のデータで示されたにもかかわらず、ＢＭＰ－２含有群の動物の歩行能力は、固定具を１週間早く外した後（ＰＯＤ４８）には正常に戻っており、このことは、再建部位が日常動作の重さに耐えられるように十分に成熟（硬化）していることを示している。骨硬化の促進は、ＩＭ釘に沿ったＢＭＰ－２曝露量の増加に対する延長量の比率によって制御される一定の放出動態で、ＩＭ釘から拡張した血管に富む軟質再建にＢＭＰ－２が持続的に放出されることに起因する。骨硬化期間は、局所的及び全身的な健康状態によって大きく異なる。しかしながら、臨床では、１ｍｍの仮骨延長術に対する１週間の骨硬化期間後に、従来の割合が報告された。げっ歯類モデルの結果は、種差を考慮しても、ＢＭＰ－２を含有するＩＭ釘によって、１週間あたり１．６ｍｍという高い骨硬化率を達成できることを示した。ＢＭＰ－２含有群では、再建部位におけるマイクロＣＴで測定したＢＶ／ＴＶ及び組織形態計測で測定したＭＡＲの変化は、ＢＬＫ群またはＩＭＮ群と比較して、初期時点（ＰＯＤ３４）では有意ではなかったが、骨硬化期間後（ＰＯＤ５５）では有意であったことも非常に心強い。これらの結果は、本開示のＢＭＰ－２含有ＩＭ釘インプラントが、臨床的に重要なヒトの大きな骨欠損の治療において、さらなる延長を妨げる早期の骨硬化を生じなかったことを示唆しており、重要である。
【0068】
臨床的適応及び将来性
【0069】
提示された結果及び実施形態は、本開示による新規の生分解性ＢＭＰ－２含有ＩＭ釘インプラントが、ＤＯ処置において、再建部位とドッキング部位との両方で安全かつ効率的に骨硬化を促進し、二次的な手術を行うことなく早期の外固定装置の除去を容易にすることを示している。このような有望な結果が得られ、ほとんどの材料がすでにＦＤＡによって医療用途の認可を受けていることから、本発明者らは、本開示による新規の生分解性ＢＭＰ－２含有ＩＭ釘が、骨輸送技術と組み合わせて臨床応用される大きな可能性を有すると信じる。
【0070】
ＩＭ釘インプラントは、ＰＣＬ－ＴＣＰ多孔性スキャフォールドと、ＧｅｌＭＡ－アルギン酸－ＢＭＰ－２含有ヒドロゲルコーティングとのハイブリッド型３Ｄ印刷技術の組み合わせによって、十分な機械的支持を提供し、ＢＭＰ－２の担持量を増加させ、かつ、移植後の血管新生を容易にする、大型動物または臨床試験におけるインビボ研究用に設計することもできる。本発明者らは、骨輸送術や患肢延長術を受ける患者が、この単一手術アプローチによって大きな利益を得ることを期待している。このアプローチでは、外固定具がより早い時期に取り外され、二次手術が回避され、ピントラック感染が大幅に減少する。
【0071】
材料及び方法
【0072】
試験デザイン
【0073】
骨輸送ＤＯにおいて８ｍｍの大腿骨セグメント欠損の再建を誘導する骨誘導性ＩＭ釘（ＩＭＮ）移植片として、生分解性インプラントを作製した。本開示の生分解性インプラントは、ＰＣＬ／ＴＣＰ（４／１）フィラメントを、ＢＭＰ－２（２μｇまたは６μｇ）を添加した脱イオン水中で、ＧｅｌＭＡ（１５％）、アルギン酸塩（１．２５％）、ＰＥＧＤＭＡ（２％）、ＨｅｐＭＡ（１％）、及び光開始剤（０．３％）を含有する凍結乾燥ヒドロゲルでコーティングした複合体から構成される。本開示の生分解性インプラントの表面形態、引張強度、及びインビトロでのタンパク質放出動態を特性評価した。本開示の生分解性インプラントを、ラット輸送ＤＯモデルの髄管に移植した。本研究のＤＯプロトコルは、５日間の待機期間、８日間の延長期間、及び、２１日間（ＰＯ３４Ｄ）または４２日間（ＰＯＤ５５）の硬化期間から構成される。Ｘ線イメージング、マイクロＣＴ分析、機械的試験、組織学試験、及び組織形態計測を実施し、仮骨延長術（ＤＯ）に伴う骨欠損治癒に対するＩＭ釘デバイスの効果を評価した。
【0074】
化学物質
【0075】
医療グレードのポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｎ＝８０ｋＤａ）を、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）から購入した。平均粒径１００ｎｍのβ－ＴＣＰナノ粉末（ＴＣＰ）を、バークレー・アドバンスト・マテリアル社（Berkeley Advanced Materials Inc.）から入手した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、及びエタノールを、フィッシャー・サイエンティフィック社（Fisher Scientific Inc.）から購入した。Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ´－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、Ａ型ゼラチン、ヘパリン、及び硫酸カルシウム二水和物（ＣａＳＯ４）を、シグマ・アルドリッチ社から購入した。ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ、Ｍｎ＝１０００グラム／モル）を、ポリサイエンス社（Polyscience, Inc.）から入手した。アルギン酸ナトリウム（アルギン酸、５００ＧＭ）を、ファルツ・アンド・バウワー社（Pfaltz & Bauer Inc.）から購入した。ヒトＢＭＰ－２タンパク質は、メドトロニック社（Medtronic）から提供された。ヒトＢＭＰ－２ＥＬＩＳＡキットを、シグマ・アルドリッチ社から購入した。
【0076】
ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの合成
【0077】
直径が０．９ｍｍで、ＰＣＬとＴＣＰとの重量比が８０：２０のＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントを合成した。簡単に説明すると、８０ｇのＰＣＬ及び２０ｇのＴＣＰをそれぞれ８００ｍＬ及び４００ｍＬのＤＭＦに別々に溶解させ、８０°Ｃで３時間撹拌した。続いて、ＰＣＬ溶液とＴＣＰ溶液とを混合し、１時間撹拌した。次に、その混合物を４リットルの水中で沈殿させて、ＰＣＬ－ＴＣＰ複合体シートを作製した。ＰＣＬ－ＴＣＰ複合体シートを水で洗浄し、残留溶媒を周囲温度で２４時間、ヒュームフード内で蒸発させた。乾燥させたＰＣＬ－ＴＣＰ複合材料をペレット状に切断し、自社製のスクリュー押出機を用いて押出成形した。
【0078】
メタクリル酸ゼラチン及びメタクリル酸ヘパリンの合成
【0079】
ＧｅｌＭＡマクロモノマーを合成するために、ゼラチンを５０°Ｃの脱イオン水（１０％ｗ／ｖ）に溶解させた。ゼラチン溶液に、メタクリル酸無水物を１００：１（メタクリル酸無水物：ゼラチン）のモル比で加え、撹拌しながら５０°Ｃで１時間反応させた。次に、混合物を脱イオン水で５倍に希釈し、６～８ｋＤａの分子量カットオフを有する透析チューブ（米国カリフォルニア州ランチョ・ドミンケス、スペクトラム・ラボラトリーズ社）を使用して、脱イオン水に対して４０°Ｃで３日間透析した。その後、ＧｅｌＭＡ溶液を凍結乾燥させ、－８０°Ｃで保存した。
【0080】
メタクリル酸ヘパリン（ＨｅｐＭＡ）を合成するために、１ｇのヘパリンを１００ｍＬのＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）に溶解させた。続いて、４５ｍｇのＥＤＣ及び３０ｍｇのＮＨＳを含有する５ｍＬのＭＥＳ緩衝液をヘパリン溶液に加えて、カルボン酸基を活性化させた。室温で１時間反応させた後、１ｍＬのＭＥＳ中の２５ｍｇのＡＰＭＡを溶液に加え、室温で２時間反応させた。次に、ＨｅｐＭＡ溶液を、６～８ｋＤａの分子量カットオフを有する透析チューブ（米国カリフォルニア州ランチョ・ドミンケス、スペクトラム・ラボラトリーズ社）を使用して、脱イオン水に対して周囲温度で３日間透析し、その後、凍結乾燥させ、－８０°Ｃで保存した。
【0081】
ＢＭＰ－２含有ヒドロゲルによるＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントのコーティング
【0082】
ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントをＢＭＰ－２－含有ヒドロゲルでコーティングする手順を図２Ａに概略的に示す。直径０．９ｍｍのＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントを合成し、手作業で１８ｍｍのフィラメントに切断し、５ＮのＮａＯＨ溶液に６時間浸漬させた。続いて、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄した後、フィラメント表面のカルボン酸基を活性化させるために、ＥＤＣ（５ｍｇ／ｍＬ）及びＮＨＳ（５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）中で、室温で３０分間インキュベートした。次に、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄した後、ＭＥＳ緩衝液中のＧｅｌＭＡ２％溶液中で、３７°Ｃで１時間インキュベートした。次いで、フィラメントを脱イオン水で３回洗浄して未反応のＧｅｌＭＡを除去した後、ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣ／ＮＨＳ（５ｍｇ／ｍＬ）中で、室温で１５分間インキュベートした。その後、ＧｅｌＭＡでコーティングしたフィラメントを脱イオン水で３回洗浄した後、真空下で乾燥させた。続いて、ＧｅｌＭＡでコーティングしたフィラメントを６０°Ｃの脱イオン水（１００ｍｇ／ｍＬ）中のＣａＳＯ４懸濁液に浸漬させ、３０秒間超音波処理した。次に、フィラメントを２４ウェルプレートのウェルに移し、真空下で乾燥させた。乾燥させたフィラメントを、３７°Ｃの脱イオン水中のＧｅｌＭＡ（１５％）、アルギン酸（１．２５％）、ＰＥＧＤＭＡ（２％）、ＨｅｐＭＡ（１％）、タンパク質（ＢＭＰ－２：２００μｇ／ｍＬ）、及び光開始剤（０．３％）を含有する９６ウェルプレートのウェルに２分間浸漬させた。ヒドロゲル担持フィラメントを溶液から除去し、別の９６ウェルプレートの乾燥させたウェル内に５分間放置した。次いで、ヒドロゲル担持フィラメントに対して可視光を１５分間照射して、ＧｅｌＭＡ、ＰＥＧＤＭＡ、及びＨｅｐＭＡを共有結合的に架橋させた。その後、ヒドロゲル担持フィラメントを－８０°Ｃで保存し、凍結乾燥させた。
【0083】
引張弾性率、ヒドロゲル担持、及び表面形態の特性評価
【0084】
ＰＣＬ－ＴＣＰフィラメントの引張弾性率（引張係数）を、２ｋＮのロードセル、及び、１Ｎの予荷重を有するインストロン５９４４単軸試験システム（米国マサチューセッツ州ノーウッド、インストロン社（Instron Corporation））を使用して試験した。引張弾性率の測定は、１％ひずみ／秒の変位速度で、２５％ひずみまで実施した。応力対ひずみ曲線の線形領域の勾配を、引張弾性率とした。引張弾性率の測定には、１群あたり５つの試料を使用した。
【0085】
ヒドロゲル担持率（％）は、ヒドロゲル担持前のスキャフォールド重量（Ｗｂ）と、ヒドロゲル担持後のスキャフォールド重量（Ｗａ）とから、下記の式を用いて計算した。ヒドロゲル担持率の測定には、１群あたり８つの試料を使用した。
ヒドロゲル担持率（％）＝１００×（Ｗａ－Ｗｂ）／Ｗｂ
ヒドロゲル担持率（％）＝１００×（Ｗａ－Ｗｂ）／Ｗｂ
【0086】
表面形態を可視化するために、フィラメントを液体窒素に浸漬させ、凍結乾燥させた。続いて、ＳＰＩスパッタ（米国ペンシルベニア州ウェストチェスター、ストラクチャープローブ社のＳＰＩサプライヤー部門（SPI Supplier Division of Structure Prob, Inc.））を使用して、ヒドロゲル試料を金で１８０秒間コーティングし、電界放出型走査電子顕微鏡（米国ニューヨーク州ホワイトプレインズ、ツァイス・シグマ社（Zeiss Sigma））を使用して加速電圧５ｋｅＶで画像化した。
【0087】
タンパク質の放出
【0088】
放出動態を測定するために、２μｇまたは６μｇのＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルでコーティングしたフィラメントを凍結乾燥させ、１ｍＬのＰＢＳ中で、３７°Ｃで２８日間インキュベートした。各時点で、放出培地中のＢＭＰ－２の量を、ＥＬＩＳＡを用いて測定し、放出培地を新鮮なＰＢＳと交換した。タンパク質の活性及び放出動態に対するインプラントの保存の影響を調べるために、ＢＭＰ－２を含有するヒドロゲルでコーティングしたフィラメントを４℃で２ヶ月間保存し、保存したインプラントからのＢＭＰ－２の放出動態を測定し、未処理のインプラントと比較した。
【0089】
骨輸送のための創外固定器の設計
【0090】
ＳＤラットモデルにおける骨輸送のために、片側創外固定器を特別に設計し、カスタマイズした。片側創外固定器は、１つのフレーム（長さ３２ｍｍ）と、５本の固定ピン（直径１．２ｍｍ、長さ２２ｍｍ）との２つの部分から構成される。フレームは２つの固定端部を有し、各固定端部は２つの固定ピンで固定され、骨切り術後に近位骨セグメント及び遠位骨セグメントを固定するために使用される。また、フレームは、２つの固定端部の間に１つの可動部分を有し、この可動部分は、皮質切除後に可動骨スライスを固定するために最後のピンをロックするために使用される。片側創外固定器の性能を、１２週齢のＳＤラットの大腿試料を用いてエクスビボで試験した。
【0091】
動物手術及びＤＯプロトコル
【0092】
手術前に、各ラットを、温熱パッド上での手術中に２～３％イソフルラン（米国アイダホ州ボイシ、ＶｅｔＯｎｅ社）で麻酔した。その後、セファゾリン（２５ｍｇ／ｋｇ）を動物に皮下注射した。消毒後、左大腿の骨外側部位を２５ｍｍ切開した。固定のために、４本の固定ピンを骨に刺入した。骨輸送のためにのみ、第１皮質骨に別の固定ピンを刺入し、その後、骨を固定するためにフレームを設置した。無菌条件下で８ｍｍの骨スライスを除去するために、大腿骨中骨幹部での大腿骨横骨切り術を、ワイヤーダイヤモンドソーを用いて実施した。さらに、大腿骨遠位部において、骨輸送のための４ｍｍの横骨切り術を実施した。長さ１８ｍｍ、直径１．２ｍｍのＩＭ釘デバイスを、近位大腿骨セグメント及び遠位大腿骨セグメントの髄管に挿入し、ＩＭ釘デバイスの両端部を近位固定ピン及び遠位固定ピンで固定した。上述のように、ＩＭ釘を、０μｇ（ＩＭＮ、１６例）、２μｇ（ＩＭＮ＋Ｂ２、ｎ＝１６）、または、６μｇ（ＩＭＮ＋Ｂ６、ｎ＝８）のＢＭＰ－２を含有したヒドロゲルでコーティングした。ＩＭ釘を移植していない動物を、ブランク対照（ＢＬＫ、ｎ＝１６）とした。その後、外科的切開部を、順次縫合した。本試験のＤＯプロトコルの治療期間、５日間の待機期間（手術日から手術後（ＰＯＤ）５日目まで）、８日間の能動的な延長期間（０．５ｍｍ／１２時間、ＰＯＤ５からＰＯＤ１３まで）、及び、２１日間（ＰＯＤ１３からＰＯＤ３４まで）または４２日間（ＰＯＤ１３からＰＯＤ５５まで）の骨硬化期間の３つの段階からなる。この動物実験では、骨輸送は、ＩＭ釘を介して逆行方向に行った。
【0093】
術後ケア及び試料採取
【0094】
手術後、動物を個別に飼育した。また、試験期間中、すべての動物においてピントラック感染をモニター及びケアした。必要に応じて、ポリビニルピロリドンヨード及びエタノールを、ピントラックのケア中に使用した。ピントラック感染をモニターし、Ｃｈｅｃｋｅｔｔｓ－Ｏｔｔｅｒｂｕｒｎ分類にしたがって分類した。この分類方法によると、ピントラック感染は、軽度（グレード１～３）と重度（グレード４～６）との２群に分類される。各群３匹のラットを無作為に選択し、インビボ標識のため、終了１３日前（ＰＯＤ３３）にキシレノールオレンジ（３０ｍｇ／ｋｇ；米国ミズーリ州セントルイス、シグマ・アルドリッチ社）を、終了３日前（ＰＯＤ４４）にカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ；、シグマ・アルドリッチ社）を皮下注射した。終了１週間前（ＰＯＤ４８）に固定具を取り外し、ＰＯＤ５４に動物の一般的歩行能力を観察した。すべての動物を屠殺し、定性的及び定量的な評価のために、ＰＯＤ３４またはＰＯＤ５５に両大腿骨を採取した。注目すべきことには、（ＩＭＮ＋Ｂ６）群では、８匹のラットのすべてをＰＯＤ３４で屠殺した。骨癒合は主に標本の肉眼的観察によって評価し、後述するマイクロＣＴ分析によってさらに確認した。標本を１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定し、７０％エタノールに移して保存した。
【0095】
動的Ｘ線イメージング
【0096】
ＬＡＧＯ－Ｘインビボ撮像システム（米国アリゾナ州ツーソン、スペクトラル・インストゥルメント・イメージング社（Spectral Instrument Imaging））を用いて、骨欠損治癒における動的変化を、全動物でＰＯＤ５からＰＯＤ３４まで毎週モニターした。まず、動物を、誘導チャンバー内で、３％イソフルランで麻酔した。その後、各動物を加熱した撮像プラットフォームに移し、撮像前に上下逆さまに配置した。撮像パラメータは、４０ｋｅＶ、露光時間１８秒に設定した。
【0097】
マイクロコンピューター断層撮影（ＣＴ）検査
【0098】
動物の延伸再建部位及びドッキング部位における微細構造変化を、マイクロＣＴを用いて定性的及び定量的に評価した。簡単に説明すると、すべての試料を、Ｓｋｙｓｃａｎ １２７６ マイクロＣＴ（ベルギー国コンティフ、Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて、電圧７０ｋＶ、電流２００Ａ、回転ステップ０．８°、３６０°走査モードで、等方性ボクセルサイズ２０μｍのカスタム等方性分解能で撮像した。０．５ｍｍのＡｌフィルタを用いて、ビーム硬化還元を行った。投影画像は、画像解析のためのポストアラインメント及びビーム硬化補正を伴うコーンビームＮＲｅｃｏｎアプリケーション（バージョン１．０．７．０、Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて、オフラインで再構成した。再構成画像の後処理を、ＳｋｙＳｃａｎ ＣＡｎソフトウェアパッケージ（バージョン１．１７、Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて解析した。延長領域（長さ８ｍｍ）とドッキング部位（長さ１．５ｍｍ）とを含む２つの関心領域（ＲＯＩ）を、別々に分析した。延長領域またはドッキング部位の断面スライスを、ＣＴａｎによる骨組織体積率（骨体積／総体積、ＢＶ／ＴＶ）測定に用いた。ＲＯＩのＢＷ／ＴＶは、対側の無傷対照群によって正規化した。ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ３Ｄ画像ビューア（バージョン２．５．０；カナダ国イルダートン、パララックス・イノベーションズ社（Parallax Innovations Iｎｃ．））を用いた目視検査のため、ＣＴＡｎ（ＣＴハンスフィールド単位（ＨＵ）の閾値＞１００００）のセグメント化データセットから、３Ｄ骨構造を作成した。骨癒合不全は、再建部位またはドッキング部位での骨癒合を示すＸ線像の証拠がないことにより定義されるマイクロＣＴ分析によって確認された。
【0099】
機械的試験
【0100】
マイクロＣＴ解析後、２４時間以内に３点曲げ試験を行い、機械的特性を評価した。２ｋＮのロードセルを備えた材料試験システムＩｎｓｔｒｏｎ５９４４試験システム（米国マサチューセッツ州ノーウッド）を用いて、大腿骨の破壊試験を行った。大腿骨には、ブレードの内側及び外側スパンをそれぞれ８ｍｍ及び１８ｍｍに設定して、前後方向に荷重をかけた。骨を０．０１ｍｍ／ｓの速度で試験し、試験中に、大腿骨の長軸をブレードに対して垂直に置いた。引張弾性率（ヤング率）、最大荷重率、破壊エネルギー（エネルギー吸収率）を求め、内蔵ソフトウェア（ＯＭＡＴプロフェッショナル；米国ペンシルベニア州ホーシャム、ティニアス・オルセン社（Tinius Olsen, Inc.））で解析した。新生骨の生体力学的特性を、対側の無傷骨の特性に対するパーセンテージとして表した。機械的試験中、本発明者らは、骨の破壊を防ぐために、荷重が１５％減少した時点で圧縮試験を終了した。
【0101】
組織学
【0102】
機械的試験の直後に、試料を１０％ホルマリンで４８時間固定し、その後、７０％エタノールに移した。試料（ｎ＝５／群）を１０％ＥＤＴＡ溶液で５週間脱灰し、エタノールで脱水した後、パラフィンで包埋した。ミクロトーム（ＲＭ２５２５；ドイツ国ヴェッツラー、ライカ社（Leica））によって、薄切片（５μｍ）を、矢状面の各大腿骨の長軸に沿って、切り出した。標準プロトコルにしたがって、スライドを、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ；シグマ・アルドリッチ社）、または、マッソントリクローム染色（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、アブカム社（Abcam））で染色した。
【0103】
組織形態計測
【0104】
組織形態計測のために、本試験では、石灰化骨のパラフィン包埋のプロトコルを適用した。固定後、いくつかの試料（ｎ＝３）をオービタルシェーカーで、室温で９６時間、５．０％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム水溶液で処理した。その後、骨を水で洗浄し、真空浸透システム下で、エタノール中で脱水した。処理した骨は、パラフィン包埋ブロックに規定どおりに埋め込んだ。１０μｍ切片を、矢状面の各大腿骨の長軸に沿って、ＲＭ２２５５ミクロトーム（ドイツ国、ライカ社）で切断した。組織形態計測のために、１００μｍ離間した２つの切片を、測定のために選択した。蛍光画像を、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（日本国大阪、キーエンス社）で撮像した。ドッキング部位または再建部位で、１０倍の倍率で、無作為で５つ撮像し、測定に用いた。ミネラル付着率（ＭＡＲ）は、赤色ラベルと緑色ラベルとの間の距離を１０日間隔で割って求めた。
【0105】
免疫蛍光アッセイ及び免疫組織化学アッセイ
【0106】
免疫蛍光アッセイ及び免疫組織化学アッセイを、標準プロトコルを用いて実施した。試料を、抗オステオカルシン（米国テキサス州ダラス、サンタクルーズ社（Santa Cruz））、抗ＢＭＰＲＩＩ（米国テキサス州ダラス、サンタクルーズ社）、または、抗α－ＳＭＡ抗体（米国テキサス州ダラス、サンタクルーズ社）と、４°Ｃで一晩インキュベートした。免疫蛍光には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５９４、または６４７標識二次抗体（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、アブカム社）を使用した。免疫組織化学には、西洋ワサビペルオキシダーゼ－ストレプトアビジン検出系（米国カリフォルニア州サンタクララ、ダコ社（Dako））を使用し、続いて、ヘマトキシリンで対比染色した。
【0107】
統計分析
【0108】
すべての定量的データは、平均及び標準偏差（ＳＤ）として示した。コルモゴロフ－スミルノフ検定で正規分布を確認した後、すべてのパラメータを、ＡＮＯＶＡ、及び事後テューキーのＨＳＤ検定によって分析した。マイクロＣＴ分析及び機械的試験については、対側の大腿骨を用いてパラメータを正規化した。統計分析は、ＳＰＳＳ（バージョン１６．０；米国イリノイ州シカゴ、ＳＰＳＳ社）を用いて計算し、有意水準はＰ＜０．０５に設定した。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図2L】
【図2M】
【図2N】
【図2O】
【図2P】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図16】
【国際調査報告】