知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｊａｐａｎ株式会社の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】効率的なワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20241128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/51 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/48 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/37 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/45 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20241128BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241128BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/18 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/155 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/11 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/045 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/02 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/025 20060101ALN20241128BHJP
C07K 14/115 20060101ALN20241128BHJP
A61P 31/14 20060101ALN20241128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/50
C12N15/49
C12N15/51
C12N15/44
C12N15/38
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N15/48
C12N15/37
C12N15/45
A61K39/12
A61K39/00 H
A61K39/145
A61K39/215
A61K39/29
A61P37/04
C07K14/52
C07K14/165
C07K14/18
C07K14/155
C07K14/11
C07K14/045
C07K14/02
C07K14/025
C07K14/115
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536100
(86)(22)【出願日】2022-12-16
(85)【翻訳文提出日】2024-06-14
(86)【国際出願番号】 JP2022046430
(87)【国際公開番号】W WO2023113016
(87)【国際公開日】2023-06-22
(31)【優先権主張番号】63/265,634
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/393,400
(32)【優先日】2022-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524226450
【氏名又は名称】ＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｊａｐａｎ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】赤畑 渉
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ジョナサン エフ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンダー，ジェファリー レオ
(72)【発明者】
【氏名】関田 隆
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BA51
4C085BA55
4C085BA71
4C085BA87
4C085BA89
4C085BB01
4C085BB17
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045CA02
4H045CA05
4H045CA11
4H045EA20
4H045EA31
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４と、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含むポリペプチドとをコードする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。このポリヌクレオチドは、ウイルス感染、とりわけ、ＣＯＶＩＤ－１９感染に対するワクチンの製造、がんおよび／または炎症性疾患の処置に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離されたポリヌクレオチドであって、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４と、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含むポリペプチドと
をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記抗原タンパク質が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープに融合されており、前記ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープがＰａｎ－ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）である、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記抗原タンパク質が、ウイルス、がんまたはサイトカインに由来するタンパク質である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記抗原タンパク質が、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、デングウイルス、オルトミクソウイルス科ウイルス、および結核菌からなる群から選択されるウイルスまたは細菌に由来するタンパク質である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記抗原タンパク質が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープにさらに融合されており、前記ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、前記抗原タンパク質が由来する前記ウイルスに由来するペプチドである、
請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記抗原タンパク質がコロナウイルスに由来する、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記抗原タンパク質が、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質に由来する、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記抗原タンパク質が、前記コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質におけるＳ１サブユニットおよび／またはＳ２サブユニットである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記抗原タンパク質が、前記コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質におけるＳ１サブユニットである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記抗原タンパク質が、前記コロナウイルスＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記膜貫通ドメインが、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ＣＤ８０、または前記抗原タンパク質に由来する改変膜貫通ドメインに由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインがインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記改変膜貫通ドメインが、ＣＯＶＩＤ－１９スパイク（Ｓ）タンパク質の膜近傍ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記膜貫通ドメインおよび／またはシグナル配列が、リンカーを通して前記抗原タンパク質に融合されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記コロナウイルスがＣＯＶＩＤ－１９である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項18】
プロモーター、５’ＵＴＲ、
アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチド、
ＳＧプロモーター、
シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含むポリペプチドをコードする目的遺伝子、
３’ＵＴＲならびに
ポリＡテールを含む、
請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
請求項１に記載の前記ポリヌクレオチドまたは請求項１に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および医薬的に許容されるデリバリー媒体を含む、ワクチン組成物。
【請求項20】
前記デリバリー媒体が、１つもしくは複数のアルファウイルス構造タンパク質からなる粒子または脂質デリバリー系である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項21】
請求項１９に記載の前記ワクチンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象において抗原に対して処置する、予防するおよび／または免疫を付与する方法。
【請求項22】
アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４と、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含むポリペプチドと
をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、
修飾ヌクレオシドを含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記修飾ヌクレオシドが修飾シチジンおよび／または修飾ウリジンである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項24】
前記修飾シチジンが５－メチル－シチジンであり、前記修飾ウリジンがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項25】
前記ポリヌクレオチド中のシチジンの実質的に１００％が修飾シチジンである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記ポリヌクレオチド中のウリジンの１００％未満が修飾ウリジンである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は全体として、アルファウイルスレプリコンおよび抗原を含む効率的なワクチンの分野にならびに抗原を処置するおよび／またはそれに対して免疫を付与する方法および組成物に関する。特に、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）などのコロナウイルス用のワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスは、風邪のように軽度～中等度の上気道疾患を通常には引き起こすウイルスの大きなファミリーである。しかし、過去２０年にわたり新規な３種のコロナウイルスが動物感染源から出現して、重篤かつ広範な病気と死を引き起こしてきた。
【0003】
コロナウイルスは数百種あり、そのほとんどはブタ、ラクダ、コウモリおよびネコなどの動物の間を循環している。時々、これらのウイルスがヒトに感染しいわゆるスピルオーバーイベントと呼ばれる疾患を引き起こすおそれがある。ヒトを病気にする既知の７種のコロナウイルスのうち４種は、軽度～中等度の疾患のみを引き起こす。３種が、より重篤な、さらには致命的な疾患を引き起こすおそれがある。ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は２００２年１１月に出現し、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こした。そのウイルスは２００４年までには消失した。中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）は、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）によって引き起こされる。ラクダの動物感染源から伝染したＭＥＲＳは、２０１２年９月に確認され、散発的かつ局地的なアウトブレイクを引き続き引き起こしている。今世紀に出現した第３の新型コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる。そのウイルスはコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすが、この感染症は２０１９年１２月に中国から出現し、２０２０年３月１１日に世界保健機関によって世界的大流行（パンデミック）と宣言された。(Coronaviruses: https://www.niaid.nih.gov/diseases-conditions/coronaviruses)
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染したほとんどのヒトは、軽度～中等度の呼吸器系の疾患を経験し、特別な処置を必要とせずに回復する。高齢者や心血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患およびがんのような基礎疾患を有するヒトは、深刻な疾患を発症する可能性がより高い。誰しもがＣＯＶＩＤ－１９にかかり、どの年齢でも重症化や死亡の可能性はある。（Coronavirus disease (COVID-19): https://www.who.int/health-topics/coronavirus#tab=tab _1）
【0005】
オミクロン（Ｂ．１．１．５２９変異型）は、２０２１年１１月２４日に新規なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型として南アフリカからＷＨＯに初めて報告された。
【0006】
予備的な証拠によると、懸念される他の変異型と比較して、オミクロンによる再感染のリスクが増大するおそれがあることを示唆する（すなわち、以前にＣＯＶＩＤ－１９に感染したことのある人々は、オミクロンにより再感染しやすくなる可能性がある）。（Update on Omicron: https://www.who.int/news/item/28-11-2021-update-on-omicron）
【0007】
現在のところ、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンはいくつか承認されている。特に、ｍＲＮＡワクチンは９５％を超える有効性を示す。しかし、このパンデミックを防止するためには、より多くのワクチンを世界中に供給する必要がある。いかなる変異型にも効率的なワクチンを世界中に供給するためには、いっそうのワクチン開発が、特に、いかなる変異型にも効率的なワクチンを短時間で製造することができる技術に基づいたワクチンが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】ＷＯ２０２１／２１０６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本開示の目的の一つは、感染症またはがんを予防するかまたは処置するために有効であるウイルス抗原、がん抗原等の抗原に対するワクチンを開発するための新たな設計概念を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、抗原に対する免疫応答を誘導することができる新規な抗原的に活性なタンパク質／ポリペプチドに関する。本明細書に開示のタンパク質／ポリペプチドは、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含む。抗原タンパク質は、コロナウイルス構造タンパク質またはその断片に由来するタンパク質であり得る。
【0011】
コロナウイルス構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質および小エンベロープタンパク質（Ｅ）を含み得る。抗原タンパク質は、構造タンパク質のいずれかまたはそれらの組合わせに由来し得る。抗原タンパク質の具体例として、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットおよび／またはＳ２サブユニット、特にＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を挙げることができる。
【0012】
別の態様では、本開示は、抗原タンパク質に対する防御を誘導することができる上述の新規な抗原的に活性なタンパク質／ポリペプチドをコードする新規のポリヌクレオチドに関する。
【0013】
別の態様では、本開示は、上述の抗原的に活性なタンパク質／ポリペプチドを発現することができる新規のアルファウイルスレプリコンに関する。アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするＲＮＡなどのポリヌクレオチドと、目的遺伝子として上述の抗原的に活性なタンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含む。
【0014】
さらに別の態様では、本開示は、上述のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むワクチンに関する。特に、本開示は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４と、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合された抗原タンパク質を含むポリペプチドと、をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープはユニバーサルエピトープであり得る。抗原タンパク質がウイルス構造タンパク質に由来するタンパク質である場合、ワクチンは、ウイルス感染から対象を予防するおよび／または処置するために使用することができる。
【0015】
さらに別の態様では、本開示は、上述のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ウイルス感染から対象を免疫を付与するか、予防するかまたは処置するための方法に関する。
【0016】
さらに別の態様では、本開示は、医薬の製造のための上述のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用に関する。
【0017】
さらなる態様では、本開示は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４と、抗原ペプチドを含むポリペプチドと、をコードする新規なポリヌクレオチドであって、修飾ヌクレオシド（例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンもしくは５－メチル－シチジンまたは両方）を含む、ポリヌクレオチドに関する。
【0018】
この効率的なワクチン設計はまた、がんまたは炎症性疾患の処置用のワクチンを開発するために適用される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】アルファウイルスレプリコンのコンストラクト。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型のＲＢＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡ。
【図3】ＡＣＥ阻害アッセイ
【図4】自然免疫における修飾ヌクレオシドを有するポリヌクレオチドの効果。
【図5】ＣＯＶＩＤ－１９ 野生株またはガンマ変異型に曝露されたハムスターの体重に対するワクチン組成物（compositions）の効果。
【図6】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２野生株またはガンマ変異型に曝露されたハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイに対するワクチン組成物の効果
【図7】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２野生株またはガンマ変異型に暴露されたハムスターの肺の病理組織学的解析に対するワクチン組成物の効果。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書で使用される場合、「抗原」とは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合することができる分子を指す。抗原は加えて、免疫系が認識することができ、かつ／または、Ｂおよび／もしくはＴリンパ球の活性化をもたらす液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することができる。抗原には、本明細書で使用される場合、それらに限定されないが、ウイルス、アレルゲン、自己抗原、ハプテン、がん抗原（すなわち腫瘍抗原）および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）などの感染性疾患抗原とともに乱用性薬物（ニコチンのような）などの有機小分子、ならびにそれらの断片および誘導体が含まれる。さらに、本開示に使用される抗原は、ペプチド、タンパク質、ドメイン、炭水化物、アルカロイド、例えばステロイドホルモンなどの脂質または小分子およびそれらの断片および誘導体、自己抗体およびサイトカインそれ自体であり得る。本明細書で使用される場合、「抗原ペプチド」とは、抗原として作用することができるタンパク質またはペプチドを指す。
【0021】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」とは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、エボラ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、デングウイルス、またはオルトミクソウイルス（orthymyxoviridae）科ウイルスであり得るが、これらに限定されない。
【0022】
本明細書で使用される場合、「コロナウイルス」とは、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）の科に属する一本鎖のポジティブセンスＲＮＡウイルスを指すこととする。例示的なコロナウイルス科ウイルスには、それらに限定されないが、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ、ＭＥＲＳ－ＣｏｖおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）が含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）は、既知および未知の突然変異型を含むことができる。既知の突然変異型として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｋ４１７Ｔ突然変異型（ガンマ、ブラジル変異型（ｖａｌｉａｎｔ））、Ｔ４７８Ｋ＿Ｌ４５２Ｒ（デルタ、インド変異型）、Ｅ４８４Ｋ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｋ４１７Ｎ突然変異型（ベータ、南アフリカ変異型）、Ｅ４８４Ｋ突然変異型およびＫ４１７Ｎ＿Ｓ４７７Ｎ＿Ｔ４７８Ｋ＿Ｅ４８４Ａ＿Ｑ４９３Ｋ＿Ｇ４４６Ｓ＿Ｎ５０１Ｙ＿Ｙ５０５Ｈ＿Ｇ４９６Ｓ＿Ｑ４９８Ｒ＿Ｎ４４０Ｋ＿Ｇ３３９Ｄ＿Ｓ３７５Ｆ＿Ｓ３７３Ｐ＿Ｓ３７１Ｌ突然変異型（オミクロン）を挙げることができる。コロナウイルスゲノムは、多数の非構造タンパク質と、スパイク（Ｓ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、膜（Ｍ）および小エンベロープ（Ｅ）タンパク質を含む主要な４つの構造タンパク質と、をコードする。大きなエンベロープ糖タンパク質であるスパイク（Ｓ）タンパク質は、Ｓ１サブユニットおよびＳ２サブユニットから構成される。「受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）」はＳ１サブユニットに位置する。本明細書で使用される抗原タンパク質の好ましい例とは、コロナウイルスＲＢＤ、その断片またはその突然変異型である。ＣＯＶＩＤ－１９のスパイクタンパク質、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットおよびＳ２サブユニットおよびＲＢＤならびにその突然変異型が特定され、公開されてきた（Wrapp et al., Science Vol. 367, issue 6483(2020) pp.1260-1263 10.1126/science.abb2507、Z. Wang et al., Nature Vol 592(2021) pp616-622 引用文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0023】
本明細書において使用される「コロナウイルス構造タンパク質」は、天然に存在するウイルス構造タンパク質である場合もあり、その改変タンパク質である場合もある。改変タンパク質は、天然に存在するウイルス構造タンパク質の断片であっても、その突然変異型であってもよい。一実施形態では、改変タンパク質は、天然に存在するウイルス構造タンパク質またはその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、改変タンパク質は、天然に存在するウイルスエンベロープタンパク質またはその断片に対して、アミノ酸のうちの多くても１０％が欠失、置換および／または付加されている突然変異型である。
【0024】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン（ＴＭ）」とは、天然の起源に由来するかまたは合成の起源に由来するかいずれかであるタンパク質である。起源が天然である場合、一部の態様におけるドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。一態様では、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質は、抗原ペプチドのオリジンに対して異種のタンパク質である。膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の例として、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータの各鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４；ヒトにおけるＴＬＲ１～ＴＬＲ１０およびマウスにおけるＴＬＲ１～ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１～ＴＬＲ１３などのトール様受容体（ＴＬＲ）；ＧＰＣＲケモカイン受容体に属するＩＬ－１－２８受容体、ＲＡＮＴＥＳ受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５）、ＭＩＰ－１受容体、ＰＦ４受容体、Ｍ－ＣＳＦ受容体およびＮＡＰ－２受容体などのインターロイキン（ＩＬ）受容体；赤血球凝集素（ヘマグルチニン、ＨＡ）が挙げられる。別の態様では、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質などのＣＯＶＩＤ－１９に由来するタンパク質である。
【0025】
膜貫通タンパク質の例として、以下のもの：５－リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、ＡＣＢＰ、アミロイドベータ（Ａ４）、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＢＮＩＰ、ＣＡＡＸプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０、Ｅ－ＮＰＰ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、脂肪酸デサチュラーゼ、ガンマセクレターゼ、グルコーストランスポーター、グリコフォリン、ＧＰＣＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４、ＨＳＤ－１１β、低酸素誘導タンパク質、免疫グロブリン、インスリン受容体、インテグリン、イオンチャネル、ＭＡＰＥＧ、ＭＦＳ、ＭｉｎＫファミリー、ＭＰＰ、ペプチダーゼＡＤ、ペプチダーゼファミリーＭ４８、ペプチダーゼＭＡ、プロテインジャギド、受容体型キナーゼ、ＳＮＡＲＥ複合体、スルファターゼ、ＴＮＦ受容体、膜貫通タンパク質１４、トランスポーター、ＴＲＯＢＰ、ＶＥＧＦ受容体、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アンモニアおよび尿素トランスポーター、ＦＭＮ結合酸化還元酵素、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）含有膜貫通タンパク質、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、リソソーム関連膜糖タンパク質、主要内在性タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＩＰ）／ＦＮＴスーパーファミリー、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ、Ｎ－（デオキシ）リボシルトランスフェラーゼ様膜タンパク質、中性／アルカリセラミダーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、五量体リガンド依存性イオンチャネル、ロドプシン様受容体およびポンプ、単一ヘリックスＡＴＰａｓｅ調節因子、スクアレン／フィトエンシンターゼ、ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ１、スタニン（ＳＮＮ）膜タンパク質、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖、テトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）アルファ－ヘリカルリピートタンパク質、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマンフォールドドメインを有する膜貫通タンパク質、も挙げられる。
【0026】
加えて、脂質二重層または他の内在性タンパク質およびペプチドに付着されているモノタイプ／周辺タンパク質も、膜貫通タンパク質として使用することができる。例として、アルファ／ベータ－ヒドロラーゼ、アネキシン、Ｂｅｔ Ｖ１様タンパク質、Ｃ１ドメイン含有タンパク質、Ｃ２ドメイン含有タンパク質、ＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼ、ＣＲＡＬ－ＴＲＩＯドメイン含有タンパク質、ＤＮａｓｅ Ｉ様タンパク質、フィブリノーゲン、ＦＹＶＥ／ＰＨＤジンクフィンガータンパク質、ガラクトース結合ドメイン様タンパク質、糖脂質転移タンパク質、免疫グロブリン様スーパーファミリー（Ｅセット）タンパク質、リポカリン、リポキシゲナーゼ、ＰＧＢＤスーパーファミリー、ＰＨドメイン様タンパク質、ホスファチジルイノシトール３－／４－キナーゼ、ＰＬＣ様ホスホジエステラーゼ、ホスホチロシンタンパク質ホスファターゼＩＩ、Ｐループ含有ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素、プロテインキナーゼスーパーファミリー、ＰＸドメイン含有タンパク質、サポシン、シヌクレインおよび転写因子タビーを挙げられる。
【0027】
本開示の一態様では、膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の少なくとも膜貫通領域を含む。加えて、膜貫通ドメインはまた、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）および／または細胞質側末端も含むことができる。
【0028】
あるいは、一部の実施形態での膜貫通ドメインは合成である。一部の態様では、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一部の態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることになる。
【0029】
好ましい膜貫通ドメインは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、ＣＤ８０、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）またはＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質に由来するものであり得る。具体例として、インフルエンザウイルスヘマグルチニン「ＨＡ（フレキシブル－ＴＭ－Ｃｙｔ）」のフレキシブル膜近傍領域またはフレキシブルリンカー、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を含むタンパク質；ヒトＣＤ８０の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端からなるタンパク質；膜貫通ドメイン（ＴＭ）およびＴｏｌｌ／インターロイキン－１受容体ドメイン（ＴＩＲ）からなるタンパク質、ならびにＣＯＶＩＤ－１９スパイク（Ｓ）タンパク質の膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）および膜貫通ドメインからなるタンパク質が挙げられる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」とは、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、またはそれらの修飾ヌクレオシドからなる分子を指す。
【0031】
修飾ヌクレオシドには、それらに限定されないが、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン、シュードシチジン、Ｎ１－メチル－シュードシチジンおよび５－メチル－シチジンが含まれる。
【0032】
シュードウリジンまたはシュードシチジンは、ウラシルまたはシトシンが窒素－炭素グリコシド結合ではなく炭素－炭素を介して付着している、ウリジンまたはシチジンの異性体である。
【0033】
一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンまたは５－メチル－シチジンから独立して選択される。一実施形態では、ｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡに含まれるシチジンおよびウリジンの実質的に１００％が、それぞれ修飾シチジン（例えば５－メチル－シチジン）および修飾ウリジン（例えばＮ１－メチル－シュードウリジン）である。一実施形態では、シチジンの１００％が修飾シチジンであり、８０％のウリジンが修飾ウリジンであり、別の実施形態では、シチジンの５０％が修飾シチジンであり、ウリジンの５０％が修飾ウリジンである。さらに別の実施形態では、ｓａＲＮＡ中の１００％未満のウリジンが修飾ウリジンである。
【0034】
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」（シグナルペプチド、ターゲティングシグナル、局在化シグナル、局在化配列、トランジットペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと呼ばれることもある）とは、文脈に応じて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。シグナル配列は、約９個から２００個までのヌクレオチドまたは３～７０個のアミノ酸の長さであり、コード領域またはタンパク質の５’またはＮ末端に適宜、組み込まれている。一部のシグナル配列は、タンパク質が所望の部位に輸送された後、例えばシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【0035】
一部の実施形態では、ＩＬ－２のシグナル配列、特にヒトＩＬ－２を用いることができる。別の実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質のシグナル配列を用いることができる。
【0036】
本明細書で使用される場合、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープとは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子（ＭＨＣ－ＩＩ）に結合し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫応答を誘発するペプチドである。ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、抗原タンパク質が由来するウイルスに由来するペプチドであり得る。ウイルスタンパク質に由来するＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、既知のエピトープマッピング手順によって特定することができる。本開示では、「ＡＡ」などのリンカーによって連結された多重のＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープからなるペプチドを、「ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ」として使用することができる。あるいは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープはＰａｎ－ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）であり得る。
【0037】
本開示で使用される「ＰＡＤＲＥ」という表現は、Ｐａｎ ＨＬＡ ＤＲ結合エピトープまたはユニバーサルエピトープ、ＨＬＡハプロタイプにかかわりなくほとんど全てのＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化するペプチドを意味する。種々のペプチドがＰＡＤＲＥとして特定され、既知のＰＡＤＲＥのいずれかを本開示で使用することができる。ＰＡＤＲＥの一例は、ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１）である。
【0038】
本明細書で使用される場合、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子（ＭＨＣ－Ｉ）に結合し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を誘発するペプチドである。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、抗原タンパク質が由来するウイルスに由来するペプチドであり得る。ウイルスタンパク質に由来するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、既知のエピトープマッピング手順によって特定することができる。本開示では、「ＡＡ」などのリンカーによって連結された多重のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープからなるペプチドを、「ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ」として使用することができる。
【0039】
抗原タンパク質、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドは、直接に融合されていても、間接に融合されていてもよい。一実施形態では、１つまたは２つのリンカーがそれらの間に介在してもよい。
【0040】
また、コロナウイルス構造タンパク質、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドを切断し、短いリンカーによって置き換えることができる。一部の実施形態では、コロナウイルス構造タンパク質、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル配列は、１つまたは複数のペプチドリンカーを含む。
【0041】
短いリンカーの例は、２個から２５個までのアミノ酸（例えば２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸）からなる。通常、それは、ＳＧ、ＧＳ、ＳＧＧ、ＧＧＳ ＳＧＳＧおよびＴＲＧＧＳなどの長さは２個から１５個までのアミノ酸の長さである。ある特定の状況では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）およびシステイン（Ｃ）などの１個のアミノ酸のみからなることができる。
【0042】
コロナウイルス構造タンパク質が化学架橋リンカーを通してシグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに化学的にコンジュゲートされている場合、架橋リンカーの例として、それらに限定されないが、ＳＭＰＨ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、およびＳＩＡが挙げられる。市場で入手可能な化学架橋リンカーも用いることができる。
【0043】
ＩｇＧ由来の物質もリンカーとして使用することができる。ＩｇＧ由来物質の例として、（ｉ）完全（ヒンジ－ＣＨ２ＣＨ３）（ｉｉ）ハーフ（ヒンジ－ＣＨ３）および（ｉｉｉ）短（１２ａａヒンジのみ）を含むＩｇＧ１～ＩｇＧ４が挙げられる。好ましい例はＩｇＧ４－ＣＨ３である。
【0044】
本明細書で使用される場合、「アルファウイルス」とは、ウイルスのトガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＲＮＡ含有ウイルスを指すこととする。例示的なトガウイルスとして、それらに限定されないが、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、バギークリークウイルスおよびオケルボウイルスが挙げられる。
【0045】
「アルファウイルス構造タンパク質」とは、天然に存在するウイルスカプシドまたはエンベロープタンパク質と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。一実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、またはバギークリークウイルス、と少なくとも約８５％、９０％、９５％またはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する。アルファウイルス構造タンパク質の野生型アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから取得することができる。
【0046】
具体的な実施形態では、アルファウイルスは、ＣＨＩＫＶ、例えばＣＨＩＫＶ株３７９９７またはＬＲ２００６ ＯＰＹ－１である。他の実施形態では、アルファウイルスは、ＶＥＥＶ、例えばＶＥＥＶ株ＴＣ－８３である。
【0047】
「アルファウイルスレプリコン」とは、標的細胞においてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でそれ自体の増幅を誘導することができるＲＮＡ分子を意味する。レプリコンは、ＲＮＡ増幅を触媒するポリメラーゼ（ｎｓｐｌ、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４）をコードするとともに、コードされたポリメラーゼによって認識されかつ利用される、複製に必要とされるシスＲＮＡ配列を含有する。アルファウイルスレプリコンは通常、以下の順序のエレメント：５’ＵＴＲ、アルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４）をコードする配列、３’ＵＴＲおよびポリＡ末端を含有する。アルファウイルスレプリコンは、目的遺伝子の発現を誘導する１つまたは複数のウイルスサブゲノム（ＳＧ）プロモーターも含有する。これらの配列は、先行技術において教示の１つまたは複数の突然変異を有することができる。
【0048】
本開示によって提供されるアルファウイルスレプリコンは、図１に示すコンストラクトを有することができる。
【0049】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法のそれらに帰する意味を有することができ、かつ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと／含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に米国特許法に帰する意味を有するが、その用語はオープンエンドであり、したがって、記載されているものの基本的または新規な特徴が記載されているものを超える存在によって変更されない限り、記載されているものを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。
【0050】
「断片」とは、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部分を意味する。この一部分は、好ましくは、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有することができる。
【0051】
「参照」とは、標準または対照の条件を意味する。
【0052】
「参照配列」とは、配列比較用の基準として使用される規定された配列である。参照配列は、ある特定の配列のサブセットであっても全体であってもよい；例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントであってもよく、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドに関して、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、さらにより好ましくは約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸となる。核酸に関して、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００個のヌクレオチドもしくは約３００個のヌクレオチドまたはそれら付近もしくはそれらの間の任意の整数である。
【0053】
配列同一性は通常、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。かかるソフトウェアによって、相同性の程度を種々の置換、欠失、および／または他の改変に割り当てることにより同一または類似の配列を整合させる。保存的置換には通常、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、この場合、ｅ＜”３＞とｅ＜”１００＞との間の確率スコアによって、密接に関連した配列が指示される。
【0054】
「有効量」とは、未処置の患者に対して疾患の症状を寛解させるのに必要とされる作用剤の量を意味する。疾患の予防または処置のために本開示を実践するのに使用される活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および全体的な健康に応じて変化する。最終的に、主治医または獣医が適当な量および投薬レジメンを決定することになる。かかる量を「有効」量と称する。
【0055】
満足のいく効果は、１～４回の全身投与、例えば筋肉内投与、皮下投与または静脈内投与によって、１０３～１０１０感染単位（ＩＵ）または１回当たり０．０１～５００μｇ、好ましくは１回当たり１０５～１０１０ＩＵまたは０．１～１００μｇ、例えば１回あたり１０７～１０９ＩＵまたは１～５０の量で得ることができる。レプリコンは、好ましくは、従来の様式での投与に適したワクチン組成物に製剤化することができる。本開示は、本明細書に開示のアルファウイルスレプリコンを含むワクチン組成物を提供する。
【0056】
「対象」とは、それらに限定されないが、ヒトまたはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含めて、哺乳動物を意味する。
【0057】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」等の用語は、障害および／またはそれに関連する症状を軽減させるかまたは寛解させることを指す。妨げられるものではないが、障害または状態を処置することは、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に解消されることを必要としないことを理解されたい。
【0058】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」等の用語は、障害または状態を有さないが、障害または状態を発症するリスクがあるかまたは発症しやすい対象における障害または状態を発症する可能性を低減させることを指す。
【0059】
具体的に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解される。
【0060】
具体的に明記されていないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、単数または複数であると理解される。
【0061】
当業者であれば、本明細書および特許請求の範囲に記載のポリヌクレオチド配列が、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を列挙するが、配列がＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられることを承認するであろう。
【0062】
本明細書で提供される任意のワクチン組成物または方法は、本明細書中で提供されるその他のワクチン組成物および方法のうちのいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
【0063】
「ベクター」という用語は、手段であって、これによって核酸配列を生物体間、細胞間、または細胞成分間で伝播および／または導入することができる手段を指す。ベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が含まれ、それらは自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体に統合することができる。ベクターはまた、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内のＤＮＡとＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ－リジンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡ等であり得るが、それらは自律的に複製しない。多くの、全てではないが、一般的な実施形態では、本開示のベクターはプラスミドまたはバクミドである。
【0064】
通常には、発現される核酸分子は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「作動可能に連結され」ており、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御の支配下にある。
【0065】
トランスフェクションの方法および発現媒体の選択は、選択される宿主系に依存することになる。トランスフェクション方法は、例えば、Ausubel et al.（上掲）に記載されている；発現媒体は、例えばCloning Vectors: A Laboratory Manual（P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987）に提供されているものから選択することができる。この段落に引用されている参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【0066】
本開示のコンストラクトの生成向けに様々な発現系が存在する。コンストラクトを生成するのに有用な発現ベクターとして、限定されないが、染色体、エピソーム、およびウイルス由来の各ベクター、例えば、細菌プラスミドに由来する、バクテリオファージに由来する、トランスポゾンに由来する、酵母エピソームに由来する、挿入エレメントに由来する、酵母染色体エレメントに由来する、アルファウイルス［例えばチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）］、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、ならびにそれらの組合せに由来するベクターが挙げられる。
【0067】
本明細書で使用されるコンストラクトおよび／またはベクターは、非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするアルファウイルスポリヌクレオチドと、上述の、シグナル配列および／または膜貫通ドメインに融合されたコロナウイルス構造タンパク質を含むポリペプチドをコードする目的遺伝子と、を含む。
【0068】
ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスの各ベクターであり得る。ヌクレオチドを含むコンストラクトおよび／またはベクターは、非限定的な例であるが、ＣＭＶプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの、適当なプロモーターに作動可能に連結されていることが求められる。他の適切なプロモーターは、宿主細胞および／または所望の発現率に応じて当業者に知られている。発現コンストラクトは、転写開始、終結のための部位、および転写領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。コンストラクトによって発現される転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳開始コドンを最初に含み、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終止コドンを含む。
【0069】
ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。かかるマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリンの各耐性遺伝子が含まれる。ベクターのうちで好ましいのは、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスベクターである。本開示とともに使用することができる他のベクターは、細菌において使用するためのベクターを含み、これは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ－９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。好ましい真核生物ベクターのうちには、ｐＦａｓｔＢａｃｌ ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは当業者にとって容易に明らかになるであろう。
【0070】
組み換えコンストラクトは、調整され得、本明細書に記載のものを含むウイルスタンパク質を真核細胞および／または原核細胞にトランスフェクトし、発現させるために使用することができる。したがって、一実施形態では、本開示は、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥｌまたはそれらの一部を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含有する一ベクター（または複数のベクター）、ならびに、アルファウイルスｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードする核酸と、アルファウイルスレプリコン粒子の形成を可能にする条件下でシグナル配列、コロナウイルスＲＢＤ、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドを含むポリペプチドをコードする目的遺伝子とを含む一ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【0071】
一実施形態では、前記ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、前記組換えバキュロウイルスを昆虫細胞にトランスフェクトする。好ましい実施形態では、前記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、前記昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【0072】
ポリペプチド生成向けの特定の一細菌発現系は大腸菌ｐＥＴ発現系（Novagen,Inc.、Madison、Wis）である。この発現系によれば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ を、発現を可能とするように設計された方向でｐＥＴベクターに挿入する。かかるポリペプチドをコードする遺伝子はＴ７調節シグナルの制御下にあるので、ポリペプチドの発現は宿主細胞におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導することによって行われる。このことは通常には、ＩＰＴＧ誘導に応答してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主株を使用することによって行われる。いったん生成されると、組換えポリペプチドは次いで、当技術分野において知られている標準法、例えば、本明細書に記載の方法に従って単離される。
【0073】
選択されたベクターおよび宿主細胞に応じて、コンストラクトは、組換えタンパク質が発現されかつアルファウイルスレプリコンが生成される条件下で、ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることにより産生され、アルファウイルス構造タンパク質の粒子でパッケージされたアルファウイルスレプリコンを含むコンストラクトが形成される。一実施形態では、コンストラクトを生成する方法であって、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチドと、シグナル配列および／または膜貫通ドメインに融合されたコロナウイルス構造タンパク質を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの目的遺伝子とを含むベクター、ならびに、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのベクターを、適切な宿主細胞内に共トランスフェクトすること、ならびにコンストラクト形成を可能とする条件下で前記アルファウイルス構造タンパク質を発現させることを伴う、方法が提供される。別の実施形態では、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類または哺乳動物の各細胞からなる群から選択される。適当な増殖条件の選択は当技術分野または当業者の範囲内である。
【0074】
本開示のアルファウイルスレプリコン粒子を産生する細胞を増殖させる方法には、それらに限定されないが、バッチ、バッチ供給、連続および潅流細胞培養の各技法が含まれる。一実施形態では、アルファウイルスレプリコンをコードするベクターとカプシドをコードするポリペプチドを含むベクターと、ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶに由来するものなどのエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターとを、共トランスフェクトした細胞が、細胞を増やしかつ精製および単離に向けてタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現させるバイオリアクターまたは発酵チャンバ内で、増殖される。通常、細胞培養は、無菌で、制御された温度および大気の条件下で実施される。バイオリアクターとは、温度、大気、撹拌および／またはｐＨなどの環境条件をモニタリングすることができる、細胞を培養するのに使用されるチャンバである。一実施形態では、バイオリアクターはステンレス鋼チャンバである。別の実施形態では、前記バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標）、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．、引用文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる）である。他の実施形態では、前記予め滅菌されたプラスチックバッグは約１０Ｌ～１０００Ｌのバッグである。
【0075】
別の実施形態では、アルファウイルスレプリコンなどのＲＮＡ分子は、鋳型ＤＮＡ配列から、当技術分野に知られている従来の手順によって創り出すことができる。インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写（ＩＶＴ）方法は、ＲＮＡ分子の鋳型による（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成を可能にする。ＩＶＴ方法は、大量のＲＮＡ転写産物の合成を可能にする。一般に、ＩＶＴは、目的の配列の上流のプロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型を利用する。プロモーター配列は、最も普通には、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６の各プロモーター配列などのバクテリオファージ起源であるが、デノボで設計されたものを含めて、他の多くのプロモーター配列を許容することができる。ＤＮＡ鋳型の転写は通常、特異的バクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによって最適に行われる。例示的なＲＮＡポリメラーゼには、それらに限定されないが、とりわけ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＩＶＴは一般に、ｄｓＤＮＡで開始されるが、一本鎖上で進行することができる。Ｔ７転写キット［ＲｉｂｏＭａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＷＩ米国）］などのインビトロ転写用キット。
【0076】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切である１種または複数の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入物質を意味し、当業者に知られているように、それには、あらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩水、非経口媒体、例えば塩化ナトリウム、およびリンゲルデキストロース）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、例えばエチルオレイン酸）、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、風味剤、染料、輸液および栄養補充薬、そのような材料およびそれらの組合せが含まれる。ワクチン組成物中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、よく知られているパラメータに従って調整される。
【0077】
封入物質とは、ポリヌクレオチドまたはベクターがパッケージングされているデリバリー媒体、例えば、レプリコン粒子（例えば米国特許公開第２０１９／０１８５８２２号に記載のアルファウイルスレプリコン粒子、同文献の内容は参照により組み込まれる）および脂質デリバリー系（例えばリポソーム）、を指す。
【0078】
一部の実施形態では、本開示のワクチン組成物または製剤は、脂質デリバリー系、例えば、リポソーム、リポプレックス（ｌｉｏｐｌｅｘｅｓ）、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンなどのポリヌクレオチドは、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、ポリヌクレオチド指向性タンパク質の生成の有効性を改善することができるが、こういった製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを高めることができるからであり、および／またはコードされたタンパク質の翻訳を高めることができるからである。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を高めることもできる。
【0079】
リポソームとは、脂質二重層から主として構成することができ、医薬製剤の投与向けのデリバリー用媒体として使用することができる、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多層ラメラ小胞（ＭＬＶ）は、数百ナノメートルの直径とすることができ、狭い水性コンパートメントによって隔てられた一連の同心二重層を含有することができる。小型の単一セル小胞（ＳＵＶ）は、直径５０ｎｍよりも小さい場合があり、大型の単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、直径５０～５００ｎｍの間である場合がある。リポソーム設計は、それらに限定されないが、オプソニンまたはリガンドを含んで、非健常組織へのリポソームの付着を改善することができるか、またはそれに限定されないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化することができる。リポソームは、医薬製剤のデリバリーを改善するために、低ｐＨ値を含有しても、高ｐＨ値を含有してもよい。
【0080】
封入される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／もしくはデリバリー中に付随するさらなる任意のプロセス、意図される適用に最適な小胞のサイズ、多分散性および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチごとの再現性およびスケールアップ生産性等によって、リポソームの形成が左右されてもよい。
【0081】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンなどのポリヌクレオチドは、リポソームによって封入されてもよく、および／または、リポソームによって次いで封入することができる水性コア中に含有させてもよい。
【0082】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンなどのポリヌクレオチドは、カチオン性の水中油型エマルジョンで製剤化することができ、ここで、エマルジョン粒子は、油性のコアおよびカチオン性脂質を含み、これらが、ポリヌクレオチドと相互作用し、その結果、分子をエマルジョン粒子に係留することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、親水性相が分散されている連続疎水性相を含む油中水型エマルジョンで製剤化することができる。
【0083】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンなどのポリヌクレオチドは、脂質ポリカチオン複合体で製剤化することができる。非限定的な例として、ポリカチオンとして、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、それらに限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンならびにカチオン性ペプチドを挙げることができる。
【0084】
一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤化することができる。
【0085】
脂質ナノ粒子製剤は通常、１つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質はカチオン性またはイオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、および粒子の凝集を低減することができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含めて、他の成分をさらに含む。一部の実施形態では、脂質組成物中のカチオン性およびイオン化可能な脂質の量は、約０．０１ｍｏｌ％から約９９ｍｏｌ％までの範囲である。
【0086】
ＬＮＰはｐＨ感受性イオン化可能なカチオン性脂質を含有し、この脂質は、アニオン性核酸を引き付けて自己集合性ナノ粒子のコアを形成し、その結果、高カプセル化を確実にする。生理的ｐＨにて、ＬＮＰは中性であり、常にカチオン性である分子によって見られる毒性のメカニズムを排除する。
【0087】
これらの同じｐＨ感受性脂質は、エンドソームの酸性環境に応答することおよびエンドソームの破壊と細胞への核酸の放出とを誘発すること、に関与する。
【0088】
本レプリコンベースのワクチン技術は、ＲＮＡが自己増幅してワクチン抗原を生成することができかつ細胞性臓器にデリバリーすることができるので、ワクチン接種のための独特なプラットフォーム技術である。さらに、本レプリコンベースのワクチン技術によれば、ゲノム統合のリスクまたは投与に必要な高用量およびデバイス、例えばエレクトロポレーションなどの、ＤＮＡベースのワクチンに共通して関連する課題が克服されるとともに、ｍＲＮＡ技術に勝る、自己複製システムに基づく最小用量をもってしてより高い免疫原性が期待される。また、本発明者らは、シグナル配列、膜貫通ドメインならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドを有する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に基づいて、抗原を設計した。好ましい実施形態には、免疫原性を増強するために、ＰＡＤＲＥなどのＣＤ４＋ Ｔ細胞のユニバーサルエピトープが含まれる。
【0089】
一実施形態では、ワクチン組成物は、一種類のアルファウイルスレプリコンのみを含有する、一価であってもよい。別の実施形態では、ワクチン組成物は二価であり、異なる株または変異型に由来する抗原タンパク質をコードする二種類のアルファウイルスレプリコンを含みうる。
【0090】
本開示によれば、新規な抗原的に活性なタンパク質／ポリペプチドはまた、コロナウイルスに対する診断および防御向けの抗体を生成するためにも、一方、ＡＤＥの可能性を最小とするためにも、有用である。本明細書に開示のタンパク質／ポリペプチドは、免疫原性を最大化し、ＡＤＥを最小化することを意図した、シグナル配列、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）ならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープから選択される少なくとも１つのペプチドに融合されたコロナウイルスＲＢＤをコードする最小配列を含む。
【0091】
こういった効率的なワクチン設計はまた、がんまたは炎症性疾患に対するワクチンの開発にも適用され得る。
【0092】
本発明を以下の実施例を参照して詳細に説明するが、それらは本出願の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例1】
【0093】
下に示すコンストラクト１をコードする遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（https://www.idtdna.com/pages）によって合成された。
【0094】
コンストラクト１
コンストラクト１の全アミノ酸は以下のとおりである：
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAA（配列番号２）
シグナル配列ＣＯＶＩＤ１９（１－１３）：
MFVFLVLLPLVSS（配列番号３）
ＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）変異型］：
VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号４）
ＨＡリンカー：
GVKLESMGIY（配列番号５）
ＨＡ ＴＭ：
QILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号６）
ＰＡＤＲＥ：
AKFVAAWTLKAAA（配列番号１）
【化1】
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAA（配列番号２）
シグナル配列ＣＯＶＩＤ１９（１－１３）：
MFVFLVLLPLVSS（配列番号３）
ＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）変異型］：
VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号４）
ＨＡリンカー：
GVKLESMGIY（配列番号５）
ＨＡ ＴＭ：
QILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号６）
ＰＡＤＲＥ：
AKFVAAWTLKAAA（配列番号１）
【実施例2】
【0095】
下に示すコンストラクト２および３をコードする遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（https://www.idtdna.com/pages）によって合成された。
コンストラクト２
全アミノ酸：
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAA*（配列番号７）
シグナル配列：
MFVFLVLLPLVSS（配列番号３）
ＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ（オミクロン変異型）：
VRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号８）
ＨＡリンカー：
GVKLESMGIY（配列番号５）
ＨＡ ＴＭ：
QILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号６）
ＰＡＤＲＥ：
AKFVAAWTLKAAA（配列番号１）
コンストラクト３
全アミノ酸：
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAAgaaVYFLQSINFNAASPRWYFYYLNARLNEVAKNLKFIAGLIAIVNAAANFKDQVILLGAAAVLQSGFRKGAAAYYQLYSTQLNLITGRLQSLKLQLPQGTTLNAAKTFPPTEPKKAAGDAALALLLLNAAAMEVTPSGTWLGAGVAMPNLYKKAATLACFVLAAVNAAGLMWLSYFIGLWLLWPVTLNKQFDTYNLW*（配列番号９）
リンカー：
gaa
ＣＤ８エピトープ：
VYFLQSINFNAASPRWYFYYLNARLNEVAKNLKFIAGLIAIVNAAANFKDQVILLGAAAVLQSGFRKGAAAYYQLYSTQLNLITGRLQSLKLQLPQGTTLNAAKTFPPTEPKKAAGDAALALLLLNAAAMEVTPSGTWLGAGVAMPNLYKKAATLACFVLAAVNAAGLMWLSYFIGLWLLWPVTLNKQFDTYNLW（配列番号１０）
コンストラクト２
【化2】
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAA*（配列番号７）
シグナル配列：
MFVFLVLLPLVSS（配列番号３）
ＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ（オミクロン変異型）：
VRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号８）
ＨＡリンカー：
GVKLESMGIY（配列番号５）
ＨＡ ＴＭ：
QILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号６）
ＰＡＤＲＥ：
AKFVAAWTLKAAA（配列番号１）
コンストラクト３
【化3】
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLKSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICIAKFVAAWTLKAAAgaaVYFLQSINFNAASPRWYFYYLNARLNEVAKNLKFIAGLIAIVNAAANFKDQVILLGAAAVLQSGFRKGAAAYYQLYSTQLNLITGRLQSLKLQLPQGTTLNAAKTFPPTEPKKAAGDAALALLLLNAAAMEVTPSGTWLGAGVAMPNLYKKAATLACFVLAAVNAAGLMWLSYFIGLWLLWPVTLNKQFDTYNLW*（配列番号９）
リンカー：
gaa
ＣＤ８エピトープ：
VYFLQSINFNAASPRWYFYYLNARLNEVAKNLKFIAGLIAIVNAAANFKDQVILLGAAAVLQSGFRKGAAAYYQLYSTQLNLITGRLQSLKLQLPQGTTLNAAKTFPPTEPKKAAGDAALALLLLNAAAMEVTPSGTWLGAGVAMPNLYKKAATLACFVLAAVNAAGLMWLSYFIGLWLLWPVTLNKQFDTYNLW（配列番号１０）
【実施例3】
【0096】
レプリコンベクターの調製
アルファウイルスレプリコンの概略のコンストラクトを図１に示す。
アルファウイルスレプリコンの概略のコンストラクトを図１に示す。
【0097】
実施例１で調製した目的のＤＮＡの遺伝子を、サブゲノム（ＳＧ）プロモーターの制御下でＶＥＥＶレプリコンベクターにクローニングした。各断片をコードするＶＥＥＶレプリコンプラスミドをＡｓｃＩおよびＳｂｆＩ制限部位にての挿入により作製し、完全長ＶＥＥＶ ＴＣ－８３レプリコンコンストラクトを得た。
【0098】
ＳＧプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリＡテールのヌクレオチド配列は以下のとおりである。ＲＮＡ配列は、それらのＤＮＡ配列を鋳型として使用することによって得た。
ＳＧプロモーター：ｃｃｔｇａａｔｇｇａｃｔａｃｇａｃａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇ（配列番号１１）
５’ＵＴＲ：ａｔａｇｇｃｇｇｃｇｃａｔｇａｇａｇａａｇｃｃｃａｇａｃｃａａｔｔａｃｃｔａｃｃｃａａａ（配列番号１２）
３’ＵＴＲ：ｇｃｇａｔｃｇｃａｔａｃａｇｃａｇｃａａｔｔｇｇｃａａｇｃｔｇｃｔｔａｃａｔａｇａａｃｔｃｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｔｇｃｃｇｃｃｔｔａａａａｔｔｔｔｔａｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｃｇａａｔｃｇｇａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔａａｔａｔｔｔｃ（配列番号１３）
ポリＡテール：ａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号１４）
ＳＧプロモーター：ｃｃｔｇａａｔｇｇａｃｔａｃｇａｃａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇ（配列番号１１）
５’ＵＴＲ：ａｔａｇｇｃｇｇｃｇｃａｔｇａｇａｇａａｇｃｃｃａｇａｃｃａａｔｔａｃｃｔａｃｃｃａａａ（配列番号１２）
３’ＵＴＲ：ｇｃｇａｔｃｇｃａｔａｃａｇｃａｇｃａａｔｔｇｇｃａａｇｃｔｇｃｔｔａｃａｔａｇａａｃｔｃｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｔｇｃｃｇｃｃｔｔａａａａｔｔｔｔｔａｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｃｇａａｔｃｇｇａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔａａｔａｔｔｔｃ（配列番号１３）
ポリＡテール：ａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号１４）
【0099】
ＶＥＥＶ ＴＣ－８３レプリコンｎｓＰ１－４のアミノ酸配列は以下のとおりである。
MEKVHVDIEEDSPFLRALQRSFPQFEVEAKQVTDNDHANARAFSHLASKLIETEVDPSDTILDIGSAPARRMYSKHKYHCICPMRCAEDPDRLYKYATKLKKNCKEITDKELDKKMKELAAVMSDPDLETETMCLHDDESCRYEGQVAVYQDVYAVDGPTSLYHQANKGVRVAYWIGFDTTPFMFKNLAGAYPSYSTNWADETVLTARNIGLCSSDVMERSRRGMSILRKKYLKPSNNVLFSVGSTIYHEKRDLLRSWHLPSVFHLRGKQNYTCRCETIVSCDGYVVKRIAISPGLYGKPSGYAATMHREGFLCCKVTDTLNGERVSFPVCTYVPATLCDQMTGILATDVSADDAQKLLVGLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFARWAKEYKEDQEDERPLGLRDRQLVMGCCWAFRRHKITSIYKRPDTQTIIKVNSDFHSFVLPRIGSNTLEIGLRTRIRKMLEEHKEPSPLITAEDIQEAKCAADEAKEVREAEELRAALPPLAADFEEPTLEADVDLMLQEAGAGSVETPRGLIKVTSYAGEDKIGSYAVLSPQAVLKSEKLSCIHPLAEQVIVITHSGRKGRYAVEPYHGKVVVPEGHAIPVQDFQALSESATIVYNEREFVNRYLHHIATHGGALNTDEEYYKTVKPSEHDGEYLYDIDRKQCVKKELVTGLGLTGELVDPPFHEFAYESLRTRPAAPYQVPTIGVYGVPGSGKSGIIKSAVTKKDLVVSAKKENCAEIIRDVKKMKGLDVNARTVDSVLLNGCKHPVETLYIDEAFACHAGTLRALIAIIRPKKAVLCGDPKQCGFFNMMCLKVHFNHEICTQVFHKSISRRCTKSVTSVVSTLFYDKRMRTTNPKETKIVIDTTGSTKPKQDDLILTCFRGWVKQLQIDYKGNEIMTAAASQGLTRKGVYAVRYKVNENPLYAPTSEHVNVLLTRTEDRIVWKTLAGDPWIKILTAKYPGNFTATIEEWQAEHDAIMRHILERPDPTDVFQNKANVCWAKALVPVLKTAGIDMTTEQWNTVDYFETDKAHSAEIVLNQLCVRFFGLDLDSGLFSAPTVPLSIRNNHWDNSPSPNMYGLNKEVVRQLSRRYPQLPRAVATGRVYDMNTGTLRNYDPRINLVPVNRRLPHALVLHHNEHPQSDFSSFVSKLKGRTVLVVGEKLSVPGKKVDWLSDQPEATFRARLDLGIPGDVPKYDIVFINVRTPYKYHHYQQCEDHAIKLSMLTKKACLHLNPGGTCVSIGYGYADRASESIIGAIARQFKFSRVCKPKSSHEETEVLFVFIGYDRKARTHNPYKLSSTLTNIYTGSRLHEAGCAPSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGESMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVEETPESPAENQSTEGTPEQPALVNVDATRTRMPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGSPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLDGASVTSGAVSAETNSYFARSMEFRARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPPLAHSRASSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRAPSRSASRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQXRFDAGAYIFSSDTGQGHLQQKSVRQTVLSEVVLERTELEISYAPRLDQEKEELLRKKLQLNPTPANRSRYQSRRVENMKAITARRILQGLGHYLKAEGKVECYRTLHPVPLYSSSVNRAFSSPKVAVEACNAMLKENFPTVASYCIIPEYDAYLDMVDGASCCLDTASFCPAKLRSFPKKHSYLEPTIRSAVPSAIQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPVLDSAAFNVECFKKYACNNEYWETFKENPIRLTEENVVNYITKLKGPKAAALFAKTHNLNMLQDIPMDRFVMDLKRDVKVTPGTKHTEERPKVQVIQAADPLATADLCGIHRELVRRLNAVLLPNIHTLFDMSAEDFDAIIAEHFQPGDCVLETDIASFDKSEDDAMALTALMILEDLGVDAELLTLIEAAFGEISSIHLPTKTKFKFGAMMKSGMFLTLFVNTVINIVIASRVLRERLTGSPCAAFIGDDNIVKGVKSDKLMADRCATWLNMEVKIIDAVVGEKAPYFCGGFILCDSVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLAVDDEHDDDRRRALHEESTRWNRVGILPELCKAVESRYETVGTSIIVMAMTTLASSVKSFSYLRGAPITLYG（配列番号１５）
ｎｓｐ３に相当するアミノ酸配列は下線が引かれている。
MEKVHVDIEEDSPFLRALQRSFPQFEVEAKQVTDNDHANARAFSHLASKLIETEVDPSDTILDIGSAPARRMYSKHKYHCICPMRCAEDPDRLYKYATKLKKNCKEITDKELDKKMKELAAVMSDPDLETETMCLHDDESCRYEGQVAVYQDVYAVDGPTSLYHQANKGVRVAYWIGFDTTPFMFKNLAGAYPSYSTNWADETVLTARNIGLCSSDVMERSRRGMSILRKKYLKPSNNVLFSVGSTIYHEKRDLLRSWHLPSVFHLRGKQNYTCRCETIVSCDGYVVKRIAISPGLYGKPSGYAATMHREGFLCCKVTDTLNGERVSFPVCTYVPATLCDQMTGILATDVSADDAQKLLVGLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFARWAKEYKEDQEDERPLGLRDRQLVMGCCWAFRRHKITSIYKRPDTQTIIKVNSDFHSFVLPRIGSNTLEIGLRTRIRKMLEEHKEPSPLITAEDIQEAKCAADEAKEVREAEELRAALPPLAADFEEPTLEADVDLMLQEAGAGSVETPRGLIKVTSYAGEDKIGSYAVLSPQAVLKSEKLSCIHPLAEQVIVITHSGRKGRYAVEPYHGKVVVPEGHAIPVQDFQALSESATIVYNEREFVNRYLHHIATHGGALNTDEEYYKTVKPSEHDGEYLYDIDRKQCVKKELVTGLGLTGELVDPPFHEFAYESLRTRPAAPYQVPTIGVYGVPGSGKSGIIKSAVTKKDLVVSAKKENCAEIIRDVKKMKGLDVNARTVDSVLLNGCKHPVETLYIDEAFACHAGTLRALIAIIRPKKAVLCGDPKQCGFFNMMCLKVHFNHEICTQVFHKSISRRCTKSVTSVVSTLFYDKRMRTTNPKETKIVIDTTGSTKPKQDDLILTCFRGWVKQLQIDYKGNEIMTAAASQGLTRKGVYAVRYKVNENPLYAPTSEHVNVLLTRTEDRIVWKTLAGDPWIKILTAKYPGNFTATIEEWQAEHDAIMRHILERPDPTDVFQNKANVCWAKALVPVLKTAGIDMTTEQWNTVDYFETDKAHSAEIVLNQLCVRFFGLDLDSGLFSAPTVPLSIRNNHWDNSPSPNMYGLNKEVVRQLSRRYPQLPRAVATGRVYDMNTGTLRNYDPRINLVPVNRRLPHALVLHHNEHPQSDFSSFVSKLKGRTVLVVGEKLSVPGKKVDWLSDQPEATFRARLDLGIPGDVPKYDIVFINVRTPYKYHHYQQCEDHAIKLSMLTKKACLHLNPGGTCVSIGYGYADRASESIIGAIARQFKFSRVCKPKSSHEETEVLFVFIGYDRKARTHNPYKLSSTLTNIYTGSRLHEAGCAPSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGESMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVEETPESPAENQSTEGTPEQPALVNVDATRTRMPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGSPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLDGASVTSGAVSAETNSYFARSMEFRARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPPLAHSRASSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRAPSRSASRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQXRFDAGAYIFSSDTGQGHLQQKSVRQTVLSEVVLERTELEISYAPRLDQEKEELLRKKLQLNPTPANRSRYQSRRVENMKAITARRILQGLGHYLKAEGKVECYRTLHPVPLYSSSVNRAFSSPKVAVEACNAMLKENFPTVASYCIIPEYDAYLDMVDGASCCLDTASFCPAKLRSFPKKHSYLEPTIRSAVPSAIQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPVLDSAAFNVECFKKYACNNEYWETFKENPIRLTEENVVNYITKLKGPKAAALFAKTHNLNMLQDIPMDRFVMDLKRDVKVTPGTKHTEERPKVQVIQAADPLATADLCGIHRELVRRLNAVLLPNIHTLFDMSAEDFDAIIAEHFQPGDCVLETDIASFDKSEDDAMALTALMILEDLGVDAELLTLIEAAFGEISSIHLPTKTKFKFGAMMKSGMFLTLFVNTVINIVIASRVLRERLTGSPCAAFIGDDNIVKGVKSDKLMADRCATWLNMEVKIIDAVVGEKAPYFCGGFILCDSVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLAVDDEHDDDRRRALHEESTRWNRVGILPELCKAVESRYETVGTSIIVMAMTTLASSVKSFSYLRGAPITLYG（配列番号１５）
ｎｓｐ３に相当するアミノ酸配列は下線が引かれている。
【実施例4】
【0100】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入された自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の調製
実施例１および２で調製したコンストラクト１～３をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを使用した。ＤＮＡを直鎖化し、鋳型として使用した。Ｔ７インビトロ転写を、Ｔ７転写キット［ＲｉｂｏＭａｘ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、（ＷＩ米国）］によって提供されるプロトコルに基づいて実施した。直鎖ＤＮＡ鋳型をＴ７酵素およびｒＮＴＰと混合してＲＮＡを合成した。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡの合成の場合、５－メチル－シチジンおよびＮ１－メチル－シュードウリジン三リン酸などの修飾ＮＴＰをインビトロ転写反応混合物に添加した。精製ＲＮＡ生成物をワクシニアキャッピング酵素を使用してキャッピングし、その結果、自己増幅ＲＮＡを得た。
実施例１および２で調製したコンストラクト１～３をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを使用した。ＤＮＡを直鎖化し、鋳型として使用した。Ｔ７インビトロ転写を、Ｔ７転写キット［ＲｉｂｏＭａｘ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、（ＷＩ米国）］によって提供されるプロトコルに基づいて実施した。直鎖ＤＮＡ鋳型をＴ７酵素およびｒＮＴＰと混合してＲＮＡを合成した。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡの合成の場合、５－メチル－シチジンおよびＮ１－メチル－シュードウリジン三リン酸などの修飾ＮＴＰをインビトロ転写反応混合物に添加した。精製ＲＮＡ生成物をワクシニアキャッピング酵素を使用してキャッピングし、その結果、自己増幅ＲＮＡを得た。
【0101】
上と同じ様式で、ＣＯＶＩＤ１９シグナル配列、Ｗｕｈａｎ（武漢）株のＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ、ＨＡリンカーおよびＨＡ ＴＭからなる対照コンストラクト「ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ」をコードする目的遺伝子を含むｓａＲＮＡ、ならびに、ＣＯＶＩＤ１９シグナル配列、ブラジル（ガンマ）変異型のＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤ、ＨＡリンカーおよびＨＡ ＴＭからなるコンストラクト「ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ」をコードする目的遺伝子を含むｓａＲＮＡも得た。
【0102】
「ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ」のアミノ酸配列は以下のとおりである：
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号１６）
MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号１６）
【0103】
上記において、Ｗｕｈａｎ株のＣＯＶＩＤ－１９－ＲＢＤのアミノ酸配列は以下のとおりである：
VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号１７）
VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKST（配列番号１７）
【0104】
得られたｓａＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入して、ｓａＲＮＡ粒子を得た。得られたｓａＲＮＡ粒子を以下の実施例で使用した。
【実施例5】
【0105】
免疫
方法：ゴールデンシリアンハムスター（1群あたりｎ＝１２）に、０週および４週に、ＨＡ膜貫通を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ株）（ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ）、ＨＡ膜貫通を有するＲＢＤブラジル（ガンマ）［ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ］および実施例１のコンストラクト１、すなわちＨＡ膜貫通＋ＰＡＤＲＥを有するＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）］［ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥ］を発現するｓａＲＮＡ ＬＮＰ １０ｕｇ、またはＰＢＳ（プラセボ）、を筋肉内に２回免疫した。第２の免疫の４週間後（５５日目）の免疫ハムスターからの血清の抗体価を、Ｗｕｈａｎ株、ブラジル変異型、インドデルタ変異型、インドデルタ＋変異型およびコロンビアＭｕ変異型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤタンパク質に対して、ＥＬＩＳＡによって評価した。結果を図２に示す。
方法：ゴールデンシリアンハムスター（1群あたりｎ＝１２）に、０週および４週に、ＨＡ膜貫通を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ株）（ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ）、ＨＡ膜貫通を有するＲＢＤブラジル（ガンマ）［ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ］および実施例１のコンストラクト１、すなわちＨＡ膜貫通＋ＰＡＤＲＥを有するＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）］［ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥ］を発現するｓａＲＮＡ ＬＮＰ １０ｕｇ、またはＰＢＳ（プラセボ）、を筋肉内に２回免疫した。第２の免疫の４週間後（５５日目）の免疫ハムスターからの血清の抗体価を、Ｗｕｈａｎ株、ブラジル変異型、インドデルタ変異型、インドデルタ＋変異型およびコロンビアＭｕ変異型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤタンパク質に対して、ＥＬＩＳＡによって評価した。結果を図２に示す。
【0106】
結果：ＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）］－ＴＭ－ＰＡＤＲＥで免疫した血清中の抗体は、ＲＢＤ［ブラジル（ガンマ）］－ＴＭで免疫した血清中の抗体と比較して、各ＲＢＤ変異型に対して３倍超のより高い抗体（ＩＣ５０力価）を誘導した。
【実施例6】
【0107】
ＡＣＥ２阻害アッセイ
方法：市販のキット（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｌ００８４７）を使用して、ＲＢＤ変異型とＡＣＥ２との結合に対する、実施例４で調製したワクチンで免疫したハムスターから得た血清の阻害効果について試験した。血清を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたＲＢＤ変異型とともに３７℃で３０分間インキュベートした。混合物をＡＣＥ２コーティングの９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ基質を添加し、室温で１５分間インキュベートした。４５０ｎｍにての吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。吸光度から下の式に従って阻害を算出した。
阻害（％）＝（１－試料の吸光度／陰性対照の平均の吸光度）×１００
結果を図３に示す。
方法：市販のキット（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｌ００８４７）を使用して、ＲＢＤ変異型とＡＣＥ２との結合に対する、実施例４で調製したワクチンで免疫したハムスターから得た血清の阻害効果について試験した。血清を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたＲＢＤ変異型とともに３７℃で３０分間インキュベートした。混合物をＡＣＥ２コーティングの９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ基質を添加し、室温で１５分間インキュベートした。４５０ｎｍにての吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。吸光度から下の式に従って阻害を算出した。
阻害（％）＝（１－試料の吸光度／陰性対照の平均の吸光度）×１００
結果を図３に示す。
【0108】
結果：全てのワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＢＡ．２変異型およびＷｕｈａｎ株に対して阻害効果を有し、中でもブラジルのガンマＰＡＤＲＥワクチンが最も高い阻害効果を示した。
【実施例7】
【0109】
自然免疫における修飾ヌクレオシドの効果
方法：ＩＦＮ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＩＳＲＥ）と組み合わせたインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）５４の最小プロモーターの制御下で分泌型ルシフェラーゼ（Ｌｕｃａ遺伝子）を特徴とする、ＴＨＰ－１ Ｄｕａｌ ｃｅｌｌ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。実施例１のコンストラクト１（試料１）とシチジンの代わりに５－メチル－シチジンが使用されたことを条件とする実施例１のコンストラクト１（試料２）とのＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）誘導効果について試験した。継代培養のＴＨＰ－１デュアル細胞を回収し、培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ）を用いて細胞懸濁液５．６×１０５個細胞／ｍＬを調製した。この細胞懸濁液１８０μＬを９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（対照）、またはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）と試料１もしくは試料２との混合物、２０μＬをウェルごとに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
方法：ＩＦＮ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＩＳＲＥ）と組み合わせたインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）５４の最小プロモーターの制御下で分泌型ルシフェラーゼ（Ｌｕｃａ遺伝子）を特徴とする、ＴＨＰ－１ Ｄｕａｌ ｃｅｌｌ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。実施例１のコンストラクト１（試料１）とシチジンの代わりに５－メチル－シチジンが使用されたことを条件とする実施例１のコンストラクト１（試料２）とのＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）誘導効果について試験した。継代培養のＴＨＰ－１デュアル細胞を回収し、培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ）を用いて細胞懸濁液５．６×１０５個細胞／ｍＬを調製した。この細胞懸濁液１８０μＬを９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（対照）、またはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）と試料１もしくは試料２との混合物、２０μＬをウェルごとに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
【0110】
培養上清２０μＬを別の９６ウェル白色プレートへと小分けし、発泡性試薬（ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）溶液５０μＬを各ウェルに添加し、発光強度を添加直後に測定した。
【0111】
【0112】
試料１（シチジンを使用）と比較して、試料２（５－メチル－シチジン、修飾ヌクレオシドを使用）のＩＲＦ誘導はより低く、自然免疫刺激作用の明らかな低下が認められた。
【実施例8】
【0113】
動物試験
ゴールデンシリアンハムスター（各群Ｎ＝６）に、実施例４で調製したｓａＲＮＡ １０ｕｇを筋肉内に２回注射した。この実施例で使用したｓａＲＮＡは、０週および４週にての、ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ、ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ、およびＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥであった。ハムスターを、５６日目に生のＳＡＲＳＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ株（ＷＴ）またはブラジル株（ガンマ）変異型に暴露させた。
ゴールデンシリアンハムスター（各群Ｎ＝６）に、実施例４で調製したｓａＲＮＡ １０ｕｇを筋肉内に２回注射した。この実施例で使用したｓａＲＮＡは、０週および４週にての、ＲＢＤ（Ｗｕｈａｎ）－ＴＭ、ＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ、およびＲＢＤ（ブラジル）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥであった。ハムスターを、５６日目に生のＳＡＲＳＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ株（ＷＴ）またはブラジル株（ガンマ）変異型に暴露させた。
【0114】
体重測定
方法：
体重を曝露後毎日記録し、試験５６日目から試験６４日目の終了まで体重変化の平均パーセンテージを記録した。
方法：
体重を曝露後毎日記録し、試験５６日目から試験６４日目の終了まで体重変化の平均パーセンテージを記録した。
【0115】
結果：
結果を図５に示す。ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥで免疫した群は、ＷＴ株曝露ハムスターにおいて、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭまたはＲＢＤ（ＷＴ）－ＴＭの免疫群と同様のレベルまでハムスターの体重減少を防止した（左パネル）。他方、ガンマ型曝露動物のＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥでは体重の減少は観察されなかったが、一方、他の２つの群は軽度の減少を呈した（右パネル）。
結果を図５に示す。ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥで免疫した群は、ＷＴ株曝露ハムスターにおいて、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭまたはＲＢＤ（ＷＴ）－ＴＭの免疫群と同様のレベルまでハムスターの体重減少を防止した（左パネル）。他方、ガンマ型曝露動物のＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥでは体重の減少は観察されなかったが、一方、他の２つの群は軽度の減少を呈した（右パネル）。
【0116】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイ
方法：
口腔スワブを、曝露後の選択時点で麻酔動物から採取し、１ｍＬ当たりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＮＡコピー量について検査した。このアッセイの検出下限は５０ＲＮＡコピー／ｍＬである。
方法：
口腔スワブを、曝露後の選択時点で麻酔動物から採取し、１ｍＬ当たりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＮＡコピー量について検査した。このアッセイの検出下限は５０ＲＮＡコピー／ｍＬである。
【0117】
結果：
結果を図６に示す。ＷＴ株（左のパネル）またはガンマ型（右のパネル）の各曝露後の、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭまたはＲＢＤ（ＷＴ）－ＴＭの各免疫群と比較して、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥ免疫群では口腔スワブウイルスＲＮＡ量のより大幅な減少が観察された。
結果を図６に示す。ＷＴ株（左のパネル）またはガンマ型（右のパネル）の各曝露後の、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭまたはＲＢＤ（ＷＴ）－ＴＭの各免疫群と比較して、ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥ免疫群では口腔スワブウイルスＲＮＡ量のより大幅な減少が観察された。
【0118】
組織学
方法：
剖検時に、左肺を採取し、組織病理学的解析用に１０％中性緩衝ホルマリンに入れた。組織切片をトリミングし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドへと処理した。
方法：
剖検時に、左肺を採取し、組織病理学的解析用に１０％中性緩衝ホルマリンに入れた。組織切片をトリミングし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドへと処理した。
【0119】
結果：
結果を図７に示す。ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥで免疫した群では、ＷＴ株（左から第３の列、上）またはガンマ型（左から第３の列、下）の各曝露後の肺組織において病理学的所見の発生が防止された。
結果を図７に示す。ＲＢＤ（ガンマ）－ＴＭ－ＰＡＤＲＥで免疫した群では、ＷＴ株（左から第３の列、上）またはガンマ型（左から第３の列、下）の各曝露後の肺組織において病理学的所見の発生が防止された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】