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特表2024-545273哺乳動物細胞における異種ポリペプチドの効率的な発現および分泌に関するシグナルペプチドのスクリーニング法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】哺乳動物細胞における異種ポリペプチドの効率的な発現および分泌に関するシグナルペプチドのスクリーニング法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20241128BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241128BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241128BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241128BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241128BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20241128BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241128BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/867 Z
C12N5/10
C40B40/06
C12Q1/6869 Z
C12N15/86 Z
C12N15/62 Z
C12P21/02 C
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C07K19/00
G01N33/53 D
G01N33/536 D
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024536406
(86)(22)【出願日】2022-12-23
(85)【翻訳文提出日】2024-06-27
(86)【国際出願番号】 FI2022050871
(87)【国際公開番号】W WO2023118670
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】20216346
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524229196
【氏名又は名称】ヘルシンギン イリオピスト
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】パーヴィライネン，ヴィレ
(72)【発明者】
【氏名】ケロサロ，ユホ
(72)【発明者】
【氏名】カールスン，ポール
(72)【発明者】
【氏名】ロスティ，カーチャ
(72)【発明者】
【氏名】グリーン，マリナ
(72)【発明者】
【氏名】ナネカール，ラーフル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR75
4B063QR76
4B063QR77
4B063QS05
4B063QS25
4B063QS33
4B063QX01
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、哺乳動物細胞において異種ポリペプチドを高効率で発現および分泌させるためのシグナルペプチドをスクリーニングする方法を対象とするが、この方法は：各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；該ポリヌクレオチドが：（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、および（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、を含む、プールを提供する工程；各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり；あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；および宿主細胞における目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程、を含む。本開示は、該方法に用いるベクター、宿主細胞またはＤＮＡライブラリーをも対象とする。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物細胞において異種ポリペプチドを高効率で発現および分泌させるためのシグナルペプチドをスクリーニングする方法であって、該方法が：（ａ）各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；
ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；
該ポリヌクレオチドが：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、
プールを提供する工程；
（ｂ）各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；
（ｄ）該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり；
あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；
ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、
該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；
（ｅ）任意選択的に該宿主細胞を第２の結合試薬、好ましくは抗体に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が標識した結合試薬でない場合には、該第２の結合試薬が蛍光標識されており；
ここで該第２の結合試薬が該第１の結合試薬に特異的に結合する、
接触させる工程；
（ｆ）各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；
（ｇ）宿主細胞における目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程、
を含む、
方法。
【請求項2】
請求項１にしたがう方法であって、ここで目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターの該プールが：・ 各種のシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドおよびその相補的配列のライブラリーを合成する工程であって、
ここで該オリゴヌクレオチドが、ライブラリー中の相補的オリゴヌクレオチドに結合する際に、配列の両方の遊離末端において制限酵素認識部位突出部を形成する、工程；
・ 二本鎖ＤＮＡ断片を生成させるために、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを該制限酵素認識部位の突出部で、ライブラリー中に存在する相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程；
および
・ シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、各種の候補シグナルペプチドを有する目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを作成する目的で、好適なクローニング部位を有するウイルスベクターに該二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする工程、
によって調製される、方法。
【請求項3】
請求項２にしたがう方法であって、ここで各種のシグナルペプチドが、真核生物、好ましくは哺乳動物、細菌、またはウイルスの蛋白質、その改変および／または人工配列の公知のシグナルペプチドから選択される、方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項にしたがう方法であって、該方法が：（ｈ）工程（ｇ）において検出される該最適シグナルペプチドの組み合わせをコードするポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドを第２の発現ベクターにクローニングし、該第２のベクターで宿主細胞を形質転換し、および該宿主細胞で該ポリペプチドを生産させる工程をさらに含む、
方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＷＩ３８細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、またはレンチウイルスによって形質導入が可能な他の任意の細胞種から成る群から選択される細胞である、方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該プロモーターが、誘導性プロモーター、好ましくはテトラサイクリン制御プロモーター、または構成的プロモーターを含むその他の好適なプロモーター配列である、方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該エピトープタグが、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、小型ユビキチン様修飾タグ（ＳＵＭＯタグ）、プロテインＣの重鎖のタグ（ＨＰＣタグ）、カルモジュリン結合ペプチドタグ（ＣＢＰタグ）、および赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）、またはその他のエピトープタグまたはその他の標識基から成る群から選択される、方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該目的ポリペプチドが、治療用または診断用の抗体などの治療用または診断用の蛋白質である、方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで工程（ｆ）が蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて実施される、方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項にしたがう方法であって、ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、形質導入マーカー蛋白質、好ましくは赤色蛍光蛋白質、ＲＦＰまたは他の蛍光蛋白質、またはフローサイトメトリーで検出可能な遺伝子マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、方法。
【請求項12】
融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むウイルス発現ベクターであって、該ポリヌクレオチドが：（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、ウイルス発現ベクター。
【請求項13】
請求項１２にしたがうベクターであって、ここで該誘導性プロモーターが、テトラサイクリン制御プロモーター、または構成的プロモーターを含むその他の好適なプロモーター配列である、ベクター。
【請求項14】
請求項１２または１３にしたがうベクターであって、ここで該エピトープタグが、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、小型ユビキチン様修飾タグ（ＳＵＭＯタグ）、プロテインＣの重鎖のタグ（ＨＰＣタグ）、カルモジュリン結合ペプチドタグ（ＣＢＰタグ）、および赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）、またはその他のエピトープタグまたはその他の標識基から成る群から選択される、ベクター。
【請求項15】
請求項１２～１４のいずれか１項にしたがうベクターであって、ここで該目的ポリペプチドが治療抗体などの治療用蛋白質である、ベクター。
【請求項16】
請求項１２～１５のいずれか１項にしたがうベクターであって、ここで該ベクターがレンチウイルスベクターである、ベクター。
【請求項17】
請求項１２～１５のいずれか１項にしたがうベクターであって、形質導入マーカー蛋白質、好ましくは赤色蛍光蛋白質、ＲＦＰをコードする配列をさらに含む、ベクター。
【請求項18】
請求項１２～１７のいずれか１項にしたがうウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項19】
請求項１８にしたがう宿主細胞であって、その細胞膜表面に融合蛋白質を表出し、ここで該融合蛋白質が、ＧＰＩ接着によって、あるいは膜貫通ドメインを介して細胞膜に付着する、宿主細胞。
【請求項20】
請求項１８または１９にしたがう宿主細胞であって、ここで該宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞およびＷＩ３８細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、あるいはレンチウイルスで形質導入が可能なその他の任意の細胞種から成る群から選択される、宿主細胞。
【請求項21】
請求項１２～１７のいずれか１項にしたがう複数のウイルスベクターを含むＤＮＡライブラリーであって、ここで該ベクターが、目的ポリペプチドに関して各種の候補シグナルペプチドをコードする、ＤＮＡライブラリー。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は組換え蛋白質生産の分野に関するものである。特に、本開示は、効率的に目的蛋白質を宿主細胞から分泌させる特異的シグナルペプチドを、多様なシグナルペプチドの中から選択する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
蛋白質輸送は、全細胞蛋白質の約３０％についての細胞膜透過および細胞膜内輸送に関する動的機構である（Ｇｅｍｍｅｒ、Ｆｏｒｓｔｅｒ、２０２０）。このプロセスはトランスロコン（小胞体（ＥＲ）膜に存在する複数サブユニットの蛋白質複合体）によって促進される。普遍的に保存されているヘテロ三量体型蛋白質チャンネルであるＳｅｃ６１は、トランスロコンのコアを形成する。
【0003】
真核細胞の細胞質においてリボソームが分泌蛋白質合成を開始する時に、新生ポリペプチド鎖のアミノ末端に位置する配列ＥＲシグナルペプチド（ＳＰ）がリボソームをＥＲ膜へ移動させる。新生蛋白質のＳＰ配列がシグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識され、新生中のポリペプチドがＥＲ膜を透過して移動する。したがって、ＳＰは蛋白質分泌経路および蛋白質標的部位に印を付ける宛先番号コードとして機能する（Ｂｌｏｂｅｌ、Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ、１９７５）。コンピューター計算による研究および実験的研究に基づけば、ＳＰ配列は３種類の特徴的領域に分割される；すなわち、正に荷電したアミノ酸を含む親水性Ｎ末端領域；疎水性コア領域、およびシグナルペプチダーゼによる通常極性アミノ酸残基を含む開裂部位を含むＣ末端領域である（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、１９８５）。
【0004】
分泌蛋白質のＥＲ内腔へのシグナルペプチド媒介性輸送は、分泌経路のボトルネックであることが判明しており、したがって組換え蛋白質の安定的生産を達成するために解決の必要な重要課題である。シグナルペプチドは非常に不均一であるが、多くのシグナルペプチドは異なる生物種間で機能的互換性があることが示されている（Ｔａｎ、Ｈｏら、２００２）。一方、異なるシグナルペプチドは、産生される蛋白質の分泌および機能に非常に異なる影響を与え得る（Ｋｏｂｅｒら、２０１３）。したがって、蛋白質分泌の効率は、シグナルペプチド配列によって顕著な影響を受け得る。これらの知見は、哺乳動物システムにおいて組換え蛋白質を最大量で生産させる目的の場合に、シグナルペプチド最適化が重要であることを強く示唆する。
【0005】
現在のシグナルペプチド最適化法は、シグナルペプチドを個々に試験する多大な労力を要する試験によって行われており（Ｋｏｂｅｒら、２０１３）、そのため試験可能な配列の数が限定的となり最適シグナルペプチドを発見することが不可能となる、あるいは法外な時間を要するのである。
【発明の概要】
【0006】
本特許出願では、哺乳動物細胞における治療関連蛋白質の高レベル生産を可能にする最適シグナルペプチドを発見するために、数千のシグナルペプチドを迅速かつ高効率の網羅的にスクリーニングすることが可能なスクリーニングプラットフォームを提示する（図１および６）。本開示は、２種類のモデル蛋白質、すなわちスーパーフォルダーＧＦＰおよび凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）（第ＶＩＩ因子または第ＩＸ因子の欠損に起因する血友病様出血障害の治療に用いる治療用蛋白質）のシグナルペプチド最適化のプラットフォームの利用の詳細を含む。
【0007】
本発明者らは、物理的シグナルペプチドスクリーニングプラットフォームに加えて、生物工学的に重要な異なる蛋白質の生産に最適なシグナルペプチドを推定する人工知能法をも設計している。これは当該技術分野における関心領域の１つであると考えられるので、このアプローチは本開示の重要部分を構成する可能性が高い。
【0008】
本開示の一局面では、哺乳動物細胞において異種ポリペプチドを効率的に発現および分泌させるシグナルペプチドをスクリーニングする方法を提供するが、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；
ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；
該ポリヌクレオチドが：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、
プールを提供する工程；
（ｂ）各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；
（ｄ）該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり；
あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；
ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、
該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；
（ｅ）任意選択的に該宿主細胞を第２の結合試薬、好ましくは抗体に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が標識した結合試薬でない場合には、該第２の結合試薬が蛍光標識されており；
ここで該第２の結合試薬が該第１の結合試薬に特異的に結合する、
接触させる工程；
（ｆ）各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、該形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；
および
（ｇ）該宿主細胞における該目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程。
（ａ）各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；
ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；
該ポリヌクレオチドが：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、
プールを提供する工程；
（ｂ）各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；
（ｄ）該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり；
あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；
ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、
該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；
（ｅ）任意選択的に該宿主細胞を第２の結合試薬、好ましくは抗体に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が標識した結合試薬でない場合には、該第２の結合試薬が蛍光標識されており；
ここで該第２の結合試薬が該第１の結合試薬に特異的に結合する、
接触させる工程；
（ｆ）各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、該形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；
および
（ｇ）該宿主細胞における該目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程。
【0009】
本開示の別の一局面においては、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むウイルス発現ベクターを提供するが；
ここで該ポリヌクレオチドは以下を含む：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列。
ここで該ポリヌクレオチドは以下を含む：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列。
【0010】
本開示のさらなる局面においては：
（１）本開示にしたがうウイルスベクターを含む宿主細胞、
および
（２）本開示にしたがう複数のウイルスベクターを含むＤＮＡライブラリー、
を提供するが、
ここで該ベクターは、目的ポリペプチドについて各種の候補シグナルペプチドをコードする。
（１）本開示にしたがうウイルスベクターを含む宿主細胞、
および
（２）本開示にしたがう複数のウイルスベクターを含むＤＮＡライブラリー、
を提供するが、
ここで該ベクターは、目的ポリペプチドについて各種の候補シグナルペプチドをコードする。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本シグナルペプチド（ＳＰ）スクリーニングプラットフォームの図示である。（Ａ）エピトープタグを付加し、ＧＰＩ固定した目的蛋白質（ＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩ）であって、機能的なシグナルペプチドおよび無機能シグナルペプチドを有する目的蛋白質の運命に関する模式図である。機能的シグナルペプチドは、蛋白質の折りたたみおよび成熟を起こすＥＲへ目的蛋白質を導く。正しく折りたたまれ処理されたＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩは細胞表面に輸送され、細胞表面において該蛋白質はエピトープタグまたは折りたたまれたＰＯＩに結合する抗体で標識され得る。シグナルペプチドがＰＯＩのＥＲへの移行あるいはその成熟または折りたたみを促進させるものでない場合には（すなわちそれが非機能的な場合には）、そのＰＯＩはそこにそのまま留まる（移行障害）、あるいはＥＲ関連分解経路で細胞質に移行し（折りたたみ／成熟障害）、細胞質プロテアソームで分解される。（Ｂ）シグナルペプチドスクリーニングプロセスのワークフロー。シグナルペプチドをコードするＤＮＡオリゴプールを合成し、好ましくはＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩをコードするレンチウイルス導入プラスミドにバッチでクローン化する。ＳＰ－ＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩをコードする構築物を用いて、ヒトまたはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の細胞を低ＭＯＩで形質導入するが、その際に１個の形質導入細胞が、ＳＰ－ＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩをコードする単一構築物を平均で１コピーのみ含むように形質導入を行う。ＳＰ－ＰＯＩ－ＥＰＩ－ＧＰＩの発現に加えて、好ましくは形質導入マーカーとしてのｉＲＦＰ蛋白質を発現する形質導入細胞をエピトープタグ認識抗体（抗ＥＰＩ）で染色した後、抗ＥＰＩシグナルに基づいて選別を行う。あるいは、折りたたまれた蛋白質を認識する抗体を細胞染色に用いることもできる。ゲノム組込みレンチウイルス構築物のＳＰインサートコード領域を増幅した後、次世代シーケンシングによって同定を行う。強いおよび弱い抗ＥＰＩ／抗折りたたみ蛋白質シグナルを示す細胞集団の読み取りＳＰ配列を比較することによって、ＰＯＩ産生を最高レベルに増強するＳＰの同定が可能になる。次世代シーケンシング前の濃縮対照として、選別プールにおけるシグナルペプチドの特異的濃縮をｑＰＣＲで評価する。
【図2】（Ａ）レンチウイルス発現カセット。シグナルペプチド（ＳＰ）ライブラリーおよび目的蛋白質（ＰＯＩ）がクローン化される可変領域１および２。（Ｂ）発現宿主の外に分泌され、ＧＰＩ／ＴＭアンカーを介して細胞膜上に表示される翻訳蛋白質ポリペプチドの模式的表現。ＬＴＲ、長い末端反復；プロモーター、誘導性プロモーター；ＳＰ、シグナルペプチド、ＰＯＩ、目的蛋白質；ＧＰＩ、グリコホスファチジルイノシトール；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＩＲＥＳ、内部リボソーム進入部位；形質導入マーカー、蛍光蛋白質；Ｎ、アミノ末端；Ｃ、カルボキシ末端。（Ｃ）本実験において、構築物はＰＯＩとしての凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）を含み、エピトープタグは３ｘＦＬＡＧタグである。
【図3】ｑＰＣＲ／ＲＴ－ＰＣＲによる濃縮ＳＰの同定。工程１において、ＧＦＰ発現レベル（高ＧＦＰ（Ｑ２）および低ＧＦＰ（Ｑ３））に基づきＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞を２つの異なるチューブに選別した。工程２および３において、選別細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲ／ＲＴＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。ｑＰＣＲによるシグナルペプチド領域の増幅には、部位特異的プライマーを用いた。低ＧＦＰ細胞には、アズロシジンプレ蛋白質ＳＰが含まれていた。ＧＦＰ、緑色蛍光蛋白質；ＲＦＰ、赤色蛍光蛋白質；ｇＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ；高ＧＦＰ、より高いレベルのＧＦＰを発現する細胞；低ＧＦＰ、低レベルＧＦＰ発現細胞；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ－ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ。
【図4】特異的ＳＰは、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）の発現レベルに影響を与える。（Ａ）構築物１：ＯＲＩ ＳＰ ＦＶＩＩおよび構築物２：ＩｇＫ ＳＰ ＦＶＩＩ（予想蛋白質サイズは５０ｋＤａ）で形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を抗ＦＬＡＧ抗体で染色したウェスタンブロット。（Ｂ）５０ｋＤａのバンドの平均的強度に基づく相対発現レベルの定量。
【図5】ＧＰＩ固定したＦＶＩＩの抗体染色によって、差異的に染色された細胞のソーティングが可能となる。（Ａ）ドキシサイクリンで誘導し、１次抗体（抗ＦＬＡＧ）および２次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）の両方で染色したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陰性対照）のＦＡＣＳプロット。（Ｂ）ＳＰライブラリーＦＶＩＩを形質導入し、ドキシサイクリンで誘導して、２次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）のみで染色したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陰性対照）のＦＡＣＳプロット。（Ｃ）ＳＰライブラリーＦＶＩＩを形質導入し、ドキシサイクリンで誘導して、１次抗体（抗ＦＬＡＧ）および２次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）の両方で染色したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳプロット；１．２％の細胞が形質導入マーカー（ｔＲＦＰ）および２次抗体シグナル（Ｑ２内で点線表示の四角で強調されている）の両方を示している。
【図6】本開示のシグナルペプチドスクリーニングプラットフォームに用いた工程毎のワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書の用語「シグナルペプチド」は、細胞外に分泌されて細胞膜を通過する分泌蛋白質のＮ末端部分であるペプチドを意味する。シグナルペプチドは通常、おおよそ１０～３０アミノ酸で構成され、後に細胞膜に特異的なプロテアーゼで切断され除去される。そのため、分泌蛋白質のみが細胞外に輸送されるのである。シグナルペプチドは標的シグナルとして働き、特定の細胞内または細胞外の位置に蛋白質を導くための細胞内輸送機構を可能にする。現在までに、４０００種類を超える数のシグナルペプチドが真核細胞に存在することが公知となっている。シグナルペプチドをコードするＤＮＡライブラリーについては、例えば、ＷＯ２０２１０４５５４１Ａ１およびＫＲ２０２１００２８１１６Ａに開示されている。
【0013】
本明細書の用語「目的蛋白質」または「ＰＯＩ」は、好適な宿主細胞を用いることによって高効率の産生が意図される蛋白質を意味する。ＰＯＩは、好ましくは治療的または診断的に重要な蛋白質（抗体など）である。
【0014】
本明細書の用語「エピトープタグ」またはＥＰは、遺伝子工学を用いて、エピトープをコードする配列を蛋白質の同一オープンリーディングフレーム内に配置することにより組換え蛋白質にタグ（典型的には６～３０アミノ酸）を融合する技術を指す。この技術では、もともと利用可能な抗体が存在しない場合であっても、抗体の利用が可能なエピトープタグを選択することによって、タグ付加した蛋白質の検出が可能になるのである。適切なエピトープタグと抗体の対を選択することによって、所望の実験法（ウェスタンブロット分析、免疫沈降、免疫化学、親和性精製など）に好適な特性を有する組み合わせを見つけることが可能である。好ましいエピトープタグは、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、小型ユビキチン様修飾タグ（ＳＵＭＯタグ）、プロテインＣの重鎖のタグ（ＨＰＣタグ）、カルモジュリン結合ペプチドタグ（ＣＢＰタグ）、および赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）から成る群から選択することができる。
【0015】
本明細書の用語「ＧＰＩで固定した（ＧＰＩ連結した）」は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）で真核細胞の外表面に固定した蛋白質を指す。これらの分泌蛋白質は、共有結合によって該蛋白質のＣ末端に結合したＧＰＩ部分で細胞膜に固定されている。ＧＰＩ部分は、保存性コアグリカン、ホスファチジルイノシトール、およびグリカン側鎖から成る。コアグリカンの構造は、ＥｔＮＰ－６Ｍａｎα２－Ｍａｎα６－（ＥｔＮＰ）２Ｍａｎα４－ＧｌＮα６－ｍｙｏＩｎｏ－Ｐ－脂肪である（ＥｔＮＰ、エタノールアミンリン酸；Ｍａｎ、マンノース；ＧｌｃＮ、グルコサミン；Ｉｎｏ、イノシトール）。本開示においては、Ｃ末端シグナルペプチドによって蛋白質がＧＰＩ接着する（例えば、ＥＰ３３８９６８２を参照のこと）。
【0016】
本明細書の用語「膜貫通ドメイン」は、宿主細胞膜を貫通する疎水性アルファヘリックス構造を指す。膜貫通ドメインは、該ベクターによってコードされる融合蛋白質のＣ末端部分に直接的に融合するのであってもよい。特定の実施態様においては、膜貫通ドメインは内在性膜蛋白質（例えば、受容体、分化（ＣＤ）分子クラスター、酵素、トランスポーター、細胞接着分子など）に由来する。好ましい実施態様においては、膜貫通ドメインはヒトＶＣＡＭ－１蛋白質（血管細胞接着分子１）で例示される１型膜貫通蛋白質に由来する。Ｉ型膜貫通蛋白質の成熟型が細胞膜に局在する場合には、該蛋白質はアンカーの膜透過停止配列によって脂質膜に固定されるが、細胞外空間への誘導に関するＮ末端ドメインを有している。本開示にしたがう膜貫通ドメインのさらなる例としては、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ２、およびＴｉｍ３の膜貫通ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、およびＣＤ８ａ膜貫通ドメインが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。本発明に用いるさらなる膜貫通ドメインが、ＥＰ３３８９６８２に開示されている。
【0017】
本明細書の用語「ベクター」は、例えば、別の核酸分子を細胞内に導入、輸入など、進入を媒介することが可能な核酸分子を指す。導入核酸は一般的に、ベクター核酸分子に連結される、例えば、挿入される。ベクターとしては、自己複製を指令する配列を挙げることができ、あるいは宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに充分な配列を挙げることができる。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。当業者には明白なことであるが、ウイルスベクターは、導入核酸の進入を仲介する核酸に加えて、各種のウイルス成分を含んでいてもよい。したがって、用語「ウイルスベクター」は、核酸を細胞に導入可能なウイルスまたはウイルス粒子、あるいは導入したその核酸自体のいずれかを指すことがある。
【0018】
一実施態様においては、本開示は、哺乳動物細胞において異種ポリペプチドを高効率で発現および分泌させるためのシグナルペプチドをスクリーニングする方法を対象とするが、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；
ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；
該ポリヌクレオチドが：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、
プールを提供する工程；
（ｂ）各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；
（ｄ）該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはアプタマーであり；
あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；
ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、
該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；
（ｅ）任意選択的に該宿主細胞を第２の結合試薬、好ましくは抗体またはアプタマーに接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が標識した結合試薬でない場合には、該第２の結合試薬が蛍光標識されており；
ここで該第２の結合試薬が該第１の結合試薬に特異的に結合する、
接触させる工程；
（ｆ）各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、好ましくは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；
および
（ｇ）宿主細胞における目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程。
（ａ）各種の候補シグナルペプチドを含む目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを提供する工程であって；
ここで該プールの各ウイルス発現ベクターが、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み；
該ポリヌクレオチドが：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、または膜貫通ドメインをコードする配列、
を含む、
プールを提供する工程；
（ｂ）各宿主細胞が好ましくは平均して該プールの１ウイルスベクターのみで形質転換されるように、該ウイルスベクタープールで宿主細胞を形質転換する工程；
（ｃ）宿主細胞表面にＧＰＩで固定される、あるいは該融合蛋白質の膜貫通ドメインで宿主細胞表面に固定される融合蛋白質を産生させる目的で、該宿主細胞において該融合蛋白質を発現させる工程；
（ｄ）該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が好ましくは該目的ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはアプタマーであり；
あるいは融合蛋白質中に該エピトープタグが存在する場合には、該エピトープタグに特異的に結合する第１の結合試薬に接触させ；
ここで該結合試薬が任意選択的に蛍光標識または他の検出手段で標識されていてもよい、
該宿主細胞を第１の結合試薬に接触させる工程；
（ｅ）任意選択的に該宿主細胞を第２の結合試薬、好ましくは抗体またはアプタマーに接触させる工程であって；
ここで該第１の結合試薬が標識した結合試薬でない場合には、該第２の結合試薬が蛍光標識されており；
ここで該第２の結合試薬が該第１の結合試薬に特異的に結合する、
接触させる工程；
（ｆ）各宿主細胞の蛍光特性に基づいて、好ましくは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、形質転換宿主細胞を少なくとも２群に分割する工程；
および
（ｇ）宿主細胞における目的ポリペプチドに関する最適シグナルペプチドを同定する目的で、最も効率的な融合蛋白質発現を示す宿主細胞の群について次世代シーケンシングを実施する工程。
【0019】
好ましい一実施態様では、本法の工程（ａ）において目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターの該プールが以下の方法で調製される：
・ 各種のシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドおよびその相補的配列のライブラリーを合成する工程であって；
ここで該オリゴヌクレオチドが、ライブラリー中の相補的オリゴヌクレオチドに結合する際に、配列の両方の遊離末端において制限酵素認識部位突出部を形成する、工程；
・ 二本鎖ＤＮＡ断片を生成させるために、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを該制限酵素認識部位の突出部で、ライブラリー中に存在する相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程；
および
・ シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、各種の候補シグナルペプチドを有する目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを作成する目的で、好適なクローニング部位を有するウイルスベクターに該二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする工程。
・ 各種のシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドおよびその相補的配列のライブラリーを合成する工程であって；
ここで該オリゴヌクレオチドが、ライブラリー中の相補的オリゴヌクレオチドに結合する際に、配列の両方の遊離末端において制限酵素認識部位突出部を形成する、工程；
・ 二本鎖ＤＮＡ断片を生成させるために、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを該制限酵素認識部位の突出部で、ライブラリー中に存在する相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程；
および
・ シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、各種の候補シグナルペプチドを有する目的ポリペプチドをコードするウイルス発現ベクターのプールを作成する目的で、好適なクローニング部位を有するウイルスベクターに該二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする工程。
【0020】
好ましい一実施態様においては、各種のシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーは、真核生物、好ましくは哺乳動物、細菌、またはウイルスの蛋白質、その改変および／または人工配列の公知のシグナルペプチドを含む。
【0021】
別の好ましい一実施態様においては、本開示の方法は、以下のさらなる工程を含む：
（ｈ）工程（ｇ）において検出される該最適シグナルペプチドの組み合わせをコードするポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドを第２の発現ベクターにクローニングし、該第２のベクターで宿主細胞を形質転換し、および該宿主細胞で該ポリペプチドを生産させる工程。
（ｈ）工程（ｇ）において検出される該最適シグナルペプチドの組み合わせをコードするポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドを第２の発現ベクターにクローニングし、該第２のベクターで宿主細胞を形質転換し、および該宿主細胞で該ポリペプチドを生産させる工程。
【0022】
好ましい一実施態様においては、該ベクターのプロモーターは、誘導性プロモーター、好ましくはテトラサイクリン制御プロモーターである。
【0023】
別の一実施態様においては、本開示は、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むウイルス発現ベクターを対象とするが；
ここで該ポリヌクレオチドは：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、
を含む。
ここで該ポリヌクレオチドは：
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードする配列、
（ｉｉｉ）目的ポリペプチドをコードする配列、
（ｉｖ）任意選択的に、エピトープタグをコードする配列、
および
（ｖ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）接着についてのＣ末端シグナルペプチドをコードする配列、
を含む。
【0024】
さらなる実施態様においては、本開示は：
（１）本開示にしたがうベクターを含む宿主細胞、
または
（２）本開示にしたがう複数のウイルスベクターを含むＤＮＡライブラリー、
を対象とするが、
ここで該ベクターは、目的ポリペプチドについて各種の候補シグナルペプチドをコードする。
（１）本開示にしたがうベクターを含む宿主細胞、
または
（２）本開示にしたがう複数のウイルスベクターを含むＤＮＡライブラリー、
を対象とするが、
ここで該ベクターは、目的ポリペプチドについて各種の候補シグナルペプチドをコードする。
【0025】
以下の実施例は、１種類以上のより具体的な応用によって本発明の原理の実例を示すものであるが、発明力を用いることなく、また本開示の原理および概念から逸脱することなく実施の態様、用途および詳細に多くの変更を加え得ることは、当業者には明白であろう。したがって、後述の請求項によって規定されるものを除いて、本発明を限定することを意図するものではない。
【0026】
動詞「を含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「を含む（ｔｏ ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、本書において、非列挙の特徴の存在をも除外することなく、また要求することもない開放的限定として用いるのである。明示的にそうでないことに言及するのでない限り、従属請求項において列挙される特徴は相互に自由に組み合わせ可能である。さらに、本明細書全体を通じて単数形として用いる「ａ」および「ａｎ」の使用は、複数の存在を除外するものではないことを理解されたい。
【0027】
本明細書全体を通じて一実施態様（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）または一実施態様（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）への言及は、当該実施態様に関して記載される特定の特性、構造、または特徴が、本開示の少なくとも一つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたって様々な部位で用いられる表現「一実施態様においては（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施態様においては（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または「好ましい一実施態様においては（ｉｎ ａ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」が用いられる場合でも、必ずしも全て同一の実施態様を指すとは限らない。例えば、約（ａｂｏｕｔ）または実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）などの用語を用いて数値に言及する場合に、正確な数値もまた開示されるものである。
【0028】
実験の節
ｐＩＮＤＵＣＥＲを基盤とする哺乳動物発現プラスミドの構築
細胞膜固定型の目的蛋白質（ＰＯＩ）の発現を可能にするレンチウイルス導入プラスミドは、本発明者らのシグナルペプチドスクリーニングプラットフォームのコアを成すものである（図１）。発現構築物のレンチウイルス形質導入は、シグナルペプチド－ＰＯＩの単一組み合わせを有する細胞であって、ＰＯＩの高発現レベルを示す細胞の単離を可能にする（図１）。本発明者らのレンチウイルス構築物の利用を、シグナルペプチドライブラリーの大規模スケールの遺伝子合成、およびフローサイトメトリー選別しプールした細胞試料由来の最適シグナルペプチドの同定のための次世代シーケンシングの利用と組み合わせることによって、シグナルペプチドの網羅的スクリーニングが達成可能である（図１）。この大規模並行シグナルペプチドスクリーニングプラットフォームは、シグナルペプチドを個々に試験することによる現在のシグナルペプチド最適化法と比較して、より迅速でより網羅的であることの両方において、蛋白質産生の最適シグナル配列の同定を可能にするのである。
ｐＩＮＤＵＣＥＲを基盤とする哺乳動物発現プラスミドの構築
細胞膜固定型の目的蛋白質（ＰＯＩ）の発現を可能にするレンチウイルス導入プラスミドは、本発明者らのシグナルペプチドスクリーニングプラットフォームのコアを成すものである（図１）。発現構築物のレンチウイルス形質導入は、シグナルペプチド－ＰＯＩの単一組み合わせを有する細胞であって、ＰＯＩの高発現レベルを示す細胞の単離を可能にする（図１）。本発明者らのレンチウイルス構築物の利用を、シグナルペプチドライブラリーの大規模スケールの遺伝子合成、およびフローサイトメトリー選別しプールした細胞試料由来の最適シグナルペプチドの同定のための次世代シーケンシングの利用と組み合わせることによって、シグナルペプチドの網羅的スクリーニングが達成可能である（図１）。この大規模並行シグナルペプチドスクリーニングプラットフォームは、シグナルペプチドを個々に試験することによる現在のシグナルペプチド最適化法と比較して、より迅速でより網羅的であることの両方において、蛋白質産生の最適シグナル配列の同定を可能にするのである。
【0029】
本発明者らが試験したシグナルペプチド－目的蛋白質構築物のゲノム組込みに用いたレンチウイルス導入プラスミド（図２）は、ｐＩＮＤＵＣＥＲ１１プラスミド（Ｍｅｅｒｂｒｅｙ、Ｈｕら、２０１１）に基づくものであり、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法でＩＲＥＳ－ｔＲＦＰまたはＩＲＥＳ－ｉＲＦＰ６７０インサートを増幅した後、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ（ＮＥＢ）による消化およびその後のＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）によるライゲーションでそのインサートを該ベクターにクローニングすることにより、元々の形質導入マーカー（ＧＦＰ）がｉＲＦＰ６７０（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ、Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ、２０１３）またはｔＲＦＰ（Ｓｔｒａｃｋ、Ｓｔｒｏｎｇｉｎら、２００８）に変更されたものである。
【0030】
スーパーフォルダー－ＧＦＰ ＳＰ－ユビキチンＧ７６Ｖ（Ｕｂ（Ｇ７６Ｖ）－ｓｆＧＦＰ－ＧＰＩアンカー構築物のシグナルペプチドスクリーニングに関しては、Ｕｂ（Ｇ７６Ｖ）（Ｄａｎｔｕｍａ、Ｌｉｎｄｓｔｅｎら、２０００）、ｓｆＧＦＰ（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ、Ｂａｌｏｂａｎら、２０１５）およびＧＰＩアンカー（Ｒｈｅｅ、Ｐｉｒｉｔｙら、２００６）の異なるインサートから、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法によって構築を行った。構築した融合蛋白質インサートを、元々のｐＩＮＤＵＣＥＲ１１プラスミドのｔＲＦＰ－ｓｈＲＮＡインサートの位置にクローン化した。
【0031】
ＦＶＩＩのシグナルペプチドスクリーニングに関しては、ハムスターのコドンに最適化した、不活性ＦＶＩＩ（Ｄ３０２Ｎ）－変異体を含むＤＮＡ構築物を、ＳＰ－３ｘＦＬＡＧタグ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩまたはＳＰ－ＨＡ－ｔａｇ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩの融合蛋白質遺伝子断片としてＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに注文した。融合蛋白質をコードするこれらのＤＮＡ構築物を、元々のｐＩＮＤＵＣＥＲ１１プラスミドのｔＲＦＰ－ｓｈＲＮＡインサートの位置にクローン化した。
【0032】
改変ｐＩＮＤＵＣＥＲ１１プラスミドの機能的要素
・ ＣＭＶプロモーター：目的遺伝子の発現を制御するドキシサイクリン誘導性プロモーター
・ 高感度緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）：本発明者らの概念実証実験において目的遺伝子として用いた。
・ 内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）：キャップ非依存性の翻訳開始を可能にする。
・ トランス活性化因子３（ｒｔＴＡ３）：ＣＭＶプロモーターのドキシサイクリン誘導を制御する。構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下。
・ ヒトユビキチンＣプロモーター（ｈＵＢＣ）：ｉＲＦＰ６７０またはｔＲＦＰの異所性発現を制御する構成的プロモーター。
・ ｉＲＦＰ６７０：構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下でのレポーター蛋白質の形質導入。
・ ｔＲＦＰ：構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下でのレポーター蛋白質の形質導入
・ ＳＶ４０遺伝子：プラスミド複製領域
・ ＣＭＶプロモーター：目的遺伝子の発現を制御するドキシサイクリン誘導性プロモーター
・ 高感度緑色蛍光蛋白質（ｅＧＦＰ）：本発明者らの概念実証実験において目的遺伝子として用いた。
・ 内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）：キャップ非依存性の翻訳開始を可能にする。
・ トランス活性化因子３（ｒｔＴＡ３）：ＣＭＶプロモーターのドキシサイクリン誘導を制御する。構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下。
・ ヒトユビキチンＣプロモーター（ｈＵＢＣ）：ｉＲＦＰ６７０またはｔＲＦＰの異所性発現を制御する構成的プロモーター。
・ ｉＲＦＰ６７０：構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下でのレポーター蛋白質の形質導入。
・ ｔＲＦＰ：構成的プロモーターｈＵＢＣの制御下でのレポーター蛋白質の形質導入
・ ＳＶ４０遺伝子：プラスミド複製領域
【0033】
シグナルペプチドの発現プラスミドへのクローン化
ディレクショナルクローニングを行うために、オリゴヌクレオチドアニーリングによって作成したＳＰインサートおよび環状ｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを２種類の制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで消化した。さらに、２種類の制限酵素で消化したｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを、５′末端の脱リン酸化を非特異的に触媒するシュリンプアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）によって処理した；この処理はベクターのセルフライゲーションを回避するためである。しかし、ＤＮＡ断片のライゲーションには、５′リン酸基がホスホジエステル結合を形成することが必要となるので、２種類の制限酵素で消化したオリゴヌクレオチドを、ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いるサーマルサイクリングによってリン酸化させた。このようにして生成したＳＰインサートおよび直鎖状ｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いたライゲーションによって共有結合させた。全ライゲーション混合物でｓｔａｂｌｅ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）化学的コンピテント大腸菌細胞を形質転換して、抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で増殖させた。得られたコロニーを、正確なＳＰインサートを含むか否かに関してサンガーシーケンシングによりスクリーニングした。
ディレクショナルクローニングを行うために、オリゴヌクレオチドアニーリングによって作成したＳＰインサートおよび環状ｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを２種類の制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで消化した。さらに、２種類の制限酵素で消化したｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを、５′末端の脱リン酸化を非特異的に触媒するシュリンプアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）によって処理した；この処理はベクターのセルフライゲーションを回避するためである。しかし、ＤＮＡ断片のライゲーションには、５′リン酸基がホスホジエステル結合を形成することが必要となるので、２種類の制限酵素で消化したオリゴヌクレオチドを、ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を用いるサーマルサイクリングによってリン酸化させた。このようにして生成したＳＰインサートおよび直鎖状ｐＩＮＤＵＣＥＲベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いたライゲーションによって共有結合させた。全ライゲーション混合物でｓｔａｂｌｅ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）化学的コンピテント大腸菌細胞を形質転換して、抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で増殖させた。得られたコロニーを、正確なＳＰインサートを含むか否かに関してサンガーシーケンシングによりスクリーニングした。
【0034】
細胞株および標準的条件下におけるその培養
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．５％Ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中で、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接着性単一層として培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）懸濁液馴化（ＣＨＯ－Ｓ）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による懸濁培養で増殖させた。両細胞株はいずれも３７℃、５％ＣＯ２の標準的条件下で培養を行った。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．５％Ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中で、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接着性単一層として培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）懸濁液馴化（ＣＨＯ－Ｓ）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による懸濁培養で増殖させた。両細胞株はいずれも３７℃、５％ＣＯ２の標準的条件下で培養を行った。
【0035】
実施例１：概念実証実験
モデル蛋白質１：緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）
ｓｆＧＦＰを用いる概念実証実験として、下記のシグナルペプチドを選択した：すなわち、ＳＰ１（インターロイキン４）、ＳＰ２（血清アルブミン）、ＳＰ３ ｆＰｒＰ（ｍｕｔ１７～２１）、ＳＰ４（アズロシジンプレ蛋白質）、ＳＰ５（セルラーゼ）、ＳＰ６（ＰｒＰ）、ＳＰ７（Ｖｃａｍ）、ＳＰ８（ＦＣＲＬ－１）。
モデル蛋白質１：緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）
ｓｆＧＦＰを用いる概念実証実験として、下記のシグナルペプチドを選択した：すなわち、ＳＰ１（インターロイキン４）、ＳＰ２（血清アルブミン）、ＳＰ３ ｆＰｒＰ（ｍｕｔ１７～２１）、ＳＰ４（アズロシジンプレ蛋白質）、ＳＰ５（セルラーゼ）、ＳＰ６（ＰｒＰ）、ＳＰ７（Ｖｃａｍ）、ＳＰ８（ＦＣＲＬ－１）。
【0036】
上記のＳＰを改変ｐＩＮＤＵＣＥＲ１１にクローン化した（２を参照のこと）。ＭｌｕＩ（ＮＥＢ）およびＮｏｔＩ（ＮＥＢ）の制限酵素部位を利用した。詳細なクローニング方略を本明細書において説明する。
【0037】
各シグナルペプチドに関しては、シグナルペプチドをコードする各配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄａｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。それらオリゴヌクレオチドは全て５′末端および３′末端において、それぞれＭｌｕＩおよびＮｏｔＩの制限酵素部位によって挟まれた。サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりｄｓＤＮＡインサートを生成させた。
【0038】
モデル蛋白質２：凝固因子ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ）
上記に開示のような手段で、目的遺伝子を含む第３世代レンチウイルス導入プラスミドｐＩＮＤＵＣＥＲ１１を設計した。ＦＶＩＩ発現ＰＭＩＤ（Ｐｅｎｇ、Ｙｕら、２０１６）に対するシグナルペプチドの差異的効果に基づいて選択した２種類の異なるシグナルペプチド（表１）を３ｘＦＬＡＧタグ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩ融合構築物およびＨＡ－ｔａｇ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩ融合構築物のＮ末端にクローン化した。
上記に開示のような手段で、目的遺伝子を含む第３世代レンチウイルス導入プラスミドｐＩＮＤＵＣＥＲ１１を設計した。ＦＶＩＩ発現ＰＭＩＤ（Ｐｅｎｇ、Ｙｕら、２０１６）に対するシグナルペプチドの差異的効果に基づいて選択した２種類の異なるシグナルペプチド（表１）を３ｘＦＬＡＧタグ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩ融合構築物およびＨＡ－ｔａｇ－ＦＶＩＩ－ＧＰＩ融合構築物のＮ末端にクローン化した。
【0039】
【表1】
【0040】
（ａ）哺乳動物細胞において目的蛋白質を発現するレンチウイルスの調製
上記に開示のような手段で、目的遺伝子を含む第３世代レンチウイルス導入プラスミドｐＩＮＤＵＣＥＲ１１を設計した。他のレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＶＰ１５７、ｐＶＰ１５８、ｐＶＰ１５９、およびｐＶＰ１６０は、Ｍａｒｔｉｎ Ｋａｍｐｍａｎｎ／Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎからの供与であった（Ｂａｓｓｉｋ、Ｋａｍｐｍａｎｎら、２０１３）。
上記に開示のような手段で、目的遺伝子を含む第３世代レンチウイルス導入プラスミドｐＩＮＤＵＣＥＲ１１を設計した。他のレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＶＰ１５７、ｐＶＰ１５８、ｐＶＰ１５９、およびｐＶＰ１６０は、Ｍａｒｔｉｎ Ｋａｍｐｍａｎｎ／Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎからの供与であった（Ｂａｓｓｉｋ、Ｋａｍｐｍａｎｎら、２０１３）。
【0041】
レンチウイルスの調製は、他の文献に記載の方法によるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質転換プロトコルにしたがって実施した（ＰＭＩＤ：（Ｌｏｂａｔｏ－Ｐａｓｃｕａｌ、Ｓａｅｔｈｅｒら、２０１３；Ｂａｓｓｉｋ、Ｋａｍｐｍａｎｎら、２０１３）。簡単に説明すると、トランスポーター５（登録商標）形質転換試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を含む陽イオンポリマーＰＥＩを用いて、パッケージングベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。総量８００～１０００μｇの導入プラスミドをパッケージングプラスミドと混合した。形質転換試薬をＰＢＳで希釈してプラスミドと混合した。この混合液を室温で２５分間インキュベートした。確実に均一分布させるために、接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物にこの混合液を滴下によって加えた。形質転換後に細胞を３日間（７２時間）インキュベートした。レンチウイルスを含む上清を回収した。０．４５μの濾過アセンブリを用いて上清液を濾過した。濾過したレンチウイルスを回収して分注し、４℃で保存した。
【0042】
（ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＣＨＯ細胞におけるウイルス力価の測定
レンチウイルス滴定には、Ｓｉｎｇｅｒ Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら（２００６）のプロトコルを用いた。
１日目：５００μｌの細胞を含む２４穴シードプレート（各ウェルに１００，０００細胞）
３日目：レンチウイルスのストックから培地による４倍段階希釈物を調製した。
ウイルス希釈：無希釈、１：４、１：１６、１：６４
２４穴プレートのウェルから培地を除去し、２５０μＬの新鮮培地を加えた。ウイルス希釈物（２０μＬ）を滴下で細胞に加え、穏やかに撹拌してから細胞を３７℃でインキュベートした。２～３時間後に、さらに２５０μＬの培地をウェルに加えた。細胞は４８時間増殖させた。
５日目：ウェルの培地を捨てた。細胞を１５０μｌのＰＢＳで１回洗浄した。３０μｌのトリプシン（０．５％）を用いて細胞を剥がした後、５００μｌの新鮮培地を混合した。別のプレートにおいて、３日目から１００μｌの細胞と共に４００μｌの新鮮培地を加えた。次いで、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。
この工程をさらに３回繰り返した。全体として、細胞を洗浄し、１週間分裂させた。これらの徹底した洗浄工程は、ウイルス粒子の除去にとって重要であった。
１４日目：後述のフローサイトメトリーの節に説明するＦＡＣＳ分析のために細胞を調製した。ＦＡＣＳ分析を実施して、陽性細胞の蛍光レポーター（ＧＦＰおよびｍＲＦＰ）の割合（％）を測定した。
レンチウイルス滴定には、Ｓｉｎｇｅｒ Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら（２００６）のプロトコルを用いた。
１日目：５００μｌの細胞を含む２４穴シードプレート（各ウェルに１００，０００細胞）
３日目：レンチウイルスのストックから培地による４倍段階希釈物を調製した。
ウイルス希釈：無希釈、１：４、１：１６、１：６４
２４穴プレートのウェルから培地を除去し、２５０μＬの新鮮培地を加えた。ウイルス希釈物（２０μＬ）を滴下で細胞に加え、穏やかに撹拌してから細胞を３７℃でインキュベートした。２～３時間後に、さらに２５０μＬの培地をウェルに加えた。細胞は４８時間増殖させた。
５日目：ウェルの培地を捨てた。細胞を１５０μｌのＰＢＳで１回洗浄した。３０μｌのトリプシン（０．５％）を用いて細胞を剥がした後、５００μｌの新鮮培地を混合した。別のプレートにおいて、３日目から１００μｌの細胞と共に４００μｌの新鮮培地を加えた。次いで、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。
この工程をさらに３回繰り返した。全体として、細胞を洗浄し、１週間分裂させた。これらの徹底した洗浄工程は、ウイルス粒子の除去にとって重要であった。
１４日目：後述のフローサイトメトリーの節に説明するＦＡＣＳ分析のために細胞を調製した。ＦＡＣＳ分析を実施して、陽性細胞の蛍光レポーター（ＧＦＰおよびｍＲＦＰ）の割合（％）を測定した。
【0043】
ウイルス力価（ＶＴ＝ＴＵ／ｍＬ、形質導入単位）は、以下の式にしたがって算出した：
形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）＝（Ｎ×Ｐ）／（Ｖ×Ｄ）
ここで、
Ｎ＝２日目の感染に用いた各ウェルの細胞数；
Ｐ＝ＧＦＰ／ＲＦＰ陽性細胞の割合（％）（１０％～２０％となるはずである）；
Ｖ＝各ウェルの感染に用いたウイルス容積；
このプロトコルにおいて、Ｖ（ｍｌ）＝２０（μｌ）×１０－３；
Ｄ＝希釈倍数；
ＴＵ＝形質導入単位。
形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）＝（Ｎ×Ｐ）／（Ｖ×Ｄ）
ここで、
Ｎ＝２日目の感染に用いた各ウェルの細胞数；
Ｐ＝ＧＦＰ／ＲＦＰ陽性細胞の割合（％）（１０％～２０％となるはずである）；
Ｖ＝各ウェルの感染に用いたウイルス容積；
このプロトコルにおいて、Ｖ（ｍｌ）＝２０（μｌ）×１０－３；
Ｄ＝希釈倍数；
ＴＵ＝形質導入単位。
【0044】
（ｃ）細胞表面の抗体染色およびフローサイトメトリー
３Ｘ－ＦＬＡＧタグまたはＨＡタグを含むＦＶＩＩ－融合蛋白質またはｓｆＧＦＰ融合蛋白質をコードするレンチウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＣＨＯ細胞に形質導入した。形質導入細胞を２回分裂させた。回収の２４時間前に、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで細胞の誘導を行った。１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて細胞を回収した。室温にて２４００ｒｐｍで５分間、遠心分離することにより細胞を沈殿させた後、室温でＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した（１ｘＰＢＳ、４％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）。ＦＡＣＳ分析用に試料分注物を保存し、残りを室温にて２４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い沈殿させた後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。遠心分離を繰り返し、次いで培地を除去した（１回洗浄）。細胞ペレットを５００μｌの１次抗体溶液（表２を参照のこと）に再懸濁して、室温で１５分間インキュベートした後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。その後、５００μｌの２次抗体溶液（表２を参照のこと）に細胞を再懸濁し、室温で１５分間インキュベートしてから、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して最終的にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ測定の直前に、細胞を２回濾過してＦＡＣＳチューブに入れた後、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析を行った；あるいはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩフローサイトメーターで低抗体シグナルおよび高抗体シグナルを示す集団として選別を行った（図１を参照のこと）。このフローサイトメトリーデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社、アシュランド、オレゴン州、米国）で分析した。
３Ｘ－ＦＬＡＧタグまたはＨＡタグを含むＦＶＩＩ－融合蛋白質またはｓｆＧＦＰ融合蛋白質をコードするレンチウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＣＨＯ細胞に形質導入した。形質導入細胞を２回分裂させた。回収の２４時間前に、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで細胞の誘導を行った。１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて細胞を回収した。室温にて２４００ｒｐｍで５分間、遠心分離することにより細胞を沈殿させた後、室温でＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した（１ｘＰＢＳ、４％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）。ＦＡＣＳ分析用に試料分注物を保存し、残りを室温にて２４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い沈殿させた後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。遠心分離を繰り返し、次いで培地を除去した（１回洗浄）。細胞ペレットを５００μｌの１次抗体溶液（表２を参照のこと）に再懸濁して、室温で１５分間インキュベートした後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。その後、５００μｌの２次抗体溶液（表２を参照のこと）に細胞を再懸濁し、室温で１５分間インキュベートしてから、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して最終的にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ測定の直前に、細胞を２回濾過してＦＡＣＳチューブに入れた後、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析を行った；あるいはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩフローサイトメーターで低抗体シグナルおよび高抗体シグナルを示す集団として選別を行った（図１を参照のこと）。このフローサイトメトリーデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社、アシュランド、オレゴン州、米国）で分析した。
【0045】
【表2】
【0046】
ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ分析に用いたレーザーおよびフィルターのパラメータは以下であった：
（１）ｉＲＦＰシグナルについてはＡＰＣ－Ａ；および抗体：ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６
（２）ｔＲＦＰシグナルについてはＰＥ－Ａ
（３）ＧＦＰシグナルについてはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８；および抗体：ＰＧＴ１４５ Ａｌｅｘａ４８８
（４）ＨＡシグナルについてはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００；および抗体：抗ウサギ６８０ＲＤ
（１）ｉＲＦＰシグナルについてはＡＰＣ－Ａ；および抗体：ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６
（２）ｔＲＦＰシグナルについてはＰＥ－Ａ
（３）ＧＦＰシグナルについてはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８；および抗体：ＰＧＴ１４５ Ａｌｅｘａ４８８
（４）ＨＡシグナルについてはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００；および抗体：抗ウサギ６８０ＲＤ
【0047】
ｑＰＣＲによる個々のシグナルペプチドの同定
混合プールＳＰ－ＰＯＩレンチウイルス構築物で形質導入した細胞から、目的蛋白質（ＰＯＩ）に融合した個々のシグナルペプチドを同定するためにｑＰＣＲを用いた。この目的のために、フローサイトメトリー選別した細胞のｇＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋｐｕｒｅまたはＬキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）によって単離した。次いで、特定の選別細胞集団（図１を参照のこと）における特異的シグナルペプチドを含む構築物の濃縮を、シグナルペプチド特異的プライマー（表３）を用いたｑＰＣＲによって示した。このｑＰＣＲの実施には、７５ｎｇのｇＤＮＡ、１μＭの順方向および逆方向プライマー、およびさらに１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５μｌの反応混合液を用いた。ＰＣＲ条件は：
ステップ１：９５℃、１０分間、
ステップ２：９５℃、１５秒間、
ステップ３：６６℃、５秒間、
ステップ４：７２℃、１０秒間、
ステップ２～４を４５回反復、
ステップ５：７２℃、５分間。
混合プールＳＰ－ＰＯＩレンチウイルス構築物で形質導入した細胞から、目的蛋白質（ＰＯＩ）に融合した個々のシグナルペプチドを同定するためにｑＰＣＲを用いた。この目的のために、フローサイトメトリー選別した細胞のｇＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋｐｕｒｅまたはＬキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）によって単離した。次いで、特定の選別細胞集団（図１を参照のこと）における特異的シグナルペプチドを含む構築物の濃縮を、シグナルペプチド特異的プライマー（表３）を用いたｑＰＣＲによって示した。このｑＰＣＲの実施には、７５ｎｇのｇＤＮＡ、１μＭの順方向および逆方向プライマー、およびさらに１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５μｌの反応混合液を用いた。ＰＣＲ条件は：
ステップ１：９５℃、１０分間、
ステップ２：９５℃、１５秒間、
ステップ３：６６℃、５秒間、
ステップ４：７２℃、１０秒間、
ステップ２～４を４５回反復、
ステップ５：７２℃、５分間。
【0048】
【表3】
【0049】
次世代シーケンシングによる大規模プールからのシグナルペプチドの同定
高抗体シグナルのフローサイトメトリー選別細胞集団（図１を参照のこと）を示すＰＯＩの最良発現について、濃縮されたシグナルペプチドを全て同定する目的で、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いた。この目的のためにまず、フローサイトメトリーで選別した細胞のｇＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋｐｕｒｅまたはＬキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）によって単離した。おおよそ３６００００コピーの２倍体ＣＨＯ細胞ゲノムに対応する２μｇのｇＤＮＡを、５０μｌのＰＣＲ反応混合液に加えた；上記混合液は、Ｑ５緩衝液（ＮＥＢ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｍＭの順方向および逆方向プライマー（表４を参照のこと）、４％のＤＭＳＯ、１ＵのＱ５ホットスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ）、およびさらに２ｍＭのＭｇＣｌ２を含むものであった。次いで、以下のパラメータを用いてＰＣＲを実施した：
ステップ１：９８℃、３分間、
ステップ２：９８℃、３０秒間、
ステップ３：６１℃、１５秒間、
ステップ４：７２℃、１５秒間、
ステップ２～４を２５回反復、
ステップ５：７２℃、５分間。
高抗体シグナルのフローサイトメトリー選別細胞集団（図１を参照のこと）を示すＰＯＩの最良発現について、濃縮されたシグナルペプチドを全て同定する目的で、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いた。この目的のためにまず、フローサイトメトリーで選別した細胞のｇＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋｐｕｒｅまたはＬキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）によって単離した。おおよそ３６００００コピーの２倍体ＣＨＯ細胞ゲノムに対応する２μｇのｇＤＮＡを、５０μｌのＰＣＲ反応混合液に加えた；上記混合液は、Ｑ５緩衝液（ＮＥＢ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５ｍＭの順方向および逆方向プライマー（表４を参照のこと）、４％のＤＭＳＯ、１ＵのＱ５ホットスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ）、およびさらに２ｍＭのＭｇＣｌ２を含むものであった。次いで、以下のパラメータを用いてＰＣＲを実施した：
ステップ１：９８℃、３分間、
ステップ２：９８℃、３０秒間、
ステップ３：６１℃、１５秒間、
ステップ４：７２℃、１５秒間、
ステップ２～４を２５回反復、
ステップ５：７２℃、５分間。
【0050】
次いで、増幅した、ＳＰをコードする単位複製配列について、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたサイズ選択を行い、最終的にはＭｉＳｅｑシーケンシング（イルミナ）で配列決定を行った。形質導入した選別細胞の最高発現の１％と残りの９９％との間でリード濃縮を比較することにより、最高発現レベルを付与するシグナルペプチドを同定した。
【0051】
【表4】
【0052】
一過性形質転換による蛋白質産生の試験
本発明者らのＳＰスクリーニングの結果が、バイオ医薬品産業において高レベル蛋白質生産を模倣する蛋白質生産条件にも応用可能であることを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて示した。ここでは、ＦＶＩＩおよびｓｆＧＦＰの両方に関して最高発現レベルを付与するシグナルペプチドの同定後に、上記のアッセイを実施した。分泌型蛋白質を含む上記のＳＰを発現させる目的で、この蛋白質をコードする発現プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞、あるいはその他の好適な哺乳動物発現宿主細胞の一過性形質転換を行った。
本発明者らのＳＰスクリーニングの結果が、バイオ医薬品産業において高レベル蛋白質生産を模倣する蛋白質生産条件にも応用可能であることを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて示した。ここでは、ＦＶＩＩおよびｓｆＧＦＰの両方に関して最高発現レベルを付与するシグナルペプチドの同定後に、上記のアッセイを実施した。分泌型蛋白質を含む上記のＳＰを発現させる目的で、この蛋白質をコードする発現プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞、あるいはその他の好適な哺乳動物発現宿主細胞の一過性形質転換を行った。
【0053】
目的とする標的に応じて、分泌蛋白質を含む培地を、典型的には形質転換から３日～５日後に回収した。コニカルチューブに発現試験試料を回収して、室温で５分間、５００ｘｇの遠心分離（エッペンドルフ）を行い、細胞をペレットにした。清明化上清を新しいチューブに移し、目的とする標的に対するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて分泌ｓｆＧＦＰまたはＦＶＩＩの量を定量した。
【0054】
すなわち、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＯＩまたはそのエピトープタグ結合蛋白質で事前コーティングした。次いで、回収した清明化発現培地をコーティング済みのプレートに加えた。さらに、異なる陽性対照および陰性対照（それぞれ、市販の精製ＰＯＩおよびモック形質導入細胞から回収した培地）を用いて、本アッセイの機能性を確認した。これは、起こり得る疑陽性を回避するためであり、またＰＯＩ発現レベルおよび標的親和性に基づくその機能性を推定することを目的とするものであった。
【0055】
典型的には、製造元（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）が推奨する標準的方法の後に、ＥＬＩＳＡ試験を実施した。捕捉標的のプレートコーティングは、典型的には４℃で一晩実施した。非結合蛋白質はアッセイ緩衝液で洗い流した；洗浄を３回反復した後、プレートを軽くタッピングすることによって素早い乾燥を行った。市販のブロッキング緩衝液（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの商品）を全ウェルに加えて、室温で１時間、プレートをインキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去して、ウェルに清明化発現培地および対照を加えた。上記のように洗浄工程を繰り返し行い、好適な標識抗体（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でウェルを処理した。蛋白質標的複合体シグナルを検出する目的で、プレートをペーパータオル上に軽く叩きつけて手短に空気乾燥させ後、標識した検出２次抗体を含むブロッキング緩衝液（５０μｌ）をウェルに加えた。過剰の検出抗体を洗い流して、好適なアッセイ緩衝液を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてシグナルを測定した。
【0056】
必要に応じて、ＨＲＰ検出を用いた。この場合には、アッセイ緩衝液の代わりに、最終工程においてＨＲＰ複合体およびＨＲＰ基質を加えた後、プレートリーダーを用いて検出を行った。上記の方法の結果を図３～５に示す。
参考文献
参考文献
【表5】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】