特表 2024-545321 ＣＸＣＬ１２に対する抗体及びそれを含む脱毛治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-05

(54)【発明の名称】ＣＸＣＬ１２に対する抗体及びそれを含む脱毛治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20241128BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241128BHJP

【ＦＩ】

C07K16/24 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

A61P17/14

A61K39/395 N

A61K39/395 T

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538090

(86)(22)【出願日】2022-12-23

(85)【翻訳文提出日】2024-06-21

(86)【国際出願番号】 KR2022021227

(87)【国際公開番号】W WO2023128494

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0188304

(32)【優先日】2021-12-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522051971

【氏名又は名称】エピ バイオテック カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 託嗣

(72)【発明者】

【氏名】チェン，メイ

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体を含む脱毛治療用組成物に関し、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体がＣＸＣＬ１２を抑制し、毛髪の成長を促進する効果を有するので、脱毛の予防または治療のための用途に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体。

【請求項2】

配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項１に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体。

【請求項3】

配列番号１のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項１に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体。

【請求項4】

配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項１に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体。

【請求項5】

配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項6】

配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項５に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項7】

配列番号１のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項５に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項8】

配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項５に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項9】

配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項10】

配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列と９５％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項11】

配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列と９９％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項12】

配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項13】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項14】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項15】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項16】

配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項17】

配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項18】

配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項19】

配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項20】

配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項21】

配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、
請求項９に記載のＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれかに記載の抗体を含む、脱毛の予防または治療用薬学組成物。

【請求項23】

前記脱毛が、円形脱毛、遺伝性アンドロゲン性脱毛、休止期脱毛、外傷性脱毛、抜毛癖、圧迫性脱毛、成長期脱毛、粃糠性脱毛、梅毒性脱毛、脂漏性脱毛、症候性脱毛、瘢痕性脱毛、先天性脱毛、及び薬物副作用による脱毛からなる群から選択されることを特徴とする、
請求項２２に記載の脱毛の予防または治療用薬学組成物。

【請求項24】

前記薬物副作用による脱毛が、抗癌剤、抗凝固剤、抗うつ剤及びホルモン剤からなる群から選択される薬物による脱毛であることを特徴とする、
請求項２３に記載の脱毛の予防または治療用薬学組成物。

【請求項25】

前記抗癌剤が、黒色腫、上皮癌、乳癌、子宮頸癌、固形癌、尿路上皮細胞癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌及び消化管癌からなる群から選択される癌の治療のための抗癌剤であることを特徴とする、
請求項２４に記載の脱毛の予防または治療用薬学組成物。

【請求項26】

請求項１～２１のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項27】

請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する新規な抗体及びそれを含む脱毛治療用組成物に関する。具体的には、本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体またはヒト化抗体に関し、前記抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより毛髪の成長を促進する効果を有する。

【背景技術】

【0002】

マウスの毛髪は、成長期（ａｎａｇｅｎ）、退化期（ｃａｔａｇｅｎ）及び休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）の３段階周期を経て成長、維持及び脱落する。一般に、成長期後の１０日～１４日間に全般的な毛嚢細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が起こり、毛嚢が縮小する段階である退化期（ｃａｔａｇｅｎ）、平均３カ月の次の成長期を準備する段階である休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）を経て毛髪が抜ける。部位によって毛髪の長さが異なる理由は、各部位によって毛嚢の固有の特徴である成長期の持続期間が異なるからである。

【0003】

ヒトの毛髪も一定の毛髪成長周期（ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｙｃｌｅ）を有するので、常に一定の数の毛髪が維持される。しかしながら、脱毛が進むと毛根に存在する毛乳頭が小さくなり、毛乳頭が小さくなると髪の毛の太さが細くなり、それと同時に毛髪成長周期も短くなる。よって、脱毛が進むと髪の毛は非常に細くなり、毛髪成長周期はさらに短くなるので、少し成長すると抜けてしまう。

【0004】

脱毛の原因としては、遺伝的な原因、男性ホルモンの作用だけでなく、内分泌疾患、栄養欠乏、薬物使用、出産、発熱、手術などの激しい身体的、精神的ストレスなどの要因が複合的に作用することが知られている。最近は、男性型脱毛だけでなく、食生活の変化、社会環境などによるストレスの増加に伴って女性の脱毛人口も増加する傾向にあり、年齢も低くなっている。

【0005】

現在、韓国で最も頻繁に用いられている脱毛治療剤としては、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ；商品名Ｐｒｏｐｅｃｉａ（登録商標））、デュタステリド（ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ；商品名Ａｖｏｄａｒｔ（登録商標））、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ；商品名マイノクシル（登録商標）またはＲｏｇａｉｎｅ（登録商標））などが挙げられる。フィナステリド及びデュタステリドは、５α還元酵素阻害薬（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であり、男性ホルモン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）が５α－ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ）に変換されることを阻害する。しかしながら、これらの製品は、性欲減退、勃起不全、運転及び遂行能力喪失などの副作用を引き起こす。一方、ミノキシジルは、いまだその機序が完全には解明されていないが、細胞膜を過分極（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）させるカリウムチャネル開口薬（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｅｎｎｅｌ ｏｐｅｎｅｒ）であり、血管拡張及びカリウムチャネル開口により毛嚢への酸素、血液、栄養素などの供給を増加させ、毛嚢を健康にするものと考えられている。しかしながら、この製品も塗布部位のかゆみ、紅斑、皮膚の刺激、目の刺激などの副作用を引き起こし、頭以外の他の身体部位での望ましくない毛髪の成長も観察されている。また、近年、重症の脱毛患者を対象に毛髪移植術が試みられているが、高価な費用と施術後の副作用による限界が指摘されている。

【0006】

一方、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は、白血球走化性因子であり、身体の様々な組織に白血球を誘引する役割を果たすが、その過程は炎症及び感染に対する身体反応の全てにおいて必須である。ケモカイン及びその受容体は、免疫調節、炎症性及び感染性疾患の病理生理学において中心となるだけでなく、近年、ケモカイン及びその受容体の種類に応じて自己免疫疾患をはじめとする特定病症に対する特異的な役割が示されており、特定のケモカインまたはその受容体の活性を調節する治療的アプローチが提示されている。

【0007】

よって、本発明者らは、新規な脱毛治療剤を開発すべく努力した結果、ケモカインの一種であるＣＸＣＬ１２に対する抗体で処理すると、毛嚢及び毛髪の成長が促進されることを確認し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｔｒａｎ ＰＢ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ：ａ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｔｏｒｙ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；４５７：１－６．

【非特許文献2】Ｚｏｕ ＹＲ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＸＣＲ４ ｉｎ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９３：５９５－５９９．

【非特許文献3】Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｌｅ ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｏｐｅｃｉａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１７；１７７：１３２２－１３３６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する抗体を提供することを目的とする。

【0010】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する抗体を含む、脱毛の予防または治療用組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体を含む、脱毛の予防または治療用薬学組成物、並びにＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含むベクターを提供する。

【0012】

前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体であってもよく、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体であることが好ましい。

【0013】

前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であることが好ましい。

【0014】

前記抗体は、配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列と少なくとも９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であることが好ましい。

【0015】

前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよい。

【0016】

前記抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよい。

【0017】

前記抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよい。

【0018】

前記脱毛は、円形脱毛、遺伝性アンドロゲン性脱毛、休止期脱毛、外傷性脱毛、抜毛癖、圧迫性脱毛、成長期脱毛、粃糠性脱毛、梅毒性脱毛、脂漏性脱毛、症候性脱毛、瘢痕性脱毛、先天性脱毛、または薬物副作用による脱毛であってもよい。また、前記薬物副作用による脱毛は、抗癌剤、抗凝固剤、抗うつ剤またはホルモン剤による脱毛であってもよく、前記抗癌剤は、黒色腫、上皮癌、乳癌、子宮頸癌、固形癌、尿路上皮細胞癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌及び消化管癌からなる群から選択される癌の治療のための抗癌剤であってもよい。

【0019】

本発明は、前記ＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体を含む、脱毛の予防または治療用途のための組成物を提供する。

【0020】

本発明は、前記ＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体を含む、脱毛の予防または治療のための組成物の用途を提供する。

【0021】

本発明は、脱毛を有する対象体に、前記ＣＸＣＬ１２に特異的に結合する抗体を投与して脱毛を治療する方法を提供する。

【発明の効果】

【0022】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する新規な抗体及びそれを含む脱毛治療用組成物に関するものであり、ＣＸＣＬ１２に対する抗体がＣＸＣＬ１２を抑制し、毛髪の成長を促進する効果を有するので、脱毛の予防または治療のための用途に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ヒト毛嚢培養モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛嚢成長の結果を示す図である。

【図2】ヒト毛嚢培養モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛嚢成長の結果を示す図である。

【図3】マウス成長期誘導モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛髪成長の結果を示す図である。

【図4】マウス成長期誘導モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛髪成長の結果を示す図である。

【図5】本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体の抗原結合親和性を分析した結果を示す図である。

【図6】マウスヒゲ培養モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛嚢成長の結果を示す図である。

【図7】マウスヒゲ培養モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛嚢成長の結果を示す図である。

【図8】マウス成長期誘導モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛髪成長の結果を示す図である。

【図9】マウス成長期誘導モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛髪成長の結果を示す図である。

【図10】円形脱毛動物モデルにおける、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛髪成長の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、添付図面を参照して本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施形態及び実施例について詳細に説明する。しかしながら、本発明は様々な形態で実現することができ、本明細書における実施形態及び実施例に限定されるものではない。

【0025】

本明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。

【0026】

本発明は、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体またはヒト化抗体、及びＣＸＣＬ１２に対する抗体を含む脱毛治療用組成物に関する。

【0027】

前記ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するモノクローナル抗体であってもよく、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよく、配列番号７～配列番号９のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０～配列番号１２のアミノ酸配列のいずれかの配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＸＣＬ１２に特異的に結合するヒト化抗体であってもよい。

【0028】

本発明における「ＣＸＣＬ１２（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １２）」とは、ケモカインの一種である間質細胞由来因子１（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ １，ＳＤＦ１）であり、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体ＣＸＣＲ４のリガンドとしてＣＸＣＲ４と相互作用することが知られており、ＣＸＣＲ７（ＲＤＣＩ）のリガンドとしても報告されている。ＣＸＣＬ１２は、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、骨格筋、内皮細胞、上皮組織、幹細胞など、様々な組織タイプにおいて広範囲に発現する。

【0029】

本発明における「ケモカイン」とは、白血球遊走作用、活性化作用を有する塩基性でヘパリン結合性の低分子タンパク質を意味する。ケモカイン分子中には４つのシステイン残基が存在し、最初の２つの分子中のシステイン残基の存在形式により、ＣＸＣ（ＣＸＣＬ）、ＣＣ（ＣＣＬ）、ＣＸ３Ｃ（ＣＸ３ＣＬ）、Ｃ（ＸＣＬ）の４つの亜科に分類され、現在、少なくとも４０種が同定されている。

【0030】

本発明における「中和抗体」とは、粒子状であるか、分子状であるかに関わらず、抗原が生体に対して感染力、または毒性、酵素活性などの生物学的活性を有する場合に、抗原特異的に結合して活性を消失または減退させる抗体を意味する。

【0031】

本発明における「ヒト化抗体」とは、ヒトにより生産された抗体のものに相当するアミノ酸配列を有する抗体、及び／または本発明で開示されたヒト抗体作製技術により作製された抗体を意味する。

【0032】

前記「抗体」とは、天然免疫グロブリン、または部分的もしくは全体的に合成により生産された免疫グロブリンを意味する。また、前記用語には、抗体の抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。抗原結合ドメインを含む抗体断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などの分子である。「抗体」なる用語は、広範囲の意味で用いられ、具体的には、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）が含まれるものであり、所望の生物学的活性を示すものであれば、抗体断片も含まれるものである。抗体は、２つの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と、２つの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）とから構成され、対象抗原の種類に応じてアミノ酸配列が変化する可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と、配列が変化しない定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）とを有する。

【0033】

前記軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）」と呼ばれる非常に可変的な３つの領域を含む。ＣＤＲは抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合し、各鎖のＣＤＲは典型的に３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を有する。

【0034】

本発明における「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、当業者に周知であるが、具体的には、抗原及び抗体が特異的に相互作用して抗原抗体複合体を形成すると共に、免疫学的反応を引き起こすことを意味する。

【0035】

本発明における「脱毛」とは、その原因には関係なく、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪が存在しない状態を意味し、円形脱毛、遺伝性アンドロゲン性脱毛、休止期脱毛、外傷性脱毛、抜毛癖、圧迫性脱毛、成長期脱毛、粃糠性脱毛、梅毒性脱毛、脂漏性脱毛、症候性脱毛、瘢痕性脱毛、先天性脱毛、または薬物副作用による脱毛であるが、これらに限定されるものではない。

【0036】

本発明における「予防」とは、組成物の投与により疾患の発病を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与により疾患の発症個体及びその疑いのある個体の症状を好転または有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

【0037】

本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法で散剤、顆粒剤、錠剤、軟質または硬質カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、軟膏、クリームなどの皮膚外用剤、坐剤、注射剤、フィラー、滅菌注射溶液などをはじめとして、製剤に適したいかなる形態に剤形化して用いてもよい。

【0038】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は単に本発明を説明するものにすぎず、本発明を限定するものではない。

【実施例1】

【0039】

ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体の作製
１－１．免疫化したマウスの作製
ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から購入した組換えｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ１２タンパク質（ｃａｔ＃１３５１１－ＨＮＣＥ）５０μｇ（マウス１匹分）を同じ体積の完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と混合してエマルジョンを作製した。このように作製したエマルジョンを７週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス６匹の腹腔内に注入した。抗原５０μｇを総容積５００μＬとして各マウスに注入した。１週間及び２週間経過後に、それぞれ不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と抗原を混合したエマルジョンをマウスの腹腔内にさらに注入した。

【0040】

１－２．抗体産生の確認
前記方法により免疫化したマウスの眼球から血液を採取して１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブに入れ、その後１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を分離し、抗体産生を確認する実験を行うまで－２０℃で保管した。抗原タンパク質を用いた酵素免疫測定法により抗体産生を確認し、その後細胞融合の３日前に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と抗原を混合したエマルジョンをマウスの腹腔内に再度注入した。

【0041】

１－３．ハイブリドーマの作製
抗体産生を確認し、その後マウスを屠殺した。脾臓細胞を分離し、骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）と融合させてハイブリドーマを作製した。具体的には、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、培養プレート内でマウスのＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を培養した。細胞融合を行うために、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）で２回洗浄し、１×１０^７の細胞濃度となるように調整した。マウスを頸椎脱臼により屠殺して脾臓を採取し、その後メッシュ容器（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）に入れて細胞を分離した。脾臓細胞の懸濁液を作製し、その後遠心分離により懸濁液を洗浄した。脾臓細胞溶液をＴｒｉｓ－ＮＨ４Ｃｌ（ＴＲＩＳ ２０．６ｇ／Ｌ，ＮＨ４Ｃｌ ８．３ｇ／Ｌ）に曝露して赤血球細胞を溶解させた。完全に分離した抗体産生細胞を４００×ｇで５分間遠心分離した。その後、無血清培地で２回洗浄し、１０ｍＬの培地に再懸濁させた。リンパ細胞を血球計で計数し、リンパ球１×１０^８を無血清培地中でＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞１×１０（１０：１）と混合した。４００×ｇで５分間遠心分離し、その後３７℃に加温した５０％（Ｍ／Ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を用いて、１ｍＬの溶液を滴下して１分間混合した。このように作製した融合混合溶液を無血清ＲＰＭＩ１６４０で希釈し、４００×ｇで３分間遠心分離した。２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン，０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）を補充したＲＰＭＩ１６４０選択培地３５ｍＬに細胞を懸濁させた。１日前にフィーダー細胞（ＲＰＭＩ１６４０を用いて腹腔から分離したマクロファージ）でコーティングした９６ウェルプレートに懸濁液１００μＬをローディングし、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。５日後から、ＨＡＴ培地を２～３日間隔で交換し、細胞を１４日間培養した。１４日後に、２０％ウシ胎児血清及びＨＴ（ＨＡＴから０．４μＭアミノプテリンを除去した培地）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２次培養を行った。

【0042】

１－４．抗体産生融合細胞の選択及び分離
前述したように作製した融合細胞の培養液の上清を収集し、酵素免疫測定法により、前述したように作製した抗原に対して特異的な抗体産生の有無を確認した。陰性対照群に比べて４倍以上の適正濃度を示す融合細胞の培養液を選択し、２４ウェルプレートに移して培養した。さらに、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１つの細胞が入るように希釈して（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）培養し、その後培養液を回収し、９６ウェルプレートに抗原として用いるＣＸＣＬ１２タンパク質を１ウェル当たり０．１μｇとなるようにコーティングした。その後、酵素免疫測定法により、最終的にモノクローナル抗体を産生する融合細胞を選択した。

【0043】

１－５．モノクローナル抗体の分析
前記過程で得られたＣＸＣＬ１２に対する中和抗体を２Ｂ１２と命名した。配列分析の結果、表１に示すように、配列番号１の配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６の配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含むことが確認された。

【0044】

【表1】

【実施例2】

【0045】

ヒト毛嚢培養モデルにおける、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛嚢成長促進効果の確認
実施例１で作製したＣＸＣＬ１２に対する中和抗体を対象に、毛嚢成長促進効果を次のように確認した。

【0046】

３０代の男性の毛嚢を整えて器官培養した。毛嚢を４８ウェルプレートで１ウェル当たり１つとなるように培養し、陰性対照群、陽性対照群（市販抗体５０ｎｇ／ｍＬ，５００ｎｇ／ｍＬ）及び２Ｂ１２処理群（０．０５ｎｇ／ｍＬ，０．５ｎｇ／ｍＬ，５ｎｇ／ｍＬ）の計６グループに分けてヒト毛嚢をそれぞれ処理し、次いで培養器にて４日間培養した。

【0047】

図１及び図２に示すように、ヒト毛嚢の培養実験の結果、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体２Ｂ１２で処理すると、毛嚢の成長が促進されることが確認され、それは、陽性対照群と同等またはより優れたレベルであることが確認された。

【0048】

よって、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより、毛嚢の成長を促進し、優れた発毛効果を有することが分かる。

【実施例3】

【0049】

マウス成長期誘導モデルにおける、ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体処理による毛髪成長促進効果の確認
実施例１で作製したＣＸＣＬ１２に対する中和抗体を対象に、毛髪成長促進効果を次のように確認した。

【0050】

生後７週齢の雄Ｃ_３Ｈ／ＨｅＮマウス１７匹の毛を除毛機械により短くし、除毛剤により残った毛を完全に除去し、その後１日間馴化して実験に用いた。１グループ５～６匹ずつに分けて実験を行った。陰性対照群（ＩｇＧ１，５μｇ／ｈｅａｄ）、陽性対照群（市販抗体５μｇ／ｈｅａｄ）及び２Ｂ１２抗体投与群（５μｇ／ｈｅａｄ）の計４グループに分け、グループ別にマウスの背部に４日間隔で計４回皮下注射した（総投与量２０μｇ／ｈｅａｄ）。各抗体の注入後１７日間にわたって、前記マウスの背部の発毛の程度を追跡観察した。１７日後に、発毛したマウスの背部を剃刀で剃り、得られた毛の重量を測定した。

【0051】

図３及び図４に示すように、マウスにおける毛髪成長促進効果を評価した結果、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体２Ｂ１２を投与すると、毛髪の成長が促進されることが確認された。

【0052】

よって、本発明のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより、毛髪の成長を促進し、優れた発毛効果を有することが分かる。

【実施例4】

【0053】

ＣＸＣＬ１２に対する中和抗体に基づくヒト化抗体の作製
４－１．ヒト化抗体の作製
実施例１のＣＸＣＬ１２に対する中和抗体をヒトに対応する構造に変更したヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製するために、マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植するＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ）法により作製した。作製したヒト化抗体の配列を分析した結果を表２に示す。

【0054】

【表2】

【0055】

４－２．ヒト化ＩｇＧの構築及び生産
ヒト化ＩｇＧ抗体を構築するために、キメラ及びヒト化抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターに挿入して全長ｈＩｇＧの発現プラスミドを構成した。前記重鎖及び軽鎖プラスミドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＰｒｏｂｉｏの標準作業手順書（ＳＯＰ）に従ってトランスフェクションし、抗体発現はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養において行った。表３に示すように、重鎖及び軽鎖可変領域に対する計９つの組み合わせのヒト化抗体が発現した。

【0056】

【表3】

【0057】

４－３．精製したヒト化ＩｇＧの抗原結合親和性の確認（ＥＬＩＳＡ）
前記９つの組み合わせのヒト化抗体の抗原結合親和性を次のように確認した。

【0058】

全ての抗体の初期濃度を１００μｇ／ｍＬとし、１／３ずつシリアルダイリューションしてウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬとなるように４℃でＯ／Ｎ培養し、翌日３％のＮｏｎｆａｔ Ｍｉｌｋと共に３７℃で１時間培養した。その後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、次いで２μｇ／ｍＬの濃度の抗原（ＳＤＦ－１α）１００μＬと共に室温で２時間培養した。２時間後に、洗浄緩衝液でウェルプレートを洗浄し、その後２次抗体（０．１μｇ／ｍＬ Ｈｉｓ－［ＨＲＰ］）を添加して４５分間処理した。その後、洗浄したウェルプレートに１００μＬのＴＭＢ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加して１０分間反応させ、次いで５０μＬの１Ｍ ＨＣＬを添加して反応を停止させた。分光光度計を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、結合親和性を分析した。

【0059】

図５に示すように、抗原結合親和性を分析した結果、前記９つの組み合わせのヒト化抗体は抗原結合親和性に優れることが確認され、特に４つのヒト化抗体は抗原結合親和性がキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体より優れることが確認された。

【実施例5】

【0060】

マウスヒゲモデルにおける、ＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛嚢成長促進効果の確認
実施例４で作製したＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体を対象に、毛嚢成長促進効果を次のように確認した。

【0061】

Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの硬毛を整えて器官培養した。毛嚢を４８ウェルプレートで１ウェル当たり１つとなるように培養し、陰性対照群、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体処理群（５０ｎｇ／ｍＬ，５００ｎｇ／ｍＬ）及びＩｇＧヒト化抗体処理群（５０ｎｇ／ｍＬ，５００ｎｇ／ｍＬ）の計２１グループに分けて硬毛をそれぞれ処理し、次いで３７℃の培養器で２日間培養した。

【0062】

図６及び図７に示すように、マウス毛嚢の培養実験の結果、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体で処理すると、全て毛嚢の成長が促進されることが確認された。

【0063】

よって、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより、毛嚢の成長を促進し、優れた発毛効果を有することが確認された。

【実施例6】

【0064】

マウス成長期誘導モデルにおける、ＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛髪成長促進効果の確認
実施例４で作製したＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体を対象に、毛髪成長促進効果を次のように確認した。

【0065】

生後７週齢の雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス２３匹の毛を除毛機械により短くし、除毛剤により残った毛を完全に除去し、その後１日間馴化した。１グループ５～６匹ずつに分けて実験を行った。グループは次の通りである。
グループ１：対照群（ＩｇＧ１，５０μｇ／ｈｅａｄ），５匹
グループ２：キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体（５０μｇ／ｈｅａｄ）投与群，６匹
グループ３：（＃１）ＶＨ１－ＶＬ１抗体（５０μｇ／ｈｅａｄ）投与群，６匹
グループ４：（＃３）ＶＨ１－ＶＬ３抗体（５０μｇ／ｈｅａｄ）投与群，６匹
グループ５：（＃４）ＶＨ２－ＶＬ１抗体（５０μｇ／ｈｅａｄ）投与群，６匹

【0066】

前記グループ別にマウスの背部に１回皮下注射し（投与量５０μｇ／ｈｅａｄ）、各抗体の注入後１７日間にわたって、前記マウスの背部の発毛の程度を追跡観察した。１７日後に、発毛したマウスの背部を剃刀で剃り、得られた毛の重量を測定した。

【0067】

図８及び図９に示すように、マウスにおける毛髪成長促進効果を評価した結果、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体で処理すると、毛髪の成長が促進されることが確認された。

【0068】

よって、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより、毛髪の成長を促進し、優れた発毛効果を有することが確認された。

【実施例7】

【0069】

円形脱毛動物モデルにおける、ＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体処理による毛髪成長促進効果の確認
実施例４で作製したＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体を対象に、毛髪成長促進効果を次のように確認した。

【0070】

Ｅｄｄｙ Ｈｓｉ Ｃｈｕｎ Ｗａｎｇらが、１０週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪ動物モデルにおける円形脱毛（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）動物由来のｓｋｉｎ－ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｃｅｌｌ（ＬＮＣ）の移植を行って円形脱毛動物モデルを確保し、実験を行った。１グループ３匹ずつに分けて実験を行った。グループは次の通りである。
グループ１：対照群（ＩｇＧ１，１００μｇ／ｈｅａｄ），３匹
グループ２：ＶＨ１－ＶＬ３抗体（１００μｇ／ｈｅａｄ）投与群，３匹

【0071】

実験開始１日目及び１０日目に、前記グループ別にマウスのａｂｄｏｍｉｎａｌ ｓｋｉｎ部分に計２回皮下注射し（投与量５０μｇ／ｈｅａｄ／ｔｉｍｅ）、６週間にわたって脱毛部位を写真撮影し、マウスの皮膚の発毛状態を観察した。

【0072】

図１０に示すように、円形脱毛動物モデルにおける毛髪成長促進効果を評価した結果、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体で処理すると、毛髪の成長が促進されることが確認された。

【0073】

よって、本発明のＣＸＣＬ１２に対するヒト化抗体は、ＣＸＣＬ１２を抑制することにより、毛髪の成長を促進し、優れた発毛効果を有することが確認され、特に円形脱毛の治療効果を有することが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】