特表 2024-545339 抗コロナウイルスのポリペプチド、その誘導体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-05

(54)【発明の名称】抗コロナウイルスのポリペプチド、その誘導体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/165 20060101AFI20241128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241128BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241128BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20241128BHJP

【ＦＩ】

C07K14/165

C12N15/63 Z ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

C12N15/50

A61P31/14

A61K47/64

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/107

A61K9/14

A61P37/04

A61K38/16

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024538259

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2024-06-21

(86)【国際出願番号】 CN2022084473

(87)【国際公開番号】W WO2023123722

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】202111675955.3

(32)【優先日】2021-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517121939

【氏名又は名称】中国科学院微生物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

(71)【出願人】

【識別番号】516373845

【氏名又は名称】深▲せん▼翰宇薬業股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＨＹＢＩＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ Ｏｆｆｉｃｅ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｈｙｂｉｏ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐａｒｋ， Ｍｉｄｄｌｅ Ｚｏｎｅ Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０５７ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】高福

(72)【発明者】

【氏名】曾少貴

(72)【発明者】

【氏名】王奇慧

(72)【発明者】

【氏名】唐洋明

(72)【発明者】

【氏名】陳健韜

(72)【発明者】

【氏名】▲ウ▼麗麗

(72)【発明者】

【氏名】鄭安▲チ▼

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C076AA17

4C076AA29

4C076AA36

4C076AA53

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB25

4C076CC06

4C076CC35

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084MA22

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA59

4C084MA66

4C084NA13

4C084ZB33

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA55

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA33

(57)【要約】

本発明は、抗コロナウイルスのポリペプチド、その誘導体及びその使用に関し、本発明は、抗コロナウイルスのためのポリペプチドを提供し、且つこれを基にして上記ポリペプチドのコレステロール含有誘導体を提供し、これらのポリペプチド誘導体は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株に対して予想外の阻害効果を生じ、新型コロナウイルスの予防又は治療のための薬物若しくはワクチンの製造に使用可能であり、極めて高い予防又は治療潜在力を有する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗コロナウイルスのためのポリペプチドであって、下記の（１）～（８）：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（６）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（７）前記ポリペプチド（１）～（６）の何れか１つのアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対する阻害活性を有するポリペプチド、或いは
（８）前記ポリペプチド（１）～（６）の何れか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対する阻害活性を有するポリペプチド、
の何れか１つに記載の配列のポリペプチドであり、
好ましくは、前記ポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４の配列である、
ことを特徴とする、ポリペプチド。

【請求項2】

抗コロナウイルスのためのポリペプチド誘導体であって、前記ポリペプチド誘導体は、コレステロールの誘導体で修飾された請求項１に記載の抗コロナウイルスのポリペプチドであり、
好ましくは、前記コレステロールの誘導体の修飾部位は、ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、又はポリペプチドのアミノ酸塩基側鎖にあり、より好ましくは、前記コレステロール修飾の修飾部位は、前記ポリペプチドのＣ末端にあり、
好ましくは、前記コレステロールの誘導体は、前記ポリペプチドのＣ末端にリンカーを介して連結しているか又は直接連結しており、
好ましくは、前記コレステロールの誘導体は、システインで修飾されたコレステロールの誘導体であり、
或いは
前記コレステロールの誘導体は、システイン及びＰＥＧで修飾されたコレステロールの誘導体である、
ことを特徴とする、ポリペプチド誘導体。

【請求項3】

前記コレステロール誘導体は、

、

から選ばれ、
前記Ｒ_２はＯＨ又はＮＨ_２であり、
前記ｎは１～２０の任意の整数、好ましくは２～６の任意の整数であり、
前記ｘは１～６の任意の整数である、
ことを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド誘導体。

【請求項4】

前記リンカーは、－ＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－、（ＧＳＧ）ｍ、（ＧＳＧＳＧ）ｍ、（ＧＳＧ）ｍ－ＣＯＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－、又は（ＧＳＧＳＧ）ｍ－ＣＯＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－であり、
そのうち、ｍは０～６の任意の整数であり、
前記ｎは１～２０の任意の整数、好ましくは２～６の任意の整数であり、
前記ｘは１～６の任意の整数である、
ことを特徴とする、請求項２又は３に記載のポリペプチド誘導体。

【請求項5】

前記ポリペプチド誘導体は、以下の構造Ｉ、構造ＩＩ及び構造ＩＩＩに示される構造式を有する：

、

、

、
そのうち、前記Ｒ_１は（ＧＳＧ）ｍ又は（ＧＳＧＳＧ）ｍであり、ｍは０～６の任意の整数から選ばれ、好ましくは、ｍは０、１又は２であり、
前記Ｒ_２はＯＨ又はＮＨ_２であり、好ましくは、Ｒ_２はＮＨ_２であり、
前記ポリペプチド配列は、請求項１における（１）～（８）から選ばれる何れか１つに記載のポリペプチド配列であり、
好ましくは、前記ポリペプチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４の配列である、
ことを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド誘導体。

【請求項6】

前記ポリペプチド誘導体は以下から選ばれる：

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

から選ばれる、
ことを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド誘導体。

【請求項7】

請求項１に記載のポリペプチドをコードするために用いられる、ことを特徴とする、ポリヌクレオチド配列。

【請求項8】

請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする、ベクター。

【請求項9】

請求項８に記載のベクターを含む、ことを特徴とする、細胞。

【請求項10】

請求項１に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２～５の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体を含む、ことを特徴とする、融合タンパク質又は複合体。

【請求項11】

医薬組成物であって、請求項１に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２～５の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体又はそれらの混合物、及び／又は請求項１０に記載の融合タンパク質又は複合体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み、
好ましくは、前記医薬組成物は、吸入剤、鼻腔用製剤、又は経口製剤若しくは非経口製剤の形態であり、
好ましくは、前記経口製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、丸剤及び液剤から選ばれ、
好ましくは、前記非経口製剤は、注射可能又はボーラス投与可能な製剤であり、
好ましくは、前記医薬組成物は、ワクチン組成物である、
ことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項12】

薬物の製造における、請求項１に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２～５の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体又はそれらの混合物、及び／又は請求項１０に記載の融合タンパク質又は複合体の使用であって、前記薬物は、コロナウイルスの阻害、或いはコロナウイルスにより引き起こされる疾患の治療及び／又は予防のために用いられ、
好ましくは、そのうち、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のオリジナル株又はそれらの変異株から選ばれ、
好ましくは、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株から選ばれ、
より好ましくは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎから選ばれ、
好ましくは、コロナウイルスにより引き起こされる疾患は、新型コロナウイルス肺炎（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）、重症急性呼吸器症候群、中東呼吸器症候群から選ばれ、
好ましくは、そのうち、前記薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、エアロゾル剤、丸剤、粉末剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン、顆粒剤、リポソーム、経皮剤、坐剤、又は凍結乾燥粉末注射剤であり、
好ましくは、そのうち、前記薬物は、好ましいは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射及び腹腔内注射、大槽内注射若しくは注入などの注射投与、経直腸、膣及び舌下などの体腔内投与、経鼻腔などの経気道投与、粘膜投与、又は表面投与により投与される、
使用。

【請求項13】

インビトロでコロナウイルスを阻害する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２～５の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体又はそれらの混合物、請求項１０に記載の融合タンパク質又は複合体、及び／又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含み、
好ましくは、そのうち、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のオリジナル株又はそれらの変異株から選ばれ、
好ましくは、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株から選ばれ、
より好ましくは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎから選ばれる、
方法。

【請求項14】

対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２～５の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体又はそれらの混合物、請求項１０に記載の融合タンパク質又は複合体、及び／又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含み、
好ましくは、そのうち、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のオリジナル株又はそれらの変異株から選ばれ、
好ましくは、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株から選ばれ、
より好ましくは、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎから選ばれ、
好ましくは、コロナウイルスにより引き起こされる疾患は、新型コロナウイルス肺炎（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）、重症急性呼吸器症候群、中東呼吸器症候群から選ばれる、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医薬分野に関し、具体的には、コロナウイルスの予防又は治療のためのポリペプチド、その誘導体、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、当該核酸構築物を含む発現ベクター、形質転換細胞、及び以上を含む医薬組成物、並びに新型コロナウイルスの予防及び／又は治療のための薬物若しくはワクチンの製造におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルス（英語：Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）は、エンベロープを有し、ゲノムが線状一本鎖プラス鎖であるＲＮＡウイルスであり、自然界に広く存在するウイルスの一種である。コロナウイルスの中には、ヒトに感染して疾患を引き起こすものがあり、これまでのところ、ヒトに感染できるコロナウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の７種類がある。

【0003】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、新型コロナ肺炎の病原体であり、２１世紀以来、ヒトの疫病の流行を引き起こす第三のコロナウイルスである。現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンやモノクローナル抗体薬物には、緊急使用許可が承認されたものが種々あるが、多くの研究によると、Ｂｅｔａ、Ｄｅｌｔａ、及びＯｍｉｃｒｏｎなどの広く流行している新型コロナウイルス変異株に対するそれらの保護効果が低下していることが示され、そのため、現在流行しており、及び将来出現する新型変異株に対する広域スペクトル薬物又はワクチンの開発が急務となっている。

【0004】

現在、コウモリ由来のＲａＴＧ１３、ＲｍＹＮ０２、ＺＣ４５、ＺＸＣ２１など、センザンコウ由来のＧＸ／Ｐ２Ｖ／２０１７及びＧＤ／１／２０１９などの様々な新型コロナ関連コロナウイルス（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓに属する）が報告されているが、研究によると、ＲａＴＧ１３、ＧＸ／Ｐ２Ｖ／２０１７、ＧＤ／１／２０１９などもヒトに感染する可能性があり、そのため、将来出現する可能性のある新規な疫病の流行に対処するために、これらの関連コロナウイルスに対する薬物又はワクチンの開発も急務となっている。

【発明の概要】

【0005】

先行技術の欠点に対して、本発明の目的は、コロナウイルスの予防又は治療のためのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、当該核酸構築物を含む発現ベクター、形質転換細胞、及び以上を含む医薬組成物、並びにコロナウイルスの予防又は治療のための薬物若しくはワクチンの製造におけるそれらの使用を提供することである。

【0006】

第１の態様において、本発明は、下記の（１）～（８）の何れか１つに記載の配列のポリペプチドである、抗コロナウイルスのためのポリペプチドを提供する：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（６）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（７）上記ポリペプチド（１）～（６）の何れか１つのアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対する阻害活性を有するポリペプチド、或いは
（８）上記ポリペプチド（１）～（６）の何れか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対する阻害活性を有するポリペプチド。

【0007】

好ましくは、上記ポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４の配列である。

【0008】

第２の態様において、本発明は、抗コロナウイルスのためのポリペプチド誘導体を提供し、上記ポリペプチド誘導体は、コレステロールの誘導体で修飾された上記抗コロナウイルスのポリペプチドである。

【0009】

更に、上記コレステロールの誘導体の修飾部位は、ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、又はポリペプチドのアミノ酸塩基側鎖にある。好ましくは、上記コレステロール修飾の修飾部位は、上記ポリペプチドのＣ末端にある。

【0010】

更に、上記コレステロールの誘導体は、上記ポリペプチドのＣ末端にリンカーを介して連結しているか又は直接連結している。

【0011】

更に、上記コレステロールの誘導体は、システイン及び／又はＰＥＧで修飾されたコレステロールの誘導体である。

【0012】

更に、上記コレステロール誘導体は、

、

から選ばれ、
上記Ｒ_２はＯＨ又はＮＨ_２であり、
上記ｎは１～２０の任意の整数、好ましくは２～６の任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であり、
上記ｘは１～６の任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６である。

【0013】

更に、上記リンカーは、－ＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－、（ＧＳＧ）ｍ、（ＧＳＧＳＧ）ｍ、（ＧＳＧ）ｍ－ＣＯＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－、又は（ＧＳＧＳＧ）ｍ－ＣＯＮＨ－ＰＥＧｎ－（ＣＨ_２）ｘ－ＣＯ－であり、
そのうち、ｍは０～６の任意の整数、例えば０、１、２、３、４、５又は６であり、
上記ｎは１～２０の任意の整数、好ましくは２～６の任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であり、
上記ｘは１～６の任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６である。

【0014】

更に、上記ポリペプチド誘導体は、以下の構造Ｉ、構造ＩＩ及び構造ＩＩＩに示される構造式を有する：

構造Ｉ式：ポリペプチド配列－Ｒ１－Ｃｙｓ（ＣＨ_２ＣＯＮＨ（ＰＥＧ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｘＣＯＯＣｈｏｌ）－Ｒ_２

構造ＩＩ式：ポリペプチド配列－Ｒ１－Ｃｙｓ（ＣＨ_２ＣＯＯＣｈｏｌ）－Ｒ_２

構造ＩＩＩ式：ポリペプチド配列－Ｒ１－ＣＯＮＨ（ＰＥＧ）_ｎ（ＣＨ_２）ｘ－Ｃｙｓ（ＣＨ_２ＣＯＯＣｈｏｌ）－Ｒ_２
そのうち、上記ポリペプチド配列は、上記（１）～（８）の何れか１つに記載のポリペプチド配列を指し、
好ましくは、上記ポリペプチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４の配列であり、
上記Ｒ_１は（ＧＳＧ）ｍ又は（ＧＳＧＳＧ）ｍであり、ｍは０～６の任意の整数から選ばれ、好ましくは、ｍは１又は２であり、
上記Ｒ_２はＯＨ又はＮＨ_２であり、好ましくは、Ｒ_２はＮＨ_２である。

【0015】

更に、上記ポリペプチド誘導体は以下：

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

から選ばれる。

【0016】

第３の態様において、本発明は、第１の態様のポリペプチドをコードするためのポリヌクレオチド配列を提供する。

【0017】

第４の態様において、本発明は、第３の態様に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

【0018】

第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様に記載のベクターを含む細胞を提供する。

【0019】

第６の態様において、本発明は、第１の態様で提供されるポリペプチド及び／又は第２の態様で提供される誘導体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供し、
一実施例において、上記医薬組成物は、吸入剤、鼻腔用製剤、又は経口製剤若しくは非経口製剤の形態であり、
好ましくは、上記経口製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、丸剤及び液剤から選ばれ、
好ましくは、上記非経口製剤は、注射可能又はボーラス投与可能な製剤であり、
より好ましくは、上記医薬組成物は、ワクチン組成物である。

【0020】

好ましくは、そのうち、上記薬物の剤形は、錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、エアロゾル剤、丸剤、粉末剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン、顆粒剤、リポソーム、経皮剤、坐剤、又は凍結乾燥粉末注射剤であり、
好ましくは、そのうち、前記薬物は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射及び腹腔内注射、大槽内注射若しくは注入などの注射投与、経直腸、膣及び舌下などの体腔内投与、経鼻腔などの経気道投与、粘膜投与、又は表面投与により投与されることが好ましく、
第７の態様において、本発明は、薬物の製造における、上記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、融合タンパク質又は複合体の使用を提供し、上記薬物は、コロナウイルスの阻害、或いはコロナウイルスにより引き起こされる疾患の治療及び／又は予防のために用いられる。

【0021】

好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のオリジナル株又はそれらの変異株から選ばれ、
好ましくは、上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株から選ばれる。

【0022】

更に好ましくは、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎから選ばれる。

【0023】

好ましくは、コロナウイルスにより引き起こされる疾患は、新型コロナウイルス肺炎（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）、重症急性呼吸器症候群、中東呼吸器症候群から選ばれる。

【0024】

第８の態様において、本発明は、上記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、融合タンパク質又は複合体、或いは医薬組成物を使用することを含む、インビトロでコロナウイルスを阻害する方法を提供し、
好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株であり、
更に好ましくは、上記変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎを含む。

【0025】

更に、使用の方法は、第１の態様のポリペプチド、第２の態様で提供される誘導体及び／又は第３の態様の医薬組成物を、ウイルスと接触させることである。

【0026】

第９の態様において、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、上記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、融合タンパク質又は複合体、或いは医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供し、
好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株であり、
更に好ましくは、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎを含む。

【0027】

第１０の態様において、本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療するための、上記ポリペプチド及びポリペプチド誘導体、融合タンパク質又は複合体の使用を提供し、
好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株であり、
更に好ましくは、上記変異株は、Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎを含む。

【0028】

本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0029】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質のＨＲ２領域に基づいて、ポリペプチドＰ３を設計し、且つそれに対して一連の改変（１つ又は複数のアミノ酸の増加又は置換を含む）を行ってポリペプチドを得、そしてポリペプチドにリンカー及びコレステロール修飾を行ってポリペプチド誘導体を得、ポリペプチド及びその誘導体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対する優れた阻害効果を有し、新型コロナウイルスの予防又は治療のための薬物若しくはワクチンの製造に使用可能であり、極めて高い予防又は治療潜在力を有する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】実施例２における異なるポリペプチドの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株のシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図2】実施例２における異なるポリペプチドの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図3】実施例３におけるポリペプチドＰ３－２の、新型コロナウイルスオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図4】実施例３におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌの、新型コロナウイルスオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図5】実施例３におけるポリペプチドＰ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、新型コロナウイルスオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図6】実施例３におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、新型コロナウイルスオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図7】実施例３におけるポリペプチドＰ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、新型コロナウイルスオリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図8】実施例４におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌのアミノ酸がＮ末端から１つずつノックアウトされた後の切断型ポリペプチドの、オリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）のシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図9】実施例４におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌのアミノ酸がＮ末端から１つずつノックアウトされた後の切断型ポリペプチドの、変異株Ｄｅｌｔａのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図10】実施例４におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌのアミノ酸がＮ末端から１つずつノックアウトされた後の切断型ポリペプチドの、変異株Ｏｍｉｃｒｏｎのシュードウイルスに対する阻害効果である。

【図11】実施例５におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【図12】実施例５におけるポリペプチドＰ３－２－ＰＥＧ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【図13】実施例５におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【図14】実施例６におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【図15】実施例６におけるポリペプチドＰ３－２－ＰＥＧ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【図16】実施例６におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルス侵入を媒介するプロセスで重要な役割を果たし、Ｓ１及びＳ２の２つのサブユニットに分けられ、そのうち、Ｓ１サブユニットは受容体の認識を担い、Ｓ２サブユニットはウイルスエンベロープと宿主細胞膜との膜融合を媒介する。Ｓ２におけるヘプタペプチド反復配列ＨＲ１及びＨＲ２は、６ヘリックスバンドルを形成することにより膜融合機能を発揮し、研究によると、異種ＨＲ１又はＨＲ２ポリペプチドの加入が、ウイルス自体のＨＲ１及びＨＲ２の６ヘリックスバンドルの形成を阻害し、更に膜融合プロセスを阻害し得ることが示唆されている。

【0032】

本発明の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ様ウイルス感染に対する阻害機能を有し得るポリペプチド類侵入阻害剤のセットを提供することであり、上記ポリペプチド類侵入阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ様ウイルスＳ２タンパク質中のＨＲ１領域に結合し、ウイルス自体の６ヘリックスバンドルの形成プロセスを妨害することにより、ウイルスの融合感染プロセスを阻害する。

【0033】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質のＨＲ２領域に基づいて、ポリペプチドＰ３を設計し、且つそれに対して一連の改変（１つ又は複数のアミノ酸の増加又は置換を含む）を行ってポリペプチドＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３を得、そしてポリペプチドＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３にリンカー及びコレステロール修飾を行い、そのコレステロール修飾ポリペプチド誘導体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対して強い阻害効果を有するようにし、新型コロナウイルスの予防又は治療のための薬物若しくはワクチンの製造に使用可能である。

【0034】

当該セットのポリペプチドの具体的な配列は、表１に示す通りであるか、又はポリペプチド配列表に詳しく示される。当該発明のポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する阻害活性を有し、一部のポリペプチドの阻害活性は予想外に高いレベルまで達しており、特に、新型コロナウイルス変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対して優れた阻害効果を達成した。

【0035】

本明細書において、ポリペプチドは、配列番号１～６の配列を含むポリペプチド又はその変異体であってもよい。

【0036】

例えば、ポリペプチドは、配列番号１、２又は３に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列を含み得る。

【0037】

アミノ酸付加は、ポリペプチドがコロナウイルスに対する阻害活性を有する限り、アミノ酸配列、例えば配列番号１、２又は３の配列のＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加することを指す。

【0038】

アミノ酸置換は、ポリペプチドがコロナウイルスに対する阻害活性を有する限り、アミノ酸配列、例えば配列番号１、２又は３の配列のある位置におけるあるアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたことを指す。

【0039】

アミノ酸挿入は、ポリペプチドがコロナウイルスに対する阻害活性を有する限り、アミノ酸配列、例えば配列番号１、２又は３の配列の適切な位置にアミノ酸残基を挿入することを指し、挿入されたアミノ酸残基は全体又は一部が互いに隣接していてもよく、或いは、挿入されたアミノ酸は何れも互いに隣接していない。

【0040】

アミノ酸欠失は、ポリペプチドがコロナウイルスに対する阻害活性を有する限り、アミノ酸配列、例えば配列番号１、２又は３の配列から１、２又は３個以上のアミノ酸を削除してもよいことを指す。

【0041】

本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体は、合成により生成されてもよく、或いは、本発明のポリペプチドは、細胞で発現されてもよい。例えば、化学的手段により本発明のポリペプチドを合成してもよい。或いは、組換え細胞において本発明のポリペプチドを発現してもよい。細胞の種類は限定されず、例えば、細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい。真核細胞は、酵母細胞などの真菌細胞、又は昆虫細胞若しくはマウス細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。原核細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞であってもよい。

【0042】

本発明のポリペプチドのコレステロール修飾は、ポリペプチドがＣ末端でコレステロールの一部に連結するように、ポリペプチドのＣ末端で行うことができる。当該連結は、直接連結であってもよく、又はリンカーを介した連結であってもよい。本発明におけるポリペプチドのコレステロール修飾方法は、従来技術における公知の方法である。

【0043】

リンカーの種類と長さは変更可能である。例えば、リンカーは（ＧＳＧ）ｍ又は（ＧＳＧＳＧ）ｍであってもよく、そのうち、ｍは任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６などであってもよい。

【0044】

リンカーはＰＥＧ化され得る。ＰＥＧ化修飾の手段は、当業者に既知のものである。本明細書で使用される場合、用語ＰＥＧ化リンカーは、１つ又は複数のＰＥＧが付加されたリンカーを指す。本明細書において、ＰＥＧ化リンカーは、ＰＥＧ化の（ＧＳＧ）ｎ又は（ＧＳＧＳＧ）ｎであってもよい。ｎは任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６などであってもよい。

【0045】

本明細書に使用されるように、「ＰＥＧｍ」は、ポリエチレングリコール繰り返し単位の数がｍであることを意味する。ｍは任意の整数、例えば１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０であってもよい。

【0046】

本明細書に使用されるように、コロナウイルスは、任意の種類のコロナウイルスであってもよい。好ましくは、上記コロナウイルスは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ又は変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎである。

【0047】

本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体は、薬物又は医薬組成物として製造することができ、このような医薬組成物は、吸入剤、鼻腔用製剤、又は経口製剤若しくは非経口製剤の形態であり、
好ましくは、上記経口製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、丸剤及び液剤から選ばれ、
好ましくは、上記非経口製剤は、注射可能又はボーラス投与可能な製剤であり、
好ましくは、医薬組成物は、ワクチン組成物であり、
このような薬物は、錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、エアロゾル剤、丸剤、粉末剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン、顆粒剤、リポソーム、経皮剤、坐剤、又は凍結乾燥粉末注射剤であってもよい。これらの薬物又は医薬組成物は、様々な投与方法、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射及び腹腔内注射、大槽内注射若しくは注入などの注射投与、経直腸、膣及び舌下などの体腔内投与、経鼻腔などの経気道投与、粘膜投与、又は表面投与により使用されてもよい。

【0048】

本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体を投与することを含む、方法を提供する。本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療するためのポリペプチド又はポリペプチド誘導体を更に提供する。

【0049】

本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、本発明のポリペプチド又はポリペプチド誘導体の組成物を対象／患者に投与することを含む、方法に更に関し、
好ましくは、そのうち、コロナウイルスは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ又は変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎである。

【0050】

本発明は、対象におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療するためのポリペプチド又はポリペプチド誘導体或いは組成物に更に関し、好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ又は変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎである。

【0051】

本発明は、対象／患者におけるコロナウイルス感染又はコロナウイルスにより引き起こされる疾患を予防又は治療するためのポリペプチド又はポリペプチド誘導体或いは組成物、医薬組成物、及び試薬キットに更に関し、好ましくは、そのうち、上記コロナウイルスは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ又は変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌａｍｂｄａ、Ｄｅｌｔａｃｒｏｎである。
実施例

【0052】

本発明がより明確に理解されるように、以下の実施例及び図面を参照しながら本発明を更に説明する。実施例は、単に説明するためであり、本発明を限定するものではない。実施例において、各未加工試薬材料は何れも市販されており、具体的な条件が明記されていない実験方法は、当技術分野における周知の通常の方法及び通常の条件、又は機器メーカーにより推奨された条件に従う。

【0053】

以下、本発明について詳しく説明する。

【0054】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＨＲ２領域に基づいて、ポリペプチドＰ３を設計し、且つＰ３ポリペプチドに対して一連の改変（１つ又は複数のアミノ酸の増加又は置換を含む）を行い、改変後のポリペプチドをそれぞれＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３と命名し、そしてポリペプチドＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３にリンカー及びコレステロール修飾を行って対応するポリペプチド誘導体を得、当分野で通常使用される方法により直接合成される。

【0055】

実験機器及び材料：
シュードウイルス・パッケージング骨格ウイルスＧ＊ＶＳＶ－ｄｅｌＧ（武漢枢密脳科学技術有限公司から購入）。

【0056】

真核生物系タンパク質ｐＣＡＧＧＳ発現ベクター（蘇州金唯智社により提供）。

【0057】

ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞（蘇州金唯智社により提供）。

【0058】

ポリペプチド：
本発明者らは、ヒト感染コロナウイルスタンパク質中のＨＲ１及びＨＲ２配列の同一性を比較することにより、ポリペプチドＰ３を設計し、且つＰ３ポリペプチドに対して一連の改変（１つ又は複数のアミノ酸の増加又は置換を含む）を行い、改変後のポリペプチドをそれぞれＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３と命名し、そしてポリペプチドＰ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３に一連のリンカー及びコレステロール修飾を行って対応するポリペプチド誘導体を得、表１に示されるこれらのポリペプチド及びポリペプチド誘導体の具体的な配列及び構造を得た。合成及び精製は、深セン翰宇薬業股フン有限公司により行い、その純度＞９５％である。

【0059】

【表1】

【0060】

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株のシュードウイルスは、本発明者らの実験室によりパッケージングして得られる（実施例２を参照）。
実施例１

【0061】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株のシュードウイルスのパッケージング
切断されたＳタンパク質の発現プラスミドの製造
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株（Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）及び変異株（Ａｌｐｈａ（Ｂ．１．１．７）、Ｂｅｔａ（Ｂ．１．３５１）、Ｇａｍｍａ（Ｐ．１）、Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）及びＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１））のＳタンパク質の最後の１８位アミノ酸をコードするヌクレオチドを除去し、それぞれヌクレオチド配列ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ－Ｓ－ｄｅｌ１８、Ｂ．１．１．７－Ｓ－ｄｅｌ１８、Ｂ．１．３５１－Ｓ－ｄｅｌ１８、Ｐ．１－Ｓ－ｄｅｌ１８、Ｂ．１．６１７．２－Ｓ－ｄｅｌ１８、ＢＡ．１－Ｓ－ｄｅｌ１８を得、そして蘇州金唯智社により合成した。

【0062】

２）ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに１）で得られた各ヌクレオチド配列をそれぞれクローニングし、発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ－Ｓ－ｄｅｌ１８、ｐＣＡＧＧＳ－Ｂ．１．１．７－Ｓ－ｄｅｌ１８、ｐＣＡＧＧＳ－Ｂ．１．３５１－Ｓ－ｄｅｌ１８、ｐＣＡＧＧＳ－Ｐ．１－Ｓ－ｄｅｌ１８、ｐＣＡＧＧＳ－Ｂ．１．６１７．２－Ｓ－ｄｅｌ１８、及びｐＣＡＧＧＳ－ＢＡ．１－Ｓ－ｄｅｌ１８を得た。

【0063】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株のシュードウイルスのパッケージング
ａ．細胞の準備：１０ｃｍ細胞ペトリ皿にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を播種し、翌日の細胞コンフルエンスが８０％程度に達するようにした。

【0064】

ｂ．トランスフェクション：上記ステップ２）で得られた各Ｓタンパク質の発現プラスミドを取り、ＰＥＩで３０μｇプラスミド／１０ｃｍ細胞ペトリ皿にトランスフェクションし、目的プラスミドとＰＥＩとを１：３の割合で均一に混合してからトランスフェクションし、４～６ｈに培養液（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）を換えて３７℃で２４ｈ培養した。

【0065】

ｃ．ウイルス加入：上記トランスフェクションしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、シュードウイルス・パッケージング骨格ウイルスＧ＊ＶＳＶ－ｄｅｌＧ（武漢枢密脳科学技術有限公司から購入）を加え、３７℃で２ｈインキュベートし、培養液（１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地）を換え、そしてＶＳＶ－Ｇ抗体（当該抗体を発現するハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ細胞バンクから購入）を加え、インキュベーターで引き続き３０ｈ培養した。

【0066】

ｄ．ウイルス回収：上清を回収して３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、超クリーンベンチにおいて０．４５μｍの滅菌フィルターでろ過し、細胞破片を除去し、分注し、－８０℃の冷蔵庫で保存した。

【0067】

上記ステップを経て、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）及び変異株（Ａｌｐｈａ（Ｂ．１．１．７）、Ｂｅｔａ（Ｂ．１．３５１）、Ｇａｍｍａ（Ｐ．１）、Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）及びＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１））のシュードウイルスをそれぞれ得た。
実施例２

【0068】

ポリペプチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株のシュードウイルスに対する阻害効果の評価
本実施例は、表１におけるポリペプチドのオリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１）のシュードウイルスに対する阻害効果を測定することを目的とする。

【0069】

実験の群分け：ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞（ブランク対照群、細胞はウイルスに感染していない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ＤＭＥＭ培地（陰性対照群、細胞はウイルスに感染しているがポリペプチドで処理されていない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ポリペプチドＰ３（Ｐ３処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－１（Ｐ３－１処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２（Ｐ３－２処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－３（Ｐ３－３処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－１－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－１－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－３－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－３－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－３－ＧＳ２－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－３－ＧＳ２－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－１－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－１－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－３－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－３－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－３－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－３－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）。

【0070】

ポリペプチド原液の調製：表１における各ポリペプチドを、まずそれぞれＤＭＳＯで１０ｍＭの母液として調製し、そして１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で母液を２０μＭに希釈し、更なる勾配希釈のための原液とした。

【0071】

ポリペプチド勾配希釈液の調製：上記２０μＭの各ポリペプチド原液を、１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で２倍の倍加で希釈し、合計９勾配で希釈し（それぞれ１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６μＭ、０．０７８μＭ、０．０３９μＭ）、１勾配あたり３つの平行ウェル、１ウェルあたり５０μＬであった。

【0072】

シュードウイルス用量の決定：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株又は変異株のシュードウイルス原液及び一連の希釈液を、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞上で定量化し、１０００個のＦＦＵが出現した時点の希釈度をポリペプチド阻害効果を評価する際のウイルス用量とした（希釈倍率は６～２０倍の間）。

【0073】

ウイルス阻害効果の測定方法は、以下の通りである：
ａ．９６ウェル細胞培養プレートにＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞を播種し、翌日の細胞コンフルエンスが８０～９０％に達するように培養した。

【0074】

ｂ．上記実験の群分けに基づいて、上記各ポリペプチド勾配希釈液を取り、等体積（５０μＬ）の定量のシュードウイルス希釈液を加え、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。

【0075】

ｃ．ステップａの９６ウェル細胞培養プレート上清を注意深く除去し、ステップｂのポリペプチド－シュードウイルス混合物（１００μＬ／ウェル）を加え、インキュベーターにおいて引き続き１５ｈ～２４ｈ培養した。

【0076】

ｄ．ハイコンテント顕微鏡を用いて感染細胞数をカウントし、各ポリペプチドの異なる濃度における阻害率を計算し、そしてＧｒａｐｈＰａｄを用いて各ポリペプチドのＥＣ_５０を計算し（図１、図２に示す通り）、合計２回の並行実験を行い、結果を１ｓｔ及び２ｎｄと表記し、表２に示した。

【0077】

【表2】

【0078】

注：Ｎ．Ｄ．は、今回の実験で、当該ポリペプチドが設計された濃度範囲内で当該株を阻害する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を測定できなかったことを示す。

【0079】

結果及び検討：
表２から分かるように、本発明の全てのポリペプチド及びそれらの誘導体は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害効果を示した。そのうち、Ｐ３－２は、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果は、オリジナルＰ３よりも優れているが、オリジナル株に対する阻害結果の再現性が悪く、
Ｐ３－１－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－３－ＧＳ２－Ｃｈｏｌの、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果は、それぞれに対応する非修飾Ｐ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３よりも顕著に優れており、そのうち、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌの阻害効果は大幅に向上し、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．０９２９μＭ及び０．０５３３３μＭであり、変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．０２２０８μＭ及び０．０１４６９μＭであり、
Ｐ３－１－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－３－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果は、それぞれに対応する非修飾Ｐ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３よりも顕著に優れており、そのうち、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの阻害効果は大幅に向上し、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．２１１３μＭ及び０．１９５５μＭであり、変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．００４１６８μＭ及び０．０１６３１μＭであり、
Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－３－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果は、それぞれに対応する非修飾Ｐ３－１、Ｐ３－２、Ｐ３－３よりも優れており、そのうち、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの阻害効果は大幅に向上し、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．１５３５μＭ及び０．０４５４μＭであり、変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する２回の実験のＥＣ_５０がそれぞれ０．００７０２１μＭ及び０．００７６２４μＭであり、
且つ、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が最も良く、特に変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が顕著であり、且つＰ３－２誘導体は２回の実験結果の再現性が良く、ウイルスに対するその阻害能力が最も安定していることが示唆された。
実施例３

【0080】

ポリペプチドＰ３－２及びその誘導体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株のシュードウイルスに対する阻害効果の評価
本実施例は、ポリペプチドＰ３－２、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、オリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）及び変異株（Ａｌｐｈａ（Ｂ．１．１．７）、Ｂｅｔａ（Ｂ．１．３５１）、Ｇａｍｍａ（Ｐ．１）、Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）及びＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１））のシュードウイルスに対する阻害効果を測定することを目的とする。

【0081】

実験の群分け：ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞（ブランク対照群、細胞はウイルスに感染していない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ＤＭＥＭ培地（陰性対照群、細胞はウイルスに感染しているがポリペプチドで処理されていない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ポリペプチドＰ３－２（Ｐ３－２処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）。

【0082】

ポリペプチド原液の調製：表１における各ポリペプチドをそれぞれ、まずＤＭＳＯで１０ｍＭの母液として調製し、そして１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で母液を２０μＭに希釈し、更なる勾配希釈のための原液とした。

【0083】

ポリペプチド勾配希釈液の調製：上記２０μＭの各ポリペプチド原液を、１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で２倍の倍加で希釈し、合計９勾配で希釈し（それぞれ１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６μＭ、０．０７８μＭ、０．０３９μＭ）、１勾配あたり３つの平行ウェル、１ウェルあたり５０μＬであった。

【0084】

シュードウイルス用量の決定：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株又は変異株のシュードウイルス原液及び一連の希釈液を、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞上で定量化し、１０００個のＦＦＵが出現した時点の希釈度をポリペプチド阻害効果を評価する際のウイルス用量とした（希釈倍率は６～２０倍の間）。

【0085】

ウイルス阻害効果の測定方法は、以下の通りである：
ａ．９６ウェル細胞培養プレートにＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞を播種し、翌日の細胞コンフルエンスが８０～９０％に達するように培養した。

【0086】

ｂ．上記実験の群分けに基づいて、上記各ポリペプチド勾配希釈液を取り、等体積（５０μＬ）の定量のシュードウイルス希釈液を加え、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。

【0087】

ｃ．ステップａの９６ウェル細胞培養プレート上清を注意深く除去し、ステップｂのポリペプチド－シュードウイルス混合物（１００μＬ／ウェル）を加え、インキュベーターにおいて引き続き１５ｈ～２４ｈ培養した。

【0088】

ｄ．ハイコンテント顕微鏡を用いて感染細胞数をカウントし、各ポリペプチドの異なる濃度における阻害率を計算し、そしてＧｒａｐｈＰａｄを用いて各ポリペプチドのＥＣ_５０を計算し（図３～７に示す通り）、結果を表３に示した。

【0089】

【表3】

【0090】

注：Ｎ．Ｄ．は、今回の実験で、当該ポリペプチドが設計された濃度範囲内で当該株を阻害する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を測定できなかったことを示す。

【0091】

結果及び検討
表３から分かるように、ポリペプチドＰ３－２の修飾誘導体Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、新型コロナウイルスのオリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ、変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対して優れた阻害効果を有するだけでなく、同時に他の変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａに対しても優れたデータ効果を有し、且つオリジナル株及び変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害実験の結果は再現性が良く、
ポリペプチドＰ３－１の誘導体Ｐ３－１－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌに比べて、ポリペプチドＰ３－２の誘導体Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ、変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果がより良く、
ポリペプチドＰ３－２に比べて、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ、変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果がより良く、そのうち、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの阻害効果はＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌよりも優れており、
各変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対して、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－ＣｈｏｌがＯｍｉｃｒｏｎ株に対する阻害効果が最も良い。
実施例４

【0092】

ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ切断型ポリペプチド及びＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ切断型ポリペプチドの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株のシュードウイルスに対する阻害効果の評価
本実施例は、ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌのアミノ酸がＮ末端から１つずつノックアウトされた後の切断型ポリペプチドの、オリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）及び変異株（Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）及びＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１））のシュードウイルスに対する阻害効果を評価することを目的とする。

【0093】

そのうち、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌのアミノ酸がＮ末端から１つずつノックアウトされた後の切断型ポリペプチドのアミノ酸配列は、表４、表５に示す通りである。

【0094】

【表4】

【表5】

【0095】

そのうち、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－１及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－１は、合成・製造における精製プロセスにおいて性質が極めて不安定であるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株のシュードウイルスに対する阻害効果の評価実験には関与し続けていない。

【0096】

実験の群分け：ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞（ブランク対照群、細胞はウイルスに感染していない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ＤＭＥＭ培地（陰性対照群、細胞はウイルスに感染しているがポリペプチドで処理されていない）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－２（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－２処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－３（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－３処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－２（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－２処理群）、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞＋オリジナル株又は変異株のシュードウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－３（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－３処理群）。

【0097】

ポリペプチド原液の調製：表４、表５における各ポリペプチドをそれぞれ、まずＤＭＳＯで１０ｍＭの母液として調製し、そして１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で母液を２０μＭに希釈し、更なる勾配希釈のための原液とした。

【0098】

ポリペプチド勾配希釈液の調製：上記２０μＭの各ポリペプチド原液を、１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で３倍の倍加で希釈し、合計９勾配で希釈し（それぞれ６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８２、０．０２７、０．００９、０．００３、０．００１μＭ）、１勾配あたり３つの平行ウェル、１ウェルあたり５０μＬであった。

【0099】

シュードウイルス用量の決定：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株又は変異株のシュードウイルス原液及び一連の希釈液を、ＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞上で定量化し、１０００個のＦＦＵが出現した時点の希釈度をポリペプチド阻害効果を評価する際のウイルス用量とした（希釈倍率は６～２０倍の間）。

【0100】

ウイルス阻害効果の測定方法は、以下の通りである：
ａ．９６ウェル細胞培養プレートにＨＥＫ ２９３Ｔ ＡＣＥ２細胞を播種し、翌日の細胞コンフルエンスが８０～９０％に達するように培養した。

【0101】

ｂ．上記実験の群分けに基づいて、上記各ポリペプチド勾配希釈液を取り、等体積（５０μＬ）の定量のシュードウイルス希釈液を加え、均一に混合した後、３７℃で１ ｈインキュベートした。

【0102】

ｃ．ステップａの９６ウェル細胞培養プレート上清を注意深く除去し、ステップｂのポリペプチド－シュードウイルス混合物（１００μＬ／ウェル）を加え、インキュベーターにおいて引き続き１５ｈ～２４ｈ培養した。

【0103】

ｄ．ハイコンテント顕微鏡を用いて感染細胞数をカウントし、各ポリペプチドの異なる濃度における阻害率を計算し、そしてＧｒａｐｈＰａｄを用いて各ポリペプチドのＥＣ_５０を計算し、結果を表６に示した。

【0104】

【表6】

【0105】

結果及び検討
本実施例において、固相合成によりＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの切断型ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－１及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－１を合成したが、これら２つのポリペプチドは安定性が悪く、精製により高純度の試料を得ることができず、シュードウイルス中和試験によるウイルスに対する阻害効果の評価に用いることができない。

【0106】

表６及び図８～１０から分かるように、ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの切断型ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－２、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ－３も、新型コロナウイルスのオリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ、変異株Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対してより良い阻害効果を示したが、阻害効果は何れもＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌよりも弱く、且つこのような阻害効果はペプチド配列の漸進的な切断に伴って漸進的に減少するものではなく、ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌの切断型ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－２、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－３、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－４、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ－５は、オリジナル株Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及び変異株Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎに対しても一定の阻害効果を有するが、阻害効果は何れもＰ－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌよりも弱い。

【0107】

切断型ポリペプチド及び元の長さのポリペプチドのシュードウイルス中和試験データを比較すると、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの切断後の抗ウイルス効果は、何れも異なる程度で低下することが分かった。
実施例５

【0108】

ポリペプチドＰ３－２の誘導体の、Ｖｅｒｏ細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果の評価
本実施例は、表１におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ細胞上でのオリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＨ０１）及び変異株Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）とＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１）の生ウイルスに対する阻害効果を測定することを目的とする。

【0109】

実験の群分け：Ｖｅｒｏ細胞（ブランク対照群、細胞はウイルスに感染していない）、Ｖｅｒｏ細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋ＤＭＥＭ培地（陰性対照群、細胞はウイルスに感染しているがポリペプチドで処理されていない）、Ｖｅｒｏ細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、Ｖｅｒｏ細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、Ｖｅｒｏ細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）。

【0110】

ポリペプチド原液の調製：表１におけるポリペプチドＰ３－２、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌを、まずＤＭＳＯで５ｍＭの母液として調製し、そして２％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で母液を５μＭに希釈し、更なる勾配希釈のための原液とした。ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの３種の株に対する３倍の倍加希釈は何れも５μＭから開始し、合計１１勾配であり、ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－ＣｈｏｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及びＤｅｌｔａ株に対する３倍の倍加希釈は５μＭから開始し、Ｏｍｉｃｒｏｎに対する５倍の倍加希釈は５μＭから開始し、合計１１勾配であり、１勾配あたり４つの平行ウェル、１ウェルあたり５０μＬであった。

【0111】

生ウイルス用量の決定：ＴＣＩＤ５０で計算し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＨ０１、Ｄｅｌｔａ及びＯｍｉｃｒｏｎのウイルス液を、２０００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬにそれぞれ希釈し、各ウイルス液に合計９．６ｍＬを要した（１２ｍＬを基準として調製）。希釈にはＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ含有）を用いた。

【0112】

ウイルス阻害効果の測定方法は、以下の通りである：
ａ．上記実験の群分けに基づいて、上記各ポリペプチド勾配希釈液を取り、等体積（５０μＬ）の定量の生ウイルス希釈液を加え、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。

【0113】

ｂ．懸濁したＶｅｒｏ細胞を混合液に加え、インキュベーターにおいて引き続き４８ｈ～１２０ｈ培養した。

【0114】

ｃ．細胞変性の状況を観察し、４８ｈ、７２ｈ及び１２０ｈの細胞変性のウェル数をそれぞれ記録し、各ポリペプチドの異なる濃度における阻害率を計算し、更にＧｒａｐｈＰａｄを用いて各ポリペプチドのＥＣ_５０を計算し（図１１～１３に示す通り）、結果を表７に示した。

【0115】

【表7】

【0116】

結果及び検討
表７から分かるように、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、Ｖｅｒｏ細胞上で優れた新型コロナウイルス生ウイルス阻害効果を有する。

【0117】

Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、新型コロナウイルスのオリジナル株（ＷＨ０１）について、ＣＰＥ（細胞変性効果）を４８時間で観察し、計算したところ、ＥＣ_５０は０．５２８０μＭであった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、７２時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０２０６μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８及び７２時間の実験群では何れもＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、１２０時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０３６２μＭであった。

【0118】

Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、新型コロナウイルスのオリジナル株（ＷＨ０１）について、ＣＰＥを４８時間で観察し、計算したところ、ＥＣ_５０は０．５２９２μＭであった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、７２時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０２０６μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８及び７２時間の実験群では何れもＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、１２０時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．１８５２μＭであった。

【0119】

Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、新型コロナウイルスのオリジナル株（ＷＨ０１）について、ＣＰＥを４８時間で観察し、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０５８７μＭであった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、７２時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０４０６μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８及び７２時間の実験群では何れもＣＰＥが観察されず、この時点でポリペプチドのウイルスに対する阻害率は１００％であり、１２０時間まで観察時間を延長したら、ＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０２１６μＭであった。

【0120】

観察時間及びＥＣ_５０を総合して分析すると、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌが、Ｖｅｒｏ細胞上で新型コロナウイルス生ウイルスに有効であり、特にＯｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が最も良い。
実施例６

【0121】

ポリペプチドＰ３－２の誘導体の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及びその変異株の生ウイルスに対する阻害効果の評価
本実施例は、表１におけるポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上でのオリジナル株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＨ０１）及び変異株Ｄｅｌｔａ（Ｂ．１．６１７．２）とＯｍｉｃｒｏｎ（ＢＡ．１）の生ウイルスに対する阻害効果を測定することを目的とする。

【0122】

実験の群分け：Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ブランク対照群、細胞はウイルスに感染していない）、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋ＤＭＥＭ培地（陰性対照群、細胞はウイルスに感染しているがポリペプチドで処理されていない）、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ処理群）、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞＋オリジナル株又は変異株の生ウイルス＋Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ（Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ処理群）。

【0123】

ポリペプチド原液の調製：表１におけるポリペプチドＰ３－２、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌを、まずＤＭＳＯで５ｍＭの母液として調製し、そして２％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で母液を５μＭに希釈し、更なる勾配希釈のための原液とした。ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの３種の株に対する３倍の倍加希釈は何れも５μＭから開始し、合計１１勾配であり、ポリペプチドＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－ＣｈｏｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ及びＤｅｌｔａ株に対する３倍の倍加希釈は５μＭから開始し、Ｏｍｉｃｒｏｎに対する５倍の倍加希釈は５μＭから開始し、合計１１勾配であり、１勾配あたり４つの平行ウェル、１ウェルあたり５０μＬであった。

【0124】

生ウイルス用量の決定：ＴＣＩＤ５０で計算し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＨ０１、Ｄｅｌｔａ及びＯｍｉｃｒｏｎのウイルス液を、２０００ ＴＣＩＤ５０／ｍＬにそれぞれ希釈し、各ウイルス液に合計９．６ｍＬを要した（１２ｍＬを基準として調製）。希釈にはＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ含有）を用いた。

【0125】

ウイルス阻害効果の測定方法は、以下の通りである：
ａ．上記実験の群分けに基づいて、上記各ポリペプチド勾配希釈液を取り、等体積（５０μＬ）の定量の生ウイルス希釈液を加え、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。

【0126】

ｂ．懸濁したＶｅｒｏ Ｅ６細胞を混合液に加え、インキュベーターにおいて引き続き４８～７２ｈ培養した。

【0127】

ｃ．細胞変性の状況を観察し、４８ｈ及び７２ｈの細胞変性のウェル数を記録し、各ポリペプチドの異なる濃度における阻害率を計算し、更にＧｒａｐｈＰａｄを用いて各ポリペプチドのＥＣ_５０を計算し（図１４～１６に示す通り）、結果を表８に示した。

【0128】

【表8】

【0129】

注：Ｎ．Ｄ．は、今回の実験で、当該ポリペプチドが設計された濃度範囲内で当該株を阻害する半数効果濃度（ＥＣ_５０）を測定できなかったことを示す。

【0130】

結果及び検討
表８から分かるように、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ、Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上で優れた新型コロナウイルス生ウイルス阻害効果を有する。４８ｈ後に各ポリペプチドのＥＣ_５０を観察することができるため、主に４８ｈのデータを比較した。

【0131】

Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上での新型コロナウイルスのオリジナル株（ＷＨ０１）について、４８ｈ及び７２ｈ観察したところ、何れにおいても生ウイルスに対する阻害効果は見られなかった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．３４８５μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．００２２μＭであった。

【0132】

Ｐ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上での新型コロナウイルスのオリジナル株（ＷＨ０１）について、４８ｈ及び７２ｈ観察したところ、何れにおいても生ウイルスに対する阻害効果は見られなかった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．５２９２μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．００１５μＭであった。

【0133】

Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌの生ウイルス中和試験において、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上での新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．１２０８μＭであった。新型コロナウイルスＤｅｌｔａ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．０４０３μＭであった。新型コロナウイルスＯｍｉｃｒｏｎ変異株について、４８時間の実験群ではＣＰＥが観察され得、計算したところ、ＥＣ_５０は０．００００２８μＭであった。

【0134】

観察時間及びＥＣ_５０を総合して分析すると、Ｐ３－２－ＧＳ－Ｃｈｏｌ及びＰ３－２－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、Ｖｅｒｏ Ｅ６上で新型コロナウイルス生ウイルスの変異株に有効であり、特にＯｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が最も良く、Ｐ３－２－ＧＳ－ＰＥＧ－Ｃｈｏｌは、新型コロナウイルス生ウイルスのオリジナル株及び変異株の何れに対しても有効であり、特にＯｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が最も良い。

【0135】

以上をまとめると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の宿主細胞への侵入プロセスにおいて、本発明のポリペプチド及びその誘導体は、Ｓタンパク質媒介性膜融合プロセスを阻害することによりウイルスの侵入を阻害し、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株により引き起こされる疾患の予防又は治療に適用される。本発明のポリペプチド及びその誘導体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オリジナル株及び変異株Ａｌｐｈａ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍｍａ、Ｄｅｌｔａ、Ｏｍｉｃｒｏｎ、特に変異株Ｏｍｉｃｒｏｎに対する阻害効果が顕著であり、潜在的な広い使用価値を有する。

【0136】

上記実施例１～６にかかる略語及び英語の意味は、下記表９に示す通りである。

【0137】

【表9】

【0138】

明らかに、上述の実施例は、明確な説明のための例に過ぎず、実施形態を限定するものではない。当業者であれば、上記の説明に基づいて他の変化又は変更を行うことができる。本明細書において、全ての実施形態の網羅は必要もなければできることもない。これらによって導かれる明らかな変更又は修正は、依然として本発明の保護範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】