特表 2024-545360 エステラーゼ及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-05

(54)【発明の名称】エステラーゼ及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/16 20060101AFI20241128BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 15/01 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP

   C08J 11/18 20060101ALI20241128BHJP

   C11D 3/386 20060101ALI20241128BHJP

【ＦＩ】

C12N9/16 ZNA

C12N15/55

C12N15/63 Z

C12N15/01 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C08J11/18 ZAB

C11D3/386

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024555266

(86)(22)【出願日】2022-11-15

(85)【翻訳文提出日】2024-07-09

(86)【国際出願番号】 EP2022082014

(87)【国際公開番号】W WO2023088908

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】21306589.9

(32)【優先日】2021-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524184518

【氏名又は名称】カルビオス

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】アラン・マルティ

(72)【発明者】

【氏名】イザベル・アンドレ

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー・アルナル

(72)【発明者】

【氏名】ソフィ・デュケーヌ

(72)【発明者】

【氏名】サビーヌ・ガヴァルダ

(72)【発明者】

【氏名】マルク・ゲルー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァンサン・トゥルニエ

【テーマコード（参考）】

4B065

4F401

4H003

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA57

4F401AA22

4F401CA67

4F401CA76

4F401CA77

4F401FA01Z

4F401FA20Z

4H003BA09

4H003BA12

4H003BA18

4H003DA01

4H003EC01

4H003ED02

4H003FA47

(57)【要約】

本発明は、新規のエステラーゼに関し、より具体的には、酸性条件下で配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼと比較して高い活性及び/又は高い耐熱性を有するエステラーゼバリアントと、ポリエステル含有物質(例えばプラスチック製品)を分解するためのその使用とに関する。本発明のエステラーゼは、酸性条件下で、ポリエチレンテレフタレート、及びポリエチレンテレフタレートを含む物質を分解するのに特に適している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)S13L、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、並びに/又はアミノ酸配列 配列番号1と比較して、E141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換を有しており、前記位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアント。

【請求項2】

前記エステラーゼは、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む、請求項1に記載のエステラーゼ。

【請求項3】

前記エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I、F208K、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む、請求項1に記載のエステラーゼ。

【請求項4】

前記エステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較して、24時間後に高い比分解活性及び/又は高いPET解重合収量を示す、請求項1から3のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項5】

前記エステラーゼは、少なくとも置換H156Dを含み、且つ配列番号1のエステラーゼと比較して、24時間後に高いPET解重合収量を示す、請求項1から4のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項6】

前記エステラーゼは、S13L、A14C、A17F、F90D/T、Y92E、F208K、N211F、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換を含み、且つ配列番号1のエステラーゼと比較して高い比分解活性を示す、請求項1から5のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項7】

前記エステラーゼは、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/D、A17V/Q/F、D18E、L67I/E、R72I/T/L/V、P93A、R138L、L239C、L202I、S206V、A209S、S212T/A/Q、N213L、F238D、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、Y92E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、R12I/M、A14C、L15Q、A17Q、L67I、R72T/L、P93A、S212A/Q、N213L、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、R12I/M、L15Q、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、且つ配列番号1と比較して、24時間後に高いPET解重合収量を有する、請求項1に記載のエステラーゼ。

【請求項8】

前記エステラーゼは、Y92、G135、V167、V170、Q182、D203、F208、N213、及びS248から選択される位置で、少なくとも2つの置換を更に含み、好ましくは、少なくとも3、4、5個の置換を更に含み、前記置換は、好ましくは、F208I/L/M/T、D203C/K/R、S248C、V170I、Y92G、G135A、V167Q、Q182E、及びN213Pから選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項9】

前記エステラーゼは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを更に含み、好ましくは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213P + Q182D/Eから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを更に含み、より好ましくは、D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを更に含み、更により好ましくは、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E、又はF208I+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eを更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項10】

前記エステラーゼは、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + F90D F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Y、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G及びF208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、好ましくは、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、より好ましくは、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + L15Q、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A17F、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + D158E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + A14E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + L15Q、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + A17F/V、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + N204G、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、更により好ましくは、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + F90D、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + L15Q、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + A14E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + L15Q、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + A17F/V、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + A14Yから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項11】

前記エステラーゼは、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼとして、S130、D175、H207、C240、又はC275から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、好ましくは、S130+D175+H207、C240+C275、及びS130+D175+H207+C240+C275から選択されるアミノ酸残基の少なくとも1つの組み合わせを含み、より好ましくは、親エステラーゼと同様に、組み合わせS130+D175+H207+C240+C275を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項12】

前記エステラーゼは、(i)配列番号2に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号2と比較して、S13L、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、G92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、P213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、前記位置は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す、請求項1から11のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項13】

前記エステラーゼバリアントは、3～6のpHで、好ましくは5～5.5のpHで、配列番号2のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す、請求項12に記載のエステラーゼ。

【請求項14】

前記エステラーゼは、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、好ましくはpH5.2で、及び50℃～90℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す、請求項1から13のいずれか一項に記載のエステラーゼバリアント。

【請求項15】

エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号3に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、並びに(ii)アミノ酸配列 配列番号3と比較して、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、並びに/又はE141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換を含み、前記位置は、配列番号3に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアント。

【請求項16】

前記エステラーゼは、配列番号3と同様に、親エステラーゼと同様の残基の組み合わせG92+P213+E182+L13を含む、請求項15に記載のエステラーゼ。

【請求項17】

前記エステラーゼは、配列番号3と同様に、親エステラーゼと同様の下記の残基E158、M208、C203、C248、及びI170の内の1つ又はいくつかを更に含み、好ましくは、M208+C203+C248、C203+C248、M208+C203+C248+I170、C203+C248+I170、M208+E158、M208+C203+C248+E158、M208+C203+C248+I170+E158から選択される残基の組み合わせを更に含む、請求項16に記載のエステラーゼ。

【請求項18】

前記エステラーゼは、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、及びL247M、H156D、E141C/K/R、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Y、E158I/C, T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、より好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138K、N204G、N211E、A215Y、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、更により好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138K、N204G、E158C+T160C、G171C+V180C、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+N211Eから選択される1つのアミノ酸置換又は置換の組み合わせから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項15から17のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項19】

前記エステラーゼは、3～6のpHで、好ましくは4～6のpHで、より好ましくは5～6のpHで、更により好ましくは5～5.5のpHで、具体的にはpH5.2で、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す、請求項15から18のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項20】

前記エステラーゼは、50℃～90℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す、請求項15から19のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項21】

前記エステラーゼは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Yから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、A17F、F90D/E/Q/N、R138K、N204G、N211E、A215Yから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、より好ましくは、A17F、F90D/E/Q/N、R138K、及びN204Gから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して高い比分解活性を示す、請求項15から20のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項22】

前記エステラーゼは、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/Nから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、少なくとも置換F90Tを含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して24時間後に高いPET解重合収量を示す、請求項15から21のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項23】

前記エステラーゼは、A17F/V/Q/D、N204A/G、E158I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、A17F、N204G、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、より好ましくは、N204G、N204G+A17F、E158C+T160C、G171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示す、請求項15から21のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項24】

前記エステラーゼは、A215S/Y + A17F/V/Q/D、N204A/G + A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A215S/Y、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204A/G、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204A/G + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E + N204A/G、E158I/C + T160C及びG171C + V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、好ましくは、A215Y+A17F、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+Q237I、F90D+A17F+N211E、F90D+A17F+N204G+Q237I、F90D+A17F+N211E+Q237I、F90D+A17F+N211E+N204G、E158C+T160C、及びG171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、より好ましくは、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+N211E、E158C+T160C、及びG171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含む、請求項15から23のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項25】

前記エステラーゼは、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼと同様に、S130、D175、H207、C240、又はC275から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくとも、S130+D175+H207、C240+C275、及びS130+D175+H207+C240+C275から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含み、より好ましくは、親エステラーゼと同様に、組み合わせS130+D175+H207+C240+C275を含む、請求項15から24のいずれか一項に記載のエステラーゼ。

【請求項26】

前記エステラーゼは、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、好ましくはpH5.2で、及び50℃～90℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す、請求項15から25のいずれか一項に記載のエステラーゼバリアント。

【請求項27】

前記エステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す、請求項15から26のいずれか一項に記載のエステラーゼバリアント。

【請求項28】

請求項1から27のいずれか一項に規定のエステラーゼをコードする核酸。

【請求項29】

請求項28に記載の核酸を含む発現カセット又は発現ベクター。

【請求項30】

請求項28に記載の核酸、又は請求項29に記載の発現カセット若しくは発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項31】

請求項1から27のいずれか一項に規定のエステラーゼ、又は請求項30に記載の宿主細胞、又はエステラーゼ活性を有するこの抽出物を含む組成物。

【請求項32】

ポリエステル、又はポリエステル含有物質の少なくとも1種のポリエステルを分解する方法であって、
a.前記ポリエステル又は前記ポリエステル含有物質と、請求項1から27のいずれか一項に規定のエステラーゼ、又は請求項30に記載の宿主細胞、又は請求項31に記載の組成物とを接触させる工程、及び任意選択で
b.単量体及び/又はオリゴマーを回収する工程
を含む方法。

【請求項33】

工程(a)を、5～11のpHで実行し、好ましくは6～9のpHで実行し、より好ましくは6.5～9のpHで実行し、更により好ましくは6.5～8のpHで実行する、請求項32に記載の方法。

【請求項34】

工程(a)を、3～6のpHで実行し、好ましくは4～6のpHで実行し、より好ましくは5～6のpHで実行し、更により好ましくは5～5.5のpHで実行し、具体的にはpH5.2で実行する、請求項32に記載の方法。

【請求項35】

前記ポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリトリメチレンテレフタレート(PTT)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート(PEIT)、ポリ乳酸(PLA)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリブチレンサクシネート(PBS)、ポリブチレンサクシネートアジペート(PBSA)、ポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)、ポリエチレンフラノエート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジペート)(PEA)、ポリエチレンナフタレート(PEN)、「ポリオレフィン様」ポリエステル、及び前記ポリエステルの内の少なくとも2種の任意のブレンド/混合物から選択され、好ましくはポリエチレンテレフタレートである、請求項32から34のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

少なくとも1種のポリエステルと、請求項1から27のいずれか一項に規定の少なくとも1種のエステラーゼ、又は請求項30に記載の宿主細胞、又は請求項31に記載の組成物とを含むポリエステル含有物質。

【請求項37】

請求項1から27のいずれか一項に規定の少なくとも1種のエステラーゼ、又は請求項30に記載の宿主細胞、又は請求項31に記載の組成物を含む洗剤組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規のエステラーゼに関し、より具体的には、3～6のpHで、好ましくは5～5.5のpHで、親エステラーゼと比較して活性及び/又は耐熱性が改善されているエステラーゼに関する。本発明はまた、ポリエステル含有物質(例えばプラスチック製品)を分解するための前記新規のエステラーゼの使用にも関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタレート、及びポリエチレンテレフタレート含有物質を分解するのに特に適している。

【背景技術】

【0002】

エステラーゼは、ポリエステル等の様々なポリマーの加水分解を触媒し得る。これに関連して、エステラーゼは、多くの工業用途で有望な効果を示しており、例えば、食器洗い及び洗濯用途の洗剤として、バイオマス及び食品を処理する分解酵素として、環境汚染物質の解毒における生体触媒として、又は繊維工業におけるポリエステル織物の処理のための生体触媒として、有望な効果を示している。ポリエチレンテレフタレート(PET)を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用が、特に注目されている。実際には、PETは、多くの技術分野で使用されており、例えば、衣服、カーペットの製造で使用されているか、又は包装材若しくは自動車用プラスチック等の製造に熱硬化性樹脂の形で使用されており、その結果、埋立地でのPETの蓄積は、ますます生態学的な問題となっている。

【0003】

ポリエステル(特にPET)の酵素分解は、プラスチック及び繊維廃棄物の蓄積を減少させるための興味深い解決策と考えられている。実際には、酵素は、ポリエステル含有物質(より具体的には、プラスチック及び繊維製品)の加水分解を単量体レベルまで促進し得る。更に、加水分解物(即ち、単量体及びオリゴマー)を、新規のポリマーを合成するための材料としてリサイクルし得る。

【0004】

これに関連して、いくつかのエステラーゼが、ポリエステルの候補分解酵素として同定されており、そのようなエステラーゼのいくつかのバリアントが開発されている。エステラーゼの中で、クチン加水分解酵素(EC 3.1.1.74)としても既知のクチナーゼが、特に興味深い。クチナーゼは、様々な真菌(P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984年, 471～504頁)、細菌、植物の花粉から同定されている。最近、メタゲノミクスアプローチにより、追加のエステラーゼが特定されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第2014/079844号

【特許文献2】国際公開第2015/173265号

【特許文献3】国際公開第2017/198786号

【特許文献4】国際公開第2020/094661号

【特許文献5】国際公開第2020/094646号

【特許文献6】国際公開第2021/123299号

【特許文献7】国際公開第2021/123301号

【特許文献8】国際公開第2021/123328号

【特許文献9】国際公開第2013/093355号

【特許文献10】国際公開第2016/198650号

【特許文献11】国際公開第2016/198652号

【特許文献12】国際公開第2019/043145号

【特許文献13】国際公開第2019/043134号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984年, 471～504頁

【非特許文献2】Sulaiman他, Appl Environ Microbiol. 2012年3月

【非特許文献3】http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/

【非特許文献4】Lebarbe他 Green Chemistry Issue 4 2014年

【非特許文献5】Belousov (1997年) Nucleic Acids Res. 25:3440～3444頁

【非特許文献6】Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988年)

【非特許文献7】Current Protocols in Molecular Biology (1989年)

【非特許文献8】Studier他、2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207～234頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、具体的には酸性条件(即ちpH3～6)でのポリエステル分解プロセスをより効率的にし、それにより競争力を高めるために、既知のエステラーゼと比較して活性及び/又は耐熱性が改善されているエステラーゼが依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、酸性条件下で、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有する親(即ち、野生型エステラーゼ)と比較して高い活性及び/又は高い耐熱性を示す新規のエステラーゼを提供する。この野生型エステラーゼは、Sulaiman他, Appl Environ Microbiol. 2012年3月で説明されており、且つSwissProtではG9BY57と称されており、且つポリエステル分解活性を有すると説明されているメタゲノム由来クチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸36～293に対応する。本発明のエステラーゼは、プラスチック製品(より具体的には、PETを含むプラスチック製品)を分解するプロセスにおいて特に有用である。

【0009】

これに関して、本発明の目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号1と比較して、E141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換、並びに/又はR12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有しており、この位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。

【0010】

好ましくは、このエステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I、F208K、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0011】

本発明の更なる目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号2に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号2と比較して、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、G92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、P213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。具体的には、前記エステラーゼは配列番号2のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す。

【0012】

本発明の更なる目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号3に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号3と比較して、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、及びL247M、及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、並びに/又はE141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号3に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。好ましくは、この置換は、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Y、E158I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択され、より好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138/K、N204G、N211E、A215Y、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択され、更により好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138K、N204G、E158C+T160C、G171C+V180C、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+N211Eから選択される1つのアミノ酸置換又は置換の組み合わせから選択される。

【0013】

本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼをコードする核酸を提供することである。本発明はまた、前記核酸を含む発現カセット又は発現ベクターと、前記核酸、発現カセット、又は発現ベクターを含む宿主細胞とにも関する。

【0014】

本発明はまた、本発明のエステラーゼ、本発明の宿主細胞、又はこの抽出物を含む組成物も提供する。

【0015】

本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼを製造する方法であって、
(a)エステラーゼをコードする核酸を発現させるのに好適な条件下で、本発明に係る宿主細胞を培養する工程、及び任意選択で
(b)細胞培養物から前記エステラーゼを回収する工程
を含む方法を提供することである。

【0016】

本発明の更なる目的は、ポリエステル、又はポリエステル含有物質のポリエステルを分解する方法であって、
(a)このポリエステルと、本発明に係るエステラーゼ、又は本発明に係る宿主細胞、又は本発明に係る組成物とを接触させる工程、及び任意選択で
(b)単量体及び/又はオリゴマーを回収する工程
を含む方法を提供することである。

【0017】

有利には、少なくとも工程a)を、酸性条件下で実施し、具体的には3～6のpHで実施し、好ましくは5～5.5のpHで実施する。

【0018】

具体的には、本発明は、PETを分解する方法であって、PETと、本発明の少なくとも1種のエステラーゼとを接触させる工程、及び任意選択で、PETの単量体及び/又はオリゴマーを回収する工程を含む方法を提供する。有利には、少なくともPETと本発明の前記エステラーゼとを接触させる工程を、酸性条件下で実施し、具体的には3～6のpHで実施し、好ましくは5～5.5のpHで実施する。

【0019】

本発明はまた、PET、又はPETを含むプラスチック製品を分解するための本発明のエステラーゼの使用にも関する。有利には、前記使用を、酸性条件下で実施し、具体的には3～6のpHで実施し、好ましくは5～5.5のpHで実施する。

【0020】

本発明はまた、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物を含むポリエステル含有物質にも関する。

【0021】

本発明はまた、本発明に係るエステラーゼ若しくは宿主細胞、又は本発明のエステラーゼを含む組成物を含む洗剤組成物にも関する。

【発明を実施するための形態】

【0022】

定義
本開示は、下記の定義を参照することにより、最もよく理解されるだろう。

【0023】

ここで、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」という用語は、アミノ酸の鎖であって、前記鎖を形成するアミノ酸の数に関係なくペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を指す。アミノ酸は、本明細書では、下記の命名法に従って1文字又は3文字のコードで表される:A:アラニン(Ala);C:システイン(Cys);D:アスパラギン酸(Asp);E:グルタミン酸(Glu);F:フェニルアラニン(Phe);G:グリシン(Gly);H:ヒスチジン(His);I:イソロイシン(Ile);K:リジン(Lys);L:ロイシン(Leu);M:メチオニン(Met);N: アスパラギン(Asn);P:プロリン(Pro);Q:グルタミン(Gln);R:アルギニン(Arg);S:セリン(Ser);T:スレオニン(Thr);V:バリン(Val);W:トリプトファン(Trp);及びY:チロシン(Tyr)。

【0024】

「エステラーゼ」という用語は、エステルの酸及びアルコールへの加水分解を触媒する、酵素命名法に従ってEC 3.1.1に分類されている加水分解酵素のクラスに属する酵素を指す。「クチナーゼ」又は「クチン加水分解酵素」という用語は、クチン及び水からクチン単量体を生成する化学反応を触媒し得る、酵素命名法に従ってEC 3.1.1.74に分類されているエステラーゼを指す。

【0025】

「野生型タンパク質」という用語は、ポリペプチドが自然界で現れる場合のポリペプチドの非変異バージョンを指す。この場合、野生型エステラーゼは、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼを指す。

【0026】

「親タンパク質」という用語は、参照ポリペプチドを指す。この場合、親エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼのいずれかを指す。

【0027】

「変異体」及び「バリアント」という用語は、配列番号1に由来するポリペプチドであって、配列番号1と比較して1箇所又は複数箇所(例えば、数箇所)の位置で少なくとも1つの改変又は変更(即ち、置換、挿入、及び/又は欠失)を含み、且つポリエステル分解活性を有するポリペプチドを指す。特定の実施形態では、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対応する配列番号2に由来しており、配列番号1と比較して、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eを有する。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対応する配列番号3に由来しており、配列番号1と比較して、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eを有する。換言すると、配列番号2又は配列番号3に由来するバリアントは、配列番号1と比較してこれらの置換の組み合わせの内の少なくとも1つと、1つ又は複数の追加の置換とを含む。バリアントを、当技術分野で公知の様々な技術により得ることができる。具体的には、野生型タンパク質をコードするDNA配列を変更する技術の例として、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。そのため、「改変」及び「変更」という用語は、特定の位置に関して本明細書で使用される場合、この特定の位置のアミノ酸が野生型タンパク質のこの特定の位置のアミノ酸と比較して改変されていることを意味する。

【0028】

「置換」は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な20種のアミノ酸残基、希少な天然に存在するアミノ酸残基(例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、6-N-メチルリジン、N-エチルグリシン、N-メチルグリシン、N-エチルアスパラギン、アロ-イソロイシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン)、及び多くの場合には合成により生成される天然には存在しないアミノ酸残基(例えば、シクロヘキシル-アラニン)から選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換えを指す。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な20種のアミノ酸残基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、及びT)から選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換えを指す。記号「+」は、置換の組み合わせを示す。本書では、置換を指定するために、下記の用語が使用される:L82Aは、親配列の82位でのアミノ酸残基(ロイシン、L)がアラニン(A)に置換されることを示す。A121V/I/Mは、親配列の121位でのアミノ酸残基(アラニン、A)が、下記のアミノ酸:バリン(V)、イソロイシン(I)、又はメチオニン(M)の内の1つに置換されることを示す。置換は、保存的置換又は非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン、及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸、及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン、アスパラギン、及びスレオニン)、疎水性アミノ酸(メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン)、並びに小型アミノ酸(グリシン、アラニン、及びセリン)のグループ内に存在する。

【0029】

別途指定されない限り、本出願で開示されている位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされている。

【0030】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、2つのポリペプチド配列間の一致(同一のアミノ酸残基)の数(又は百分率%で表される割合)を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小限に抑えつつ重複及び同一性を最大化するようにアラインされた場合に配列を比較することにより決定される。具体的には、配列同一性を、2つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムの内のいずれかを使用して決定し得る。長さが類似した配列は、好ましくは、全長にわたり配列を最適にアラインさせるグローバルアラインメントアルゴリズム(例えば、Needleman及びWunschアルゴリズム; Needleman and Wunsch, 1970年)を使用してアラインされるが、長さが実質的に異なる配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム(例えば、Smith及びWatermanアルゴリズム(Smith and Waterman, 1981年)又はAltschulアルゴリズム(Altschul他, 1997年;Altschul他, 2005年)を使用してアラインされる。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 又は http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/等のインターネットウェブサイトで利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野内の様々な方法で達成される。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズム等の、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。本明細書で目的のために、アミノ酸配列同一性値%は、ペアワイズ配列アラインメントプログラムEMBOSS Needleを使用して生成された値を指しており、このプログラムは、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して2つの配列の最適なグローバルアラインメントを生成しており、全ての検索パラメータは、デフォルト値に設定されており、即ち、スコアリングマトリックス=BLOSUM62、ギャップオープン=11、ギャップエクステンド=1に設定されている。

【0031】

「ポリマー」は、共有化学結合により連結された複数の単量体(繰り返し単位)で構成されている構造を有する化合物又は化合物の混合物を指す。本発明に関連して、ポリマーという用語は、単一タイプの繰り返し単位(即ち、ホモポリマー)又は異なる繰り返し単位の混合物(即ち、コポリマー若しくはヘテロポリマー)で構成される天然ポリマー又は合成ポリマーを含む。本発明によれば、「オリゴマー」は、2～約20個の単量体を含む分子を指す。

【0032】

本発明に関連して、「ポリエステル含有物質」又は「ポリエステル含有製品」は、結晶形態、半結晶形態、又は完全な非晶質形態の、少なくとも1種のポリエステルを含む製品(例えば、プラスチック製品)を指す。特定の実施形態では、ポリエステル含有物質は、プラスチック製のシート、チューブ、ロッド、プロファイル、シェイプ、フィルム、塊、繊維等の少なくとも1種のプラスチック材料から作られた任意のアイテムを指しており、少なくとも1種のポリエステル、及び場合により、可塑剤、無機物、又は有機充填剤等の他の物質又は添加剤を含む。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有物質は、プラスチック製品の製造に適した、溶融状態又は固体状態のプラスチック化合物又はプラスチック配合物を指す。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有物質は、少なくとも1種のポリエステルを含む織物、布地、又は繊維を指す。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有物質は、少なくとも1種のポリエステルを含むプラスチック廃棄物又は繊維廃棄物を指す。具体的には、プラスチック製品とは、工業製品のことであり、例えば、硬質又は軟質の包装(ボトル、トレイ、カップ等)、農業用フィルム、バッグ及び袋、使い捨て商品等、カーペットの切れ端、布地、織物等のことである。プラスチック製品は、可塑剤、無機物、有機充填剤、又は染料等の追加の物質又は添加剤を含み得る。本発明に関連して、プラスチック製品は、半結晶性及び/又は非晶質のポリマー及び/又は添加剤の混合物を含み得る。

【0033】

本明細書では、「ポリエステル」という用語は下記を包含するが、これらに限定されない:ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリトリメチレンテレフタレート(PTT)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート(PEIT)、ポリ乳酸(PLA)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリブチレンサクシネート(PBS)、ポリブチレンサクシネートアジペート(PBSA)、ポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)、ポリエチレンフラノエート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジペート)(PEA)、ポリエチレンナフタレート(PEN)、及びこれらのポリマーのブレンド/混合物。ポリエステルはまた、「ポリオレフィン様」ポリエステル(好ましくは、「ポリエチレン様」ポリエステル)も包含し得、これは、Lebarbe他 Green Chemistry Issue 4 2014年で定義されているように、エステルセグメントが導入されている(一般に、長鎖α,ω-二官能性単量体の重縮合により達成される)ポリオレフィン(好ましくはポリエチレン)に対応する。

【0034】

新規のエステラーゼ
本発明は、酸性条件下で、具体的には3～6のpHで、親エステラーゼと比較して活性及び/又は耐熱性が改善されている新規のエステラーゼを提供する。より具体的には、本発明者らは、酸性条件下での工業プロセスでの使用に特に適した新規の酵素を設計している。本発明のエステラーゼは、ポリエステル(より具体的にはPET、例えばPET含有物質、具体的には、PETを含むプラスチック製品)を分解するのに特に適している。具体的な実施形態では、エステラーゼは、酸性条件下で、親エステラーゼと比較して、高い活性及び高い耐熱性の両方を示す。

【0035】

本発明によれば、「酸性条件」は、3～6のpHでの条件(例えば、媒体、溶液等)を指す。具体的には、「酸性条件」は、ポリエステルの分解工程を実施するための条件を指しており、即ち、エステラーゼを、pHが3～6の媒体中においてポリエステルと接触させる条件を指す。

【0036】

本発明のエステラーゼは、酸性条件下で、親エステラーゼと比較して高い活性及び/又は高い耐熱性を示す。具体的には、本発明のエステラーゼは、3～6のpHで提示された場合に、親エステラーゼと比較して高い活性及び/又は高い耐熱性を示す。本発明によれば、この高い活性及び/又は高い耐熱性を、3～6の特定のpH及び/又は3～6のpHの範囲で観察し得る。具体的には、この高い活性及び/又は高い耐熱性を、少なくともpH3、pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.2、pH5.5、及び/又はpH6で観察し得る。この高い活性及び/又は高い耐熱性をまた、pH3～6の全範囲、pH4～6の全範囲、pH4.5～6の全範囲、pH5～6の全範囲、pH5.5～6の全範囲、pH5～5.5の全範囲、pH5～5.2の全範囲、pH5.2～5.5の全範囲でも観察し得る。

【0037】

従って、本発明の目的は、3～6のpHでの、親エステラーゼに記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼと比較して、同一のpHでの高い活性を示すエステラーゼを提供することである。本発明に関連して、親エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3のいずれかのエステラーゼであり得る。

【0038】

具外的には、本発明者らは、配列番号1における特定のアミノ酸置換を特定しており、この置換により、酸性条件下におけるポリマー(具合的にはポリエステル、より具体的にはポリエチレンテレフタレート(PET))へのエステラーゼの活性が有利に増加する。

【0039】

本発明との関連の中で、「高い活性」又は「高い分解活性」という用語は、所与の条件(例えば、温度、pH、濃度)での親エステラーゼのエステラーゼのポリエステルを分解する及び/又は吸着する能力と比較して、同一の条件での、本エステラーゼの同一のポリエステルを分解する能力が高いこと、及び/又は同一のポリエステルを吸着する能力が高いことを示す。具体的には、本発明のエステラーゼは、PET分解活性が増加している。そのような増加は、親エステラーゼのエステラーゼのPET分解活性と比べて少なくとも10%高い可能性があり、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、又はより高い可能性がある。具体的には、分解活性とは、ポリエステルの単量体及び/又はオリゴマーをもたらす解重合活性のことであり、この単量体及び/又はオリゴマーを更に回収して任意選択で再利用し得る。本発明との関連の中で、本エステラーゼは、少なくとも3～6のpHでの親エステラーゼの分解活性と比較して、同一のpHで高い分解活性を示す。好ましくは、本エステラーゼは、少なくとも4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、高い活性を示す。

【0040】

エステラーゼの「分解活性」を、当技術分野で既知の方法に従って、当業者により評価し得る。例えば、特定のポリマーの解重合活性率の測定、寒天プレート中に分散させた固体高分子化合物の分解速度の測定、又は反応器中でのポリマーの解重合活性率の測定により、分解活性を評価し得る。具体的には、分解活性を、エステラーゼの「比分解活性」を測定することにより評価し得る。PETに対するエステラーゼの「比分解活性」は、反応の初期期間(即ち、最初の24時間)の間でのエステラーゼ 1mg当たりの加水分解されるPET μmol/分又は生成される相当量のTA mg/時間に相当し、反応の加水分解曲線の直線部分から決定され、そのような曲線は、最初の24時間の間での様々な時間で実施されるいくつかのサンプリングにより設定される。別の例として、ポリマー、又はポリマー含有プラスチック製品と分解酵素とを接触させた場合に、温度、pH、及び緩衝液の適切な条件下で放出されるオリゴマー及び/又は単量体の割合及び/又は収量を、規定の期間後(例えば、24時間後、48時間後、又は72時間後)に測定することにより、「分解活性」を評価し得る。

【0041】

酵素の基質に吸着する能力を、当技術分野で既知の方法に従って、当業者により評価し得る。例えば、酵素の基質に吸着する能力を、酵素を含む溶液から測定し得、この酵素は、適切な条件下で、基質と共に事前にインキュベートされている。

【0042】

本発明者らはまた、親エステラーゼ中の標的アミノ酸であって、酸性条件及び高温(有利には、50℃以上90℃以下の温度で、好ましくは60超の温度で、より好ましくは65℃以上の温度)における対応するエステラーゼの安定性を改善する(即ち、耐熱性の改善)ために有利に改変され得る標的アミノ酸も同定している。

【0043】

従って、本発明の目的は、3～6のpHでの親エステラーゼに記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼの耐熱性を比較して同一のpHでの高い耐熱性を示す新規のエステラーゼを提供することである。

【0044】

本発明との関連で、「高い耐熱性」という用語は、親エステラーゼと比較した、高温(具体的には、50℃～90℃の温度)での化学的な及び/又は物理的な構造の変化に抵抗するエステラーゼの能力の高さを示す。特定の実施形態では、エステラーゼの耐熱性は、50℃～90℃、50℃～80℃、50℃～75℃、50℃～70℃、50℃～65℃、55℃～90℃、55℃～80℃、55℃～75℃、55℃～70℃、55℃～65℃、60℃～90℃、60℃～80℃、60℃～75℃、60℃～70℃、60℃～65℃、65℃～90℃、65℃～80℃、65℃～75℃、65℃～70℃の温度で、親エステラーゼの耐熱性と比較して、酸性条件下で改善されている。具体的には、本エステラーゼの耐熱性は、40℃～80℃、50℃～72℃、55℃～60℃、50℃～55℃、60℃～72℃の温度で、親エステラーゼの耐熱性と比較して、酸性条件下で改善されている。特定の実施形態では、本エステラーゼの耐熱性は、少なくとも50℃～65℃の温度で、親エステラーゼの耐熱性と比較して改善されている。本発明との関連で、温度は、+/-1℃で示されている。

【0045】

具体的には、耐熱性を、エステラーゼの融点(Tm)の評価により評価し得る。本発明に関連して、「融点」は、検討する酵素集団の半分が折り畳まれていないか又はミスフォールドする温度を指す。典型的には、本発明のエステラーゼは、3～6のpHで、親エステラーゼのエステラーゼのTmと比較して、約0.8℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、又はより高いTmの上昇を示す。具外的には、3～6のpHで、本発明のエステラーゼは、親エステラーゼと比較して、50℃～90℃の温度での半減期が延長され得る。具体的には、本発明のエステラーゼは、3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して、50℃～90℃、50℃～80℃、50℃～75℃、50℃～70℃、50℃～65℃、55℃～90℃、55℃～80℃、55℃～75℃、55℃～70℃、55℃～65℃、60℃～90℃、60℃～80℃、60℃～75℃、60℃～70℃、60℃～65℃、65℃～90℃、65℃～80℃、65℃～75℃、65℃～70℃の温度での半減期が延長され得る。有利には、本発明のエステラーゼは、3～6のpHで、親エステラーゼと比較して、少なくとも50℃～60℃の温度での半減期が延長されている。

【0046】

本発明に関連して、本発明のエステラーゼは、少なくとも3～6のpHで、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に記載されているアミノ酸配列を有するエステラーゼ(即ち、親エステラーゼ)と比較して、高い耐熱性を示す。好ましくは、本エステラーゼは、少なくとも4～6のpH、好ましくは5～6のpH、より好ましくは5～5.5のpH、更により好ましくはpH5.2で、高い耐熱性を示す。

【0047】

エステラーゼの融点(Tm)を、当技術分野で既知の方法に従って、当業者により評価し得る。例えば、DSFを使用してエステラーゼの熱変性温度の変化を定量し、それにより、このエステラーゼのTmを決定し得る。或いは、円二色性を使用するタンパク質の折り畳みの分析により、Tmを評価し得る。好ましくは、実験部分で示すように、DSF又は円二色性を使用してTmを測定する。本発明に関連して、Tmの比較を、同一条件(例えば、pH、ポリエステルの性質及び量等)下で測定されるTmと共に実施する。

【0048】

或いは、様々な温度でのインキュベーション後のエステラーゼのエステラーゼ活性及び/又はポリエステル解重合活性を測定し、親エステラーゼのエステラーゼ活性及び/又はポリエステル解重合活性と比較することにより、耐熱性を評価し得る。様々な温度でのポリエステルの解重合アッセイを複数回実施する能力も評価し得る。迅速で有益な試験は、様々な温度でのインキュベーション後に寒天プレート中に分散させた固体ポリエステル化合物を分解するエステラーゼの能力のハロー直径測定による評価からなり得る。

【0049】

本発明によれば、本発明のこれらのエステラーゼは、塩基性条件よりも酸性条件において、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の酵素(即ち、親エステラーゼ)と比較して、より高いポリエステル分解活性及び/又はより高い耐熱性を更に示す。本発明に関連して、「塩基性条件」は、7超のpHでの、好ましくは7～9のpHでの条件(例えば、培地、溶液等)を指す。具体的には、これらのエステラーゼは、3～6のpHで、具体的には、4～6、5～6、5～5.5のpHで、7超のpHで、具体的には7～9のpHで、親エステラーゼと比較して効率的であり且つ安定している。

【0050】

そのため、本発明の目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号1と比較して、E141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換、並びに/又はR12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有しており、この位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。

【0051】

ある実施形態では、本エステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較して、規定の期間の後(例えば、24時間、48時間、又は72時間の後)に、高い比分解活性及び/又は高いPET解重合収量を示す。

【0052】

特定の実施形態では、本エステラーゼは、E141、G171、及びV180から選択される残基に対応する位置で少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。具体的には、このエステラーゼは、E141C/K/R、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0053】

本発明によれば、本エステラーゼは、少なくともG171+V180位での置換の組み合わせを含み得、好ましくは、置換の組み合わせG171C+V180Cを含み得る。

【0054】

本発明によれば、本エステラーゼは、T11、R12、S13、A14、L15、T16、A17、D18、R30、G37、Y60、T61、S66、L67、W69、R72、R89、F90、Y92、P93、A127、R138、W155、T157、D158、P179、Q182、F187、L202、N204、A205、S206、F208、A209、N211、S212、N213、N214、A215、I217、S218、V219、Y220、Q237、F238、L239、N241、N243、L247、H156、G135、V167、V170、D203、及びS248から選択される少なくとも1箇所の位置で1つの置換を更に含み得、好ましくは、R12、S13、A14、L15、A17、D18、R30、G37、Y60、T61、S66、L67、W69、R72、R89、F90、Y92、P93、R138、A127、W155、D158、T160、L202、N204、A205、S206、F208、A209、N211、S212、N213、N214、A215、I217、Y220、Q237、F238、L239、V242、L247、H156、G135、V167、V170、D203、及びS248から選択される少なくとも1箇所の位置で1つの置換を更に含み得る。好ましくは、本エステラーゼは、T11E、R12D/A/N/Q/I/M、S13E/L、A14D/E/C/Y、L50Q/G/I/D、T16E、A17T/V/Q/F/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61S/Y/H/Q/E/V、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90G/P/S/T/A/Y/H/Q/N/D/E、Y92D/E/G、P93A、A127T、R138L/K/D/E、W155M/A/H/E、T157S、D158E/I、P179D/E、Q182D/E、F187Y/I、L202I、N204D/A/E/G、A205M/D/Q、S206D/E/V/I/N、F208V/G/N/K/R/I/A/Q/L/S/M/T/W/E、A209S/D/E、N211F/D/W/Y、S212T/A/Q/F、N213P/L/D、N214D/T、A215N/S/Y、I217L/C/V、S218A、V219I、Y220M/W/C/T/F、Q237C/D/I、F238I/D/E、L239C、N241E/D、N243E/D、L247T/M、H156D、G135A、V167Q/T、V170I、D203C/E/R/K及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61S/Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、H156D、F187I、G135A、V167Q/T、V170I、D203C/E/R/K及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得る。

【0055】

本発明によれば、本エステラーゼは、D203位での置換(好ましくは、D203K/Rから選択される)と、親エステラーゼ(即ち、配列番号1のエステラーゼ)と同様に、少なくともアミノ酸残基S248とを更に含み得る。

【0056】

本発明によれば、本エステラーゼは、E141+D158、E141+T160、及びE141+R138から選択される位置での少なくとも1つの置換の組み合わせを含み得、好ましくは、E141C/K/R+D158E/I/C、E141C/K/R+T160C、及びE141C/K/R+R138E/Dから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み得、より好ましくは、E141C+D158C、E141C+T160C、及びE141C+R138Eから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み得る。

【0057】

特定の実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、E141、G171、及びV180から選択される位置での1～3個の置換を有し、好ましくは、G171及びV180から選択される位置での1又は2個の置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。具体的には、本エステラーゼのアミノ酸配列は、E141C/K/R、G171C、及びV180Cから選択される1～3個の置換を有し、好ましくは、G171C及びV180Cから選択される1又は2個の置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0058】

別の特定の実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、G171+V180、E141+D158、E141+T160、及びE141+R138から選択される位置での置換の1つの組み合わせを有し、好ましくは、G171C+V180C、E141C/K/R+D158E/I/C、E141C/K/R+T160C、及びE141C/K/R+R138E/Dから選択される置換の1つの組み合わせを有し、より好ましくは、G171C+V180C、E141C+D158C、E141C+T160C、及びE141C+R138Eから選択される置換の1つの組み合わせを有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0059】

別の特定の実施形態では、本エステラーゼバリアントは、アミノ酸配列 配列番号1と比較して、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。

【0060】

具体的には、本エステラーゼは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0061】

好ましい実施形態では、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I、F208K、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0062】

ある実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される1～42個の置換を含み、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される1～41個の置換を含む。

【0063】

ある実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される1～42個の置換を有し、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される1～41個の置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0064】

ある実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される単一の置換を有し、好ましくはR12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される単一の置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0065】

本発明によれば、本エステラーゼは、配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、上記で列挙されている置換の内の少なくとも1つを有しており、且つE141、G171、V180から選択される少なくとも1箇所の位置で1つの置換を更に含み得、好ましくは、E141C/K/R、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得る。本エステラーゼは、T11、R12、S13、A14、T16、A17、T61、F90、Y92、W155、T157、P179、Q182、F187、D203、N204、A205、S206、F208、N211、S212、N213、N214、A215、S218、V129、Y220、Q237、F238、N241、N243、L247、G135、V167、V170、及びS248から選択される少なくとも1箇所の位置で1つの置換を更に含み得、好ましくは、T11E/M、R12D/N/Q/E/F、S13E、A14E/D、T16E、A17T、A24R、T61V、A62D、F90A/Y、Y92G/D、W155A、T157S、P179D/E、Q182D/E、F187Y/I、D203C/K/R、N204D/E/G、A205D、S206D/E、F208W/G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E、N211D/Y/E、S212F、N213P/D、N214D、A215N、S218A、V129I、Y220M/F、Q237D、F238E、N241E/D、N243E/D、L247T、G135A、V167Q/T、V170I、及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得、より好ましくは、A14E、F90A Y92G/D、Q182D/E、D203C/K/R、N204G、F208W/G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E、N211D/E、N213P、V219I、V170I、及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得、更により好ましくは、F90A Y92G、Q182D/E、D203C/K/R、N204G、F208T/L/M/S/Q/I/A/R/N/G、N211D/E、N213P、V170I、及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得る。

【0066】

本発明の目的はまた、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号1と比較して、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有しており、この位置は、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。

【0067】

本発明によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、H156D、R12A/I/M、D18E、L67I/E、R72I/T/L/V、P93A、R138L、L239C、L202I、A209S、S212T/A/Q、N213L、F238D、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換を含み得、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211W/F、A215Y Q237I、H156D、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換を含み得、より好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211W/F、A215Y、Q237I、H156D、R12I/M、L15Q、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換を含み得、更により好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E、S206I、F208K、N211W/F、A215Y、Q237I、H156D、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換を含み得る。

【0068】

具体的には、本エステラーゼは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0069】

ある実施形態では、本エステラーゼは、12A/I/M、A14C/Y、L15Q/D、A17V/Q/F、D18E、L67I/E、R72I/T/L/V、P93A、R138L、L239C、L202I、S206V、A209S、S212T/A/Q、N213L、F238D、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、Y92E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、R12I/M、A14C、L15Q、A17Q、L67I、R72T/L、P93A、S212A/Q、N213L、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、R12I/M、L15Q、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0070】

好ましくは、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、S13L、A14C/Y、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I、F208K、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。別の好ましい実施形態では、本エステラーゼは、S13L、L15Q、A17F、F90D、及びD158Eから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A17F、及びF90Dから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0071】

ある実施形態によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択され、好ましくは、S13L、L15Q、A17F、F90D、及びD158Eから選択され、より好ましくは、S13L、A17F、及びF90Dから選択される少なくとも1つの置換と、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E、又はF208M+D203K+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせ、好ましくは、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eとを含む。

【0072】

本発明によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも2つの置換を含み得、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも2つの置換を含み得、より好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも2つの置換を含み得る。

【0073】

ある実施形態では、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、F208V/K、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、Q182E+A127T、H156D、R12A/I/M、D18E、L67I/E、R72I/T/L/V、P93A、R138L、L239C、L202I、S206V、A209S、S212T/A/Q、N213L、F238D、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、好ましくは、S13L、A14C、L15Q、A17F/Q、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E、F208K、N211F/W、A215Y、Q237C/I、Q182E+A127T、H156D、R12I/M、L67I、R72T/L、P93A、S212A/Q、N213L、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、及びW155M/Hから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を示す。

【0074】

ある実施形態によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、S206V/I/N、F208V/K、A127T、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、Y92E、D158E、S206I/N、F208K、A127T、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換を含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性及び/又は高い耐熱性を示す。

【0075】

ある実施形態によれば、本エステラーゼは、少なくとも置換H156Dを含み、且つ配列番号1のエステラーゼと比較して、24時間後及び/又は48時間後に、高いPET解重合収量を示す。

【0076】

ある実施形態によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C、A17F、F90D/T、Y92E、F208K、N211F、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ配列番号1のエステラーゼと比較して高い比分解活性を示す。

【0077】

ある実施形態によれば、本エステラーゼは、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/D、A17V/Q/F、D18E、L67I/E、R72I/T/L/V、P93A、R138L、L239C、L202I、S206V、A209S、S212T/A/Q、N213L、F238D、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、Y92E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、R12I/M、A14C、L15Q、A17Q、L67I、R72T/L、P93A、S212A/Q、N213L、Q237C/I、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、R12I/M、L15Q、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択され、更により好ましくは、R72T、S212A、N213L、R30Y/L/Q/M/S/E、G37E、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、R89E/G/V、F90G/P/S/T/H/Q/N/D/E、W155M/H、及びN211W/Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、且つ配列番号1と比較して、24時間後に、高いPET解重合収量を有する。

【0078】

別の実施形態では、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、F208V/K、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、Q182E+A127T、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、好ましくは、S13L、A14C、L15Q、A17F、F90D/T、Y92E、D158E、F208K、N211F、A215Y、Q237I、Q182E+A127T、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、より好ましくは、S13L、A14C、A17F、F90D/T、Y92E、F208K、N211F、A215Y、Q237I、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ本エステラーゼは、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を示す。

【0079】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、D158E/I/C、F208V/K、N211F/W、A215S/Y、Q237C/I、Q182E+A127Tから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、好ましくは、S13L、A14C、L15Q、A17F、F90D/T、Y92E、D158E、F208K、N211F、A215Y、Q237I、Q182E+A127T、及びH156Dから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、より好ましくは、S13L、A14C、A17F、F90D/T、Y92E、F208K、N211F、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い比分解活性を示す。

【0080】

別の特定の実施形態では、本エステラーゼは、少なくとも置換H156Dを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して、48時間後に、高いPET解重合収量を示す。

【0081】

本発明によれば、本エステラーゼは、S13L、D158E/I/C、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Q237C/I、A14C/Y、A17F/V/Q/D、D158E、及びS206V/I/Nから選択される少なくとも1つの置換を含み得、好ましくは、S13L、D158E、N204G、F90D、Q237I、A14Y、A17V、D158E、及びS206I/Nから選択される少なくとも1つの置換を含み得、より好ましくは、A14Y、A17V、D158E、及びS206Iから選択され、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示す。

【0082】

有利には、本発明のエステラーゼは、3～6のpHの範囲で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性及び/又は高い耐熱性を示す。具体的には、本発明のエステラーゼは、3～6、4～6、5～6、5～5.5、5.2～5.5、5.5～6、5～5.2のpHの範囲で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性及び/又は高い耐熱性を示す。本発明によれば、pHの範囲の指定は、前記範囲の上限及び下限を含む。

【0083】

ある実施形態では、本発明のエステラーゼは、6～10のpHで、好ましくは6.5～9のpHで、より好ましくは6.5～8のpHで、更により好ましくはpH8で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す。

【0084】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、D158E/I/C、S206V/I/N、及びN211F/Wから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、D158E、S206N、及びN211Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、置換N211Fを含み、且つ3～6のpHで、具体的には5～5.5のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示し、且つ6～10のpHで、好ましくは6.5～9のpHで、より好ましくは6.5～8のpHで、更により好ましくはpH8で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す。

【0085】

例えば、本エステラーゼは、S13L、A14Y、L15Q、S206N、及びN211Fから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、置換N211Fを含み、且つ3～6のpHで、具体的には、5～5.5のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を示しており、且つ6～10のpHで、好ましくは6.5～9のpHで、より好ましくは6.5～8のpHで、更により好ましくはpH8で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を更に示す。

【0086】

或いは、又は加えて、本エステラーゼは、少なくとも置換D158Eを含み、3～6のpHで、具体的には5～5.5のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示し、且つ6～10のpHで、好ましくは6.5～9のpHで、より好ましくは6.5～8のpHで、更により好ましくはpH8で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性を更に示す。

【0087】

本発明によれば、本エステラーゼは、上記で列挙された置換の内の少なくとも1つを含み、且つT11、R12、S13、A14、T16、A17、T61、F90、Y92、W155、T157、P179、Q182、F187、D203、N204、A205、S206、F208、N211、S212、N213、N214、A215、S218、V129、Y220、Q237、F238、N241、N243、L247、G135、V167、V170、及びS248から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置での置換を更に含み得、好ましくは、T11E/M、R12D/N/Q/E/F、S13E/D、A14E/D、T16E、A17T、A24R、T61V、A62D、F90A/Y、Y92G/D、W155A、T157S、P179D/E、Q182D/E、F187Y/I、D203C/K/R、N204D/E/G、A205D、S206D/E、F208W/G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E、N211D/Y/E、S212F、N213P/D、N214D、A215N、S218A、V129I、Y220M/F、Q237D、F238E、N241E/D、N243E/D、L247T、G135A、V167Q/T、V170I、及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得、好ましくは、S13E/D、A14E/D、A17T、F90A/Y、Y92D/G、Q182D/E、D203C/K/R、N204D/E/G、S206D/E、F208W/G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E、N211D/Y/E、N213P、A215N、V219I、Q237D、G135A、V167Q/T、V170I、及びS248Cから選択される少なくとも1つの置換を更に含み得る。

【0088】

本発明によれば、本エステラーゼは、D203位での置換、好ましくは、D203K/Rから選択される置換と、親エステラーゼと同様に少なくともアミノ酸残基S248とを更に含み得る。

【0089】

特定の実施形態では、本エステラーゼは、置換S13Lと、A14C/E/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、N204D/E/G、N211F/W/D/Y/E、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択され、好ましくは、A14E、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、N204G、N211E、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの追加の置換とを含む。より好ましくは、本エステラーゼは、少なくとも、S13L+D158E/I/Cから選択される置換の組み合わせを含み、好ましくは、置換の組み合わせS13L+D158Eを含む。

【0090】

本発明によれば、本エステラーゼは、Y92、G135、V167、V170、Q182、D203、F208、N213、及びS248から選択される位置での少なくとも2つの置換を更に含み得、好ましくは、少なくとも3、4、5個の置換を更に含み得る。特定の実施形態では、本エステラーゼバリアントは、Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、G135A、V167Q/T、V170I、Q182E/D、D203E/R/K/C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y、N213D/E/R/K/P、及びS248Cから選択され、好ましくは、F208I/L/M/T、D203C/K/R、S248C、V170I、Y92G、G135A、V167Q、Q182E、及びN213Pから選択される少なくとも2つの置換を含み、好ましくは、少なくとも3、4、5個の置換を含む。

【0091】

例えば、本エステラーゼは、D203+S248位での置換の組み合わせを更に含み、好ましくは、置換の組み合わせD203C+S248Cを更に含む。

【0092】

別の例では、本エステラーゼは、少なくともF208+D203+S248位での置換の組み合わせを更に含み得、好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248Cから選択される置換の組み合わせを更に含み得る。ある実施形態では、本エステラーゼは、少なくともF208+D203+S248位での置換の組み合わせと、Y92、G135、V167、V170、Q182、及びN213から選択される位置での1又は2つの置換とを含む。具体的には、本エステラーゼは、少なくともF208I/L/M/T+D203C+S248Cから選択される置換の組み合わせと、Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、G135A、V167Q/T、V170I、Q182E/D、及びN213D/E/R/K/Pから選択され、好ましくは、Y92G、G135A、V167Q、V170I、Q182E、及びN213Pから選択される1つの置換とを含む。

【0093】

別の例では、本エステラーゼは、少なくともF208+D203位での置換の組み合わせを更に含み得、好ましくは、F208I/L/M/T+D203K/Rから選択される置換の組み合わせを更に含み得る。ある実施形態では、本エステラーゼは、少なくともF208+D203位での置換の組み合わせと、Y92、G135、V167、V170、Q182、及びN213から選択される位置での1又は2つの置換とを含む。具体的には、本エステラーゼは、少なくとも置換F208I/L/M/T+D203K/Rの組み合わせと、Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、G135A、V167Q/T、V170I、Q182E/D、及びN213D/E/R/K/Pから選択され、好ましくは、Y92G、G135A、V167Q、V170I、Q182E、及びN213Pから選択される1つの置換とを含む。有利には、前記実施形態において、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、少なくともアミノ酸残基S248を含む。

【0094】

本発明によれば、本エステラーゼは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを更に含み得、好ましくは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213P + Q182D/Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを更に含み得、より好ましくは、D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを更に含み得、更により好ましくは、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E、又はF208I+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを更に含み得る。

【0095】

ある実施形態では、本エステラーゼは、E141C+T160C、E141C+D158E/I/C、G171C+V180C、R138D/E+E141C/K/R、及びD158E/I/C+T160Cから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、好ましくは、E141C+T160C、E141C+D158C、G171C+V180C、R138D/E+E141C/K/R、及びD158C+T160Cから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含む。

【0096】

本発明によれば、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択され、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択され、より好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換、好ましくは少なくとも2つの置換と、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、好ましくは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、より好ましくは、D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせ、更により好ましくは、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eとを含み得る。

【0097】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択され、好ましくは、S13L、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換と、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、好もしくは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、より好ましくは、D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせ、更により好ましくは、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eとを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を示す。

【0098】

或いは、又は加えて、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、及びQ237C/Iから選択され、好ましくは、S13L、A14Y、A17F、F90D、D158E、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換と、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、好ましくは、D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D + N213D/E/R/K/P + Q182D/Eから選択され、より好ましくは、D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択され、更により好ましくは、F208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせとを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示す。

【0099】

好ましい実施形態では、本エステラーゼは、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + F90D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Y、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G及びF208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、好ましくは、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + A17F、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A14E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + L15Q、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + A17F/V、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E、F208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + N204G及びF208W/I/L/G/S/N/A/R/T/H/M/E/Q/Y + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、より好ましくは、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + F90D、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + L15Q、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A17F、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + D158E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + A14E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + L15Q、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + A17F/V、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + S13L + N204G及びF208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182E + A14Yから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、更により好ましくは、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + F90D、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + L15Q、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + A14E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + L15Q、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + A17F/V、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + A14Yから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含む。

【0100】

本発明によれば、本エステラーゼは、配列番号1に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、且つF208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203C+S248C+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/I、及びF208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203K/R+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを有する。好ましくは、この置換の組み合わせは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158E、及びF208I/L/M/T+D203K/R+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択され、より好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択される。特定の実施形態では、本エステラーゼは、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203C+S248C+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/I、及びF208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203K/R+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/Iから選択され、より好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158E、及びF208I/L/M/T+D203K/R+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択され、より好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択される置換の組み合わせを有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列を有する。ある実施形態では、本エステラーゼは、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203C+S248C+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/I、及びF208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203K/R+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/Iから選択され、好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158E、及びF208I/L/M/T+D203K/R+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択され、より好ましくは、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eから選択される置換の組み合わせを有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する。

【0101】

本発明によれば、本エステラーゼは、少なくとも、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203C+S248C+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/I、及びF208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E+D203K/R+V170I+Y92G/D+N213P+Q182D/E+S13L+D158E/Iから選択される置換の組み合わせと、A14C/E/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、N204D/E/G、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択される少なくとも1つの置換とを含み得る。好ましくは、このエステラーゼは、少なくとも、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182D/E+S13L+D158E、及びF208I/L/M/T+D203K/R+V170I+Y92G+N213P+Q182D/E+S13L+D158Eから選択される置換の組み合わせと、A14E、A17F/V、F90D、N204G、N211E、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換とを含む。より好ましくは、このエステラーゼは、少なくとも、F208I/L/M/T+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182D/E+S13L+D158Eから選択される置換の組み合わせと、A14E、A17F、F90D、N204G、N211E、A215Y、及びQ237Iから選択される少なくとも1つの置換とを含む。

【0102】

好ましい実施形態では、本エステラーゼは、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A215Y、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、 F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G + Q237I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G + A17F/V/Q/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A215Y、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、 F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G + Q237Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、好ましくは、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、 F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + Q237C/D/I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G + Q237Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、より好ましくは、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A17F/V/Q/D、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + A215Y + A17F/V/Q/D、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + N204G + A17F/V/Q/D、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A215Y、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、 F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237I、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204G + Q237C/D/I、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + Q237C/D/I、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G、F208I/L/M/T + D203C + S248C + V170I + Y92G/D + N213P + Q182D/E + S13L + D158E/I + F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211E + N204G + Q237Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含み、更により好ましくは、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A215Y、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A215Y + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + N204G + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A215Y、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F、 F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N204G + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + N204G + Q237Iから選択される置換の少なくとも1つの組み合わせを含む。

【0103】

特定の実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A215Y、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + A215Y + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + N204G + A17F、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A215Y、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F、 F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N204G、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N204G + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + Q237I、F208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + N204G、及びF208M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E + S13L + D158E + F90D + A17F + N211E + N204G + Q237Iから選択される置換の1つの組み合わせを有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0104】

ある実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸は、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される1～45個のアミノ酸置換を含み、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156から選択される1～41個のアミノ酸置換を含む。

【0105】

ある実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される1～45個のアミノ酸配列を有し、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156から選択される1～41個のアミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0106】

別の実施形態では、本エステラーゼのアミノ酸配列は、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される単一のアミノ酸置換を有し、好ましくは、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、Y92E、P93A、R138L、A127T、W155M/H/E、D158E/I、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、F208K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、N213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される単一のアミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0107】

好ましくは、本エステラーゼは、配列番号1の親エステラーゼと同様に、S130、D175、H207、C240、又はC275から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を示しており、即ち、本発明のエステラーゼは、これらの位置の内の1、2、3箇所等、又は全てで改変されていない。

【0108】

具体的には、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、このエステラーゼの触媒部位を形成する少なくともアミノ酸S130、D175、及びH207、並びに/又はジスルフィド結合を形成するアミノ酸C240及びC275を示し得る。好ましくは、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、少なくとも、S130+D175+H207、C240+C275、及びS130+D175+H207+C240+C275から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含み、より好ましくは、親エステラーゼと同様に、組み合わせS130+D175+H207+C240+C275を含む。

【0109】

本発明の更なる目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号2に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号2と比較して、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、G92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、P213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。

【0110】

配列番号2に記載されているアミノ酸配列は、配列番号1と比較した置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eで、配列番号1のアミノ酸配列に対応する。

【0111】

具体的には、前記エステラーゼは、配列番号2に記載されているアミノ酸配列と、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択され、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択され、より好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択され、更により好ましくは、S13L、L15Q、A17F、F90D、及びD158Eから選択される少なくとも1つの置換とを含む。

【0112】

ある実施形態では、本エステラーゼバリアントは、アミノ酸配列 配列番号2と比較して、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、G92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、P213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M及びH156Dから選択される1～45個のアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、且つポリエステル分解活性を有しており、且つ3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0113】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択される1～8個の置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される1～8個の置換を含み、より好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される1～8個の置換を含む。具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択される2つの置換を含み、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される2つの置換を含み、より好ましくは、2つの置換S13L及びD158Eを含む。

【0114】

ある実施形態では、本エステラーゼバリアントは、配列番号2のアミノ酸と比較して、E141C/K/R、G171C、V180C、R12A/I/M、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、G92E、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、D158E/I/C、T160C、L202I、N204A、A205M/Q、S206V/I/N、M208V/K、A209S/D/E、N211F/W、S212T/A/Q、P213L、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I L247M及びH156Dから選択される1～45個のアミノ酸置換を有する、配列番号2に記載されているアミノ酸配列からなり、この位置は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、且つポリエステル分解活性を有しており、且つ3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0115】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択される1～8個の置換を有し、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される1～8個の置換を有し、より好ましくは、S13L、A14Y、L15Q、A17F/V、F90D、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される1～8個の置換を有する、配列番号2に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0116】

具体的には、本エステラーゼは、S13L、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、D158E/I/C、A215S/Y、及びQ237C/Iから選択される2つの置換を有し、好ましくは、S13L、A14C/Y、L15Q、A17F/V、F90D/T、D158E、A215Y、及びQ237Iから選択される2つの置換を有し、より好ましくは、2つの置換S13L及びD158Eを有する、配列番号2に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0117】

好ましくは、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に(即ち、配列番号2に記載されているアミノ酸配列中に)、このエステラーゼの触媒部位を形成する少なくともアミノ酸S130、D175、及びH207、並びに/又はジスルフィド結合を形成するアミノ酸C240及びC275を含む。好ましくは、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、少なくとも、S130+D175+H207、C240+C275、及びS130+D175+H207+C240+C275から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含む。

【0118】

本発明によれは、本エステラーゼは、3～6のpHで、好ましくは5～5.5のpHで、配列番号2のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示す。

【0119】

本発明の更なる目的は、エステラーゼバリアントであって、(i)配列番号3に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有しており、(ii)アミノ酸配列 配列番号3と比較して、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G 、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、及びH156Dから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換、並びに/又はアミノ酸配列 配列番号3と比較して、E141、G171、及びV180から選択される残基に対応する少なくとも1箇所の位置でのアミノ酸置換を含み、この位置は、配列番号3に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、(iii)ポリエステル分解活性を有しており、並びに(iv)3～6のpHで、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示すエステラーゼバリアントを提供することである。

【0120】

配列番号3に記載されているアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列に対応するが、配列番号1と比較して、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eを有する。

【0121】

本発明との関連の中で、配列番号3に記載されている完全長アミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する、配列番号3のエステラーゼのバリアントは、常に、配列番号3と同様に、親エステラーゼと同様の残基の組み合わせG92+P213+E182+L13を含む。換言すると、上記の同一性%内であれば、配列がどのように変化しても、この残基の組み合わせは影響を受けない。

【0122】

特定の実施形態では、配列番号3のエステラーゼのバリアントは、下記の残基E158、M208、C203、C248、及びI170の内の1つ又はいくつかの組み合わせを更に含む。ある実施形態では、このバリアントは、M208+C203+C248、C203+C248、M208+C203+C248+I170、C203+C248+I170、M208+E158、M208+C203+C248+E158、M208+C203+C248+I170+E158から選択される残基の組み合わせを更に含む。

【0123】

本発明によれば、本エステラーゼは、3～6のpHで、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示し得る。好ましくは、本エステラーゼは、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示し、任意選択で、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、具体的にはpH5.2で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0124】

加えて、本エステラーゼは、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示し、任意選択で、50℃～90℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0125】

具体的には、前記エステラーゼは、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、H156D、E141C/K/R、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つの置換を含み、好ましくは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Y、E158/I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つの置換を含み、より好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138K、N204G、N211E、A215Y、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つの置換を含み、更により好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138K、N204G、E158C+T160C、G171C+V180C、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+N211Eから選択される少なくとも1つの置換を含む。

【0126】

ある実施形態では、本エステラーゼバリアントは、アミノ酸配列 配列番号3と比較して、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、H156D、E141C/K/R、G171C及びV180Cから選択される1～43個のアミノ酸置換を含む。

【0127】

ある実施形態では、本エステラーゼバリアントは、アミノ酸配列 配列番号3と比較して、R12A/I/M、A14C/Y、L15Q/G/I/D、A17F/V/Q/D、D18E、R30Y/L/Q/M/N/S/E、G37E/C、Y60H/C/G、T61Y/H/Q/E、S66E/W/D、L67I/E、W69I、R72I/T/L/V、R89E/G/V、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、P93A、R138L/K/D/E、A127T、W155M/H/E、E158I/C、T160C、L202I、N204A/G、A205M/Q、S206V/I/N、F208V/K、A209S/D/E、N211F/W/E、S212T/A/Q、N214T、A215S/Y、I217L/C/V、Y220W/C/T、Q237C/I、F238I/D、L239C、V242I、L247M、H156D、E141C/K/R、G171C及びV180Cから選択される1～43個のアミノ酸置換を有する、配列番号3に記載されているアミノ酸配列からなり、この位置は、配列番号3に記載されているアミノ酸配列を参照してナンバリングされており、且つポリエステル分解活性を有しており、且つ3～6のpHで、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0128】

別の実施形態では、本エステラーゼは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Y、E158I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される1～10個の置換を含み、好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138/K、N204G、N211E、A215Y、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される1～10個の置換を含む。

【0129】

具体的には、本エステラーゼは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Y、E158I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択され、好ましくは、A17F、F90D/T/E/Q/N、R138/K、N204G、N211E、A215Y、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される1～10個の置換を有する、配列番号3に記載されているアミノ酸配列からなる。

【0130】

有利には、前記エステラーゼは、配列番号3のエステラーゼと比較して高い比分解活性及び/又は高いPET解重合収量を示す。

【0131】

ある実施形態では、本エステラーゼは、A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N、R138L/K/D/E、N204A/G、N211F/W/E、A215S/Yから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、A17F、F90D/E/Q/N、R138K、N204G、N211E、A215Yから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、より好ましくは、A17F、F90D/E/Q/N、R138K、及びN204Gから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して高い比分解活性を示す。

【0132】

別の実施形態では、本エステラーゼは、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/Nから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、少なくとも置換F90Tを含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して、24時間後に高いPET解重合収量を示す。

【0133】

ある実施形態では、本エステラーゼは、A17F/V/Q/D、N204A/G、E158I/C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、A17F、N204G、E158C、T160C、G171C、及びV180Cから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、より好ましくは、N204G、N204G+A17F、E158C+T160C、G171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換又は置換の組み合わせを含み、且つ配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示す。

【0134】

ある実施形態では、本エステラーゼは、A215S/Y + A17F/V/Q/D、N204A/G + A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A215S/Y、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204A/G、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N204A/G + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E + Q237C/I、F90D/T/H/E/G/P/S/Q/N + A17F/V/Q/D + N211F/W/E + N204A/G、E158E/I/C + T160C及びG171C + V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、好ましくは、A215Y+A17F、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+Q237I、F90D+A17F+N211E、F90D+A17F+N204G+Q237I、F90D+A17F+N211E+Q237I、F90D+A17F+N211E+N204G、E158C+T160C、及びG171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、より好ましくは、N204G+A17F、F90D+A215Y、F90D+A17F、F90D+A17F+N204G、F90D+A17F+N211E、E158C+T160C、及びG171C+V180Cから選択される少なくとも1つの置換の組み合わせを含み、且つ4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、更により好ましくはpH5.2で、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性を示す。

【0135】

好ましくは、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に(即ち、配列番号3に記載されているアミノ酸配列中に)、このエステラーゼの触媒部位を形成する少なくともアミノ酸S130、D175、及びH207、並びに/又はジスルフィド結合を形成するアミノ酸C240及びC275を含む。好ましくは、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、少なくとも、S130+D175+H207、C240+C275、及びS130+D175+H207+C240+C275から選択されるアミノ酸残基の組み合わせを含む。加えて、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、C203、C248、I170、G92、P213、E182、及びL13、及びE158から選択されるアミノ酸残基の内の少なくとも1つを更に含む。好ましい実施形態では、本エステラーゼは、親エステラーゼと同様に、少なくとも、アミノ酸S130、D175、H207、C240、C275、C203、C248、I170、G92、P213、E182、L13、及びE158を含み、好ましくは、少なくとも、アミノ酸S130、D175、H207、C240、C275、G92、P213、E182、及びL13を含む。より好ましくは、本エステラーゼは、少なくとも、組み合わせS130+D175+H207+C240+C275+G92+P213+E182+L13を含む。

【0136】

好ましい実施形態では、本エステラーゼは、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、好ましくはpH5.2で、且つ50℃～60℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号3のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を示す。

【0137】

本発明によれば、本エステラーゼは、4～6のpHで、好ましくは5～6のpHで、より好ましくは5～5.5のpHで、好ましくはpH5.2で、且つ50℃～90℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、配列番号1のエステラーゼと比較して高い耐熱性及び/又は高いポリエステル分解活性を更に示し得る。

【0138】

本バリアントのポリエステル分解活性
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規の酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素は、クチナーゼ活性を示す。

【0139】

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、ポリエステル分解活性を有しており、好ましくは、ポリエチレンテレフタレート(PET)分解活性、及び/又はポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)分解活性、及び/又はポリカプロラクトン(PCL)分解活性、及び/又はポリブチレンサクシネート(PBS)分解活性を有しており、より好ましくは、ポリエチレンテレフタレート(PET)分解活性、及び/又はポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)分解活性を有する。更により好ましくは、本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタレート(PET)分解活性を有する。

【0140】

有利には、本発明のエステラーゼは、20℃～90℃の温度の範囲で、好ましくは30℃～90℃の温度の範囲で、より好ましくは40℃～90℃の温度の範囲で、より好ましくは50℃～90℃の温度の範囲で、更により好ましくは60℃～90℃の温度の範囲で、ポリエステル分解活性を示す。具体的には、本発明のエステラーゼは、65℃～90℃、65℃～85℃、65℃～80℃、70℃～90℃、70℃～85℃、70℃～80℃の温度の範囲で、ポリエステル分解活性を示す。具体的には、本発明のエステラーゼは、40℃～80℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、ポリエステル分解活性を示す。ある実施形態では、本発明のエステラーゼは、55℃～60℃、50℃～55℃、55℃～65℃、60℃～72℃、60℃～70℃の温度で、ポリエステル分解活性を示す。特定の実施形態では、本エステラーゼは、少なくとも50℃、54℃、60℃、65℃、68℃、又は70℃で、ポリエステル分解活性を示す。有利には、ポリエステル分解活性は、55℃～70℃の温度で、依然として測定可能である。本発明との関連の中で、温度は、+/-1℃で示されている。

【0141】

本発明によれば、本発明のエステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼと比較して、所与の温度で高いポリエステル分解活性を有しており、より好ましくは40℃～90℃の温度で高いポリエステル分解活性を有しており、より好ましくは50℃～90℃の温度で高いポリエステル分解活性を有している。有利には、本発明のエステラーゼは、40℃～90℃、40℃～80℃、40℃～70℃、50℃～70℃、54℃～70℃、55℃～70℃、60℃～70℃、65℃～75℃、65℃～80℃、65℃～90℃の温度の全範囲で、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼと比較して高いポリエステル分解活性を有する。具体的には、本発明のエステラーゼは、40℃～80℃の温度で、好ましくは50℃～72℃の温度で、より好ましくは50℃～65℃の温度で、高いポリエステル分解活性を示す。ある実施形態では、本発明のエステラーゼは、55℃～60℃、50℃～55℃、55℃～65℃、60℃～72℃、60℃～70℃の温度で、高いポリエステル分解活性を示す。より具体的には、本発明のエステラーゼは、少なくとも50℃、54℃、60℃、65℃、又は68℃で、好ましくは54℃又は60℃で、高いポリエステル分解活性を示す。有利には、本エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼのポリエステル分解活性と比べて少なくとも5%高いポリエステル分解活性を有しており、好ましくは、少なくとも10%、20%、50%、100%、又はより高いポリエステル分解活性を有する。

【0142】

好ましい実施形態では、本エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼのポリエステル分解活性と比べて少なくとも5%高い54℃でのポリエステル分解活性を有しており、好ましくは、少なくとも10%、20%、50%、100%、又はより高い54℃でのポリエステル分解活性を有する。

【0143】

別の好ましい実施形態では、本エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼのポリエステル分解活性と比べて少なくとも5%高い60℃でのポリエステル分解活性を有しており、好ましくは、少なくとも10%、20%、50%、100%、又はより高い60℃でのポリエステル分解活性を有する。

【0144】

具体的には、本エステラーゼは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3の親エステラーゼのポリエステル分解活性と比べて少なくとも5%高い、54℃～60℃の温度の全範囲でのポリエステル分解活性を有し得、好ましくは、少なくとも10%、20%、50%、100%、又はより高い、54℃～60℃の温度の全範囲でのポリエステル分解活性を有し得る。

【0145】

本発明によれば、本発明のエステラーゼは、少なくとも、3～6のpH、4～6のpH、4.5～6のpH、5～6のpH、5.5～6のpH、5～5.5のpH、5～5.2のpH、5.2～5.5のpH、4～5.5のpH、4.5～5.5のpH、5～5.5のpHの範囲で、好ましくは5～5.2のpHの範囲で、より好ましくはpH5.2で、測定可能なポリエステル分解活性を示し得る。

【0146】

本エステラーゼは、6.5～10、7～9.5、7～9、7.5～8.5、6～9、6.5～9、6.5～8のpH範囲で、測定可能なポリエステル分解活性を更に示し得る。好ましくは、本エステラーゼは、pH8で測定可能なポリエステル分解活性を更に示す。

【0147】

核酸、発現カセット、ベクター、宿主細胞
本発明の更なる目的は、上記で定義されているエステラーゼをコードする核酸を提供することである。

【0148】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド及び/又はリボヌクレオチドの配列を指す。核酸は、DNA(cDNA若しくはgDNA)、RNA、又はこれらの混合物であり得る。核酸は、一本鎖形態若しくは二本鎖形態であり得るか、又はこれらの混合物であり得る。核酸は、組換え起源、人工起源、及び/又は合成起源であり得、且つ例えば、改変結合、改変プリン若しくはピリミジン塩基、又は改変糖を含む改変ヌクレオチドを含み得る。本発明の核酸は、単離形態又は精製形態であり得、当該技術部分野でそれ自体既知の技術(例えば、cDNAライブラリのクローニング及び発現、増幅、酵素合成、若しくは組換え技術)により作製され、単離され、及び/又は操作され得る。核酸は、例えば、Belousov (1997年) Nucleic Acids Res. 25:3440～3444頁で説明されているように、公知の化学合成技術によりインビボでも合成され得る。

【0149】

本発明はまた、ストリンジェント条件下で、上記で定義されているエステラーゼをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も包含する。好ましくは、そのようなストリンジェントな条件は、2 X SSC/0.1%SDS中での約2.5時間にわたる約42℃でのハイブリダイゼーションフィルターのインキュベーション、続いて65℃での1 X SSC/0.1% SDS中における15分4回のフィルターの洗浄を含む。使用されるプロトコルは、Sambrook他(Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988年))、及びAusubel(Current Protocols in Molecular Biology (1989年))等の参考文献で説明されている。

【0150】

本発明はまた、本発明のエステラーゼをコードする核酸であって、前記核酸の配列は、又は少なくとも前記核酸の一部は、最適化されたコドン使用法を使用して操作されている、核酸も包含する。

【0151】

或いは、本発明に係る核酸は、本発明に係るエステラーゼの配列から推定され得、コドン使用法は、核酸が転写される宿主細胞に応じて適合され得る。これらの工程を、当業者に公知の方法に従って実行し得、その一部は、参考マニュアルSambrook他(Sambrook他, 2001年)で説明されている。

【0152】

本発明の核酸は、選択された宿主細胞又は宿主系中でポリペプチドの発現を引き起こすか又は調節するために使用され得る調節領域(即ち、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、シグナルペプチド等)等の付加的なヌクレオチド配列を更に含み得る。

【0153】

本発明は、更に、適切な宿主細胞中での前記核酸の発現を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明に係る核酸を含む発現カセットに関する。

【0154】

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの産生に関与するあらゆる工程(例えば、限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、及び分泌)を指す。

【0155】

「発現カセット」という用語は、コード領域(即ち、本発明の核酸)と、作動可能に連結された調節領域(即ち、1つ又は複数の制御配列)とを含む核酸コンストラクトを示す。

【0156】

典型的には、本発現カセットは、転写プロモーター、及び/又は転写ターミネーター等の制御配列に作動可能に連結された、本発明に係る核酸を含むか、又はからなる。この制御配列は、本発明のエステラーゼをコードする核酸の発現のための宿主細胞又はインビトロ発現系により認識されるプロモーターを含み得る。このプロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含む。このプロモーターは、変異プロモーター、トランケートプロモーター、及びハイブリッドプロモーター等の宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるポリヌクレオチドであり得、且つ宿主細胞と同種又は異種の細胞外ポリペプチド又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる場合がある。この制御配列はまた、転写ターミネーターでもあり得、これは、宿主細胞により認識されて転写を終結させる。このターミネーターは、本エステラーゼをコードする核酸の3'末端に作動可能に連結されている。宿主細胞中で機能する任意のターミネーターを、本発明で使用し得る。典型的には、本発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに作動可能に連結された、本発明に係る核酸を含むか、又はからなる。

【0157】

本発明はまた、上記で定義されている核酸又は発現カセットを含むベクターにも関する。

【0158】

本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に導入するためにビヒクルとして使用される、本発明の発現カセットを含むDNA分子又はRNA分子を指す。ベクターの主要なタイプは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート(異種核酸配列、導入遺伝子)と、このベクターの「主鎖」として機能するより大きな配列とからなるDNA配列である。宿主に遺伝情報を伝達するベクターの目的は、典型的には、標的細胞中でインサートを単離するか、増加させるか、又は発現させることである。発現ベクター(発現コンストラクト)と呼ばれるベクターは、標的細胞中での異種配列の発現に特異的に適合しており、一般に、ポリペプチドをコードする異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般に、発現ベクター中に存在する調節エレメントとして、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び任意選択で存在するオペレーターが挙げられる。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞中での自己複製のための複製起点、選択可能マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数の可能性も含む。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。様々な宿主中で適切なレベルのポリペプチド発現を提供する発現ベクターは、当技術分野で公知である。ベクターの選択は、典型的には、このベクターの、このベクターを導入しなければならない宿主細胞との適合性に依存する。好ましくは、発現ベクターは、直鎖又は環状の二本鎖DNA分子である。

【0159】

本発明の別の目的は、上記で説明されている核酸、発現カセット、又はベクターを含む宿主細胞を提供することである。そのため、本発明は、宿主細胞を形質転換させるか、トランスフェクトするか、又は形質導入するための、本発明に係る核酸、発現カセット、又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、このベクターの、このベクターを導入しなければならない宿主細胞との適合性に依存する。

【0160】

本発明によれば、本宿主細胞を、一過性の方法又は安定的な方法で、形質転換し得るか、トランスフェクトし得るか、又は形質導入し得る。本発明の発現カセット又はベクターを宿主細胞に導入し、その結果、このカセット又はベクターは、染色体組み込み体として維持されるか、又は自己複製染色体外ベクターとして維持される。「宿主細胞」という用語はまた、複製中に起こる変異に起因して親宿主細胞と同一ではない、親宿主細胞のあらゆる子孫も包含する。宿主細胞は、本発明のバリアントの製造に有用な任意の細胞であり得、例えば、例えば原核生物又は真核生物であり得る。原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。宿主細胞はまた、酵母細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、又は植物細胞等の真核生物細胞でもあり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス属(Bacillus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、トリコデルマ属(Trichoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ビブリオ属(Vibrio)、又はヤロウイア属(Yarrowia)の群から選択される。

【0161】

本発明に係る核酸、発現カセット、又は発現ベクターを、当業者に既知の任意の方法(例えば、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入、コンピテント細胞形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、生物学的「遺伝子銃」形質転換、PEG媒介形質転換、脂質補助形質転換又はトランスフェクション、化学的媒介トランスフェクション、酢酸リチウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換)により、宿主細胞に導入し得る。

【0162】

任意選択で、本発明の核酸、カセット、又はベクターの複数コピーを宿主細胞に挿入して、バリアントの産生を増加させ得る。

【0163】

特定の実施形態では、本宿主細胞は、組換え微生物である。本発明により、ポリエステル含有物質を分解する能力が改善されている微生物の操作が可能になる。例えば、本発明の配列を使用して、ポリエステルを分解し得ることが既に既知である真菌又は細菌の野生型株を補完して、この株の能力を改善し得、及び/又は増加させ得る。

【0164】

エステラーゼの製造
本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼを製造する方法であって、このエステラーゼをコードする核酸を発現させる工程、及び任意選択で、このエステラーゼを回収する工程を含む方法を提供することである。

【0165】

具体的には、本発明は、本発明のエステラーゼを製造するインビトロでの方法であって、(a)本発明の核酸、カセット、又はベクターと、インビトロ発現系とを接触させる工程;及び(b)産生されたエステラーゼを回収する工程を含む方法に関する。インビトロ発現系は、当業者に公知であり、且つ市販されている。

【0166】

好ましくは、本製造方法は、
(a)本発明のエステラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞を、この核酸を発現させるのに好適な条件下で培養する工程;及び任意選択で
(b)細胞培養物から前記エステラーゼを回収する工程
を含む。

【0167】

有利には、本宿主細胞は、組換えバチルス属(Bacillus)、組換え大腸菌(E. coli)、組換えアスペルギルス属(Aspergillus)、組換えトリコデルマ属(Trichoderma)、組換えストレプトマイセス属(Streptomyces)、組換えサッカロマイセス属(Saccharomyces)、組換えピキア属(Pichia)、組換えビブリオ属(Vibrio)、又は組換えヤロウイア属(Yarrowia)である。

【0168】

本宿主細胞を、当技術分野で既知の方法を使用して、ポリペプチドの産生に適した栄養培地で培養する。例えば、細胞を、振とうフラスコ培養で培養し得るか、又は適切な培地中で並びに酵素の発現及び/若しくは単離が可能な条件下で実施される実験室若しくは工業用の発酵槽における小規模な若しくは大規模な発酵(例えば、連続発酵、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、若しくは固体発酵)により培養し得る。培養を、商業的供給業者から入手されるか又は公開されている組成(例えば、American Type Culture Collectionのカタログで公開されている組成)に従って調製されている適切な栄養培地で行う。

【0169】

本エステラーゼが栄養培地に分泌される場合には、このエステラーゼを、培養上清から直接回収し得る。逆に、本エステラーゼを、細胞溶解物から回収し得るか、又は透過処理後に回収し得る。本エステラーゼを、当技術分野で既知の任意の方法を使用して回収し得る。例えば、本エステラーゼを、従来の手順(例えば、限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿)により、栄養培地から回収し得る。任意選択で、本エステラーゼを、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、当技術分野で既知の様々な手順(例えば、限定されないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動手順(例えば、分取等電点電気エイド)、示差溶解(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS-PAGE、又は抽出)により部分的に又は完全に精製し得る。

【0170】

本エステラーゼを、単独で又は追加の酵素との組み合わせで、精製された形態でそのまま使用して、ポリエステル及び/又はポリエステル含有物質(例えば、ポリエステルを含むプラスチック製品)の分解及び/又はリサイクルに関与する酵素反応を触媒し得る。本エステラーゼは、可溶形態であり得るか、又は固相であり得る。具体的には、本エステラーゼを、細胞膜若しくは脂質小胞に結合させ得るか、又は例えば、ビーズ、カラム、プレート等の形態で、ガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜等の合成支持体に結合させ得る。

【0171】

組成物
本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼ若しくは宿主細胞、又はエステラーゼを含むこれらの抽出物を含む組成物を提供することである。本発明との関連で、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼ若しくは宿主細胞、又はエステラーゼを含むこれらの抽出物を含むあらゆる種類の組成物を包含する。

【0172】

本発明の組成物は、この組成物の総質量を基準として、質量で、0.1%～99.9%のエステラーゼを含み得、好ましくは0.1%～50%のエステラーゼを含み得、より好ましくは0.1%～30%のエステラーゼを含み得、更により好ましく0.1～5%のエステラーゼを含み得る。或いは、この組成物は、5～10質量%の本発明のエステラーゼを含み得る。

【0173】

本組成物は、液体又は乾燥の形態であり得、例えば、粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、凍結乾燥物である。

【0174】

本組成物は、賦形剤及び/又は試薬等を更に含み得る。適切な賦形剤には、下記が包含される:生化学で一般的に使用される緩衝剤、pH調整剤、保存料、例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、又はアスコルビン酸ナトリウム、防腐剤、保護剤又は安定剤、例えば、デンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩類、糖類、例えば、ソルビトール、トレハロース、又はラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、金属イオン封鎖剤、例えば、EDTA、還元剤、アミノ酸、キャリア、例えば、溶媒又は水溶液、及び同類のもの。本発明の組成物を、エステラーゼと1種又は数種の賦形剤とを混合することにより得ることができる。

【0175】

特定の実施形態では、本組成物は、この組成物の総質量を基準として、質量で、0.1%～99.9%の賦形剤を含み得、好ましくは50%～99.9%の賦形剤を含み得、より好ましくは70%～99.9%の賦形剤を含み得、更により好ましく95～99.9%の賦形剤を含み得る。或いは、この組成物は、5～10質量%の賦形剤を含み得る。

【0176】

本組成物は、酵素活性を示す追加のポリペプチドを更に含み得る。本発明のエステラーゼの量は、例えば、分解するポリエステルの性質及び/又は組成物に含まれる追加の酵素/ポリペプチドに応じて、当業者により容易に適合される。

【0177】

本発明のエステラーゼを、1種又は数種の賦形剤(特に、このポリペプチドを安定化するか又は分解から保護することが可能な賦形剤)と共に、水性媒体に溶解させ得る。例えば、本発明のエステラーゼを、追加の成分(例えば、グリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、塩等)と共に、水に溶解させ得る。次いで、得られた混合物を乾燥させて粉末を得ることができる。そのような混合物を乾燥させる方法は、当業者に公知であり、凍結乾燥(lyophilisation)、凍結乾燥(freeze-drying)、噴霧乾燥、超臨界乾燥、ダウンドラフト蒸発、薄層蒸発、遠心蒸発、コンベア乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0178】

本組成物は、粉末形態であり得、且つ本エステラーゼと、安定化/可溶化量のグリセロール、ソルビトール若しくはデキストリン、例えば、マルトデキストリン、及び/若しくはシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えば、プロパンジオール、並びに/又は塩とを含み得る。

【0179】

本発明の組成物は、本発明のエステラーゼ又はその抽出物を発現する少なくとも1種の組換え細胞を含み得る。「細胞の抽出物」は、細胞から得られるあらゆる画分を指しており、例えば、細胞上清、細胞残渣、細胞壁、DNA抽出物、酵素若しくは酵素調製物、又は化学的処理、物理的処理、及び/若しくは酵素的処理により細胞から得られる、本質的に生細胞を含まない任意の調製物を指す。好ましい抽出物は、酵素的に活性な抽出物である。本発明の組成物は、1種若しくは数種の本発明の組換え細胞、又はその抽出物、及び任意選択で1種又は数種の追加の細胞を含み得る。

【0180】

例えば、本組成物は、本発明のエステラーゼを発現して分泌する組換え微生物の培養培地からなるか、又は含む。特定の実施形態では、この組成物は、凍結乾燥したそのような培養培地を含む。

【0181】

エステラーゼの使用
本発明の更なる目的は、ポリエステル又はポリエステル含有物質を好気性条件下又は嫌気性条件下で分解する及び/又はリサイクルするために本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼは、特に酸性条件下での、PET及びPET含有物質の分解に特に有用である。

【0182】

従って、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ、又はエステラーゼ活性を有する対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又はポリエステルの酵素分解のための組成物を使用することである。

【0183】

有利には、本エステラーゼの標的となるポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリトリメチレンテレフタレート(PTT)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート(PEIT)、ポリ乳酸(PLA)、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリブチレンサクシネート(PBS)、ポリブチレンサクシネートアジペート(PBSA)、ポリブチレンアジペートテレフタレート(PBAT)、ポリエチレンフラノエート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジペート)(PEA)、ポリエチレンナフタレート(PEN)、「ポリオレフィン様」ポリエステル、及びこれらの物質のブレンド/混合物から選択され、好ましくはポリエチレンテレフタレートである。

【0184】

好ましい実施形態では、このポリエステルは、PETであり、少なくとも単量体(例えば、モノエチレングリコール又はテレフタル酸)、及び/又はオリゴマー(例えば、メチル-2-ヒドロキシエチルテレフタレート(MHET)、ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(BHET)、1-(2-ヒドロキシエチル)4-メチルテレフタレート(HEMT)、及びジメチルテレフタレート(DMT))が、任意選択で回収される。

【0185】

本発明の目的はまた、特に酸性条件下で、ポリエステル含有物質の少なくとも1種のポリエステルの酵素分解のために、本発明のエステラーゼ、又はその対応する組換え細胞若しくは抽出物、又は組成物を使用することでもある。

【0186】

本発明の別の目的は、ポリエステル含有物質の少なくとも1種のポリエステルを分解する方法であって、このポリエステル含有物質を、特に酸性条件下で、本発明のエステラーゼ、又は宿主細胞、又はその抽出物、又は組成物と接触させ、それにより、ポリエステル含有物質の少なくとも1種のポリエステルが分解する、方法を提供することである。

【0187】

有利には、ポリエステルは、単量体及び/又はオリゴマーまで解重合される。

【0188】

具体的には、本発明は、PET含有物質のPETを分解する方法であって、このPET含有物質を、好ましくは酸性条件下で、本発明のエステラーゼ、又は宿主細胞、又は組成物と接触させ、それにより、PETが分解する、方法を提供する。

【0189】

有利には、少なくとも1種のポリエステルは、再重合可能な単量体及び/又はオリゴマーに分解され、再利用するために有利に回収され得る。回収された単量体及び/又はオリゴマーを、リサイクル(例えば、ポリエステルの再重合)又はメタン化に使用し得る。特定の実施形態では、少なくとも1種のポリエステルは、PETであり、モノエチレングリコール、テレフタル酸、メチル-2-ヒドロキシエチルテレフタレート(MHET)、ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(BHET)、1-(2-ヒドロキシエチル)4-メチルテレフタレート(HEMT)、及びジメチルテレフタレート(DMT)が回収される。

【0190】

好ましくは、ポリエステル含有物質のポリエステルは、完全に分解される。

【0191】

ポリエステル含有物質の分解に必要な時間は、このポリエステル含有物質自体(即ち、このポリエステル含有物質の性質及び起源、その組成、形状等)、使用されるエステラーゼのタイプ及び量、並びに様々なプロセスパラメータ(即ち、温度、pH、追加の薬剤等)に応じて異なり得る。当業者は、プロセスパラメータを、ポリエステル含有物質、及び想定される分解時間に容易に適応させ得る。

【0192】

有利には、分解プロセスを、20℃～90℃の温度で実行し、好ましくは40℃～90℃の温度で実行し、より好ましくは50℃～70℃の温度で実行する。特定の実施形態では、分解プロセスを、60℃で実行する。別の特定の実施形態では、分解プロセスを、65℃で実行する。別の特定の実施形態では、分解プロセスを、70℃で実行する。より一般的には、この温度を、エステラーゼが不活性化される温度(即ち、エステラーゼが、最適温度でのその活性と比較して80%超の活性を失う温度)、及び/又は組換え微生物がエステラーゼをもはや合成しない温度に相当する不活性化温度未満に維持する。具体的には、この温度を、標的のポリエステルのガラス転移温度(Tg)未満に維持する。

【0193】

有利には、このプロセスを、エステラーゼを数回使用し得、及び/又はリサイクルし得る温度にて、連続フロープロセルで実行する。

【0194】

本発明によれば、分解プロセスを、3～6のpHで実行し、好ましくは4～5.5のpHで実行し、より好ましくは4.5～5.5のpHで実行し、更により好ましくは5～5.5のpHで実行し、具体的にはpH5.2で実行する。

【0195】

ある実施形態では、分解プロセスをまた、5～9のpHでも実行し得、好ましくは6～9のpHでも実行し得、より好ましくは6.5～9のpHでも実行し得、更により好ましくは6.5～8のpHでも実行し得る。別の実施形態では、分解プロセスを、6.5～10のpHで実行し、好ましくは7～9.5のpHで実行し、より好ましくは7～9のpHで実行し、更により好ましくは7.5～8.5のpHで実行する。

【0196】

ポリエステル含有物質を、エステラーゼと接触させる前に前処理してその構造を物理的に変化させ、ポリエステルとエステラーゼとの接触面を増加させ得る。

【0197】

本発明の別の目的は、ポリエステル含有物質から単量体及び/又はオリゴマーを製造する方法であって、ポリエステル含有物質を、特に酸性条件下で、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物に曝露する工程、及び任意選択で、単量体及び/又はオリゴマーを回収する工程を含む方法を提供することである。

【0198】

解重合により得られる単量体及び/又はモノマーを、逐次的に又は連続的に回収し得る。出発ポリエステル含有物質に応じて、単一のタイプの単量体、及び/又はいくつかの異なるタイプの単量体、及び/又はオリゴマーを回収し得る。

【0199】

本発明の方法は、PET、及び/又はPETを含むプラスチック製品から、モノエチレングリコール及びテレフタル酸から選択される単量体、並びに/又はメチル-2-ヒドロキシエチルテレフタレート(MHET)、ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(BHET)、1-(2-ヒドロキシエチル)4-メチルテレフタレート(HEMT)、及びジメチルテレフタレート(DMT)から選択されるオリゴマーを製造するのに特に有用である。

【0200】

回収された単量体及び/又はオリゴマーを、全ての適切な精製方法を使用して更に精製し得、且つ再重合可能な形態に調整し得る。

【0201】

回収された再重合可能な単量体及び/又はオリゴマーを再利用して、例えばポリエステルを合成し得る。有利には、同一の性質のポリエステルを再重合させる。しかしながら、回収された単量体及び/又はオリゴマーを、他の単量体及び/又はオリゴマーと混合して、例えば新たなコポリマーを合成することが可能である。或いは、回収された単量体を、目的の新たな化合物を製造するための化学中間体として使用し得る。一例として、本発明のエステラーゼを含む、そのようなポリエステル含有物質を分解するプロセスは、国際公開第2014/079844号、国際公開第2015/173265号、国際公開第2017/198786号、国際公開第2020/094661号、国際公開第2020/094646号、国際公開第2021/123299号、国際公開第2021/123301号、及び国際公開第2021/123328号で開示されている。

【0202】

本発明はまた、ポリエステル含有物質の表面加水分解又は表面官能化の方法であって、具体的には酸性条件下で、ポリエステル含有物質を、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物に曝露する工程を含む方法にも関する。本発明の方法は、ポリエステル物質の親水性(即ち、吸水性)を高めるのに特に有用である。そのような親水性の向上は、繊維製品の製造、電子機器、及び生物医学的用途において特に興味深い可能性がある。

【0203】

本発明はまた、具体的には酸性条件下で、水、廃水、又は下水を処理する方法にも関する。廃水又は下水の処理用途において、本発明に係るエステラーゼを使用して、ポリマーフィラメント、繊維、又は他の種類のポリエステルベースの製品の破片及び断片、好ましくは、PETベースの製品の破片及び断片のようなポリエステル(好ましくはPET)からなるマイクロプラスチック粒子を分解し得る。

【0204】

本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼ、及び/又は前記エステラーゼを発現して排出する組換え微生物が含まれるポリエステル含有物質を提供することである。一例として、本発明のエステラーゼを含むそのようなポリエステル含有物質を調製するプロセスは、国際公開第2013/093355号、国際公開第2016/198650号、国際公開第2016/198652号、国際公開第2019/043145号、及び国際公開第2019/043134号で開示されている。

【0205】

そのため、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ、及び/又は組換え細胞、及び/又は組成物、又はこれらの抽出物と、少なくともPETとを含むポリエステル含有物質を提供することである。ある実施形態によれば、本発明は、PETと、PET分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含むプラスチック製品を提供する。

【0206】

そのため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ、及び/又は組換え細胞、及び/又は組成物、又はこれらの抽出物と、少なくともPBATとを含むポリエステル含有物質を提供することである。ある実施形態によれば、本発明は、PBATと、PBAT分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含むプラスチック製品を提供する。

【0207】

そのため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ、及び/又は組換え細胞、及び/又は組成物、又はこれらの抽出物と、少なくともPBSとを含むポリエステル含有物質を提供することである。ある実施形態によれば、本発明は、PBSと、PBS分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含むプラスチック製品を提供する。

【0208】

そのため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ、及び/又は組換え細胞、及び/又は組成物、又はこれらの抽出物と、少なくともPCLとを含むポリエステル含有物質を提供することである。ある実施形態によれば、本発明は、PCLと、PCL分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含むプラスチック製品を提供する。

【0209】

古典的には、本発明のエステラーゼを、洗剤、食品、動物飼料、製紙、繊維、及び医薬の用途で使用し得る。より具体的には、本発明のエステラーゼを、洗剤組成物の構成成分として使用し得る。洗剤組成物として下記が挙げられるが、これらに限定されない:手洗い又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば、汚れた布地の前処理に適した洗濯添加剤組成物、及びすすぎに添加される布地柔軟剤組成物、一般家庭の硬質表面洗浄操作で使用される洗剤組成物、手洗い又は機械食器洗浄操作用の洗剤組成物。例えば、本発明のエステラーゼを、洗剤添加剤として使用し得る。そのため、本発明は、本発明のエステラーゼを含む洗剤組成物を提供する。具体的には、本発明のエステラーゼを、繊維製品洗浄中での毛羽立ち及び灰色化効果(greying effect)を軽減するために、洗剤添加剤として使用し得る。

【0210】

本発明はまた、動物飼料で本発明のエステラーゼを使用する方法、並びに本発明のエステラーゼを含む飼料組成物及び飼料添加剤も対象とする。「飼料」及び「飼料組成物」という用語は、動物による摂取に適しているか又は動物による摂取が意図されているあらゆる化合物、調製物、混合物、又は組成物を指す。本発明のエステラーゼをまた、タンパク質を加水分解するためにも使用し得、且つペプチドを含む加水分解物を製造するためにも使用し得る。そのような加水分解物を、飼料組成物又は飼料添加剤として使用し得る。

【0211】

本発明の更なる目的は、製紙工業において本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。より具体的には、本発明のエステラーゼを使用して、抄紙機の紙パルプ及び水パイプラインから粘着物を除去し得る。

【実施例】

【0212】

(実施例1)
エステラーゼの構築、発現、及び精製
- 構築
本発明に係るエステラーゼを、プラスミド構築pET26b-LCC-Hisを使用して生成した。このプラスミドは、配列番号1のエステラーゼをコードする遺伝子をクローニングしたものであり、NdeI制限部位とXhoI制限部位との間で、大腸菌(Escherichia coli)発現に最適化されている。エステラーゼバリアントを生成するために、供給者の推奨に従って、下記の2種類の部位特異的変異誘発キットを使用した:(Santa Clara社, California, USAの) QuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット、及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed from Agilent。

【0213】

- エステラーゼの発現及び精製
LB-Miller培地又はZYM自動誘導培地(Studier他、2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207～234頁) 50mL中でクローニング及び組換え発現を実施するために、Stellar(商標)株(Clontech社, California, USA)及び大腸菌(E. coli)BL21(DE3)(New England Biolabs社, Evry, France)を連続して採用した。0.5mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG、Euromedex社, Souffelweyersheim, France)により、LB-Miller培地での誘導を16℃で実施した。培養を、Avanti J-26 XP遠心機(Beckman Coulter社, Brea, USA)で遠心分離(8000rpm、10℃で20分)して停止させた。細胞を、Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM、NaCl 300 mM、pH8) 20mLに懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を、FB 705超音波発生装置(Fisherbrand社, Illkirch, France)により、30%の振幅で2分間超音波処理した(2秒のON及び1秒のOFFサイクル)。次いで、下記の遠心分離工程を行った:エッペンドルフの遠心分離機で10000g、10℃にて30分間。可溶性画分を回収し、アフィニティークロマトグラフィーに供した。この精製工程を、Talon(登録商標) Metal Affinity Resin (Clontech社, CA, USA)で完了した。タンパク質の溶出を、イミダゾールを補充したTalon緩衝液の工程で実行した。精製されたタンパク質を、Talon緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液(100～300mM、pH5.2)に対して透析し、次いで、製造業者の指示に従いBio-Radタンパク質アッセイを使用して定量し(Lifescience Bio-Rad社、France)、+4℃で保存した。

【0214】

(実施例2)
エステラーゼの分解活性の評価
エステラーゼの分解活性を決定し、配列番号1のエステラーゼの活性と比較した。

【0215】

比活性を評価するために、下記の複数の方法論を使用した。
(1)PET加水分解及び超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)分析に基づく比活性
(2)PET加水分解及び紫外線吸収(UVアッセイ)分析に基づく比活性
(3)固体形態のポリエステルの分解に基づく分解活性
(4)100mLを超える反応器中でのPET加水分解に基づく分解活性

【0216】

2.1.PET加水分解及び超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)分析に基づく比活性
粉末状の非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 100mgを秤量し、100mLのガラス瓶に導入した。酸性条件での測定用に酢酸ナトリウム緩衝液(100～300mM、pH5.2)で1,727μMに調製した(又は塩基性条件ではTalon緩衝液(Tris-HCl 20mM、NaCl 0.3M、pH8)で0.69μMに調製した)、配列番号1のエステラーゼ(参照対照として)又は本発明のエステラーゼを含むエステラーゼ調製物1mLを、ガラス瓶に導入した。最後に、(測定を行うpHに応じて)対応する緩衝液9mL又は49mLを添加した。

【0217】

Max Q 4450インキュベータ(Thermo Fisher Scientific, Inc.社, Waltham, MA, USA)中において、50℃、54℃、60℃、65℃、68℃、又は72℃、及び150rpmで各ガラス瓶をインキュベートすることにより、解重合が開始した。

【0218】

解重合反応の初速度(mg 生成された当量のTA/時間)を、最初の24時間中の様々な時点で実施したサンプリングにより決定し、超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)により分析した。必要に応じて、サンプルを、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8)で希釈した。次いで、メタノール 150μL及び6N HCl 6.5μLを、サンプル又は希釈液 150μLに添加した。混合し、0.45μmのシリンジフィルターでろ過した後、サンプルをUHPLCにロードして、テレフタル酸(TA)、MHET、及びBHETの遊離をモニタリングした。使用するクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、25℃でのカラムオーブンサーモスタット、及び240nmでのUV検出器を含むUltimate 3000 UHPLCシステム(Thermo Fisher Scientific, Inc.社, Waltham, MA, USA)であった。使用するカラムは、Discovery(登録商標)HS C18 HPLCカラム(150×4.6mm、5μm、プレカラムを備えている、Supelco社, Bellefonte, USA)であった。TA、MHET、及びBHETを、1mL/分で1mM H₂SO₄中のMeOHの勾配(30%～90%)を使用して分離した。注入は、サンプル 20μLであった。TA、MHET、及びBHETを、サンプルと同じ条件で、市販のTA及びBHET、並びにインハウス合成したMHETから作成した検量線に従って測定した。PET加水分解の比活性(mg 当量のTA/時間/mg 酵素)を、反応の加水分解曲線の直線部分で(即ち、反応の開始時に)決定し、そのような曲線を、最初の24、48、又は72時間中の様々な時点で実施したサンプリングにより設定した。当量のTAは、測定されたTAと、測定されたMHET及びBHETに含まれるTAとの合計に相当する。前記当量のTAの測定を使用して、所与の時間での及び/又は規定の期間(例えば、24時間又は48時間)後のPET解重合アッセイの収量も算出し得る。

【0219】

2.2.PET加水分解及び紫外線吸収(UVアッセイ)分析に基づく比活性
粉末状の非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 100mgを秤量し、100mLのガラス瓶に導入した。酸性条件での測定用に酢酸ナトリウム緩衝液(100～300mM、pH5.2)で1,727μMに調製したか又は塩基性条件ではTalon緩衝液(Tris-HCl 20mM、NaCl 0.3M、pH8)で0.69μMに調製した、配列番号1のエステラーゼ(参照対照として)又は本発明のエステラーゼを含むエステラーゼ調製物1mLを、ガラス瓶に導入した。最後に、(測定を行うpHに応じて)対応する緩衝液9mL又は49mLを添加した。

【0220】

Max Q 4450インキュベータ(Thermo Fisher Scientific, Inc.社, Waltham, MA, USA)中において、50℃、54℃、60℃、又は65℃、及び150rpmで各ガラス瓶をインキュベートすることにより、解重合が開始した。

【0221】

解重合反応の初速度(μmol 生成された可溶性分解物/時間)を、最初の24時間中の様々な時点で実施したサンプリングにより決定し、Eon Microplate Spectrophotometer (BioTek社, USA)を使用して242nmで吸光度を読み取ることにより分析した。(242nmでの)光スペクトルの紫外領域における反応混合物の吸光度の増加は、不溶性PET基質からの可溶性TA又はそのエステル(BHET及びMHET)の放出を示す。この波長での吸光度値を使用して、Lambert-Beerの法則に従ってPET加水分解生成物の総和を算出し得、酵素の比活性を、生成された総当量TAとして決定する。PET加水分解の比活性(μmol 可溶性生成物/時間/mg 酵素)を、反応の加水分解曲線の直線部分で(即ち、反応の開始時に)決定し、そのような曲線を、最初の24、48、又は72時間中の様々な時点で実施したサンプリングにより設定した。前記当量のTAの測定を使用して、所与の時間での及び/又は規定の期間(例えば、24時間又は48時間)後のPET解重合アッセイの収量も算出し得る。必要に応じて、サンプルを、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8)で希釈した。

【0222】

2.3.固体形態のポリエステルの分解に基づく活性
寒天プレートの調製を、PET 50mgをヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)に溶解させ、この培地を水溶液 250mLに注ぐことにより実現した。140mbar下での50℃でのHFIP蒸発後、溶液を、リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)と混合して、0.5mg/mLのPET及び0.1Mの緩衝液を含む1%寒天の最終濃度を得た。この混合物 約30mLを使用して各プレートを調製し、4℃で保存した。pH8.0、5.2、又は5.0それぞれで、PETを含む寒天プレートのウェルに、酵素調製物(純粋な酵素又は細胞溶解物) 1μL、5μL、又は20μLを入れた。

【0223】

野生型エステラーゼ及びバリアントによるポリエステル分解に起因して形成されたハローの直径又は表面積を、ソフトウェアGimpを使用して寒天プレート写真のハローの直径を測定することにより決定し、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、又は70℃での規定の期間(2～24時間)後に比較した。

【0224】

2.4.反応器中でのPET加水分解に基づく活性
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH8)、又は300mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は300mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は300mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) 80mLで調製された精製エステラーゼ 0.69μmol～2.07μmolを、500mLのMinibioバイオリアクター(Applikon Biotechnology社, Delft, The Netherlands)中において、非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 20gと混合した。40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、又は70℃での温度レギュレーションを、水浴浸漬により実施し、単独のマリンインペラ(marine impeller)を使用して、250rpmで一定の撹拌を維持した。PET解重合アッセイのpHを、6N NaOHの添加により、pH5、又はpH5.2、又はpH6、又はpH8で制御し、my-Control bio controllerシステム(Applikon Biotechnology社, Delft, The Netherlands)により保証した。アッセイ中に塩基消費を記録し、PET解重合アッセイのキャラクタリゼーションに使用し得る。

【0225】

PET解重合アッセイの最終収量を、残存PET質量の決定、又は生成された当量のTAの決定、又は塩基消費のいずれかにより決定した。残存PETの質量決定を、反応の終わりに、12～15μmグレードの11無灰ろ紙(Dutscher SAS社, Brumath, France)に通して反応体積をろ過し、そのような残留物を乾燥させた後に秤量することにより評価した。生成された当量のTAの決定を、2.1で説明されているUHPLC法を使用して実現し、加水分解の百分率を、初期サンプルに含まれるTAの総量に対する所与の時間でのモル濃度(TA+MHET+BHET)の比に基づいて算出した。PET解重合により、反応器内のpHを維持し得るために塩基で中和される酸性単量体が生成された。生成された当量のTAの決定を、対応するモル塩基消費量を使用して算出しており、加水分解の百分率を、初期サンプルに含まれるTAの総量に対する当量のTAの所与の時間におけるモル濃度の比に基づいて算出した。

【0226】

結果
配列番号1のエステラーゼと比較した、酸性条件下での固体形態のPETの分解に基づく活性
本発明のエステラーゼ(バリアント)の活性を、実施例2.3で示したように、50℃、及びpH5.0(V1～V38、及びV124)又はpH5.2(V38～V93)で24時間後に評価した。

【0227】

本発明のエステラーゼ(バリアント)のハローの表面積を、配列番号1の野生型エステラーゼにより形成された表面積と比較した。配列番号1の野生型エステラーゼと比べて表面積が大きいバリアント(即ち、規定の期間後に配列番号1のエステラーゼと比べて優れた分解活性を有するバリアント)を、下記のTable 1(表1)で報告する。

【0228】

【表1A】

【0229】

【表1B】

【0230】

V1～V93及びV124は、Table 1(表1)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0231】

興味深いことに、バリアントのほとんどは、配列番号1の野生型エステラーゼのハロー直径の110%以上の直径を有するハローを示す。これらのバリアントを、下記のTable 2(表2)で報告する。

【0232】

【表2A】

【0233】

【表2B】

【0234】

Table 2(表2)で列挙されているバリアントは、Table 2(表2)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0235】

配列番号1のエステラーゼと比較した、酸性条件下での比分解活性
本発明のエステラーゼ(バリアント)の比分解活性を、加水分解曲線の直線部分から(即ち、反応開始時に)決定した。配列番号1のエステラーゼの比分解活性を、基準として使用し、100%比分解活性とみなす。この比分解活性を、pH5.2及び54℃で、実施例2.1で示したように測定した。結果を、下記のTable 3(表3)にまとめる。

【0236】

【表3】

【0237】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 3(表3)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0238】

配列番号1のエステラーゼと比較した、酸性条件下でのPET解重合収量
本発明のエステラーゼ(バリアント)のPET解重合収量を、pH5.2及び50℃での48時間後に更に評価した。本発明に関連して、PET解重合収量を使用して、分解活性を評価する。結果を、下記のTable 4(表4)に示す。配列番号1のエステラーゼの分解活性を、基準として使用し、100%分解活性とみなす。比分解活性を、実施例2.2で示すように測定した。

【0239】

【表4】

【0240】

配列番号2のエステラーゼと比較した、酸性条件下での比分解活性
本発明の更なるエステラーゼ(バリアント)の比分解活性を、下記のTable 5(表5)に示す。前記バリアントは、配列番号2に基づいており、この配列番号2は、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182Eを有する配列番号1のエステラーゼに対応しており、且つ配列番号1のエステラーゼと比べて、pH.5.2及び60℃で4.5倍高い比分解活性を有する。配列番号2のエステラーゼの比分解活性を、基準として使用し、100%比分解活性とみなす。比分解活性を、実施例2.2で示すように測定した。

【0241】

【表5】

【0242】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 5(表5)で列挙されている置換を除いて、配列番号2の正確なアミノ酸配列を有する。

【0243】

配列番号3のエステラーゼと比較した、酸性条件下での比分解活性
本発明の更なるエステラーゼ(バリアント)の比分解活性を、下記のTable 6(表6)に示す。前記バリアントは、配列番号3に基づいており、この配列番号3は、置換の組み合わせF208M+D203C+S248C+V170I+Y92G+N213P+Q182E+S13L+D158Eを有する配列番号1のエステラーゼに対応しており、且つ配列番号1のエステラーゼと比べて、pH.5.2及び54℃で3倍高い比分解活性を有する。配列番号3のエステラーゼの比分解活性を、基準として使用し、100%比分解活性とみなす。比分解活性を、実施例2.2で示すように測定した。

【0244】

【表6】

【0245】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 6(表6)で列挙されている置換を除いて、配列番号3の正確なアミノ酸配列を有する。

【0246】

本発明の更なるエステラーゼ(バリアント)の24時間後の分解活性を、下記のTable 7(表7)に示す。配列番号3のエステラーゼの分解活性を、基準として使用し、24時間後の100%分解活性とみなす。分解活性を、24時間後に、実施例2.1で示すように測定する。

【0247】

【表7】

【0248】

バリアントは、Table 7(表7)で列挙されている置換を除いて、配列番号3の正確なアミノ酸配列を有する。

【0249】

pH8で配列番号1のエステラーゼと比較した比分解活性
本発明のエステラーゼの比分解活性もまた、pH8で測定した。

【0250】

比分解活性を、実施例2.1で示すように測定した。

【0251】

pH8での本発明のエステラーゼ(バリアント)の比分解活性を、下記のTable 8(表8)に示す。配列番号1のエステラーゼの比分解活性を、基準として使用し、100%比分解活性とみなす。比活性を、実施例2.1で示すように65℃で測定する。

【0252】

【表8】

【0253】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 8(表8)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0254】

(実施例3)
本発明のエステラーゼの耐熱性の評価
本発明のエステラーゼの耐熱性を決定し、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3のエステラーゼの耐熱性と比較した。

【0255】

下記の様々な方法論を使用して、耐熱性を推定した:
(1)溶液中のタンパク質の円二色性;
(2)温度、時間、及び緩衝液に関する所与の条件下でのタンパク質のインキュベーション後の残存エステラーゼ活性;
(3)温度、時間、及び緩衝液に関する所与の条件下でのタンパク質のインキュベーション後の残存ポリエステル解重合活性;
(4)温度、時間、及び緩衝液に関する所与の条件下でのタンパク質のインキュベーション後の、寒天プレート中に分散させた固体ポリエステル化合物(例えば、PET、又はPBAT、又は類似物)を分解する能力;
(5)温度、緩衝液、タンパク質濃度、及びポリエステル濃度に関する所与の条件下でポリエステル解重合アッセイを複数回実施する能力;
(6)示差走査蛍光定量(DSF)。

【0256】

そのような方法のプロトコルの詳細を、下記に示す。

【0257】

3.1 円二色性
円二色性(CD)をJasco 815装置(Easton社, USA)で実施して、配列番号1のエステラーゼの融点(Tm)と本発明のエステラーゼのTmとを比較した。技術的には、タンパク質サンプル 400μLを、規定の条件のpH(Talon緩衝液(pH8)、酢酸ナトリウム緩衝液 100mM pH5又は5.2)で0.5mg/mLにて調製し、CDに使用した。280～190nmの1回目のスキャンを実現して、タンパク質の正しい折り畳みに対応するCDの2つの最大強度を決定した。次いで、2回目のスキャンを、そのような最大強度に対応する長さの波で25℃～110℃で実施し、Sigmaplotバージョン11.0ソフトウェアにより分析される特定の曲線(シグモイド3パラメータ y=a/(1+e^((x-x0)/b)))を提供し、x=x0の場合には、Tmを決定する。得られたTmは、所与のタンパク質の耐熱性を反映している。Tmが高いほど、バリアントは、高温でより安定となる。

【0258】

3.2 残存エステラーゼ活性
40mg/L(Talon緩衝液、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中)の配列番号1のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの溶液 1mLを、最大10日間、様々な温度(40、50、60、65、70、75、80、及び90℃)でインキュベートした。定期的にサンプルを採取し、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で1～500倍に希釈し、パラニトロフェノール-ブチラート(pNP-B)アッセイを実現した。サンプル 20μLを、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) 175μL、及び2-メチル-2ブタノール中のpNP-B溶液(40mM) 5μLと混合する。酵素反応を、15分にわたり、撹拌下で30℃にて実施し、405nmでの吸光度を、マイクロプレート分光光度計(Versamax, Molecular Devices社, Sunnyvale, CA, USA)により取得した。pNP-B加水分解の活性(μmol pNPB/分で表される初速度)を、加水分解曲線の直線部分における遊離したパラニトロフェノールに関する酵素アッセイと同一の条件の緩衝液及びpHで調製した検量線を使用して決定した。

【0259】

3.3 残存ポリエステル解重合活性
40mg/L(Talon緩衝液、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中)の配列番号1のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの溶液 10mLを、それぞれ、最大30日間、様々な温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、及び90℃)でインキュベートした。定期的にサンプル 1mLを採取し、250～500μmに微粉化した非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 100mg、及び0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は0.2M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) 49mLが入っているボトルに移し、50℃、55℃、60℃、65℃、又は70℃でインキュベートした。緩衝液 150μLを、定期的にサンプリングした。必要に応じて、サンプルを、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8)で希釈した。次いで、メタノール 150μL及び6N HCl 6.5μLを、サンプル又は希釈液 150μLに添加した。混合し、0.45μmのシリンジフィルターでろ過した後、サンプルをUHPLCにロードして、テレフタル酸(TA)、MHET、及びBHETの遊離をモニタリングした。使用するクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、25℃でのカラムオーブンサーモスタット、及び240nmでのUV検出器を含むUltimate 3000 UHPLCシステム(Thermo Fisher Scientific, Inc.社, Waltham, MA, USA)であった。使用するカラムは、Discovery(登録商標)HS C18 HPLCカラム(150×4.6mm、5μm、プレカラムを備えている、Supelco社, Bellefonte, USA)であった。TA、MHET、及びBHETを、1mL/分で1mM H₂SO₄中のMeOHの勾配(30%～90%)を使用して分離した。注入は、サンプル 20μLであった。TA、MHET、及びBHETを、サンプルと同じ条件で、市販のTA及びBHET、並びにインハウス合成したMHETから作成した検量線に従って測定した。PET加水分解の活性(μmol 加水分解されたPET/分、又はmg 生成された当量のTA/時間)を、加水分解曲線の直線部分で決定し、そのような曲線を、最初の24時間中の様々な時点で実施したサンプリングにより設定した。当量のTAは、測定されたTAと、測定されたMHET及びBHETに含まれるTAとの合計に相当する。

【0260】

3.4 固体形態のポリエステルの分解
配列番号1のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼの40mg/L(Talon緩衝液、又は0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又は0.1M リン酸クエン酸緩衝液(pH6.0)、又は0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))の溶液 1mLを、それぞれ、最大30日間、様々な温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、及び90℃)でインキュベートした。定期的に酵素調製物をサンプリングし、PETが入った寒天プレートのウェルに入れた。寒天プレートの調製を、PET 50mgをヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)に溶解させ、この培地を水溶液 250mLに注ぐことにより実現した。140mbar下での50℃でのHFIP蒸発後、溶液を、リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、又はリン酸クエン酸緩衝液(pH6.0)、又は酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)と混合して、0.5mg/mLのPET及び0.1Mの緩衝液を含む1%寒天の最終濃度を得た。この混合物 約30mLを使用して各プレートを調製し、4℃で保存した。pH8.0、6.0、又は5.2それぞれで、PETを含む寒天プレートのウェルに、酵素調製物1μL、5μL、又は20μLを入れた。

【0261】

野生型エステラーゼ及び本発明のバリアントによるポリエステル分解に起因して形成されたハローの直径又は表面積を測定し、50℃、55℃、60℃、65℃、又は70℃での2～24時間後に比較した。所与の温度での酵素の半減期は、ハローの直径が1/2まで減少するのに必要な時間に相当する。

【0262】

3.5 複数回のポリエステルの解重合
エステラーゼが連続回のポリエステル解重合アッセイを実施する能力を、酵素反応器で評価した。Minibio 500バイオリアクター(Applikon Biotechnology B.V.社, Delft, The Netherlands)を、非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 3gと、エステラーゼ 3mgを含む100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)、又は100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)、又は100mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) 100mLとで開始した。撹拌を、マリンインペラを使用して250rpmに設定した。バイオリアクターを、外付けの水浴への浸漬により、50℃、55℃、60℃、65℃、又は70℃で温度調節した。pHを、3M NaOHの添加により、5.0、5.2、又は6.0に調節した。様々なパラメータ(pH、温度、撹拌、塩基の添加)を、BioXpertソフトウェアV2.95によりモニタリングした。非晶質PET(20%未満の結晶化度に達するために、国際公開第2017/198786号に従って調製した) 1.8gを、20時間毎に添加した。反応媒体 500μLを、定期的にサンプリングした。

【0263】

TA、MHET、及びBHETの量を、実施例2.3で説明したように、HPLCにより決定した。EGの量を、65℃に温度調節されたAminex HPX-87Kカラム(Bio-Rad Laboratories, Inc社, Hercules, California, United States)を使用して決定した。溶出液は、0.6mL.分^-1での5mM K₂HPO₄であった。注入は、20μLであった。エチレングリコールを、屈折計を使用してモニタリングした。

【0264】

加水分解の百分率を、初期サンプルに含まれるTAの総量に対する所与の時間におけるモル濃度(TA+MHET+BHET)の比に基づいて算出したか、又は初期サンプルに含まれるEGの総量に対する所与の時間におけるモル濃度(EG+MHET+2×BHET)の比に基づいて算出した。分解速度を、1時間当たりのmg 総遊離TA、又は1時間当たりのmg 総EGで算出する。

【0265】

酵素の半減期を、分解速度の50%の損失を得るのに必要なインキュベーション時間として評価した。

【0266】

3.6 示差走査蛍光定量(DSF)
DSFを使用して、タンパク質集団の半分がアンフォールディングされる温度である融点(Tm)を決定することにより、野生型タンパク質(配列番号1)及びそのバリアントの耐熱性を評価した。Tm値を推定するために、タンパク質サンプルを、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)からなる緩衝液A中に25μMの濃度で調製した。次いで、調製したタンパク質サンプル 6μLを、緩衝液A(pH8.0での測定及びTm評価用)18μLで希釈したか、又は300mM 酢酸ナトリウム(pH5.09)からなる緩衝液B(pH5.2での測定及びTm評価用)18μLで希釈して、最終的なpH値を5.2にした。DMSO中のSYPROオレンジ色素5000×ストック溶液を、最初に水で250倍に希釈した。タンパク質サンプルを、白色透明96ウェルPCRプレート(Bio-Rad カタログ# HSP9601)上にロードし、各ウェルには、25μlの最終容量が入っていた。各ウェル中のタンパク質及びSYPROオレンジ色素の最終濃度は、それぞれ、6μM(0.17mg/ml)及び10×であった。ウェル当たりのロードされた容量は、下記の通りであった:6.25μM 希釈タンパク質溶液 24μL、及び250×Sypro Orange希釈溶液 1μL。次いで、PCRプレートを、光学品質のシーリングテープで密封し、室温で1分にわたり1000rpmで回転させた。次いで、DSF実験を、450/490励起及び560/580発光フィルターを使用するように設定されたCFX96リアルタイムPCRシステムを使用して実行した。サンプルを、0.3℃/秒の速度で25～100℃に加熱した。1回の蛍光測定を、0.03秒毎に行った。融点を、Bio-Rad CFX Managerソフトウェアを使用して、融解曲線の一次導関数のピークから決定した。本発明のエステラーゼと親エステラーゼとの両方に同一の緩衝液が使用される限り、本発明のエステラーゼと親エステラーゼとの間のデルタTmに影響を及ぼすことなく、緩衝液の種類又は緩衝液濃度を変化させて使用し得る。

【0267】

次いで、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3のエステラーゼ、及び本発明のエステラーゼを、それらのTm値に基づいて比較した。pH5.2及びpH8.0で、0.8℃のΔTmを、同一の実験セット内でバリアントを比較するのに有意であるとみなした。Tm値は、少なくとも3回の測定の平均に対応する。

【0268】

結果
酸性条件下で配列番号1のエステラーゼと比較した耐熱性
本発明のエステラーゼの耐熱性を、実施例3.6に示すように評価した。配列番号1のエステラーゼと比較したTmの増加を、下記のTable 9(表9)に示す。

【0269】

【表9】

【0270】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 9(表9)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0271】

pH8で配列番号1のエステラーゼと比較した耐熱性
エステラーゼバリアントのTmもまた、pH8で評価した。配列番号1のエステラーゼと比較した本発明のエステラーゼのTmの増加を、下記のTable 10(表10)に示す。

【0272】

【表10】

【0273】

上記で列挙されているバリアントは、Table 10(表10)で列挙されている置換を除いて、配列番号1の正確なアミノ酸配列を有する。

【0274】

酸性条件下で配列番号2のエステラーゼと比較した耐熱性
配列番号2のエステラーゼと比較した本発明のエステラーゼのTmの増加を、下記のTable 11(表11)に示す。配列番号2のエステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較してTmが17.4℃改善されている。

【0275】

【表11】

【0276】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 11(表11)で列挙されている置換を除いて、配列番号2の正確なアミノ酸配列を有する。

【0277】

酸性条件下で配列番号3のエステラーゼと比較した耐熱性
配列番号3のエステラーゼと比較した本発明のエステラーゼのTmの増加を、下記のTable 12(表12)に示す。配列番号3のエステラーゼは、配列番号1のエステラーゼと比較して、pH5.2でTmが16.3℃改善されている。

【0278】

【表12】

【0279】

上記で列挙されているバリアントは、それぞれ、Table 12(表12)で列挙されている置換を除いて、配列番号3の正確なアミノ酸配列を有する。

【配列表】

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【国際調査報告】