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特表2024-545368Ｇｑ共役シグナル伝達および／または細胞の活性化のための超光感受性ニューロオプシンベースの光遺伝学的ツール
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-05
(54)【発明の名称】Ｇｑ共役シグナル伝達および／または細胞の活性化のための超光感受性ニューロオプシンベースの光遺伝学的ツール
(51)【国際特許分類】
C07K 14/705 20060101AFI20241128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241128BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20241128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241128BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241128BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
C07K14/705 ZNA
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K35/76
A61K35/761
A61K48/00
A61P43/00 105
A61P37/06
A61P25/00
A61P11/00
A61P3/00
A61P9/00
A61K38/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024558169
(86)(22)【出願日】2022-12-20
(85)【翻訳文提出日】2024-08-19
(86)【国際出願番号】 CN2022140440
(87)【国際公開番号】W WO2023116720
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/139751
(32)【優先日】2021-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524232484
【氏名又は名称】ジェンアンス バイオテクノロジー カンパニー， リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＡＮＳ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ユー， タオ
(72)【発明者】
【氏名】ダイ， ルイチォン
(72)【発明者】
【氏名】ウォン， ダンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ルオ， ミンミン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA361
4C084ZA362
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4C084ZB081
4C084ZB082
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4C084ZB212
4C084ZC211
4C084ZC212
4C087AA01
4C087AA02
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4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA36
4C087ZA59
4C087ZB08
4C087ZB21
4C087ZC21
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045CA53
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を迅速、可逆的且つ正確に活性化するための単離された光感受性オプシンに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された光感受性オプシンであって、Ｇｑシグナル伝達および/または細胞の活性化のために使用されることを特徴とする、単離された光感受性オプシン。
【請求項2】
生物に由来する単離されたオプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたオプシン。
【請求項3】
前記生物における野生型オプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたオプシン。
【請求項4】
動物に由来する単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたオプシン。
【請求項5】
前記動物における野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項6】
前記生物は、脊椎動物であることを特徴とする、請求項２に記載の単離されたオプシン。
【請求項7】
前記脊椎動物は、鳥類、爬虫類または魚類、両生類または哺乳類動物であり、好ましくは、前記動物は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、エミュー、レア、シギ、ヒクイドリ、七面鳥、ウズラ、ニワトリ、フォルコンリー、タカ、ハヤブサ、ハト、インコ、冠オウム、コンゴウインコ、オウム、スズメ目（例えば、鳴き鳥）、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ウグイスおよびスズメを含むが、これらに限定されない鳥類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、トカゲ、ヘビ、アリゲーター（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）、海亀、ワニおよびリクガメを含むが、これらに限定されない爬虫類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、ナマズ、ウナギ、サメおよびメカジキを含むが、これらに限定されない魚類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、ヒキガエル、カエル、イモリおよびサンショウウオを含むが、これらに限定されない両生類であることを特徴とする、請求項６に記載の単離されたオプシン。
【請求項8】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ニワトリに由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ニワトリに由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項9】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、海亀に由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、海亀に由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項10】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項11】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項12】
前記光は、３６０～５２０ｎｍ、好ましくは４５０～５００、より好ましくは４６０～４８０ｎｍの範囲、特に４７０ｎｍの波長を有することを特徴とする、請求項４に記載の単離されたオプシン。
【請求項13】
単離された核酸であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離されたオプシンをコードすることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項14】
キメラ遺伝子であって、請求項１３に記載の単離された核酸配列を含み、前記核酸配列は、適切な調節配列に作動可能に連結されることを特徴とする、キメラ遺伝子。
【請求項15】
ベクターであって、請求項１３に記載の単離された核酸または請求項１４に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項16】
前記ベクターは、真核ベクター、原核発現ベクター、ウイルスベクターまたは酵母ベクターであることを特徴とする、請求項１５に記載のベクター。
【請求項17】
前記ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたは昆虫ベクターであり、好ましくは、ここで、前記ベクターは、組み換えされたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＳ、ＡＡＶＯまたはＡＡＶ１０であることを特徴とする、請求項１６に記載のベクター。
【請求項18】
発現ベクターまたは遺伝子治療ベクターであることを特徴とする、請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
単離された細胞または細胞培養物であって、請求項１３に記載の単離された核酸、請求項１４に記載のキメラ遺伝子または請求項１５～１８のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とする、単離された細胞または細胞培養物。
【請求項20】
Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症の治療における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離されたオプシン、請求項１３に記載の単離された核酸、請求項１４に記載のキメラ遺伝子、請求項１５～１８のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項１９に記載の単離された細胞または細胞培養物の用途。
【請求項21】
被験者におけるＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症を治療する方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離されたオプシン、請求項１３に記載の単離された核酸、請求項１４に記載のキメラ遺伝子、請求項１５～１８のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項１９に記載の単離された細胞または細胞培養物を投与することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項22】
前記Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化から恩恵を受ける、例えば、アストロサイトの活性化、強力なＡＴＰ放出または増加されたニューロン活性から恩恵を受ける疾患または病症を含むが、これらに限定されないことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、例えば膵島細胞、免疫細胞、例えば中枢ニューロン、アストロサイト、グリア細胞等の神経細胞、筋細胞、骨格細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎臓細胞および肝臓細胞、心筋細胞または血管内皮細胞のような活性化細胞から恩恵を受ける疾患または病症を含むが、これらに限定されないことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記疾患または病症は、自己免疫疾患、発達疾患、代謝性疾患、精神疾患、呼吸器系疾患または心血管疾患であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
前記方法は、波長範囲が３６０～５５０ｎｍ、好ましくは４５０～５００ｎｍ、より好ましくは４６０～４８０ｎｍ、特に４７０ｎｍである青色光を印加することを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
前記方法は、波長が≧９２０ｎｍである光を使用して二光子活性化を実行することをさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、多くの細胞内シグナル伝達経路を調節し、最も集中的に研究されている薬物ターゲットポイントのいくつかを表す（Ｈａｕｓｅｒら、２０１７）。リガンドが結合した後、ＧＰＣＲは、構造変化を起こし、且つそれをヘテロ三量体Ｇタンパク質に伝達し、後者は、Ｇαサブユニットと緊密に結合したＧβγサブユニットとを含むマルチサブユニット複合体である。ヘテロ三量体ＧαサブユニットのサブファミリーであるＧｑタンパク質は、ＧＰＣＲのクラスに共役し、全身の神経伝達物質、感覚刺激およびホルモンに対する細胞応答を媒介する。それらの主な下流シグナル伝達ターゲットポイントは、リン脂質ホスファチジルイノシトールニリン酸（ＰＩＰ２）のイノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）への加水分解を触媒するホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣ－β）酵素を含む。ＩＰ３は、細胞内に蓄積されたＣａ２＋の細胞質への放出を引き起こし、Ｃａ２＋は、ＤＡＧとともにプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。Ｇｑ共役ＧＰＣＲおよび細胞内Ｃａ２＋放出のシグナル伝達メカニズムおよび生理学的機能を研究するために、化学遺伝学および光活性化可能な小分子を含むいくつかのツールを開発した。
【0002】
光遺伝学は、光応答性タンパク質を利用して、遺伝的特異性および高い時空間精度で細胞活動の光学的制御摂動を実現する。光感受性イオンチャネルおよびトランスポーターを使用した光遺伝学的ツールの初期の発見以来、様々な技術を開発しており、現在では細胞内のセカンドメッセンジャー、タンパク質の相互作用と分解、並びに遺伝子転写への光学的介入をサポートしている。創造的に設計されたＧｑ共役ロドプシン－ＧＰＣＲキメラであるＯｐｔ－ａ１ＡＲは、長時間の光刺激（６０ｓ）に応答して、細胞内Ｃａ２＋の増加を誘導することができる（Ａｉｒａｎら、２００９）。しかしながら、このようなツールは、おそらく光感受性および反応速度論に関連する制限性（Ｔｉｃｈｙら、２０１９）のため、広く使用されていない。ほとんどの動物は、ＧＰＣＲベースの光受容体を使用して光を検出し、ここで、光受容体は、タンパク質部分（オプシン）と、リガンドおよび発色団の両方として機能するビタミンＡ誘導体（レチナール）とを含む。これまでに数千のオプシンが同定されている。最近の２件の研究では、ニューロンのシナプス前終末抑制に蚊およびヤツメウナギ由来のＧｉベースのオプシンを使用したことが報告されており、特定の天然に存在する光受容体の効率的な光遺伝学的ツールとしての使用に適していることが簡単に実証される。Ｇｑシグナル伝達に関しては、哺乳動物の網膜神経節細胞の亜集団におけるメラニン（Ｏｐｎ４）は、Ｇｑ共役オプシンである。画像を形成しない視覚機能を媒介する。しかしながら、Ｏｐｎ４を異種発現するＨＥＫ２９３またはＮｅｕｒｏ－２ａ細胞は、弱い光応答を示し、培地中に追加のレチナールを必要とする。多くの脊椎動物におけるＯｐｎ５（ニューロオプシン（ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ））およびそのオルソログは、Ｇｉタンパク質に共役した紫外線（ＵＶ）感受性オプシンであることが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を迅速、可逆的且つ正確に活性化するための単離された光感受性オプシンに関する。
【0004】
第１の態様において、本発明は、Ｇｑシグナル伝達および/または細胞の活性化ために使用される、単離された光感受性オプシンに関する。
【0005】
いくつかの実施形態において、前記光は、３６０～５２０ｎｍ、好ましくは４５０～５００、より好ましくは４６０～４８０ｎｍの範囲内の波長を有する。
【0006】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシンは、生物に由来する単離されたオプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシンは、前記生物における野生型オプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0008】
いくつかの実施形態において、前記生物は、動物である。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシンは、動物に由来する単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、前記動物における野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記動物は、脊椎動物である。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記動物は、鳥類、爬虫類または魚類、両生類または哺乳類動物である。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記動物は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、エミュー、レア（rhea）、シギ（kiwi）、ヒクイドリ、七面鳥、ウズラ、ニワトリ、フォルコンリー、タカ、ハヤブサ、ハト、インコ、冠オウム、コンゴウインコ、オウム、スズメ目（例えば、鳴き鳥）、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ウグイスおよびスズメを含むが、これらに限定されない鳥類である。
【0014】
いくつかの実施形態において、前記動物は、トカゲ、ヘビ、アリゲーター（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）、海亀、ワニおよびリクガメを含むが、これらに限定されない爬虫類である。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記動物は、ナマズ、ウナギ、サメおよびメカジキを含むが、これらに限定されない魚類である。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記動物は、ヒキガエル、カエル、イモリおよびサンショウウオを含むが、これらに限定されない両生類である。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ニワトリに由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、前記ニワトリに由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、海亀に由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0020】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、前記海亀に由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0021】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0024】
いくつかの実施形態において、前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0025】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、細胞内Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を正確に活性化するための便利な光遺伝学的ツールとして使用されることができる。
【0026】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に記載の単離されたオプシンをコードする、単離された核酸に関する。
【0027】
いくつかの実施形態において、前記単離された核酸は、生物における野生型オプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体をコードし、それらのＧｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有する。
【0028】
第３の態様において、本発明は、第２の態様に記載の単離された核酸配列を含む、キメラ遺伝子に関し、当該核酸配列は、適切な調節配列に作動可能に連結される。
【0029】
第４の態様において、本発明は、第２の態様に記載の単離された核酸または第３の態様に記載のキメラ遺伝子を含む、ベクターに関する。
【0030】
前記ベクターは、真核ベクター、原核発現ベクター、ウイルスベクターまたは酵母ベクターである。
【0031】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたは昆虫ベクターである。
【0032】
好ましくは、前記ベクターは、組み換えＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＳ、ＡＡＶＯまたはＡＡＶ１０である。
【0033】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、発現ベクターである。
【0034】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、遺伝子治療ベクターである。
【0035】
第５の態様において、本発明は、第２の態様に記載の単離された核酸、第３の態様に記載のキメラ遺伝子または第４の態様に記載のベクターを含む、単離された細胞または細胞培養物に関する。
【0036】
例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃＯｐｎ５の発現は、青色光によって引き起こされる細胞内蓄積物からのＧｑ依存性Ｃａ２＋の増加を強力に媒介する。
【0037】
例えば、マウスの脳におけるｃＯｐｎ５発現アストロサイトの光遺伝学的活性化は、大量のＡＴＰ放出を誘導する。
【0038】
第６の態様において、本発明は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症の治療における、第１の態様に記載の単離されたオプシン、第２の態様に記載の単離された核酸、第３の態様に記載のキメラ遺伝子、第４の態様に記載のベクターまたは第５の態様に記載の単離された細胞または細胞培養物の用途に関する。
【0039】
ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学は、回路依存性の方法で、ニューロンを活性化し、且つ動物行動を制御するために使用されることができる。
【0040】
第７の態様において、本発明は、被験者におけるＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症，またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症を治療する方法に関し、前記方法は、第１の態様に記載の単離されたオプシン、第２の態様に記載の単離された核酸、第３の態様に記載のキメラ遺伝子、第４の態様に記載のベクターまたは第５の態様に記載の単離された細胞または細胞培養物を投与することを含む。
【0041】
いくつかの実施形態において、前記Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化から恩恵を受ける、例えば、アストロサイトの活性化、強力なＡＴＰ放出または増加されたニューロン活性から恩恵を受ける疾患または病症を含むが、これらに限定されない。
【0042】
いくつかの実施形態において、前記Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、例えば膵島細胞、免疫細胞、例えば中枢ニューロン、アストロサイト、グリア細胞等の神経細胞、筋細胞、骨格細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎臓細胞および肝臓細胞、心筋細胞または血管内皮細胞のような活性化細胞から恩恵を受ける疾患または病症を含むが、これらに限定されない。
【0043】
いくつかの実施形態において、前記疾患または病症は、糖尿病、免疫抑制性疾患、アルツハイマー病、うつ病、不安神経症、脳出血等を含むが、これらに限定されない。
【0044】
いくつかの実施形態において、前記方法は、波長範囲が３６０～５５０ｎｍ、好ましくは４５０～５００、より好ましくは４６０～４８０ｎｍである青色光を印加することを含む。
【0045】
いくつかの実施形態において、前記方法は、長波長（≧９２０ｎｍ）の光を使用して二光子活性化を実行することをさらに含む。
【0046】
本発明に記載の単離されたオプシンは、波長が３６０～５５０ｎｍ、好ましくは４５０～５００、より好ましくは４６０～４８０ｎｍの範囲内である光感受性である。具体的には、４７０ｎｍの青色光は、細胞内で最も強いＣａ２＋トランジェントを誘発し、これは、本発明に記載の単離されたオプシンが波長４７０ｎｍの光に超感受性であることを意味する。
【0047】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のすべての組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるｃＯｐｎ５が光誘導性Ｇｑシグナル伝達の強力な活性化を媒介することを示す。
【図2】ｃＯｐｎ５がＧｑシグナル伝達には共役するが、Ｇｉシグナル伝達には共役しないことを示す。
【図3】ｃＯｐｎ５が高い時空間分解能でＧｑシグナル伝達の光学的制御を高感度に媒介することを示す。
【図4】ｃＯｐｎ５がｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ、ｈＭ３Ｄｑまたはｏｐｎ４よりも光に対してより迅速且つ敏感な応答を媒介することを示す。
【図5】ｃＯｐｎ５がアストロサイトの活性化を効率的に媒介することを示す。
【図6】ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの活性化が、インビボで大量のＡＴＰフラッシュおよびニューロンの活性化を誘導することを示す。
【図7】ｃＯｐｎ５がアストロサイトにおける持続的且つ確実なＡＴＰ放出および末梢ニューロンの活性化を媒介することを示す。
【図8】ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学が神経回路依存性方法でマウスの行動を改変させることを示す。
【図9】ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学がニューロンを確実に活性化することを示す。
【図10】光ファイバーの注入位置および配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明では、複数の種に由来するオプシン、特にＯｐｎ５オルソログの能力を試験し、多くのオプシンが光誘導性Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化を感受性且つ強力に媒介することが発見された。
【0050】
好ましくは、前記Ｏｐｎ５オルソログは、ニワトリオルソログ（ｃＯｐｎ５と略記）または海亀オルソログ（ｔＯｐｎ５と略記）である。
【0051】
Ｏｐｎ５、特にｃＯｐｎ５に対する詳細な特性評価により、それは、青色光に対して超敏感であり（μＷ／ｍｍ２レベル、既存のＧｑ共役オプシンベースのツールｏｐｔｏ－ａ１ＡＲおよびｏｐｎ４感度が～３桁高い）、高い時間（１０ｍｓ光パルスに応答し、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲまたはｏｐｎ４よりも～３桁速い）および空間（亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌ）レベル）分解能を有し、発色団を添加する必要もない。具体的には、内因性レチナールで十分であり、レチナールを添加する必要はない。
【0052】
本発明はさらに、ｃＯｐｎ５光遺伝学が、効率的な方法として、インビボでアストロサイトを活性化して大量のＡＴＰ放出を誘導し、ニューロンを活性化して自由に動くマウスでロバストネス行動変化を生み出すために用いられることを証明する。これらの発見により、ｃＯｐｎ５およびおそらく他のＯｐｎ５オルソログは、強力な光遺伝学的ツールとして使用されることができ、非興奮性細胞および興奮性細胞の両方におけるＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化に関連する生理学的および行動的機能の実験的研究をサポートする。
【0053】
ｃＯｐｎ５がＧｑシグナル伝達の光遺伝学的活性化および／または細胞の活性化を媒介する
具体的には、本発明では、ニワトリ、海亀、ヒトおよびマウスに由来するＯｐｎ５オルソログを試験して（それらは、互いに８０～９０％のタンパク質配列同一性を有する）、それらがＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における青色光誘導性Ｇｑシグナル伝達活性化を媒介する能力を有するかどうかを決定するために試験する。青色光を刺激に使用し、赤色細胞内カルシウム指示薬ＣａｌｂｒｙｔｅＴＭ６３０ＡＭ染料を使用して、モニタリング相対的なＣａ２＋応答をモニタリングする。ニワトリ（ｃＯｐｎ５）および海亀（ｔＯｐｎ５）に由来するＯｐｎ５オルソログは、Ｃａ２＋シグナル（～３ΔＦ／Ｆ）伝達の即時且つ強力な光誘導性増加を媒介するが、ヒトまたはマウスＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では、ヒト又はマウスのＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では光の影響が観察されない。ニワトリオルソログで例示されるように、ｃＯｐｎ５は、ＥＧＦＰ－ＣＡＡＸ膜マーカーと共局在しており、これは、細胞膜に効率的に輸送されることを示す。培地に外因性レチナールを添加する必要なく、これは、内因性レチナールがｃＯｐｎ５を機能させるのに十分であることを示唆する。Ｃａ２＋シグナルは、細胞外Ｃａ２＋の除去に耐性があるため、これは、細胞内蓄積からのＣａ２＋の放出を示す。両方のｃＯｐｎ５発現細胞において、Ｇｑタンパク質阻害剤（例えば、ＹＭ－２５４８９０、高選択性Ｇｑタンパク質阻害剤）のプレインキュベーションは、光誘導性Ｃａ２＋トランジェントを可逆的に除去する。ｃＯｐｎ５を発現するがヒトＯＰＮ５を発現しない細胞において、ＩＰ３の迅速分解産物であるイノシトールリン酸（ＩＰ１）レベルの光誘導性の増加が検出され、さらに、ＹＭ－２５４８９０による治療では、このような増加の程度が減少する。ｃＯｐｎ５発現細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において、青色光も、ＰＫＣ活性に依存性方式でＭＡＲＣＫＳタンパク質（推定ＰＫＣターゲットポイント）のリン酸化を引き起こす。対照的に、レチナールの存在下で、青色光照射は、ヒトおよびマウスＯｐｎ５を発現する細胞におけるｃＡＭＰレベルを効率的に低下させるが、レチナールの非存在下で、青色光照射は、ｃＯｐｎ５を発現する細胞においてこのような効果がない。総合すると、これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光照射がｃＯｐｎ５とＧｑシグナル伝達経路との共役を可能にしていることが裏付ける。
具体的には、本発明では、ニワトリ、海亀、ヒトおよびマウスに由来するＯｐｎ５オルソログを試験して（それらは、互いに８０～９０％のタンパク質配列同一性を有する）、それらがＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における青色光誘導性Ｇｑシグナル伝達活性化を媒介する能力を有するかどうかを決定するために試験する。青色光を刺激に使用し、赤色細胞内カルシウム指示薬ＣａｌｂｒｙｔｅＴＭ６３０ＡＭ染料を使用して、モニタリング相対的なＣａ２＋応答をモニタリングする。ニワトリ（ｃＯｐｎ５）および海亀（ｔＯｐｎ５）に由来するＯｐｎ５オルソログは、Ｃａ２＋シグナル（～３ΔＦ／Ｆ）伝達の即時且つ強力な光誘導性増加を媒介するが、ヒトまたはマウスＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では、ヒト又はマウスのＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では光の影響が観察されない。ニワトリオルソログで例示されるように、ｃＯｐｎ５は、ＥＧＦＰ－ＣＡＡＸ膜マーカーと共局在しており、これは、細胞膜に効率的に輸送されることを示す。培地に外因性レチナールを添加する必要なく、これは、内因性レチナールがｃＯｐｎ５を機能させるのに十分であることを示唆する。Ｃａ２＋シグナルは、細胞外Ｃａ２＋の除去に耐性があるため、これは、細胞内蓄積からのＣａ２＋の放出を示す。両方のｃＯｐｎ５発現細胞において、Ｇｑタンパク質阻害剤（例えば、ＹＭ－２５４８９０、高選択性Ｇｑタンパク質阻害剤）のプレインキュベーションは、光誘導性Ｃａ２＋トランジェントを可逆的に除去する。ｃＯｐｎ５を発現するがヒトＯＰＮ５を発現しない細胞において、ＩＰ３の迅速分解産物であるイノシトールリン酸（ＩＰ１）レベルの光誘導性の増加が検出され、さらに、ＹＭ－２５４８９０による治療では、このような増加の程度が減少する。ｃＯｐｎ５発現細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において、青色光も、ＰＫＣ活性に依存性方式でＭＡＲＣＫＳタンパク質（推定ＰＫＣターゲットポイント）のリン酸化を引き起こす。対照的に、レチナールの存在下で、青色光照射は、ヒトおよびマウスＯｐｎ５を発現する細胞におけるｃＡＭＰレベルを効率的に低下させるが、レチナールの非存在下で、青色光照射は、ｃＯｐｎ５を発現する細胞においてこのような効果がない。総合すると、これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光照射がｃＯｐｎ５とＧｑシグナル伝達経路との共役を可能にしていることが裏付ける。
【0054】
敏感且つ正確であるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学
具体的には、本発明では、ｃＯｐｎ５の光活性化特性を特徴付ける。ｃＯｐｎ５を細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で異種発現することができる。Ｏｐｎ５は、これまで紫外線（ＵＶ）感受性光受容体であると考えられているが、固定光強度（１００μＷ／ｍｍ２）で３６５～６３０ｎｍの範囲内の一連の波長をプロットすると、４７０ｎｍの青色光が最も強いＣａ２＋トランジェントを引き起こすことを示すが、ＵＶＡ光（３６５および３９５ｎｍ）は、効率が低く、より長い波長の可視光（５６１ｎｍまたは以上）は、まったく効果がない。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する様々な光持続時間の影響を試験し、短い光パルス（１、５、１０、２０、５０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）による刺激では、光持続時間が１０ｍｓを超える際にＣａ２＋応答が飽和モードに達することを示す。この光強度（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）下で、光持続時間を長くしても、Ｃａ２＋シグナル振幅をさらに増加させまい。異なる強度で４７０ｎｍの光を照射すると、～４．８μＷ／ｍｍおよび１６μＷ／ｍｍの青色光がそれぞれ最大の約半分および最大応答を生成することが分かる。これらのデータは、ｃＯｐｎ５の光感受性が、一般的な光遺伝学的ツールであるチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）の報告値より２～３桁高いことを示す。総合すると、本発明の結果は、ｃＯｐｎ５がレチナールを追加しなくても単一成分の光遺伝学的ツールとして機能できること、ｃＯｐｎ５が青色光に超敏感であること、その完全な活性化には低い光強度（１６μＷ／ｍｍ２）と短い持続時間（１０ｍｓ）が必要であることを示す。
具体的には、本発明では、ｃＯｐｎ５の光活性化特性を特徴付ける。ｃＯｐｎ５を細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で異種発現することができる。Ｏｐｎ５は、これまで紫外線（ＵＶ）感受性光受容体であると考えられているが、固定光強度（１００μＷ／ｍｍ２）で３６５～６３０ｎｍの範囲内の一連の波長をプロットすると、４７０ｎｍの青色光が最も強いＣａ２＋トランジェントを引き起こすことを示すが、ＵＶＡ光（３６５および３９５ｎｍ）は、効率が低く、より長い波長の可視光（５６１ｎｍまたは以上）は、まったく効果がない。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する様々な光持続時間の影響を試験し、短い光パルス（１、５、１０、２０、５０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）による刺激では、光持続時間が１０ｍｓを超える際にＣａ２＋応答が飽和モードに達することを示す。この光強度（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）下で、光持続時間を長くしても、Ｃａ２＋シグナル振幅をさらに増加させまい。異なる強度で４７０ｎｍの光を照射すると、～４．８μＷ／ｍｍおよび１６μＷ／ｍｍの青色光がそれぞれ最大の約半分および最大応答を生成することが分かる。これらのデータは、ｃＯｐｎ５の光感受性が、一般的な光遺伝学的ツールであるチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）の報告値より２～３桁高いことを示す。総合すると、本発明の結果は、ｃＯｐｎ５がレチナールを追加しなくても単一成分の光遺伝学的ツールとして機能できること、ｃＯｐｎ５が青色光に超敏感であること、その完全な活性化には低い光強度（１６μＷ／ｍｍ２）と短い持続時間（１０ｍｓ）が必要であることを示す。
【0055】
ｃＯｐｎ５の性能をｏｐｔｏ－ａ１ＡＲの性能と比較し、ここで、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲは、ロドプシンをＧｑ共役アドレナリン受容体と混合することによって操作されたキメラＧＰＣＲである。以前に報告されたプロトコールに従って、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゆっくりと小さな（～０．５ΔＦ／Ｆ）Ｃａ２＋シグナル増加を引き起こすには、非常に長時間の強い照射（６０ｓ、７ｍＷ／ｍｍ２）への曝露が必要であり、１５秒の照射では効果がないことが発見される。ｃＯｐｎ５の性能をｏｐｎ４の性能と比較し、ｏｐｎ４は、Ｇｑシグナル伝達活性化のツールであると報告されている天然オプシンである。ｏｐｎ４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゆっくりとした（～１ΔＦ／Ｆ）Ｃａ２＋シグナル増加を引き起こすには、強い照射（２５ｓ、４０ｍＷ／ｍｍ２）への長時間の曝露および追加のレチナールが必要であることが発見される。従って、既存オプシンベースのツール（ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲおよびｏｐｎ４）と比較して、ｃＯｐｎ５は、光感受性がはるかに高く（感度が～３桁高い）、必要な曝露時間（１０ｍｓ ｖｓ． ６０ｓ）がはるかに短く、より強い応答を生成する。
【0056】
さらに、ｃＯｐｎ５の性能を、一般的なＧｑ共役化学遺伝学ツールｈＭ３Ｄｑの性能と比較し、ここで、ｈＭ３Ｄｑは、外因性小分子リガンドクロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ）を添加することによって活性化される。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の光誘導性活性化、およびｈＭ３Ｄｑ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＮＯ誘導性活性化は、類似なＣａ２＋シグナルのピーク値応答振幅を有する。同時に、ｈＭ３Ｄｑ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、より速く、より時間的に正確な応答を示し、より速い回復時間を示す。これらの結果は、ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学がｈＭ３Ｄｑよりも時間的精度の点でより制御可能であることを示す。
【0057】
ｃＯｐｎ５光遺伝学により、細胞活動を空間的に正確に制御することができる。個々のｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の亜細胞領域に短時間の光刺激（６３ｍｓ）を限定すると、個々の細胞が即時に活性化される。興味深いことに、細胞が高度に密集した領域では、Ｃａ２＋シグナルが周囲の細胞に伝播し、それによりまだ未確認のメカニズムによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞間の細胞間コミュニケーションが示唆される。新生児マウスの脳から調製された初代アストロサイト培養物において、ｃＯｐｎ５およびＥＧＦＰマーカータンパク質のバイシストロン性発現のためのＡＡＶベクターを使用してｃＯｐｎ５を発現する。Ｃａｌｂｒｙｔｅ ６３０ ＡＭ染料を使用してＣａ２＋レベルをモニタリングしたところ、青色光を使用してｃＯｐｎ５発現アストロサイトに照射すると、強力なＣａ２＋トランジェント（～８ΔＦ／Ｆ）が生じることが分かる。光刺激（６３ｍｓ）が個々のｃＯｐｎ５発現アストロサイトの亜細胞領域のみに正確に制限される場合、Ｃａ２＋シグナルが個々の細胞内で伝播されることが観察される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での試験と同様に、刺激されたアストロサイトからより遠位の刺激されていないアストロサイトへのＣａ２＋シグナルの緩やかな波状伝播が観察される。従って、これらの実験は、ｃＯｐｎ５光遺伝学によって正確な空間制御が可能であることを確認し、最初に神経化学的および機械的刺激を使用して発見したアストロサイトネットワークの動態を研究することが有用である可能性があることを示唆する。
【0058】
インビボで大量のＡＴＰ放出およびニューロン活性化を誘導するアストロサイトのｃＯｐｎ５光遺伝学的活性化
ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学のインビボでの性能を試験する。アストロサイトは、中枢神経系における非興奮性細胞の重要な集団を表し、これまでに光遺伝学的ツールは当該集団で限られた成功しか収めていない。ＡＴＰは、アストロサイト間のコミュニケーションメッセンジャーであることが知られているが、ＡＴＰ放出に対する細胞内Ｃａ２＋のリアルタイムの影響はまだ視覚化されていない。最近報告されたＧＰＣＲ活性化ベースの超高感度ＡＴＰセンサーＧＲＡＢＡＴＰを使用して、細胞外ＡＴＰレベルの変化をモニタリングする。具体的には、ＧｆａＡＢＣ１Ｄプロモーター（アストロサイトの遺伝子発現を駆動するために一般に使用される）含有ＡＡＶベクターを注入した後、マウスＳ１感覚皮質でｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰセンサーを発現する。
ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学のインビボでの性能を試験する。アストロサイトは、中枢神経系における非興奮性細胞の重要な集団を表し、これまでに光遺伝学的ツールは当該集団で限られた成功しか収めていない。ＡＴＰは、アストロサイト間のコミュニケーションメッセンジャーであることが知られているが、ＡＴＰ放出に対する細胞内Ｃａ２＋のリアルタイムの影響はまだ視覚化されていない。最近報告されたＧＰＣＲ活性化ベースの超高感度ＡＴＰセンサーＧＲＡＢＡＴＰを使用して、細胞外ＡＴＰレベルの変化をモニタリングする。具体的には、ＧｆａＡＢＣ１Ｄプロモーター（アストロサイトの遺伝子発現を駆動するために一般に使用される）含有ＡＡＶベクターを注入した後、マウスＳ１感覚皮質でｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰセンサーを発現する。
【0059】
頭を固定して覚醒し、正常に行動するマウスからのＧＲＡＢＡＴＰシグナルを二光子イメージングする。驚くべきことに、イメージングのために送達された９２０ｎｍの光自体は、ｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰを発現するマウスでは大量のＡＴＰフラッシュを引き起こすが、ＡＴＰセンサーを発現するがｃＯｐｓ５発現が欠くマウスではそうではない。ＡＴＰシグナルを刺激するために青色光パルスは必要ない。個々のＡＴＰフラッシュの直径は、通常２０～１００μｍの範囲内であり、且つ～１分間持続する。～１分間の最初の静止期間の後、フラッシュ周波数は、徐々に増加し、～５分間内にピーク値に達し、イメージング領域（６４０×６４０μｍ２）内で～５０回フラッシュ／分間のレベルに達する。さらに、繰り返しの試験では、高周波ＡＴＰフラッシュも発生する。ＧＲＡＢＡＴＰのみを発現するマウスでは、散発的なＡＴＰイベント（イメージング領域内で～０．３回フラッシュ／分間）が観察され、リポ多糖類（ＬＰＳ）の腹腔内注射による炎症誘発性治療後の８時間、ＡＴＰフラッシュイベントは、基礎条件（～２回フラッシュ／分間）のほぼ６倍に増加するが、かなり安定した周波数を示し、これは、炎症が脳内でＡＴＰ放出を誘導することが確認される。ｃＯｐｎ５発現マウスで観察されたＡＴＰフラッシュ周波数は、Ｏｐｎ５を発現しないマウスの炎症誘発性治療後のフラッシュ周波数よりも～２５倍高いことを考えると、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの光活性化がインビボで連続して大量のＡＴＰ放出を誘導することを実証する。
【0060】
アストロサイトは、ＡＴＰを放出し、他のグリア伝達物質もニューロン受容体に作用して、ニューロン活性を調節する。ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化を使用して、頭を固定し、覚醒し、正常に行動するマウスにおけるニューロンＣａ２＋シグナルを二光子イメージングする。ｃＯｐｎ５発現細胞（ｎ＝４０６）は、ＧＦＡＰ染色（ｎ＝３９７）と共局在するが、ＧＣａＭＰ７ｂ発現ニューロンとは共局在しない。生の追跡例およびコホートデータは、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの活性化が０～５分間と比較して１５～２０分間のニューロン活性を有意に増加させることを示す。ｃＯｐｎ５は、アストロサイトで厳密に発現され、これは、ｃＯｐｎ５発現細胞およびＧＦＡＰ染色シグナル（ニューロンにおけるＧＣａＭＰ７ｂシグナルとは異なる）の共局在によって確認される。ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの光活性化がインビボで末梢ニューロンの活性を増加させることが実証される。さらに、本発明は、二光子イメージングに使用されるパルスレーザーの長波長（９２０ｎｍ）光がｃＯｐｎ５を活性化できることを示し、ｃＯｐｎ５が二光子光遺伝学を有する可能性があることを示唆する。
【0061】
ニューロンを活性化し且つ動物行動を調節するｃＯｐｎ５光遺伝学
ニューロンにおけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の応用を調査する。まず、ｃＯｐｎ５が光誘導性Ｃａ２＋シグナルを媒介できるかどうかを検査する。ＡＡＶおよび汎ニューロンＳＹＮプロモーターを使用して、マウス皮質ニューロンでｃＯｐｎ５および遺伝的にコードされたＣａ２＋センサーｊＲＧＥＣＯ１ａを発現する（図８ａ）。脳切片サンプルでは、青色光パルス（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４７３ｎｍ）を印加することにより、ニューロンにおけるＣａ２＋トランジェントを確実に誘発する（図８ｂ、図８ｃ）。従って、ｃＯｐｎ５は、ニューロンにおいて光誘導性活性化を実現することもできる。
ニューロンにおけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の応用を調査する。まず、ｃＯｐｎ５が光誘導性Ｃａ２＋シグナルを媒介できるかどうかを検査する。ＡＡＶおよび汎ニューロンＳＹＮプロモーターを使用して、マウス皮質ニューロンでｃＯｐｎ５および遺伝的にコードされたＣａ２＋センサーｊＲＧＥＣＯ１ａを発現する（図８ａ）。脳切片サンプルでは、青色光パルス（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４７３ｎｍ）を印加することにより、ニューロンにおけるＣａ２＋トランジェントを確実に誘発する（図８ｂ、図８ｃ）。従って、ｃＯｐｎ５は、ニューロンにおいて光誘導性活性化を実現することもできる。
【0062】
運動皮質、海馬および背側線条体からの切片サンプルにおけるニューロンの電気生理学的性質に対する光誘導性ｃＯｐｎ５活性化の影響を研究する（図８ｄ）。２種類の活性化パターンが観察される。記録されたほとんどのニューロンでは、青色光パルスは、電圧クランプモードで小さな脱分極電流（～２０ｐＡ）を誘導し、電流クランプモードで活動電位の遅延するが活発な放電を誘発する（図８ｅ、左側、ｎ＝１２個のニューロン）。より高い周波数の光パルスでは、ｃＯｐｎ５は、最初の光パルスの後、より短い潜伏期間（約５秒～約３秒）でより多くのスパイクを駆動するが、内部向き電流は、顕著な影響を受けない（図９ａ）。別のニューロン亜集団において、短時間の光パルスは、急速に強力な内部向き電流（１００～１０００ｐＡ）を引き起こし、活動電位のバースト発火（ｂｕｒｓｔｉｎｇｆｉｒｉｎｇ）を駆動する（図８ｅ、右側、ｎ＝６個のニューロン）。ニューロンは、１０Ｈｚ、１０ｍｓ／パルスで繰り返し刺激され、光刺激の繰り返しの試験において発火速度（ｆｉｒｉｎｇｒａｔｅ）の非減衰パターンを示す（図９ｂ）。注意すべきことに、ＣｈＲ２光遺伝学によって生成される活動電位とは異なり、ｃＯｐｎ５光刺激によって誘発される活動電位は、光パルスに時間ロックされていない。最後に、動物行動の調節におけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の用途を評価する。外側視床下部（ＬＨ）は、報酬の処理および摂食行動に機能することが知られている脳の中枢である。ＶＧＡＴ－ＣｒｅマウスのＬＨＧＡＢＡ作動性ニューロンでｃＯｐｎ５を発現させ、光パルスを自由に行動するマウスのＬＨに送達するために光ファイバーを移植する（図８ｇ）。ＬＨＧＡＢＡニューロンの活性化が摂食行動５６を駆動するという以前に発見と一致し、光刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ／パルス、４７３ｎｍ、０．７５ｍＷ、線維先端から出力する）は、ｃＯｐｎ５発現マウスにおいて食物摂取の顕著な増加を誘発するが、ＥＧＦＰを発現する対照マウスにおいて食物摂取の顕著な増加を引き起こさない（図８ｈ）。食物採餌行動課題を使用して、不定帯（ＺＩ）におけるｃＯｐｎ５媒介性ＧＡＢＡニューロンの光遺伝学的活性化の効果も試験し（図８ｉ）、ここで、不定帯は、既知の強迫的な摂食を駆動する領域である。ＥＧＦＰ発現マウスと比較して、ｃＯｐｎ５発現マウスは、繰り返した光刺激後、高脂肪食物ペレットの採餌時間が顕著な増加する（図８ｊ）。応答プロファイルを特徴付けるために、ＬＨおよびＺＩのｃＯｐｎ５発現ニューロンから電気生理学的記録を実行する。全脳切片により、光ファイバーの注入部位および配置を確認する（図１０ａ～１０ｃ）。注意すべきことに、マウスは、点灯時に前記行動（摂食行動または高脂肪食物の採餌行動）を維持し、消灯すると即時にこのような行動を停止する。従って、ｃＯｐｎ５は、動物の行動状態を迅速、正確且つ可逆的に効率的に調節する。
【0063】
ここで、本発明は、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化のための極めて効果的な光遺伝学的ツールとしての本発明のＯｐｎ５の用途を実証する。以前の研究では、哺乳動物Ｏｐｎ５がＵＶ感受性Ｇｉ共役オプシンとして特徴付けられ、Ｏｐｎ５（例えば、ｃＯｐｎ５を発現するか、またはｔＯｐｎ５を発現する）を発現する哺乳動物細胞において、可視青色光は、急速なＣａ２＋トランジェント、ＩＰ１蓄積およびＰＫＣ活性化を誘導する可能性があるという驚くべき発見を提示する。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５）は、マウスのアストロサイトにおいて、インビボでの光による強力なＡＴＰ放出を効果的に媒介し、ニューロン活性を増加させる。本発明は、Ｏｐｎ５、特にｃＯｐｎ５が、ニューロンの迅速、強力且つ可逆的な光学活性化を可能にし、動物行動の選択的調節に適用されることを示す。重要なことに、本発明におけるＯｐｎ５（例えば、ｃＯｐｎ５）は、外因性発色団を必要としない、強力で使いやすい単一の成分系である。本発明は、Ｏｐｎ５ベースの光遺伝学、例えば、ｃＯｐｎ５ベースの光遺伝学が、非興奮性細胞および興奮性細胞におけるＧｑ共役シグナル伝達および／または活性化細胞によって調節される重要な生理学的および行動的機能を研究するために使用できる技術となることを想定する。
【0064】
表６は、ｃＯｐｎ５と他の光遺伝学的ツールとの応答振幅、光感受性、時間分解能および追加の発色団の必要性を直接比較することにより、ｃＯｐｎ５の可能にする特性を示す。ｃＯｐｎ５発現細胞では、強度１６μＷ／ｍｍ２の１０ｍｓ青色光パルスのみが、ピーク値振幅３～８ΔＦ／ＦのＣａ２＋シグナルの急速な増加を引き起こすことができる。対照的に、本発明に先立って、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲまたは哺乳動物Ｏｐｎ４（Ｇｑシグナル伝達のために提案された２種の光遺伝学的ツール）の活性化には、約３倍の光強度（７～４０ｍＷ／ｍｍ２）および長時間の露光（２０～６０秒）が必要であり、弱いＣａ２＋シグナル（０．２５～０．５ΔＦ／Ｆ）しか生成しないことが明らかになる。従って、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲまたは哺乳動物Ｏｐｎ４は、内因性Ｇｑ共役受容体の急速な活性化プロファイルを模倣することはできず、ここで、内因性Ｇｑ共役受容体は、通常、対応するリガンドの印加後サブ秒内に強いＧｑシグナル伝達を引き起こす。ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトおよびニューロンの光学活性化に応答してインビボで示される顕著な生理学的および行動的効果は、ｃＯｐn５光遺伝学の能力を裏付ける。対照的に、最近の体系的な特徴付けでは、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ-およびＯｐｎ４媒介性光遺伝学的刺激は、Ｃａ２＋シグナルの振幅を増加せず、長時間の照射後でも、Ｃａ２＋トランジェントおよびシナプスイベントの周波数をわずかに調節するだけであることを示す（Ｇｅｒａｓｉｍｏｖら、２０２１、Ｍｅｄｅｒｏｓら、２０１９）。ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲおよびＯｐｎ４媒介性光遺伝学に関連する光感受性、時間分解能および応答振幅の制限を克服することにより、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）は、大量の細胞および組織におけるＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化のメカニズムおよび機能の研究において幅広い適用性を有するであろう。
【0065】
本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）に基づく光遺伝学は、安全性および利便性の利点も有する。多くの種のＯｐｎ５がＵＶ応答性であることが報告されているが（Ｋｏｊｉｍａら、２０１１）、ｃＯｐｎ５は、４７０ｎｍの青色光によって最適に活性化され、青色光の透過性は、ＵＶの透過性よりも優れ、ＵＶに関連する細胞毒性を回避する。光に対する超感受性により、潜在的な加熱アーチファクト（ｈｅａｔｉｎｇａｒｔｉｆａｃｔ）も最小限に抑えられる。長波長（≧９２０ｎｍ）光を使用して二光子活性化することができ、これは、パルスレーザーを使用してより深い組織活性化に適していることを示す。ｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５は、外因性レチナールを必要とせずに、光によって強力且つ再現可能に活性され、これは、ｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５が内因性レチナールに共有結合する双安定オプシンであるため、光漂白に耐性があるためと考えられる（ＫｏｙａｎａｇｉおよびＴｅｒａｋｉｔａ、２０１４、ＴｓｕｋａｍｏｔｏおよびＴｅｒａｋｉｔａ、２０１０）。対照的に、Ｏｐｎ４の哺乳動物実験では、追加のレチナールが必要であり、応答時間が長く、且つ光感受性が低い。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）は、実験中に化合物を組織に送達する負担を回避するため、単一成分系としてインビボ研究に特に有用である。
【0066】
化学遺伝学およびアンケージング（ｕｎｃａｇｉｎｇ）ツールと比較して、本発明のＯｐｎ５の光遺伝学（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５の光遺伝学）は、いくつかの重要な利点をさらに提供する。時間的にははるかに正確であり、単細胞または亜細胞の空間分解能を提供する。ＣＮＯ／ｈＭ３Ｄｑ媒介性化学遺伝学は、非興奮性細胞例（例えば、脳内のアストロサイト）の生理学的および行動的機能（Ａｇｕｌｈｏｎら、２０１３、Ｓｈｅｎら、２０２１）の研究に使用されているが、インビボでの使用には、通常、ＣＮＯが標的細胞および組織に到達するまで数分を必要とすることがよくある。化合物の拡散性の性質は、細胞および亜細胞の分解能でのＧｑシグナル伝達の化学遺伝学的刺激がほぼ不可能であることを示唆する。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）は、ケージド化合物ベースの「アンケージング」ツール（例えば、ケージドカルシウムおよびケージドＩＰ３）とも異なり、これらのツールは、化合物の事前ロードを必要とし、且つＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化に関連するＣａ２＋関連経路を部分的にしか模倣しないためである。例えば、内因性ＧＰＣＲを標的とするケージドグルタミン酸塩およびケージドＡＴＰ（Ｅｌｌｉｓ－Ｄａｖｉｅｓ、２００７、Ｌｅｚｍｙら、２０２１）等の他の「アンケージング」ツールも存在する。しかしながら、これらのケージド化合物は、細胞外培地または細胞内の細胞質への導入を必要とするため、行動動物への応用を制限する（ＡｄａｍｓおよびＴｓｉｅｎ、１９９３ｂ）。「アンケージング」ツールに対する本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）の利点は、実験によって明らかに実証され、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｓ５またはｔＯｐｎ５）は、既存のＣｈＲ２ベースのツールと同様であり、動物行動を調節するために同様に容易に使用されることができる。
【0067】
本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｓ５またはｔＯｐｎ５）の光遺伝学は、細胞内のＧｑシグナル伝達および／または細胞の正確な活性化に特に適しており、その後細胞内に蓄積されたＣａ２＋の放出を引き起こし、且つＰＫＣを活性化する。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）は、例えば、細胞膜を貫通して陽イオンを輸送するＣｈＲ２またはその変異体等の現在のチャネルベースの光遺伝学的ツールとは異なる。細胞膜電位、ひいては活動電位の放電を制御することにより、ＣｈＲ２およびその変異体は、神経回路の解剖に多大な貢献をしているが、それらの成功は、活動電位を生成する活性イオンチャネルを欠く非興奮性細胞の研究においてはさらに限定的である（Ｇｏｕｒｉｎｅら、２０１０）。非興奮性細胞に応用されることに加えて、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）の光遺伝学は、ニューロンにおけるＧｑシグナル伝達および／またはニューロンの活性化を刺激し、回路依存的に動物行動を制御することもできる。注意すべきことに、Ｇｑ共役ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を無差別に動員し、受容体および細胞特異的な方法で可変の下流シグナル伝達を生成する可能性がある。実際に、同じ光照明パラメーターが異なるニューロンで異なる活性化パターンを生成することが観察される。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）媒介性光遺伝学的活性化は、ＣｈＲ２のようにニューロンにおいて厳密に時間ロックされた活動電位発火（ｆｉｒｉｎｇ）を正確に生成するわけではない。これは、人工的に同期されたニューロンの活性化を回避できるため、有用である可能性がある。しかしながら、活動電位発火の正確な時間制御が必要な場合、イオンチャネルベースの光遺伝学的ツールの使用を勧める。
【0068】
技術の進歩に加えて、我々の発見は、インビボでのアストロサイトのシグナル伝達および／または活性化に対していくつかの機能的な効果がある可能性がある。ＡＴＰは、重要なグリア伝達物質であると考えられているが、以前の研究により複数の放出メカニズムが明らかになり、これらの放出メカニズムは、処理方法、細胞外Ｃａ２＋の存在、並びに細胞および組織調製サンプルの正確な形態に依存する（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏら、２０１４、ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＡｔｔｗｅｌｌ、２０１０）。さらに、通常、ＡＴＰ放出の存在を間接的にモニタリングする。アストロサイトの活性化がＡＴＰ放出を引き起こすかどうか、もしそうであればこのような放出がインビボでどのように現れるかは不明である。ここで、我々は、アストロサイト内のＧｑシグナル伝達経路の刺激がＡＴＰフラッシュの形態で大量のＡＴＰ放出を引き起こすことを初めで実証した。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）の光遺伝学は、ＡＴＰ放出の分子および細胞メカニズムを研究するための理想的な技術を提供する。ＡＴＰに加えて、アストロサイトの活性化により、Ｄ－セリン、グルタミン酸およびＧＡＢＡ等の他のグリア伝達物質の放出も引き起こす。ＡＴＰは、アデノシン等の他の代謝産物にも変換される。グリア伝達物質およびその代謝産物は、ニューロンの興奮性およびシナプス強度に複雑な調節効果を及ぼす可能性がある。例えば、ＡＴＰは、様々なＰ２ＸおよびＰ２Ｙ受容体を介してニューロンを活性化することができるが、アデノシンは、Ａ１受容体を介してニューロンを強力に阻害する（Ｌｅｚｍｙら、２０２１、Ｚｈａｎｇら、２００３）。これらの異なる効果がどのように統合されて、インビボでニューロン活動を調節するのかは不明である。ここで、我々は、ｃＯｐｎ５発現アストロサイトの光遺伝学的活性化がマウスＳ１皮質におけるニューロンを顕著に刺激することを明らかにする。従って、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）の光遺伝学は、アストロサイトとニューロンとの間の複雑な相互作用の分子、細胞および回路メカニズムを分析するための基礎を築く。インビボ実験は、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）が光遺伝学的プローブおよびイメージングセンサー（例えば、遺伝的にコードされたＣａ２＋指示薬およびＧＰＣＲベースの神経伝達物質センサー）と適合性があることを示す。本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）は、これらのセンサーとともに、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を一時的に活性化し、同時に関連効果をモニタリングするための全光学的アプローチを可能にする可能性がある。
【0069】
総合すると、本発明は、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）が、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を迅速、可逆的且つ正確な活性化するための青色光感受性オプシンとして作用することを実証する。本発明は、本発明のＯｐｎ５（特にｃＯｐｎ５またはｔＯｐｎ５）を、非興奮性細胞およびニューロンを活性するための強力で使いやすい光遺伝学的ツールとして確立する。Ｇｑ共役ＧＰＣＲの重要性を考慮すると、ｃＯｐｎ５は、すべての主な細胞種類および組織におけるＧｑシグナル伝達のメカニズムおよび機能の詳細な解明に幅広い応用が期待される。
【0070】
特定の実施形態および実施例の説明は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。当業者であれば、実質的に同様の結果を生み出すために、様々な重要でないパラメーターを変更または修正できることが容易に理解されるであろう。
【0071】
実施例
材料および方法：
材料および方法：
【表1】
【0072】
【表2】
【0073】
【表3】
【0074】
【表4】
【0075】
【表5】
【0076】
【表6-1】
【表6-2】
【0077】
実施例１．Ｇｑシグナル伝達の光遺伝学的活性化を媒介するｃＯｐｎ５
ニワトリ、海亀（ｔｕｒｔｌｅ）、ヒトおよびマウスからのＯｐｎ５オルソログ（互いに８０～９０％のタンパク質配列同一性を有する）の異種発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における青色光誘導性Ｇｑシグナル伝達活性化を媒介する能力を有するかどうかを試験する（図１ａおよび表７）。青色光を使用して刺激し、赤色細胞内のカルシウム指示薬ＣａｌｂｒｙｔｅＴＭ６３０ＡＭ染料を使用して、相対的なＣａ２＋応答をモニタリングする（図１ｂ）。ニワトリ（ｃＯｐｎ５）および海亀（ｔＯｐｎ５）からのＯｐｎ５オルソログは、Ｃａ２＋シグナルの即時且つ強力な光誘導性の増加（約３ΔＦ／Ｆ）を媒介するが、ヒトまたはマウスのＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では、光効果が観察されない（図１ｄおよび図２ａ、図２ｂ）。ニワトリオルソログによって例示されるように、ｃＯｐｎ５は、ＥＧＦＰ－ＣＡＡＸ膜マーカーと共局在し、これは、それが細胞膜に効率的に輸送されることを示す（図１ｃ）。培地に外因性レチナールを添加せず、これは、内因性レチナールがｃＯｐｎ５を機能させるのに十分であることを示す。Ｃａ２＋シグナルは、細胞外Ｃａ２＋の除去に耐性があるため、細胞内蓄積からのＣａ２＋の放出を示す（図２ｃ）。ＹＭ－２５４８９０（高選択性Ｇｑタンパク質阻害剤３３）のプレインキュベーションにより、両方のｃＯｐｎ５発現細胞における光誘導性Ｃａ２＋トランジェントが可逆的に消失される（図１ｅ）。ｃＯｐｎ５（ヒトＯＰＮ５ではない）発現細胞において、ＩＰ３の急速分解産物であるイノシトールリン酸塩（ＩＰ１）レベルの光誘導性増加が検出され、さらに、ＹＭ－２５４８９０での治療により、当該増加の程度が減少される（図１ｆおよび図２ｄ）。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光も、ＰＫＣ活性依存性の方法で、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（ＰＫＣの知られたターゲットポイント３４）のリン酸化を引き起こす（図１ｇおよび図２ｅ）。対照的に、レチナールの存在下でのヒトおよびマウスＯｐｎ５発現細胞において、青色光照射は、ｃＡＭＰレベルを効率的に低下させるが、レチナールなしのｃＯｐｎ５発現細胞ではこのような効果がない（図２ｆ）。総合すると、これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光照射がＧｑシグナル伝達経路にｃＯｐｎ５を共役させることを裏付けている。
ニワトリ、海亀（ｔｕｒｔｌｅ）、ヒトおよびマウスからのＯｐｎ５オルソログ（互いに８０～９０％のタンパク質配列同一性を有する）の異種発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における青色光誘導性Ｇｑシグナル伝達活性化を媒介する能力を有するかどうかを試験する（図１ａおよび表７）。青色光を使用して刺激し、赤色細胞内のカルシウム指示薬ＣａｌｂｒｙｔｅＴＭ６３０ＡＭ染料を使用して、相対的なＣａ２＋応答をモニタリングする（図１ｂ）。ニワトリ（ｃＯｐｎ５）および海亀（ｔＯｐｎ５）からのＯｐｎ５オルソログは、Ｃａ２＋シグナルの即時且つ強力な光誘導性の増加（約３ΔＦ／Ｆ）を媒介するが、ヒトまたはマウスのＯｐｎ５オルソログを発現する細胞では、光効果が観察されない（図１ｄおよび図２ａ、図２ｂ）。ニワトリオルソログによって例示されるように、ｃＯｐｎ５は、ＥＧＦＰ－ＣＡＡＸ膜マーカーと共局在し、これは、それが細胞膜に効率的に輸送されることを示す（図１ｃ）。培地に外因性レチナールを添加せず、これは、内因性レチナールがｃＯｐｎ５を機能させるのに十分であることを示す。Ｃａ２＋シグナルは、細胞外Ｃａ２＋の除去に耐性があるため、細胞内蓄積からのＣａ２＋の放出を示す（図２ｃ）。ＹＭ－２５４８９０（高選択性Ｇｑタンパク質阻害剤３３）のプレインキュベーションにより、両方のｃＯｐｎ５発現細胞における光誘導性Ｃａ２＋トランジェントが可逆的に消失される（図１ｅ）。ｃＯｐｎ５（ヒトＯＰＮ５ではない）発現細胞において、ＩＰ３の急速分解産物であるイノシトールリン酸塩（ＩＰ１）レベルの光誘導性増加が検出され、さらに、ＹＭ－２５４８９０での治療により、当該増加の程度が減少される（図１ｆおよび図２ｄ）。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光も、ＰＫＣ活性依存性の方法で、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（ＰＫＣの知られたターゲットポイント３４）のリン酸化を引き起こす（図１ｇおよび図２ｅ）。対照的に、レチナールの存在下でのヒトおよびマウスＯｐｎ５発現細胞において、青色光照射は、ｃＡＭＰレベルを効率的に低下させるが、レチナールなしのｃＯｐｎ５発現細胞ではこのような効果がない（図２ｆ）。総合すると、これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光照射がＧｑシグナル伝達経路にｃＯｐｎ５を共役させることを裏付けている。
【0078】
【表7】
【0079】
図１は、ｃＯｐｎ５がＨＥＫ２９３Ｔ細胞における光誘導性Ｇｑシグナル伝達の強力な活性化を媒介することを示す。
ａ．光誘導性ｃＯｐｎ５活性化に応答した推定の細胞内シグナル伝達の概略図。ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ、ＰＩＰ２：ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸、ＩＰ３：イノシトール－１，４，５－三リン酸、ＩＰ１：イノシトール一リン酸；ＤＡＧ：ジアシルグリセロール、ＰＫＣ：プロテインキナーゼＣ、ＹＭ－２５４８９０：選択性Ｇｑタンパク質阻害剤。
ａ．光誘導性ｃＯｐｎ５活性化に応答した推定の細胞内シグナル伝達の概略図。ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ、ＰＩＰ２：ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸、ＩＰ３：イノシトール－１，４，５－三リン酸、ＩＰ１：イノシトール一リン酸；ＤＡＧ：ジアシルグリセロール、ＰＫＣ：プロテインキナーゼＣ、ＹＭ－２５４８９０：選択性Ｇｑタンパク質阻害剤。
【0080】
ｂ．３種（セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））のＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光刺激（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４８８ｎｍ）の前後にＣａ２＋シグナルの擬似カラー画像。スケールバー、１０μｍ。
【0081】
ｃ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｃｙ３対比染色されたＶ５－ｃＯｐｎ５融合タンパク質（赤色）が膜タグＥＧＦＰ－ＣＡＡＸ（緑色）と共局在する。ＤＡＰＩ対比染色（青色）は、細胞核を支持する。スケールバー、１０μｍ。
【0082】
ｄ．ｃには、細胞の光誘発Ｃａ２＋シグナルの経時的変化を示す。
【0083】
ｅ．Ｇｑタンパク質阻害剤ＹＭ－２５４８９０（１０ｎＭ）は、ｃＯｐｎ５媒介性光誘導性Ｃａ２＋シグナルを可逆的にブロックする。
【0084】
ｆ．ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＹＭは、連続光刺激（３分間、１００μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）によって誘発されるＩＰ１蓄積（左）を阻害する。＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＝０．０１２８、Ｔｕｋｅｙ′ｓ多重比較検定。
【0085】
ｇ．対照群（光刺激なし）、光刺激群および光＋スタウロスポリン（ＳＴ、ＰＫＣ阻害剤）群において、ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＡＲＣＫＳのリン酸化。同じ画分中のｐ－ＭＡＲＣＫＳの量を、α－チューブリンの量に対して正規化する。＊＊Ｐ＝０．００９６、＊＊＊Ｐ＝０．０００４、Ｔｕｋｅｙ′ｓ多重比較検定。
【0086】
図２は、ｃＯｐｎ５がＧｑシグナル伝達に共役するが、Ｇｉシグナル伝達に共役しないことを示す。
ａ．海亀種（アオウミガメ（Ｃｈｅｌｏｎｉａ ｍｙｄａｓ））からのＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光刺激（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４８８ｎｍ）の前後のＣａ２＋シグナルの擬似カラー画像。スケールバー、１０μｍ（左）；応答細胞における誘発されたＣａ２＋シグナルの経時的変化（右）。
ａ．海亀種（アオウミガメ（Ｃｈｅｌｏｎｉａ ｍｙｄａｓ））からのＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、青色光刺激（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４８８ｎｍ）の前後のＣａ２＋シグナルの擬似カラー画像。スケールバー、１０μｍ（左）；応答細胞における誘発されたＣａ２＋シグナルの経時的変化（右）。
【0087】
ｂ．Ｇｑタンパク質阻害剤ＹＭ－２５４８９０（１０ｎＭ）が、ｃＯｐｎ５および海亀Ｏｐｎ５媒介性光誘導性Ｃａ２＋シグナルを可逆的にブロックするグループデータ。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【0088】
ｃ．細胞外Ｃａ２＋の非存在下で、光刺激（１０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）を使用して産生されたＣａ２＋シグナルの経時的変化。
【0089】
ｄ．光刺激の油有無にかかわらず、ヒトＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＰ１蓄積（右）。ｎ．ｓ．、有意差なし、対応のないｔ検定。
【0090】
ｅ．対照群（光刺激なし）、光刺激群および光＋スタウロスポリン群において、ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＡＲＣＫＳのリン酸化の代表的な結果。同じ画分中のｐ－ＭＡＲＣＫＳの量をα－チューブリンの量に対して正規化する。
【0091】
ｆ．培地中にレチナールを追加しない場合、光は、ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃＡＭＰレベルに影響を及ぼさない（１０μＭフォルスコリンプレインキュベーション）（左図）。右図は、１０μＭレチナールプレインキュベーション後、四つの異なる種のＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃＡＭＰ濃度に対する光刺激の影響を示す。
【0092】
ｄおよびｆにおけるエラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【0093】
実施例２． 好感度且つ正確であるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で異種発現するｃＯｐｎ５の光活性化性質に対して特徴付ける。Ｏｐｎ５は、これまでに紫外線（ＵＶ）感受性の光受容体２７であると考えられているが、固定光強度（１００μＷ／ｍｍ２）下で３６５～６３０ｎｍ範囲の一連の波長をプロットすると、４７０ｎｍの青色光が最も強いＣａ２＋トランジェントを引き起こすのに対し、ＵＶＡ光（３６５および３９５ｎｍ）は、効率が低く、より長い波長の可視光（５６１ｎｍまたは以上）は、まったく効果がない（図３ａ）。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する異なる光持続時間の影響を試験する。短時間光パルス（１、５、１０、２０、５０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）による刺激は、光持続時間が１０ｍｓを超えるとＣａ２＋応答が飽和モードに達することを示す（図３ｂ）。当該光強度（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）下で、光持続時間を長くしてもＣａ２＋シグナル振幅はさらに増加されない（図４ａ）。異なる強度で４７０ｎｍの光を照射すると、約４．８μＷ／ｍｍ２および１６μＷ／ｍｍ２の青色光は、それぞれ約半分および最大の応答を生成することが分かる（図３ｃおよび図４ｂ）。従って、ｃＯｐｎ５の光感受性は、光感受性Ｇｑ共役ＧＰＣＲの報告値よりも３～４桁高く、一般に使用される光遺伝学的ツールであるチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）の数値よりも２～３桁高くさえある（Ｌｉｎ、２０１１、Ｚｈａｎｇら、２００６）（表８）。総合すると、これらの結果によると、ｃＯｐｎ５がレチナールを追加しなくても単一成分の光遺伝学的ツールとして機能できること、完全な活性には低い光強度（１６μＷ／ｍｍ２）および短い持続時間（１０ｍｓ）が必要であるため、ｃＯｐｎ５が青色光に対して超敏感であることを示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で異種発現するｃＯｐｎ５の光活性化性質に対して特徴付ける。Ｏｐｎ５は、これまでに紫外線（ＵＶ）感受性の光受容体２７であると考えられているが、固定光強度（１００μＷ／ｍｍ２）下で３６５～６３０ｎｍ範囲の一連の波長をプロットすると、４７０ｎｍの青色光が最も強いＣａ２＋トランジェントを引き起こすのに対し、ＵＶＡ光（３６５および３９５ｎｍ）は、効率が低く、より長い波長の可視光（５６１ｎｍまたは以上）は、まったく効果がない（図３ａ）。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する異なる光持続時間の影響を試験する。短時間光パルス（１、５、１０、２０、５０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）による刺激は、光持続時間が１０ｍｓを超えるとＣａ２＋応答が飽和モードに達することを示す（図３ｂ）。当該光強度（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）下で、光持続時間を長くしてもＣａ２＋シグナル振幅はさらに増加されない（図４ａ）。異なる強度で４７０ｎｍの光を照射すると、約４．８μＷ／ｍｍ２および１６μＷ／ｍｍ２の青色光は、それぞれ約半分および最大の応答を生成することが分かる（図３ｃおよび図４ｂ）。従って、ｃＯｐｎ５の光感受性は、光感受性Ｇｑ共役ＧＰＣＲの報告値よりも３～４桁高く、一般に使用される光遺伝学的ツールであるチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）の数値よりも２～３桁高くさえある（Ｌｉｎ、２０１１、Ｚｈａｎｇら、２００６）（表８）。総合すると、これらの結果によると、ｃＯｐｎ５がレチナールを追加しなくても単一成分の光遺伝学的ツールとして機能できること、完全な活性には低い光強度（１６μＷ／ｍｍ２）および短い持続時間（１０ｍｓ）が必要であるため、ｃＯｐｎ５が青色光に対して超敏感であることを示す。
【0094】
【表8-1】
【表8-2】
【0095】
ｃＯｐｎ５の性能をｏｐｔｏ－ａ１ＡＲの性能と比較し、ここで、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲは、ロドプシンとＧｑ共役アドレナリン受容体とを混合することによって操作されたキメラＧＰＣＲである。以前に報告１４されたプロトコールに従って、ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＣａ２＋シグナルのゆっくりとした小さな（～０．５ΔＦ／Ｆ）増加を引き起こすには、非常に長時間の強い照射（６０ｓ、７ｍＷ／ｍｍ２）に曝露する必要があり、１５秒間の照射では効果がないことが発見された（図４ｃ、図４ｄ）。ｃＯｐｎ５の性能をｏｐｎ４の性能と比較し、ここで、ｏｐｎ４は、天然オプシンであり、Ｇｑシグナル伝達活性化に使用されるツールであると報告されている。強い照射への長時間曝露（２５ｓ、４０ｍＷ／ｍｍ２）および追加のレチナールは、ｏｐｎ４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゆっくりとした（～１ΔＦ／Ｆ）Ｃａ２＋シグナルの増加を引き起こすことが発見される（図４ｅ、図４ｆ）。従って、既存のオプシンベースのツール（ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲおよびｏｐｎ４）と比較して、ｃＯｐｎ５は、光感受性がはるかに高く（感度が約３桁高い）、必要な曝露時間（６０ｓに対する１０ｍｓ）がはるかに短く、より強い応答を生成する。
【0096】
さらに、ｃＯｐｎ５の性能を、一般的なＧｑ共役化学遺伝学ツールｈＭ３Ｄｑの性能と比較し、後者は、外因性小分子リガンドであるクロザピン－Ｎ－オキシド（ＣＮＯ）を添加することによって活性化される３７－３９。ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の光誘導性活性化およびｈＭ３Ｄｑ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＮＯ誘導性活性化は、類似なＣａ２＋シグナルのピーク値応答振幅を有する。同時に、ｈＭ３Ｄｑ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、より速く、より時間的に正確な応答を示し、より速い回復時間を示す（図４ｇ～図４ｉ）。これらの結果は、ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学が時間的精度の点でｈＭ３Ｄｑよりも制御可能であることを示す。
【0097】
ｃＯｐｎ５光遺伝学により、細胞活動を空間的に正確に制御できる。短時間の光刺激（６３ｍｓ）を個々のｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の亜細胞領域に制限すると、個々の細胞が即時に活性化される。興味深いことに、細胞が高度に密集された領域において、Ｃａ２＋シグナルは、周囲の細胞に伝播することにより、まだ未確認のメカニズムによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞間の細胞間コミュニケーションの存在が示唆される（図３ｄ、図３ｅ）。前記発見は、初代細胞培養物にも拡張される。新生児マウスの脳から調製された初代アストロサイト培養物において、ｃＯｐｎ５およびＥＧＦＰマーカータンパク質のバイシストロン性発現のためのＡＡＶベクターを使用してｃＯｐｎ５を発現する（図５ａ）。Ｃａｌｂｒｙｔｅ６３０ＡＭ染料を使用して、Ｃａ２＋レベルをモニタリングしたところ、青色光をｃＯｐｎ５発現アストロサイトに照射すると、強力なＣａ２＋トランジェントが賛成することが分かる（～８ΔＦ／Ｆ）（図５ｂ、図５ｃ）。光刺激（６３ｍｓ）が個々のｃＯｐｎ５発現アストロサイトの亜細胞領域にのみ正確に制限される場合、Ｃａ２＋シグナルが個々の細胞内で伝播されることが観察される（図３ｆ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での試験と同様に、刺激されたアストロサイトからより遠位の未刺激のアストロサイトへのＣａ２＋シグナルの緩やかな波状伝播が観察される（図３ｇ、図３ｈ）。従って、これらの実験は、ｃＯｐｎ５光遺伝学により正確な空間制御が可能であることを確認し、且つ最初に神経化学的および機械的刺激を使用して発見されたアストロサイトネットワークの動態を研究することが有用である可能性があることを示唆する４０、４１。
【0098】
図３は、ｃＯｐｎ５が高い時間的および空間的分解能でＧｑシグナル伝達の光学的制御を感度に媒介することを示す。
ａ．異なる波長での光刺激に応答した、選択された波長（３６５、３９５、４７０、５１５、５６１、５９０および６３０ｎｍ、左図）およびｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣａ２＋シグナルの振幅（２ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、右図）の概略図。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
ａ．異なる波長での光刺激に応答した、選択された波長（３６５、３９５、４７０、５１５、５６１、５９０および６３０ｎｍ、左図）およびｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣａ２＋シグナルの振幅（２ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、右図）の概略図。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【0099】
ｂ．異なる光刺激持続時間（１、５、１０、２０または５０ｍｓ、１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ）下での応答振幅。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【0100】
ｃ．異なる光強度下でのｃＯｐｎ５媒介性Ｃａ２＋シグナルの経時的変化（０、４．８、８、１６または３２μＷ／ｍｍ２、１０ｍｓ、４７０ｎｍ、１０ｍｓの１６μＷ／ｍｍ２刺激の場合、１０％ピーク値活性＝１．３６±０．５５ｓ、９０％ピーク値活性＝２．３７±０．８７ｓ、減衰時間τ＝１８．６６±４．９８ｓ、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝１０個の細胞）。
【0101】
ｄ．ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における光誘導性（６３ｍｓ、１７μＷ、矢印は、刺激領域を指す）Ｃａ２＋シグナル伝播の画像。スケールバー、１０μｍ。
【0102】
ｅ．ｄの経時的なＣａ２＋シグナルの伝播を示す擬似カラー画像（フレームＮ／（Ｎ－１）＞１）。フレーム間隔は、５００ｍｓであり、各フレームは、１回カウントされる。
【0103】
ｆ．亜細胞領域で刺激された個々のｃＯｐｎ５発現初代アストロサイトにおける光誘導性Ｃａ２＋シグナル伝播の画像（刺激サイズは、４×４μｍ２であり、フレーム間隔は、３００ｍｓである）。スケールバー、１０μｍ。
【0104】
ｇ．ｃＯｐｎ５発現初代アストロサイトにおける光誘導性Ｃａ２＋シグナル伝播の画像。スケールバー、１０μｍ。
【0105】
ｈ．ｇの経時的なＣａ２＋シグナルの伝播を示す擬似カラー画像（フレームＮ／（Ｎ－１）＞１）。フレーム間隔は、５００ｍｓであり、各フレームは、１回カウントされる。
【0106】
図４は、ｃＯｐｎ５がｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ、ｈＭ３Ｄｑまたはｏｐｎ４よりも光に対して迅速且つ敏感な応答を媒介することを示す。
ａ．光パルス（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ、１、５、１０、２０または５０ｍｓ）を使用する場合のＣａ２＋シグナルの経時的変化。
ａ．光パルス（１６μＷ／ｍｍ２、４７０ｎｍ、１、５、１０、２０または５０ｍｓ）を使用する場合のＣａ２＋シグナルの経時的変化。
【0107】
ｂ．１０ｍｓ、４７０ｎｍでの異なる光強度（０、４．８、８、１６または３２μＷ／ｍｍ２）下での応答振幅。
【0108】
ｃ．ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ベースラインおよびピーク値Ｃａ２＋シグナル（ΔＦ／Ｆ０）の擬似カラー画像。培地緩衝液は、１０μＭのオールトランスレチナールを含む。スケールバー、３０μｍ。
【0109】
ｄ．ｏｐｔｏ－ａ１ＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｃａ２＋に対する６０ｓの光刺激の影響（ｎ＝１５個の細胞、上図）、１５ｓの光刺激は、Ｃａ２＋シグナルに影響を与えない（下図）。
【0110】
ｅ．ヒトＯＰＮ４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ベースラインおよびピーク値Ｃａ２＋シグナル（ΔＦ／Ｆ０）の擬似カラー画像。培地緩衝液は、１０μＭのオールトランスレチナールを含む。スケールバー、３０μｍ。
【0111】
ｆ．ｏｐｎ４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｃａ２＋に対する１０ｕＭのＡＴＲ下での２５ｓの光刺激の影響（ｎ＝１２個の細胞、赤線）、ＡＴＲの非存在下でＣａ２＋シグナルに影響を与えない（黒色図）。
【0112】
ｇ．ｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣａ２＋シグナルに対する光刺激の影響。上図は、ベースラインおよびピーク値応答の擬似カラー画像を示す。下図は、５回の連続試験にわたるｃＯｐｎ５発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学的刺激によって誘発されるＣａ２＋シグナルのヒートマップを示す。スケールバー、２０μｍ。
【0113】
ｈ．ｈＭ３Ｄｑ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｃａ２＋シグナルに対する化学遺伝学的刺激の影響。
【0114】
ｉ．それぞれｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学的刺激（１０ｓ）およびＣＮＯパフを使用した（１００ｎＭ、１０ｓ）ｈＭ３Ｄｑ媒介性化学遺伝学的刺激によって誘発されるＣａ２＋シグナルの経時的変化。
【0115】
図５は、ｃＯｐｎ５がアストロサイトの活性化を効率的に媒介することを示す。
ａ．ＡＡＶ－ｃＯｐｎ５－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ（緑色）を使用して、培養初代アストロサイトでｃＯｐｎ５を発現する。ＧＦＡＰ免疫染色（赤色）によってアストロサイトの同一性を確認する。スケールバー、２０μｍ。
ａ．ＡＡＶ－ｃＯｐｎ５－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ（緑色）を使用して、培養初代アストロサイトでｃＯｐｎ５を発現する。ＧＦＡＰ免疫染色（赤色）によってアストロサイトの同一性を確認する。スケールバー、２０μｍ。
【0116】
ｂ．光刺激後のｃＯｐｎ５発現アストロサイトにおけるベースラインおよびピーク値Ｃａ２＋シグナルの擬似カラー画像。スケールバー、２０μｍ。
【0117】
ｃ．Ｃａ２＋シグナルの図および試験全体にわたるＣａ２＋シグナルのヒートマップ（ｎ＝２５個の細胞）。
【0118】
実施例３．インビボで大量のＡＴＰ放出およびニューロン活性化を誘導するアストロサイトにおけるｃＯｐｎ５光遺伝学的活性化
ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学のインビボでの性能を試験する。アストロサイトは、中枢神経系における非興奮性細胞の重要な集団を表し、これまでに、光遺伝学的ツールは、当該集団で限られた成功しか収めていない４２。ＡＴＰは、アストロサイト間のコミュニケーションメッセンジャーであることが知られているが、ＡＴＰ放出に対する細胞内Ｃａ２＋のリアルタイムの影響はまだ視覚化されていない。ＧＰＣＲ活性化ベースの超高感度ＡＴＰセンサーＧＲＡＢＡＴＰを使用して、細胞外のＡＴＰレベルの変化をモニタリングする。具体的には、ＧｆａＡＢＣ１Ｄプロモーター（アストロサイトにおける遺伝子発現を駆動するために一般に使用される）含有ＡＡＶベクターを注入した後、マウスＳ１感覚皮質でｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰセンサーが発現される（図６ａ）。
ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学のインビボでの性能を試験する。アストロサイトは、中枢神経系における非興奮性細胞の重要な集団を表し、これまでに、光遺伝学的ツールは、当該集団で限られた成功しか収めていない４２。ＡＴＰは、アストロサイト間のコミュニケーションメッセンジャーであることが知られているが、ＡＴＰ放出に対する細胞内Ｃａ２＋のリアルタイムの影響はまだ視覚化されていない。ＧＰＣＲ活性化ベースの超高感度ＡＴＰセンサーＧＲＡＢＡＴＰを使用して、細胞外のＡＴＰレベルの変化をモニタリングする。具体的には、ＧｆａＡＢＣ１Ｄプロモーター（アストロサイトにおける遺伝子発現を駆動するために一般に使用される）含有ＡＡＶベクターを注入した後、マウスＳ１感覚皮質でｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰセンサーが発現される（図６ａ）。
【0119】
頭を固定して覚醒し、正常に行動するマウスからのＧＲＡＢＡＴＰシグナルを二光子イメージングする（図６ａ）。二光子イメージングに使用されるパルスレーザーの９２０ｎｍ光に加えて、ＡＴＰシグナルを刺激するには、青色光パルスが必要であると当初予想される。驚くべきことに、イメージングのために送達された９２０ｎｍの光自体は、ｃＯｐｎ５およびＧＲＡＢＡＴＰを発現するマウスでは大量のＡＴＰフラッシュを引き起こすが、ＡＴＰセンサーを発現するがｃＯｐｓ５発現を欠くマウスではそうではＡＴＰフラッシュを引き起こさない。個々のＡＴＰフラッシュの直径は、通常、２０～１００μｍの範囲内であり、約１分間持続する。約１分間の最初の停止期間の後、フラッシュ周波数は、徐々に増加し、約５分間以内にピーク値に達し、イメージング領域（６４０×６４０μｍ２）内で約５０回のフラッシュ／分間のレベルに達する（図６ｂ、図６ｃおよび図７ａ）。さらに、繰り返しの試験では高周波ＡＴＰフラッシュも現れる（図７ｂ）。ＧＲＡＢＡＴＰのみを発現するマウスでは、散発的なＡＴＰイベント（イメージング領域内で約０．３回のフラッシュ／分間）が観察され、リポ多糖類（ＬＰＳ）の腹腔内注射による炎症誘発性治療後の８時間の場合、ＡＴＰフラッシュイベントは、基礎条件（約２回のフラッシュ／分間）のほぼ６倍に増加するが、かなり安定した周波数を示し、これは、炎症が脳内でＡＴＰ放出を誘導することが確認される。ｃＯｐｎ５発現マウスで観察されたＡＴＰフラッシュ周波数がＯｐｎ５を発現しないマウスで炎症誘発性治療後のフラッシュ周波数よりも約２５倍（図６ｄ、図７ｃ）高かったことを考慮すると、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの光活性化がインビボで連続して大量のＡＴＰ放出を誘導することを実証する。
【0120】
アストロサイトは、ＡＴＰを放出し、他のグリア伝達物質も、ニューロン受容体に作用してニューロン活性を調節する。ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化を使用して、頭を固定して覚醒し、正常に行動するマウスにおけるニューロンＣａ２＋シグナルを二光子イメージングする（図６ｅ）。ｃＯｐｎ５発現細胞（ｎ＝４０６）は、ＧＦＡＰ染色（ｎ＝３９７）と共局在するが、ＧＣａＭＰ７ｂ発現ニューロンとは共局在しない（図６ｆ）。生の追跡例およびコホートデータは、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化が０～５ｍｉｎと比較して１５～２０ｍｉｎのニューロン活性を顕著に増加させることを示す（図６ｇ、図６ｈおよび図７ｄ）。ｃＯｐｎ５は、アストロサイトで厳密に発現され、これは、ｃＯｐｎ５発現細胞およびＧＦＡＰ染色シグナル（ニューロンにおけるＧＣａＭＰ７ｂシグナルとは異なる）の共局在によって確認される。我々は、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの光活性化がインビボで末梢ニューロンの活性を増加させることを実証した。さらに、我々のデータは、二光子イメージングに使用されるパルスレーザーからの長波長（９２０ｎｍ）光がｃＯｐｎ５を活性化できることを示し、これは、ｃＯｐｎ５が二光子光遺伝学を有する可能性があることを示唆する。
【0121】
図６は、ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイトの活性化がインビボで大量のＡＴＰフラッシュおよびニューロン活性化を誘導することを示す。
ａ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化後、ＡＴＰ放出のインビボ二光子イメージング（９２０ｎｍ）の実験設定の概略図。画像は、マウスＳ１皮質内において、アストロサイトにおけるｃＯｐｎ５（赤色）の発現およびアストロサイトにおけるＧＲＡＢＡＴＰセンサー（緑色）の発現を示す。スケールバー、１００μｍ。
ａ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化後、ＡＴＰ放出のインビボ二光子イメージング（９２０ｎｍ）の実験設定の概略図。画像は、マウスＳ１皮質内において、アストロサイトにおけるｃＯｐｎ５（赤色）の発現およびアストロサイトにおけるＧＲＡＢＡＴＰセンサー（緑色）の発現を示す。スケールバー、１００μｍ。
【0122】
ｂ．対照マウス（ｃＯｐｎ５発現なし）、ＬＰＳ処理マウス（ｃＯｐｎ５発現なし）およびｃＯｐｎ５発現マウス（右側）におけるアストロサイトＡＴＰフラッシュイベントの数の経時的変化（０～１０ｍｉｎ）。
【0123】
ｃ．対照マウス（ｃＯｐｎ５発現なし）、ＬＰＳ処理マウス（ｃＯｐｎ５発現なし）およびｃＯｐｎ５発現マウスにおける総ＡＴＰフラッシュイベント。左の列は、基礎レベル（光照射前）での生のＧＲＡＢＡＴＰ画像を示し、中央の列は、５分でのＧＲＡＢＡＴＰシグナルを示し、右の列は、０～２０分間に蓄積された擬似色分けされたＡＴＰフラッシュイベントを示す。
【0124】
ｄ．ｃに示されるデータに対応し、アストロサイトＡＴＰフラッシュイベントの経時的なラスタープロット。
【0125】
ｅ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化後、ニューロンカルシウムイメージングに対してインビボ二光子イメージング（９２０ｎｍ）を実行する実験設定の概略図。画像は、マウスＳ１皮質内において、アストロサイトにおけるｃＯｐｎ５（赤色）の発現およびアストロサイトにおけるＧＣａＭＰ７ｂ（緑色）の発現を示す。スケールバー、１００μｍ。
【0126】
ｆ．ｃＯｐｎ５発現細胞（赤色）は、６４７ｎｍ染料で対比染色したＧＦＡＰ細胞（紫色）と共局在し、ＧＣａＭＰ７ｂ発現細胞（緑色）は、ニューロンである。４０６個の赤色細胞および３９７個の紫色細胞、スケールバー、１００μｍ。
【0127】
ｇ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化と共役する、０～５ｍｉｎおよび１５～２０ｍｉｎ内の１０個のＧＣａＭＰ７ｂ発現ニューロンの時間トレース。
【0128】
ｈ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化と共役する、０～５ｍｉｎおよび１５～２０ｍｉｎ内のＧＣａＭＰ７ｂ発現ニューロンのカルシウムイベント分析。Ｎ＝１９３個のニューロン、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定。
【0129】
図７は、ｃＯｐｎ５がアストロサイトにおける持続的且つ確実なＡＴＰ放出および末梢ニューロンの活性化を媒介することを示す。
ａ．異なる色で個々のフラッシュを示す、ｃＯｐｎ５発現マウスで検出されたアストロサイトＡＴＰフラッシュイベントの例。
ａ．異なる色で個々のフラッシュを示す、ｃＯｐｎ５発現マウスで検出されたアストロサイトＡＴＰフラッシュイベントの例。
【0130】
ｂ．１時間後の繰り返しの試験において、ｃＯｐｎ５発現マウスにおけるＡＴＰフラッシュイベント（０～２０ｍｉｎ）。
【0131】
ｃ．対照、ＬＰＳおよびｃＯｐｎ５群におけるＡＴＰフラッシュイベントの数の定量化。対照－ＬＰＳ比較、＊＊Ｐ＝０．００６６、ＬＰＳ－ｃＯｐｎ５比較、＊＊Ｐ＝０．００３１、対照－ｃＯｐｎ５比較、＊＊＊Ｐ＝０．０００２、対応のないｔ検定。
【0132】
ｄ．ｃＯｐｎ５媒介性アストロサイト活性化と共役する、０～５ｍｉｎおよび１５～２０ｍｉｎ内のＧＣａＭＰ７ｂ発現ニューロンのデコードスパイク発火速度の分析。Ｎ＝１９３個のニューロン、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定。
【0133】
実施例４．ニューロンを活性化し、且つ動物行動を調節するｃＯｐｎ５光遺伝学
ニューロンにおけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の応用を調査する。まず、ｃＯｐｎ５が光誘導性Ｃａ２＋シグナルを媒介できるかどうかを検査する。ＡＡＶおよび汎ニューロンＳＹＮプロモーターを使用して、マウス皮質ニューロンでｃＯｐｎ５および遺伝的にコードされたＣａ２＋センサーｊＲＧＥＣＯ１ａを発現する（図８ａ）。脳切片サンプルにおいて、青色光パルス（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４７３ｎｍ）の印加により、ニューロンにおけるＣａ２＋トランジェントを確実に誘導する（図８ｂ、図８ｃ）。従って、ｃＯｐｎ５は、ニューロンにおいて光誘導性活性化も実現することができる。
ニューロンにおけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の応用を調査する。まず、ｃＯｐｎ５が光誘導性Ｃａ２＋シグナルを媒介できるかどうかを検査する。ＡＡＶおよび汎ニューロンＳＹＮプロモーターを使用して、マウス皮質ニューロンでｃＯｐｎ５および遺伝的にコードされたＣａ２＋センサーｊＲＧＥＣＯ１ａを発現する（図８ａ）。脳切片サンプルにおいて、青色光パルス（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４７３ｎｍ）の印加により、ニューロンにおけるＣａ２＋トランジェントを確実に誘導する（図８ｂ、図８ｃ）。従って、ｃＯｐｎ５は、ニューロンにおいて光誘導性活性化も実現することができる。
【0134】
運動皮質、海馬および背側線条体からの切片サンプルにおけるニューロンの電気生理学的性質に対する光誘導性ｃＯｐｎ５活性化の影響を研究する（図８ｄ）。２種類の活性化パターンが観察される。記録されたほとんどのニューロンにおいて、青色光パルスは、電圧クランプモードで小さな脱分極電流（約２０ｐＡ）を誘導し、且つ電流クランプモードで活動電位の遅延するが活発な放電を誘導する（図８ｅ、左側、ｎ＝１２個のニューロン）。より高い周波数の光パルス下では、ｃＯｐｎ５は、最初の光パルス後、より多くのスパイクを駆動し、より短い潜伏期間（約５ｓ～約３ｓ）を有し、内部向き電流は、顕著な影響を受けない（図９ａ）。別のニューロンの亜集団において、短時間の光パルスは、急速に強力な内部向き電流（１００～１０００ｐＡ）を引き起こし、且つ活動電位のバースト発火を駆動する（図８ｅ、右側、ｎ＝６個のニューロン）。ニューロンは、１０Ｈｚ、１０ｍｓ／パルスで繰り返し刺激され、光刺激の繰り返しの試験において発火速度の非減衰パターンを示す（図９ｂ）。注意すべきことに、ＣｈＲ２光遺伝学によって５３生成される活動電位とは異なり、ｃＯｐｎ５光刺激によって誘発される活動電位は光パルスに時間ロックされていない。
【0135】
最後に、動物行動の調節におけるｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学の有用性を評価する。外側視床下部（ＬＨ）は、報酬の処理および摂食行動における機能があることが知られている脳中枢である５４，５５。ＶＧＡＴ－ＣｒｅマウスのＬＨＧＡＢＡ作動性ニューロンでｃＯｐｎ５を発現させ、光ファイバーを移植し、自由に行動するマウスのＬＨに光パルスを送達する（図８ｇ）。ＬＨＧＡＢＡニューロンの活性化が摂食行動５６を駆動するという以前の発見と一致し、光刺激（２０Ｈｚ、５ｍｓ／パルス、４７３ｎｍ、０．７５ｍＷ、線維先端からの出力）は、ｃＯｐｎ５発現マウスにおいて食物摂取の顕著な増加を引き起こすが、ＥＧＦＰ発現対照マウスにおいては食物摂取の顕著な増加を引き起こさない（図８ｈ）。食物採餌行動課題を使用して、不定帯（ＺＩ）におけるｃＯｐｎ５媒介性ＧＡＢＡニューロンの光遺伝学的活性化の効果も試験し（図８ｉ）、ここで、不定帯は、強迫的な摂食を駆動することが知られて入る領域である５７。ＥＧＦＰ発現マウスと比較して、ｃＯｐｎ５発現マウスは、光刺激を繰り返した後、高脂肪食物ペレットの採餌に費やされる時間の顕著な増加を示す（図８ｊ）。応答プロファイルを特徴付けるために、ＬＨおよびＺＩのｃＯｐｎ５発現ニューロンから電気生理学的記録を実行する。全脳切片により、光ファイバーの注入部位および配置を確認する（図１０ａ～図１０ｃ）。注意すべきことに、マウスは、点灯時に前記行動（摂食行動または高脂肪食物採餌行動）を維持し、消灯すると即時にこのような行動を停止する。従って、ｃＯｐｎ５は、動物の行動状態を効率的に迅速、正確且可逆的に調節できる。
【0136】
図８は、ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学が神経回路に依存的方法でマウスの行動を変化させることを示す。
ａ．光遺伝学的刺激およびＣａ２＋イメージングのための実験設定を示す概略図。
ａ．光遺伝学的刺激およびＣａ２＋イメージングのための実験設定を示す概略図。
【0137】
ｂ．光刺激（１０ｓ、１００μＷ／ｍｍ２、４７３ｎｍ）の前後のＣａ２＋シグナルを示す擬似カラー画像。スケールバー、１０μｍ。
【0138】
ｃ．ｂの６個のニューロンのＣａ２＋シグナルトレースを示す図。
【0139】
ｄ．皮質、線条体および海馬におけるｃＯｐｎ５発現ニューロンの光遺伝学的刺激および全細胞パッチクランプ記録を示す概略図。
【0140】
ｅ．２種類のニューロンの代表的図、ここで、光パルス（１Ｈｚ、５ｓ、１０ｍｓ／パルス）に応答して、強力な、遅延した活動電位発火、および小さな持続的な内部向き電流を示し、もう一方は、急速な膜電位脱分極および大きな内部向き電流を示す。
【0141】
ｆ．４７３ｎｍの光刺激のパルスシグナル（１Ｈｚ、５ｓ）を印加した後、ニューロンの発火速度を増加する（＊＊＊Ｐ＝０．０００５、ｎ＝１８、対応のないｔ検定）。
【0142】
ｇ．光遺伝学および食物摂取測定に使用される実験設定の概略図。ＶＧＡＴ－Ｃｒｅマウスの外側視床下部（ＬＨ）内のＧＡＢＡ作動性ニューロンでｃＯｐｎ５－ＥＧＦＰを発現する。ＥＧＦＰを対照として発現させる。
【0143】
ｈ．光誘導性（２０Ｈｚ、５ｍｓ／パルス、４７３ｎｍ、０．７５ｍＷ、線維先端からの出力）ｃＯｐｎ５媒介性摂食行動の活性化の概要。＊＊＊Ｐ＝０．０００３、ｎ．ｓ．、顕著でなく、ｎ＝６匹のマウス、対応のないｔ検定。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。
【0144】
ｉ．食物採餌行動に使用される実験設定の概略図。高脂肪食物ペレットを使用する。マウスの不定帯（ＺＩ）内のＧＡＢＡ作動性ニューロンでｃＯｐｎ５－ＥＧＦＰを発現する。ＥＧＦＰを対照として発現させる。
【0145】
ｊ．ｃＯｐｎ５媒介性採餌行動の概要。光刺激を受けてからマウスが隠れた食物を発見するまで、採餌時間の割合を計算する。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ＝６匹のマウス、対応のないｔ検定。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【0146】
図９は、ｃＯｐｎ５媒介性光遺伝学がニューロンを確実に活性化することを示す。
ａ．１、１０および２０Ｈｚの光パルス（５ｓ、１０ｍｓ／パルス）に応答する一つの代表的なニューロン。
ａ．１、１０および２０Ｈｚの光パルス（５ｓ、１０ｍｓ／パルス）に応答する一つの代表的なニューロン。
【0147】
ｂ．信頼性と繰り返し可能なｃＯｐｎ５媒介性ニューロン光活性化を示す生のトレース。
【0148】
ｃ．光刺激の繰り返しの試験における発火速度の概要。
【0149】
図１０は、光ファイバーの注入位置および配置を示す。
ａ．ＬＨにおけるＥＧＦＰ対照の発現およびｃＯｐｎ５のバイシストロン性発現（白色破線）を示す画像。病変部位および青色破線は、光ファイバーの配置を示す。スケールバー、５００μｍ。
ａ．ＬＨにおけるＥＧＦＰ対照の発現およびｃＯｐｎ５のバイシストロン性発現（白色破線）を示す画像。病変部位および青色破線は、光ファイバーの配置を示す。スケールバー、５００μｍ。
【0150】
ｂ．ＺＩにおける注入位置および光ファイバーの配置。スケールバー、５００μｍ。
【0151】
ｃ．ＬＨおよびＺＩにおけるｃＯｐｎ５発現ニューロンの電気生理学的記録は、ｃＯｐｎ５媒介性光活性化を特徴付ける。
【0152】
実施例５
実験の説明：以下の表９は、本発明で試験された脊椎動物亜門（vertebrata）からのｃＯｐｎ５オルソログの部分的なリストである。脊椎動物亜門（円形動物（ｒｏｔｕｎｄｉａ）、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む脊椎動物亜門）由来の報告されているすべてのオプシン５オルソログの完全な遺伝子を合成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現される。光に対するオプシン５オルソログの感度を試験するために、４７０ｎｍの青色光刺激を使用するか、または使用しない状況でカルシウムイメージングを実行する。光誘導性カルシウムシグナルの経時的変化は、Ｇｑシグナル伝達経路の的活性化の程度およびこれらのオルソログの感受性を明らかにする。
実験の説明：以下の表９は、本発明で試験された脊椎動物亜門（vertebrata）からのｃＯｐｎ５オルソログの部分的なリストである。脊椎動物亜門（円形動物（ｒｏｔｕｎｄｉａ）、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む脊椎動物亜門）由来の報告されているすべてのオプシン５オルソログの完全な遺伝子を合成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現される。光に対するオプシン５オルソログの感度を試験するために、４７０ｎｍの青色光刺激を使用するか、または使用しない状況でカルシウムイメージングを実行する。光誘導性カルシウムシグナルの経時的変化は、Ｇｑシグナル伝達経路の的活性化の程度およびこれらのオルソログの感受性を明らかにする。
【0153】
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【表9-5】
【表9-6】
【表9-7】
【表9-8】
【表9-9】
【表9-10】
【表9-11】
【表9-12】
【表9-13】
【表9-14】
【表9-15】
【表9-16】
【表9-17】
【0154】
参照文献
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３５．Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｗａｎｇ， Ｌ．－Ｐ．， Ｂｏｙｄｅｎ， Ｅ． Ｓ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，チャネルロドプシン－２および興奮性細胞の光制御（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ３， ７８５－７９２ （２００６）．
３６．Ｌｉｎ， Ｊ． Ｙ．，チャネルロドプシン変異体のユーザーガイド：特徴、制限および将来の開発（Ａ ｕｓｅｒ′ｓ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ： ｆｅａｔｕｒｅｓ， ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９６， １９－２５ （２０１１）．
３７．Ｇｏｍｅｚ， Ｊ． Ｌ．ら，化学遺伝学の開示：変換されたクロザピンによるＤＲＥＡＤＤの占有および活性化（Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ： ＤＲＥＡＤＤ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｃｌｏｚａｐｉｎｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７， ５０３－５０７ （２０１７）．
３８．Ｋｒａｓｈｅｓ， Ｍ． Ｊ．ら，ＡｇＲＰニューロンの急速且つ可逆的な活性化がマウスの摂食行動を促進する（Ｒａｐｉｄ， ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＡｇＲＰ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｒｉｖｅｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２１， １４２４－１４２８ （２０１１）．
３９．Ｒｏｇａｎ， Ｓ． Ｃ．， Ｒｏｔｈ， Ｂ． Ｌ． ＆ Ｍｏｒｒｏｗ， Ａ． Ｌ．，ニューロンシグナル伝達の遠隔制御（Ｒｅｍｏｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６３， ２９１－３１５， ｄｏｉ：１０．１１２４／ｐｒ．１１０．００３０２０ （２０１１）．
４０．Ｃｈａｒｌｅｓ， Ａ． Ｃ．， Ｍｅｒｒｉｌｌ， Ｊ． Ｅ．， Ｄｉｒｋｓｅｎ， Ｅ． Ｒ． ＆ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎｔ， Ｍ． Ｊ．，グリア細胞における細胞間シグナル伝達：機械的刺激およびグルタミン酸に応答するカルシウム波および振とう（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｃａｌｃｉｕｍ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ），Ｎｅｕｒｏｎ ６， ９８３－９９２ （１９９１）．
４１．Ｃｏｒｎｅｌｌ－Ｂｅｌｌ， Ａ． Ｈ．， Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ， Ｓ． Ｍ．， Ｃｏｏｐｅｒ， Ｍ． Ｓ． ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｊ．，培養アストロサイトにカルシウム波を誘導するグルタミン酸：長距離グリアシグナル伝達（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ： ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｇｌｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， ４７０－４７３ （１９９０）．
４２．Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｗａｎｇ， Ｌ． Ｐ．， Ｂｏｙｄｅｎ， Ｅ． Ｓ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，チャネルロドプシン－２および興奮性細胞の光制御（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３， ７８５－７９２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ９３６ （２００６）．
４３．Ｄａｖａｌｏｓ， Ｄ．ら，ＡＴＰは、インビボでの局所脳損傷に対する迅速なミクログリア反応を媒介する（ＡＴＰ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｏｃａｌ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ），Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８， ７５２－７５８ （２００５）．
４４．Ｚｈａｎｇ， Ｊ．－ｍ．ら，アストロサイトによって放出されるＡＴＰは、グルタミン酸作動性活性依存性のヘテロシナプス抑制を媒介する（ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｔｅｒｏｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｎｅｕｒｏｎ ４０， ９７１－９８２ （２００３）．
４５．Ｚｈａｎｇ， Ｚ．ら，リソソームエキソサイトーシスを介したアストロサイトからのＡＴＰ放出の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９， ９４５－９５３ （２００７）．
４６．Ｗｕ， Ｚ． ＆ Ｌｉ， Ｙ．，インビボでのプリン作動性伝達物質の動態を調査する新たな境地（Ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １５２， ３５－４３ （２０２０）．
４７．Ｗｕ， Ｚ．ら，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０２．２４．４３２６８０ （２０２１）．
４８．Ｌａｗｌｏｒ， Ｐ． Ａ．， Ｂｌａｎｄ， Ｒ． Ｊ．， Ｍｏｕｒａｖｌｅｖ， Ａ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｄ． ＆ Ｄｕｒｉｎｇ， Ｍ． Ｊ．，非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶ血清型による哺乳動物の脳における効率的な遺伝子送達およびグリア細胞の選択的導入（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｂｙ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ １７， １６９２－１７０２ （２００９）．
４９．Ｌｅｅ， Ｙ．， Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ．， Ｓｕ， Ｍ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．，領域特異的およびアストロサイト特異的な発現に必要なＧＦＡＰプロモーターエレメント（ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｇｌｉａ ５６， ４８１－４９３ （２００８）．
５０．Ｂａｌ－Ｐｒｉｃｅ， Ａ．， Ｍｏｎｅｅｒ， Ｚ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｇ． Ｃ．，一酸化窒素は、培養ラットアストロサイトからの小胞グルタミン酸とＡＴＰの急速なカルシウム依存性放出を誘導する（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ， ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ＡＴＰ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ），Ｇｌｉａ ４０， ３１２－３２３， ｄｏｉ：１０．１００２／ｇｌｉａ．１０１２４ （２００２）．
５１．Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｋ．， Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ． ＆ Ｙｏｎｅｄａ， Ｙ．，培養アストロサイトにおけるリポ多糖類刺激性の一酸化窒素産生のＡＴＰによる増強（Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＴＰ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１７， ３７－４２ （２００３）．
５２．Ｌｅｚｍｙ， Ｊ．ら，アストロサイトＣａ（２＋）誘発ＡＴＰ放出は、有髄軸索の興奮性および伝達速度を調節する（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｃａ（２＋）－ｅｖｏｋｅｄ ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ ａｘｏｎ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７４， ｅａｂｈ２８５８， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｈ２８５８ （２０２１）．
５３．Ｔｉａｎ， Ｌ．ら，改良されたＧＣａＭＰカルシウム指示剤によるワーム、ハエおよびマウスの神経活動のイメージング（Ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｗｏｒｍｓ， ｆｌｉｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＧＣａＭＰ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ８７５－８８１ （２００９）．
５４．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｊ． Ｈ．， Ｒｉｚｚｉ， Ｇ．， Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ， Ａ． Ｍ．， Ｕｎｇ， Ｒ． Ｌ． ＆ Ｓｔｕｂｅｒ， Ｇ． Ｄ．，視床下部外側部の抑制回路構造が摂食を調整する（Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ｆｅｅｄｉｎｇ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１， １５１７－１５２１ （２０１３）．
５５．Ｓｔｕｂｅｒ， Ｇ． Ｄ． ＆ Ｗｉｓｅ， Ｒ． Ａ．，摂食および報酬のための側方視床下部回路（Ｌａｔｅｒａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｗａｒｄ），Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９， １９８－２０５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４２２０ （２０１６）．
５６．Ｌｉ， Ｙ．ら，捕食および回避のための視床下部回路（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｓｉｏｎ），Ｎｅｕｒｏｎ ９７， ９１１－９２４ ｅ９１５， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０１．００５ （２０１８）．
５７．Ｚｈａｎｇ， Ｘ． ＆ ｖａｎ ｄｅｎ Ｐｏｌ， Ａ． Ｎ．，不定帯ＧＡＢＡニューロンの活性化によって引き起こされる急速な過食症および体重増加（Ｒａｐｉｄ ｂｉｎｇｅ－ｌｉｋｅ ｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｚｏｎａ ｉｎｃｅｒｔａ ＧＡＢＡ ｎｅｕｒｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６， ８５３－８５９， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ７１００ （２０１７）．
５８．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， Ｈ． ＆ Ｔｅｒａｋｉｔａ， Ａ．，双安定色素の多様性および機能的特性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｓｔａｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔｓ），Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９， １４３５－１４４３ （２０１０）．
５９．Ｅｌｌｉｓ－Ｄａｖｉｅｓ， Ｇ． Ｃ．，ケージド化合物：細胞の化学および生理機能を制御するための光放出技術（Ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ： ｐｈｏｔｏｒｅｌｅａｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ６１９－６２８ （２００７）．
６０．Ａｄａｍｓ， Ｓ． Ｒ． ＆ Ｔｓｉｅｎ， Ｒ． Ｙ．，ケージド化合物による細胞化学の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５５， ７５５－７８４， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐｈ．５５．０３０１９３．００３５４３ （１９９３）．
６１．Ｃｈｅｎ， Ｔ．－Ｗ．ら，ニューロン活動をイメージングするための超高感度蛍光タンパク質（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎａｔｕｒｅ ４９９， ２９５－３００ （２０１３）．
６２．Ｊｉｎｇ， Ｍ．ら，生体内コリン作動性活性をモニタリングするための最適化されたアセチルコリンセンサー（Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １７， １１３９－１１４６ （２０２０）．
６３．Ｓｕｎ， Ｆ．ら，遺伝的にコードされた蛍光センサーにより、ハエ、魚およびマウスのドーパミンを迅速且つ特異的に検出できるようになる（Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎ ｆｌｉｅｓ， ｆｉｓｈ， ａｎｄ ｍｉｃｅ），Ｃｅｌｌ １７４， ４８１－４９６． ｅ４１９ （２０１８）．
６４．Ｗａｎ， Ｊ．ら，セロトニンの動態を測定するための遺伝的にコードされたセンサー（Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ），Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２４， ７４６－７５２ （２０２１）．
６５．Ｚｈａｏ， Ｙ．ら，遺伝的にコードされたＣａ２＋指示剤の拡張されたパレット（Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｌｅｔｔｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃａ２＋ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３， １８８８－１８９１ （２０１１）．
６６．Ｈｏｃｈｂａｕｍ， Ｄ． Ｒ．ら，遺伝子操作された微生物ロドプシンを用いた哺乳動物ニューロンにおける全光学的電気生理学（Ａｌｌ－ｏｐｔｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１， ８２５－８３３， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３０００ （２０１４）．
６７．Ｓａｈｅｌ， Ｊ．－Ａ．ら，光遺伝学的治療後の視覚障害患者の視覚機能の部分的回復（Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｂｌｉｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １－７ （２０２１）．
１．Ｈａｕｓｅｒ， Ａ． Ｓ．， Ａｔｔｗｏｏｄ， Ｍ． Ｍ．， Ｒａｓｋ－Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｍ．， Ｓｃｈｉｏｔｈ， Ｈ． Ｂ． ＆ Ｇｌｏｒｉａｍ， Ｄ． Ｅ．，ＧＰＣＲ創薬の動向：新しい薬剤、標的および適応症（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ＧＰＣＲ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ： ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ， ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １６， ８２９－８４２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１７．１７８ （２０１７）．
２．Ｗｅｔｔｓｃｈｕｒｅｃｋ， Ｎ． ＆ Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ， Ｓ．，哺乳動物Ｇタンパク質、およびその細胞型に特異的な機能（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ），Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ８５， １１５９－１２０４， ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．００００３．２００５ （２００５）．
３．Ｅｘｔｏｎ， Ｊ． Ｈ．，ホルモン、神経伝達物質、およびその他のＧタンパク質関連アゴニストによるホスホイノシチドホスホリパーゼの調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ ｂｙ ｈｏｒｍｏｎｅｓ， ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ， ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３６， ４８１－５０９， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐａ．３６．０４０１９６．００２４０５ （１９９６）．
４．Ｒｉｔｔｅｒ， Ｓ． Ｌ． ＆ Ｈａｌｌ， Ｒ． Ａ．，受容体相互作用タンパク質によるＧＰＣＲ活性の微調整（Ｆｉｎｅ－ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ＧＰＣＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １０， ８１９－８３０ （２００９）．
５．Ｋａｄａｍｕｒ， Ｇ． ＆ Ｒｏｓｓ， Ｅ． Ｍ．，哺乳動物のホスホリパーゼＣ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７５， １２７－１５４， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｐｈｙｓｉｏｌ－０３０２１２－１８３７５０ （２０１３）．
６．Ｇｏｍｅｚ， Ｊ． Ｌ．ら，化学遺伝学の開示：変換されたクロザピンによるＤＲＥＡＤＤの占有および活性化（Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ： ＤＲＥＡＤＤ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｃｌｏｚａｐｉｎｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７， ５０３－５０７， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｎ２４７５ （２０１７）．
７．Ａｄａｍｓ， Ｓ． Ｒ． ＆ Ｔｓｉｅｎ， Ｒ． Ｙ．，ケージド化合物による細胞化学の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ），Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５５， ７５５－７８４ （１９９３）．
８．Ｂｏｙｄｅｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｂａｍｂｅｒｇ， Ｅ．， Ｎａｇｅｌ， Ｇ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，ミリ秒タイムスケール、遺伝子ターゲットを絞った神経活動の光学制御（Ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ－ｔｉｍｅｓｃａｌｅ， ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８， １２６３－１２６８， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ１５２５ （２００５）．
９．Ｆｅｎｎｏ， Ｌ．， Ｙｉｚｈａｒ， Ｏ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，オプトジェネティクスの開発および応用（Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ），Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３４， ３８９－４１２， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｎｅｕｒｏ－０６１０１０－１１３８１７ （２０１１）．
１０．Ｑｕａｄｒａｔｏ， Ｇ．ら，感光性ヒト脳オルガノイドにおける細胞の多様性およびネットワークダイナミクス（Ｃｅｌｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｎｅｔｗｏｒｋ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ），Ｎａｔｕｒｅ ５４５， ４８－５３ （２０１７）．
１１．Ｒｏｓｔ， Ｂ． Ｒ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ－Ｗａｒｍｅ， Ｆ．， Ｓｃｈｍｉｔｚ， Ｄ． ＆ Ｈｅｇｅｍａｎｎ， Ｐ．，神経科学における亜細胞応用のための光遺伝学的ツール（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ） ，Ｎｅｕｒｏｎ ９６， ５７２－６０３ （２０１７）．
１２．Ｔｙｅ， Ｋ． Ｍ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，動物モデルにおける脳疾患の基礎となる神経回路の光遺伝学的研究（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３， ２５１－２６６ （２０１２）．
１３．Ｚｈａｎｇ， Ｆ．ら，光遺伝学的ツールの微生物オプシンファミリー（Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｐｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｓ），Ｃｅｌｌ １４７， １４４６－１４５７ （２０１１）．
１４．Ａｉｒａｎ， Ｒ． Ｄ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｋ． Ｒ．， Ｆｅｎｎｏ， Ｌ． Ｅ．， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｈ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，細胞内シグナル伝達の時間的に正確なインビボ制御（Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ），Ｎａｔｕｒｅ ４５８， １０２５－１０２９， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７９２６ （２００９）．
１５．Ｔｉｃｈｙ， Ａ． Ｍ．， Ｇｅｒｒａｒｄ， Ｅ． Ｊ．， Ｓｅｘｔｏｎ， Ｐ． Ｍ． ＆ Ｊａｎｏｖｊａｋ， Ｈ．，光活性化キメラＧＰＣＲ：限界性および機会（Ｌｉｇｈｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＰＣＲｓ： ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ５７， １９６－２０３， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｂｉ．２０１９．０５．００６ （２０１９）．
１６．Ｋｏｙａｎａｇｉ， Ｍ． ＆ Ｔｅｒａｋｉｔａ， Ａ，動物におけるオプシンベースの色素の多様性およびその光遺伝学的可能性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｏｐｓｉｎ－ｂａｓｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ），Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３７， ７１０－７１６， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｂｉｏ．２０１３．０９．００３ （２０１４）．
１７．Ｙａｕ， Ｋ．－Ｗ． ＆ Ｈａｒｄｉｅ， Ｒ． Ｃ．，光伝達モチーフおよびその変異（Ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ），Ｃｅｌｌ １３９， ２４６－２６４ （２００９）．
１８．Ｃｏｐｉｔｓ， Ｂ． Ａ．ら，シナプス前抑制のための光スイッチ可能なＧＰＣＲベースのオプシン（Ａ ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ＧＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｏｐｓｉｎ ｆｏｒ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），Ｎｅｕｒｏｎ １０９， １７９１－１８０９ ｅ１７１１， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０２１．０４．０２６ （２０２１）．
１９．Ｍａｈｎ， Ｍ．ら，蚊ロドプシンによる神経伝達物質放出の効率的な光遺伝学的サイレンシング（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ），Ｎｅｕｒｏｎ １０９， １６２１－１６３５ ｅ１６２８， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０２１．０３．０１３ （２０２１）．
２０．Ｇuｌｅｒ， Ａ． Ｄ．ら，メラノプシン細胞は、非結像視覚への桿体錐体入力の主要な導管である（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｎｄｕｉｔｓ ｆｏｒ ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｉｎｐｕｔ ｔｏ ｎｏｎ－ｉｍａｇｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｓｉｏｎ），Ｎａｔｕｒｅ ４５３， １０２－１０５ （２００８）．
２１．Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｍ． Ｗ．， Ｐｅｉｒｓｏｎ， Ｓ． Ｎ． ＆ Ｆｏｓｔｅｒ， Ｒ． Ｇ．，メラノプシン：刺激的な光色素（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ： ａｎ ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｐｈｏｔｏｐｉｇｍｅｎｔ），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１， ２７－３６ （２００８）．
２２．Ｈａｔｔａｒ， Ｓ．， Ｌｉａｏ， Ｈ．－Ｗ．， Ｔａｋａｏ， Ｍ．， Ｂｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ｍ． ＆ Ｙａｕ， Ｋ．－Ｗ．，メラノプシン含有網膜神経節細胞：構造、投影および固有の光感受性（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ： ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ， ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５， １０６５－１０７０ （２００２）．
２３．Ｘｕｅ， Ｔ．ら，哺乳動物の虹彩および網膜におけるメラノプシンシグナル伝達（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｒｉｓ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａ），Ｎａｔｕｒｅ ４７９， ６７－７３ （２０１１）．
２４．Ｑｉｕ， Ｘ．ら，メラノプシンの異種発現による光過敏症の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ），Ｎａｔｕｒｅ ４３３， ７４５－７４９ （２００５）．
２５．Ｍｅｌｙａｎ， Ｚ．， Ｔａｒｔｔｅｌｉｎ， Ｅ． Ｅ．， Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｊ．， Ｌｕｃａｓ， Ｒ． Ｊ． ＆ Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｍ． Ｗ．，ヒトメラノプシンの添加により哺乳動物細胞が光応答性になる（Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ ｒｅｎｄｅｒｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ），Ｎａｔｕｒｅ ４３３， ７４１－７４５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３３４４ （２００５）．
２６．Ｋｏｊｉｍａ， Ｄ．ら，ヒトおよびマウスにおけるＵＶ感受性光受容体タンパク質ＯＰＮ５（ＵＶ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＯＰＮ５ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６， ｅ２６３８８， ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６３８８ （２０１１）．
２７．Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｔ．ら，Ｏｐｎ５は、Ｇタンパク質のＧｉサブタイプと共役するＵＶ感受性双安定色素である（Ｏｐｎ５ ｉｓ ａ ＵＶ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｉｓｔａｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｃｏｕｐｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｇｉ ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７， ２２０８４－２２０８９， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１２４９８１０７ （２０１０）．
２８．Ｚｈａｎｇ， Ｋ． Ｘ．ら，オプシン５視床下部ニューロンによる熱産生の紫色光抑制（Ｖｉｏｌｅｔ－ｌｉｇｈｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｐｓｉｎ ５ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ），Ｎａｔｕｒｅ ５８５， ４２０－４２５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２６８３－０ （２０２０）．
２９．Ｎａｋａｎｅ， Ｙ．ら，哺乳動物神経組織オプシン（ｏｐｓｉｎ ５）は鳥類の脳深部光受容体である（Ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｐｓｉｎ （Ｏｐｓｉｎ ５） ｉｓ ａ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｂｉｒｄｓ），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０７， １５２６４－１５２６８ （２０１０）．
３０．Ｎａｋａｎｅ， Ｙ．， Ｓｈｉｍｍｕｒａ， Ｔ．， Ａｂｅ， Ｈ． ＆ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ．，脳深部光受容体の固有の光感受性（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｄｅｅｐ ｂｒａｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４， Ｒ５９６－Ｒ５９７ （２０１４）．
３１．Ｒｉｏｓ， Ｍ． Ｎ．， Ｍａｒｃｈｅｓｅ， Ｎ． Ａ． ＆ Ｇｕｉｄｏ， Ｍ． Ｅ．，発育中の鳥の網膜内の細胞における非視覚オプシンＯｐｎ３およびＯｐｎ５の発現。ミュラーグリア細胞における光応答（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－ｖｉｓｕａｌ Ｏｐｓｉｎｓ Ｏｐｎ３ ａｎｄ Ｏｐｎ５ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｉｎｎｅｒ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｂｉｒｄｓ． Ｌｉｇｈｔ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｍｕｌｌｅｒ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ），Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３， ３７６， ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１９．００３７６ （２０１９）．
３２．Ｍｅｄｅｒｏｓ， Ｓ．ら，アストロサイト－ニューロンネットワークの正確な光遺伝学的活性化のためのメラノプシン（Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ‐ｎｅｕｒｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ），Ｇｌｉａ ６７， ９１５－９３４ （２０１９）．
３３．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．ら，Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＱＳ３６６６由来の新規Ｇｑ／１１阻害剤ＹＭ－２５４８９０の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＹＭ－２５４８９０， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｇｑ／１１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＱＳ３６６６），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５９， ４５３３－４５３８， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ００４０－４０２０（０３）００６８０－ｘ （２００３）．
３４．Ｈａｒｔｗｉｇ， Ｊ．ら，ＭＡＲＣＫＳは、プロテインキナーゼＣおよびカルシウム－カルモジュリンによって調節されるアクチンフィラメント架橋タンパク質である（ＭＡＲＣＫＳ ｉｓ ａｎ ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ），Ｎａｔｕｒｅ ３５６， ６１８－６２２ （１９９２）．
３５．Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｗａｎｇ， Ｌ．－Ｐ．， Ｂｏｙｄｅｎ， Ｅ． Ｓ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，チャネルロドプシン－２および興奮性細胞の光制御（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ３， ７８５－７９２ （２００６）．
３６．Ｌｉｎ， Ｊ． Ｙ．，チャネルロドプシン変異体のユーザーガイド：特徴、制限および将来の開発（Ａ ｕｓｅｒ′ｓ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ： ｆｅａｔｕｒｅｓ， ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９６， １９－２５ （２０１１）．
３７．Ｇｏｍｅｚ， Ｊ． Ｌ．ら，化学遺伝学の開示：変換されたクロザピンによるＤＲＥＡＤＤの占有および活性化（Ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ： ＤＲＥＡＤＤ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｃｌｏｚａｐｉｎｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７， ５０３－５０７ （２０１７）．
３８．Ｋｒａｓｈｅｓ， Ｍ． Ｊ．ら，ＡｇＲＰニューロンの急速且つ可逆的な活性化がマウスの摂食行動を促進する（Ｒａｐｉｄ， ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＡｇＲＰ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｒｉｖｅｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２１， １４２４－１４２８ （２０１１）．
３９．Ｒｏｇａｎ， Ｓ． Ｃ．， Ｒｏｔｈ， Ｂ． Ｌ． ＆ Ｍｏｒｒｏｗ， Ａ． Ｌ．，ニューロンシグナル伝達の遠隔制御（Ｒｅｍｏｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６３， ２９１－３１５， ｄｏｉ：１０．１１２４／ｐｒ．１１０．００３０２０ （２０１１）．
４０．Ｃｈａｒｌｅｓ， Ａ． Ｃ．， Ｍｅｒｒｉｌｌ， Ｊ． Ｅ．， Ｄｉｒｋｓｅｎ， Ｅ． Ｒ． ＆ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎｔ， Ｍ． Ｊ．，グリア細胞における細胞間シグナル伝達：機械的刺激およびグルタミン酸に応答するカルシウム波および振とう（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｃａｌｃｉｕｍ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ），Ｎｅｕｒｏｎ ６， ９８３－９９２ （１９９１）．
４１．Ｃｏｒｎｅｌｌ－Ｂｅｌｌ， Ａ． Ｈ．， Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ， Ｓ． Ｍ．， Ｃｏｏｐｅｒ， Ｍ． Ｓ． ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． Ｊ．，培養アストロサイトにカルシウム波を誘導するグルタミン酸：長距離グリアシグナル伝達（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ： ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｇｌｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， ４７０－４７３ （１９９０）．
４２．Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｗａｎｇ， Ｌ． Ｐ．， Ｂｏｙｄｅｎ， Ｅ． Ｓ． ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ， Ｋ．，チャネルロドプシン－２および興奮性細胞の光制御（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ａｎｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３， ７８５－７９２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ９３６ （２００６）．
４３．Ｄａｖａｌｏｓ， Ｄ．ら，ＡＴＰは、インビボでの局所脳損傷に対する迅速なミクログリア反応を媒介する（ＡＴＰ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｏｃａｌ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ），Ｎａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８， ７５２－７５８ （２００５）．
４４．Ｚｈａｎｇ， Ｊ．－ｍ．ら，アストロサイトによって放出されるＡＴＰは、グルタミン酸作動性活性依存性のヘテロシナプス抑制を媒介する（ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｔｅｒｏｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｎｅｕｒｏｎ ４０， ９７１－９８２ （２００３）．
４５．Ｚｈａｎｇ， Ｚ．ら，リソソームエキソサイトーシスを介したアストロサイトからのＡＴＰ放出の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９， ９４５－９５３ （２００７）．
４６．Ｗｕ， Ｚ． ＆ Ｌｉ， Ｙ．，インビボでのプリン作動性伝達物質の動態を調査する新たな境地（Ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １５２， ３５－４３ （２０２０）．
４７．Ｗｕ， Ｚ．ら，ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０２．２４．４３２６８０ （２０２１）．
４８．Ｌａｗｌｏｒ， Ｐ． Ａ．， Ｂｌａｎｄ， Ｒ． Ｊ．， Ｍｏｕｒａｖｌｅｖ， Ａ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｄ． ＆ Ｄｕｒｉｎｇ， Ｍ． Ｊ．，非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶ血清型による哺乳動物の脳における効率的な遺伝子送達およびグリア細胞の選択的導入（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｂｙ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ １７， １６９２－１７０２ （２００９）．
４９．Ｌｅｅ， Ｙ．， Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ．， Ｓｕ， Ｍ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．，領域特異的およびアストロサイト特異的な発現に必要なＧＦＡＰプロモーターエレメント（ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ），Ｇｌｉａ ５６， ４８１－４９３ （２００８）．
５０．Ｂａｌ－Ｐｒｉｃｅ， Ａ．， Ｍｏｎｅｅｒ， Ｚ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｇ． Ｃ．，一酸化窒素は、培養ラットアストロサイトからの小胞グルタミン酸とＡＴＰの急速なカルシウム依存性放出を誘導する（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ， ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ＡＴＰ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ），Ｇｌｉａ ４０， ３１２－３２３， ｄｏｉ：１０．１００２／ｇｌｉａ．１０１２４ （２００２）．
５１．Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｋ．， Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ． ＆ Ｙｏｎｅｄａ， Ｙ．，培養アストロサイトにおけるリポ多糖類刺激性の一酸化窒素産生のＡＴＰによる増強（Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＴＰ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１７， ３７－４２ （２００３）．
５２．Ｌｅｚｍｙ， Ｊ．ら，アストロサイトＣａ（２＋）誘発ＡＴＰ放出は、有髄軸索の興奮性および伝達速度を調節する（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｃａ（２＋）－ｅｖｏｋｅｄ ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ ａｘｏｎ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７４， ｅａｂｈ２８５８， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｈ２８５８ （２０２１）．
５３．Ｔｉａｎ， Ｌ．ら，改良されたＧＣａＭＰカルシウム指示剤によるワーム、ハエおよびマウスの神経活動のイメージング（Ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｗｏｒｍｓ， ｆｌｉｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＧＣａＭＰ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ８７５－８８１ （２００９）．
５４．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｊ． Ｈ．， Ｒｉｚｚｉ， Ｇ．， Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ， Ａ． Ｍ．， Ｕｎｇ， Ｒ． Ｌ． ＆ Ｓｔｕｂｅｒ， Ｇ． Ｄ．，視床下部外側部の抑制回路構造が摂食を調整する（Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ｆｅｅｄｉｎｇ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１， １５１７－１５２１ （２０１３）．
５５．Ｓｔｕｂｅｒ， Ｇ． Ｄ． ＆ Ｗｉｓｅ， Ｒ． Ａ．，摂食および報酬のための側方視床下部回路（Ｌａｔｅｒａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｗａｒｄ），Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９， １９８－２０５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４２２０ （２０１６）．
５６．Ｌｉ， Ｙ．ら，捕食および回避のための視床下部回路（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｓｉｏｎ），Ｎｅｕｒｏｎ ９７， ９１１－９２４ ｅ９１５， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０１．００５ （２０１８）．
５７．Ｚｈａｎｇ， Ｘ． ＆ ｖａｎ ｄｅｎ Ｐｏｌ， Ａ． Ｎ．，不定帯ＧＡＢＡニューロンの活性化によって引き起こされる急速な過食症および体重増加（Ｒａｐｉｄ ｂｉｎｇｅ－ｌｉｋｅ ｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｚｏｎａ ｉｎｃｅｒｔａ ＧＡＢＡ ｎｅｕｒｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６， ８５３－８５９， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ７１００ （２０１７）．
５８．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， Ｈ． ＆ Ｔｅｒａｋｉｔａ， Ａ．，双安定色素の多様性および機能的特性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｓｔａｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔｓ），Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９， １４３５－１４４３ （２０１０）．
５９．Ｅｌｌｉｓ－Ｄａｖｉｅｓ， Ｇ． Ｃ．，ケージド化合物：細胞の化学および生理機能を制御するための光放出技術（Ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ： ｐｈｏｔｏｒｅｌｅａｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ６１９－６２８ （２００７）．
６０．Ａｄａｍｓ， Ｓ． Ｒ． ＆ Ｔｓｉｅｎ， Ｒ． Ｙ．，ケージド化合物による細胞化学の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５５， ７５５－７８４， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐｈ．５５．０３０１９３．００３５４３ （１９９３）．
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６２．Ｊｉｎｇ， Ｍ．ら，生体内コリン作動性活性をモニタリングするための最適化されたアセチルコリンセンサー（Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ），Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １７， １１３９－１１４６ （２０２０）．
６３．Ｓｕｎ， Ｆ．ら，遺伝的にコードされた蛍光センサーにより、ハエ、魚およびマウスのドーパミンを迅速且つ特異的に検出できるようになる（Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｉｎ ｆｌｉｅｓ， ｆｉｓｈ， ａｎｄ ｍｉｃｅ），Ｃｅｌｌ １７４， ４８１－４９６． ｅ４１９ （２０１８）．
６４．Ｗａｎ， Ｊ．ら，セロトニンの動態を測定するための遺伝的にコードされたセンサー（Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ），Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２４， ７４６－７５２ （２０２１）．
６５．Ｚｈａｏ， Ｙ．ら，遺伝的にコードされたＣａ２＋指示剤の拡張されたパレット（Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｌｅｔｔｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃａ２＋ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３， １８８８－１８９１ （２０１１）．
６６．Ｈｏｃｈｂａｕｍ， Ｄ． Ｒ．ら，遺伝子操作された微生物ロドプシンを用いた哺乳動物ニューロンにおける全光学的電気生理学（Ａｌｌ－ｏｐｔｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１， ８２５－８３３， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３０００ （２０１４）．
６７．Ｓａｈｅｌ， Ｊ．－Ａ．ら，光遺伝学的治療後の視覚障害患者の視覚機能の部分的回復（Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｂｌｉｎｄ ｐａｔｉｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １－７ （２０２１）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された光感受性オプシンであって、Ｇｑシグナル伝達および/または細胞の活性化のために使用され、好ましくは、前記光は、３６０～５２０ｎｍ、好ましくは４５０～５００、より好ましくは４６０～４８０ｎｍの範囲、特に４７０ｎｍの波長を有することを特徴とする、単離された光感受性オプシン。
【請求項2】
生物に由来する単離されたオプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有し、好ましくは、
前記生物における野生型オプシン、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有し、および／または
動物に由来する単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体であり、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有し、好ましくは、
前記動物における野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その断片または変異体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたオプシン。
【請求項3】
前記生物は、脊椎動物であり、好ましくは、
前記脊椎動物は、鳥類、爬虫類、魚類、両生類または哺乳類動物であり、
好ましくは、前記動物は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、エミュー、レア、シギ、ヒクイドリ、七面鳥、ウズラ、ニワトリ、フォルコンリー、タカ、ハヤブサ、ハト、インコ、冠オウム、コンゴウインコ、オウム、スズメ目（例えば、鳴き鳥）、カケス、クロウタドリ、フィンチ、ウグイスおよびスズメを含むが、これらに限定されない鳥類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、トカゲ、ヘビ、アリゲーター（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）、海亀、ワニおよびリクガメを含むが、これらに限定されない爬虫類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、ナマズ、ウナギ、サメおよびメカジキを含むが、これらに限定されない魚類であるか、又は
好ましくは、前記動物は、ヒキガエル、カエル、イモリおよびサンショウウオを含むが、これらに限定されない両生類であることを特徴とする、請求項２に記載の単離されたオプシン。
【請求項4】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ニワトリに由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ニワトリに由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有し、および／または
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、海亀に由来する単離された野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）またはその断片または変異体であり、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、海亀に由来する野生型オプシン５（Ｏｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項２に記載の単離されたオプシン。
【請求項5】
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列（ｃＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇｑシグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有し、および／または
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）またはその断片または変異体を有し、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有するか、又は
前記単離されたオプシン５（Ｏｐｎ５）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列（ｔＯｐｎ５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有し、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞を活性化する活性を有することを特徴とする、請求項２に記載の単離されたオプシン。
【請求項6】
単離された核酸であって、請求項１に記載の単離されたオプシンをコードすることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項7】
キメラ遺伝子であって、請求項６に記載の単離された核酸配列を含み、前記核酸配列は、適切な調節配列に作動可能に連結されることを特徴とする、キメラ遺伝子。
【請求項8】
ベクターであって、請求項６に記載の単離された核酸または請求項７に記載のキメラ遺伝子を含み、好ましくは、
前記ベクターは、真核ベクター、原核発現ベクター、ウイルスベクターまたは酵母ベクターであり、好ましくは、
前記ベクターは、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたは昆虫ベクターであり、好ましくは、ここで、前記ベクターは、組み換えされたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＳ、ＡＡＶＯまたはＡＡＶ１０であり、好ましくは、
発現ベクターまたは遺伝子治療ベクターであることを特徴とする、ベクター。
【請求項9】
単離された細胞または細胞培養物であって、請求項６に記載の単離された核酸または請求項７に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、単離された細胞または細胞培養物。
【請求項10】
Ｇｑシグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧｑシグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症の治療に使用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離されたオプシン、請求項６に記載の単離された核酸、または請求項７に記載のキメラ遺伝子であって、
好ましくは、前記治療は、波長範囲が３６０～５５０ｎｍ、好ましくは４５０～５００ｎｍ、より好ましくは４６０～４８０ｎｍ、特に４７０ｎｍである青色光を印加することを含み、および／または、波長が≧９２０ｎｍである光を使用して二光子活性化を実行することを含み、
好ましくは、前記Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧ ｑ シグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞の活性化から恩恵を受ける、例えば、アストロサイトの活性化、強力なＡＴＰ放出または増加されたニューロン活性から恩恵を受ける疾患または病症を含み、
好ましくは、前記Ｇ ｑ シグナル伝達および／または細胞の活性化によって媒介される疾患または病症、またはＧ ｑ シグナル伝達および／または細胞の活性化が関与する疾患または病症は、例えば膵島細胞、免疫細胞、例えば中枢ニューロン、アストロサイト、グリア細胞等の神経細胞、筋細胞、骨格細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎臓細胞および肝臓細胞、心筋細胞または血管内皮細胞のような活性化細胞から恩恵を受ける疾患または病症を含み、
好ましくは、前記疾患または病症は、自己免疫疾患、発達疾患、代謝性疾患、精神疾患、呼吸器系疾患または心血管疾患であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離されたオプシン、請求項６に記載の単離された核酸、または請求項７に記載のキメラ遺伝子。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0071】
実施例
材料および方法：
材料および方法：
【表1】
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】