特表 2024-545382 スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ、プライマーの組み合わせ及びスイカズラの品種の同定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-06

(54)【発明の名称】スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ、プライマーの組み合わせ及びスイカズラの品種の同定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6895 20180101AFI20241129BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241129BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241129BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6895 Z ZNA

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505215

(86)(22)【出願日】2023-03-27

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 CN2023084082

(87)【国際公開番号】W WO2023231532

(87)【国際公開日】2023-12-07

(31)【優先権主張番号】202211657645.3

(32)【優先日】2022-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521493695

【氏名又は名称】河南師範大学

【氏名又は名称原語表記】ＨＥＮＡＮ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ４６， Ｊｉａｎｓｈｅ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ Ｘｉｎｘｉａｎｇ， Ｈｅｎａｎ ４５３００７， ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100088063

【弁理士】

【氏名又は名称】坪内 康治

(72)【発明者】

【氏名】李 建軍

(72)【発明者】

【氏名】常 ▲しょう▼▲はい▼

(72)【発明者】

【氏名】常 翠芳

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ04

4B063QQ42

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX01

(57)【要約】

本発明は、スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ、プライマーの組み合わせ及びスイカズラの品種の同定方法を提供し、遺伝子工学分野に関するものであり、前記ＳＮＰ座位の前後１５０ｂｐの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１５で示される。本発明による方法は、簡便かつ迅速であり、短時間でスイカズラの新品種を同定することができる上、低コストである。また、高感度であり、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法と構築済みの３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを組み合わせることで、検査対象のサンプルの遺伝子型と既存のスイカズラの品種との遺伝子型との違いを効果的に検出することができる。優れた特異性を備え、本発明は、１５個の高品質なＳＮＰ座位配列に基づいて１５対のプライマーを設計し、高い特異性を備えている。本発明は、スイカズラの新品種の同定において高い参考価値があり、普及・応用にも適している。

【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせであって、
前記ＳＮＰ座位の前後１５０ｂｐの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１５で示される
ことを特徴とするスイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ。

【請求項2】

請求項１に記載のＳＮＰ座位の組み合わせを増幅するためのプライマーの組み合わせであって、
前記プライマーの塩基配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～４５で示される
ことを特徴とするプライマーの組み合わせ。

【請求項3】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～１７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８～１９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０～２１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２～２３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４～２５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～２７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８～２９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０～３１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２～３３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４～３５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６～３７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～３９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０～４１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２～４３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４～４５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５を増幅する
ことを特徴とする請求項２に記載のプライマーの組み合わせ。

【請求項4】

スイカズラの品種を同定する方法であって、
１） 検査対象のサンプルのＤＮＡを抽出し、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、請求項２又は３に記載のプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲ増幅を実行し、増幅産物を得るステップと、
２） 前記ステップ１）で得られた増幅産物に対してＳａｎｇｅｒ配列決定を実行して、検査対象のサンプルの、請求項１に記載のＳＮＰ座位における遺伝子型を取得し、ＤＮＡフィンガープリントを描画するステップと、
３） 前記ステップ２）で得られたＤＮＡフィンガープリントと、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを照合し、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位＝０である場合、「同一品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≦２である場合、「近似品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≧３である場合、「異品種」とするステップと、
を含むことを特徴とするスイカズラの品種を同定する方法。

【請求項5】

前記ステップ１）におけるＰＣＲ増幅反応系は、１μｌの鋳型ＤＮＡと、１μｌの濃度１０μＭの上流プライマーと、１μｌの濃度１０μＭの下流プライマーと、１μｌのｄＮＴＰ（ｍｉｘ）と、２．５μｌのＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒと、０．２μｌのＴａｑ酵素とを含み、滅菌脱イオン水を２５μｌとなるまで加える
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＰＣＲ増幅の手順は、９５℃で５分間プレ変性し、９４℃で３０秒間変性し、６３℃で３０秒間アニーリングし、１サイクル当たりアニーリング温度を０．５℃下げ、７２℃で３０秒間伸長し、１０サイクルし、９５℃で３０秒間変性し、５８℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３０サイクル後、７２℃で１０分間修復伸長する
ことを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記ステップ３）における構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースは３９個のスイカズラ品種を用いて通常の方法により構築される
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記３９個のスイカズラ品種は、封花１号、魯峰王、巨花１号、亜特１号、亜特立本金銀花、密県線花、密県野生、密県大毛花、豫金１号、豫金２号、特蕾１号、封金１号、豫金４号、豫金５号、密花３号、密花２号、密花１号、豫金３号、金翠蕾、白雲、龍花、龍瑶、華金２号、華金３号、華金６号、豫金６号、豫金５号１－２、九豊１号、野生線花、長針線花、小鶏爪、大鶏爪、細針観花、亜特良種、亜特５号、亜特４号、豊蕾及び淡紅金銀花である
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項9】

検査対象のサンプルの若い葉からＤＮＡを抽出すること
を特徴とする請求項４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子工学の分野を関し、特に、スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ、プライマーの組み合わせ及びスイカズラの品種の同定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）は、スイカズラ科スイカズラ属の多年生半常緑つる性低木であり、中国原産であり、主に北半球の温帯地域に分布し、日本と韓国とにも少量植栽されている。金銀花は、スイカズラ科の植物スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）の花の蕾又は咲き始めの花を乾燥したものであり、性味が甘寒で芳香があり、胃を痛めずに清熱し、血液を解毒する効果があり、古くから清熱・解毒の良薬として知られており、医療に利用されるほか、健康食品、飲料、化粧品、飼料、香料などの幅広い用途に使用されている。金銀花は、今回の新型コロナウイルス感染症の予防・治療においても重要な役割を果たしており、幅広い市場の可能性を秘めている。

【0003】

中国における金銀花は、主に河南省の密県と封丘、山東省の平邑、河北省の巨鹿の３つの生産地に分布している。河南省の金銀花は、栽培の歴史が長く、品質は最も優れているとされており、特に封丘県は、「中原の二つの花は世界一であり、封丘の二つの花は中原一である」という評判を得ている。中国明代の李時珍の『本草綱目』にも、「スイカズラはどこにでもあるが、封丘の方が優れている」という言葉が記載されている。２００３年３月、封丘の金銀花は中国品質監督検査検疫総局が発行する「原産地標記登録証明書」を獲得し、ＷＴＯ加盟国で知的財産レベルの保護を受けている。金銀花の市場需要が日ましに高まるにつれ、如何に金銀花の品種を科学的且つ正確に同定することが難題となっている。現在、金銀花の生産には、（１）金銀花の生殖質資源の損失が深刻であり、生殖質資源の収集・保存量が少ない、（２）金銀花の新品種や改良品種が少ない、（３）栽培規模が不安定で、金銀花の収穫量と品質が低下するといった課題が存在する。劣った栽培技術、管理標準化の不行き届き、深刻な病虫害、不健全な産業チェーンなどの問題により、スイカズラの生殖質資源は非常に混乱しており、異なる品種の同名、同じ品種の別名、品種間の遺伝的関係が不明などの問題がしばしば発生し、これらの問題により、品種間の知的財産紛争につながるだけでなく、スイカズラの生殖質資源のカタログ作成と保存、新品種の栽培及びスイカズラの品種の普及と応用が非常に困難である。したがって、スイカズラの品種同定の課題を解決する正確、迅速、簡便で低コストの方法の確立が求められている。現在、スイカズラの生殖質は、品種同定において形態学的及び化学的フィンガープリント分析法に限定されており、ほとんどの研究では高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動フィンガープリント（ＣＥＦＰ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）などが使用されており、ＤＮＡ分子マーカー技術やＤＮＡフィンガープリントの構築を用いた研究方法は依然として非常に不足しており、スイカズラの新品種を正確、迅速且つ便利に同定するという目的を達成することはできていない。

【0004】

一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）は、ハイスループットシーケンシング技術とＤＮＡチップ技術とに基づいた分子マーカー技術であり、高い多型性、高い共優性継承、効率的で便利な検出手段及び低コストという利点がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特定のＤＮＡ断片を増幅するために使用される分子生物学の手法であり、ＰＣＲの最大の特徴は、微量のＤＮＡを大幅に増加させることができ、サンプルの特異性を観察しやすくすることである。現時点では、ＳＮＰ分子マーカー技術やＰＣＲ技術は、スイカズラの新品種の迅速同定には使用されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記課題を解決するために、本発明は、スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせ、プライマーの組み合わせ及びスイカズラの品種の同定方法を提供し、本発明は１５個の高品質ＳＮＰ座位を提供し、特異性に基づいて１５個の特異的プライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と第一世代の配列決定技術を使用して、スイカズラの新品種の、１５個のＳＮＰ座位における遺伝子型を検出し、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの照合・解析により、スイカズラの新品種かどうかを判別する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を実現するために、本発明は以下のような技術案を提案する。

【0007】

本発明は、スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせに関するものであり、前記ＳＮＰ座位の前後１５０ｂｐの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１５で示される。

【0008】

本発明は、上記の技術案に記載のＳＮＰ座位の組み合わせを増幅するためのプライマーの組み合わせを提供し、前記プライマーの塩基配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～４５で示される。

【0009】

好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～１７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８～１９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０～２１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２～２３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４～２５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～２７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８～２９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０～３１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２～３３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４～３５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６～３７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～３９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０～４１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２～４３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４～４５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５を増幅する。

【0010】

本発明は、スイカズラ品種を同定する方法を提供し、前記方法は、
１） 検査対象のサンプルのＤＮＡを抽出し、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、上記の技術案に記載のプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲ増幅を実行し、増幅産物を得るステップと、
２） 前記ステップ１）で得られた増幅産物に対してＳａｎｇｅｒ配列決定を実行して、検査対象のサンプルの、上記の技術案に記載のＳＮＰ座位における遺伝子型を取得し、ＤＮＡフィンガープリントを描画するステップと、
３） 前記ステップ２）で得られたＤＮＡフィンガープリントと、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを照合し、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位＝０である場合、「同一品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≦２である場合、「近似品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≧３である場合、「異品種」とするステップと、を含む。

【0011】

好ましくは、前記ステップ１）におけるＰＣＲ増幅反応系は、１μｌの鋳型ＤＮＡと、１μｌの濃度１０μＭの上流プライマーと、１μｌの濃度１０μＭの下流プライマーと、１μｌのｄＮＴＰ（ｍｉｘ）と、２．５μｌのＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒと、０．２μｌのＴａｑ酵素とを含み、滅菌脱イオン水を２５μｌとなるまで加える。

【0012】

好ましくは、前記ＰＣＲ増幅の手順は、９５℃で５分間プレ変性し、９４℃で３０秒間変性し、６３℃で３０秒間アニーリングし、１サイクル当たりアニーリング温度を０．５℃下げ、７２℃で３０秒間伸長し、１０サイクルし、９５℃で３０秒間変性し、５８℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３０サイクル後、７２℃で１０分間修復伸長する。

【0013】

好ましくは、前記ステップ３）における構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースは３９個のスイカズラ品種を用いて通常の方法により構築される。

【0014】

好ましくは、前記３９個のスイカズラ品種は、封花１号、魯峰王、巨花１号、亜特１号、亜特立本金銀花、密県線花、密県野生、密県大毛花、豫金１号、豫金２号、特蕾１号、封金１号、豫金４号、豫金５号、密花３号、密花２号、密花１号、豫金３号、金翠蕾、白雲、龍花、龍瑶、華金２号、華金３号、華金６号、豫金６号、豫金５号１－２、九豊１号、野生線花、長針線花、小鶏爪、大鶏爪、細針観花、亜特良種、亜特５号、亜特４号、豊蕾及び淡紅金銀花である。

【0015】

好ましくは、検査対象のサンプルの若い葉からＤＮＡを抽出する。

【0016】

本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0017】

本発明による方法は、簡便かつ迅速であり、短時間でスイカズラの新品種を同定することができる上、低コストである。また、高感度であり、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法と構築済みの３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを組み合わせることで、検査対象のサンプルの遺伝子型と既存のスイカズラの品種との遺伝子型との違いを効果的に検出することができる。優れた特異性を備え、本発明は、１５個の高品質なＳＮＰ座位配列に基づいて１５対のプライマーを設計し、高い特異性を備えている。本発明は、スイカズラの新品種の同定において高い参考価値があり、普及・応用にも適している。

【図面の簡単な説明】

【0018】

本発明の実施例又は従来技術における技術案をより明確に説明するために、実施例で利用する必要のある添付図面について以下に簡単に説明する。

【図1】ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１の電気泳動である。

【図2】ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ２の電気泳動である。

【図3】構築済みの３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースである。

【図4】ＤＮＡの検出及び抽出の図である。

【図5】３９個のスイカズラサンプルのＰＣＡ主成分分析である。

【図6】３９個のスイカズラサンプルの進化系統樹解析図である。

【図7】３９個のスイカズラサンプルの遺伝子集団分析である。

【図8】検証実験のピークチャート結果であり、Ｍａｒｋｅｒ１～１５はＳＮＰ座位名であり、Ｔｙｐｅは各サンプルの、座位における遺伝子型である。

【図9】検証実験の品種のＤＮＡフィンガープリントである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、スイカズラの品種を同定するためのＳＮＰ座位の組み合わせに関するものであり、前記ＳＮＰ座位の前後１５０ｂｐの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１５で示され、具体的には以下の通りである。

【0020】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：
ＣＣＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＡＣＴＡＴＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：
ＡＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴＡＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＧＴＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：
ＧＡＴＣＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＡＣＴＣＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＧＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＡＣＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：
ＣＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＡＴＴＧＴＴＡＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＴＡＣＴＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＧＴＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５：
ＡＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＧＧＴＡＡＴＣＴＣＧＧＴＡＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＣＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＣＧＴＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６：
ＧＧＧＡＣＡＴＡＴＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＴＴＡＡＧＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＧＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＣＴＣＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７：
ＴＧＴＴＣＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＴＡＡＣＧＴＧＴＡＡＡＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＧＣＴＡＴＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８：
ＡＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＴＴＡＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡＧＡＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＡＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧＡＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧＣＧＣＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９：
ＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＡＴＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＣＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＡ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０：
ＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＴＧＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＡＧＴＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１：
ＣＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＣＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＴＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２：
ＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＴＡＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＧＧＡＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＧＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＧＴＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＣＴ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３：
ＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＧＴＡＡＣＣＧＣＡＡＡＴＴＴＧＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＣＣＴＧＴＧＡ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４：
ＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＣＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＴＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＴＡＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５：
ＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＡＴＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＴＣＧＴＡＧＴＡＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＧＴＡＧＴＣ。

【0021】

本発明は、上記の技術案に記載のＳＮＰ座位の組み合わせを増幅するためのプライマーの組み合わせをさらに提供し、前記プライマーの塩基配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～４５で示され、具体的には以下の通りである。

【0022】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６－Ｆ：ＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧＧＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－Ｒ：ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８－Ｆ：ＡＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＧＡＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９－Ｒ：ＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＡＣＡＣＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０－Ｆ：ＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＴＧＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１：１－Ｒ：ＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２－Ｆ：ＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３－Ｒ：ＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：４－Ｆ：ＴＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５－Ｒ：ＴＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＡＣＧＴＴＧＧＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６－Ｆ：ＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７－Ｒ：ＧＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＡＴＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８－Ｆ：ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９－Ｒ：ＡＴＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＡＣＴＣＣＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０－Ｆ：ＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１－Ｒ：ＣＴＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２－Ｆ：ＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＴＡＧＧＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３－Ｒ：ＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４－Ｆ：ＴＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＧＣＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５－Ｒ：ＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＴＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６－Ｆ：ＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＴＣＴＧＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７－Ｒ：ＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８－Ｆ：ＣＣＴＧＣＴＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９－Ｒ：ＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０－Ｆ：ＧＧＡＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１－Ｒ：ＧＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２－Ｆ：ＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３－Ｒ：ＡＡＧＴＧＧＴＡＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４－Ｆ：ＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５－Ｒ：ＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＧ。

【0023】

本発明において、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～１７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８～１９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０～２１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２～２３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を増幅し、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４～２５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～２７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８～２９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０～３１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８を増幅し、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２～３３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４～３５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６～３７はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～３９はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２を増幅し、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０～４１はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２～４３はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４～４５はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７を増幅する。

【0024】

本発明は、スイカズラ品種を同定する方法を提供し、前記方法は、
１） 検査対象のサンプルのＤＮＡを抽出し、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、上記の技術案に記載のプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲ増幅を実行し、増幅産物を得るステップと、
２） 前記ステップ１）で得られた増幅産物に対してＳａｎｇｅｒ配列決定を実行して、検査対象のサンプルの、上記の技術案に記載のＳＮＰ座位における遺伝子型を取得し、ＤＮＡフィンガープリントを描画するステップと、
３） 前記ステップ２）で得られたＤＮＡフィンガープリントと、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを照合し、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位＝０である場合、「同一品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≦２である場合、「近似品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≧３である場合、「異品種」とするステップと、を含む。

【0025】

本発明によれば、検査対象のサンプルのＤＮＡを抽出し、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、上記の技術案に記載のプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲ増幅を実行し、増幅産物を得る。本発明によれば、好ましくは、検査対象のサンプルの若い葉からＤＮＡを抽出する。本発明において、ＤＮＡを抽出する方法について特に限定せず、当業者であれば、植物組織のＤＮＡを抽出する一般的な方法に従えばよい。本発明において、前記ＰＣＲ増幅反応系は、好ましくは、１μｌの鋳型ＤＮＡと、１μｌの濃度１０μＭの上流プライマーと、１μｌの濃度１０μＭの下流プライマーと、１μｌのｄＮＴＰ（ｍｉｘ）と、２．５μｌのＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒと、０．２μｌのＴａｑ酵素とを含み、滅菌脱イオン水を２５μｌとなるまで加える。本発明において、好ましくは、前記ＰＣＲ増幅の手順は、９５℃で５分間プレ変性し、９４℃で３０秒間変性し、６３℃で３０秒間アニーリングし、１サイクル当たりアニーリング温度を０．５℃下げ、７２℃で３０秒間伸長し、１０サイクルし、９５℃で３０秒間変性し、５８℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３０サイクル後、７２℃で１０分間修復伸長する。

【0026】

本発明によれば、前記ステップ１）で得られた増幅産物に対してＳａｎｇｅｒ配列決定を実行して、検査対象のサンプルの、上記の技術案に記載のＳＮＰ座位における遺伝子型を取得し、ＤＮＡフィンガープリントを描画する。配列決定が完了した後に、Ｃｈｒｏｍａｓソフトウェア又はＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用してピークチャートファイル（．ａｂｌ）を開き、ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用して検査対象のサンプルの配列と１５ｓｎｐ配列とを照合し、検査対象のサンプルの遺伝子型を得ることができる。

【0027】

本発明によれば、得られたＤＮＡフィンガープリントと、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとを照合し、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位＝０である場合、「同一品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≦２である場合、「近似品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≧３である場合、「異品種」とする。

【0028】

本発明において、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースの構築方法について特に限定せず、一般的な方法を用いて構築すればよく、例えば、ＳＮＰ分子マーカー技術を利用して構築してもよく、操作方法もいずれも一般的な方法である。

【0029】

本発明の具体的な実施形態において、前記構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースの構築方法は、好ましくは以下のステップを含む。

【0030】

（１） ＤＮＡの抽出とライブラリの構築
スイカズラサンプルのＤＮＡを抽出し（ＤＮＡ抽出プロセスは上記の方法と同じなので、説明を省く）、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００紫外分光光度計を使用してＤＮＡの質量と濃度を測定し、５００ｎｇのゲノムＤＮＡを採取し、０．６ＵのＥｃｏＲＩ （ＮＥＢ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、ＡＴＰ （ＮＥＢ）及びＥｃｏＲＩ リンカー（サンプルを区別するためのＩｎｄｅｘ配列を含む）を加え、３７℃で３時間反応させ、６５℃で１時間アニーリングする。次に、制限エンドヌクレアーゼＮｌａＩＩＩ（ＮＥＢ）とＮｌａＩＩＩリンカーとを加え、３７℃で３時間反応させる。反応が完了した後に、ＰＣＲ装置に６５℃で３０分間放置しエンドヌクレアーゼを不活性化させ、その後、アガロースゲル電気泳動を使用してライゲーション産物の断片を選択し、４００～６００ｂｐを選択して酵素切断産物を回収してＱｕｂｉｔ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して回収された産物に対してＤＮＡ定量し、２４個のサンプルを等量混合し、最終的にＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑキットを使用して混合生成物についてＤＮＡライブラリを構築する。

【0031】

（２） ｄｄＲＡＤ簡易配列決定とデータの品質管理
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ ＰＥ１５０を使用してライブラリ構築後のサンプルに対して配列決定を行い、ソフトウェアｆａｓｔｐ（バージョン：０．２０．０）を使用してローデータ内の低品質配列をフィルタリングして除去し、Ｃｌｅａｎ Ｄａｔａデータを得て、パラメータを－ｑ ５ －ｎ ５に設定して、主に以下のｒｅａｄｓを取り除く。一、 不明な塩基の数Ｎ＜５のｒｅａｄｓを取り除く。二、 Ｒｅａｄｓの５０％長さの塩基品質値が５よりも小さいｒｅａｄｓを取り除く。三、リンカー配列を取り除く。

【0032】

（３） 参照ゲノムとの照合
ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ，０．７．１７－ｒ１１８８）を使用して参照ゲノムと照合し（参照ゲノム名：ＧＷＨＡＡＺＥ００００００００．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ、ダウンロードＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｎｇｄｃ．ｃｎｃｂ．ａｃ．ｃｎ／ｓｅａｒｃｈ／？ｄｂＩｄ＝ｇｗｈ＆ｑ＝ＳＡＭＣ０９７３５６）、パラメータを－Ｍ －Ｒに設定する。照合により生成されたｓａｍファイルを、ｓａｍｔｏｏｌｓ（バージョン：１．９）ソフトウェアを使用してｂａｍフォーマットに変換する。次に、ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓ（バージョン：２．２１．２）を使用してＰＣＲ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓマーキングを行う。その後、後の分析のために、高品質なｐｒｏｐｅｒ ｒｅａｄｓのみ残しておく。

【0033】

（４） ＳＮＰの検出とアノテーション
ＳＮＰの検出は、主にＧＡＴＫ（バージョン：４．１．４．１）ソフトウェアツールキットを使用して行う。Ｃｌｅａｎ Ｒｅａｄｓの、参照ゲノムにおける位置決定の結果に基づいて、ＧＡＴＫを使用して一塩基多型を検出し、最終的なＳＮＰ座位セットを得て、ＳＮＰの統計を実行する。主な検出プロシージャは以下の通りである。一、ＢＷＡ照合により得られた結果に対して、Ｐｉｃａｒｄ（バージョン：０．７．１７－ｒ１１８８）のＭａｒｋ Ｄｕｐｌｉｃａｔｅツールを使用して重複を削除し、ＰＣＲ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎによる影響を除去する。二、ＧＡＴＫを使用して変異検出（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ）を行い、主にＳＮＰとＩｎＤｅｌとを含む。三、ＧＡＴＫを使用して変異座位の品質値の再校正（ＶＱＳＲ）を行う。

【0034】

四、ＧＡＴＫを使用して、得られた変異結果に対してフィルタリングを行い、信頼できる変異結果を選択する。

【0035】

（５） 集団の遺伝構造解析
一、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）。ＳＮＰに基づいて、ソフトウェアＧＣＴＡ（バージョン：１．９２．１）（ｈｔｔｐ：／／ｃｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｃｔａ／＃Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）を用いて、３９個のサンプルの主成分クラスタリング結果を得て、異なる形質と特徴を有する個体をクラスタリングし、異なるサブグループに分類し、結果を図５に示す。

【0036】

二、進化系統樹解析（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）。ソフトウェアＦａｓｔＴｒｅｅ（バージョン：２．１．９）の最尤法（Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ＭＬ）を使用して、３９個のサンプル間の進化的関係を説明する進化系統樹を構築し、結果を図６に示す。

【0037】

三、集団の遺伝構造解析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）。集団の遺伝構造解析は、ａｄｍｉｘｔｕｒｅソフトウェア（バージョン：１．３．０）（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ａｄｍｉｘｔｕｒｅ／）を使用して行われる。３９個のスイカズラのサンプルに含まれる祖先の数及び類似度を観察する。その結果が図７に示されている。

【0038】

（６） ＤＮＡフィンガープリントの構築と分析。できるだけ少ないマーカーを用いてできるだけ多くの品種を同定するというＤＮＡフィンガープリント構築の原則に従うことにより、簡単、効率的、経済的という目的を達成する。マーカーのＰＩＣ値の大きさや分布頻度などに基づいて、検出率が高く、多型性が高く、全品種を区別できるコアマーカーを１５個選択し、ＤＮＡフィンガープリントを構築した。マーカー同定の効率が図３に示されている。

【0039】

本発明では、ホモ接合型遺伝子型Ｃ／Ｃ、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ｇはそれぞれ黄色、緑、青、紫の４色で表され、ヘテロ接合型遺伝子型は灰色で表され、欠損遺伝子型は白色で表され、サンプル番号に対応する品種を以下の表１に示す。
表１ スイカズラの品種と番号

【0040】

本発明をさらに説明するために、以下に、実施例を参照して本発明について詳細に説明するが、これらを本発明の保護範囲に対する限定として理解すべきではない。
実施例１

【0041】

１．鋳型ＤＮＡの抽出
（１）５０～１００ｍｇの新鮮な植物組織を液体窒素中で充分に粉に研磨し、１．５ｍｌのｌ遠心管に移す。

【0042】

（２）６５℃で予熱した６００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＰＣＢと１２ μｌのβ－メルカプトエタノールを加える。均一となるように振盪して混合し、６５℃の水浴に２５分間置き、間欠的に均一となるように混合する。

【0043】

（３）６００μｌのクロロホルムを加え、よく混ぜ、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上層の水相をきれいな１．５ｍｌ遠心管に吸引したあとに、等体積のフェノール：クロロホルム（１：１、ｐＨ８．０）と繰り返し混合し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を取り、１～３回間繰り返し抽出する。

【0044】

（４）上層水と等体積のＢｕｆｆｅｒ ＢＤを加え、３～５回均一となるように転倒混和した後、上層水と等体積の無水エタノールを加えて均一となるようによく混ぜ、ピペットを用いて全部吸着カラムに加え、室温で２分間静置する。１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、コレクションチューブ内の廃液を捨てる。

【0045】

（５）吸着カラムをコレクションチューブに戻し、５００μｌのＰＷ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、コレクションチューブ内の廃液を捨てる。

【0046】

（６）吸着カラムをコレクションチューブに戻し、５００μｌのＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１００００ ｒｐｍで１分間遠心分離し、コレクションチューブ内の廃液を捨てる。

【0047】

（７） 吸着カラムをコレクションチューブに戻し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。

【0048】

（８） 吸着カラムを取り出し、新たな１．５ｍｌの遠沈管に移し、吸着膜の中心に５０μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒを加え、３分間静置し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、得られたＤＮＡ溶液を－２０℃で保存するか、そのまま後続の実験に使用する。

【0049】

２． ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
２．１ ＰＣＲ反応系
表２ ＰＣＲ反応系

【0050】

プライマーの塩基配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６～４５に示す。

【0051】

２．２ ＰＣＲ反応条件
表３ ＰＣＲ反応条件

【0052】

２．３ 電気泳動検出ストリップ
５μｌのＰＣＲ産物を取り、１１％アガロースゲル電気泳動を行う。電気泳動パラメータ：１５０Ｖ、１００ｍＡ、１０～２０分間の電気泳動観察（電気泳動図を参照）ＤＮＡマーカーが２種類あり、それぞれ図１及び２を参照する。

【0053】

３． Ｓａｎｇｅｒ配列決定
３．１ ＰＣＲ産物の精製と回収
（１）アガロースゲル電気泳動を通じて目的のＤＮＡ断片を他の断片からできるだけ分離し、ターゲットＤＮＡ断片を含むアガロースゲルブロックを清潔なメス刃で切り出し、１．５ｍＬの遠沈管に入れて秤量する。

【0054】

（２）ゲルブロックの重量と濃度に応じて、アガロース１００ｍｇあたり３００～６００μｌのＢｕｆｆｅｒＢ２を加える（ゲルブロックが１００ｍｇ未満の場合は、水を加えて１００ｍｇとする）。

【0055】

（３）遠心管を５０℃の水浴に５～１０分間置き、ゲルブロックが完全に溶解するまで間欠的に均一となるように混合する。

【0056】

（５）溶解済みの溶液を全て吸着カラムに移し、８０００Ｘｇで３０秒間遠心分離する。コレクションチューブ内の液体を捨て、吸着カラムを同じコレクションチューブに置く。

【0057】

（６）３００μｌのＢｕｆｆｅｒＢ２を吸着カラムに加え、９０００Ｘｇで３０秒間遠心分離する。コレクションチューブ内の液体を捨て、吸着カラムを同じコレクションチューブに置く。

【0058】

（７）５００μｌのＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎを吸着カラムに加え、９０００Ｘｇで３０秒間遠心分離する。コレクションチューブ内の液体を捨て、吸着カラムを同じコレクションチューブに置く。

【0059】

（８）ステップ７を１回繰り返す。

【0060】

（９）空の吸着カラムとコレクションチューブを遠心分離機に入れ、９．０００Ｘｑで１分間遠心分離する。

【0061】

（１０）１５～４０μｌのＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを吸着膜の中心に加え、室温で１～２分間静置し、９０００Ｘｇで１分間遠心分離する。得られたＤＮＡ溶液は－２０℃で保存するか、その後の実験に使用する。

【0062】

３．２ データ分析
ｒｅｓｕｌｔ ｇｒｏｕｐ内で結果を検索し、ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して解析し、ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用して検査対象のサンプルの配列を１５ｓｎｐ配列と照合し、検査対象のサンプルの遺伝子型を取得できる。

【0063】

４． 結果の判定：Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用して、検査対象のサンプルの、１５個のＳＮＰ座位における遺伝子型のＤＮＡフィンガープリントを描画し、構築済みのスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベース（図３）を照合する。検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位＝０である場合、「同一品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≦２である場合、「近似品種」として、検査対象のサンプルとスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの異なる座位≧３である場合、「異品種」とする。

【0064】

実験結果：
３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースにない「亜特立本」、「百農２号」及び「魏紫」との３つのスイカズラの品種を選択して、上記の実験手順に従って検証実験を実施し、本方法の信頼性と有効性を検証した。実験結果は次のとおりである。
表４ 検証実験による遺伝子型結果

【0065】

注：ＲＥＦは参照ゲノムの遺伝子型であり、ＡＬＴは検証結果である。遺伝子型：Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ。
表５ ３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの照合結果

【0066】

「表５ ３９個のスイカズラＤＮＡフィンガープリントデータベースとの照合結果」によれば、「亜特立本」、「百農２号」及び「魏紫」とフィンガープリントデータベースと照合した結果、データベース内の既存の３９品種との異なる座位は全て＞３であり、「異品種」に属することが分かる。

【0067】

検証実験を通じて、本発明による方法は、短時間でスイカズラ品種の遺伝子型を取得でき、新品種のスイカズラを同定でき、且つ低コスト、高感度、良好な特異性を有し、スイカズラの新品種の同定のための高い参考価値があり、普及・応用にも適していることがさらに証明された。

【0068】

上述の実施例により、本発明を詳細に説明したが、これらは本発明の全部の実施例ではなく、一部の実施例にすぎず、当業者であれば、創造的な労働を行うことなく得る全ての実施例は、全て本発明の保護範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図 】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】