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特表2024-545386細胞の修復を促進し、高い保湿美白効果を有する燕窩ペプチドの製造方法及び応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-06
(54)【発明の名称】細胞の修復を促進し、高い保湿美白効果を有する燕窩ペプチドの製造方法及び応用
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20241129BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20241129BHJP
C07K 14/465 20060101ALI20241129BHJP
A61K 35/57 20150101ALI20241129BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241129BHJP
A61K 38/01 20060101ALI20241129BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20241129BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241129BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20241129BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20241129BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 B
A23L33/18
C07K14/465
A61K35/57
A61P17/00
A61K38/01
A61K8/98
A61Q19/00
A61Q19/02
A61K8/64
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518368
(86)(22)【出願日】2023-08-02
(85)【翻訳文提出日】2024-03-19
(86)【国際出願番号】 CN2023110809
(87)【国際公開番号】W WO2024098848
(87)【国際公開日】2024-05-16
(31)【優先権主張番号】202211398048.3
(32)【優先日】2022-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524107034
【氏名又は名称】厦門市燕之屋絲濃食品有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＸＩＡＭＥＮ ＹＡＮ ＰＡＬＡＣＥ ＳＥＥＬＯＮＧ ＦＯＯＤ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０１， ＮＯ．３ Ｘｉａｎｇｍｉｎｇ Ｒｏａｄ， （Ｘｉａｎｇ’ａｎ） Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ， Ｘｉａｍｅｎ Ｔｏｒｃｈ Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ， Ｘｉａｍｅｎ， Ｆｕｊｉａｎ ３６１１００ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】範 群艶
(72)【発明者】
【氏名】柳 訓材
(72)【発明者】
【氏名】郭 宝忠
(72)【発明者】
【氏名】白 偉娟
(72)【発明者】
【氏名】連 建梅
(72)【発明者】
【氏名】李 有泉
【テーマコード（参考）】
4B018
4B064
4C083
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018MD22
4B018MD69
4B018ME04
4B018ME06
4B018MF12
4B064AG01
4B064CA21
4B064CB01
4B064CC01
4B064CC06
4B064CC07
4B064CD21
4B064CE06
4B064DA01
4B064DA10
4C083AA071
4C083AA072
4C083AD411
4C083AD412
4C083CC02
4C083EE12
4C083EE13
4C083EE16
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA41
4C084NA14
4C084ZA89
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA04
4C087BB54
4C087CA03
4C087CA47
4C087NA14
4C087ZA89
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA16
4H045FA70
4H045GA01
4H045GA10
(57)【要約】
本願は、燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、アルカリプロテアーゼで燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収するステップと、を含み、遠心分離の条件は、速度が約１００００～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０～３０ｍｉｎであることを含み、限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００～２００ｎｍである、燕窩ペプチドの製造方法に関する。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍであり、好ましくは、限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１５０ｎｍ～２００ｎｍである、ことを特徴とする燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項2】
１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、約１０ｇ～５０ｇであり、好ましくは、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、約２５ｇ～３５ｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項3】
煮込み時間は、約０．５～２時間であり、好ましくは、煮込み時間は、約１．７５～２時間である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項4】
均質化処理の条件は、パワーが約１０ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、好ましくは、均質化処理の条件は、パワーが約２５ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が約２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項5】
酵素分解の条件は、温度が約５０℃～６０℃で、ｐＨ値が約８．０～１０．０で、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎで、１ｇあたりの燕窩に対応する前記アルカリプロテアーゼの使用量が約６Ｕ～９Ｕであることを含む、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項6】
酵素失活の方法は、加熱による酵素失活であり、加熱による酵素失活の条件は、酵素分解により得られた反応系を約８０℃～１００℃に加熱し、約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ保持することを含む、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項7】
前記限外ろ過液中の溶媒を除去するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項8】
前記溶媒を除去するステップは、前記限外ろ過液を濃縮し、得られた濃縮物を噴霧乾燥させるステップを含む、ことを特徴とする請求項７に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項9】
前記溶媒を除去するステップは、（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の約１／３～約１／８であること、
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１５０℃～２００℃で、排気温度＞約７０℃であることを含み、好ましくは、噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１６５℃～１７５℃で、排気温度＞約９０℃であることを含むこと、という技術的特徴のうちの１つ以上を有する、ことを特徴とする請求項８に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項10】
前記燕窩ペプチドにおいて、総アミノ酸含有量が約６６．７５ｗｔ％～６８．８９ｗｔ％であり、シアル酸含有量が約６．１４ｗｔ％～６．６４ｗｔ％であり、水分含有量が約１１．０１ｗｔ％～１２．０１ｗｔ％である、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、ことを特徴とする燕窩ペプチド。
【請求項12】
請求項１１に記載の燕窩ペプチドの、医薬品又は保湿、美白、修復及び／又は抗酸化効果を有する食品又はスキンケア製品の製造における使用。【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、２０２２年１１月９日に出願された、出願番号が２０２２１１３９８０４８３であり、名称が「細胞の修復を促進し、高い保湿美白効果を有する燕窩ペプチドの製造方法及び応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容全体は参照により本願に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本願は、食品加工の技術分野に関し、特に、細胞の修復を促進し、高い保湿美白効果を有する燕窩ペプチドの製造方法及び応用に関する。
【背景技術】
【0003】
研究者は、燕窩がプロテアーゼにより加水分解された後に生成した燕窩ペプチドが、優れた血圧降下、抗ウイルスなどの効果を有することを見出した。特に、燕窩ペプチドは、いくつかの機能において燕窩よりも優れている。また、燕窩ペプチドは、比較的低い分子量を有するため、人体に吸収されやすく、経皮吸収される能力を有すると考えられる。以上の利点に基づいて、燕窩ペプチドは、食品、医薬品、スキンケア製品などの分野において、消費者、製造業者、研究者から期待されており、広い応用の将来性を有する活性物質であると考えられる。
【0004】
従来の燕窩ペプチドの製造方法は、例えば、以下のとおりである。
【0005】
ＣＮ１０７６６８３１２Ａには、燕窩を水に入れて煮込んだ後に得られた燕窩液を、まず、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ３溶液でｐＨ値８に調整するステップと、次に、アルカリプロテアーゼを添加して、部分的に酵素分解し、沸騰水で酵素を３ｍｉｎ失活させた後に冷却するステップと、さらに、真空高低速ホイップと高低温脱泡を３回繰り返し処理するステップと、を含む、燕窩タンパク液の複合脱泡方法が記載される。
【0006】
ＣＮ１１１５２８３３２Ａには、乾燥燕窩を精製水で浸漬した後に不純物を除去し、粉砕し、乾燥させて、使用に備えるという燕窩の浸漬、選別のステップ（１）と、ステップ（１）で浸漬した燕窩に精製水を添加して煮込み、そして、細かく粉砕して、燕窩ペーストを得るという煮込み、すりつぶしのステップ（２）と、ステップ（２）で製造された燕窩ペーストの濃度及びｐＨを調整し、そして、調製後の燕窩ペーストに中性プロテアーゼを添加し、撹拌して酵素分解した後、酵素を失活させ、冷却して１００～２００メッシュのふるいにかけた後、１回目の酵素分解液を得るという１回目の生物酵素分解のステップ（３）と、ステップ（３）で製造された１回目の酵素分解液を均質化処理し、粗ろ過して酵素分解均質化処理液を得るという均質化処理、ろ過のステップ（４）と、ステップ（４）で製造された酵素分解均質化処理液の濃度及びｐＨを調整し、そして、調製後の酵素分解均質化処理液に複合プロテアーゼを添加し、撹拌して酵素分解した後、酵素を失活させ、冷却して２回目の酵素分解液を得るという２回目の生物酵素分解のステップ（５）と、ステップ（５）で製造された２回目の酵素分解液を精密ろ過し、ＲＯ膜で逆浸透濃縮した後、噴霧乾燥させ、燕窩ペプチドを得るという精製、噴霧乾燥のステップ（６）と、を含む、燕窩ペプチドの製造方法が記載される。
【0007】
ＣＮ１１２００６２７６Ａには、乾燥燕窩を精製水で浸漬した後に不純物を除去し、粉砕し、乾燥させた後にふるいにかけ、使用に備えるという燕窩の浸漬、選別のステップ（１）と、ステップ（１）でふるいにかけた燕窩にアルギニン溶液を添加して燕窩液を調製し
、湯煎後に冷却するという燕窩液調製、煮込みのステップ（２）と、ステップ（２）で処理した溶液のｐＨ値を８～１０に調整し、アルカリプロテアーゼを添加して、部分的に酵素分解し、そして、高温沸騰水で酵素を失活させ、酵素分解液を得るという酵素分解のステップ（３）と、ステップ（３）で調製した酵素分解液を低温真空でホイップした後、超音波で脱泡し、高圧均質化処理して酵素分解均質化処理液を得るという超音波脱泡、高圧均質化処理のステップ（４）と、ステップ（４）で調製した酵素分解均質化処理液に氷砂糖及びクエン酸を添加して、そして、真空で噴霧乾燥させ、燕窩粉末を得るという噴霧乾燥のステップ（５）と、ステップ（５）で調製した燕窩粉末の表面にリン脂質をスプレーして、湯戻しインスタント燕窩粉末を得るというリン脂質スプレーのステップ（６）と、を含む、湯戻しインスタント燕窩粉末の製造方法が記載される。
、湯煎後に冷却するという燕窩液調製、煮込みのステップ（２）と、ステップ（２）で処理した溶液のｐＨ値を８～１０に調整し、アルカリプロテアーゼを添加して、部分的に酵素分解し、そして、高温沸騰水で酵素を失活させ、酵素分解液を得るという酵素分解のステップ（３）と、ステップ（３）で調製した酵素分解液を低温真空でホイップした後、超音波で脱泡し、高圧均質化処理して酵素分解均質化処理液を得るという超音波脱泡、高圧均質化処理のステップ（４）と、ステップ（４）で調製した酵素分解均質化処理液に氷砂糖及びクエン酸を添加して、そして、真空で噴霧乾燥させ、燕窩粉末を得るという噴霧乾燥のステップ（５）と、ステップ（５）で調製した燕窩粉末の表面にリン脂質をスプレーして、湯戻しインスタント燕窩粉末を得るというリン脂質スプレーのステップ（６）と、を含む、湯戻しインスタント燕窩粉末の製造方法が記載される。
【0008】
ＣＮ１１３５６４２１８Ａには、乾燥燕窩を熱水中で加熱処理して原料液を得て、使用に備えるという原料前処理のステップ（１）と、前記原料液を酵素分解タンクに入れ、ｐＨを調整した後、昇温加熱し、プロテアーゼを添加して酵素分解を行って酵素分解液を得るという酵素分解のステップ（２）と、前記酵素分解液を沸騰水浴中で失活させ後、限外ろ過を行い、ろ過液を回収するという酵素失活、限外ろ過のステップ（３）と、前記ろ過液を噴霧乾燥させて、前記美白活性小分子燕窩ペプチド粉末を得るステップ（４）と、を含む、美白活性小分子燕窩ペプチドの製造方法が記載される。
【0009】
ＣＮ１１１０１９９８４Ａには、燕窩原料を乾燥させ、粉砕処理した後、前処理済みの燕窩を得るという前処理のステップＩと、前処理済みの燕窩に前処理済みの燕窩体積の１０～３０倍の水を添加し、均一に撹拌してから、３０～４５℃で１５～４０ｍｉｎ超音波処理して、燕窩ペーストを得て、次に、燕窩ペーストにトリプシン、アルカリプロテアーゼ、フレーバーザイム、ペプシン、及び酵素安定化剤を添加し、前記燕窩ペースト、トリプシン、アルカリプロテアーゼ、フレーバーザイム、ペプシン、及び酵素安定化剤の質量比が１００：（０．５～１）：（０．５～１）：（０．５～１）：（０．５～１）：（０．０１～０．０５）であり、４０～６０℃で２～７ｈ酵素分解し、１００～１０５℃で酵素を５～１０ｍｉｎ失活させ、冷却し、酵素分解液を得るという抽出のステップＩＩと、上記酵素分解液を遠心分離処理し、得られた上澄み液をろ過し、真空凍結乾燥処理した後、製品を得るというろ過、乾燥のステップＩＩＩと、を含む、燕窩中のシアル酸の効率的な抽出方法が記載される。
【0010】
ＣＮ１１５２２６８８６Ａには、砕かれた燕窩を水で浸漬し、ミリオーダーの顆粒になるまで湿式研磨し、そして、超音波破砕した後、アルカリプロテアーゼを添加して酵素分解を行い、酵素を失活させた後、遠心分離し、ろ過してシアル酸に富んだ抽出液を得るというシアル酸抽出液調製のステップ（１）と、再添加した乾燥燕窩を前記抽出液で浸漬してから、超音波装置に入れて超音波膨潤を行い、最後に、糸状になるようにホイップし、不純物を除去し、脱水し、煮込んだ後、高シアル酸の燕窩製品を得るという抽出液再添加のステップ（２）と、を含む、抽出液の再添加法による高シアル酸の燕窩製品の製造方法が記載される。
【0011】
ＣＮ１１１０９６４６２Ｂには、１：４０の比で燕窩に水を添加して常温で５～１２ｈ浸漬するという燕窩の浸漬のステップＳ１と、浸漬後の燕窩を９５℃～１００℃の水浴で１～２ｈ湯煎するという煮込みのステップＳ２と、煮込んだ燕窩水溶液を降温させた後、ホモジナイザーで１～２回均質化処理するという均質化処理のステップＳ３と、均質化処理液にアルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、フレーバーザイムを順に添加し、５０～６５℃で４～８ｈ酵素分解するステップであって、前記アルカリプロテアーゼの成分は、４５～６０％の水、５～１０％のプロテアーゼＡ、３５～４５％のプロピレングリコール及び０．２～０．４％の塩化カルシウムを含み、前記中性プロテアーゼは、３５～５０％の水、５～１０％のプロテアーゼＢ、３３～４５％のソルビトール、７～１０％のプロピ
レングリコール及び５％の塩化ナトリウムを含み、プロテアーゼＡは、バチルス・リケニフォルミスの生成物であり、プロテアーゼＢは、バチルス・アミロリケファシエンスの生成物であるという酵素分解のステップＳ４と、得られた酵素分解液を８０～９０℃で１５～２０ｍｉｎ失活させるという酵素失活のステップＳ５と、失活後の上澄み液を降温させた後、ろ過膜でろ過するステップであって、ろ過範囲が１００～１２０ｍｍであるというろ過膜ろ過のステップＳ６と、ろ過後の上澄み液を遠心分離して残渣を除去するステップであって、遠心分離の回転数は、３０００～５０００ｒｐｍであるという遠心分離のステップＳ７と、遠心分離後の上澄み液を回収して、上澄み液を得るという上澄み液取りのステップＳ８と、燕窩の上澄み液とβ－シクロデキストリンの１：４～６の質量比で、β－シクロデキストリン溶液を調製するというマイクロカプセル化のステップＳ９と、－３５℃～－３６℃に安定させた後、凍結乾燥を行い、粉砕してマイクロカプセル化燕窩ペプチド製品を得るという凍結乾燥のステップＳ１０と、を含む、バイオ酵素分解・精製した無公害の燕窩ポリペプチド及びその脱苦味法が記載される。
レングリコール及び５％の塩化ナトリウムを含み、プロテアーゼＡは、バチルス・リケニフォルミスの生成物であり、プロテアーゼＢは、バチルス・アミロリケファシエンスの生成物であるという酵素分解のステップＳ４と、得られた酵素分解液を８０～９０℃で１５～２０ｍｉｎ失活させるという酵素失活のステップＳ５と、失活後の上澄み液を降温させた後、ろ過膜でろ過するステップであって、ろ過範囲が１００～１２０ｍｍであるというろ過膜ろ過のステップＳ６と、ろ過後の上澄み液を遠心分離して残渣を除去するステップであって、遠心分離の回転数は、３０００～５０００ｒｐｍであるという遠心分離のステップＳ７と、遠心分離後の上澄み液を回収して、上澄み液を得るという上澄み液取りのステップＳ８と、燕窩の上澄み液とβ－シクロデキストリンの１：４～６の質量比で、β－シクロデキストリン溶液を調製するというマイクロカプセル化のステップＳ９と、－３５℃～－３６℃に安定させた後、凍結乾燥を行い、粉砕してマイクロカプセル化燕窩ペプチド製品を得るという凍結乾燥のステップＳ１０と、を含む、バイオ酵素分解・精製した無公害の燕窩ポリペプチド及びその脱苦味法が記載される。
【0012】
ＣＮ１０９８５２６５６Ａには、燕窩を燕窩粉末に粉砕し、１：１５の固液比で燕窩粉末を水に入れて浸漬し、フレンチプレスで破砕処理して、燕窩ペーストを得るステップ（１）と、前記燕窩ペーストに３％の前記燕窩粉末重量のプロテアーゼを添加して、３ｈ酵素分解し、沸騰水浴中で酵素を失活させ、遠心分離処理して、酵素分解後の上澄み液Ｙ１と沈殿物Ｙ２を得るステップ（２）と、前記沈殿物Ｙ２を取って１：２０の固液比で水に入れて再懸濁して燕窩再懸濁液に調製し、さらに燕窩再懸濁液に１％の前記燕窩粉末重量のプロテアーゼを添加して、２ｈ酵素分解し、沸騰水浴中で酵素を失活させ、遠心分離処理して、酵素分解後の上澄み液Ｙ３と沈殿物Ｙ４を得るステップ（３）と、前記酵素分解後の上澄み液Ｙ１と酵素分解後の上澄み液Ｙ３を混合して、酵素分解後の上澄み液Ｙ５を得るステップ（４）と、前記酵素分解後の上澄み液Ｙ５を逆浸透膜で脱塩処理し、膜ろ過装置でろ過処理して、燕窩ポリペプチド精製液を得るステップ（５）と、前記燕窩ポリペプチド精製液を凍結乾燥させて、燕窩ポリペプチド粉末を得るステップ（６）と、を含む、燕窩ポリペプチド粉末の製造方法が記載される。
【0013】
しかしながら、従来の製造方法で製造された燕窩ペプチドと燕窩原料とは、成分的には、一致しないことが多く、その機能特性及び応用分野は、特性評価及び明確化されていない。本願は、このような事情に鑑みて提案されたものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
これにより、本願の様々な実施例によれば、細胞の修復を促進し、高い保湿美白効果を有する燕窩ペプチドの製造方法及び応用を提供し、技術的手段は、以下のとおりである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本願の第１態様では、
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、
前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍである、燕窩ペプチドの製
造方法を提供する。
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、
前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍである、燕窩ペプチドの製
造方法を提供する。
【0016】
本願のいくつかの実施形態では、限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１５０ｎｍ～２００ｎｍである。
【0017】
本願のいくつかの実施形態では、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、１０ｇ～５０ｇである。
【0018】
本願のいくつかの実施形態では、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、２５ｇ～３５ｇである。
【0019】
本願のいくつかの実施形態では、煮込み時間は、０．５～２時間であり、好ましくは、煮込み時間は、１．７５～２時間である。
【0020】
本願のいくつかの実施形態では、均質化処理の条件は、パワーが１０ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、好ましくは、均質化処理の条件は、パワーが２５ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含む。
【0021】
本願のいくつかの実施形態では、酵素分解の条件は、温度が５０℃～６０℃で、ｐＨ値が５．０～９．０で、時間が１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎで、１ｇあたりの燕窩に対応する前記アルカリプロテアーゼの使用量が６Ｕ～９Ｕであることを含む。
【0022】
本願のいくつかの実施形態では、酵素失活の方法は、加熱による酵素失活であり、加熱による酵素失活の条件は、酵素分解により得られた反応系を８０℃～１００℃に加熱し、１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ保持することを含む。
【0023】
本願のいくつかの実施形態では、前記製造方法は、前記限外ろ過液中の溶媒を除去するステップをさらに含む。
【0024】
本願のいくつかの実施形態では、前記溶媒を除去するステップは、前記限外ろ過液を濃縮し、得られた濃縮物を噴霧乾燥させるステップを含む。
【0025】
本願のいくつかの実施形態では、前記溶媒を除去するステップは、
（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の１／３～約１／８であること、
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１５０℃～２００℃で、排気温度＞約７０℃であることを含むこと、という技術的特徴のうちの１つ以上を有する。
（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の１／３～約１／８であること、
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１５０℃～２００℃で、排気温度＞約７０℃であることを含むこと、という技術的特徴のうちの１つ以上を有する。
【0026】
本願のいくつかの実施形態では、噴霧乾燥の条件は、吸気温度が１６５℃～１７５℃で、排気温度＞９０℃であることを含む。
【0027】
本願のいくつかの実施形態では、前記燕窩ペプチドにおいて、総アミノ酸含有量が６６．７５ｗｔ％～６８．８９ｗｔ％であり、シアル酸含有量が６．１４ｗｔ％～６．６４ｗｔ％であり、水分含有量が１１．０１ｗｔ％～１２．０１ｗｔ％である。
【0028】
本願の第２態様では、第１態様に記載の製造方法により製造される燕窩ペプチドを提供する。
【0029】
本願の第３態様では、第２態様に記載の燕窩ペプチドの、医薬品又は保湿、美白、修復及び／又は抗酸化効果を有する食品又はスキンケア製品の製造における応用を提供する。
【0030】
本願の１つ又は複数の実施例の詳細は、以下の説明で述べられ、本願の他の特徴、目的及び利点は、明細書及びその特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0031】
本願の実施例における技術的手段をより明確に説明し、本願及びその有益な効果をより完全に理解するために、以下、実施例の説明に使用される必要がある図面を簡単に説明する。明らかなように、以下の説明における図面は、本願のいくつかの実施例に過ぎず、当業者であれば、創造的な労働をせずに、これらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。
【0032】
【図1】実施例１における燕窩ペプチドのＧＰＣ保持スペクトルである。
【図2】実施例１における燕窩ペプチドの化学抗酸化能を示す図であり、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
【図3】実施例１における燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性であり、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
【図4】実施例１における燕窩ペプチドのＭＲＣ－５細胞傷跡に対する修復作用である。
【図5】実施例２における燕窩ペプチドのＧＰＣ保持スペクトルである。
【図6】実施例２における燕窩ペプチドの化学抗酸化能を示す図であり、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
【図7】実施例２における燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性であり、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
【図8】実施例２における燕窩ペプチドのＭＲＣ－５細胞傷跡に対する修復作用である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、図面、実施形態及び実施例を参照しながら、本願をさらに詳細に説明する。これらの実施形態及び実施例は、本願を説明するためのものに過ぎず、本願の範囲を限定するものではなく、これらの実施形態及び実施例を提供する目的は、本願の開示内容に対する理解をより完全かつ全面的にすることである。さらに、本願は、本明細書に記載されている実施形態及び実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、多くの異なる形態で実現することが可能であり、当業者であれば、本願の趣旨を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができ、これらの均等な形成も本願の保護範囲に含まれることを理解されたい。また、以下の記載においては、多くの具体的な詳細が本願の完全な理解を与えるために述べられる。本願は、これらの具体的な詳細の一部又は全てがなくても実施できることを理解されたい。
【0034】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本願の説明において、本明細書で用いられる用語は、実施形態及び実施例を説明することのみを目的としており、本願を限定することを意図したものではない。
用語
用語
【0035】
本明細書で使用される用語又は表現は、別段の説明又は矛盾がない限り、以下の意味を有する。
【0036】
本明細書で使用される用語「及び／又は」、「又は／及び」、「並びに／若しくは」の選択範囲は、２つ以上の関連する列挙された項目のうちのいずれか１つの項目を含み、関連する列挙された項目の任意かつ全ての組み合わせをさらに含み、前記任意かつ全ての組み合わせは、任意の２つの関連する列挙された項目、任意のより多くの関連する列挙された項目、又は全ての関連する列挙された項目の組み合わせを含む。なお、「及び／又は」、「又は／及び」、「並びに／若しくは」から選択される少なくとも２つの接続詞の組み合わせで少なくとも３つの項目を接続する場合、理解できるように、本願において、当該技術的手段は、いずれも「論理積」で接続される技術的手段を含み、さらに、いずれも「論理和」で接続される技術的手段を含むことは言うまでもない。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ、Ｂ及びＡ＋Ｂの３つの意味を含む。また例えば、「Ａ及び／又はＢ及び／又はＣ及び／又はＤ」という技術的手段は、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのうちのいずれか１つ（即ち、全てが「論理和」で接続される技術的手段）を含み、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの任意かつ全ての組み合わせを含み、即ち、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのうちのいずれか２つ又は３つの組み合わせを含み、さらに、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの組み合わせ（即ち、全てが「論理積」で接続される技術的手段）を含む。
【0037】
本願において、「複数」、「複数種」、「複数回」、「多様」などは、特に断らない限り、数量が２つ以上であることを指す。例えば、「１つ又は複数」は、１つ又は２つ以上を示す。
【0038】
本明細書において使用される「その組み合わせ」、「その任意の組み合わせ」、「その任意の組み合わせ方式」などは、列挙された項目のうちの任意の２つ以上の項目の全ての適切な組み合わせ方式を含む。
【0039】
本明細書において、「適切な組み合わせ方式」、「適切な方式」、「任意の適切な方式」などに記載の「適切」は、本願の技術的手段を実施し、本願の技術的課題を解決し、本願の所望の技術的効果を奏することができることを基準とする。
【0040】
本明細書において、「好ましい」、「より好ましい」、「さらに好ましい」、「最も好ましい」は、より効果的な実施形態又は実施例を説明するためのものに過ぎず、本願の保護範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0041】
本願において、「さらに」、「またさらに」、「特に」などは、目的を説明するためのものであり、内容の差異を示すが、本願の保護範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【0042】
本願において、「選択的に」、「選択的な」、「選択的」は、存在しても、存在しなくてもよく、つまり「存在する」又は「存在しない」２つの並列案から選択されるいずれかを指す。１つの技術的手段において、特に断らない限り、また、矛盾や相互の制約関係がない限り、「選択的」が複数存在する場合、各「選択的」は、それぞれ独立している。
【0043】
本願において、「第１態様」、「第２態様」、「第３態様」、「第４態様」などにおいて、「第１」、「第２」、「第３」、「第４」などの用語は説明目的でのみ用いられており、相対的な重要性や量を示したり暗示したりするものとして理解されるべきではなく、示された技術的特徴の重要性や量を暗黙的に示すものとして理解されるべきではない。また、「第１」、「第２」、「第３」、及び「第４」などは、非網羅的な列挙説明の目的のみを果たし、数量に対するクローズド型限定を構成しないことを理解されたい。
【0044】
本願において、オープン形式で記載された技術的特徴には、列挙された特徴からなるクローズド型技術的手段も、列挙された特徴を含むオープン型技術的手段も含まれる。
【0045】
本願において、数値区間（即ち、数値範囲）について、特に断らない限り、選択可能な数値分布は、上記数値区間内で連続すると見なされ、当該数値範囲の２つの数値端点（即ち、最小値及び最大値）、及び当該２つの数値端点間の各数値を含む。特に断らない限り、数値区間は、当該数値区間内の整数のみを指す場合、当該数値範囲の２つの端点の整数、及び２つの端点間の各整数を含み、本明細書において、各整数を直接列挙することに相当し、例えば、ｔが１～１０から選ばれる整数であることは、ｔが１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０からなる整数群から選ばれるいずれか１つの整数であることを表す。また、特徴や特性を説明する範囲が複数ある場合には、それらを組み合わせてもよい。換言すれば、特に断らない限り、本明細書に開示される範囲は全て、その中に包摂されるありとあらゆるサブ範囲を包含するものと理解されるべきである。
【0046】
本願における温度パラメータは、特に断らない限り、恒温処理であってもよく、一定の温度区間内で変動してもよい。前記恒温処理は、機器制御の精度範囲内で温度が変動することを許容することを理解されたい。例えば、±５℃、±４℃、±３℃、±２℃、±１℃の範囲での変動が許容される。
【0047】
本願において、％（ｗ／ｗ）とｗｔ％は、いずれも重量百分率を表し、％（ｖ／ｖ）は、体積百分率を指し、％（ｗ／ｖ）は、質量体積百分率を指す。
【0048】
本願において言及される全ての文献は、各々の文献が個別に参照により組み込まれるのと同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本願の目的及び／又は技術的手段と矛盾しない限り、本願に係る引用文献は、その全体が、かつ全ての目的で本明細書に組み込まれる。本願において、引用文献に関する場合、関連する技術的特徴、用語、名詞、フレーズなどの引用文献における定義も併せて組み込まれる。本願において、引用文献に関する場合、組み込まれる関連する技術的特徴の例、好ましい実施形態も参照として本願に組み込まれてもよいが、本願を実施できるものに限定される。引用内容が本願の説明と矛盾する場合、本願を基準として、又は本願の説明に従って、適応的に修正することを理解されたい。
本願の第１態様
本願の第１態様
【0049】
本願は、
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、
前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉ
ｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍである、燕窩ペプチドの製造方法を提供する。
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、
前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉ
ｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍである、燕窩ペプチドの製造方法を提供する。
【0050】
本願における遠心分離の条件は、速度（ｒｐｍ）が、例えば、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００であり、時間（ｍｉｎ）が、例えば、１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２８、３０である。
【0051】
本願における限外ろ過に用いられる膜の孔径（ｎｍ）は、例えば、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００である。好ましくは、限外ろ過に用いられる膜の孔径は、１５０ｎｍ～２００ｎｍである。
【0052】
好ましくは、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、１０ｇ～５０ｇ（例えば、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ）である。
【0053】
好ましくは、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、２５ｇ～３５ｇ（例えば、２５ｇ、２６ｇ、２７ｇ、２８ｇ、２９ｇ、３０ｇ、３１ｇ、３２ｇ、３３ｇ、３４ｇ、３５ｇ）である。
【0054】
好ましくは、煮込み時間は、０．５ｈ～２ｈ（例えば、０．５ｈ、０．６ｈ、０．７ｈ、０．８ｈ、０．９ｈ、１ｈ、１．１ｈ、１．２ｈ、１．３ｈ、１．４ｈ、１．５ｈ、１．６ｈ、１．７ｈ、１．８ｈ、１．９、２ｈ）であり、好ましくは、煮込み時間は、１．７５ｈ～２ｈである。
【0055】
好ましくは、均質化処理の条件は、パワーが１０ＭＰａ～３０ＭＰａ（例えば、１０ＭＰａ、１１ＭＰａ、１２ＭＰａ、１３ＭＰａ、１４ＭＰａ、１５ＭＰａ、１６ＭＰａ、１７ＭＰａ、１８ＭＰａ、１９ＭＰａ、２０ＭＰａ、２１ＭＰａ、２２ＭＰａ、２３ＭＰａ、２４ＭＰａ、２５ＭＰａ、２６ＭＰａ、２７ＭＰａ、２８ＭＰａ、２９ＭＰａ、３０ＭＰａ）で、時間が１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ（例えば、１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２２ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、２８ｍｉｎ、３０ｍｉｎ）であることを含み、好ましくは、均質化処理の条件は、パワーが２５ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が２０ｍｉｎ－３０ｍｉｎであることを含む。
【0056】
好ましくは、酵素分解の条件は、温度が５０℃～６０℃（例えば、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃）で、ｐＨ値が８．０～１０．０（例えば、８、８．５、９、９．５、１０）で、時間が５ｈ～６ｈ（例えば、５ｈ、５．１ｈ、５．２ｈ、５．３ｈ、５．４ｈ、５．５ｈ、５．６ｈ、５．７ｈ、５．８ｈ、５．９ｈ、６ｈ）で、１ｇあたりの燕窩に対応する前記アルカリプロテアーゼの使用量が６Ｕ～９Ｕ（例えば、６Ｕ、６．５Ｕ、７Ｕ、７．５Ｕ、８Ｕ、８．５Ｕ、９Ｕ）であることを含む。
【0057】
好ましくは、酵素失活の方法は、加熱による酵素失活であり、加熱による酵素失活の条件は、酵素分解により得られた反応系を８０℃～１００℃（例えば、８０℃、８２℃、８４℃、８６℃、８８℃、９０℃、９２℃、９４℃、９６℃、９８℃、１００℃）に加熱し、１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ（例えば、１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２２ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、２８ｍｉｎ、３０ｍｉｎ）保持することを含む。
【0058】
好ましくは、前記製造方法は、前記限外ろ過液中の溶媒を除去するステップをさらに含む。
【0059】
好ましくは、前記溶媒を除去するステップは、前記限外ろ過液を濃縮し、得られた濃縮物を噴霧乾燥させるステップを含む。
【0060】
好ましくは、前記溶媒を除去するステップは、
（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の１／３～１／８（例えば、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８）であること、
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が１５０℃～２００℃（例えば、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃）で、排気温度＞７０℃（例えば、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃）であることを含み、好ましくは、噴霧乾燥の条件は、吸気温度が１６５℃～１７５℃であり、排気温度＞９０℃であることを含むこと、という技術的特徴のうちの１つ以上を有する。。
（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の１／３～１／８（例えば、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８）であること、
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が１５０℃～２００℃（例えば、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃）で、排気温度＞７０℃（例えば、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃）であることを含み、好ましくは、噴霧乾燥の条件は、吸気温度が１６５℃～１７５℃であり、排気温度＞９０℃であることを含むこと、という技術的特徴のうちの１つ以上を有する。。
【0061】
好ましくは、総アミノ酸含有量が６６．７５ｗｔ％～６８．８９ｗｔ％であり、シアル酸含有量が６．１４ｗｔ％～６．６４ｗｔ％であり、水分含有量が１１．０１ｗｔ％～１２．０１ｗｔ％である。
【0062】
好ましくは、１００ｇあたりの前記燕窩ペプチドにおいて、６６．７５％～６８．８９％のアミノ酸を含有し、前記アミノ酸に占める質量割合として、必須アミノ酸の含有量が３９．３４％～４４．８９％であり、半必須アミノ酸の含有量が１１．１９％～１１．３４％であり、非必須アミノ酸の含有量が４３．９９％～４９．３１％であり、非極性アミノ酸の含有量が３４．８３％～３７．４９％であり、極性アミノ酸の含有量が２５．２９％～３０．４０％であり、酸性アミノ酸の含有量が１３．０６％～１７．０２％であり、塩基性アミノ酸の含有量が１６．５５％～２４．２３％であり、芳香族アミノ酸の含有量が１１．４２％～１８．７８％であり、
前記アミノ酸に占める質量割合として、前記必須アミノ酸中のリジンの含有量が５．２１％～１３．０３％であり、フェニルアラニンの含有量が４．７５％～７．７６％であり、ロイシンの含有量が３．９０％～７．６７％であり、前記非必須アミノ酸中のチロシンの含有量が６．６７％～９．６６％であり、
前記ポリペプチドに占める質量割合として、数平均分子量が２９１４～２９１９Ｄａであるポリペプチドの含有量は、６．０８％～８．０７％であり、数平均分子量が１５７６～１５８９Ｄａであるポリペプチドの含有量は、１１．３６％～１１．６０％であり、数平均分子量が７１０～７１５Ｄａであるポリペプチドの含有量は、３４．１１％～３４．６９％であり、数平均分子量が２０７～２１０Ｄａであるポリペプチドの含有量は、４６．２２％～４７．８７％である。
本願の第２態様
前記アミノ酸に占める質量割合として、前記必須アミノ酸中のリジンの含有量が５．２１％～１３．０３％であり、フェニルアラニンの含有量が４．７５％～７．７６％であり、ロイシンの含有量が３．９０％～７．６７％であり、前記非必須アミノ酸中のチロシンの含有量が６．６７％～９．６６％であり、
前記ポリペプチドに占める質量割合として、数平均分子量が２９１４～２９１９Ｄａであるポリペプチドの含有量は、６．０８％～８．０７％であり、数平均分子量が１５７６～１５８９Ｄａであるポリペプチドの含有量は、１１．３６％～１１．６０％であり、数平均分子量が７１０～７１５Ｄａであるポリペプチドの含有量は、３４．１１％～３４．６９％であり、数平均分子量が２０７～２１０Ｄａであるポリペプチドの含有量は、４６．２２％～４７．８７％である。
本願の第２態様
【0063】
本願は、第１態様に記載の製造方法により製造される燕窩ペプチドを提供する。
本願の第３態様
本願の第３態様
【0064】
本願は、第２態様に記載の燕窩ペプチドの、医薬品又は保湿、美白、修復及び／又は抗酸化効果を有する食品又はスキンケア製品の製造における応用を提供する。
具体的な実施例
具体的な実施例
【0065】
以下、実施例を参照しながら、本願の実施形態を詳細に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本願の範囲を限定するものではない。以下の実施例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は、本願により提供される案内を優先的に参照し、本分野の実験マニュアル又は通常の条件に従って行ってもよく、メーカーで薦めている条件に従って行ってもよく、本分野の既知の実験方法を参照してもよ
い。
い。
【0066】
下記具体的な実施例において、原料成分の用量パラメータについて、特に断らない限り、秤量精度範囲内のわずかな偏差が存在する可能性がある。温度及び時間パラメータについて、機器の検査精度又は操作精度による許容可能な偏差が許容される。
【実施例1】
【0067】
１ 材料と方法
１．１ 材料
ＨａＣａｔ細胞、ＭＲＣ－５細胞は、中国の武漢普諾賽生命科技有限公司（Ｐｒｏｃｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）から購入した。ＣＣＫ－８は、米国のＡＰＥｘＢＩＯ社から購入した。ＴＡＣキット（ａｂ６５３２９）は、英国のＡｂｃａｍ社から購入した。ヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（ＥＵ２５５６）は、中国のＦｉｎｅＴｅｓｔ社から購入した。シアル酸標準品、トリプトファン標準品は、米国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、アミノ酸標準品は、北京世紀奥科生物技術有限公司から購入した。他の試薬は、分析用試薬以上の純度を有するものであり、米国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
１．１ 材料
ＨａＣａｔ細胞、ＭＲＣ－５細胞は、中国の武漢普諾賽生命科技有限公司（Ｐｒｏｃｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）から購入した。ＣＣＫ－８は、米国のＡＰＥｘＢＩＯ社から購入した。ＴＡＣキット（ａｂ６５３２９）は、英国のＡｂｃａｍ社から購入した。ヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（ＥＵ２５５６）は、中国のＦｉｎｅＴｅｓｔ社から購入した。シアル酸標準品、トリプトファン標準品は、米国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、アミノ酸標準品は、北京世紀奥科生物技術有限公司から購入した。他の試薬は、分析用試薬以上の純度を有するものであり、米国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【0068】
１．２ 燕窩ペプチドの生産
燕窩ペプチドの生産プロセスは、原料洗浄、煮込み、すりつぶし、均質化処理、ｐＨ調整、酵素分解、酵素失活、冷却、遠心分離、限外ろ過、濃縮、乾燥、及び小分けである。具体的には、可食の燕窩原料（３０％ｗ／ｖ）を洗浄した後、二重釜に入れて沸騰水で２時間煮込んだ。その後、煮込んだ可食の燕窩を３０ＭＰａの条件下で３０ｍｉｎ均質化処理した。均質化処理された可食の燕窩ペーストを酵素分解タンクに入れて、０．０１％の炭酸ナトリウムで反応系のｐＨを９．０の範囲に安定化させた。酵素分解タンクに６Ｕ／ｇのアルカリプロテアーゼを添加し、酵素分解温度を５１℃に維持して６時間酵素分解反応させた。酵素分解の終了後、反応系の温度を８５℃に調整し、２０ｍｉｎ保持して酵素を十分に失活させた。酵素失活の終了後、試料を１３０００ｒｐｍの条件下で３０ｍｉｎ遠心分離して、可食の燕窩ペプチドの粗試料溶液を得た。可食の燕窩ペプチド溶液を２００ｎｍの限外ろ過膜でろ過して、可食の燕窩ペプチド溶液を得た。最後に、該溶液を噴霧乾燥させて可食の燕窩ペプチド粉末を得て、噴霧乾燥の吸気温度は、１７０℃であり、排気温度＞９０℃であった。
燕窩ペプチドの生産プロセスは、原料洗浄、煮込み、すりつぶし、均質化処理、ｐＨ調整、酵素分解、酵素失活、冷却、遠心分離、限外ろ過、濃縮、乾燥、及び小分けである。具体的には、可食の燕窩原料（３０％ｗ／ｖ）を洗浄した後、二重釜に入れて沸騰水で２時間煮込んだ。その後、煮込んだ可食の燕窩を３０ＭＰａの条件下で３０ｍｉｎ均質化処理した。均質化処理された可食の燕窩ペーストを酵素分解タンクに入れて、０．０１％の炭酸ナトリウムで反応系のｐＨを９．０の範囲に安定化させた。酵素分解タンクに６Ｕ／ｇのアルカリプロテアーゼを添加し、酵素分解温度を５１℃に維持して６時間酵素分解反応させた。酵素分解の終了後、反応系の温度を８５℃に調整し、２０ｍｉｎ保持して酵素を十分に失活させた。酵素失活の終了後、試料を１３０００ｒｐｍの条件下で３０ｍｉｎ遠心分離して、可食の燕窩ペプチドの粗試料溶液を得た。可食の燕窩ペプチド溶液を２００ｎｍの限外ろ過膜でろ過して、可食の燕窩ペプチド溶液を得た。最後に、該溶液を噴霧乾燥させて可食の燕窩ペプチド粉末を得て、噴霧乾燥の吸気温度は、１７０℃であり、排気温度＞９０℃であった。
【0069】
１．３ 燕窩ペプチドの成分の特性評価
１．３．１ 燕窩ペプチド中のシアル酸の特性評価
液体クロマトグラフィーにより、燕窩ペプチド中のシアル酸に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ３０６３６－２０１４）を参照した。
１．３．１ 燕窩ペプチド中のシアル酸の特性評価
液体クロマトグラフィーにより、燕窩ペプチド中のシアル酸に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ３０６３６－２０１４）を参照した。
【0070】
１．３．２ 燕窩ペプチド中のアミノ酸の特性評価
液体クロマトグラフィー－質量分析計（ＬＣＭＳ ８０５０、島津）により、燕窩ペプチド中のアミノ酸に対して特性評価を行った。アミノ酸標準試料を前処理した後、機器により検出して対照とした。具体的には、移動相で燕窩ペプチド試料（１００ｍｇ／ｍＬ）を調製し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン樹脂フィルムでろ過した後、機器により検出した。液体クロマトグラフィーの条件は、カラムが島津Ｃ１８－ＡＱ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．９μｍで、流速が３００μＬ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、試料注入量が５μＬで、分析時間が１６ｍｉｎで、移動相Ａが０．０５％ギ酸溶液で、移動相Ｂがメタノールで、溶出手順を表１に示すことである。質量分析条件は、イオン源がエレクトロスプレーイオン源ＥＳＩで、モニタリング方式が正イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）であり、インタフェース電圧が２．５ｋＶで、霧化ガス流量が３Ｌ／ｍｉｎで、加熱ガス流量が１０Ｌ／ｍｉｎ、インタフェース温度が３００℃で、ＤＬ温度が２５０℃で
、加熱ブロック温度が４００℃、乾燥ガス流量が１０Ｌ／ｍｉｎで、ＣＩＤガスが２７０ｋＰａであることである。
液体クロマトグラフィー－質量分析計（ＬＣＭＳ ８０５０、島津）により、燕窩ペプチド中のアミノ酸に対して特性評価を行った。アミノ酸標準試料を前処理した後、機器により検出して対照とした。具体的には、移動相で燕窩ペプチド試料（１００ｍｇ／ｍＬ）を調製し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン樹脂フィルムでろ過した後、機器により検出した。液体クロマトグラフィーの条件は、カラムが島津Ｃ１８－ＡＱ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．９μｍで、流速が３００μＬ／ｍｉｎで、カラム温度が４０℃で、試料注入量が５μＬで、分析時間が１６ｍｉｎで、移動相Ａが０．０５％ギ酸溶液で、移動相Ｂがメタノールで、溶出手順を表１に示すことである。質量分析条件は、イオン源がエレクトロスプレーイオン源ＥＳＩで、モニタリング方式が正イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）であり、インタフェース電圧が２．５ｋＶで、霧化ガス流量が３Ｌ／ｍｉｎで、加熱ガス流量が１０Ｌ／ｍｉｎ、インタフェース温度が３００℃で、ＤＬ温度が２５０℃で
、加熱ブロック温度が４００℃、乾燥ガス流量が１０Ｌ／ｍｉｎで、ＣＩＤガスが２７０ｋＰａであることである。
【表1】
【0071】
１．３．３ 燕窩ペプチド中の水分の特性評価
直接乾燥法により、燕窩ペプチド中の水分に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ５００９．３－２０１６）を参照した。
直接乾燥法により、燕窩ペプチド中の水分に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ５００９．３－２０１６）を参照した。
【0072】
１．３．４ 燕窩ペプチドの分子量の特性評価
ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）により、燕窩ペプチドの分子量に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ３１６４５－２０１８）を参照した。
ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）により、燕窩ペプチドの分子量に対して特性評価を行い、特性評価方法は、中国国家標準規格（ＧＢ ３１６４５－２０１８）を参照した。
【0073】
１．４ 燕窩ペプチドの化学抗酸化能の評価
１．４．１ ＤＰＰＨラジカル消去能の評価
ＤＰＰＨラジカル溶液調製：ＤＰＰＨを無水エタノールで０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液に調製した。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に２ｍＬの無水エタノール及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬの無水エタノールを添加した。上記測定対象溶液を均一に混合し、室温で３０ｍｉｎ放置した。最後に、混合溶液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後の上澄み液の５１７ｎｍでの吸光度値を測定して、試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率を算出した。試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
式中、Ａ０は、２ｍＬの無水エタノール＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ１は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬの無水エタノールの吸光度値である。
１．４．１ ＤＰＰＨラジカル消去能の評価
ＤＰＰＨラジカル溶液調製：ＤＰＰＨを無水エタノールで０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液に調製した。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に２ｍＬの無水エタノール及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬの無水エタノールを添加した。上記測定対象溶液を均一に混合し、室温で３０ｍｉｎ放置した。最後に、混合溶液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後の上澄み液の５１７ｎｍでの吸光度値を測定して、試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率を算出した。試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
【数1】
Ａ１は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬの無水エタノールの吸光度値である。
【0074】
１．４．２ ＡＢＴＳラジカル消去能の評価
ＡＢＴＳラジカル溶液調製：７ｍｍｏｌ／ＬのＡＢＴＳ水溶液と２．４５ｍｍｏｌ／Ｌの過硫酸カリウムを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、室温遮光下で１２－１６時間反応させた。その後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳで希釈し、７３４ｎｍでの吸光度値を０．７０±０．０２にした。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に０．４ｍＬの超純水及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、遮光下で６ｍｉｎ反応させた後、７３４ｎｍで吸光度値を測定して、試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率を算出した。試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
式中、Ａ０は、０．４ｍＬの超純水＋４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液の吸光度値であり、Ａ１は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬの超純水の吸光度値である。
ＡＢＴＳラジカル溶液調製：７ｍｍｏｌ／ＬのＡＢＴＳ水溶液と２．４５ｍｍｏｌ／Ｌの過硫酸カリウムを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、室温遮光下で１２－１６時間反応させた。その後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳで希釈し、７３４ｎｍでの吸光度値を０．７０±０．０２にした。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に０．４ｍＬの超純水及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、遮光下で６ｍｉｎ反応させた後、７３４ｎｍで吸光度値を測定して、試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率を算出した。試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
【数2】
Ａ２は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬの超純水の吸光度値である。
【0075】
１．４．３ ヒドロキシラジカル消去能の評価
試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１１ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ１）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１０ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ２）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸及び１１ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、３７℃で６０ｍｉｎ水浴した後、５１０ｎｍで吸光度値を測定して、試料のヒドロキシラジカルに対する消去率を算出した。試料のヒドロキシラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。ＯＨ
式中、
Ａ０は、１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液であり、
Ａ１は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１０ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液であり、
Ａ２は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水である。
試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１１ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ１）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１０ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ２）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸及び１１ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、３７℃で６０ｍｉｎ水浴した後、５１０ｎｍで吸光度値を測定して、試料のヒドロキシラジカルに対する消去率を算出した。試料のヒドロキシラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。ＯＨ
【数3】
Ａ０は、１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液であり、
Ａ１は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１０ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液であり、
Ａ２は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水である。
【0076】
１．４．４ 総抗酸化能の評価
総抗酸化能（ＴＡＣ）は、市販の検出キット（Ａｂｃａｍ ａｂ６５３２９）で測定した。
総抗酸化能（ＴＡＣ）は、市販の検出キット（Ａｂｃａｍ ａｂ６５３２９）で測定した。
【0077】
１．５ 燕窩ペプチドの細胞内効果の評価
１．５．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性の評価
燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性は、ＣＣＫ－８によって測定され、それにより、燕窩ペプチドの細胞内の安全濃度範囲を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、それぞれ９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（ＣＣＬ－１７０Ｂ－８、シンガポールＥＳＣＯ）に入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。細胞の生存率は、下記式により算出した。
試料群は、燕窩ペプチド試料＋細胞であり、
対照群は、ＭＥＭ培地＋細胞であり、
ブランク群は、ＭＥＭ培地である。
１．５．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性の評価
燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性は、ＣＣＫ－８によって測定され、それにより、燕窩ペプチドの細胞内の安全濃度範囲を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、それぞれ９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（ＣＣＬ－１７０Ｂ－８、シンガポールＥＳＣＯ）に入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。細胞の生存率は、下記式により算出した。
【数4】
対照群は、ＭＥＭ培地＋細胞であり、
ブランク群は、ＭＥＭ培地である。
【0078】
１．５．２ Ｈ２Ｏ２により誘導されるＨａＣａｔ細胞損傷に対する燕窩ペプチドの保護作用の評価
まず、Ｈ２Ｏ２のＨａＣａｔ細胞に対する毒性を測定して、細胞損傷を誘導するＨ２Ｏ２の濃度を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。その後、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度のＨ２Ｏ２溶液（５０μｍｏｌ／ｍＬ、１００μｍｏｌ／ｍＬ、２００μｍｏｌ／ｍＬ、３００μｍｏｌ／ｍＬ、５００μｍｏｌ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。本実施例は、ＨａＣａｔ細胞損傷を誘導するＨ２Ｏ２の濃度が３００μｍｏｌ／Ｌであることを実験により決定した。
まず、Ｈ２Ｏ２のＨａＣａｔ細胞に対する毒性を測定して、細胞損傷を誘導するＨ２Ｏ２の濃度を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。その後、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度のＨ２Ｏ２溶液（５０μｍｏｌ／ｍＬ、１００μｍｏｌ／ｍＬ、２００μｍｏｌ／ｍＬ、３００μｍｏｌ／ｍＬ、５００μｍｏｌ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。本実施例は、ＨａＣａｔ細胞損傷を誘導するＨ２Ｏ２の濃度が３００μｍｏｌ／Ｌであることを実験により決定した。
【0079】
その後、Ｈ２Ｏ２により誘導されるＨａＣａｔ細胞損傷に対する燕窩ペプチドの保護作用を測定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。その後、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。計算式は、１．５．１欄に記載される計算式と同じである。
【0080】
１．５．３ ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響の評価ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量は、市販のヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（ＥＵ
２５５６）で測定した。
２５５６）で測定した。
【0081】
１．５．４ Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制作用の評価
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、団体標準（Ｔ／ＳＨＲＨ ０２７－２０１９）を参考に測定した。
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、団体標準（Ｔ／ＳＨＲＨ ０２７－２０１９）を参考に測定した。
【0082】
１．５．５ ＭＲＣ－５細胞傷跡に対する燕窩ペプチドの修復作用の評価
対数期のＭＲＣ－５細胞を５×１０４個／ｍＬで懸濁し、６ウェルプレートに接種し、各ウェルに２ｍＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。その後、ピペットチップを用いて細胞培養プレートにおいて細胞傷跡を残し、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、撮影した。その後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れてインキュベートし、定期的に取り出して撮影した（１２時間、２４時間）。
対数期のＭＲＣ－５細胞を５×１０４個／ｍＬで懸濁し、６ウェルプレートに接種し、各ウェルに２ｍＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。その後、ピペットチップを用いて細胞培養プレートにおいて細胞傷跡を残し、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、撮影した。その後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れてインキュベートし、定期的に取り出して撮影した（１２時間、２４時間）。
【0083】
１．６ データ分析
全ての実験において、新たに調製した試料を用いて、少なくとも２回繰り返した。統計分析は、ＳＰＳＳ（２６．０バージョン、ＳＰＳＳ社、米国）で行った。Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定、単変量分析（ＡＮＯＶＡ）で平均値の比較を行い、５％レベルでの有意差が認められた。
全ての実験において、新たに調製した試料を用いて、少なくとも２回繰り返した。統計分析は、ＳＰＳＳ（２６．０バージョン、ＳＰＳＳ社、米国）で行った。Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定、単変量分析（ＡＮＯＶＡ）で平均値の比較を行い、５％レベルでの有意差が認められた。
【0084】
２ 結果と検討
２．１ 燕窩ペプチドの成分
燕窩ペプチドの基本成分を表２に示した。本実施例のプロセスで試作された燕窩ペプチドは、総アミノ酸含有量が６９．１０％で、シアル酸含有量が６．６４％で、水分含有量が１１．０１％である。
２．１ 燕窩ペプチドの成分
【表2】
【0085】
【表3】
【0086】
表３は、燕窩ペプチド中の１８種のアミノ酸の組成及び含有量を示した。まず、燕窩ペプチド中のアミノ酸含有量は、６８．８９ｇ／１００ｇであり、リジンは、燕窩ペプチド中
の最も豊富なアミノ酸であり、総アミノ酸（ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＴＡＡ）の１３．０３％を占め、次は、チロシン（９．６６％）、フェニルアラニン（７．７６％）、ロイシン（７．６７％）である。特に、燕窩ペプチド中の総必須アミノ酸は、３０．９０ｇ／１００ｇになり、総アミノ酸の４４．８９％を占め、鶏卵（４．７～７．０ｇ／１００ｇ）及び牛乳（１．１ｇ／１００ｇ）などの他のタンパク質に富んだ食物よりも明らかに高い。なお、燕窩ペプチド中の乳児の成長に必要なヒスチジンは、２．６２ｇ／１００ｇになる。ＦＡＯ／ＷＨＯによって推奨されるアミノ酸栄養基準によれば、必須アミノ酸（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ＥＡＡ）とＴＡＡとの比が約０．４であり、かつＥＡＡと非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＮＥＡＡ）との比が０．６以上であるタンパク質は、良質なタンパク質である。表３から分かるように、燕窩ペプチド中のＥＡＡ／ＴＡＡは、０．４４であり、ＥＡＡ／ＮＥＡＡは、１．０２であり、ＦＡＯ／ＷＨＯ基準よりもはるかに優れている。したがって、燕窩ペプチドは、単純に必須アミノ酸を補う観点から見ても、良質な必須アミノ酸由来であると考えられる。
の最も豊富なアミノ酸であり、総アミノ酸（ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＴＡＡ）の１３．０３％を占め、次は、チロシン（９．６６％）、フェニルアラニン（７．７６％）、ロイシン（７．６７％）である。特に、燕窩ペプチド中の総必須アミノ酸は、３０．９０ｇ／１００ｇになり、総アミノ酸の４４．８９％を占め、鶏卵（４．７～７．０ｇ／１００ｇ）及び牛乳（１．１ｇ／１００ｇ）などの他のタンパク質に富んだ食物よりも明らかに高い。なお、燕窩ペプチド中の乳児の成長に必要なヒスチジンは、２．６２ｇ／１００ｇになる。ＦＡＯ／ＷＨＯによって推奨されるアミノ酸栄養基準によれば、必須アミノ酸（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ＥＡＡ）とＴＡＡとの比が約０．４であり、かつＥＡＡと非必須アミノ酸（ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＮＥＡＡ）との比が０．６以上であるタンパク質は、良質なタンパク質である。表３から分かるように、燕窩ペプチド中のＥＡＡ／ＴＡＡは、０．４４であり、ＥＡＡ／ＮＥＡＡは、１．０２であり、ＦＡＯ／ＷＨＯ基準よりもはるかに優れている。したがって、燕窩ペプチドは、単純に必須アミノ酸を補う観点から見ても、良質な必須アミノ酸由来であると考えられる。
【0087】
２．２ 燕窩ペプチドの分子量
本実施例で得られた燕窩ペプチドのＧＰＣ保持スペクトルを図１に示し、対応する相対分子質量分布を表４に示した。本実施例において使用した生産プロセスによって得られた燕窩ペプチド全体の数平均分子量は、３５５Ｄａである。それをさらに細分化すると、燕窩ペプチドは、４つの成分に細分化されてもよく、Ｆ１の数平均分子量は、２９１４Ｄａであり、８．０７％を占め、Ｆ２の数平均分子量は、１５７６Ｄａであり、１１．６０％を占め、Ｆ３の数平均分子量は、７１０Ｄａであり、３４．１１％を占め、Ｆ４の数平均分子量は、２０７Ｄａであり、４６．２２％を占める。タンパク質の酵素加水分解産物は、その分子量によりオリゴペプチド（＜１０００Ｄａ）、メソペプチド（１０００～５０００Ｄａ）、マクロペプチド（５０００～１００００Ｄａ）、及びタンパク質（＞１００００Ｄａ）（１０．３３９０／ｇｅｌｓ８０１００２４）に分類される。したがって、結果は、本実施例において使用した生産プロセスによって得られた燕窩ペプチドが主にオリゴペプチドであることを示した。
【表4】
【0088】
２．３ 燕窩ペプチドの化学抗酸化能
検出結果を図２に示し、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
検出結果を図２に示し、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
【0089】
抗酸化は、老化防止能の基礎であると考えられている。そのため、ＥＢＮＰの抗酸化能は、生化学及び細胞レベルから検討されている。ＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨは、３
つの有名なラジカルであり、それらは、抗酸化剤によって消去されることにより、特徴色を消失させる。したがって、吸光度の変化により、抗酸化剤のＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋、－ＯＨに対する消去能を求めることができる。ＥＢＮＰのＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋、－ＯＨに対する消去能を、それぞれ、図２のＡ、Ｂ、Ｃに示した。ＥＢＮＰのＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨに対する消去能は、５０～２５００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、濃度の増加に伴って高くなった。したがって、この結果は、ＥＢＮＰがＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨを消去する能力を有することを示した。
つの有名なラジカルであり、それらは、抗酸化剤によって消去されることにより、特徴色を消失させる。したがって、吸光度の変化により、抗酸化剤のＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋、－ＯＨに対する消去能を求めることができる。ＥＢＮＰのＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋、－ＯＨに対する消去能を、それぞれ、図２のＡ、Ｂ、Ｃに示した。ＥＢＮＰのＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨに対する消去能は、５０～２５００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、濃度の増加に伴って高くなった。したがって、この結果は、ＥＢＮＰがＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨを消去する能力を有することを示した。
【0090】
ＥＢＮＰの抗酸化能をより直感的に表現するために、Ｔｒｏｌｏｘ（水溶性のα－トコフェロール類似体、既知の抗酸化剤である）をターゲットとして、さらにＥＢＮＰの総抗酸化能に対して定量的特性評価を行った。総抗酸化能は、異なる活性成分の様々なラジカルに対する消去作用の総和である。結果を図２のＤに示し、結果の単位は、ｍｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／Ｌである。他の３つのラジカル消去能の傾向と一致するため、この結果から、ＥＢＮＰが抗酸化能を有し、かつＥＢＮＰの総抗酸化能が５０～２５００μｇ／ｍＬの間で濃度の増加に伴って高くなることが実証された。ＥＢＮＰの濃度が２５００μｇ／ｍＬの場合、その総抗酸化能は、２８．４１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｏｌｏｘに相当する。
【0091】
２．４ 細胞内効果
２．４．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性
検出結果を図３に示し、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
２．４．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性
検出結果を図３に示し、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
【0092】
細胞実験において、細胞の生存率は、実験結果に影響を与えるため、予め毒性実験により細胞実験中の各物質の安全な添加濃度を決定する必要がある。実験により決定された燕窩ペプチドの各細胞内の安全濃度の結果を図３のＡ、Ｂ、Ｃに示した。５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、各細胞の生存率は、いずれも９０％を超えた。このような結果は、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドが各細胞に対していずれも細胞毒性がなく、細胞実験を行う安全な濃度であることを示した。
【0093】
２．４．２ Ｈ２Ｏ２により誘導されるＨａＣａｔ細胞損傷に対する燕窩ペプチドの保護作用
Ｈ２Ｏ２により誘導される細胞酸化損傷実験は、介入物の細胞内抗酸化能を評価するために、広く使用されている細胞実験プロトコールである。燕窩ペプチドの保護下でＨ２Ｏ２によって誘導されるＨａＣａｔ細胞の生存率を図３のＤに示した。結果は、燕窩ペプチドの保護下でのＨａＣａｔ細胞の生存率が高いほど、燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞内の抗酸化活性がより高いことを示した。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＨａＣａｔ細胞内での抗酸化能を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内抗酸化能が濃度の増加に伴って高くなり、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内抗酸化活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
Ｈ２Ｏ２により誘導される細胞酸化損傷実験は、介入物の細胞内抗酸化能を評価するために、広く使用されている細胞実験プロトコールである。燕窩ペプチドの保護下でＨ２Ｏ２によって誘導されるＨａＣａｔ細胞の生存率を図３のＤに示した。結果は、燕窩ペプチドの保護下でのＨａＣａｔ細胞の生存率が高いほど、燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞内の抗酸化活性がより高いことを示した。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＨａＣａｔ細胞内での抗酸化能を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内抗酸化能が濃度の増加に伴って高くなり、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内抗酸化活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
【0094】
２．４．３ ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響
ヒアルロン酸は、天然保湿因子であり、皮膚の保湿に関与し、細胞外マトリックスの重要な組成成分である。ヒト細胞内のヒアルロン酸含有量は、加齢に伴って減少する。ヒト細胞は、細胞の湿度を保証するためにヒアルロン酸を積極的に合成し、重要な例として、ＨａＣａｔ細胞がヒアルロニダーゼの触媒下で細胞膜の内表面にヒアルロン酸を生成する。
したがって、細胞内のヒアルロン酸含有量の測定は、細胞の保水能力をある程度反映して、関与する細胞保湿能力を評価することができる。
ヒアルロン酸は、天然保湿因子であり、皮膚の保湿に関与し、細胞外マトリックスの重要な組成成分である。ヒト細胞内のヒアルロン酸含有量は、加齢に伴って減少する。ヒト細胞は、細胞の湿度を保証するためにヒアルロン酸を積極的に合成し、重要な例として、ＨａＣａｔ細胞がヒアルロニダーゼの触媒下で細胞膜の内表面にヒアルロン酸を生成する。
したがって、細胞内のヒアルロン酸含有量の測定は、細胞の保水能力をある程度反映して、関与する細胞保湿能力を評価することができる。
【0095】
燕窩ペプチドの影響下でのＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量を図３のＥに示した。結果は、１００μｇ／ｍＬ以下の燕窩ペプチドが、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量（ｐ＞０．０５）を顕著に増加させることができず、２５０μｇ／ｍＬ以上の燕窩ペプチドが、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量（ｐ＜０．０５）を顕著に増加させることができることを示した。また、燕窩ペプチドの濃度が高いほど、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸の含有量が高い。したがって、結果は、燕窩ペプチドが細胞保湿能を有することを示し、燕窩ペプチドが保湿機能を有する化粧品に用いられる可能性があることをさらに証明した。
【0096】
２．４．４ Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制作用
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、燕窩ペプチドの美白効果に最も直接的な証拠を提供することができ、Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率を、図３のＦに示した。結果は、燕窩ペプチドがＢ１６細胞メラニン産生に対する抑制能力を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内でのメラニン産生抑制能力が濃度の増加に伴って高くなり、５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内でのメラニン抑制活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、燕窩ペプチドの美白効果に最も直接的な証拠を提供することができ、Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率を、図３のＦに示した。結果は、燕窩ペプチドがＢ１６細胞メラニン産生に対する抑制能力を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内でのメラニン産生抑制能力が濃度の増加に伴って高くなり、５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内でのメラニン抑制活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
【0097】
２．４．５ ＭＲＣ－５細胞傷跡に対する燕窩ペプチドの修復作用
結果を図４に示した。本実施例において、ＭＲＣ－５細胞傷跡試験により、燕窩ペプチドの細胞修復、増殖促進能力を評価した結果を図４に示した。明らかに、燕窩ペプチドの介入なしに、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後でも明らかな傷跡が残った。逆に、燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４じｋ案培養後に傷跡面積が小さくなった。特に、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後、明らかな傷跡が残らなかった。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＭＲＣ－５細胞内での修復、増殖促進能力を有するとともに、燕窩ペプチドの細胞内での修復、増殖促進能力が濃度の増加に伴って高くなることを示した。細胞修復、増殖促進能力は、介入物に応用面での想像力を付与することができ、例えば、皮膚創傷治癒、組織修復を促進する医薬品、化粧品などの機能性製品を開発することができる。したがって、傷跡試験の結果に基づいて、燕窩ペプチドは、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性があるとさらに考えられる。
結果を図４に示した。本実施例において、ＭＲＣ－５細胞傷跡試験により、燕窩ペプチドの細胞修復、増殖促進能力を評価した結果を図４に示した。明らかに、燕窩ペプチドの介入なしに、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後でも明らかな傷跡が残った。逆に、燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４じｋ案培養後に傷跡面積が小さくなった。特に、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後、明らかな傷跡が残らなかった。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＭＲＣ－５細胞内での修復、増殖促進能力を有するとともに、燕窩ペプチドの細胞内での修復、増殖促進能力が濃度の増加に伴って高くなることを示した。細胞修復、増殖促進能力は、介入物に応用面での想像力を付与することができ、例えば、皮膚創傷治癒、組織修復を促進する医薬品、化粧品などの機能性製品を開発することができる。したがって、傷跡試験の結果に基づいて、燕窩ペプチドは、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性があるとさらに考えられる。
【0098】
３ 結論
要するに、本実施例は、成熟した燕窩ペプチドの生産プロセスを提供し、当該プロセスで製造された燕窩ペプチドに対して体系的な評価を行った。基本的な性質について、燕窩ペプチドは、総アミノ酸が６８．８９％で、シアル酸が６．６４％であり、特に、燕窩ペプチドは、３０．９０ｇ／１００ｇの必須アミノ酸を含有し、その総アミノ酸含有量の４４．８９％を占め、良質な必須アミノ酸由来である。機能的性質について、燕窩ペプチドは、抗酸化（ＤＰＰＨラジカル、ＡＢＴＳラジカル、ヒドロキシラジカルの消去を含む）の能力を有する。最も重要となるのは、燕窩ペプチドが、細胞抗酸化、細胞保湿、細胞美白、細胞傷跡修復、増殖促進の機能を有することである。以上の結果から、該燕窩ペプチドは、食品、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性がある。本実施例のプロセスに基づく燕窩ペプチドの開発及び利用は、燕窩産業のさらなる高値化発展に有利である。
要するに、本実施例は、成熟した燕窩ペプチドの生産プロセスを提供し、当該プロセスで製造された燕窩ペプチドに対して体系的な評価を行った。基本的な性質について、燕窩ペプチドは、総アミノ酸が６８．８９％で、シアル酸が６．６４％であり、特に、燕窩ペプチドは、３０．９０ｇ／１００ｇの必須アミノ酸を含有し、その総アミノ酸含有量の４４．８９％を占め、良質な必須アミノ酸由来である。機能的性質について、燕窩ペプチドは、抗酸化（ＤＰＰＨラジカル、ＡＢＴＳラジカル、ヒドロキシラジカルの消去を含む）の能力を有する。最も重要となるのは、燕窩ペプチドが、細胞抗酸化、細胞保湿、細胞美白、細胞傷跡修復、増殖促進の機能を有することである。以上の結果から、該燕窩ペプチドは、食品、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性がある。本実施例のプロセスに基づく燕窩ペプチドの開発及び利用は、燕窩産業のさらなる高値化発展に有利である。
【実施例2】
【0099】
１ 材料と方法
１．１ 材料
材料は、実施例１と同じである。
１．１ 材料
材料は、実施例１と同じである。
【0100】
１．２ 燕窩ペプチドの生産
燕窩ペプチドの生産プロセスは、原料洗浄、煮込み、すりつぶし、均質化処理、ｐＨ調整、酵素分解、酵素失活、冷却、遠心分離、限外ろ過、濃縮、乾燥、及び小分けである。具体的には、可食の燕窩原料（３０％ｗ／ｖ）を洗浄した後、二重釜に入れて沸騰水で１．７５時間煮込んだ。その後、煮込んだ後の可食の燕窩を２５ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ均質化処理した。均質化処理された可食の燕窩ペーストを酵素分解タンクに入れて、０．０１％の炭酸ナトリウムで反応系のｐＨを１０．０に安定化させた。酵素分解タンクにアルカリプロテアーゼ（１ｇあたりの燕窩に対応するアルカリプロテアーゼの使用量が９Ｕである）を添加し、酵素分解温度を６０℃に維持して５時間酵素分解反応させた。酵素分解の終了後、反応系の温度を８５℃に調整し、２０ｍｉｎ保持して酵素を十分に失活させた。酵素失活の終了後、試料を１５０００ｒｐｍの条件下で１０ｍｉｎ遠心分離して、可食の燕窩ペプチドの粗試料溶液を得た。可食の燕窩ペプチド溶液を１５０ｎｍの限外ろ過膜でろ過して、可食の燕窩ペプチド溶液を得た。最後に、該溶液を噴霧乾燥させて可食の燕窩ペプチド粉末を得て、噴霧乾燥の吸気温度は、１７５℃であり、排気温度＞９０℃であった。
燕窩ペプチドの生産プロセスは、原料洗浄、煮込み、すりつぶし、均質化処理、ｐＨ調整、酵素分解、酵素失活、冷却、遠心分離、限外ろ過、濃縮、乾燥、及び小分けである。具体的には、可食の燕窩原料（３０％ｗ／ｖ）を洗浄した後、二重釜に入れて沸騰水で１．７５時間煮込んだ。その後、煮込んだ後の可食の燕窩を２５ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ均質化処理した。均質化処理された可食の燕窩ペーストを酵素分解タンクに入れて、０．０１％の炭酸ナトリウムで反応系のｐＨを１０．０に安定化させた。酵素分解タンクにアルカリプロテアーゼ（１ｇあたりの燕窩に対応するアルカリプロテアーゼの使用量が９Ｕである）を添加し、酵素分解温度を６０℃に維持して５時間酵素分解反応させた。酵素分解の終了後、反応系の温度を８５℃に調整し、２０ｍｉｎ保持して酵素を十分に失活させた。酵素失活の終了後、試料を１５０００ｒｐｍの条件下で１０ｍｉｎ遠心分離して、可食の燕窩ペプチドの粗試料溶液を得た。可食の燕窩ペプチド溶液を１５０ｎｍの限外ろ過膜でろ過して、可食の燕窩ペプチド溶液を得た。最後に、該溶液を噴霧乾燥させて可食の燕窩ペプチド粉末を得て、噴霧乾燥の吸気温度は、１７５℃であり、排気温度＞９０℃であった。
【0101】
１．３ 燕窩ペプチドの成分及び機能の特性評価
具体的な方法は、実施例１と同じである。
具体的な方法は、実施例１と同じである。
【0102】
１．４ データ分析
データ分析方法は、実施例１と同じである。
データ分析方法は、実施例１と同じである。
【0103】
２ 結果と検討
２．１ 燕窩ペプチドの成分
燕窩ペプチドの基本成分を表４に示した。本研究のプロセスで試作された燕窩ペプチドは、総アミノ酸含有量が６９．１０％で、シアル酸含有量が６．１４％で、水分含有量が１２．０１％である。
２．１ 燕窩ペプチドの成分
【表5】
【0104】
【表6】
【0105】
表５は、燕窩ペプチド中の１８種のアミノ酸の組成及び含有量を示した。まず、燕窩ペプチド中のアミノ酸含有量は、６６．７５ｇ／１００ｇであり、セリンは、燕窩ペプチド中
の最も豊富なアミノ酸であり、総アミノ酸（ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＴＡＡ）の９．６８％を占め、次は、グルタミン酸（９．３０％）、スレオニン（９．１７％）、アルギニン（８．１２％）である。表５から分かるように、燕窩ペプチド中のＥＡＡ／ＴＡＡは、０．３９であり、ＥＡＡ／ＮＥＡＡは、０．８０であり、ＦＡＯ／ＷＨＯ基準よりもはるかに優れている。したがって、燕窩ペプチドは、単純に必須アミノ酸を補う観点から見ても、良質な必須アミノ酸由来であると考えられる。
の最も豊富なアミノ酸であり、総アミノ酸（ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、ＴＡＡ）の９．６８％を占め、次は、グルタミン酸（９．３０％）、スレオニン（９．１７％）、アルギニン（８．１２％）である。表５から分かるように、燕窩ペプチド中のＥＡＡ／ＴＡＡは、０．３９であり、ＥＡＡ／ＮＥＡＡは、０．８０であり、ＦＡＯ／ＷＨＯ基準よりもはるかに優れている。したがって、燕窩ペプチドは、単純に必須アミノ酸を補う観点から見ても、良質な必須アミノ酸由来であると考えられる。
【0106】
２．２ 燕窩ペプチドの分子量
本実施例で得られた燕窩ペプチドのＧＰＣ保持スペクトルを図５に示し、対応する相対分子質量分布を表７に示した。本実施例において使用した生産プロセスによって得られた燕窩ペプチド全体の数平均分子量は、３５０Ｄａである。それをさらに細分化すると、燕窩ペプチドは、４つの成分に細分化されてもよく、Ｆ１の数平均分子量は、２９１９Ｄａであり、６．０８％を占め、Ｆ２の数平均分子量は、１５８９Ｄａであり、１１．３６％を占め、Ｆ３の数平均分子量は、７１５Ｄａであり、３４．６９％を占め、Ｆ４の数平均分子量は、２１０Ｄａであり、４７．８７％を占める。タンパク質の酵素加水分解産物は、その分子量によりオリゴペプチド（＜１０００Ｄａ）、メソペプチド（１０００～５０００Ｄａ）、マクロペプチド（５０００～１００００Ｄａ）、及びタンパク質（＞１００００Ｄａ）（１０．３３９０／ｇｅｌｓ８０１００２４）に分類される。したがって、結果は、本実施例において使用した生産プロセスによって得られた燕窩ペプチドが主にオリゴペプチドであることを示した。
【表7】
【0107】
２．３ 燕窩ペプチドの化学抗酸化能
検出結果を図６に示し、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
検出結果を図６に示し、図Ａは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＤＰＰＨラジカル消去率であり、図Ｂは、異なる濃度の燕窩ペプチドのＡＢＴＳラジカル消去率であり、図Ｃは、異なる濃度の燕窩ペプチドのヒドロキシラジカル消去率であり、図Ｄは、異なる濃度の燕窩ペプチドの総抗酸化能値である。
【0108】
ＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨに対する燕窩ペプチドの消去能を、それぞれ、図６のＡ、Ｂ及びＣに示した。ＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨに対する燕窩ペプチドの消去能は、５０～２５００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、濃度の増加に伴って高くなった。したがって、この結果は、燕窩ペプチドがＤＰＰＨ－、ＡＢＴＳ＋及び－ＯＨを消去する能力を有することを示した。
【0109】
燕窩ペプチドの抗酸化能をより直感的に表現するために、Ｔｒｏｌｏｘ（水溶性のα－トコフェロール類似体、既知の抗酸化剤である）をターゲットとして、さらに燕窩ペプチドの総抗酸化能に対して定量的特性評価を行った。総抗酸化能は、様々なラジカルに対する異なる活性成分の消去作用の総和である。結果を図６のＤに示し、結果の単位は、ｍｍｏ
ｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／Ｌである。他の３つのラジカル消去能の傾向と一致するため、この結果から、燕窩ペプチドが抗酸化能を有し、かつ燕窩ペプチドの総抗酸化能が５０～２５００μｇ／ｍＬの間で濃度の増加に伴って高くなることが実証された。燕窩ペプチドの濃度が２５００μｇ／ｍＬの場合、その総抗酸化能は、２６．４１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｏｌｏｘに相当する。
ｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／Ｌである。他の３つのラジカル消去能の傾向と一致するため、この結果から、燕窩ペプチドが抗酸化能を有し、かつ燕窩ペプチドの総抗酸化能が５０～２５００μｇ／ｍＬの間で濃度の増加に伴って高くなることが実証された。燕窩ペプチドの濃度が２５００μｇ／ｍＬの場合、その総抗酸化能は、２６．４１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｏｌｏｘに相当する。
【0110】
２．４ 細胞内効果
２．４．１ ＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する燕窩ペプチドの毒性
検出結果を図７に示し、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
２．４．１ ＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する燕窩ペプチドの毒性
検出結果を図７に示し、図Ａは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＨａＣａｔ細胞の生存率であり、図Ｂは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＢ１６細胞の生存率であり、図Ｃは、異なる燕窩ペプチド濃度でのＭＲＣ－５細胞の生存率であり、図Ｄは、Ｈ２Ｏ２損傷のＨａＣａｔ細胞の生存率に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｅは、ＨａＣａｔ細胞のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響であり、図Ｆは、Ｂ１６細胞内のメラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率である。
【0111】
細胞実験において、細胞の生存率は、実験結果に影響を与えるため、予め毒性実験により細胞実験中の各物質の安全な添加濃度を決定する必要がある。実験により決定された燕窩ペプチドの各細胞内の安全濃度の結果を図７のＡ、Ｂ、Ｃに示した。５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、各細胞の生存率は、いずれも９０％を超えた。このような結果は、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドが各細胞に対していずれも細胞毒性がなく、細胞実験を行う安全な濃度であることを示した。
【0112】
２．４．２ Ｈ２Ｏ２により誘導されるＨａＣａｔ細胞損傷に対する燕窩ペプチドの保護作用
Ｈ２Ｏ２により誘導される細胞酸化損傷実験は、介入物の細胞内抗酸化能を評価するために、広く使用されている細胞実験プロトコールである。燕窩ペプチドの保護下でＨ２Ｏ２によって誘導されるＨａＣａｔ細胞の生存率を図７のＤに示した。結果は、燕窩ペプチドの保護下でのＨａＣａｔ細胞の生存率が高いほど、燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞内の抗酸化活性がより高いことを示した。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＨａＣａｔ細胞内での抗酸化能を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内抗酸化能が濃度の増加に伴って高くなり、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内抗酸化活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
Ｈ２Ｏ２により誘導される細胞酸化損傷実験は、介入物の細胞内抗酸化能を評価するために、広く使用されている細胞実験プロトコールである。燕窩ペプチドの保護下でＨ２Ｏ２によって誘導されるＨａＣａｔ細胞の生存率を図７のＤに示した。結果は、燕窩ペプチドの保護下でのＨａＣａｔ細胞の生存率が高いほど、燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞内の抗酸化活性がより高いことを示した。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＨａＣａｔ細胞内での抗酸化能を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内抗酸化能が濃度の増加に伴って高くなり、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内抗酸化活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
【0113】
２．４．３ ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量に対する燕窩ペプチドの影響
ヒアルロン酸は、天然保湿因子であり、皮膚の保湿に関与し、細胞外マトリックスの重要な組成成分である。ヒト細胞内のヒアルロン酸含有量は、加齢に伴って減少する。ヒト細胞は、細胞の湿度を保証するためにヒアルロン酸を積極的に合成し、重要な例として、ＨａＣａｔ細胞がヒアルロニダーゼの触媒下で細胞膜の内表面にヒアルロン酸を生成する。したがって、細胞内のヒアルロン酸含有量の測定は、細胞の保水能力をある程度反映して、関与する細胞保湿能力を評価することができる。
ヒアルロン酸は、天然保湿因子であり、皮膚の保湿に関与し、細胞外マトリックスの重要な組成成分である。ヒト細胞内のヒアルロン酸含有量は、加齢に伴って減少する。ヒト細胞は、細胞の湿度を保証するためにヒアルロン酸を積極的に合成し、重要な例として、ＨａＣａｔ細胞がヒアルロニダーゼの触媒下で細胞膜の内表面にヒアルロン酸を生成する。したがって、細胞内のヒアルロン酸含有量の測定は、細胞の保水能力をある程度反映して、関与する細胞保湿能力を評価することができる。
【0114】
燕窩ペプチドの影響下でのＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量を図７のＥに示した。結果は、１００μｇ／ｍＬ以下の燕窩ペプチドが、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量（ｐ＞０．０５）を顕著に増加させることができず、２５０μｇ／ｍＬ以上の燕窩ペプチドが、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸含有量（ｐ＜０．０５）を顕著に増加させることができることを示した。また、燕窩ペプチドの濃度が高いほど、ＨａＣａｔ細胞内のヒアルロン酸の含有量が高い。したがって、結果は、燕窩ペプチドが細胞保湿能を有することを示し、燕窩ペプチドが保湿機能を有する化粧品に用いられる可能性があることをさらに証明した。
【0115】
２．４．４ Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制作用
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、燕窩ペプチドの美白効果に最も直接的な証拠を提供することができ、Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率を、図７のＦに示した。結果は、燕窩ペプチドがＢ１６細胞メラニン産生に対する抑制能力を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内でのメラニン産生抑制能力が濃度の増加に伴って高くなり、５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内でのメラニン抑制活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
Ｂ１６細胞メラニン産生抑制試験は、燕窩ペプチドの美白効果に最も直接的な証拠を提供することができ、Ｂ１６細胞メラニン産生に対する燕窩ペプチドの抑制率を、図７のＦに示した。結果は、燕窩ペプチドがＢ１６細胞メラニン産生に対する抑制能力を有し、５０～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、燕窩ペプチドの細胞内でのメラニン産生抑制能力が濃度の増加に伴って高くなり、５０μｇ／ｍＬ以上の濃度において、顕著な細胞内でのメラニン抑制活性を有することを示した（ｐ＜０．０５）。
【0116】
２．４．５ ＭＲＣ－５細胞傷跡に対する燕窩ペプチドの修復作用
結果を図８に示した。本研究において、ＭＲＣ－５細胞傷跡試験により、燕窩ペプチドの細胞修復、増殖促進能力を評価した結果を図８に示した。明らかに、燕窩ペプチドの介入なしに、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後でも明らかな傷跡が残った。逆に、燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後に傷跡面積が小さくなった。特に、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後、明らかな傷跡が残らなかった。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＭＲＣ－５細胞内での修復、増殖促進能力を有するとともに、燕窩ペプチドの細胞内での修復、増殖促進能力が濃度の増加に伴って高くなることを示した。細胞修復、増殖促進能力は、介入物に応用面での想像力を付与することができ、例えば、皮膚創傷治癒、組織修復を促進する医薬品、化粧品などの機能性製品を開発することができる。したがって、傷跡試験の結果に基づいて、燕窩ペプチドは、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性があるとさらに考えられる。
結果を図８に示した。本研究において、ＭＲＣ－５細胞傷跡試験により、燕窩ペプチドの細胞修復、増殖促進能力を評価した結果を図８に示した。明らかに、燕窩ペプチドの介入なしに、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後でも明らかな傷跡が残った。逆に、燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後に傷跡面積が小さくなった。特に、２５０μｇ／ｍＬ以上の濃度の燕窩ペプチドの介入下で、ＭＲＣ－５細胞は、２４時間培養後、明らかな傷跡が残らなかった。したがって、結果は、燕窩ペプチドがＭＲＣ－５細胞内での修復、増殖促進能力を有するとともに、燕窩ペプチドの細胞内での修復、増殖促進能力が濃度の増加に伴って高くなることを示した。細胞修復、増殖促進能力は、介入物に応用面での想像力を付与することができ、例えば、皮膚創傷治癒、組織修復を促進する医薬品、化粧品などの機能性製品を開発することができる。したがって、傷跡試験の結果に基づいて、燕窩ペプチドは、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性があるとさらに考えられる。
【0117】
３ 結論
要するに、本実施例は、成熟した燕窩ペプチドの生産プロセスを提供し、当該プロセスで製造された燕窩ペプチドに対して体系的な評価を行った。基本的な性質について、燕窩ペプチドは、総アミノ酸が６６．７５％で、シアル酸が６．１４％であり、特に、燕窩ペプチドは、２６．２６ｇ／１００ｇの必須アミノ酸を含有し、その総アミノ酸含有量の３９．３４％を占め、良質な必須アミノ酸由来である。機能的性質について、燕窩ペプチドは、抗酸化（ＤＰＰＨラジカル、ＡＢＴＳラジカル、ヒドロキシラジカルの消去を含む）の能力を有する。最も重要となるのは、燕窩ペプチドが、細胞抗酸化、細胞保湿、細胞美白、細胞傷跡修復、増殖促進の機能を有することである。以上の結果から、該燕窩ペプチドは、食品、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性がある。本実施例のプロセスに基づく燕窩ペプチドの開発及び利用は、燕窩産業のさらなる高値化発展に有利である。
要するに、本実施例は、成熟した燕窩ペプチドの生産プロセスを提供し、当該プロセスで製造された燕窩ペプチドに対して体系的な評価を行った。基本的な性質について、燕窩ペプチドは、総アミノ酸が６６．７５％で、シアル酸が６．１４％であり、特に、燕窩ペプチドは、２６．２６ｇ／１００ｇの必須アミノ酸を含有し、その総アミノ酸含有量の３９．３４％を占め、良質な必須アミノ酸由来である。機能的性質について、燕窩ペプチドは、抗酸化（ＤＰＰＨラジカル、ＡＢＴＳラジカル、ヒドロキシラジカルの消去を含む）の能力を有する。最も重要となるのは、燕窩ペプチドが、細胞抗酸化、細胞保湿、細胞美白、細胞傷跡修復、増殖促進の機能を有することである。以上の結果から、該燕窩ペプチドは、食品、医薬品、化粧品などの分野への応用の可能性がある。本実施例のプロセスに基づく燕窩ペプチドの開発及び利用は、燕窩産業のさらなる高値化発展に有利である。
【0118】
上記実施形態及び実施例の各技術的特徴を任意に組み合わせることができ、説明を簡潔にするために、上記実施形態及び実施例における各技術的特徴の全ての可能な組み合わせについて説明していないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、それらの全ては、本明細書の範囲と見なされるべきである。
【0119】
上記実施例は、本願のいくつかの実施形態のみを説明しており、本願の技術的手段を具体的かつ詳細に理解することを容易にするが、本願の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。なお、当業者にとって、本願の趣旨から逸脱することなく、いくつかの変形及び改良を加えることができ、これらはいずれも本願の保護範囲に属する。また、理解できるように、本願の上記説明内容を読んだ後、当業者は本願に対して様々な変更や修正を行うことができ、これらの等価形式も本願の保護範囲に含まれる。当業者が本願によって提供される技術的手段に基づいて、論理的な分析、推論、又は限定的な実験により取得した技術的手段は、いずれも本願に添付される特許請求の範囲内にあることをさらに理解されたい。よって、本願の特許の保護範囲は、添付する特許請求の範囲の内容に依るものであり、明細書及び図面は、特許請求の範囲の内容を説明するためのものであ
る。
る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
燕窩と水を混合して煮込み、煮込んだ燕窩を調製するステップと、前記煮込んだ燕窩を均質化処理して、燕窩ペーストを調製するステップと、
アルカリプロテアーゼで前記燕窩ペーストを酵素分解し、酵素を失活させて、酵素分解物を調製するステップと、
前記酵素分解物を遠心分離し、上澄み液を回収して、燕窩ペプチドの粗試料溶液を調製するステップと、
前記燕窩ペプチドの粗試料溶液に対して限外ろ過を行い、限外ろ過液を回収して、燕窩ペプチドを調製するステップと、を含み、
遠心分離の条件は、速度が約１００００ｒｐｍ～１５０００ｒｐｍで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、
限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１００ｎｍ～２００ｎｍであり、好ましくは、限外ろ過に用いられる膜の孔径は、約１５０ｎｍ～２００ｎｍである、ことを特徴とする燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項2】
１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、約１０ｇ～５０ｇであり、好ましくは、１００ｍＬあたりの前記水に対応する前記燕窩の使用量は、約２５ｇ～３５ｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項3】
煮込み時間は、約０．５～２時間であり、好ましくは、煮込み時間は、約１．７５～２時間である、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項4】
均質化処理の条件は、パワーが約１０ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含み、好ましくは、均質化処理の条件は、パワーが約２５ＭＰａ～３０ＭＰａで、時間が約２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎであることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項5】
酵素分解の条件は、温度が約５０℃～６０℃で、ｐＨ値が約８．０～１０．０で、時間が約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎで、１ｇあたりの燕窩に対応する前記アルカリプロテアーゼの使用量が約６Ｕ～９Ｕであることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項6】
酵素失活の方法は、加熱による酵素失活であり、加熱による酵素失活の条件は、酵素分解により得られた反応系を約８０℃～１００℃に加熱し、約１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ保持することを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項7】
前記限外ろ過液中の溶媒を除去するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項8】
前記溶媒を除去するステップは、前記限外ろ過液を濃縮し、得られた濃縮物を噴霧乾燥させるステップを含む、ことを特徴とする請求項７に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項9】
前記溶媒を除去するステップにおいて、（１）前記濃縮物の体積が前記限外ろ過液の体積の約１／３～約１／８であり、
及び／又は
（２）噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１５０℃～２００℃で、排気温度＞約７０℃であり、好ましくは、噴霧乾燥の条件は、吸気温度が約１６５℃～１７５℃で、排気温度＞約９０℃である、ことを特徴とする請求項８に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項10】
前記燕窩ペプチドにおいて、総アミノ酸含有量が約６６．７５ｗｔ％～６８．８９ｗｔ％であり、シアル酸含有量が約６．１４ｗｔ％～６．６４ｗｔ％であり、水分含有量が約１１．０１ｗｔ％～１２．０１ｗｔ％である、ことを特徴とする請求項１に記載の燕窩ペプチドの製造方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、ことを特徴とする燕窩ペプチド。
【請求項12】
請求項１１に記載の燕窩ペプチドの、医薬品又は保湿、美白、修復及び／又は抗酸化効果を有する食品又はスキンケア製品の製造における使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0073】
１．４ 燕窩ペプチドの化学抗酸化能の評価
１．４．１ ＤＰＰＨラジカル消去能の評価
ＤＰＰＨラジカル溶液調製：ＤＰＰＨを無水エタノールで０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液に調製した。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に２ｍＬの無水エタノール及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬの無水エタノールを添加した。上記測定対象溶液を均一に混合し、室温で３０ｍｉｎ放置した。最後に、混合溶液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後の上澄み液の５１７ｎｍでの吸光度値を測定して、試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率を算出した。試料のＤＰＰＨラジカルに対
する消去率は、下記式により算出した。
式中、Ａ０は、２ｍＬの無水エタノール＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ１は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬの無水エタノールの吸光度値である。
１．４．１ ＤＰＰＨラジカル消去能の評価
ＤＰＰＨラジカル溶液調製：ＤＰＰＨを無水エタノールで０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液に調製した。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に２ｍＬの無水エタノール及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び２ｍＬの無水エタノールを添加した。上記測定対象溶液を均一に混合し、室温で３０ｍｉｎ放置した。最後に、混合溶液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後の上澄み液の５１７ｎｍでの吸光度値を測定して、試料のＤＰＰＨラジカルに対する消去率を算出した。試料のＤＰＰＨラジカルに対
する消去率は、下記式により算出した。
【数1】
Ａ１は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬのＤＰＰＨラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、２ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋２ｍＬの無水エタノールの吸光度値である。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0074】
１．４．２ ＡＢＴＳラジカル消去能の評価
ＡＢＴＳラジカル溶液調製：７ｍｍｏｌ／ＬのＡＢＴＳ水溶液と２．４５ｍｍｏｌ／Ｌの過硫酸カリウムを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、室温遮光下で１２－１６時間反応させた。その後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳで希釈し、７３４ｎｍでの吸光度値を０．７０±０．０２にした。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に０．４ｍＬの超純水及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、遮光下で６ｍｉｎ反応させた後、７３４ｎｍで吸光度値を測定して、試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率を算出した。試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
式中、Ａ０は、０．４ｍＬの超純水＋４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液の吸光度値であり、Ａ１は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬの超純水の吸光度値である。
ＡＢＴＳラジカル溶液調製：７ｍｍｏｌ／ＬのＡＢＴＳ水溶液と２．４５ｍｍｏｌ／Ｌの過硫酸カリウムを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、室温遮光下で１２－１６時間反応させた。その後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳで希釈し、７３４ｎｍでの吸光度値を０．７０±０．０２にした。試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に０．４ｍＬの超純水及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ１）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬのＡＢＴＳラジカル溶液を添加し、Ａ２）試験管に０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液及び４ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、遮光下で６ｍｉｎ反応させた後、７３４ｎｍで吸光度値を測定して、試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率を算出した。試料のＡＢＴＳラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。
【数2】
Ａ２は、０．４ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋４ｍＬの超純水の吸光度値である。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0075】
１．４．３ ヒドロキシラジカル消去能の評価
試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１１ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ１）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１０ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ２）試験管に１ｍＬの燕
窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸及び１１ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、３７℃で６０ｍｉｎ水浴した後、５１０ｎｍで吸光度値を測定して、試料のヒドロキシラジカルに対する消去率を算出した。試料のヒドロキシラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。ＯＨ
式中、
Ａ０は、１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液の吸光度値であり、
Ａ１は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１０ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水の吸光度値である。
試料調製：燕窩ペプチド試料を、超純水で異なる濃度の燕窩ペプチド溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、２５００μｇ／ｍＬ）に調製した。測定対象溶液調製：Ａ０）試験管に１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１１ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ１）試験管に１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸、１０ｍＬの超純水及び１ｍＬの過酸化水素水溶液を添加し、Ａ２）試験管に１ｍＬの燕
窩ペプチドの試料溶液、１ｍＬの硫酸第一鉄、１ｍＬのサリチル酸及び１１ｍＬの超純水を添加した。上記溶液を均一に混合し、３７℃で６０ｍｉｎ水浴した後、５１０ｎｍで吸光度値を測定して、試料のヒドロキシラジカルに対する消去率を算出した。試料のヒドロキシラジカルに対する消去率は、下記式により算出した。ＯＨ
【数3】
Ａ０は、１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液の吸光度値であり、
Ａ１は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１０ｍＬの超純水＋１ｍＬの過酸化水素水溶液の吸光度値であり、
Ａ２は、１ｍＬの燕窩ペプチドの試料溶液＋１ｍＬの硫酸第一鉄＋１ｍＬのサリチル酸＋１１ｍＬの超純水の吸光度値である。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0077】
１．５ 燕窩ペプチドの細胞内効果の評価
１．５．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性の評価
燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性は、ＣＣＫ－８によって測定され、それにより、燕窩ペプチドの細胞内の安全濃度範囲を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、それぞれ９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（ＣＣＬ－１７０Ｂ－８、シンガポールＥＳＣＯ）に入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。細胞の生存率は、下記式により算出した。
試料群は、燕窩ペプチド試料＋細胞であり、
対照群は、ＭＥＭ培地＋細胞であり、
ブランク群は、ＭＥＭ培地である。
１．５．１ 燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性の評価
燕窩ペプチドのＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞に対する毒性は、ＣＣＫ－８によって測定され、それにより、燕窩ペプチドの細胞内の安全濃度範囲を決定した。具体的には、対数期のＨａＣａｔ細胞、Ｂ１６細胞及びＭＲＣ－５細胞を５×１０５個／ｍＬで懸濁し、それぞれ９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（ＣＣＬ－１７０Ｂ－８、シンガポールＥＳＣＯ）に入れて２４時間培養し、細胞を完全に接着させた。培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＥＭで調製した異なる濃度の燕窩ペプチドの試料溶液（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れて２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、４５０ｎｍで吸光度値を測定して、細胞の生存率を算出した。細胞の生存率は、下記式により算出した。
【数4】
対照群は、ＭＥＭ培地＋細胞であり、
ブランク群は、ＭＥＭ培地である。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
２ 結果と検討
２．１ 燕窩ペプチドの成分
燕窩ペプチドの基本成分を表５に示した。本研究のプロセスで試作された燕窩ペプチドは、総アミノ酸含有量が６６．７５％で、シアル酸含有量が６．１４％で、水分含有量が１２．０１％である。
２．１ 燕窩ペプチドの成分
【表5】
【国際調査報告】