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特表2024-545555半数体を誘導する方法、及び当該半数体の、植物育種における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-10
(54)【発明の名称】半数体を誘導する方法、及び当該半数体の、植物育種における使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/415 20060101AFI20241203BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241203BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241203BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/84 20060101ALN20241203BHJP
A01H 6/46 20180101ALN20241203BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241203BHJP
【ＦＩ】
C07K14/415 ZNA
C12N15/29
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/84 Z
A01H6/46
C12N15/09 110
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519327
(86)(22)【出願日】2023-06-06
(85)【翻訳文提出日】2024-05-09
(86)【国際出願番号】 CN2023098723
(87)【国際公開番号】W WO2023241420
(87)【国際公開日】2023-12-21
(31)【優先権主張番号】202210675450.5
(32)【優先日】2022-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513009727
【氏名又は名称】中国水▲稲▼研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】王克剣
(72)【発明者】
【氏名】王春
(72)【発明者】
【氏名】尉▲しん▼
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA89X
4B065AA89Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA53
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA30
4H045CA31
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、生物技術および植物育種の分野に属し、具体的には植物細胞の増殖を制御する遺伝子を利用して半数体を誘導する方法およびその植物育種への応用に関するものである。本発明は、イネの未受精卵細胞と受精後5日目の胚の発現プロファイルを解析し、強く発現している2つの遺伝子OsCPRO1とOsCPRO2を発見し、これら2つの遺伝子が半数体の子孫を誘導するために使用できることを明らかにした。具体的に、卵細胞で特異的に発現しているプロモーターにより上記遺伝子組み換え体を制御することで、陽性の遺伝子組換えの半数体誘導剤を作製する。さらに、半数体誘導剤をMiMeシステムと組み合わせて無融合生殖種を作製し、それによってクローンの種子を作ることもできる。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
POXドメインとホメオボックスを持つ半数体誘導能力を持つタンパク質であって、具体的には、POXドメインにはTELLドメインとSKYドメイン:SKYLKAAQELLDEVVSVが含まれ、OsCPRO1またはOsCPRO2タンパク質が好ましく、そのアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：6に示されるか、または次の種の同源遺伝子由来であり、好ましくは90％、95％以上、より好ましくは98％、99％以上の同源遺伝子である、タンパク質：イネ（Oryzasativa）、オリザ・メイエリアナ亜種（Oryzameyerianavar）、トウモロコシ（Zeamays）、コムギ（Triticumaestivum）、硬粒コムギ（Triticumturgidumsubsp）、野生二粒コムギ（Triticumdicoccoides）、ウラルトゥコムギ（Triticumurartu）、オオムギ（Hordeumvulgare）、エギロプス・タウスキー（Aegilopstauschii）、ライ麦（Secalecereale）、オートムギ（Avenasativa）、ソバ（Fagopyrumesculentum）、ハダカムギ（Hordeumvulgare）、ハトムギ（Coixlacryma-jobi）、アワ（Setariaitalica）、フォルニオこごめ（Digitariaexilis）、コーリャン（Sorghumbicolor）、キビ（Panicummiliaceum）、カツミグサ（Zizanialatifolia）、リュウキンカ（Zizaniapalustris）、エレウシネ（Eleusinecoracana）、ヤムイモ（Zizaniapalustris）、キャッサバ（Manihotesculenta）、ジャガイモ（Solanumtuberosum）、ナガイモ（Dioscoreapolystachya）、落花生（Arachishypogaea）、ナンキンマメ（Arachisduranensis）、大豆（Glycinemax）、野生大豆（Glycinesoja）、コスミグサ（Vignaangularis）、コメアズキ（Vignaumbellata）、レンズマメ（Lensculinaris）、緑豆（Vignaradiata）、ササゲ（Vignaunguiculata）、インゲンマメ（Phaseolusvulgaris）、ソラマメ（Viciafaba）、エンドウ（Pisumsativum）、ナタマメ（Canavaliagladiata）、キマメ（Cajanuscajan）、ルピナスルバス（Lupinusalbus）、ムクナプルリエンス（Mucunapruriens）、狹葉ルピナス（Lupinusangustifolius）、カロポゴニウム（Calopogoniummucunoides）、シセラリエチナム（Cicerarietinum）、ゴマ（Sesamumindicum）、亜麻（Linumusitatissimum）、アブラナ（Brassicanapus）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ヒマ（Ricinuscommunis）、スエツムハナ（Carthamustinctorius）、白ビート（Betavulgaris）、サトウキビ（Saccharumofficinarum）、綿花（Gossypiumspp）、大麻（Cannabissativa）、セラギネラ（Selaginellamoellendorffii）、レモンユーカリ（Corymbiacitriodora）、テトラセントロン・シネンセ（Tetracentronsinense）、プロソピスアルバ（Prosopisalba）、タクサス・ワリチアナ・チャイネンシス（Taxuschinensis）、オリーブ（Oleaeuropaea）、アブラス・プレカトリウス（Abrusprecatorius）、パニクム・ウィルガツム（Panicumvirgatum）、ラムネルブリネルヴィス（Rhamnellarubrinervis）、カリアイリノインエンシス（Caryaillinoinensis）、カメリアシネンシス（Camelliasinensis）、ニコチアナタバクム（Nicotianatabacum）、ペニセタムプルプレウム（Pennisetumpurpureum）、イタリアンライグラス（Loliumrigidum）、オギ（Miscanthuslutarioriparius）、エノコログサ（Setariaviridis）、ペニセタムアロペクロイデス（Pennisetumalopecuroides）、スーダングラス（Sorghumsudanense）、タリクトルムタリクトロイデス（Thalictrumthalictroides）、エラグロスティスクルヴラ（Eragrostiscurvula）、ブラキポディウムディスタキオン（Brachypodiumdistachyon）、ロタスコルニキュラトゥス（LotuscorniculatusL）、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana）、フィスコミトリウムパテンス（Physcomitriumpatens）、ケラトドンプルプレウス（Ceratodonpurpureus）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ブラッシカジュンセア（Brassicajuncea）、ブブラッシカ・ラパ（Brassicarapa）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、スピナシアオレラケア（Spinaciaoleracea）、ラファヌスサティウス（Raphanussativus）、白菜（Brassicarapa）、ククルビタペポ（Cucurbitapepo）、アピウムグラヴェオレンス（Apiumgraveolens）、アリウムトゥベロスム（Alliumtuberosum）、ダウクスカロタ（Daucuscarota）、ソラナムメロンゲナ（Solanummelongena）、リコペルシコヌムエスクレンタム（Lycopersiconesculentum）、キュウリ（Cucumissativus）、ベニンカサヒスピダ（Benincasahispida）、ククルビタモスカタ（Cucurbitamoschata）、ルッファシリンドリカ（Luffacylindrica）、ククミスメロ（Cucumismelo）、ポテンティラアンセリナ（Potentillaanserina）、ヘメロカリスシトリナ（Hemerocalliscitrina）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、アスパラガスオフィシナリス（Asparagusofficinalis）、カプシクムアンヌム（Capsicumannuum）、アリウムサティウム（Alliumsativum）、アリウムフィストローサム（Alliumfistulosum）、ヘリアンサスタベロスス（Helianthustuberosus））、コリアンダー（Coriandrumsativum）、スイカ（Citrulluslanatus）、梨（Pyrusspp）、桃（Prunuspersica）、杏（Armeniacavulgaris）、スモモ（Prunussalicina）、ナツメ（Ziziphusjujuba）、ヴァティカ・マンガチャポイ（Vaticamangachapoi）、リンゴ（Maluspumila）、サンゴクリンゴ（Malusasiatica）、サクランボ（Cerasusspp）、クルミ（Juglansregia）、イチゴ（Fragaria×ananassa）、ブドウ（Vitisvinifera）、パイナップル（Ananascomosus）、黄連（Coptischinensis）、ルムラサキ（Astragalussinicus）、オタネニンジン（Panaxginseng）、アンゼリカ（Angelicasinensis）、スイカズラ（Lonicerajaponica）、赤根（Artemisiaargyi）、ミント（Menthacanadensis）、蘭（Cymbidiumssp）、ユリ（Liliumbrownii）、チューリップ（Tulipagesneriana）。
【請求項2】
OsCPRO1またはOsCPRO2をコードし、ここでOsCPRO1の遺伝子記号がLOC_Os03g47740であり、OsCPRO2の遺伝子記号がLOC_Os12g43950であるか、またはトウモロコシ由来のBEL1-like homeodomain protein 6（Sequence ID: PWZ21223.1）、または小麦由来のBEL1-like homeodomain protein 7(Sequence ID: XP_044365192.1)、または大豆由来のBEL1-like homeodomain protein 1(Sequence ID: XP_003543416.1)、または落花生由来のBEL1-like homeodomain protein 1(Sequence ID: XP_016170518.1)、または、上記の遺伝子と少なくとも90％、95％以上、より好ましくは98％、99％以上の同一種由来の遺伝子を持つものであり、依然として半数体誘導能力を持つ請求項1記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項3】
OsCPRO1のヌクレオチド配列がSEQ ID NO:1に示され、少なくとも90％、95％以上、より好ましくは98％、99％以上のイネ由来の同源遺伝子を持つものであり、依然として半数体誘導能力を持ち；OsCPRO2遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO：4に示されており、より好ましくは98%より大きく、99%以上のイネ由来の同源遺伝子であり、半数体誘導能を持つことを特徴とする請求項2記載の遺伝子。
【請求項4】
OsCPRO1のCDSヌクレオチド配列がSEQ ID NO：2に示されるか、あるいは、イネ由来の、依然として半数体誘導能を有し、それより98%を超え、99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ、依然として半数体誘導能を有し、OsCPRO2のCDSヌクレオチド配列がSEQ ID NO：5に示され、あるいは、イネ由来の、依然として半数体誘導能を有し、それより98%を超え、99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を特徴とする請求項2記載の遺伝子。
【請求項5】
請求項2から4のいずれかに記載された遺伝子を含むカセット、組み換えタンパク質、組み換え体または宿主細胞。
【請求項6】
請求項1に記載された蛋白質、あるいは請求項2から4のいずれかに記載された遺伝子の、植物半数体誘導における使用であって、好ましくは、前記植物が以下のものである、使用：イネ（Oryzasativa）、オリザ・メイエリアナ亜種（Oryzameyerianavar）、トウモロコシ（Zeamays）、コムギ（Triticumaestivum）、硬粒コムギ（Triticumturgidumsubsp）、野生二粒コムギ（Triticumdicoccoides）、ウラルトゥコムギ（Triticumurartu）、オオムギ（Hordeumvulgare）、エギロプス・タウスキー（Aegilopstauschii）、ライ麦（Secalecereale）、オートムギ（Avenasativa）、ソバ（Fagopyrumesculentum）、ハダカムギ（Hordeumvulgare）、ハトムギ（Coixlacryma-jobi）、アワ（Setariaitalica）、フォルニオこごめ（Digitariaexilis）、コーリャン（Sorghumbicolor）、キビ（Panicummiliaceum）、カツミグサ（Zizanialatifolia）、リュウキンカ（Zizaniapalustris）、エレウシネ（Eleusinecoracana）、ヤムイモ（Zizaniapalustris）、キャッサバ（Manihotesculenta）、ジャガイモ（Solanumtuberosum）、ナガイモ（Dioscoreapolystachya）、落花生（Arachishypogaea）、ナンキンマメ（Arachisduranensis）、大豆（Glycinemax）、野生大豆（Glycinesoja）、コスミグサ（Vignaangularis）、コメアズキ（Vignaumbellata）、レンズマメ（Lensculinaris）、緑豆（Vignaradiata）、ササゲ（Vignaunguiculata）、インゲンマメ（Phaseolusvulgaris）、ソラマメ（Viciafaba）、エンドウ（Pisumsativum）、ナタマメ（Canavaliagladiata）、キマメ（Cajanuscajan）、ルピナスルバス（Lupinusalbus）、ムクナプルリエンス（Mucunapruriens）、狹葉ルピナス（Lupinusangustifolius）、カロポゴニウム（Calopogoniummucunoides）、シセラリエチナム（Cicerarietinum）、ゴマ（Sesamumindicum）、亜麻（Linumusitatissimum）、アブラナ（Brassicanapus）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ヒマ（Ricinuscommunis）、スエツムハナ（Carthamustinctorius）、白ビート（Betavulgaris）、サトウキビ（Saccharumofficinarum）、綿花（Gossypiumspp）、大麻（Cannabissativa）、セラギネラ（Selaginellamoellendorffii）、レモンユーカリ（Corymbiacitriodora）、テトラセントロン・シネンセ（Tetracentronsinense）、プロソピスアルバ（Prosopisalba）、タクサス・ワリチアナ・チャイネンシス（Taxuschinensis）、オリーブ（Oleaeuropaea）、アブラス・プレカトリウス（Abrusprecatorius）、パニクム・ウィルガツム（Panicumvirgatum）、ラムネルブリネルヴィス（Rhamnellarubrinervis）、カリアイリノインエンシス（Caryaillinoinensis）、カメリアシネンシス（Camelliasinensis）、ニコチアナタバクム（Nicotianatabacum）、ペニセタムプルプレウム（Pennisetumpurpureum）、イタリアンライグラス（Loliumrigidum）、オギ（Miscanthuslutarioriparius）、エノコログサ（Setariaviridis）、ペニセタムアロペクロイデス（Pennisetumalopecuroides）、スーダングラス（Sorghumsudanense）、タリクトルムタリクトロイデス（Thalictrumthalictroides）、エラグロスティスクルヴラ（Eragrostiscurvula）、ブラキポディウムディスタキオン（Brachypodiumdistachyon）、ロタスコルニキュラトゥス（LotuscorniculatusL）、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana）、フィスコミトリウムパテンス（Physcomitriumpatens）、ケラトドンプルプレウス（Ceratodonpurpureus）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ブラッシカジュンセア（Brassicajuncea）、ブブラッシカ・ラパ（Brassicarapa）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、スピナシアオレラケア（Spinaciaoleracea）、ラファヌスサティウス（Raphanussativus）、白菜（Brassicarapa）、ククルビタペポ（Cucurbitapepo）、アピウムグラヴェオレンス（Apiumgraveolens）、アリウムトゥベロスム（Alliumtuberosum）、ダウクスカロタ（Daucuscarota）、ソラナムメロンゲナ（Solanummelongena）、リコペルシコヌムエスクレンタム（Lycopersiconesculentum）、キュウリ（Cucumissativus）、ベニンカサヒスピダ（Benincasahispida）、ククルビタモスカタ（Cucurbitamoschata）、ルッファシリンドリカ（Luffacylindrica）、ククミスメロ（Cucumismelo）、ポテンティラアンセリナ（Potentillaanserina）、ヘメロカリスシトリナ（Hemerocalliscitrina）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、アスパラガスオフィシナリス（Asparagusofficinalis）、カプシクムアンヌム（Capsicumannuum）、アリウムサティウム（Alliumsativum）、アリウムフィストローサム（Alliumfistulosum）、ヘリアンサスタベロスス（Helianthustuberosus））、コリアンダー（Coriandrumsativum）、スイカ（Citrulluslanatus）、梨（Pyrusspp）、桃（Prunuspersica）、杏（Armeniacavulgaris）、スモモ（Prunussalicina）、ナツメ（Ziziphusjujuba）、ヴァティカ・マンガチャポイ（Vaticamangachapoi）、リンゴ（Maluspumila）、サンゴクリンゴ（Malusasiatica）、サクランボ（Cerasusspp）、クルミ（Juglansregia）、イチゴ（Fragaria×ananassa）、ブドウ（Vitisvinifera）、パイナップル（Ananascomosus）、黄連（Coptischinensis）、ルムラサキ（Astragalussinicus）、オタネニンジン（Panaxginseng）、アンゼリカ（Angelicasinensis）、スイカズラ（Lonicerajaponica）、赤根（Artemisiaargyi）、ミント（Menthacanadensis）、蘭（Cymbidiumssp）、ユリ（Liliumbrownii）、チューリップ（Tulipagesneriana）。
【請求項7】
請求項２から4のいずれかに記載された遺伝子を用いて、植物半数体を誘導する方法であって、次の手順を含む方法：所定の遺伝子を含む再構成エクスプレーションベクターを植物に導入し、陽性遺伝子組み換え株を得て、その遺伝子は卵細胞特異的なエクスプレーションのプロモーターによって制御され、好ましくは、前記植物には、単子葉植物と双子葉植物が含まれ、好ましくは前記植物が、以下のものである：イネ（Oryza sativa）、オリザ・メイエリアナ亜種（Oryzameyerianavar）、トウモロコシ（Zeamays）、コムギ（Triticumaestivum）、硬粒コムギ（Triticumturgidumsubsp）、野生二粒コムギ（Triticumdicoccoides）、ウラルトゥコムギ（Triticumurartu）、オオムギ（Hordeumvulgare）、エギロプス・タウスキー（Aegilopstauschii）、ライ麦（Secalecereale）、オートムギ（Avenasativa）、ソバ（Fagopyrumesculentum）、ハダカムギ（Hordeumvulgare）、ハトムギ（Coixlacryma-jobi）、アワ（Setariaitalica）、フォルニオこごめ（Digitariaexilis）、コーリャン（Sorghumbicolor）、キビ（Panicummiliaceum）、カツミグサ（Zizanialatifolia）、リュウキンカ（Zizaniapalustris）、エレウシネ（Eleusinecoracana）、ヤムイモ（Zizaniapalustris）、キャッサバ（Manihotesculenta）、ジャガイモ（Solanumtuberosum）、ナガイモ（Dioscoreapolystachya）、落花生（Arachishypogaea）、ナンキンマメ（Arachisduranensis）、大豆（Glycinemax）、野生大豆（Glycinesoja）、コスミグサ（Vignaangularis）、コメアズキ（Vignaumbellata）、レンズマメ（Lensculinaris）、緑豆（Vignaradiata）、ササゲ（Vignaunguiculata）、インゲンマメ（Phaseolusvulgaris）、ソラマメ（Viciafaba）、エンドウ（Pisumsativum）、ナタマメ（Canavaliagladiata）、キマメ（Cajanuscajan）、ルピナスルバス（Lupinusalbus）、ムクナプルリエンス（Mucunapruriens）、狹葉ルピナス（Lupinusangustifolius）、カロポゴニウム（Calopogoniummucunoides）、シセラリエチナム（Cicerarietinum）、ゴマ（Sesamumindicum）、亜麻（Linumusitatissimum）、アブラナ（Brassicanapus）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ヒマ（Ricinuscommunis）、スエツムハナ（Carthamustinctorius）、白ビート（Betavulgaris）、サトウキビ（Saccharumofficinarum）、綿花（Gossypiumspp）、大麻（Cannabissativa）、セラギネラ（Selaginellamoellendorffii）、レモンユーカリ（Corymbiacitriodora）、テトラセントロン・シネンセ（Tetracentronsinense）、プロソピスアルバ（Prosopisalba）、タクサス・ワリチアナ・チャイネンシス（Taxuschinensis）、オリーブ（Oleaeuropaea）、アブラス・プレカトリウス（Abrusprecatorius）、パニクム・ウィルガツム（Panicumvirgatum）、ラムネルブリネルヴィス（Rhamnellarubrinervis）、カリアイリノインエンシス（Caryaillinoinensis）、カメリアシネンシス（Camelliasinensis）、ニコチアナタバクム（Nicotianatabacum）、ペニセタムプルプレウム（Pennisetumpurpureum）、イタリアンライグラス（Loliumrigidum）、オギ（Miscanthuslutarioriparius）、エノコログサ（Setariaviridis）、ペニセタムアロペクロイデス（Pennisetumalopecuroides）、スーダングラス（Sorghumsudanense）、タリクトルムタリクトロイデス（Thalictrumthalictroides）、エラグロスティスクルヴラ（Eragrostiscurvula）、ブラキポディウムディスタキオン（Brachypodiumdistachyon）、ロタスコルニキュラトゥス（LotuscorniculatusL）、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana）、フィスコミトリウムパテンス（Physcomitriumpatens）、ケラトドンプルプレウス（Ceratodonpurpureus）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ブラッシカジュンセア（Brassicajuncea）、ブブラッシカ・ラパ（Brassicarapa）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、スピナシアオレラケア（Spinaciaoleracea）、ラファヌスサティウス（Raphanussativus）、白菜（Brassicarapa）、ククルビタペポ（Cucurbitapepo）、アピウムグラヴェオレンス（Apiumgraveolens）、アリウムトゥベロスム（Alliumtuberosum）、ダウクスカロタ（Daucuscarota）、ソラナムメロンゲナ（Solanummelongena）、リコペルシコヌムエスクレンタム（Lycopersiconesculentum）、キュウリ（Cucumissativus）、ベニンカサヒスピダ（Benincasahispida）、ククルビタモスカタ（Cucurbitamoschata）、ルッファシリンドリカ（Luffacylindrica）、ククミスメロ（Cucumismelo）、ポテンティラアンセリナ（Potentillaanserina）、ヘメロカリスシトリナ（Hemerocalliscitrina）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、アスパラガスオフィシナリス（Asparagusofficinalis）、カプシクムアンヌム（Capsicumannuum）、アリウムサティウム（Alliumsativum）、アリウムフィストローサム（Alliumfistulosum）、ヘリアンサスタベロスス（Helianthustuberosus））、コリアンダー（Coriandrumsativum）、スイカ（Citrulluslanatus）、梨（Pyrusspp）、桃（Prunuspersica）、杏（Armeniacavulgaris）、スモモ（Prunussalicina）、ナツメ（Ziziphusjujuba）、ヴァティカ・マンガチャポイ（Vaticamangachapoi）、リンゴ（Maluspumila）、サンゴクリンゴ（Malusasiatica）、サクランボ（Cerasusspp）、クルミ（Juglansregia）、イチゴ（Fragaria×ananassa）、ブドウ（Vitisvinifera）、パイナップル（Ananascomosus）、黄連（Coptischinensis）、ルムラサキ（Astragalussinicus）、オタネニンジン（Panaxginseng）、アンゼリカ（Angelicasinensis）、スイカズラ（Lonicerajaponica）、赤根（Artemisiaargyi）、ミント（Menthacanadensis）、蘭（Cymbidiumssp）、ユリ（Liliumbrownii）、チューリップ（Tulipagesneriana）。
【請求項8】
卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターがAtDD45の卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターであり、好ましくは、そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:7に示され、前記導入はアグロバクテリウム介在法または遺伝子ショット法または遺伝子編集法で行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項9】
遺伝子組換え陽性材料の子一世代植物から半数体検査を行い、半数体材料を得るというステップを含むことを特徴とする請求項7または8に記載された方法。
【請求項10】
半数体誘導材料をMiMeシステムと組み合わせてアポミクシス材料を得るステップをさらに含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物技術および植物育種の分野に属し、具体的には植物細胞の増殖を利用して遺伝子誘導半数体を制御する方法およびその植物育種への応用に関するものである。
【背景技術】
【0002】
伝統的な育種方法と比べて、半数体誘導技術は2世代でホモ接合体種を得ることができ、育種期間を短縮するだけでなく、不要な労働コストも節約できる。半数体の源は主に2つある。1つは自然界での自発的な形成から生じるものであり、もう1つは人工的な誘導によって得られるものである。このうち、自然界における自然発生的な半数体の形成経路には、主に産雌単為生殖、産雄単為生殖、無性生殖があるが、これら3つの経路の発生頻度は非常に低いため（張正、2007年、農作物の半数体育種研究の概況と考え、山東農業科学、5:122-125.DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2007.05.025；崔▲てぃん▼、李亜莉、喬麟軼、郭慧娟、董艶輝、任永康、唐朝暉、2016.小麦の半数体育種方法とその研究進展.山西農業科学、44(1):106-109.DOI:10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.28.)、育種の需要を満たすことができない。育種専門家は通常、人工的に誘導した半数体の方法を組み合わせて育種を補助する。
【0003】
人工的手法を用いて半数体を誘導する方法は多くあり、その誘導率は自然発生の頻度と比べて大幅に向上している。その中で、産雌単為生殖を誘発する方法には、放射線誘発、化学誘発、異種花粉刺激、産雄単為生殖誘発系統を活用した誘発などが含まれる（相志国、海燕、康明輝、趙永英、2011年。半数体の産生経路とその作物遺伝育種への応用。河南農業科学、40（11）：17-21。DOI：10.15933/j.cnki.1004-3268.2011.11.009）。産雌単為生殖を誘発する方法として花粉離体培養、花藥離体培養及び着糸粒介導などある（李英、王佳、季樂翔、李昊、葉梅霞、郭斌、陳仲、安新民、2011年。植物半数体技術及び應用の研究進展。中國細胞生物學學報、33(9)：1008-1014。）。胞子体の繁殖を誘導する方法は、雌核体外培養と呼ばれ、受粉しない子房や胚珠などの器官を体外で培養し、新しい二倍体の植物を形成することである。半数体誘導技術は、イネ、小麦、トウモロコシ、綿花、おおむぎ、タバコ、アブラナなど多くの作物の育種に応用されており、トウモロコシでの発展が最も成熟しており、WS14、EMK、農大高誘1号、吉高誘3号などの一連の高頻度誘導系を創造した。農大高誘1号の誘導率は4％～6％、吉高誘3号の誘導率は10％であり、これらの誘導系の応用によりトウモロコシの育種プロセスが大幅に加速された。（才卓、徐国良、劉向輝、董亜琳、代玉仙、李淑華、2007. トウモロコシ高頻度半数生殖誘導系吉高誘致系3号の選別育成. トウモロコシ科学、15(1):1-4.DOI:10.13597/j.cnki.maize.science.2007.01.001.)
2015年、CONNERら(CONNER J A, MOOKKAN M, HUO H, CHAE K, OZIAS-AKINS P, 2015. A parthenogenesis gene of apomict origin elicits embryo formation from unfertilized eggs in a sexual plant. PNAS, 112(36): 11205-11210.DOI: 10.1073/pnas.1505856112.)は、アフリカオオアワガエリのPsASGR-BBML遺伝子が受精前の卵巣、発育中の種子、根、葯でレクスプレスしていること、PsASGR-BBML導入遺伝子を用いて有性生殖種であるアワガエリの半数体胚の誘導が容易にできることを発見した。2017年、CONNERら(CONNER J A, PODIO M, OZIAS-AKINS P, 2017. Haploid embryo production in rice and maize induced by PsASGR-BBML transgenes. Plant Reprod, 30(1): 41-52.DOI: 10.1007/s00497-017-0298-x.)によるその後の研究で、PsASGR-BBML導入遺伝子が2つの主要な単子葉作物、トウモロコシとイネにおいて単子葉作物半数体胚の生産を誘導することが判明した。2019年、KHANDAYら(KHANDAY I, SKINNER D, YANG B, MERCIER R, SUNDARESAN V, 2019. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature, 565(7737): 91-95.DOI: 10.1038/s41586-018-0785-8.)は、イネにおけるBBM1のエクスプレーションは雄性配偶子から始まり、雌性ゲノムのエクスプレーションを活性化する作用を持ち、それが胚の発生を通して作用すること、AtDD45プロモーターを用いた卵母細胞におけるOsBBM1の異所性エクスプレーションは孤発雌を誘導することができ、その誘導率は5％から10％、T2世代の遺伝子組み換え材料では最大29％であることを発見した。卵細胞におけるBBM1の異所性エクスプレーションとMiMe(osd1/rec8/spo11-1)システムを組み合わせることで、つまり、始原生殖細胞の減数分裂を有糸分裂に置き換えながら産雌単為生殖を行い、親の全ゲノムを維持するクローン子孫が得られた。
2015年、CONNERら(CONNER J A, MOOKKAN M, HUO H, CHAE K, OZIAS-AKINS P, 2015. A parthenogenesis gene of apomict origin elicits embryo formation from unfertilized eggs in a sexual plant. PNAS, 112(36): 11205-11210.DOI: 10.1073/pnas.1505856112.)は、アフリカオオアワガエリのPsASGR-BBML遺伝子が受精前の卵巣、発育中の種子、根、葯でレクスプレスしていること、PsASGR-BBML導入遺伝子を用いて有性生殖種であるアワガエリの半数体胚の誘導が容易にできることを発見した。2017年、CONNERら(CONNER J A, PODIO M, OZIAS-AKINS P, 2017. Haploid embryo production in rice and maize induced by PsASGR-BBML transgenes. Plant Reprod, 30(1): 41-52.DOI: 10.1007/s00497-017-0298-x.)によるその後の研究で、PsASGR-BBML導入遺伝子が2つの主要な単子葉作物、トウモロコシとイネにおいて単子葉作物半数体胚の生産を誘導することが判明した。2019年、KHANDAYら(KHANDAY I, SKINNER D, YANG B, MERCIER R, SUNDARESAN V, 2019. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature, 565(7737): 91-95.DOI: 10.1038/s41586-018-0785-8.)は、イネにおけるBBM1のエクスプレーションは雄性配偶子から始まり、雌性ゲノムのエクスプレーションを活性化する作用を持ち、それが胚の発生を通して作用すること、AtDD45プロモーターを用いた卵母細胞におけるOsBBM1の異所性エクスプレーションは孤発雌を誘導することができ、その誘導率は5％から10％、T2世代の遺伝子組み換え材料では最大29％であることを発見した。卵細胞におけるBBM1の異所性エクスプレーションとMiMe(osd1/rec8/spo11-1)システムを組み合わせることで、つまり、始原生殖細胞の減数分裂を有糸分裂に置き換えながら産雌単為生殖を行い、親の全ゲノムを維持するクローン子孫が得られた。
【0004】
2017年、KELLIHERら(KELLIHER T, STARR D, RICHBOURG L, CHINTAMANANI S, DELZER B, NUCCIO M L, GREEN J, CHEN Z Y, MCCUISTON J, WANG W L,LIEBLER T, BULLOCK P, MARTIN B, 2017. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid Induction. Nature, 542(7639): 105-109.DOI: 10.1038/nature20827.)はトウモロコシ中のMTL遺伝子が精子の細胞質にエクスプレスし、トランスコード変異は半数体の産生を誘導し、誘導率は6.7%であることを発見した。2018年、YAOら(YAO L, ZHANG Y, LIU C X, LIU Y B, WANG Y L, LIANG D W, LIU J T, SAHOO G, KELLIHER T, 2018. OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice. Nature Plants,4(8): 530-533.DOI: 10.1038/s41477-018-0193-y.)はイネで半数体誘導遺伝子を開発するため、ZmMTLと相同するOsMTLを発見した。そして、この遺伝子をノックアウトするとイネの半数体の産生が誘導されることを発見した。誘導率は２％～６％であり、イネでもMTLが媒介半数体の形成に関与し、イネの半数体誘導系の構築に利用できることが証明された。2019年、WANGら(WANG C, LIU Q, SHEN Y, HUA Y F, WANG J J, LIN J R, WU M G, SUN T T, CHENG Z K, MERCIER R,WANG K J, 2019. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nature Biotechnology, 37(3): 283-286.DOI: 10.1038/s41587-018-0003-0.)はハイブリッドライスCY84中のOsMTL遺伝子をノックアウトし、交雑水稲を背景としたmtl半数体の誘導材料を得て、誘導率は5%程度、成熟率は10%程度であった。さらに、イネの内在性遺伝子であるREC8、PAIR1、OSD1、MTLの4つを同時にノックアウトすることにより、アポミクシスを生じさせることができるFix（Fixation of hybrid）材料を得て、雑種強勢の固定を完了する。
【0005】
半数体を誘導する方法は数多くあるが、単一遺伝子制御によって半数体誘導を達成できる遺伝子は非常に少数である。イネのアポミクシスでクローン種子を生産するために使用できる制御遺伝子はさらに少ない。現在、OsBBM1とOsMTLの2つだけの遺伝子が使用されている。
【発明の概要】
【0006】
イネの受精していない卵細胞と受精した後5日目の胚のエクスプレーションプロファイルを解析した結果、高いエクスプレーションの2つの遺伝子が発見され、最終的にイネに半数体誘導能を持つ2つの新しい遺伝子が発見されたことを確定し、それぞれOsCPRO1(CELLPROLIFERATION1)とOsCPRO2(CELLPROLIFERATION2)と名付けた。ここで、OsCPRO1の遺伝子シンボルはLOC_Os03g47740で、OsCPRO2の遺伝子シンボルはLOC_Os12g43950である。そして、これら2つの半数体誘導遺伝子は、イネのアポミクシスに応用することができ、雑種の優位性を固定し、クローン種子の形成を実現することができる。
【0007】
イネにおいて半数体誘導能を有する新たな遺伝子OsCPRO1(LOC_Os03g47740)とOsCPRO2(LOC_Os12g43950)を発見し、当該半数体誘導の成熟率が高く、イネのアポミクシスに応用できる。
【0008】
したがって、本発明は、POXスーパーファミリードメインとホメオボックスドメインを有する半数体誘導能を持つタンパク質を提供する。具体的には、POXスーパーファミリードメインは、TELLドメインとSKYドメインを含んでおり、SKYLKAAQELLDEVVSVである。好ましいのは、OsCPRO1またはOsCPRO2タンパク質であり、そのアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：6に示される、または次の種の同源遺伝子由来であり、好ましくは90％、95％以上、より好ましくは98％、99％以上の同源遺伝子は下記のんとおりである：イネ（Oryzasativa）、オリザ・メイエリアナ亜種（Oryzameyerianavar）、トウモロコシ（Zeamays）、コムギ（Triticumaestivum）、硬粒コムギ（Triticumturgidumsubsp）、野生二粒コムギ（Triticumdicoccoides）、ウラルトゥコムギ（Triticumurartu）、オオムギ（Hordeumvulgare）、エギロプス・タウスキー（Aegilopstauschii）、ライ麦（Secalecereale）、オートムギ（Avenasativa）、ソバ（Fagopyrumesculentum）、ハダカムギ（Hordeumvulgare）、ハトムギ（Coixlacryma-jobi）、アワ（Setariaitalica）、フォルニオこごめ（Digitariaexilis）、コーリャン（Sorghumbicolor）、キビ（Panicummiliaceum）、カツミグサ（Zizanialatifolia）、リュウキンカ（Zizaniapalustris）、エレウシネ（Eleusinecoracana）、ヤムイモ（Zizaniapalustris）、キャッサバ（Manihotesculenta）、ジャガイモ（Solanumtuberosum）、ナガイモ（Dioscoreapolystachya）、落花生（Arachishypogaea）、ナンキンマメ（Arachisduranensis）、大豆（Glycinemax）、野生大豆（Glycinesoja）、コスミグサ（Vignaangularis）、コメアズキ（Vignaumbellata）、レンズマメ（Lensculinaris）、緑豆（Vignaradiata）、ササゲ（Vignaunguiculata）、インゲンマメ（Phaseolusvulgaris）、ソラマメ（Viciafaba）、エンドウ（Pisumsativum）、ナタマメ（Canavaliagladiata）、キマメ（Cajanuscajan）、ルピナスルバス（Lupinusalbus）、ムクナプルリエンス（Mucunapruriens）、狹葉ルピナス（Lupinusangustifolius）、カロポゴニウム（Calopogoniummucunoides）、シセラリエチナム（Cicerarietinum）、ゴマ（Sesamumindicum）、亜麻（Linumusitatissimum）、アブラナ（Brassicanapus）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ヒマ（Ricinuscommunis）、スエツムハナ（Carthamustinctorius）、白ビート（Betavulgaris）、サトウキビ（Saccharumofficinarum）、綿花（Gossypiumspp）、大麻（Cannabissativa）、セラギネラ（Selaginellamoellendorffii）、レモンユーカリ（Corymbiacitriodora）、テトラセントロン・シネンセ（Tetracentronsinense）、プロソピスアルバ（Prosopisalba）、タクサス・ワリチアナ・チャイネンシス（Taxuschinensis）、オリーブ（Oleaeuropaea）、アブラス・プレカトリウス（Abrusprecatorius）、パニクム・ウィルガツム（Panicumvirgatum）、ラムネルブリネルヴィス（Rhamnellarubrinervis）、カリアイリノインエンシス（Caryaillinoinensis）、カメリアシネンシス（Camelliasinensis）、ニコチアナタバクム（Nicotianatabacum）、ペニセタムプルプレウム（Pennisetumpurpureum）、イタリアンライグラス（Loliumrigidum）、オギ（Miscanthuslutarioriparius）、エノコログサ（Setariaviridis）、ペニセタムアロペクロイデス（Pennisetumalopecuroides）、スーダングラス（Sorghumsudanense）、タリクトルムタリクトロイデス（Thalictrumthalictroides）、エラグロスティスクルヴラ（Eragrostiscurvula）、ブラキポディウムディスタキオン（Brachypodiumdistachyon）、ロタスコルニキュラトゥス（LotuscorniculatusL）、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana）、フィスコミトリウムパテンス（Physcomitriumpatens）、ケラトドンプルプレウス（Ceratodonpurpureus）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ブラッシカジュンセア（Brassicajuncea）、ブブラッシカ・ラパ（Brassicarapa）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、スピナシアオレラケア（Spinaciaoleracea）、ラファヌスサティウス（Raphanussativus）、白菜（Brassicarapa）、ククルビタペポ（Cucurbitapepo）、アピウムグラヴェオレンス（Apiumgraveolens）、アリウムトゥベロスム（Alliumtuberosum）、ダウクスカロタ（Daucuscarota）、ソラナムメロンゲナ（Solanummelongena）、リコペルシコヌムエスクレンタム（Lycopersiconesculentum）、キュウリ（Cucumissativus）、ベニンカサヒスピダ（Benincasahispida）、ククルビタモスカタ（Cucurbitamoschata）、ルッファシリンドリカ（Luffacylindrica）、ククミスメロ（Cucumismelo）、ポテンティラアンセリナ（Potentillaanserina）、ヘメロカリスシトリナ（Hemerocalliscitrina）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、アスパラガスオフィシナリス（Asparagusofficinalis）、カプシクムアンヌム（Capsicumannuum）、アリウムサティウム（Alliumsativum）、アリウムフィストローサム（Alliumfistulosum）、ヘリアンサスタベロスス（Helianthustuberosus））、コリアンダー（Coriandrumsativum）、スイカ（Citrulluslanatus）、梨（Pyrusspp）、桃（Prunuspersica）、杏（Armeniacavulgaris）、スモモ（Prunussalicina）、ナツメ（Ziziphusjujuba）、ヴァティカ・マンガチャポイ（Vaticamangachapoi）、リンゴ（Maluspumila）、サンゴクリンゴ（Malusasiatica）、サクランボ（Cerasusspp）、クルミ（Juglansregia）、イチゴ（Fragaria×ananassa）、ブドウ（Vitisvinifera）、パイナップル（Ananascomosus）、黄連（Coptischinensis）、ルムラサキ（Astragalussinicus）、オタネニンジン（Panaxginseng）、アンゼリカ（Angelicasinensis）、スイカズラ（Lonicerajaponica）、赤根（Artemisiaargyi）、ミント（Menthacanadensis）、蘭（Cymbidiumssp）、ユリ（Liliumbrownii）、チューリップ（Tulipagesneriana）。
【0009】
同様に、本発明は、OsCPRO1またはOsCPRO2であるタンパク質をコードする遺伝子を提供し、OsCPRO1の遺伝子記号はLOC_Os03g47740であり、OsCPRO2の遺伝子記号はLOC_Os12g43950であり、またはトウモロコシ由来のBEL1-like homeodomain protein 6、配列ID：PWZ21223.1；または小麦由来のBEL1-like homeodomain protein 7、SequenceID:XP_044365192.1、または大豆由来のBEL1-like homeodomain protein 1、SequenceID:XP_003543416.1、または落花生由来のBEL1-like homeodomain protein 1、SequenceID:XP_016170518.1、または、上記の遺伝子と少なくとも90％、95％以上、より好ましくは98％、99％以上の同一種由来の同源遺伝子を持つものであり、依然として半数体誘導能力を持つ。
【0010】
より好ましく、OsCPRO1の遺伝子ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：1に示すとおりであるか、または９０％、９５％を超え、より好ましくは９８％、９９％以上のイネ由来の同源遺伝子であり、なおかつ、半数体誘導能力を持っている。OsCPRO2遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO：4に示されており、より好ましくは98%より大きく、99%以上のイネ由来の同源遺伝子であり、半数体誘導能を持つこと。
【0011】
また、好ましいのは、OsCPRO1のＣＤＳヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：2に示される、又は、半数体誘導能を有し、それと98％又は99％を超える同一性を有し、かつ、依然として半数体誘導能を有するイネ由来のヌクレオチド配列である。OsCPRO2のCDSヌクレオチド配列がSEQ ID NO：5に示される。あるいは、イネ由来の、依然として半数体誘導能を有し、それと98%を超え、99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【0012】
本発明は、遺伝子を含む遺伝子カセット、組み換えタンパク質、組み換え体または宿主細胞を提供する。
【0013】
本発明は、前記のタンパク質または前記の遺伝子を誘導植物半数体中での利用に提供する。
【0014】
本発明は、遺伝子誘導植物半数体を利用する方法をさらに提供する。この方法は、以下の手順を含む：遺伝子を含む組み換えエクスプレーションベクターを植物に導入し、陽性遺伝子組み換え株を得る。前記遺伝子は卵細胞特異的なエクスプレーションのプロモーターによって制御される。好ましいのは、前記植物は、単子葉植物と双子葉植物が含まれる。
【0015】
好ましいのは、卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターは、AtDD45の卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターであり、より好ましく、そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：7に示される通りである。前記導入はアグロバクテリウム介在法または遺伝子ショット法または遺伝子編集法で行われる。
【0016】
より具体的には、野生型植物およびT0世代遺伝子組み換え陽性植物の野外表現型形質を調査するというステップが含まれる。T0世代の遺伝子組み換え体の種子を採取し、発芽処理を行って、T1世代の遺伝子組み換え株を取得する。Indelマークまたはフローサイトメトリー倍性検査技術を使用して、T1世代の遺伝子組み換え体で半数体検査を実行し、半数体材料を取得する。さらに、半数体誘導材料をMiMeシステムと組み合わせてアポミクシス材料を取得することも含まれる。
【0017】
現在の技術で発見された半数体誘導遺伝子はOsBBM1とOsMTLのみで、これらは人工的にアポミクシスを作り出すために使用されている。本発明により発見された半数体誘導能を有する２つの新規遺伝子（OsCPRO1およびOsCPRO2）は、クローン種子を作製するためのアポミクシスにも適用可能であることが確認され、高い応用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
実施例を組み合わせて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を制限するものではない。
【0020】
実施例1:OsCPRO1およびOsCPRO2の発見と特徴
イネの受精していない卵細胞と受精した後5日目の胚のエクスプレーションプロファイルを解析した結果、高いエクスプレーションの2つの遺伝子が発見され、最終的にイネに半数体誘導能を持つ2つの新しい遺伝子が発見されたことを確定し、それぞれOsCPRO1(CELLPROLIFERATION1)とOsCPRO2(CELLPROLIFERATION2)と名付けた。ここで、OsCPRO1の遺伝子シンボルはLOC_Os03g47740で、OsCPRO2の遺伝子シンボルはLOC_Os12g43950である。
イネの受精していない卵細胞と受精した後5日目の胚のエクスプレーションプロファイルを解析した結果、高いエクスプレーションの2つの遺伝子が発見され、最終的にイネに半数体誘導能を持つ2つの新しい遺伝子が発見されたことを確定し、それぞれOsCPRO1(CELLPROLIFERATION1)とOsCPRO2(CELLPROLIFERATION2)と名付けた。ここで、OsCPRO1の遺伝子シンボルはLOC_Os03g47740で、OsCPRO2の遺伝子シンボルはLOC_Os12g43950である。
【0021】
1.OsCPRO1(LOC_Os03g47740)
（1）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)遺伝子配列はSEQ ID NO：1に示す通りである。
（2）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)CDS配列はSEQ ID NO：2に示す通りである。
（3）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)アミノ酸配列はSEQ ID NO：3に示す通りである。
（4）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)の重要な構造ドメイン:
［1］POXスーパーファミリードメイン(pfam07526):核機能に関連するタンパク質ドメインのファミリー。TELLドメインが含まれ、LQNKMAKLMAMLDEVDRKYKHYYHQMQIVVSSFDMVAGSGAAKPYTAVALQTISKHFRCLKDAINDQINVIRKKLGEEESSSGKEGKLTRLRYIDQQLRQQRAFQQYGLLQとSKY構造ドメイン：SKYLKAAQELLDEVVSV。
［2］Homeoboxドメイン(pfam05920):これは、菌類から人類および植物に至るまで保存されているホメオボックス転写因子KN構造ドメインである。最初、それらは真核生物の中でTALEホメオボックス遺伝子（KNOXおよびMEIS遺伝子を含む）として判定された。
（1）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)遺伝子配列はSEQ ID NO：1に示す通りである。
（2）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)CDS配列はSEQ ID NO：2に示す通りである。
（3）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)アミノ酸配列はSEQ ID NO：3に示す通りである。
（4）OsCPRO1(LOC_Os03g47740)の重要な構造ドメイン:
［1］POXスーパーファミリードメイン(pfam07526):核機能に関連するタンパク質ドメインのファミリー。TELLドメインが含まれ、LQNKMAKLMAMLDEVDRKYKHYYHQMQIVVSSFDMVAGSGAAKPYTAVALQTISKHFRCLKDAINDQINVIRKKLGEEESSSGKEGKLTRLRYIDQQLRQQRAFQQYGLLQとSKY構造ドメイン：SKYLKAAQELLDEVVSV。
［2］Homeoboxドメイン(pfam05920):これは、菌類から人類および植物に至るまで保存されているホメオボックス転写因子KN構造ドメインである。最初、それらは真核生物の中でTALEホメオボックス遺伝子（KNOXおよびMEIS遺伝子を含む）として判定された。
【0022】
2.OsCPRO2(LOC_Os12g43950)
（1）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)遺伝子配列はSEQ ID NO：4に示す通りである。
（2）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)CDS配列はSEQ ID NO：5に示す通りである。
（3）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)アミノ酸配列SEQ ID NO：6に示す通りである。
（4）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)の重要な構造ドメイン:
［1］POXスーパーファミリードメイン(pfam07526):核機能に関連するタンパク質ドメインのファミリー。TELL構造ドメインが含まれ：LQNKMAKLMAMLDEVDRKYKHYYHQMQTVVSSFDVVAGPGSAKPYTAVALQTISRHFRCLKDAINDQINVIRKKLGEEENSSGKEGKLTRLRYIDQQLRQQRAFQQYGMIP和SKY構造ドメイン：SRYLKAAQELLDEVVSV。
［2］Homeoboxドメイン(pfam05920):これは、菌類から人類および植物に至るまで保存されているホメオボックス転写因子KNドメインである。最初、それらは真核生物の中でTALEホメオボックス遺伝子（KNOXおよびMEIS遺伝子を含む）として判定された。
（1）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)遺伝子配列はSEQ ID NO：4に示す通りである。
（2）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)CDS配列はSEQ ID NO：5に示す通りである。
（3）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)アミノ酸配列SEQ ID NO：6に示す通りである。
（4）OsCPRO2(LOC_Os12g43950)の重要な構造ドメイン:
［1］POXスーパーファミリードメイン(pfam07526):核機能に関連するタンパク質ドメインのファミリー。TELL構造ドメインが含まれ：LQNKMAKLMAMLDEVDRKYKHYYHQMQTVVSSFDVVAGPGSAKPYTAVALQTISRHFRCLKDAINDQINVIRKKLGEEENSSGKEGKLTRLRYIDQQLRQQRAFQQYGMIP和SKY構造ドメイン：SRYLKAAQELLDEVVSV。
［2］Homeoboxドメイン(pfam05920):これは、菌類から人類および植物に至るまで保存されているホメオボックス転写因子KNドメインである。最初、それらは真核生物の中でTALEホメオボックス遺伝子（KNOXおよびMEIS遺伝子を含む）として判定された。
【0023】
3.OsCPRO1とOsCPRO2の同源遺伝子が存在する種
NCBIデータベースを利用して、トウモロコシ、小麦、大豆、落花生のアミノ酸配列の同源性比較を行う。OsCPRO1とOsCPRO2の同源遺伝子のアミノ酸配列の比較結果は以下のとおりである。
NCBIデータベースを利用して、トウモロコシ、小麦、大豆、落花生のアミノ酸配列の同源性比較を行う。OsCPRO1とOsCPRO2の同源遺伝子のアミノ酸配列の比較結果は以下のとおりである。
【0024】
トウモロコシ[Zea mays]，BEL1-like homeodomain protein 6，Sequence ID: PWZ21223.1Length: 643Number of Matches: 1，Range 1: 1 to 634。
小麦[Triticum aestivum]，BEL1-like homeodomain protein 7，Sequence ID: XP_044365192.1Length: 638Number of Matches: 1，Range 1: 1 to 626。
大豆[Glycine max]，BEL1-like homeodomain protein 1，Sequence ID: XP_003543416.1Length: 702Number of Matches: 1，Range 1: 166 to 489。
落花生[Arachis ipaensis]，BEL1-like homeodomain protein 1，Sequence ID: XP_016170518.1Length: 733Number of Matches: 1，Range 1: 278 to 488。
チェックした結果、同源遺伝子が存在する種は、以下に限定されないが、イネ（Oryzasativa）、オリザ・メイエリアナ亜種（Oryzameyerianavar）、トウモロコシ（Zeamays）、コムギ（Triticumaestivum）、硬粒コムギ（Triticumturgidumsubsp）、野生二粒コムギ（Triticumdicoccoides）、ウラルトゥコムギ（Triticumurartu）、オオムギ（Hordeumvulgare）、エギロプス・タウスキー（Aegilopstauschii）、ライ麦（Secalecereale）、オートムギ（Avenasativa）、ソバ（Fagopyrumesculentum）、ハダカムギ（Hordeumvulgare）、ハトムギ（Coixlacryma-jobi）、アワ（Setariaitalica）、フォルニオこごめ（Digitariaexilis）、コーリャン（Sorghumbicolor）、キビ（Panicummiliaceum）、カツミグサ（Zizanialatifolia）、リュウキンカ（Zizaniapalustris）、エレウシネ（Eleusinecoracana）、ヤムイモ（Zizaniapalustris）、キャッサバ（Manihotesculenta）、ジャガイモ（Solanumtuberosum）、ナガイモ（Dioscoreapolystachya）、落花生（Arachishypogaea）、ナンキンマメ（Arachisduranensis）、大豆（Glycinemax）、野生大豆（Glycinesoja）、コスミグサ（Vignaangularis）、コメアズキ（Vignaumbellata）、レンズマメ（Lensculinaris）、緑豆（Vignaradiata）、ササゲ（Vignaunguiculata）、インゲンマメ（Phaseolusvulgaris）、ソラマメ（Viciafaba）、エンドウ（Pisumsativum）、ナタマメ（Canavaliagladiata）、キマメ（Cajanuscajan）、ルピナスルバス（Lupinusalbus）、ムクナプルリエンス（Mucunapruriens）、狹葉ルピナス（Lupinusangustifolius）、カロポゴニウム（Calopogoniummucunoides）、シセラリエチナム（Cicerarietinum）、ゴマ（Sesamumindicum）、亜麻（Linumusitatissimum）、アブラナ（Brassicanapus）、ヒマワリ（Helianthusannuus）、ヒマ（Ricinuscommunis）、スエツムハナ（Carthamustinctorius）、白ビート（Betavulgaris）、サトウキビ（Saccharumofficinarum）、綿花（Gossypiumspp）、大麻（Cannabissativa）、セラギネラ（Selaginellamoellendorffii）、レモンユーカリ（Corymbiacitriodora）、テトラセントロン・シネンセ（Tetracentronsinense）、プロソピスアルバ（Prosopisalba）、タクサス・ワリチアナ・チャイネンシス（Taxuschinensis）、オリーブ（Oleaeuropaea）、アブラス・プレカトリウス（Abrusprecatorius）、パニクム・ウィルガツム（Panicumvirgatum）、ラムネルブリネルヴィス（Rhamnellarubrinervis）、カリアイリノインエンシス（Caryaillinoinensis）、カメリアシネンシス（Camelliasinensis）、ニコチアナタバクム（Nicotianatabacum）、ペニセタムプルプレウム（Pennisetumpurpureum）、イタリアンライグラス（Loliumrigidum）、オギ（Miscanthuslutarioriparius）、エノコログサ（Setariaviridis）、ペニセタムアロペクロイデス（Pennisetumalopecuroides）、スーダングラス（Sorghumsudanense）、タリクトルムタリクトロイデス（Thalictrumthalictroides）、エラグロスティスクルヴラ（Eragrostiscurvula）、ブラキポディウムディスタキオン（Brachypodiumdistachyon）、ロタスコルニキュラトゥス（LotuscorniculatusL）、アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana）、フィスコミトリウムパテンス（Physcomitriumpatens）、ケラトドンプルプレウス（Ceratodonpurpureus）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ブラッシカジュンセア（Brassicajuncea）、ブブラッシカ・ラパ（Brassicarapa）、ブラッシカオレラケア（Brassicaoleracea）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、スピナシアオレラケア（Spinaciaoleracea）、ラファヌスサティウス（Raphanussativus）、白菜（Brassicarapa）、ククルビタペポ（Cucurbitapepo）、アピウムグラヴェオレンス（Apiumgraveolens）、アリウムトゥベロスム（Alliumtuberosum）、ダウクスカロタ（Daucuscarota）、ソラナムメロンゲナ（Solanummelongena）、リコペルシコヌムエスクレンタム（Lycopersiconesculentum）、キュウリ（Cucumissativus）、ベニンカサヒスピダ（Benincasahispida）、ククルビタモスカタ（Cucurbitamoschata）、ルッファシリンドリカ（Luffacylindrica）、ククミスメロ（Cucumismelo）、ポテンティラアンセリナ（Potentillaanserina）、ヘメロカリスシトリナ（Hemerocalliscitrina）、ラクトゥカサティバ（Lactucasativa）、アスパラガスオフィシナリス（Asparagusofficinalis）、カプシクムアンヌム（Capsicumannuum）、アリウムサティウム（Alliumsativum）、アリウムフィストローサム（Alliumfistulosum）、ヘリアンサスタベロスス（Helianthustuberosus））、コリアンダー（Coriandrumsativum）、スイカ（Citrulluslanatus）、梨（Pyrusspp）、桃（Prunuspersica）、杏（Armeniacavulgaris）、スモモ（Prunussalicina）、ナツメ（Ziziphusjujuba）、ヴァティカ・マンガチャポイ（Vaticamangachapoi）、リンゴ（Maluspumila）、サンゴクリンゴ（Malusasiatica）、サクランボ（Cerasusspp）、クルミ（Juglansregia）、イチゴ（Fragaria×ananassa）、ブドウ（Vitisvinifera）、パイナップル（Ananascomosus）、黄連（Coptischinensis）、ルムラサキ（Astragalussinicus）、オタネニンジン（Panaxginseng）、アンゼリカ（Angelicasinensis）、スイカズラ（Lonicerajaponica）、赤根（Artemisiaargyi）、ミント（Menthacanadensis）、蘭（Cymbidiumssp）、ユリ（Liliumbrownii）、チューリップ（Tulipagesneriana）。
【0025】
実施例2：OsCPRO1とOsCPRO2を用いた半数体の誘導方法
本発明におけるOsCPRO1およびOsCPRO2を使用して半数体を誘導する方法は、以下のように要約される（図９）：［1］AtDD45卵細胞において特異的エクスプレーションのプロモーターを使用して、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO：7に示されるように、それぞれOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のＣＤＳ配列またはゲノム配列を駆動して、異所性エクスプレーションベクターを構築する。［2］アグロバクテリウム法を使用して遺伝子組み換え体を取得する。［3］野生型CY84およびT0世代遺伝子組み換え陽性植物の野外表現型形質を調査する。［4］半数体検査用Indelマークをデザインする。［5］T0世代の遺伝子組み換え体の成熟率を計測し、発芽処理を行ってT1世代の遺伝子組み換え株を取得する。［6］Indelマークを使用して、T1世代の遺伝子組み換え体の半数体検査を行う。［7］T1世代遺伝子組み換え株の半数体誘導率を統計する。［8］半数体誘導材料をMiMeシステムと組み合わせて、アポミクシス材料を取得する。技術路線の概要は図9に示されている。
本発明におけるOsCPRO1およびOsCPRO2を使用して半数体を誘導する方法は、以下のように要約される（図９）：［1］AtDD45卵細胞において特異的エクスプレーションのプロモーターを使用して、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO：7に示されるように、それぞれOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のＣＤＳ配列またはゲノム配列を駆動して、異所性エクスプレーションベクターを構築する。［2］アグロバクテリウム法を使用して遺伝子組み換え体を取得する。［3］野生型CY84およびT0世代遺伝子組み換え陽性植物の野外表現型形質を調査する。［4］半数体検査用Indelマークをデザインする。［5］T0世代の遺伝子組み換え体の成熟率を計測し、発芽処理を行ってT1世代の遺伝子組み換え株を取得する。［6］Indelマークを使用して、T1世代の遺伝子組み換え体の半数体検査を行う。［7］T1世代遺伝子組み換え株の半数体誘導率を統計する。［8］半数体誘導材料をMiMeシステムと組み合わせて、アポミクシス材料を取得する。技術路線の概要は図9に示されている。
【0026】
実験例1
1.実験材料
本実施例では、インディカ粳型三系ハイブリッド稲の春優84（CY84）を遺伝子組み換え材料として選択した。CY84は、粳型不稔系の春江16Aを母本とし、インディカ型回復系C84を父本として交雑育成されたものである。このハイブリッド稲は生育期間が長く、単季晩稲の栽培に適している。また、生育力が旺盛で穂が大きく、粒数も多い。茎が太くて倒伏に強い。
1.実験材料
本実施例では、インディカ粳型三系ハイブリッド稲の春優84（CY84）を遺伝子組み換え材料として選択した。CY84は、粳型不稔系の春江16Aを母本とし、インディカ型回復系C84を父本として交雑育成されたものである。このハイブリッド稲は生育期間が長く、単季晩稲の栽培に適している。また、生育力が旺盛で穂が大きく、粒数も多い。茎が太くて倒伏に強い。
【0027】
2.異所性エクスプレーションベクターを構築する
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターは、それぞれOsCPRO1遺伝子とOsCPRO2遺伝子のCDS配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了させるために選択された。
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターは、それぞれOsCPRO1遺伝子とOsCPRO2遺伝子のCDS配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了させるために選択された。
【0028】
2.1異所性エクスプレーションのためのベクター構築に必要なフラグメントを取得する。
【0029】
（1）シロイヌナズナの葉からゲノムDNAを抽出し、AtDD45プロモーター配列を増幅するためのテンプレートとして使用した。
【0030】
DNAの抽出方法：［1］稲葉を約2cm採取し、スチールビーズを入れた2mL遠心チューブに入れ、番号を付けた後、CTAB抽出液500μLを加える。［2］遠心チューブを組織細胞破砕機に移し、60Hz/秒、2分間振動および粉砕する。［3］粉砕したサンプルを65℃のオーブンに30分間置き、その間上下に回転させたり、10分間/回振動したりした。［4］サンプルを取り出し、12,000rpmで30秒間遠心分離し、ドラフト内に300μLのクロロホルムを加え、上下を逆にして混合する。［5］再度12,000rpmで8分間遠心分離する。遠心分離後、上清液を350μL取り、滅菌済みの遠心チューブに入れ、700μLの冷却された無水エタノールを加え、軽く振って均一に混ぜた後、-20℃の冷蔵庫に移し、15分間静置する。［6］サンプルを静置した後、遠心分離機に入れ、12,000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、室温で乾燥する。［7］100μLのddH2Oを加えて溶解し、軽く振り、後で使用するために4℃の冷蔵庫に保管する。
【0031】
（2）CY84イネ小穂を材料としてRNAを抽出し、次にcDNA配列に逆転写して、遺伝子OsCPRO1およびOsCPRO2のCDS配列の増幅のための鋳型を提供した。
【0032】
RNAの抽出方法：［1］液体窒素であらかじめ冷却しておいた滅菌乳鉢に3～4cmの稲穂を入れ、時計回りにすりつぶし、白緑色の粉末になった後、Trizol1mLを加えたRNaseフリーのEPチューブに素早く移し、1分間ボルテックスする。1分間完全に混合する。［2］室温で5分間インキュベートし、EPチューブに200μLのクロロホルムを加え、15秒間ボルテックスし、氷上で2分間放置する。［3］4℃での高速冷却遠心分離、12,000rpmで15分間の遠心分離。［4］上清500μLを吸引し、クロロホルム100μLを加え、15秒間ボルテックスし、氷上に2分間放置する。［5］4℃での高速冷却遠心分離、12,000rpmで15分間の遠心分離をする。［6］400μLの上清を1.5mLRNaseフリーEPチューブにピペットで移し、500μLイソプロパノールを加え、反転して混合する。［7］氷上に10分間放置し、4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨てる。［8］1mLの75%エタノールを加え、ボルテックスして沈殿を洗浄し、4℃、12,000rpmで10分間遠心分離する。［9］上清を捨て、前のステップを繰り返す。［10］RNA沈殿物をチューブの底に残し、残った液体を吸い取り、軽く乾燥させ、100μLのRNaseフリー水を加え、軽くはじいて溶解し、濃度と純度を確認し、後で使用するために-80℃で保存する。
【0033】
RNA逆転写をcDNAに変換する方法：HiFiScriptcDNASynthesisKit(CW2569M)を使用してcDNAを作成する。［1］キットに付属の試薬とRNAテンプレートを氷上に置き、溶解して保管する。［2］RNA逆転写システム(表1)に従って試薬を混合し、短時間遠心分離してチューブの底のチューブ壁に液体を濃縮する。［3］次に、反応プログラムを実行し、42℃で15分間反応させ、次に85℃で5分間反応させる。［4］反応後、後で使用するためにcDNAを氷上で冷却した。
【0034】
（3）増幅プライマーを設計する。AtDD45プロモーター配列の増幅プライマー、およびOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のCDS配列の増幅プライマーを表2に示す。小文字はアダプタープライマーを示す。
【0035】
（4）増幅プライマーを使用して、プロモーター配列および遺伝子CDS配列を増幅した。増幅体系は表3に示されており、増幅プロセスは表4に示されている。
【0036】
（5）1%アガロースゲル電気泳動で検査した後、ゲルを切断して必要なフラグメントを回収し、後で使用するために-20℃で保存する。
【0037】
2.2酵素切断骨格ベクター
KpnI-HFおよびBamHI-HFエンドヌクレアーゼを使用して、pCAMBIA1300-ACTINバックボーンベクターを消化し、元のACTINプロモーター配列を除去し、粘着末端の欠けを形成し、元のターミネーター配列を含む他のすべての配列を保持する。酵素切断体系は表5に示されている。
KpnI-HFおよびBamHI-HFエンドヌクレアーゼを使用して、pCAMBIA1300-ACTINバックボーンベクターを消化し、元のACTINプロモーター配列を除去し、粘着末端の欠けを形成し、元のターミネーター配列を含む他のすべての配列を保持する。酵素切断体系は表5に示されている。
【0038】
2.3回収した増幅フラグメントを骨格ベクターに連結する
連結体系は表6に示されており、体系を混合下後、50℃で15分間接続され、接続後、生成物は氷上に置かれて使用される。
連結体系は表6に示されており、体系を混合下後、50℃で15分間接続され、接続後、生成物は氷上に置かれて使用される。
【0039】
2.4連結生成物を変換する
連結生成物を変換する方法:［1］-80℃の冷蔵庫に保管していたコンピテントセル（当研究室提供）を取り出し、氷上に置いて解凍する。［2］コンピテントセル(50μL～100μL)が溶融状態に達したら、直ちに連結生成物を添加する。［3］氷上に30分間放置する。［4］42℃の水浴で90秒間のヒートショック。［5］500μLの液体LB培地を追加する。［6］シェーカーで37℃で1時間培養する。［7］4000rpm、3分間、低速遠心分離し、Kan耐性のあるLB固体培地に広げる。［8］37℃で一晩培養し、プラークが増殖した後にコロニーPCR検査を実行する。［9］Kan耐性液体培地でシングルコロニーを選択し、200rpm、37℃の恒温シェーカーで14時間培養する。［10］プラスミドを抽出し、Sangerシーケンシングを行う。
連結生成物を変換する方法:［1］-80℃の冷蔵庫に保管していたコンピテントセル（当研究室提供）を取り出し、氷上に置いて解凍する。［2］コンピテントセル(50μL～100μL)が溶融状態に達したら、直ちに連結生成物を添加する。［3］氷上に30分間放置する。［4］42℃の水浴で90秒間のヒートショック。［5］500μLの液体LB培地を追加する。［6］シェーカーで37℃で1時間培養する。［7］4000rpm、3分間、低速遠心分離し、Kan耐性のあるLB固体培地に広げる。［8］37℃で一晩培養し、プラークが増殖した後にコロニーPCR検査を実行する。［9］Kan耐性液体培地でシングルコロニーを選択し、200rpm、37℃の恒温シェーカーで14時間培養する。［10］プラスミドを抽出し、Sangerシーケンシングを行う。
【0040】
3.遺伝子組み換え株を取得する
異所性エクスプレーションベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株に導入し、アグロバクテリウム法を用いて異所性エクスプレーションベクターをハイブリッドライスCY84のカルスに導入した。
異所性エクスプレーションベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株に導入し、アグロバクテリウム法を用いて異所性エクスプレーションベクターをハイブリッドライスCY84のカルスに導入した。
【0041】
具体的な変換方法:［1］ハイブリッドライスCY84種子の胚に滅菌処理を行う。［2］誘導カルスの培地に接種する。［3］1週間の培養後、活発に増殖し、淡黄色で比較的緩い胚形カルスを転換用のレシピエントとして選択した。［4］イネカルスに、それぞれpC1300-AtDD45P-OsCPRO1プラスミドとpC1300-AtDD45P-OsCPRO2プラスミドを含むEHA105菌株を感染させた。［5］暗所で25℃で3日間の暗黒培養をする。［6］耐性カルスおよび遺伝子組み換え株をスクリーニングするには、50mg/Lハイグロマイシンを含む選択培地を使用する。［7］正常に生育する遺伝子組み換え株を選択する。
【0042】
4.遺伝子組み換え株の栽培
遺伝子組み換え材料は夏季に遺伝子組み換え実験場で、冬季に温室で栽培される。温室の昼間の平均温度は34℃で、夜間の平均温度は25℃で、光が12時間、暗が12時間のサイクルで循環し、湿度は75%である。
遺伝子組み換え材料は夏季に遺伝子組み換え実験場で、冬季に温室で栽培される。温室の昼間の平均温度は34℃で、夜間の平均温度は25℃で、光が12時間、暗が12時間のサイクルで循環し、湿度は75%である。
【0043】
5.遺伝子組み換え株の検査
5.1検査プライマーをデザインする。
5.1検査プライマーをデザインする。
【0044】
AtDD45プロモーター配列から設計されたプライマーと遺伝子CDS配列から設計されたプライマー（イントロン領域にわたる）を、遺伝子組み換え陽性植物の検査プライマーとして同時に使用した。具体なプライマー情報は、表7に示されている。
5.2検査体系は表8に示されており、検査手順は表9に示されている。
【0045】
6.畑の表現型を調べる
畑の表現型調査には、プラントタイプ、スパイクタイプ、成熟率が含まれる。
6.1、プラントタイプ(図1)と穂のタイプ(図2)を調査するために、変異株と野生型CY84を選択して比較観察した(n=3)。
6.2、成熟率の統計：各株について3つの稲穂を選び、統計を行う。計算式：成熟率=(実粒数/総粒数)×100%。
畑の表現型調査には、プラントタイプ、スパイクタイプ、成熟率が含まれる。
6.1、プラントタイプ(図1)と穂のタイプ(図2)を調査するために、変異株と野生型CY84を選択して比較観察した(n=3)。
6.2、成熟率の統計：各株について3つの稲穂を選び、統計を行う。計算式：成熟率=(実粒数/総粒数)×100%。
【0046】
7.Indelマークを使用して半数体を選択する
ハイブリッドライスCY84とその2つの親本(16AおよびC84)の全ゲノム配列に基づいて、イネの各染色体上に1対のIndelマークが設計され、合計12対のプライマーマークが設計された。プライマー情報は表10に示されており、遺伝子分類は図3に示すように、T1世代の遺伝子組み換え材料の半数体誘導率を検査するために使用される。12対のIndelマークすべてが、CY84ヘテロ接合遺伝子型と同じダブルバンド遺伝子型ではなく、親16AまたはC84と同じシングルバンド遺伝子型を示す場合、それが半数体または二重半数体である確率は99.98%に達する。具体的な計算方法は、1-(1/2)12=99.98%である。T1世代の半数体および二重半数体物質のIndelマークの検査状況を図4に示する。
ハイブリッドライスCY84とその2つの親本(16AおよびC84)の全ゲノム配列に基づいて、イネの各染色体上に1対のIndelマークが設計され、合計12対のプライマーマークが設計された。プライマー情報は表10に示されており、遺伝子分類は図3に示すように、T1世代の遺伝子組み換え材料の半数体誘導率を検査するために使用される。12対のIndelマークすべてが、CY84ヘテロ接合遺伝子型と同じダブルバンド遺伝子型ではなく、親16AまたはC84と同じシングルバンド遺伝子型を示す場合、それが半数体または二重半数体である確率は99.98%に達する。具体的な計算方法は、1-(1/2)12=99.98%である。T1世代の半数体および二重半数体物質のIndelマークの検査状況を図4に示する。
【0047】
【0048】
8.フローサイトメトリー倍性検査
Indelマークで選別された半数体または二重半数体の植物体に対して、フローサイトメトリー技術を用いて細胞倍性をさらに確認しました（図5）。半数体材料と野生型CY84の性状の比較は図6に示されており、二重半数体材料と野生型CY84の性状の比較は図7に示されている。
Indelマークで選別された半数体または二重半数体の植物体に対して、フローサイトメトリー技術を用いて細胞倍性をさらに確認しました（図5）。半数体材料と野生型CY84の性状の比較は図6に示されており、二重半数体材料と野生型CY84の性状の比較は図7に示されている。
【0049】
フローサイトメトリー倍性検査方法:［1］新鮮な若葉を3cmほどに切り、滅菌したガラス製シャーレに入れ、シャーレを氷を入れたトレイに置く。［2］1mLの植物ライシスバッファー(LB01)をシャーレに加え、葉をブレードで切り刻み、葉の組織細胞をライシスバッファーに浸する。［3］シャーレ内のライセートを吸引し、50μmナイロンメッシュで濾過して1.5mL滅菌遠心チューブに移し、氷上に保管する。［4］4℃で、1200rpmで5分間遠心分離する。［5］上清を捨て、450μLの予冷したLB01、25μLのPI(1mg/mL)と25μLのRNaseA(1mg/mL)を加える。［6］光を遮断した氷中で10分間染色する。［7］BDAccuriC6のオンマシンテスト。
【0050】
9.全ゲノムシーケンシング解析
ハイブリッドライスCY84、CY84の2つの親本16AとC84、および半数体植物の葉からDNAを抽出し、全ゲノムシーケンシングを行う。全ゲノムシーケンシングの結果、16AとC84の間には多くの異なるホモ接合体遺伝子型が存在することが示された。CY84のこれらの位置の遺伝子型は、16A遺伝子型とC84遺伝子型の両方を含むヘテロ接合遺伝子型である。半数体の植物の位点は16AまたはC84のホモ接合体遺伝子型である。
ハイブリッドライスCY84、CY84の2つの親本16AとC84、および半数体植物の葉からDNAを抽出し、全ゲノムシーケンシングを行う。全ゲノムシーケンシングの結果、16AとC84の間には多くの異なるホモ接合体遺伝子型が存在することが示された。CY84のこれらの位置の遺伝子型は、16A遺伝子型とC84遺伝子型の両方を含むヘテロ接合遺伝子型である。半数体の植物の位点は16AまたはC84のホモ接合体遺伝子型である。
【0051】
実験例2
1.実験材料:実験例1を参照
2.異所性エクスプレーションベクターを構築する
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターは、それぞれOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了するために選択された。
1.実験材料:実験例1を参照
2.異所性エクスプレーションベクターを構築する
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターは、それぞれOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了するために選択された。
【0052】
2.1異所性エクスプレーションのためのベクター構築に必要なフラグメントを取得する。
（1）シロイヌナズナの葉からゲノムDNAを抽出し、AtDD45プロモーター配列を増幅するためのテンプレートとして使用した。DNAの抽出方法については、実験例1を参照してください。
（2）イネの葉からゲノムDNAを抽出し、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を増幅するためのテンプレートとして使用する。
（3）増幅プライマーを設計し、AtDD45プロモーター配列とOsCPRO1およびOsCPRO2ゲノム配列を増幅するために使用する。
（4）1%アガロースゲル電気泳動で検査した後、ゲルを切断して必要なフラグメントを回収し、後で使用するために-20℃で保存する。
（1）シロイヌナズナの葉からゲノムDNAを抽出し、AtDD45プロモーター配列を増幅するためのテンプレートとして使用した。DNAの抽出方法については、実験例1を参照してください。
（2）イネの葉からゲノムDNAを抽出し、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を増幅するためのテンプレートとして使用する。
（3）増幅プライマーを設計し、AtDD45プロモーター配列とOsCPRO1およびOsCPRO2ゲノム配列を増幅するために使用する。
（4）1%アガロースゲル電気泳動で検査した後、ゲルを切断して必要なフラグメントを回収し、後で使用するために-20℃で保存する。
【0053】
2.2酵素切断骨格ベクター：実験例1を参照してください。
【0054】
2.3回収した増幅断片を骨格ベクターに連結する：実験例1を参照してください。
【0055】
2.4連結生成物を変換する：実験例1を参照してください。
【0056】
3.遺伝子組み換え株を入手する:実験例1を参照してください。
【0057】
4.遺伝子組み換え株を植える:実験例1を参照。
【0058】
5.遺伝子組み換え株の検査
遺伝子組み換え陽性植物の検査プライマーとしてAtDD45プロモーター配列上のプライマーを設計する。プライマー情報は実験例1の表7を参照してください。検査体系は実験例1の表8を参照してください。増幅プログラムは実験例1の表9を参照してください。
遺伝子組み換え陽性植物の検査プライマーとしてAtDD45プロモーター配列上のプライマーを設計する。プライマー情報は実験例1の表7を参照してください。検査体系は実験例1の表8を参照してください。増幅プログラムは実験例1の表9を参照してください。
【0059】
6.畑の表現型を調査する:実験例1を参照してください。
【0060】
7.Indelマークを使用して半数体をスクリーニングする:実験例1を参照してください。
【0061】
8.フローサイトメトリー倍性検査:実験例1を参照してください。
【0062】
9.全ゲノムシーケンシング解析:実験例1を参照してください。
【0063】
実験例3
1.実験材料:コロンビア(Col-0)生態型野生シロイヌナズナを実験材料として使用した。
1.実験材料:コロンビア(Col-0)生態型野生シロイヌナズナを実験材料として使用した。
【0064】
2.異所性エクスプレーションベクターを構築する
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションプロモーターは、それぞれAtCPRO1およびAtCPRO2遺伝子のCDS配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了するために選択された。
AtDD45卵細胞特異的エクスプレーションプロモーターは、それぞれAtCPRO1およびAtCPRO2遺伝子のCDS配列を駆動して異所性エクスプレーションプロセスを完了するために選択された。
【0065】
2.1異所性エクスプレーションのベクターの構築に必要なフラグメントを取得する
（1）シロイヌナズナの葉からゲノムDNAを抽出し、AtDD45プロモーター配列を増幅するためのテンプレートとして使用した。DNAの抽出方法については、実験例1を参照してください。
（2）材料としてコロンビア生態型のシロイヌナズナの若い花からRNAを抽出し、cDNA配列に逆転写して遺伝子AtCPRO1およびAtCPRO2のCDS配列の増幅用のテンプレートを提供する。RNAの抽出方法とRNAをcDNAに逆転写する方法については、実験例1を参照してください。
（3）増幅プライマーを設計し、AtDD45プロモーター配列とAtCPRO1およびAtCPRO2遺伝子のCDS配列を増幅するために使用した。増幅体系については、実験例1の表3を参照してください。増幅プログラムについては、実験例1の表4を参照してください。
（4）1%アガロースゲル電気泳動で検査した後、ゲルを切断して必要なフラグメントを回収し、後で使用するために-20℃で保存する。
（1）シロイヌナズナの葉からゲノムDNAを抽出し、AtDD45プロモーター配列を増幅するためのテンプレートとして使用した。DNAの抽出方法については、実験例1を参照してください。
（2）材料としてコロンビア生態型のシロイヌナズナの若い花からRNAを抽出し、cDNA配列に逆転写して遺伝子AtCPRO1およびAtCPRO2のCDS配列の増幅用のテンプレートを提供する。RNAの抽出方法とRNAをcDNAに逆転写する方法については、実験例1を参照してください。
（3）増幅プライマーを設計し、AtDD45プロモーター配列とAtCPRO1およびAtCPRO2遺伝子のCDS配列を増幅するために使用した。増幅体系については、実験例1の表3を参照してください。増幅プログラムについては、実験例1の表4を参照してください。
（4）1%アガロースゲル電気泳動で検査した後、ゲルを切断して必要なフラグメントを回収し、後で使用するために-20℃で保存する。
【0066】
2.2酵素切断骨格ベクター：実験例1を参照してください。
【0067】
2.3回収した増幅断片を骨格ベクターに連結する：実験例1を参照してください。
【0068】
2.4連結生成物を変換する：実験例1を参照してください。
【0069】
3.遺伝子組み換え株を取得する
異所性エクスプレーションベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)GV310菌株に導入し、アグロバクテリウム媒介フラワーディッピング法を用いて異所性エクスプレーションベクターをCol-0エコタイプ野生シロイヌナズナに導入する。
異所性エクスプレーションベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)GV310菌株に導入し、アグロバクテリウム媒介フラワーディッピング法を用いて異所性エクスプレーションベクターをCol-0エコタイプ野生シロイヌナズナに導入する。
【0070】
具体的な変換方法:［1］T0世代のシロイヌナズナの花序を、目標転化プラスミドを一定濃度で含むアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)GV310菌株の懸濁液に浸漬する。［2］特定の条件下で培養する。［3］成熟後にT0世代のシロイヌナズナの種子を収集する。［4］これらの種子は、生育スクリーニングのために特定の抗生物質を含む培地に置かれ、陽性の植物体が得られる。
【0071】
4.遺伝子組み換え株の栽培
光照培養箱で遺伝子組み換え材料が成長する。光照処理15時間、平均気温は24℃；暗い処理は9時間行われ、平均気温は22℃である。土壌の平均湿度は75％で、栄養土：ベントナイト=1：1である。3～4日に一度、栄養液を盆底から浸透させる。
光照培養箱で遺伝子組み換え材料が成長する。光照処理15時間、平均気温は24℃；暗い処理は9時間行われ、平均気温は22℃である。土壌の平均湿度は75％で、栄養土：ベントナイト=1：1である。3～4日に一度、栄養液を盆底から浸透させる。
【0072】
5.遺伝子組み換え株の検査
CDS配列上でプライマーを設計し、また、プライマーはイントロン領域にまたがっており、このプライマーを遺伝子組換え陽性株の検出プライマーとして利用する。検査体系については、実験例1の表8を参照してください。増幅プロセスについては、実験例1の表9を参照してください。
CDS配列上でプライマーを設計し、また、プライマーはイントロン領域にまたがっており、このプライマーを遺伝子組換え陽性株の検出プライマーとして利用する。検査体系については、実験例1の表8を参照してください。増幅プロセスについては、実験例1の表9を参照してください。
【0073】
6.表現型の性状を調査する
表現型の性状調査には、株形と成熟率が含まれる。
表現型の性状調査には、株形と成熟率が含まれる。
【0074】
6.1T2世代植物の植物プラントタイプを調査するために(図8)、比較観察のために変異株と野生型シロイヌナズナを選択した(n=3)。
【0075】
6.2成熟率の統計：成熟したがまだ割れていない野生型と変異体のシロイヌナズナの果実を収集し、脱色液（エタノール：酢酸=3：1）に透明に脱色する。種子が果実の中で明確に見えるようになったら、取り出して顕微鏡の下で種子の成熟率を統計する。
【0076】
7.フローサイトメトリー倍性検査
フローサイトメトリー技術を利用して、植物の細胞倍数を確認する。フローサイトメトリー倍数検査の方法については、実験例1を参照してください。
フローサイトメトリー技術を利用して、植物の細胞倍数を確認する。フローサイトメトリー倍数検査の方法については、実験例1を参照してください。
【0077】
実験例4
1.実験材料:実験例1を参照してください。
1.実験材料:実験例1を参照してください。
【0078】
2.異所性エクスプレーションベクターの構築:実験例1を参照ください。
【0079】
3.多遺伝子ノックアウトベクターの構築
CRISPR-Cas9多重遺伝子ノックアウトシステムを使用して、3つの内在性イネ遺伝子OsOSD1、OsPAIR1およびOsREC8を同時にノックアウトして、MiMe材料を構築した。主な手順は次のとおりである(操作の詳細はCN201510485573.2にも記載されている)。):
3.1ターゲット配列とプライマーを設計する
（1）ターゲット配列の設計:遺伝子のターゲット位置で、GC含量が35%～75%であるNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(NGG)特異的配列を見つける。以下の4つの部位が、OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8をそれぞれノックアウトするためのCRISPR-Cas9遺伝子編集システムの部位として選択された(PAM配列は下線で示されている)。
OsOSD1遺伝子のノックアウト部位：CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG
OsPAIR1遺伝子のノックアウト部位：AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG
OsREC8遺伝子のノックアウト部位：CGGAGAGCCTTAGTGCCATGGG
CRISPR-Cas9多重遺伝子ノックアウトシステムを使用して、3つの内在性イネ遺伝子OsOSD1、OsPAIR1およびOsREC8を同時にノックアウトして、MiMe材料を構築した。主な手順は次のとおりである(操作の詳細はCN201510485573.2にも記載されている)。):
3.1ターゲット配列とプライマーを設計する
（1）ターゲット配列の設計:遺伝子のターゲット位置で、GC含量が35%～75%であるNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(NGG)特異的配列を見つける。以下の4つの部位が、OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8をそれぞれノックアウトするためのCRISPR-Cas9遺伝子編集システムの部位として選択された(PAM配列は下線で示されている)。
OsOSD1遺伝子のノックアウト部位：CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG
OsPAIR1遺伝子のノックアウト部位：AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG
OsREC8遺伝子のノックアウト部位：CGGAGAGCCTTAGTGCCATGGG
【0080】
（2）プライマー設計:順方向ターゲット配列の前に4つのGGCAヌクレオチドを追加し、逆方向ターゲット配列の前に4つのAAACヌクレオチドを追加し、プライマー合成用にそれぞれg++およびg--と名前を付ける。
【0081】
3.2中間ベクターの構築
（1）AarI酵素を使用して中間ベクターSK-gRNAを切断し、粘着末端を形成する。切断体系を表11に示する。
（1）AarI酵素を使用して中間ベクターSK-gRNAを切断し、粘着末端を形成する。切断体系を表11に示する。
【0082】
（2）100 μMg++およびg--プライマーのそれぞれ20μLを等しい割合で混合し、100℃で5分間インキュベートし、変性およびアニーリング後に粘着末端を形成する。
【0083】
（3）T4 DNAリガーゼを使用して連結し、室温で1時間連結される。連結体系は表12に示されている。
【0084】
（4）連結生成物の変換:実験例1を参照してください。
【0085】
3.3最終的なベクターを構築する
BamHIとBglIIがisocaudarnerであるという特性を利用して、T4DNAリガーゼを使用して3つのSK-gRNA中間ベクターの重合を完了した。最終的なベクターをKpnIとBamHIで消化し、提供されたフラグメントをKpnIとBglIIで酵素切断をし、SK-gRNA相互間の連結は、2組のisocaudarner NheI/XbaIとSalI/XhoIを用いて行われる。複数の中間ベクターを連結する体系は、表13に示されている。
BamHIとBglIIがisocaudarnerであるという特性を利用して、T4DNAリガーゼを使用して3つのSK-gRNA中間ベクターの重合を完了した。最終的なベクターをKpnIとBamHIで消化し、提供されたフラグメントをKpnIとBglIIで酵素切断をし、SK-gRNA相互間の連結は、2組のisocaudarner NheI/XbaIとSalI/XhoIを用いて行われる。複数の中間ベクターを連結する体系は、表13に示されている。
【0086】
4.二元融合エクスプレーションベクターを構築する
異所性エクスプレーションベクターとマルチ遺伝子ノックアウトベクターを組み合わせて、二元融合エクスプレーションベクターを構築する。その中で、異所性エクスプレーションベクターは必要なフラグメントを提供し、マルチジェンノックアウトベクターは骨格ベクターとして酵素切断を行う。
異所性エクスプレーションベクターとマルチ遺伝子ノックアウトベクターを組み合わせて、二元融合エクスプレーションベクターを構築する。その中で、異所性エクスプレーションベクターは必要なフラグメントを提供し、マルチジェンノックアウトベクターは骨格ベクターとして酵素切断を行う。
【0087】
4.1ダブルエレメント融合エクスプレーションベクター構築に必要なフラグメントを取得する
異所性エクスプレーションベクターからAtDD45卵細胞特異的エクスプレーションプロモーターを増幅してOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子CDS配列を駆動し、AtDD45プロモーターフラグメント、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子CDS配列およびターミネーター配列を含む異所性エクスプレーションプロセスの全体的なフラグメントを完成させる。増幅プライマーは表14に示されており、小文字はアダプタープライマーを表する。
異所性エクスプレーションベクターからAtDD45卵細胞特異的エクスプレーションプロモーターを増幅してOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子CDS配列を駆動し、AtDD45プロモーターフラグメント、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子CDS配列およびターミネーター配列を含む異所性エクスプレーションプロセスの全体的なフラグメントを完成させる。増幅プライマーは表14に示されており、小文字はアダプタープライマーを表する。
【0088】
4.2酵素切断マルチ遺伝子ノックアウトベクター
PmeIエンドヌクレアーゼを使用する私エンドヌクレアーゼを使用して、pC1300-Cas9-gRNAOSD1-gRNAPAIR1-gRNAREC8多重遺伝子ノックアウトベクターを消化する。酵素消化システムを表15に示する。
PmeIエンドヌクレアーゼを使用する私エンドヌクレアーゼを使用して、pC1300-Cas9-gRNAOSD1-gRNAPAIR1-gRNAREC8多重遺伝子ノックアウトベクターを消化する。酵素消化システムを表15に示する。
【0089】
4.3マルチ遺伝子ノックアウトベクターに増幅フラグメントを結合する
連結体系は表16に示されており、均一な体系を作った後、50℃の条件で15分間接続する。連結後、生成物を氷上に置いておく。
連結体系は表16に示されており、均一な体系を作った後、50℃の条件で15分間接続する。連結後、生成物を氷上に置いておく。
【0090】
4.4連結生成物を変換する：実験例1を参照してください。
【0091】
5.遺伝子組み換え株を入手する:実験例1を参照してください。
【0092】
6.遺伝子組み換え株の植え付け:実験例1を参照してください。
【0093】
7.遺伝子組み換え株の検査
7.1遺伝子組み換え株の陽性検査：実験例1を参照してください。
7.1遺伝子組み換え株の陽性検査：実験例1を参照してください。
【0094】
7.2ターゲットサイトのノックアウト状況の検査
（1）OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8遺伝子のノックアウト状態を決定するためのターゲットサイト検査プライマーを設計する。プライマー情報は表17に示されている。小文字はプライマーを示する。
（2）配列解析：PCR増幅生成物を中国水稲研究所に送り、Hi-TOM(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)プラットフォームを利用してデータ解析を行い、3つの遺伝子の変異情報を得た。
（1）OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8遺伝子のノックアウト状態を決定するためのターゲットサイト検査プライマーを設計する。プライマー情報は表17に示されている。小文字はプライマーを示する。
【0095】
8.畑の表現型を調査する:実験例1を参照してください。
【0096】
9.フローサイトメトリー倍性検査
9.1材料の準備
二元融合エクスプレーションが成功した材料が選択された。つまり、AtDD45プロモーターがOsCPRO1/OsCPRO2遺伝子CDS配列のエクスプレーションをよく駆動し、OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8の3つの遺伝子がよくノックアウトされた(MiMe)。この材料の種子を発芽させて栽培する（子一世代）。
9.1材料の準備
二元融合エクスプレーションが成功した材料が選択された。つまり、AtDD45プロモーターがOsCPRO1/OsCPRO2遺伝子CDS配列のエクスプレーションをよく駆動し、OsOSD1、OsPAIR1、およびOsREC8の3つの遺伝子がよくノックアウトされた(MiMe)。この材料の種子を発芽させて栽培する（子一世代）。
【0097】
9.2フローサイトメトリー検査
フローサイトメトリー分析を利用して、細胞の倍性を選別し、母体植物と同じ倍性を持つ子一世代植物を選択することで、アポミクシス材料を得ることができる。
フローサイトメトリー分析を利用して、細胞の倍性を選別し、母体植物と同じ倍性を持つ子一世代植物を選択することで、アポミクシス材料を得ることができる。
【0098】
10.全ゲノムシーケンシング解析:実験例1を参照。
【0099】
実験例5
1.実験材料:実験例1を参照してください。
1.実験材料:実験例1を参照してください。
【0100】
2.異所性エクスプレーションベクターの構築:実験例2を参照。
【0101】
3.マルチ遺伝子ノックアウトベクターを構築する。実験例4を参照してください。
【0102】
4.二元融合エクスプレーションベクターを構築する
異所性エクスプレーションベクターとマルチ遺伝子ノックアウトベクターを組み合わせて、二元融合エクスプレーションベクターを構築する。その中で、異所性エクスプレーションベクターは必要なフラグメントを提供し、マルチジェンノックアウトベクターは骨格ベクターとして酵素切断を行う。
異所性エクスプレーションベクターとマルチ遺伝子ノックアウトベクターを組み合わせて、二元融合エクスプレーションベクターを構築する。その中で、異所性エクスプレーションベクターは必要なフラグメントを提供し、マルチジェンノックアウトベクターは骨格ベクターとして酵素切断を行う。
【0103】
4.1ダブルエレメント融合エクスプレーションベクター構築に必要なフラグメントを取得する
異所性エクスプレーションベクターからAtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターを増幅して、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を駆動し、AtDD45プロモーターフラグメント、OsCPRO1およびOsCPRO2の遺伝子のゲノム配列とおよびターミネーター配列を含む異所性エクスプレーションプロセスの全体的なフラグメントを完成させる。増幅プライマーは実験例3の表14に示されている。
異所性エクスプレーションベクターからAtDD45卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターを増幅して、OsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子のゲノム配列を駆動し、AtDD45プロモーターフラグメント、OsCPRO1およびOsCPRO2の遺伝子のゲノム配列とおよびターミネーター配列を含む異所性エクスプレーションプロセスの全体的なフラグメントを完成させる。増幅プライマーは実験例3の表14に示されている。
【0104】
4.2酵素切断マルチ遺伝子ノックアウトベクター：実験例4を参照してください。
【0105】
4.3マルチ遺伝子ノックアウトベクターに増幅フラグメントを組み込む：実験例4を参照してください。
【0106】
4.4連結生成物を変換する：実験例1を参照してください。
【0107】
5.遺伝子組み換え株を入手する:実験例1を参照してください。
【0108】
6.遺伝子組み換え株の植え付け:実験例1を参照してください。
【0109】
7.遺伝子組み換え株の検査
7.1遺伝子組み換え株の陽性検査：実験例2を参照してください。
7.1遺伝子組み換え株の陽性検査：実験例2を参照してください。
【0110】
7.2ターゲットサイトのノックアウト状況の検査：実験例4を参照してください。
【0111】
8.畑の表現型を調査する:実験例1を参照してください。
【0112】
9.フローサイトメトリー倍性検査:実験例4を参照してください。
【0113】
10.全ゲノムシーケンシング解析:実験例1を参照してください。
【0114】
実施例3
1. T0世代OsCPROシリーズ半数体誘導材料の表現型形質
実施例2における実験例1および２に関して、遺伝子組み換え陽性植物の畑表現型調査により、野生型CY84と比較して、Ｔ０世代遺伝子組み換え体の栄養生長に有意差はなく、成熟率が低下したことが示された。80～100%、50～80%、30～50%、10～30%、0～10%の5つの変化範囲を例として、プラントタイプのまとめを図1に、スパイクタイプのまとめを図2に示す。
1. T0世代OsCPROシリーズ半数体誘導材料の表現型形質
実施例2における実験例1および２に関して、遺伝子組み換え陽性植物の畑表現型調査により、野生型CY84と比較して、Ｔ０世代遺伝子組み換え体の栄養生長に有意差はなく、成熟率が低下したことが示された。80～100%、50～80%、30～50%、10～30%、0～10%の5つの変化範囲を例として、プラントタイプのまとめを図1に、スパイクタイプのまとめを図2に示す。
【0115】
2. 12Indelマークの遺伝子分類
図3に示すように、実施例2の実験例1と2において、半数体と二重半数体を選択するための12対のIndelマークが明らかな多型性を持って、遺伝子組み換え材料の遺伝子型鑑定に使用できる。
図3に示すように、実施例2の実験例1と2において、半数体と二重半数体を選択するための12対のIndelマークが明らかな多型性を持って、遺伝子組み換え材料の遺伝子型鑑定に使用できる。
【0116】
3. 半数体と二重半数体材料の遺伝子型と倍性検査
実施例2の実験例１および実験例２でスクリーニングした半数体材料または二重半数体材料について、実験例1の卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターAtDD45によるOsCPRO2のCDS配列の異所性エクスプレーションの検査結果を例に挙げる:遺伝子組み換え材料のうち、4株の12対のIndelマーク部位がスクリーニングされ、そのすべてが単一バンドの遺伝子型を示し(図4)、半数体材料または二重半数体材料であることが示された。さらに、フローサイトメトリーを利用して、CPRO2-22-1およびCPRO2-39-1の2つの株が半数型(n)ゲノムであり、半数体材料であることが確認された。その他の2つの株(CPRO2-32-1およびCPRO2-32-2)は、2倍型(2n)のゲノムを持ち、二重半数体材料である(図5)。
実施例2の実験例１および実験例２でスクリーニングした半数体材料または二重半数体材料について、実験例1の卵細胞特異的エクスプレーションのプロモーターAtDD45によるOsCPRO2のCDS配列の異所性エクスプレーションの検査結果を例に挙げる:遺伝子組み換え材料のうち、4株の12対のIndelマーク部位がスクリーニングされ、そのすべてが単一バンドの遺伝子型を示し(図4)、半数体材料または二重半数体材料であることが示された。さらに、フローサイトメトリーを利用して、CPRO2-22-1およびCPRO2-39-1の2つの株が半数型(n)ゲノムであり、半数体材料であることが確認された。その他の2つの株(CPRO2-32-1およびCPRO2-32-2)は、2倍型(2n)のゲノムを持ち、二重半数体材料である(図5)。
【0117】
4. 半数体と二重半数体材料の性状調査
実施例2の実験例1および実験例２でスクリーニングした半数体材料および二重半数体材料について、実験例1におけるAtDD45卵胞特異的エクスプレーションのプロモーターがOsCPRO2を駆動して異所性エクスプレーションを完成させた検査結果を例にすると、半数体材料は野生型CY84と比較して栄養成長と生殖成長の両方に顕著な影響を受ける：プラント高さが低下し、穂の長さが短くなり、稈が小さくなり、肥沃度が完全に失われた(図6)。二重半数体材料と野生型CY84と比較して、栄養成長と生殖成長の両方において顕著な差はない（図7）。実施例2の実験例3で選択された半数体材料は、Col-0生態型の野生のシロイヌナズナと比較して、栄養成長と生殖成長の両方において顕著な影響を受けている：プラントタイプが小さくなり、葉が細くなる（図8）。
実施例2の実験例1および実験例２でスクリーニングした半数体材料および二重半数体材料について、実験例1におけるAtDD45卵胞特異的エクスプレーションのプロモーターがOsCPRO2を駆動して異所性エクスプレーションを完成させた検査結果を例にすると、半数体材料は野生型CY84と比較して栄養成長と生殖成長の両方に顕著な影響を受ける：プラント高さが低下し、穂の長さが短くなり、稈が小さくなり、肥沃度が完全に失われた(図6)。二重半数体材料と野生型CY84と比較して、栄養成長と生殖成長の両方において顕著な差はない（図7）。実施例2の実験例3で選択された半数体材料は、Col-0生態型の野生のシロイヌナズナと比較して、栄養成長と生殖成長の両方において顕著な影響を受けている：プラントタイプが小さくなり、葉が細くなる（図8）。
【0118】
5. CPROシリーズ半数体誘導材料とアポミクシス材料の検査状況
実施例2の実験例1、2、3のＴ１世代遺伝子組み換え体を試験したところ、半数体誘導能を有する材料の成熟率は18.98±2.14%～50.88±0.74%の範囲であることが判明した。誘導率の範囲は0.44%～7.14%であり、具体的な統計情報を表18に示する。実施例２の実験例４および実験例５のＴ１世代遺伝子組み換え体を試験したところ、MiMeシステムと組み合わせた卵細胞におけるOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子の異所性エクスプレーションによって産生されるアポミクシス材料は、クローン種子の割合は0.95%～7.92%であることが判明した。具体的な統計情報を表19に示する。
実施例2の実験例1、2、3のＴ１世代遺伝子組み換え体を試験したところ、半数体誘導能を有する材料の成熟率は18.98±2.14%～50.88±0.74%の範囲であることが判明した。誘導率の範囲は0.44%～7.14%であり、具体的な統計情報を表18に示する。実施例２の実験例４および実験例５のＴ１世代遺伝子組み換え体を試験したところ、MiMeシステムと組み合わせた卵細胞におけるOsCPRO1およびOsCPRO2遺伝子の異所性エクスプレーションによって産生されるアポミクシス材料は、クローン種子の割合は0.95%～7.92%であることが判明した。具体的な統計情報を表19に示する。
【0119】
【0120】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】