2024-545610 疾患分類のための長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた分子分析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-10

(54)【発明の名称】疾患分類のための長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた分子分析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20241203BHJP

   C12Q 1/6809 20180101ALI20241203BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241203BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20241203BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALI20241203BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241203BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20241203BHJP

   G16B 40/10 20190101ALN20241203BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6809 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6886 Z

C12Q1/6883 Z

C12M1/34 Z

C12M1/34 B

C12M1/00 A

G16B40/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531285

(86)(22)【出願日】2022-11-24

(85)【翻訳文提出日】2024-05-31

(86)【国際出願番号】 CN2022133878

(87)【国際公開番号】W WO2023093782

(87)【国際公開日】2023-06-01

(31)【優先権主張番号】63/283,190

(32)【優先日】2021-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/285,683

(32)【優先日】2021-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＳＷＩＦＴ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524195802

【氏名又は名称】センター フォー ノヴォスティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロー， ユク－ミン デニス

(72)【発明者】

【氏名】チウ， ロッサ ワイ クゥン

(72)【発明者】

【氏名】チャン， クワン チー

(72)【発明者】

【氏名】ジアン， ペイヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ロク イー

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB11

4B029BB20

4B029FA03

4B029FA15

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR56

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書に記載の方法及びシステムは、無細胞ＤＮＡ分子の様々な特徴を使用して生体サンプル又は対象の特性を特定することを含む。かかる特徴は、サイズ（例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子を特徴とする場合）、メチル化、及び末端モチーフを含み得る。前記方法は、疾患分類の特定及び／又は起源組織の予測を含む。いくつかの実例において、前記方法は、長い無細胞ＤＮＡ分子の量の特定を含み、前記疾患分類は、前記特定された量を基礎としてもよい。前記方法は、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンを同定し、そして前記メチル化パターンを参照パターンと比較して前記組織起源を予測することも含み得る。いくつかの実例において、前記メチル化パターン分析は、訓練された機械学習モデルを使用することを含む。前記特徴は、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度も含み得、該特徴で前記相対頻度を参照頻度と比較して疾患分類を特定することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取るステップであって、前記配列リードの各々が前記配列リード上の１組の部位でのメチル化状態のメチル化パターンを含むステップと、
前記配列リードの各々について、
前記メチル化パターンを第１参照メチル化パターンと比較し、前記第１参照メチル化パターンが複数の組織型の第１組織型に対応し、そして
前記メチル化パターンと前記第１参照メチル化パターンの比較に基づき、前記配列リードの組織分類を前記複数の組織型の１つに由来すると特定するステップと、
前記配列リードの前記組織分類に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記疾患の分類を特定するステップは、
前記第１組織型に由来すると分類された配列リードの第１量を特定するステップと、
前記第１量に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１量に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップは、前記第１量をカットオフ値と比較するステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記カットオフ値は前記疾患の分類が既知の参照サンプルに基づいて決定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記疾患の分類を特定するステップは、機械学習モデルを前記第１量に適用して前記疾患の分類を示す出力を生成するステップを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記機械学習モデルは前記疾患の分類が既知の訓練サンプルを使用して訓練される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記配列リードの各々について、
前記メチル化パターンを１つ又は複数の他の組織型に対応する１つ又は複数の他の参照メチル化パターンと比較するステップと、
１つ又は複数の他の組織型に由来すると分類された配列リードの１つ又は複数の他の量を特定するステップと、
更に前記１つ又は複数の他の量に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を更に含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１組織型は疾患組織型である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１組織型は前記疾患に関連する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記疾患は癌である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記疾患の分類を特定するステップは、前記癌の血管浸潤の有無を判定するステップを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記配列リードの位置を特定するステップを更に含み、前記第１参照メチル化パターンが前記位置に対応する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記メチル化パターンは前記１組の部位の部位対間の塩基の数を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記組織分類は前記配列リードが前記複数の組織型の１つに由来する確率を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記疾患の分類は前記疾患の重篤度を同定する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記疾患の前記重篤度は前記疾患の複数の病期から選択される病期を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１参照メチル化パターンは第１組織型の参照組織の複数の部位を含み、前記複数の部位の各々が前記部位でのメチル化指数を同定する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記メチル化パターンを前記第１参照メチル化パターンと比較するステップは、
前記メチル化パターンの前記１組の部位の各部位について、
前記部位のメチル化状態と前記第１参照メチル化パターンの対応する部位の前記メチル化指数との間の類似度メトリックを決定するステップと、
前記決定された類似度メトリックに基づいて前記配列リードの集計値を決定するステップと、を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記類似度メトリックは、前記部位の前記メチル化状態を表す２進値と前記対応する部位の前記メチル化指数との差に基づいて決定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記集計値は、前記決定された類似度メトリックの合計、代表値、又は中央値である、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記複数の組織型の１つは、前記第１組織型を含み、前記配列リードの前記組織分類を前記複数の組織型の１つに由来すると特定するステップは、
前記第１参照メチル化パターンについて決定された前記集計値が第２参照メチル化パターンについて決定された別の集計値より大きいと特定するステップであって、前記第２参照メチル化パターンが前記複数の組織型の他の組織型に対応するステップと、
前記配列リードの前記組織分類を前記第１組織型に由来すると特定するステップと、を含む、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記複数の組織型の１つは、前記複数の組織型の他の組織型の１つを含み、前記配列リードの前記組織分類を前記複数の組織型の１つに由来すると特定するステップは、
前記第１参照メチル化パターンについて決定された前記集計値が第２参照メチル化パターンについて決定された別の集計値より小さいと特定するステップであって、前記第２参照メチル化パターンが前記他の組織型の１つに対応するステップと、
前記配列リードの前記組織分類を前記他の組織型の１つに由来すると特定するステップと、を含む、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

複数の参照メチル化パターンは、前記第１参照メチル化パターンを含み、前記複数の参照メチル化パターンの各々が前記複数の組織型の特定の組織型に対応し、前記方法は、
前記配列リードの各々について、
前記複数の参照メチル化パターンの各参照メチル化パターンに対して、
前記メチル化パターンを前記参照メチル化パターンと比較し、そして
前記メチル化パターンと前記参照メチル化パターンの比較に基づき、前記配列リードの前記組織分類を前記複数の組織型の１つに由来すると特定するステップと、
前記第１組織型の前記組織分類と関連している配列リードの最大量の特定に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を更に含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記複数の組織型は２つの組織型を含み、前記第１組織型が疾患組織型であり、第２組織型が非疾患組織型である、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記疾患は癌である、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、又は頭頸部扁平上皮癌の１つである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取るステップであって、前記配列リードの各々が前記配列リード上の１組の部位でのメチル化状態のメチル化パターンを含むステップと、
前記配列リードの各々について、
第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練された機械学習モデルに前記配列リードの前記メチル化パターンを入力し、そして
前記機械学習モデルの出力に基づき、前記配列リードが前記第１組織型に由来するか否かの分類を特定するステップと、
前記分類を使用して前記第１組織型の特性を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項28】

前記分類を使用して前記第１組織型の特性を特定するステップは、
前記第１組織型に由来すると分類された配列リードの第１量を特定するステップと、
前記第１量に基づいて前記第１組織型の前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記配列リードを前記機械学習モデルに入力するステップを更に含む、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

塩基及びメチル化状態のワンホットエンコーディングの行列を形成するステップを更に含む、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記機械学習モデルは畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む、請求項２７から３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

配列リードの前記第１又は第２訓練セットは１つ又は複数の示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）から取得される、請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記配列リードの位置を特定するステップを更に含み、前記位置も前記機械学習モデルに入力される、請求項２７から３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記メチル化パターンは前記１組の部位の部位対間の塩基の数を含む、請求項２７から３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記第１組織型の前記特性は前記第１組織型に由来すると分類された配列リードの量を同定する、請求項２７から３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記第１組織型の前記特性は前記第１組織型に関連する疾患の疾患状態を同定する、請求項２７から３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記疾患は癌である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第１組織型の前記特性は前記第１組織型に関連する前記疾患の予測予後を更に同定する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記疾患は癌であり、
前記予測予後は前記癌に関連する血管浸潤の存在を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記１つ又は複数の他の組織型はＴ細胞、Ｂ細胞、好中球、肺組織、又は肝臓を含む、請求項２７から３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

各配列リードの前記１組の部位は、少なくとも３つの部位を含む、請求項１から４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取るステップであって、前記配列リードの各々が前記配列リード上の１組の部位でのメチル化状態のメチル化パターンを含むステップと、
第１配列リードの位置を同定するステップと、
前記位置に対応する前記第１配列リードにおけるバリアントを検出するステップと、
前記第１配列リードの前記メチル化パターンを使用して前記バリアントの起源組織を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項43】

前記起源組織を特定するステップは、
前記メチル化パターンを前記位置での第１参照メチル化パターンと比較するステップであって、前記第１参照メチル化パターンが疾患の疾患組織型に対応するステップと、
前記メチル化パターンと前記第１参照メチル化パターンの比較に基づき、前記第１配列リードを複数の組織型の１つに由来すると分類するステップと、を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記起源組織を特定するステップは、
前記位置及び前記メチル化パターンを、第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練された機械学習モデルに入力するステップと、
前記機械学習モデルの出力に基づき、前記第１配列リードが前記第１組織型に由来するか否かを特定するステップと、を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記バリアントはマイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、反転、及び／又は微小欠失である、請求項４２から４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取るステップであって、前記配列リードの各々が前記配列リード上の１組の部位でのメチル化状態のメチル化パターンを含むステップと、
第１配列リードの位置を同定するステップと、
前記位置に対応する前記第１配列リードにおけるバリアントを検出するステップと、
前記第１配列リードの前記メチル化パターン及び前記バリアントを使用して癌の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項47】

前記バリアントは分類が既知の癌に関連し、前記メチル化パターンはメチル化レベルであり、前記癌の分類を特定するステップは、
前記第１配列リードの前記１組の部位のメチル化状態に基づいて前記第１配列リードの前記メチル化レベルを特定するステップと、
前記第１配列リードの前記メチル化レベルを閾値と比較するステップであって、前記閾値が、癌の分類が既知の参照サンプルのメチル化レベルに基づいて決定されるステップと、
前記バリアント及び前記メチル化レベルが前記閾値を超える判定に基づいて前記癌の分類を特定するステップと、を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記配列リードのそれぞれの位置を同定するステップと、
前記配列リードから複数の配列リードを決定するステップであって、前記複数の配列リードの各配列リードが前記第１配列リードの同じ位置由来であり、前記バリアントを含み、前記複数の配列リードが前記第１配列リードを含むステップと、を更に含み、
前記癌の分類を特定するステップは、
前記複数の配列リードの集計メチル化レベルを特定するステップと、
前記複数の配列リードの前記集計メチル化レベルを閾値と比較するステップであって、前記閾値が、癌の分類が既知の参照サンプルのメチル化レベルに基づいて決定されるステップと、
前記バリアント及び前記集計メチル化レベルが前記閾値を超える判定に基づいて前記癌の分類を特定するステップと、を更に含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記複数の配列リードの集計メチル化レベルを特定するステップは、
前記複数の配列リードの各配列リードについて、前記配列リードの前記１組の部位のメチル化状態に基づいてメチル化レベルを特定するステップと、
前記複数の配列リードのメチル化レベルに基づいて集計値を決定するステップであって、前記集計値が前記集計メチル化レベルであるステップと、を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記集計値は、前記複数の配列リードの前記特定されたメチル化レベルの代表値、合計、又は中央値である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記複数の配列リードの前記位置は特定のハプロタイプの位置である、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記バリアントは前記特定のハプロタイプでのＤＮＡ分子の増幅又は欠失である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記メチル化レベルが前記閾値を超える判定は、前記メチル化レベルが前記閾値未満であると特定することを含む、請求項４７又は４８に記載の方法。

【請求項54】

前記位置での高メチル化は前記分類が既知の癌に関連し、前記メチル化レベルが前記閾値を超える判定は、前記メチル化レベルが前記閾値より高いと特定することを含む、請求項４７又は４８に記載の方法。

【請求項55】

前記癌は特定の組織型であると特定される、請求項４６に記載の方法。

【請求項56】

前記癌の分類を特定するステップは、
前記第１配列リードの前記位置及び前記メチル化パターンを、癌細胞由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット及び正常細胞由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練された機械学習モデルに入力するステップと、
前記機械学習モデルの出力に基づき、前記第１配列リードが前記癌細胞に由来するか否かを判定するステップと、を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項57】

前記メチル化パターンは前記生体サンプルの全体的なメチル化レベルである、請求項４６から５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記癌の分類を特定するステップは、前記メチル化パターンを癌に関連する参照メチル化パターンと比較するステップを含む、請求項４６から５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記バリアントは、マイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、及び／又は反転である、請求項４６から５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記第１配列リードは、サイズ範囲内のサイズを有し、前記サイズ範囲の下限は、少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、６ｋｂｐ、７ｋｂｐ、８ｋｂｐ、９ｋｂｐ、又は１０ｋｂｐのうちの１つである、請求項４２から５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記第１配列リードの前記１組の部位は少なくとも３つの部位を含む、請求項４２から６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記第１配列リードの前記位置を同定するステップは、前記第１配列リードを参照配列にアライメントするステップを含み、前記第１配列リードにおける前記バリアントが前記位置での前記参照配列に対するものである、請求項４２から６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記第１配列リードの前記位置を同定するステップは、前記第１配列リードを参照配列にアライメントするステップを含み、前記第１配列リードにおける前記バリアントが前記対象の生得的ゲノムに対するものである、請求項４２から６１に記載の方法。

【請求項64】

前記メチル化認識配列決定は亜硫酸水素塩処理を含まない、請求項１から６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記メチル化認識配列決定は亜硫酸水素塩処理を含む、請求項１から６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、前記生体サンプルが正常細胞を起源とするＤＮＡ、及び場合によっては癌に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの少なくとも一部が前記生体サンプルにおいて無細胞であり、
前記生体サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子のサイズを測定するステップと、
第１サイズ範囲内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の第１量を測定するステップであって、前記第１サイズ範囲の上限が少なくとも１，０００塩基であるステップと、
前記第１量を使用して、正規化されたパラメーターの値を生成するステップと、
前記正規化されたパラメーターを使用して癌のレベルの分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項67】

前記第１サイズ範囲はゼロより大きい下限を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記生体サンプルからの前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取るステップと、
前記配列リードの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々の配列モチーフを特定するステップと、
終了配列における１組の１つ又は複数の配列モチーフの少なくとも１つを有する前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の群を同定するステップと、を更に含み、
前記第１量は前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の群のサブグループから特定され、前記無細胞ＤＮＡ分子のサブグループは前記第１サイズ範囲内のサイズを有する、請求項６６又は６７に記載の方法。

【請求項69】

前記１組の１つ又は複数の配列モチーフはＣＣＣＡを含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択される、請求項６７に記載の方法。

【請求項71】

前記第１サイズ範囲の上限は少なくとも３，０００塩基である、請求項６６から７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記癌のレベルの分類は前記癌の組織学的状態の分類を含む、請求項６６から７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記癌の組織学的状態は癌の血管浸潤の存在を含む、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記生体サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子のサイズを測定するステップは、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の単一分子リアルタイム配列決定又はナノポア配列決定を行うステップと、
前記複数の無細胞ＤＮＡ分子の各無細胞ＤＮＡ分子中のヌクレオチドの数を計数するステップと、を含む、請求項６６から７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記正規化されたパラメーターは、前記第１サイズ範囲内のサイズを有する前記無細胞ＤＮＡ分子の相対頻度を含む、請求項６６から７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記正規化されたパラメーターは、第２サイズ範囲内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の第２量を使用して決定され、前記第１サイズ範囲と前記第２サイズ範囲が異なる、請求項６６から７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記癌のレベルの分類を特定するステップは、前記正規化されたパラメーターをカットオフ値と比較するステップを含む、請求項６６から７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記カットオフ値は癌分類が既知の参照サンプルを使用して決定される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記正規化されたパラメーターをカットオフ値と比較するステップは、機械学習モデルを使用して前記正規化されたパラメーターを前記カットオフ値と比較するステップを含み、前記カットオフ値が、癌のレベルの分類が既知の参照サンプルを含む１つ又は複数の訓練データセットを使用して決定される、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取るステップと、
前記配列リードの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々の配列モチーフを特定するステップと、
１組のＮ個の配列モチーフの各々について、
前記配列モチーフの相対頻度を特定することで、Ｎ個の相対頻度を特定するステップと、
前記Ｎ個の相対頻度を使用して、それぞれが互いに正規化された又は参照サンプルの群内の配列モチーフの他の頻度に正規化されたＮ個の頻度のベクターを生成するステップと、
前記Ｎ個の頻度のベクターを疾患の分類が既知の参照サンプルの群から決定された複数の参照ベクターと比較するステップと、
前記Ｎ個の頻度のベクターと前記複数の参照ベクターの比較に基づいて前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項81】

前記Ｎ個の頻度のベクターの頻度はｚスコアである、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記Ｎ個の頻度のベクターを複数の参照ベクターと比較するステップは、前記複数の参照ベクターに機械学習モデルを適用して１組のクラスターを生成するステップを含み、前記１組のクラスターの各クラスターが前記複数の参照ベクターの１つ又は複数の参照ベクターを含む、請求項８０又は８１に記載の方法。

【請求項83】

前記分類を特定するステップは、
前記Ｎ個の頻度のベクターと前記１組のクラスターの参照ベクターの第１クラスターの最も近い参照ベクターとの第１距離を特定するステップであって、前記参照ベクターの第１クラスターが前記疾患を有すると分類された参照サンプルの群の第１サブグループを表すステップと、
前記Ｎ個の頻度のベクターと前記１組のクラスターの参照ベクターの第２クラスターの最も近い参照ベクターとの第２距離を特定するステップであって、前記参照ベクターの第２クラスターが前記疾患を有さないと分類された参照サンプルの群の第２サブグループを表すステップと、
前記第１距離が前記第２距離未満であると特定するステップと、
前記第１距離が前記第２距離より大きい判定に基づいて前記対象が前記疾患を有さないと特定するステップと、を含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記分類を特定するステップは、
前記Ｎ個の頻度のベクターと前記１組のクラスターの参照ベクターの第１クラスターの最も近い参照ベクターとの第１距離を特定するステップであって、前記参照ベクターの第１クラスターが、前記疾患を有すると分類された参照サンプルの群の第１サブグループを表すステップと、
前記Ｎ個の頻度のベクターと前記１組のクラスターの参照ベクターの第２クラスターの最も近い参照ベクターとの第２距離を特定するステップであって、前記参照ベクターの第２クラスターが前記疾患を有さないと分類された参照サンプルの群の第２サブグループを表すステップと、
前記第１距離が前記第２距離未満であると特定するステップと、
前記第１距離が前記第２距離未満である判定に基づいて前記対象が前記疾患を有すると特定するステップと、を含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項85】

前記相対頻度は、前記生体サンプルからの前記無細胞ＤＮＡ分子に対する、前記配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の割合に基づいて決定される、請求項８０から８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記相対頻度は、前記１組のＮ個の配列モチーフの他の配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、前記配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の割合に基づいて決定される、請求項８０から８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記相対頻度は前記配列モチーフの順位である、請求項８０から８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

前記配列モチーフの前記順位は、前記配列モチーフに対応する終了配列を有する前記無細胞ＤＮＡ分子の個数に基づいて決定される、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記Ｎ個の頻度のベクターを生成するステップは、前記参照サンプルの群内の前記配列モチーフの他の頻度を使用して前記配列モチーフの前記相対頻度を正規化するステップを含む、請求項８０から８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記Ｎ個の頻度のベクターにおける各頻度は、前記相対頻度を前記参照サンプルの群内の前記配列モチーフの平均頻度と比較することによって決定される、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取るステップと、
前記配列リードを使用して前記無細胞ＤＮＡ分子のサイズを特定するステップと、
前記配列リードの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々の配列モチーフを決定するステップと、
第１サイズ範囲を有する前記無細胞ＤＮＡ分子の第１組について、前記無細胞ＤＮＡ分子の前記第１組内の１つ又は複数の配列モチーフの出現の第１相対頻度を特定するステップと、
第２サイズ範囲を有する前記無細胞ＤＮＡ分子の第２組について、前記無細胞ＤＮＡ分子の前記第２組内の１つ又は複数の配列モチーフの出現の第２相対頻度を特定するステップであって、前記第２サイズ範囲が、前記第１サイズ範囲の上限より大きい上限を有するステップと、
前記第１相対頻度と前記第２相対頻度の分離値を特定するステップと、
前記分離値を使用して疾患の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項92】

前記分類を特定するステップは、前記分離値を１つ又は複数のカットオフ値と比較するステップを含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記１つ又は複数のカットオフ値のうちのカットオフ値は、前記疾患の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記１つ又は複数のカットオフ値のうちのカットオフ値は０．６、０．６５、０．７、又は０．７５のうちの１つである、請求項９２に記載の方法。

【請求項95】

前記疾患の分類は、前記疾患の重篤度の分類を含む、請求項９１から９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

前記疾患の重篤度は、前記疾患の複数の病期から選択される病期を含む、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記第１サイズ範囲は上限を含む、請求項９１から９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

前記上限は、少なくとも８０塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも１５０塩基、少なくとも２００塩基、又は少なくとも３００塩基のうちの１つから選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記第２サイズ範囲は下限を含む、請求項９１から９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

前記下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択される、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記分離値は前記第１相対頻度と前記第２相対頻度の比率値である、請求項９１から１００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項102】

前記分離値を使用して疾患の分類を特定するステップは、前記分離値に機械学習モデルを適用して前記疾患の分類を示す出力を生成するステップを含む、請求項９１から１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

前記機械学習モデルは前記疾患の分類が既知の訓練サンプルを使用して訓練される、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の機械学習モデルの１つ又は複数を含む複合モデルのうちの１つから選択される、請求項１０２に記載の方法。

【請求項105】

前記第１相対頻度は、前記生体サンプルからの前記無細胞ＤＮＡ分子に対する、第１組の前記無細胞ＤＮＡ分子の割合である、請求項９１から１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

前記第１相対頻度は、他の配列モチーフを有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、第１組の前記無細胞ＤＮＡ分子の割合である、請求項９１から１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取るステップと、
前記配列リードの各々について、
前記配列リードの１つ又は複数の特徴を、第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練された機械学習モデルに入力し、そして
前記機械学習モデルの出力に基づき、前記配列リードが前記第１組織型に由来するか否かの組織分類を特定するステップと、
前記第１組織型に由来すると分類された配列リードの第１量を特定するステップと、
前記第１量に基づいて前記第１組織型の前記生体サンプルの第１疾患の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項108】

前記１つ又は複数の特徴は、参照ゲノムにおける末端の位置、配列構成、サイズ、１つ又は複数の末端での配列モチーフ、及びＤＮＡメチル化パターンから選択される少なくとも１つを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記１つ又は複数の特徴は、前記配列リードの配列構成を含み、前記配列構成が前記配列リードのヌクレオチド塩基組成及び／又はヌクレオチド塩基順序を含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記１つ又は複数の特徴は、前記配列リードの末端の位置を含み、前記末端の位置を特定するステップは、前記配列リードを前記参照ゲノムにアライメントするステップを含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項111】

前記１つ又は複数の特徴は、前記配列リードのＤＮＡメチル化パターンを含み、前記ＤＮＡメチル化パターンが前記配列リード上の１組の部位でのメチル化状態を含む、請求項１０８に記載の方法。

【請求項112】

前記第１組織型は疾患組織型である、請求項１０７から１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

前記第１組織型は前記疾患に関連する、請求項１０７から１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

前記疾患は癌である、請求項１０７から１１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

前記疾患の分類を特定するステップは、前記癌の血管浸潤の有無を判定するステップを含む、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記癌は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、又は頭頸部扁平上皮癌の１つである、請求項１０７から１１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項117】

前記機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶、（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の機械学習モデルの１つ又は複数を含む複合モデルのうちの１つから選択される、請求項１０７から１１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項118】

前記生体サンプルの疾患の分類を特定するステップは、前記第１量を１つ又は複数のカットオフ値と比較するステップを含む、請求項１０７から１１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項119】

前記１つ又は複数のカットオフ値のうちのカットオフ値は、前記疾患の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

対象の生体サンプルを分析する方法であって、
前記対象の前記生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取るステップであって、前記配列リードの各々が前記配列リードの１組の部位でのメチル化状態を含むステップと、
前記配列リードの各々について、
前記配列リードの前記１組の部位の各々のメチル化状態を特定し、そして
前記メチル化状態に基づいて前記配列リードのメチル化レベルを特定するステップと、
前記配列リードの前記特定されたメチル化レベルに基づいて統計値を決定するステップと、
前記統計値を参照値と比較して前記対象の病態の分類のレベルを特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項121】

前記メチル化認識配列決定は、単一分子配列決定を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記メチル化認識配列決定は、ナノポア配列決定を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項123】

前記配列リードのメチル化レベルを特定するステップは、前記１組の部位のメチル化された１つ又は複数の部位の個数を特定するステップを含む、請求項１２０から１２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項124】

前記統計値は前記配列リードの前記特定されたメチル化レベルの代表値又は中央値である、請求項１２０から１２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項125】

前記病態は癌を含む、請求項１２０から１２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

前記病態の分類のレベルは、癌の病期を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記配列リードの各々は第１サイズ範囲内のサイズを有する、請求項１２０から１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項128】

前記第１サイズ範囲は下限を含む、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択される、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記第１サイズ範囲は上限を含む、請求項１２７から１２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項131】

前記第１サイズ範囲の上限は少なくとも３，０００塩基である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記１組の部位は少なくとも３つの部位を含む、請求項１２０から１３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項133】

前記参照値は、前記病態の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される、請求項１２０から１３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項134】

実行されるとコンピュータシステムに先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を行わせる複数の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含む、コンピュータ製品。

【請求項135】

請求項１３４に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ又は複数のプロセッサと、を含む、システム。

【請求項136】

上記の方法のいずれかを行うための手段を含む、システム。

【請求項137】

上記の方法のいずれかを行うように構成された１つ又は複数のプロセッサを含む、システム。

【請求項138】

それぞれ上記の方法のいずれかのステップを行うモジュールを含む、システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年１１月２４日に出願した、発明の名称が「疾患分類のための長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた分子分析」である米国仮特許出願第６３／２８３，１９０号、及び２０２１年１２月３日に出願した、発明の名称が「疾患分類のための長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた分子分析」である米国仮特許出願第６３／２８５，６８３号の優先権を主張し、それらの内容の全てがあらゆる目的で参照によって本出願に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

以前の多くの研究は、癌患者の血漿中の４００ｂｐ以下の循環無細胞ＤＮＡ分子の先天的情報／後天的情報に注目していた（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１５；１１２：Ｅ１３１７－２５、Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１；６：ｅ２３４１８、Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１８；１０：ｅａａｔ４９２１、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６；１２：ｅ１００６１６２、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３；１１０：１８７６１－８）。癌又は自己免疫疾患等の多くの他の疾患を有する患者における、例えば≧５００ｂｐ、≧６００ｂｐ、≧１ｋｂ、≧２ｋｂ、≧３ｋｂ、≧４ｋｂ、≧５ｋｂ、≧１０ｋｂ又は他の組み合わせの長いＤＮＡ分子に関する診断的価値及び商業的価値は、まだ探究されていない。

【0003】

Ｊａｈｒらは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用することで、癌を有する６つのサンプルのうち、３つのサンプルの血漿中に高分子量ＤＮＡ断片が存在することを報告した（Ｊａｈｒ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；６１：１６５９－６５）。この試験で検査した癌サンプルの５０％のみに存在するこのような高分子量ＤＮＡ分子は、癌患者の間でかかる長い無細胞ＤＮＡ分子が一貫して検出可能ではない可能性があることを示唆しているようである。たとえ高分子量の無細胞ＤＮＡ分子の存在を示した３つのサンプルでも、これらのＤＮＡ分子がどの程度豊富であるか不明である。更に、この試験は、癌を有さない個体からのサンプルとの比較を提供しなかった。これらいくつかの要因は、長い無細胞ＤＮＡ分子が癌検出用の実用的なバイオマーカーであることを示唆していないようである。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ベースの分析では、配列における実際の先天的／後天的情報の解読が不可能である。
一般的なゲノム分析ツールは、ショートリード超並列配列決定を含む。ショートリード超並列配列決定は、典型的には＜８００ｂｐ、又は実際に、好ましくは＜６００ｂｐの短いＤＮＡ分子を分析するように設計される。その上、Ｊａｈｒらによる文献等では長い無細胞ＤＮＡ分子の検出可能性が低いと示していることから、長い無細胞ＤＮＡ分子の分析は、まだ探究されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１５；１１２：Ｅ１３１７－２５

【非特許文献2】Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１；６：ｅ２３４１８

【非特許文献3】Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１８；１０：ｅａａｔ４９２１

【非特許文献4】Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６；１２：ｅ１００６１６２

【非特許文献5】Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３；１１０：１８７６１－８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書に記載の技術は、無細胞ＤＮＡ分子の様々な特徴を使用して生体サンプル又は対象の特性を特定することができる。かかる特徴は、サイズ（例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子を特徴とする場合）、メチル化、及び末端モチーフを含み得る。例えば、本明細書に記載のいくつかの方法、装置、及びシステムは、長い無細胞ＤＮＡ断片を使用して生体サンプルを分析することを含み得る。

【0006】

様々な方法は、前記対象の生体サンプル（例えば、血漿サンプル）中の無細胞ＤＮＡ分子（例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子）の１つ又は複数の特徴に基づく疾患分類の特定及び／又は起源組織の予測を含み得る。いくつかの実例において、前記方法は、（例えば、上限が１０００塩基のサイズ範囲内の）無細胞ＤＮＡ分子の量の特定を含み、前記疾患分類は前記特定された量を基礎としてもよい。更なる例として、前記方法は、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンを同定し、そして前記無細胞ＤＮＡ分子の前記メチル化パターンを参照パターンと比較して前記起源組織を予測することも含み得る。無細胞ＤＮＡ分子上のバリアントの起源はこの方式で特定できる。尚更なる例として、前記特徴は、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度も含み得、該特徴で前記相対頻度（例えば、相対頻度のベクター）を参照頻度と比較して疾患分類を特定することができる。

【0007】

いくつかの実例において、メチル化パターン分析は訓練された機械学習モデルを使用することを含み得る。前記メチル化パターン分析は、無細胞ＤＮＡ分子の個別の特性、例えば、メチル化された部位の百分率等のような、前記分子上の１組の部位から特定されたメチル化レベルを提供できる。このような単一分子メチル化レベルは病態の特定に使用できる。

【0008】

いくつかの実施形態において、前記無細胞ＤＮＡ分子（例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子）の複数の特徴は疾患分類の特定及び／又は起源組織の予測のために組み合わせられる。例えば、参照配列と比較してバリアントを有する配列リードのメチル化パターンを特定してもよく、かかるメチル化パターンは疾患分類の特定に使用できる。別の例として、末端モチーフの相対頻度は、特定のサイズ範囲内の無細胞ＤＮＡ分子から選択してもよい。

【0009】

本開示のこれらの及び他の実施形態は以下に詳細に説明する。例えば、他の実施形態は、本明細書に記載の方法に関連するシステム、デバイス、及びコンピュータ可読媒体に関する。

【0010】

以下の詳細な説明及び添付の図面を参照した上で、本開示の実施形態の本質及び利点をより良く理解することができる。図面及び特許請求の範囲を含む明細書の残りの部分を参照することで、本開示の他の特徴及び利点が認識されるであろう。本開示の更なる特徴及び利点、並びに本開示の様々な実施形態の構造及び操作は、以下に添付の図面を参照しながら説明する。図面において、同様の参照番号は、同一又は機能的に類似の要素を示すことができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子を分析する一例の概要を図示する概略図を示す。

【0012】

【図2】単一分子リアルタイム配列決定によって配列決定されたメチル化及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位を持つ分子の例を示す。

【0013】

【図3】いくつかの実施形態に係る、無細胞ＤＮＡ分子の動態特徴を特定するプロセス例を図示する概略図を示す。

【0014】

【図4】いくつかの実施形態に係る、無細胞ＤＮＡ分子の動態特徴を特定する別のプロセス例を図示する概略図を示す。

【0015】

【図5】いくつかの実施形態に係る、異なる配列決定技術にわたる５００ｂｐより大きい長さを有する血漿ＤＮＡ断片の割合を同定するグラフを示す。

【0016】

【図6】１人のＨＣＣ対象と１人のＨＢＶ保菌者のサイズ分布を図示する折れ線グラフを示す。

【0017】

【図7】血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者における、所与のサイズを上回るｃｆＤＮＡ断片の百分率を同定する棒グラフを示す。

【0018】

【図8】血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者における＞２００ｂｐの長いＤＮＡ断片の百分率を同定する箱ひげ図を示す。

【0019】

【図9】血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者のサイズ比を同定する箱ひげ図を示す。

【0020】

【図10】いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子の頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を描くフローチャートを示す。

【0021】

【図11】いくつかの実施形態に係る、血漿ＤＮＡ分子の２５６個の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析に基づいて生成されたヒートマップを示す。

【0022】

【図12】いくつかの実施形態に係る、短い血漿ＤＮＡ（＜２００ｂｐ）の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップを示す。

【0023】

【図13】いくつかの実施形態に係る、長い血漿ＤＮＡ（＞１ｋｂ）の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップを示す。

【0024】

【図14】いくつかの実施形態に係る、短い血漿ＤＮＡ（＜２００ｂｐ）及び長い血漿ＤＮＡ（＞１ｋｂ）の両方の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップを示す。

【0025】

【図15】ある実施形態に係る、４－ｍｅｒ末端モチーフ比率の階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップを示す。

【0026】

【図16】いくつかの実施形態に係る、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0027】

【図17】短い血漿ＤＮＡ分子（＜６００ｂｐ）と長い血漿ＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）のモチーフ順位の関係を同定する１組のグラフを示す。

【0028】

【図18】ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象における＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図を示す。

【0029】

【図19】血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する１組の箱ひげ図を示す。

【0030】

【図20】ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象を区別する際の短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0031】

【図21】ＨＣＣ患者、ＨＢＶ保菌者、及び健康対象におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図を示す。

【0032】

【図22】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のＣＣＣＡ率の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0033】

【図23】ＣＲＣ患者及び健康対象における＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図を示す。

【0034】

【図24】ＣＲＣ患者及び健康対象における１ｋｂより長い血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する箱ひげ図を示す。

【0035】

【図25】ＳＭＲＴ－配列決定際のＣＲＣ患者及び健康対象におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図を示す。

【0036】

【図26】ＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者における＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図を示す。

【0037】

【図27】血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する１組の箱ひげ図を示す。

【0038】

【図28】ナノポア配列決定際のＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図を示す。該ＣＣＣＡ率は、ＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者における長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）のＣＣＣＡモチーフ頻度を短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）のＣＣＣＡモチーフ頻度で割ることで算出されたものである。

【0039】

【図29】２００ｂｐ未満のサイズを有する短いＤＮＡ分子における末端モチーフ特徴のロジスティック回帰分析によって生成された結果を同定する箱ひげ図を示す。

【0040】

【図30】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）における末端モチーフ特徴を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0041】

【図31】１ｋｂより大きいサイズを有する長いＤＮＡ分子における末端モチーフ特徴のロジスティック回帰分析から生成された結果を同定する箱ひげ図を示す。

【0042】

【図32】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）における末端モチーフ特徴を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0043】

【図33】＞１ｋｂの長いＤＮＡ分子及び＜２００ｂｐの短いＤＮＡ分子の両方における末端モチーフ特徴を用いたロジスティック回帰分析を同定する箱ひげ図を示す。

【0044】

【図34】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方から導き出された末端モチーフ特徴を組み合わせて用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0045】

【図35】モチーフ比率を用いたロジスティック回帰分析によって生成された結果を同定する箱ひげ図を示す。

【0046】

【図36】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0047】

【図37】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の末端モチーフ比率を用いたＳＶＭの実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0048】

【図38】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたランダムフォレスト分析の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0049】

【図39】ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたＬＤＡ分析の実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0050】

【図40】いくつかの実施形態に係る、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0051】

【図41】いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンを参照組織のメチル化パターンと比較する図示例を示す。

【0052】

【図42】いくつかの実施形態に係る、少なくとも１つのメチル化ミスマッチを含む長い無細胞ＤＮＡ分子におけるメチル化パターンを分析する技術を示す。

【0053】

【図43】ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来一塩基バリアント（ＳＮＶ）の普遍性の１ｋｂ分解能での比較を示す。

【0054】

【図44】ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来ＳＮＶの普遍性の３ｋｂ分解能での比較を示す。

【0055】

【図45】ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来ＳＮＶの普遍性の２００ｂｐ分解能での比較を示す。

【0056】

【図46】無細胞ＤＮＡ分子が腫瘍ＤＮＡに対応するか否かをそのメチル化ハプロタイプ情報に応じて予測するプロセス例を図示する概略図を示す。

【0057】

【図47】本開示の実施形態に係るメチル化ハプロタイプ分析に基づき、異なる病期のＨＣＣ患者において肝臓起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する箱ひげ図を示す。

【0058】

【図48】いくつかの実施形態に係る、異なる病期にわたるＨＣＣ患者の癌メチル化スコアを同定する箱ひげ図を示す。

【0059】

【図49】いくつかの実施形態に係る、ＨＣＣ患者における生存率分析を同定する１組の生存率曲線を示す。

【0060】

【図50】ＳＭＲＴ－ｓｅｑ及びナノポア配列決定からのデータを使用して算出されたＨＢＶ保菌者及びＨＣＣ患者のＨＣＣメチル化スコアを同定する箱ひげ図を示す。

【0061】

【図51】ＳＭＲＴ－ｓｅｑ及びナノポア配列決定からのデータを使用してＨＢＶ保菌者及びＨＣＣ患者からの血漿サンプルにおいて単一分子起源組織分析によって特定された肝臓由来ｃｆＤＮＡの百分率を同定するグラフを示す。

【0062】

【図52】本開示で提示される実施形態に基づいて１５人の健康対象、４５人のＨＣＣ患者及び４人のＣＲＣ患者において結腸起源と分類された血漿ＤＮＡ分子の百分率を同定する箱ひげ図を示す。

【0063】

【図53】いくつかの実施形態に係るメチル化ハプロタイプ分析に基づき、血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者の間でＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する１組のバープロットを示す。

【0064】

【図54】いくつかの実施形態に係る、ＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する１組のバープロットを示す。

【0065】

【図55】長い無細胞ＤＮＡの単一分子メチル化配列データの分析の癌検出精度及び短い無細胞ＤＮＡのメチル化配列データを用いた他の分析の癌検出精度を同定する１組のＲＯＣ曲線を示す。

【0066】

【図56】長いＤＮＡ（＞１ｋｂ）を用いたメチル化ハプロタイプベースの分析のＨＣＣ検出精度及び短い血漿ＤＮＡ分子（＜６００ｂｐ）のショートリード亜硫酸水素塩配列決定を用いた血漿ＤＮＡ組織マッピング分析のＨＣＣ検出精度を同定する１組のＲＯＣ曲線を示す。

【0067】

【図57】いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0068】

【図58】いくつかの実施形態に係る、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ）際の個体の異なる群における単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図を示す。

【0069】

【図59】サイズが＞５００ｂｐであり、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含有し、ＳＭＲＴ－Ｓｅｑにおいてメチル化レベルが≦６０％であるＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図を示す。

【0070】

【図60】いくつかの実施形態に係る、ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ及びショートリード配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）におけるＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を区別する際の単一分子メチル化レベルの実績を同定するＲＯＣ曲線を示す。

【0071】

【図61】異なるバルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）病期のＨＣＣ患者における単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図を示す。

【0072】

【図62】いくつかの実施形態に係る、ＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルを用いた疾患分類を特定するプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0073】

【図63】いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを用いたメチル化ハプロタイプのパターン認識の例示図を示す。

【0074】

【図64】訓練プロセスに使用される様々な配列決定深度にわたる血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別するための機械学習モデルの実績を同定する１組の棒グラフを示す。

【0075】

【図65】血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別するための機械学習モデルの実績を同定する１組の棒グラフを示し、該機械学習モデルでは機械学習が様々な配列決定深度にわたる示差的にメチル化された領域を使用して訓練されたものである。

【0076】

【図66】異なる長さの血漿ＤＮＡ分子による、癌患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別する機械学習モデルの実績を同定する表を示す。

【0077】

【図67】いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて組織型特性を特定するプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0078】

【図68】いくつかの実施形態に係る、ＳＮＶ及びＣｐＧメチル化ハプロタイプ情報を用いた組み合わせ分析の例を図示する概略図を示す。

【0079】

【図69】野生型対立遺伝子を持つ第１群の血漿ＤＮＡ分子及び変異を持つ第２群の血漿ＤＮＡ分子の特徴を示す。

【0080】

【図70】体細胞変異周囲の２００ｂｐ又は１ｋｂ領域におけるＣｐＧ部位の数の分布を同定する表を示す。

【0081】

【図71】癌の有無の情報を提供する歪んだ対立遺伝子比及び歪んだメチル化レベルを伴う相対的ハプロタイプ不均衡を有するＤＮＡ分子の概略図を示す。

【0082】

【図72】いくつかの実施形態に係る、バリアント及びメチル化パターンを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて起源組織を特定する生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0083】

【図73】いくつかの実施形態に係る、バリアント及びメチル化パターンを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて癌分類を特定する生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0084】

【図74】血漿ＤＮＡ分子に存在する配列構成、ゲノム位置、断片情報及び後天的情報に基づいて癌を有する患者と有さない患者を区別するための機械学習モデルを訓練するプロセス例を図示する概略図を示す。

【0085】

【図75】血漿ＤＮＡ分子に存在する断片情報及び後天的情報を用いた癌検出に訓練されたモデルを適用するプロセス例を図示する概略図を示す。

【0086】

【図76】いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子の複数の特徴に基づいて疾患分類を特定する対象の生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャートを示す。

【0087】

【図77】ＤＮＡ分子における１組のマイクロサテライト配列の例を示す。

【0088】

【図78】癌特異的マイクロサテライトマーカーに基づいて腫瘍由来ＤＮＡを検出する一例の概要を図示する。

【0089】

【図79】本発明の一実施形態に係る測定システムを図示する。

【0090】

【図80】本発明の実施形態に係るシステム及び方法と共に使用可能なコンピュータシステムの例のブロック図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0091】

用語
「組織」は、機能単位として共に群化する細胞の群に対応する。１タイプより多くの細胞が、単一の組織内に見出され得る。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、又は血球細胞）からなり得るが、異なる生物（宿主対ウイルス）からの組織又は健康細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「組織」という用語は一般に、ヒト体内に見られる任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、口腔咽頭組織）を指し得る。いくつかの態様において、「組織」又は「組織型」という用語は、無細胞核酸が起源とする組織を指すために使用され得る。一例では、ウイルス核酸断片は、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の血液組織に由来し得る。別の例では、ウイルス核酸断片は、腫瘍組織、例えば、ＥＢＶ又はヒトパピローマウイルス感染（ＨＰＶ）に由来し得る。

【0092】

「サンプル」、「生体サンプル」、又は「患者サンプル」という用語は、生きている対象又は死んだ対象に由来する任意の組織又は物質を含むことを意味する。生体サンプルは、無細胞サンプルであり得、それは、対象からの核酸分子と、場合によっては病原体、例えばウイルスからの核酸分子との混合物を含み得る。生体サンプルは一般に、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその断片を含む。「核酸」という用語は一般に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの任意のハイブリッド又は断片を指し得る。サンプル中の核酸は無細胞核酸であり得る。サンプルは、液体サンプル又は固体サンプル（例えば、細胞又は組織サンプル）であり得る。生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、膣液、（例えば精巣の）水腫からの液、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳房）からの吸引流体等の体液であり得る。便サンプルもまた、使用することができる。様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡについて濃縮された生体サンプル（例えば、遠心分離プロトコルを通じて得られた血漿サンプル）中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、又は９９％超は、無細胞であり得る）。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析される。他の実施形態において、少なくとも１０，０００又は５０，０００又は１００，０００又は５００，０００又は１，０００，０００又は５，０００，０００個の無細胞ＤＮＡ分子、又はそれ以上の無細胞ＤＮＡ分子が、分析され得る。少なくとも同じ数の配列リードが分析され得る。生体サンプルは、組織又は細胞の構造を物理的に破壊するように（例えば、遠心分離及び／又は細胞溶解）処理され得るため、細胞内成分を、分析用のサンプルを調製するための酵素、緩衝液、塩、界面活性剤等を更に含有し得る溶液中に放出し得る。

【0093】

「生得的ゲノム」（ＣＧとも呼ばれる）という用語はゲノム中の遺伝子座におけるコンセンサスヌクレオチドから構成され、したがって、コンセンサス配列と見なされ得る。ＣＧは対象のゲノム全体（例えば、ヒトゲノム）、又はゲノムの部分のみをカバーすることができる。細胞のＤＮＡ及び（例えば、血漿中に見出され得るような）無細胞ＤＮＡから生得的ゲノム（ＣＧ）を得ることができる。理想的には、コンセンサスヌクレオチドは、ある遺伝子座が１つの対立遺伝子についてホモ接合性であり、又は２つの対立遺伝子についてヘテロ接合性であることを示すべきである。ヘテロ接合性遺伝子座は通常はある遺伝的多型のメンバーである２つの対立遺伝子を含有する。例として、ある遺伝子座にアライメントしたリードにおいて２つの対立遺伝子がそれぞれ少なくとも所定の百分率（例えば、３０％又は４０％）で現れる閾値が、その遺伝子座がヘテロ接合性であるか否かを特定するための特定基準であり得る。１種類のヌクレオチドが十分な百分率（例えば、７０％以上）で現れる場合、その遺伝子座はＣＧ中でホモ接合性であると判断され得る。１つの健康細胞のゲノムは細胞分裂の間に自然に起こるランダム変異のため別の健康細胞のゲノムと異なり得るが、このようなコンセンサスが使用されるとき、ＣＧは変化しないはずである。いくつかの細胞はゲノム再構成したゲノムを有し得、例えば、抗体及びＴ細胞受容体遺伝子に関係するＢリンパ球及びＴリンパ球がそうである。そのような大規模な差異はそれでも血液中の有核細胞集団のうちの比較的小さい集団であり、したがって、血液細胞の十分なサンプリング（例えば、配列決定深度）により、そのような再構成が生得的ゲノムの特定に影響を与えることはない。口腔細胞、皮膚細胞、毛包、又は様々な正常な体組織の生検組織を含む他の細胞種もＣＧ源として役立ち得る。

【0094】

「生得的ＤＮＡ」という用語は、対象が持って生まれた遺伝的構成を反映するあらゆるＤＮＡ源を指す。対象について、生得的ＤＮＡを得ることができる「生得的サンプル」の例は健康な血液細胞ＤＮＡ、口腔細胞ＤＮＡ及び毛根ＤＮＡを含む。これらの健康細胞に由来するＤＮＡが対象のＣＧを定義する。それらの細胞は様々な方法で、例えば、ある人が癌を有していないと知られているとき、又は癌細胞若しくは前腫瘍細胞（例えば、肝臓癌が疑われるときの毛根ＤＮＡ）を含む可能性がない組織からサンプルを得ることができるときに健康であると同定され得る。別の例として、患者に癌がないときに血漿サンプルを得ることができ、決定された生得的ＤＮＡをその後の（例えば、１年以上後の）血漿サンプルから得られた結果と比較する。別の実施形態において、５０％未満の腫瘍ＤＮＡを含有する単一の生体サンプルを生得的ゲノムと腫瘍関連遺伝的変化の推測のために使用することができる。そのようなサンプルでは、腫瘍関連一塩基変異の濃度はＣＧ中のヘテロ接合性ＳＮＰの各対立遺伝子の濃度よりも低い。そのようなサンプルは以下に記載されるサンプルゲノムの決定のために使用される生体サンプルと同一のものであり得る。

【0095】

「配列リード」とは、核酸分子の任意の部分又は全部から配列決定されたヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定されたヌクレオチドの短い鎖（例えば、２０～１５０ヌクレオチド）、核酸断片の片端又は両端でのヌクレオチドの短い鎖、又は生体サンプルに存在する核酸断片全体の連鎖であり得る。配列リードは様々な方式で、例えば配列決定技術を使用するか、又は、例えばハイブリダイゼーションアレイでのプローブ又はマイクロアレイで使用され得る捕捉プローブを使用するか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一プライマー又は等温増幅を用いた線形増幅等の増幅技術を使用して、得ることができる。生体サンプルの分析の一環として、少なくとも１，０００配列リードを分析してもよい。他の例として、少なくとも１０，０００又は５０，０００又は１００，０００又は５００，０００又は１，０００，０００又は５，０００，０００配列リード、又はそれ以上の配列リードを分析してもよい。ＤＮＡ分子のかかる例示的な数は超並列配列決定の一環として分析され得る。

【0096】

配列リードは、断片の末端に関連する「終了配列」を含み得る。終了配列は、断片の最も外側のＮ塩基、例えば、断片の末端での１～３０塩基に対応し得る。配列リードが断片全体に対応する場合、配列リードは２つの終了配列を含み得る。ペアエンド配列決定により断片の末端に対応する２つの配列リードが提供される場合、各配列リードはそれぞれ１つの終了配列を含み得る。

【0097】

「配列モチーフ」とは、ＤＮＡ断片（例えば、無細胞ＤＮＡ断片）における塩基の短い繰り返しパターンを指し得る。配列モチーフは断片の末端に発生し得るため、終了配列の一部となり得るか又はそれを含み得る。「末端モチーフ」とは、潜在的に特定のタイプの組織について、ＤＮＡ断片の末端で優先的に発生する終了配列の配列モチーフを指し得る。末端モチーフは断片の末端の直前又は直後にも発生し得るため、依然として終了配列に対応する。ヌクレアーゼは、特定の末端モチーフに対する特定の切断選択、及び第２末端モチーフに対する２番目に好ましい切断選択を有し得る。

【0098】

「終了位置」又は「末端位置」（又は単に「末端」）とは、無細胞ＤＮＡ分子、例えば血漿ＤＮＡ分子の最も外側の塩基即ち端部でのゲノム座標又はゲノムアイデンティティ又はヌクレオチドアイデンティティを指し得る。末端位置はＤＮＡ分子のどちらの末端に対応してもよい。このように、ＤＮＡ分子の開始及び終了が言及する場合、両方とも終了位置に対応する。実際に、１つの末端位置は、超並列配列決定又は次世代配列決定、単一分子配列決定、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列決定ライブラリ作成プロトコル、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はマイクロアレイに限定されない分析方法によって検出又は特定された無細胞ＤＮＡ分子の１つの端部上の最も外側塩基のゲノム座標又はヌクレオチドアイデンティティである。このようなインビトロ技術は、無細胞ＤＮＡ分子の真のインビボ物理的末端（複数可）を変化させる可能性がある。よって、各検出可能な末端は、生物学的に真の末端を表し得るか、又は該末端は内側の１つ又は複数のヌクレオチドであるか、又は１つ又は複数のヌクレオチドは、例えばクレノウ断片による非平滑末端二本鎖ＤＮＡ分子のオーバーハングの５’平滑化及び３’充填のように、分子の元の末端から延長された。末端位置のゲノムアイデンティティ又はゲノム座標は、ヒト参照ゲノム、例えばｈｇ１９に対する配列リードのアライメントの結果から導き出され得る。それは、ヒトゲノムの元の座標を表すインデックス又はコードのカタログから導き出され得る。それは、標的特異的プローブ、ミニ配列決定、ＤＮＡ増幅に限定されない手段によって読み取られる無細胞ＤＮＡ分子上の位置又はヌクレオチドアイデンティティを指し得る。

【0099】

「好ましい末端」（又は「反復終了位置」）とは、生理学的（例えば妊娠）又は病理学的（疾患）状態（例えば癌）を有する生体サンプルにおいて、かかる状態を有さない生体サンプルよりも、又は同じ病理学的又は生理学的状態の異なる時点又はステージ、例えば、治療前又は後よりも、（例えば、あるレート（ｒａｔｅ）によって測定されて）多く提示されるか又は多く存在する末端を指す。したがって、好ましい末端は、関連生理学的又は病理学的状態では、他の状態と比較して、検出される尤度又は確率が増加する。増加した確率は、病理学的状態と非病理学的状態の間、例えば癌を有する患者と有さない患者の間で比較し、尤度比又は相対確率として定量化することができる。尤度比は、検査されるサンプルにおいて少なくとも閾値数の好ましい末端が検出される確率に基づいて、又はかかる症状を有さない患者よりもかかる症状を有する患者において好ましい末端が検出される確率に基づいて、決定することができる。尤度比の閾値の例としては、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、６、８、１０、２０、４０、６０、８０及び１００を含むが、それらに限定されない。かかる尤度比は、関連状態を有するサンプルと有さないサンプルの相対存在値を比較することで測定できる。関連生理学的又は疾患状態で好ましい末端が検出される確率がより高いため、かかる好ましい終了位置は、同じ生理学的又は疾患状態を有する複数の個体において見られる。確率が増加することで、１つより多くの無細胞ＤＮＡ分子は、分析される無細胞ＤＮＡ分子の数がゲノムのサイズより遥かに少ない場合でも、同じ好ましい終了位置で終了すると検出することができる。よって、好ましい終了位置又は反復終了位置は、「頻繁終了位置」とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、定量的閾値を使用して、末端が好ましい末端と見なされるように同じサンプル又は同じサンプルアリコート内で少なくとも複数回（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は５０回）検出されるように、要求を立ててもよい。関連生理学的状態は、人が健康、無疾患、又は目的の疾患を有さない場合の状態を含み得る。同様に、「好ましい終了ウィンドウ」は、１組の連続した好ましい終了位置に対応する。

【0100】

ＤＮＡ分子がある位置で終了する「レート」は、ＤＮＡ分子が該位置で終了する頻度に関係する。かかるレートは「末端密度」と呼ばれてもよい。レートは、分析されるＤＮＡ分子の数に対して正規化された位置で終了するＤＮＡ分子の数に基づいたものであり得る。正規化は、周囲領域における末端の代表値、中央値、又は総数に基づいて行うこともできる。正規化に使用される周囲領域としては、該位置から上流及び／又は下流の５００、１０００、３０００、５０００ｂｐ等を含み得るが、それらに限定されない。

【0101】

「対立遺伝子」という用語は、同じ物理的ゲノム遺伝子座にある代替ＤＮＡ配列を指し、異なる表現型の特徴をもたらす場合ともたらさない場合がある。各染色体のコピーが２つある任意の特定の二倍体生物（男性の対象の性染色体を除く）では、各遺伝子の遺伝子型は、ホモ接合体においては同じであり、ヘテロ接合体においては異なる、その遺伝子座に存在する対立遺伝子の対を含む。生物の集団又は種は、典型的には、様々な個体の各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。集団内に２つ以上の対立遺伝子が見られるゲノム遺伝子座は、多型部位と呼ばれる。遺伝子座での対立遺伝子バリエーションは、存在する対立遺伝子の数（即ち、多型の程度）、又は集団内のヘテロ接合体の割合（即ち、ヘテロ接合性率）として測定可能である。本明細書で使用される「多型」という用語は、その頻度に関係なく、ヒトゲノムにおける任意の個体間のバリエーションを指す。そのようなバリエーションの例は、一塩基多型、単純なタンデムリピート多型、挿入－欠失多型、変異（疾患を引き起こし得る）、及びコピー数バリエーションを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ハプロタイプ」という用語は、同じ染色体又は染色体領域上で一緒に伝達される複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、僅か１対の遺伝子座、又は染色体領域、又は染色体全体又は染色体腕を指し得る。

【0102】

「相対頻度」（単に「頻度」とも呼ばれる）は、割合（例えば、百分率、画分、又は濃度）を指し得る。特に、特定の末端モチーフ（例えば、ＣＣＧＡ又は単一塩基のみ）の相対頻度は、例えば、ＣＣＧＡの末端配列を有することによって末端モチーフＣＣＧＡと関連付けられるサンプル中の無細胞ＤＮＡ断片の割合を提供し得る。別の例として、相対頻度は、各モチーフの互いの出現の順位であり得る。かかる順位は、分母が同じであるため、割合又は生の個数を使用できる。

【0103】

「サブリード」は、環状化ＤＮＡ鋳型の１つの鎖の全ての塩基から生成された配列であり、ＤＮＡポリメラーゼによって１つの連続した鎖にコピーされている。例えば、サブリードは、環状化ＤＮＡ鋳型のＤＮＡの１つの鎖に対応し得る。このような例では、環状化後、１つの二本鎖ＤＮＡ分子には、２つのサブリードがある（各配列決定パスについて１つ）。いくつかの実施形態では、生成された配列は、例えば、配列決定エラーが存在するため、１つの鎖の全ての塩基のサブセットを含み得る。

【0104】

「部位」（「ゲノム部位」とも呼ばれる）は、単一の塩基位置、又は相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位、又は相関する塩基位置のより大きい群であり得る、単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、該遺伝子座をそのコンテキストにおける部位と等価にするただ１つの部位を含み得る。

【0105】

「メチル化状態」とは、所与の部位でのメチル化の状態を指す。例えば、ある部位は、メチル化されてもよく、メチル化されていなくてもよく、又はいくつかのケースでは、特定されていなくてもよい。配列リードは、対応する無細胞ＤＮＡ分子のメチル化状態が特定できる１つ又は複数の部位を含み得る。１つ又は複数の部位の各部位は、メチル化状態に関連付けられ得る。例えば、１つ又は複数の部位は、ＣｐＧ部位であり得、各部位は、特定のメチル化状態が特定されたＣｐＧ部位であり得る。いくつかの実例において、配列リードの各々の１つ又は複数の部位は、少なくともＮ個の部位を含む。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０より多い部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、５００塩基対（ｂｐ）より大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、３つのＣｐＧ部位）を含み得る。本明細書で使用されるように、「１組の部位」は、Ｎ個の部位に対応し得る。

【0106】

各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）の「メチル化指数」は、その部位をカバーするリード総数に対する、その部位でメチル化を示すＤＮＡ断片の（例えば、配列リード又はプローブから決定されるような）割合を指し得る。「リード」は、ＤＮＡ断片から取得された情報（例えば、部位のメチル化状態）に対応し得る。リードは、１つ又は複数の部位における特定のメチル化状態のＤＮＡ断片と優先的にハイブリダイズする試薬（例えば、プライマー又はプローブ）を使用して、取得することができる。典型的に、このような試薬は、それらのメチル化状態に応じて、ＤＮＡ分子を示差的に修飾するか又は認識するプロセス、例えば、亜硫酸水素塩変換、又はメチル化感受性制限酵素、又はメチル化結合タンパク質、又は抗メチルシトシン抗体、あるいはメチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンを認識する単一分子配列決定技術（例えば、単一分子リアルタイム配列決定及びナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）で、処理した後に適用される。メチル化指数は２進値（０又は１）に変換してもよい。例えば、メチル化指数は、実際のメチル化指数が≦０．５の場合、０に再コード化してもよく、メチル化指数は、実際のメチル化指数が＞０．５の場合、１に再コード化してもよい。メチル化指数は、単一ＤＮＡ分子における個別のＣｐＧ部位にわたるメチル化を言及する場合に２進値である。

【0107】

領域の「メチル化密度」は、この領域内の部位におけるメチル化を示すリードの数を領域における部位をカバーするリード総数で割ったものを指し得る。この部位は、具体的な特徴を有し得、例えば、ＣｐＧ部位であり得る。よって、領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、ＣｐＧメチル化を示すリードの数を、この領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内又はそれより大きな領域のＣｐＧ部位）をカバーするリード総数で割ったものを指し得る。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域にマッピングされた配列リードによってカバーされた全てのＣｐＧ部位に占める割合として、ＣｐＧ部位での（メチル化シトシンに対応する）亜硫酸水素塩処理後に変換されていないシトシンの総数から決定することができる。この分析は、５００ｂｐ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、若しくは１Ｍｂ等の他のビンサイズについて実施することもできる。領域は、全ゲノム、又は染色体、又は染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合、その領域のメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの割合」は、この領域において、分析されたシトシン残基の総数に対する、メチル化されている（例えば、亜硫酸水素塩変換後に変換されていない）と示されているシトシン部位「Ｃ」の数を指し得、即ちＣｐＧのコンテキスト外のシトシンを含む。「メチル化レベル」の例としては、メチル化指数、メチル化密度、１つ又は複数の部位でメチル化された分子の個数、及び１つ又は複数の部位でメチル化された分子（例えば、シトシン）の割合が挙げられる。亜硫酸水素塩変換とは別に、当業者に既知の他のプロセスを使用してＤＮＡ分子のメチル化状態を調べることができ、これらのプロセスは、メチル化状態に感受性の酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に感受性のプラットフォームを使用した単一分子配列決定（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１３； １１０： １８９１０－１８９１５）及び単一分子リアルタイム配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０； ７： ４６１－４６５））を含むが、それらに限定されない。

【0108】

「メチローム」は、ゲノムにおける複数の部位又は遺伝子座でのＤＮＡメチル化の量の尺度を提供する。メチロームは、ゲノムの全部、ゲノムの実質的な部分、又はゲノムの比較的僅かな箇所（複数可）に対応し得る。

【0109】

「メチル化プロファイル」は、複数の部位又は領域のＤＮＡ又はＲＮＡメチル化に関する情報を含む。ＤＮＡメチル化に関する情報としては、ＣｐＧ部位のメチル化指数、領域におけるＣｐＧ部位のメチル化密度（ＭＤと略す）、連続領域にわたるＣｐＧ部位の分布、１つより多くのＣｐＧ部位を含有する領域内の各個別のＣｐＧ部位のメチル化パターン又はレベル、及び非ＣｐＧメチル化を含み得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、メチル化プロファイルは、１タイプより多くの塩基（例えばシトシン又はアデニン）のメチル化又は非メチル化のパターンを含み得る。ゲノムの実質的部分のメチル化プロファイルは、メチロームと同等であると見なし得る。哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」とは、典型的に、ＣｐＧジヌクレオチドにおいてのシトシン残基の５’炭素へのメチル基付加（即ち、５－メチルシトシン）を指す。ＤＮＡメチル化は、他のコンテキスト、例えば、ＣＨＧ及びＣＨＨのコンテキストでのシトシンに発生し得、ここでＨはアデニン、シトシン又はチミンである。シトシンのメチル化は、５－ヒドロキシメチルシトシンの形としてもよい。非シトシンメチル化、例えばＮ^６－メチルアデニンも報告されている。

【0110】

「メチル化パターン」とは、メチル化塩基と非メチル化塩基の順序を指す。例えば、メチル化パターンは、単一のＤＮＡ鎖、単一の二本鎖ＤＮＡ分子、又は別のタイプの核酸分子上のメチル化塩基の順序であり得る。一例として、３つの連続するＣｐＧ部位は、ＵＵＵ、ＭＭＭ、ＵＭＭ、ＵＭＵ、ＵＵＭ、ＭＵＭ、ＭＵＵ、又はＭＭＵといったメチル化パターンのいずれかを有し得る。ここで、「Ｕ」は非メチル化部位を示し、「Ｍ」はメチル化部位を示す。この概念をメチル化に限定されない塩基修飾に拡張する場合、修飾塩基と非修飾塩基の順序を指す「修飾パターン」という用語が使用される。例えば、修飾パターンは、単一のＤＮＡ鎖、単一の二本鎖ＤＮＡ分子、又は別のタイプの核酸分子上の修飾された塩基の順序であり得る。一例として、３つの連続する潜在的に修飾可能な部位は、ＵＵＵ、ＭＭＭ、ＵＭＭ、ＵＭＵ、ＵＵＭ、ＭＵＭ、ＭＵＵ、又はＭＭＵといった修飾パターンのいずれかを有し得る。ここで、「Ｕ」は非修飾部位を示し、「Ｍ」は修飾部位を示す。メチル化に基づかない塩基修飾の一例は、８－オキソグアニン等のような酸化的変化である。

【0111】

「高メチル化」及び「低メチル化」という用語は、その単一分子のメチル化レベルによって測定される単一のＤＮＡ分子のメチル化密度、例えば、その分子内のメチル化塩基又はヌクレオチドの数を、その分子内のメチル化可能な塩基又はヌクレオチドの総数で割ったものを指し得る。高メチル化分子は、単一分子のメチル化レベルが閾値以上である分子であり、用途ごとに定義され得る。この閾値は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％であり得る。低メチル化分子は、単一分子のメチル化レベルが閾値以下である分子であり、用途ごとに定義され得、用途ごとに変化し得る。この閾値は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％であり得る。

【0112】

「高メチル化」及び「低メチル化」という用語はまた、これらの分子の複数分子メチル化レベルによって測定される、ＤＮＡ分子の集団のメチル化レベルも指し得る。分子の高メチル化集団は、複数分子メチル化レベルが閾値以上である集団であり、用途ごとに定義され得、用途ごとに変化し得る。この閾値は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％であり得る。分子の低メチル化集団は、複数分子メチル化レベルが閾値以下である集団であり、用途ごとに定義され得る。この閾値は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％であり得る。いくつかの実施形態において、分子の集団は、１つ又は複数の選択されたゲノム領域にアライメントされ得る。いくつかの実施形態において、選択されたゲノム領域（複数可）は、遺伝障害、インプリンティング障害、代謝障害、又は神経障害等の疾患に関連し得る。選択されたゲノム領域（複数可）は、５０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２ｋｎｔ、５ｋｎｔ、１０ｋｎｔ、２０ｋｎｔ、３０ｋｎｔ、４０ｋｎｔ、５０ｋｎｔ、６０ｋｎｔ、７０ｋｎｔ、８０ｋｎｔ、９０ｋｎｔ、１００ｋｎｔ、２００ｋｎｔ、３００ｋｎｔ、４００ｋｎｔ、５００ｋｎｔ、又は１Ｍｎｔの長さを有し得る。

【0113】

「メチル化認識配列決定」とは、配列決定プロセス中にＤＮＡ分子のメチル化状態を確認できるようにする任意の配列決定方法を指し、亜硫酸水素塩配列決定、あるいはメチル化感受性制限酵素消化、抗メチルシトシン抗体若しくはメチル化結合タンパク質を用いた免疫沈降、又はメチル化状態（例えば、亜硫酸水素塩配列決定無し）の解明を可能にする単一分子配列決定が先行する配列決定を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載の任意のこのような配列決定は、超並列配列決定であり得る。「メチル化認識アッセイ」又は「メチル化感受性アッセイ」は、ＭＳＰ、プローブベースの調査、ハイブリダイゼーション、密度測定が続く制限酵素消化、抗メチルシトシン免疫アッセイ、メチル化シトシン又はヒドロキシメチルシトシンの割合の質量分析調査、配列決定が続かない免疫沈降等ような、配列決定及び非配列決定ベースの方法の両方を含み得る。

【0114】

「配列決定深度」という用語は、遺伝子座が、その遺伝子座にアライメントされた配列リードによってカバーされる回数を指す。遺伝子座は、ヌクレオチドの小ささ、又は染色体腕の大きさ、又はゲノム全体の大きさであってもよい。配列決定深度は、５０ｘ、１００ｘ等と表され得、ここで「ｘ」は、遺伝子座が配列リードでカバーされる回数を指す。配列決定深度は、複数の遺伝子座又はゲノム全体に適用することもでき、この場合、ｘはそれぞれ、遺伝子座若しくはハプロイドゲノム又はゲノム全体が配列決定される平均回数を指し得る。ウルトラディープ配列決定は、少なくとも１００ｘの配列決定深度を指し得る。

【0115】

「癌のレベル」という用語は、癌が存在するか否か、癌の病期、腫瘍のサイズ、転移があるか否か、体の総腫瘍負荷、及び／又は癌の重篤度の他の尺度を指し得る。癌のレベルは、数字、又は、記号、アルファベット文字、及び色等の他のしるしであり得る。レベルは、ゼロであり得る。癌のレベルは、変異又はの変異の数に関連する前悪性症状又は前癌性症状（状態）も含む。癌のレベルは、様々な方法で使用され得る。例えば、スクリーニングによって、癌を有することを今まで知らなかった者において癌が存在するか否かをチェックすることができる。評価は、癌と診断されている者を検査して、癌の進行を経時的に監視し、療法の有効性を研究し、又は予後を判定し得る。いくつかの実施形態において、予後は、患者が癌で死亡する確率、又は特定の持続時間若しくは特定の時間後、癌が進行する確率、又は癌が転移する確率として表し得る。検出は、「スクリーニング」を意味し得るか、又は癌の示唆的な特徴（例えば、症状又は他の陽性検査結果）を有する者が癌を有するか否かをチェックすることを意味し得る。

【0116】

「病態のレベル」（又は障害のレベル）は、生物に関連する病態の量、程度、又は重篤度を指し得、そのレベルは、癌について上記で記述した通りであり得る。病態の別の例は、移植された臓器の拒絶反応である。他の病態の例としては、遺伝子インプリンティング障害、自己免疫発作（例えば、腎臓を損傷するループス腎炎又は多発性硬化症）、炎症性疾患（例えば、肝炎）、線維化プロセス（例えば、肝硬変）、脂肪浸潤（例えば、脂肪性肝疾患）、変性プロセス（例えば、アルツハイマー病）、及び虚血性組織損傷（例えば、心筋梗塞又は脳卒中）を含み得る。対象の健康な状態は、病態のない分類と見なし得る。

【0117】

「分離値」は、２つの値、例えば、２つの画分寄与又は２つのメチル化レベルを含む差又は比に対応する。分離値は単純な差又は比であり得る。分離値は他の因子、例えば、乗法的因子を含み得る。他の例として、値の関数の差又は比は、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差として使用され得る。

【0118】

「分離値」及び「集計値」（例えば、相対頻度）は、異なる分類（状態）間で変化するサンプルの測定値を提供するパラメーター（メトリックとも呼ばれる）の２つの例であり、そのため異なる分類の特定に使用できる。集計値は、例えば、クラスタリングで行われるように、サンプルの１組の相対頻度と１組の参照相対頻度間で差が取られる場合の分離値であり得る。

【0119】

「相対存在量」は、ゲノム位置の１つのウィンドウ内で終了するある量（１つの値）の無細胞ＤＮＡ分子を、ゲノム位置の別のウィンドウ内で終了するある量（他の値）の無細胞ＤＮＡ分子と関連付ける分離値の１種に対応し得る。２つのウィンドウは重複し得るが、サイズが異なる。他の実施形態において、２つのウィンドウは重複しない。更に、ウィンドウの幅は、１ヌクレオチドであり得るため、１ゲノム位置に相当し得る。末端密度は、相対存在量の１種である。

【0120】

本明細書で使用される「分類」という用語は、サンプルの特定の特性に関連付けられた任意の数（複数可）又は他の文字（複数可）を指す。例えば、「＋」記号（又は「陽性」という語）は、サンプルが欠失又は増幅を有すると分類されることを表し得る。分類は、二項分類（例えば、陽性又は陰性）であり得るか、又はより多くの分類レベル（例えば、１～１０又は０～１のスケール）を有し得る。「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを上回ると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、それを上回る又は下回ると特定の分類が適用する値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。

【0121】

本明細書で使用される「パラメーター」という用語は、定量的データセット及び／又は定量的データセット間の数値関係を特徴付ける数値を意味する。例えば、第１核酸配列の第１量と第２核酸配列の第２量との比（又は比の関数）はパラメーターである。

【0122】

「サイズプロファイル」という用語は一般に、生体サンプル中のＤＮＡ断片のサイズに関する。サイズプロファイルは、様々なサイズの、ある量のＤＮＡ断片の分布を提供するヒストグラムであり得る。様々な統計パラメーター（サイズパラメーター又は単にパラメーターとも呼ばれる）は、１つのサイズプロファイルを別のサイズプロファイルと区別するために使用することができる。１つのパラメーターは、全てのＤＮＡ断片に対する、又は他のサイズ若しくは範囲のＤＮＡ断片に対する、特定のサイズ若しくはサイズ範囲のＤＮＡ断片の百分率である。

【0123】

「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを上回ると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用されるのを上回る又は下回る値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。カットオフ又は閾値は、「参照値」であり得るか、又は特定の分類を表すか若しくは２つ以上の分類間を区別する参照値から導き出され得る。かかる参照値は、当業者によって理解されるように、様々な方法で決定され得る。例えば、メトリックは、異なる既知の分類を有する対象の２つの異なるコホートについて決定され得、参照値は、１つの分類（例えば、平均）の代表として、又はメトリックの２つのクラスター間の値（例えば、所望の感度及び特異性を取得するために選択された）として選択され得る。別の例として、参照値は、サンプルの統計分析又はシミュレーションに基づいて決定され得る。カットオフ、閾値、参照等の特定の値は、所望の正確度（例えば、感度及び特異性）に基づいて決定することができる。

【0124】

略語「ｂｐ」は塩基対を指す。場合によっては、一本鎖であり塩基対を含まないＤＮＡ断片でも、「ｂｐ」はその長さを示すために使用できる。一本鎖ＤＮＡの文脈において、「ｂｐ」はヌクレオチドとしての長さを提供すると解してもよい。

【0125】

略語「ｎｔ」は、ヌクレオチドを指す。場合によっては、「ｎｔ」を使用して、塩基単位で一本鎖ＤＮＡの長さを示すことができる。また、「ｎｔ」は、分析される遺伝子座の上流又は下流等の相対位置を示すためにも使用され得る。二本鎖ＤＮＡについても、「ｎｔ」は、文脈が別段明確に示さない限り、２本の鎖におけるヌクレオチドの総数ではなく、一本鎖の長さを指し得る。技術的概念化、データ表示、処理及び分析に関する一部の文脈では、「ｎｔ」と「ｂｐ」は互換的に使用される場合がある。

【0126】

「動態特徴」という用語は、単一分子リアルタイム配列決定を含む配列決定から導き出される特徴を指し得る。このような特徴は、塩基修飾分析に使用することができる。動態特徴の例は、上流及び下流の配列構成、鎖情報、パルス間隔、パルス幅、及びパルス強度を含む。単一分子リアルタイム配列決定では、ＤＮＡ鋳型に対するポリメラーゼの活性の影響を継続的に監視している。したがって、このような配列決定から生成された測定値は、動態特徴、例えば、ヌクレオチド配列と見なすことができる。

【0127】

「機械学習モデル」という用語は、サンプルデータ（例えば、訓練データ）を使用して試験データを予測することに基づくモデルを含み得るため、教師あり学習を含み得る。機械学習モデルは、コンピュータ又はプロセッサを使用して開発されることが多い。機械学習モデルは、統計モデルを含み得る。

【0128】

「データ分析フレームワーク」という用語は、データを入力として受け取り、次に予測結果を出力することができるアルゴリズム及び／又はモデルを含み得る。「データ分析フレームワーク」の例としては、統計モデル、数学的モデル、機械学習モデル、他の人工知能モデル、及びそれらの組み合わせを含む。

【0129】

「リアルタイム配列決定」という用語は、配列決定に関与する反応の進行中にデータ収集又は監視を伴う技術を指し得る。例えば、リアルタイム配列決定は、新しい塩基を組み込むＤＮＡポリメラーゼの光学的監視又は撮影を伴う場合がある。

【0130】

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは値の測定若しくは決定方法、即ち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当分野の慣例により、１つ以内又は１つより多くの標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、「約」又は「およそ」という用語は、値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明示しない限り、「約」という用語は特定の値の許容誤差範囲内を意味すると想定すべきである。「約」という用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有し得る。「約」という用語は±１０％を指し得る。「約」という用語は、±５％を指し得る。

【0131】

値の範囲が提供される場合、文脈が別段明確に示さない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在する値も、下限の１０分の１まで具体的に開示されていることが理解される。示された範囲における任意の示された値又は介在する値と、その示された範囲における任意の他の示された又は介在する値との間の各より小さな範囲が本開示の実施形態内に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれるか除外されてもよく、どちらか一方、両方の限界がより小さな範囲に含まれるか、又はどちらも含まれない各範囲も、示された範囲内で特に除外される任意の限界を条件として、本開示内に包含される。示された範囲が一方又は両方の限界を含む場合、それらの限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

【0132】

標準略語は使用され得、例えば、ｂｐは塩基対、ｋｂはキロ塩基、ｐｉはピコリットル、ｓ又はｓｅｃは秒間、ｍｉｎは分間、ｈ又はｈｒは時間、ａａはアミノ酸、ｎｔはヌクレオチド、等である。

【0133】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語と科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味である。本明細書に記載の場合と類似又は相当する任意の方法及び材料が本開示の実施形態の実施又は試験において使用できるが、ここでいくつかの可能な例示的方法及び材料を説明する。

【0134】

本技術は、癌を有する対象及び癌を有さない対象の血漿サンプル中の長い無細胞ＤＮＡ分子の存在、存在量及び配列特徴を分析することを含む。そして、これらの特徴は、対象の疾患分類を特定するために使用できる。これらの長い無細胞ＤＮＡ分子を使用することで、より短い無細胞ＤＮＡ断片では意図されない又は不可能な分析が可能になる。例えば、メチル化ＣｐＧ部位及び一塩基多型（ＳＮＰ）の状態は、生体サンプルのＤＮＡ断片を分析するために使用されることが多い。ＣｐＧ部位及びＳＮＰは、典型的に、最も近いＣｐＧ部位又はＳＮＰから数百又は数千の塩基対離れている。生体サンプル中の大部分の無細胞ＤＮＡ断片の長さは、通常、２００ｂｐ未満である。その結果、大部分の無細胞ＤＮＡ断片上で２つ以上の連続したＣｐＧ部位又はＳＮＰを見つけることは、殆ど不可能又は不可能である。６００ｂｐ又は１ｋｂより長いものを含めて、２００ｂｐより長い無細胞ＤＮＡ断片は、複数のＣｐＧ部位及び／又はＳＮＰを含み得る。長い無細胞ＤＮＡ断片上の複数のＣｐＧ部位及び／又はＳＮＰの存在により、短い無細胞ＤＮＡ断片のみの場合よりも効率的及び／又は正確な分析が可能になる。

【0135】

いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンは、対象の疾患の分類を特定するために使用される。無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンは、１組の部位（例えば、少なくとも３つのＣｐＧ部位）のメチル化状態を含み得る。メチル化状態は、対応する部位がメチル化されたか否かを示すことができる。メチル化パターンを特定するために、メチル化認識配列決定（例えば、単一分子配列決定、ナノポア配列決定）を使用して生体サンプルを配列決定して配列リードを取得してもよく、ここで配列リードの各々はそれぞれのメチル化パターンを含む。長い無細胞ＤＮＡ分子（例えば、サイズが６００ｂｐより大きい）は、比較的多いＣｐＧ部位（例えば、少なくとも３つのＣｐＧ部位）を含み得るので使用できる。

【0136】

配列リードの各々について、配列リードのメチル化パターンを１つ又は複数の参照メチル化パターンと比較する。１つ又は複数の参照メチル化パターンの各々は、複数の組織型のうちの組織型と関連付けてもよい。いくつかの実例において、１つ又は複数の参照メチル化パターンのうちの参照メチル化パターンは分類が既知の疾患と関連付けられる。例えば、比較は、（ｉ）１組の部位の各部位について、配列リードのＣｐＧ部位のメチル化状態と対応するＣｐＧ部位の参照メチル化パターンのメチル化指数との間の類似度メトリックを決定すること、及び（ｉｉ）類似度メトリックに基づいて配列リードの集計値（例えば、合計）を生成することを含み得る。比較に基づき、配列リードの組織分類（例えば、肝臓）を、配列リードのメチル化パターンに最も一致する参照メチル化パターンに基づいて特定することができる。引き続きこの例では、メチル化パターンに最も一致する参照メチル化パターンは、該参照メチル化パターンの集計値が他の参照メチル化パターンの１つ又は複数の他の集計値より大きい場合に、決定できる。組織分類プロセスは、配列リードの組織分類が特定されるまで、配列リードごとに繰り返してもよい。その後、疾患分類を組織分類に基づいて特定できる。例えば、疾患分類は、特定の組織分類（例えば、肝臓、肺、結腸）を有すると分類された配列リードの量に基づいて特定できる。

【0137】

いくつかの実例において、各配列リードのメチル化パターンは機械学習モデルに入力されて配列リードの組織分類を示す出力を生成する。分類は、組織型の特性（例えば、該組織型に由来すると分類された配列リードの量）を特定するために使用できる。組織型の特性は、該組織型に関連する疾患の疾患状態を同定することもできる。

【0138】

いくつかの実例において、無細胞ＤＮＡ分子において検出されたメチル化パターン及び１つ又は複数のバリアント（例えば、多型）は、起源組織を特定するために使用される。例えば、いくつかの血漿ＤＮＡ分子は、白血球に存在しない変異を持ち得る。しかし、それらのそれぞれのメチル化パターンに基づいてこれらの血漿ＤＮＡ分子が肝臓組織に関連すると特定できる。いくつかの実例において、バリアント及びメチル化パターンは機械学習モデルに入力されて出力を生成し、ここで出力は無細胞ＤＮＡ分子の起源組織を特定するために用いられる。

【0139】

無細胞ＤＮＡ分子において検出されたメチル化パターン及び１つ又は複数のバリアント（例えば、多型）は共に使用して癌の分類を特定することができる。例えば、血漿ＤＮＡ分子のバリアント（例えば、一塩基バリアント）及びこれらのバリアント周囲の配列のそれぞれのメチル化パターン（例えば、多数の非メチル化状態）は、一緒に使用して肝細胞癌（ＨＣＣ）の分類を特定することができる。

【0140】

いくつかの実施形態において、長い無細胞ＤＮＡ分子の量は、対象の癌の分類を特定するために使用される。例えば、各無細胞ＤＮＡ分子のサイズが測定される。サイズ範囲（例えば、１０００ｂｐより大きいサイズ）内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の量を特定してもよい。正規化されたパラメーターは、無細胞ＤＮＡ分子の特定された量から決定できる。例えば、正規化されたパラメーターは、第１量を第２サイズ範囲（例えば、１５０ｂｐ未満のサイズ）内の無細胞ＤＮＡ分子の第２量で正規化することで決定できる。いくつかの実例において、正規化されたパラメーターは第１量と第２量の比率値である。そして、正規化されたパラメーターは癌のレベルを特定するために使用できる。

【0141】

いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡ分子の末端モチーフの頻度は疾患の分類を特定するために使用される。生体サンプルは、配列リードを取得するために配列決定される。配列リードの各々について、配列リードの終了配列の各々の配列モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）を特定してもよい。その後、１組のＮ個の配列モチーフの各配列モチーフについて、相対頻度を特定してもよい。例えば、配列モチーフの相対頻度は、１組のＮ個の配列モチーフの他の配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の割合に基づいて特定できる。

【0142】

Ｎ個の頻度のベクターは１組のＮ個のモチーフの相対頻度を使用して特定してもよく、ここでＮ個の頻度の各々は互いに正規化されるか又は参照サンプルの群内の配列モチーフの他の頻度に正規化される。ベクターは複数の参照ベクターと比較してもよい。比較は、ベクターと複数の参照ベクターのうちの参照ベクターとの距離を特定することを含み得る。複数の参照ベクターの各々は疾患の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される。比較に基づき、対象の疾患の分類を特定できる。例えば、分類は、Ｎ個の頻度のベクターとの距離が最も短いと特定された特定の参照ベクターの疾患分類を選択することを含み得る。

【0143】

いくつかの実施形態において、異なるサイズ範囲を有する無細胞ＤＮＡ分子の末端モチーフ頻度は疾患の分類を特定するために使用される。１つ又は複数の配列モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）について、第１モチーフ頻度は、第１サイズ範囲（例えば、１ｋｂより大きいサイズ）内の無細胞ＤＮＡ分子について特定してもよく、第２モチーフ頻度は第２サイズ範囲（例えば、２００ｂｐ未満のサイズ）内の無細胞ＤＮＡ分子について特定してもよい。分離値（例えば、比率値）は、第１モチーフ頻度及び第２モチーフ頻度に基づいて特定できる。分離値は疾患の分類を特定するために使用できる。例えば、分離値は、疾患の分類が既知の参照サンプルを使用して決定されたカットオフ値と比較してもよい。別の例において、分離値は、疾患分類を特定するために機械学習モデルを使用して処理してもよく、ここで機械学習モデル（例えば、ロジスティック回帰、サポートベクターマシン）は疾患の分類が既知の訓練サンプルを使用して訓練されたものである。

【0144】

いくつかの実施形態において、機械学習モデルは、訓練データセットの様々な特徴を使用して訓練されて第１組織及び他の組織からのリードを区別する。区別に基づき、癌分類を特定できる。配列リードは血漿ＤＮＡサンプルから取得してもよい。いくつかの実例において、少なくともいくつかの配列リードは閾値サイズ（例えば、６００ｂｐ）より大きい長さを有する。各配列リードについて、１つ又は複数の特徴が特定される。１つ又は複数の特徴は、配列リードについて、参照ゲノムにおける末端の位置、配列構成、サイズ、１つ又は複数の末端での配列モチーフ、又はＤＮＡメチル化パターンを含み得る。特徴は訓練された機械学習モデルに入力してもよい。機械学習モデルは、配列リードの分類を特定するために使用できる出力を生成できる。分類は、配列リードが第１組織型に由来するかそれとも別の組織型に由来するかを同定できる。その後、配列リードの分類は、疾患の分類を特定するために使用してもよい。例えば、第１組織型に由来すると分類された配列リードの量を特定してもよく、該量を疾患分類の特定に使用してもよい。

【0145】

いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡ分子の単一分子メチル化レベルは、対象の病態のレベルを特定するために使用される。例えば、メチル化部位の百分率は、複数の無細胞ＤＮＡ分子の各ＤＮＡ分子について特定される。いくつかの実例において、複数の無細胞ＤＮＡ分子は閾値（例えば、５００ｂｐ）を上回るサイズを有する。複数の無細胞ＤＮＡ分子のメチル化部位の特定された百分率は、統計値（例えば、代表値、中央値）を決定するために使用できる。統計値は病態を特定するために参照と比較してもよい。

【0146】

長い無細胞ＤＮＡ分子の分析は、これまで未踏の癌検出及び評価に付加価値を提供できる。無細胞ＤＮＡ分子が長いほど、ＣｐＧ部位が多く存在するため、短い分子よりも、そのメチル化パターン、プロファイル又はハプロタイプの特異性が高くなれる。したがって、メチル化及び非メチル化部位順の順列は大幅に大きくなる。これにより、任意の特定の組織を起源とするＤＮＡ分子の同定、つまり起源組織分析が改善できる。

【0147】

かかる起源組織分析は、ショートリード配列決定を使用して短い無細胞ＤＮＡ分子を分析するこれまで知られていた技術とは区別される。短い無細胞ＤＮＡ分子上の限られた数のＣｐＧ部位により、以前の方法は、短い無細胞ＤＮＡ分子の集団／複数の短い無細胞ＤＮＡ分子に対して集団統計を使用して血漿サンプル中の無細胞ＤＮＡ含有量のメチル化プロファイルを組み立てていた。このアプローチでは、様々な組織又は臓器を起源とする無細胞ＤＮＡ分子の相対的な寄与度を推測することしかできなかった。長い無細胞ＤＮＡ分子上の数がより多いＣｐＧ部位によって付与されたＤＮＡメチル化パターン特異性により、このような個別の長い無細胞ＤＮＡ分子の起源組織の特定が実行可能であると考えられる。言い換えれば、個別の分子は起源組織又は起源臓器に割り当てられ得る。

【0148】

長い無細胞ＤＮＡ分子を分析する別の予想される利点は、該分子上の配列バリアントを同分子上の隣接ＣｐＧのメチル化情報と結び付けることができる潜在力にある。実際、長い無細胞ＤＮＡ分子の分析では、かかる分子上で２つ以上の分子的（例えば先天的又は後天的）特徴の分析が可能である。例としては、（ｉ）２つ以上の配列バリエーション（例えば点変異、マイクロサテライトバリエーション等）、（ｉｉ）２つ以上の後天的バリエーション（例えば２つ以上の高又は低メチル化ＣｐＧ部位）、及び（ｉｉｉ）先天的及び後天的変化の異なる組み合わせを含む。加えて、悪性腫瘍は細胞死率がより高いと知られているため、腫瘍から放出された長い無細胞ＤＮＡ分子の存在量は、非腫瘍組織と異なる場合がある。本開示では、癌及び自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、外傷、虚血、壊死等に限定されない多くの他の疾患の検出及び監視を可能にするために、長い無細胞ＤＮＡ断片を分析するいくつかのアプローチが発明されている。いくつかの実施形態において、本開示で提示されるアプローチは予後、リスク階層化、治療指導等に使用され得る。
Ｉ．長い無細胞ＤＮＡ分子を分析するための技術

【0149】

癌を有する患者及び癌を有さない対象の血漿サンプルから無細胞ＤＮＡを採取した。かかる無細胞ＤＮＡを、メチル化ハプロタイプ分析、個別の血漿ＤＮＡ分子の起源組織、断片サイズプロファイリング、血漿ＤＮＡ末端分析、不揃い末端分析、マイクロサテライト不安定性等に限定されない様々な分析のために単一分子配列決定に供した。長い無細胞ＤＮＡ分子の様々な特徴（例えば、メチル化状態、不揃い末端）を同定するための技術に関する情報は、全ての内容があらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／９９５，６０７号に更に記載されている。
Ａ．生体サンプル中の長い無細胞ＤＮＡ分子の検出

【0150】

図１は、いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子を分析する一例の概要を図示する概略図１００を示す。一例において、分析は、配列決定、例えば、単一分子配列決定を含み得る。単一分子配列決定は、単一分子リアルタイム配列決定（即ちＳＭＲＴ－ｓｅｑ）（例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑによる）及びナノポア配列決定（例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を含み得るが、それらに限定されない。各配列決定されたＤＮＡ分子のヌクレオチドは、配列決定プロセス中に生成された電気信号又は光信号に応じて同定できる。同定されたヌクレオチドは対応する長い無細胞ＤＮＡ分子の後続の分析に使用できる。追加的に又は代替的に、他の配列決定技術を使用して長い無細胞ＤＮＡを検出してもよい。例えば、クラスターベースの配列決定は、所与の断片の各末端（例えば、２００ｂｐ以上）を配列決定することで、同定されたヌクレオチド配列（例えば、４００ｂｐ以上）の配列リードを生成することを含み得る。

【0151】

例えば、血漿ＤＮＡの長さは配列に存在するヌクレオチドの数を計数することで特定され得る。血漿ＤＮＡの４－ｍｅｒ末端モチーフはその末端で４ヌクレオチドを分析することで特定され得る。同様に、いくつかの実施形態において、１－ｍｅｒ、２－ｍｅｒ、３－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、又は他の組み合わせに限定されない末端モチーフの他のタイプは使用され得る。

【0152】

いくつかの実施形態において、癌対象と非癌対象の間の血漿ＤＮＡ分子の分析も不揃い末端（即ち一本鎖の突出末端（複数可）を持つ元の二本鎖）及びマイクロサテライト不安定性を含み得る。マイクロサテライト不安定性とは、通常１～６ヌクレオチド反復のマイクロサテライトが、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失／挿入に対応する変異を蓄積するゲノム変化を指す。

【0153】

いくつかの実施形態において、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑを使用すると、血漿ＤＮＡ分子における一連のＣｐＧ部位にわたってメチル化状態を、以前に刊行したアプローチ（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０２１；１１８： ｅ２０１９７６８１１８）に限定されないアプローチに従って測定ウィンドウにおけるＤＮＡポリメラーゼ動態信号を分析することで、特定することができる。追加的に又は代替的に、ナノポア配列決定を使用すると、血漿ＤＮＡ分子における一連のＣｐＧ部位にわたってメチル化状態を、米国出願第６３／１７３，７２８号に提示されたツール、刊行したアプローチ、例えばオープンソースソフトウェアＮａｎｏｐｏｌｉｓｈ（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７；１４：４０７－４１０）、ＤｅｅｐＭｏｄ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１９；１０：２４４９）、Ｔｏｍｂｏ（Ｓｔｏｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＲｘｉｖ． ２０１７：ｐ．０９４６７２）、ＤｅｅｐＳｉｇｎａｌ（Ｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１９；３５：４５８６－４５９５）、Ｇｕｐｐｙ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ）、Ｍｅｇａｌｏｄｏｎ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ／ｍｅｇａｌｏｄｏｎ）等に限定されないものに従って、ナノポアを通過するＤＮＡ分子に応じて電気信号を分析することで、特定することができる。いくつかの実施形態において、メチル化パターンは、化学変換（例えば亜硫酸水素塩）又は酵素変換（例えばＴＥＴ２及びＡＰＯＢＥＣ）の処理及びそれに続くＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑ及び／又はナノポア配列決定により取得され得る。酵素変換により、非メチル化シトシンは、チミンとして増幅及び配列決定されるウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは不変のままである。よって、メチル化状態は、参照ゲノムにおけるＣｐＧ部位全体にわたってチミン（非メチル化シグナル）又はシトシン（メチル化シグナル）を検出することで特定できる。

【0154】

いくつかの実施形態において、配列決定されたリードはＭｉｎｉｍａｐ２（Ｌｉ Ｈ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１８；３４（１８）：３０９４－３１００）を使用してヒト参照ゲノムにアライメントされる。いくつかの実施形態において、配列決定されたリードを参照ゲノムにアライメントさせるために、ＢＬＡＳＲ（Ｍａｒｋ Ｊ Ｃｈａｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１２； １３： ２３８）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０；２１５（３）：４０３－４１０）、ＢＬＡＴ（Ｋｅｎｔ ＷＪ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００２；１２（４）：６５６－６６４）、ＢＷＡ（Ｌｉ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１０；２６（５）：５８９－５９５）、ＮＧＭＬＲ（Ｓｅｄｌａｚｅｃｋ ＦＪ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１８；１５（６）：４６１－４６８）、及びＬＡＳＴ（Ｋｉｅｌｂａｓａ ＳＭ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１１；２１（３）：４８７－４９３）が使用される。いくつかの実施形態において、配列決定されたリードのアライメントは使用されない。
Ｂ．長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化状態の特定

【0155】

本明細書に記載のように、ＣｐＧ部位全体にわたるメチル化状態は、ＳＭＲＴ配列決定中に生成された動態特徴を分析することで取得することができる。例えば、例示の目的でＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＭＲＴ配列決定を単一分子リアルタイム配列決定の例とすると、ＤＮＡポリメラーゼ分子がゼロモード導波路（ＺＭＷ）として機能するウェルの底部に配置される。ＺＭＷは、光を小さな観測量に閉じ込めるためのナノ光デバイスであり、直径が非常に小さな穴であり得、検出に使用される波長範囲の光の伝播を許容せず、それによって、固定化ポリメラーゼによって組み込まれた色素標識ヌクレオチドからの光信号の発光のみが、低い一定のバックグラウンド信号に対して検出可能となる（Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ヌクレオチドの相補的な核酸鎖への組み込みを触媒する。

【0156】

図２は、単一分子リアルタイム配列決定によって配列決定されたメチル化及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位を持つ分子２００の例を示す。ＤＮＡ分子は、固定化ＤＮＡポリメラーゼに結合する環状化分子を形成しＤＮＡ合成を開始するように、最初にヘアピンアダプターに連結された。図２中、ＤＮＡ分子２０２は、ヘアピンアダプターに連結されて連結分子２０４を形成する。その後、連結分子２０４は環状化分子２０６を形成する。ＣｐＧ部位を有さない分子も配列決定され得る。環状化分子２０６は、依然として配列決定され得る非メチル化ＣｐＧ部位２０８を含む。

【0157】

血漿ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位全体にわたるメチル化状態（本明細書でメチル化ハプロタイプという）が特定されていると、血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプを様々な組織のメチル化ハプロタイプと比較してその血漿ＤＮＡ分子の起源組織を特定することができる。言い換えれば、メチル化ハプロタイプを、単一ＤＮＡ分子における１つ又は複数のＣｐＧ部位にわたるメチル化パターンと定義した。例えば、「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－」はメチル化ハプロタイプを表し、メチル化ＣｐＧとそれに続く非メチル化ＣｐＧとそれに続く３つの連続したメチル化ＣｐＧ部位を示した。「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－」及び「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－」のメチル化ハプロタイプ情報は異なった。前述した組織としては、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、巨核球、赤血球、単球、ＮＫ細胞、肝臓、肺、食道、心臓、膵臓、結腸、小腸、脂肪組織、副腎、脳、乳房、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮等を含み得るが、それらに限定されない。組織は、膀胱癌、乳癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌等のような癌に関与し得るが、それらに限定されない。
１．動態特徴

【0158】

本開示に記載の方法のいくつかの実施形態は、測定ウィンドウ内の全ての塩基のパルス間隔（ＩＰＤ）、パルス幅（ＰＷ）、及び配列構成を測定・利用することに基づくものである。複数のメトリックの組み合わせを使用できれば、例えば、上流及び下流配列構成、鎖情報、ＩＰＤ、パルス幅並びにパルス強度等の特徴を同時に利用できれば、単一塩基分解能での塩基修飾の正確な測定（例えばｍＣ検出）を達成できる可能性があると推測した。配列構成とは、ＤＮＡのストレッチにおける塩基組成（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）及び塩基順序を指す。かかるＤＮＡのストレッチは、塩基修飾分析の対象又は標的である塩基を囲み得る。１つの実施形態において、ＤＮＡのストレッチは、塩基修飾分析の対象である塩基に近接し得る。別の実施形態において、ＤＮＡのストレッチは、塩基修飾分析の対象である塩基から遠く離れ得る。ＤＮＡのストレッチは、塩基修飾分析の対象である塩基の上流及び／又は下流にあり得る。

【0159】

１つの実施形態において、塩基修飾分析に使用するための上流及び下流配列構成、鎖情報、ＩＰＤ、パルス幅並びにパルス強度の特徴は、動態特徴と呼ばれる。

【0160】

修飾及び／又は塩基を酵素的に又は化学的に変換することなく、塩基における修飾を検出する技術が求められる。本明細書に記載のように、標的塩基における修飾は、標的塩基周囲の塩基の単一分子リアルタイム配列決定から取得された動態特徴データを使用して検出され得る。動態特徴は、パルス間隔、パルス幅、及び配列構成を含み得る。これらの動態特徴は、標的塩基の上流及び下流の一定数のヌクレオチドの測定ウィンドウについて取得され得る。（例えば、測定ウィンドウにおける特定の位置での）これらの特徴は、機械学習モデルの訓練に使用できる。サンプル調製の例として、ＤＮＡ分子の２本の鎖をヘアピンアダプターに接続することで、環状ＤＮＡ分子を形成してもよい。環状ＤＮＡ分子により、Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ鎖のいずれか又は両方の動態特徴を取得することが可能になる。測定ウィンドウにおける動態特徴に基づいてデータ分析フレームワークを開発することができる。このデータ分析フレームワークは、メチル化を含む修飾の検出に使用され得る。本セクションでは修飾を検出するための様々な技術を説明する。

【0161】

図３は、いくつかの実施形態に係る、無細胞ＤＮＡ分子の動態特徴を特定するプロセス例を図示する概略図３００を示す。図３に示すように、例として、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＭＲＴ配列決定からＷａｔｓｏｎ鎖のサブリードを取得して塩基修飾の状態に関して１つの特定の塩基を分析した。図３中、塩基修飾分析に供された塩基の各側からの３塩基は測定ウィンドウ３００と定義される。１つの実施形態において、これら７塩基（即ち塩基修飾分析のための３ヌクレオチド（ｎｔ）の上流配列及び下流配列並びに１つのヌクレオチド）の配列構成、ＩＰＤ、及びＰＷを、測定ウィンドウとしての２次元（即ち２Ｄ）行列内にコンパイルした。示される例において、測定ウィンドウ３００はＷａｔｓｏｎ鎖の１つのサブリードに用いられる。他の変形は本明細書で説明される。

【0162】

行列の１行目３０２は、試験された配列を示した。行列の２行目３０４において、０の位置は塩基修飾分析用の塩基を表した。－１、－２、及び－３の相対位置は、それぞれ、塩基修飾分析に供された塩基の上流の位置１－ｎｔ、２－ｎｔ、及び３－ｎｔを示した。＋１、＋２、及び＋３の相対位置は、それぞれ、塩基修飾分析に供された塩基の下流の位置１－ｎｔ、２－ｎｔ及び３－ｎｔを示した。各位置は、対応するＩＰＤ及びＰＷ値を含有する２列を含む。次の４行（行３０８、３１２、３１６、及び３２０）は、それぞれ、鎖（例えばＷａｔｓｏｎ鎖）におけるヌクレオチドの４タイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）に対応した。行列におけるＩＰＤ及びＰＷ値の存在は、特定の位置でどの対応するヌクレオチドタイプが配列決定されたかに依存した。図３に示すように、０の相対位置で、ＩＰＤ及びＰＷ値はＷａｔｓｏｎ鎖において「Ｇ」を示す行に表示され、これは、その位置での配列結果においてグアニンが判読されたことを示唆する。配列決定された塩基に対応しない列における他の格子は、「０」とコード化される。例として、２Ｄデジタル行列（図３）に対応する配列情報は、Ｗａｔｓｏｎ鎖について５’－ＧＡＴＧＡＣＴ－３’である。

【0163】

図４は、いくつかの実施形態に係る、無細胞ＤＮＡ分子の動態特徴を特定する別のプロセス例を図示する概略図４００を示す。図４に記載の１つの実施形態に示すように、測定ウィンドウをＣｒｉｃｋ鎖からのデータに適用してもよい。単一分子リアルタイム配列決定からＣｒｉｃｋ鎖のサブリードを取得して塩基修飾の状態に関して１つの特定の塩基を分析した。図４中、塩基修飾分析に供された塩基の各側からの３塩基及び塩基修飾分析に供された塩基は測定ウィンドウと定義される。１つの実施形態において、これら７塩基（即ち塩基修飾分析のための３ヌクレオチド（ｎｔ）の上流配列及び下流配列並びに１つのヌクレオチド）の配列構成、ＩＰＤ、ＰＷを測定ウィンドウとしての２次元（即ち２Ｄ）行列にコンパイルした。

【0164】

行列の１行目は試験された配列を示した。行列の２行目において、０の位置は、塩基修飾分析用の塩基を表した。－１、－２、及び－３の相対位置は、それぞれ、塩基修飾分析に供された塩基の上流の位置１－ｎｔ、２－ｎｔ及び３－ｎｔを示した。＋１、＋２、及び＋３の相対位置は、それぞれ、塩基修飾分析に供された塩基の下流位置１－ｎｔ、２－ｎｔ及び３－ｎｔを示した。各位置は、対応するＩＰＤ及びＰＷ値を含有する２列を含む。次の４行は、この鎖（例えばＣｒｉｃｋ鎖）におけるヌクレオチドの４タイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）に対応した。行列におけるＩＰＤ及びＰＷ値の存在は、特定の位置でどの対応するヌクレオチドタイプが配列決定されたかに依存した。図４に示すように、０の相対位置で、ＩＰＤ及びＰＷ値はＣｒｉｃｋ鎖において「Ｔ」を示す行に表示され、これは、その位置での配列結果においてチミンが判読されたことを示唆する。配列決定された塩基に対応しない列における他の格子は「０」とコード化される。例として、２Ｄデジタル行列（図４）に対応する配列情報は、Ｃｒｉｃｋ鎖について５’－ＡＣＴＴＡＧＣ－３’である。
２．機械学習モデル

【0165】

機械学習モデルについて、サブリードの入力データ構造は訓練に使用できる。入力データ構造は、サンプル核酸分子において配列決定されたヌクレオチドのウィンドウに対応し得る。訓練セットは、メチル化状態が既知の部位を有してもよい。各訓練サンプルは、第１の複数の第１データ構造の１つ及び標的位置でのヌクレオチドの修飾（例えば、メチル化）の第１状態を示すラベルを含み得る。訓練は、第１の複数の第１データ構造及び任意に第２の複数の第２データ構造がモデルに入力される時、第１ラベル及び任意に第２ラベルのうちの対応するラベルにマッチする又はマッチしないモデルの出力に基づいてモデルのパラメーターを最適化することで、行われる。モデルの出力は、それぞれのウィンドウにおける標的位置でのヌクレオチドが修飾を有するか否かを指定する。いくつかの実施形態において、モデルの出力は、複数の状態の各々にある確率を含み得る。最も高い確率を有する状態はその状態と取ることができる。

【0166】

モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を含み得る。ＣＮＮは、第１の複数のデータ構造及び任意に第２の複数のデータ構造をフィルタするように構成された１組の畳み込みフィルタを含み得る。フィルタは、本明細書に記載の任意のフィルタであり得る。各層のフィルタの数は、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、又はそれ以上であり得る。フィルタのカーネルサイズは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５～２０、２０～３０、３０～４０、又は以上であり得る。ＣＮＮは、フィルタされた第１の複数のデータ構造及び任意にフィルタされた第２の複数のデータ構造を受信するように構成された入力層を含み得る。ＣＮＮは、複数のノードを含む複数の隠れ層も含み得る。複数の隠れ層の最初の層が入力層に結合された。ＣＮＮは、複数の隠れ層の最後の層に結合され、出力データ構造を出力するように構成された出力層を更に含み得る。出力データ構造は特性を含み得る。

【0167】

モデルは、教師あり学習モデルを含み得る。教師あり学習モデルは、分析的学習、人工ニューラルネットワーク、誤差逆伝播、ブースティング（メタアルゴリズム）、ベイズ統計、事例ベース推論、決定木学習、帰納論理プログラミング、ガウス過程回帰、遺伝的プログラミング、データ処理のグループ法、カーネル推定器、学習オートマトン、学習分類器システム、最小メッセージ長（決定木、決定グラフ等）、多重線形部分空間学習、ナイーブベイズ分類器、最大エントロピー分類器、条件付き確率場、最近傍アルゴリズム、確率的で近似的に正しい学習（ＰＡＣ）学習、リップルダウンルール、知識獲得法論、シンボリック機械学習アルゴリズム、サブシンボリック機械学習アルゴリズム、サポートベクトルマシン、最小複雑性マシン（ＭＣＭ）、ランダムフォレスト、分類器のアンサンブル、通常分類、データ事前処理、不均衡データセットの処理、統計的関係学習、又は多基準分類アルゴリズムＰｒｏａｆｔｎを含む、様々なアプローチ及びアルゴリズムを含み得る。モデルは、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、長短期メモリ、ＬＳＴＭ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は本明細書に記載の任意のモデルであり得る。
ＩＩ．長い無細胞ＤＮＡ分子の頻度ベースの分析

【0168】

血漿中に存在する長い無細胞ＤＮＡ分子の量は、特定の対象の疾患状態に依存し得る。例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する対象の生体サンプル中に存在する長い無細胞ＤＮＡ分子の第１量は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）保菌者である別の対象の生体サンプル中に存在する長い無細胞ＤＮＡ分子の第２量より小さい場合がある。このため、ＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者の長い無細胞ＤＮＡ分子は、単一分子リアルタイム配列決定（例えば、ＰａｃＢｉｏシーケンサーによる）を使用して配列決定してこれらの量ベースの特徴を同定することができる。

【0169】

いくつかの実施形態において、長いＤＮＡ分子は、５００ｂｐ、６００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ以上、又は１０ｋｂを上回る長さを有するＤＮＡ分子として定義される。いくつかの実例において、長いＤＮＡ分子は、サイズ範囲内のサイズを有すると定義される。サイズ範囲は、下限及び上限を含み得る。下限は、長いＤＮＡ分子と見なされる無細胞ＤＮＡ分子の最小サイズを同定する。例えば、サイズ範囲の下限は、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐを含む。逆に、上限は、長いＤＮＡ分子と見なされる無細胞ＤＮＡ分子の最大サイズを同定する。例えば、サイズ範囲の上限は、少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、又は１０ｋｂ以上を含む。いくつかの実例において、サイズ範囲は下限のみを指定し、上限を指定しない。上記の長さは非限定的であり、他のタイプの長さが考慮され得る。
Ａ．長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた頻度ベースの分析と短い無細胞ＤＮＡ分子を用いた頻度ベースの分析との比較

【0170】

慢性Ｂ型肝炎感染症を有する５人の患者（ＨＢＶ保菌者）及びＨＣＣを有する１９人の患者からの血漿ＤＮＡサンプルを、ＳＭＲＴｂｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定鋳型構築に供した。ＤＮＡを１．８×ＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズで精製し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してライブラリサイズを推定した。配列決定プライマーのアニーリング及びポリメラーゼの結合条件をＳＭＲＴ Ｌｉｎｋ ｖ１０．１ソフトウェア（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計算した。要するに、配列決定プライマーｖ４を配列決定鋳型にアニールし、その後Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｋｉｔ ２．１及びＩｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ １．０（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してポリメラーゼを鋳型に結合した。配列決定をＳＭＲＴ Ｃｅｌｌ ８Ｍ上で行った。Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２．０ Ｋｉｔ （Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して配列決定の動画を３０時間収集した。中央値が３１４，４７７の配列決定されたリード（四分位範囲（ＩＱＲ）：１２８，７９１～５６１，０１８）を取得した。血漿ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位全体にわたるＤＮＡメチル化状態を、ＨＫモデル（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０２１；１１８； ｅ２０１９７６８１１８）に従って特定した。比較のために、ショートリード配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）を同血漿ＤＮＡサンプルに対して行った。各配列リードの長さを、ＨＣＣサンプルに対応する配列リードについて特定した。５００ｂｐを上回る長さを有する配列リードのサイズ分布を、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー結果及びＳＭＲＴ配列結果ごとに同定した。

【0171】

図５は、いくつかの実施形態に係る、様々な配列決定技術にわたって５００ｂｐより大きい長さを有する血漿ＤＮＡ断片の割合を同定するグラフ５００を示す。図５は、ＨＣＣを有する患者における＞５００ｂｐの血漿ＤＮＡ断片の割合が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定結果（中央値：０．６８％、範囲：０．３４％～１．２４％）よりも、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ－ｓｅｑ）結果（中央値：２２．８８％、範囲：１１．６４％～４０．４６％）の方が遥かに高いことを示す（Ｐ値＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定）。データは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に基づいては調査できなかった実質的な量の長い血漿ＤＮＡ分子が存在することを示唆した。

【0172】

図６は、１人のＨＣＣ対象６０２及び１人のＨＢＶ保菌者６０４のサイズ分布を図示する折れ線グラフ６００を示す。ＳＭＲＴ－ｓｅｑを使用してサンプルの各々の配列リードを生成した。Ｙ軸は、対数スケール（例えば、サイズ分布の正規化されたパラメーター）で示される頻度値に対応する。両方のサイズプロファイルとも、１６６ｂｐ、３３３ｂｐ、５００ｂｐ、６６３ｂｐ、８３０ｂｐ、９９４ｂｐ等でのヌクレオソームサイズのピークを表示した。１ｋｂより長い長ＤＮＡの頻度は、ＨＢＶ保菌者よりも、ＨＣＣを有する患者の方が速く低下するようであった。いくつかの実施形態において、サイズプロファイルの変化を利用してＨＣＣを有する患者と有さない患者を区別することができる。

【0173】

上記の結果は、腫瘍サンプルのサイズ分布が疾患分類に使用できることを示す。いくつかの実例において、サンプルが癌を含むか否かを分類するためにカットオフが決定される。カットオフは、特定の長さ（例えば、６００ｂｐ）以上の長さを有する無細胞ＤＮＡ分子の特定の量又は頻度を表す正規化されたパラメーターに対応し得る。
Ｂ．長いＤＮＡ分子の頻度に基づく疾患の組織学的状態予測

【0174】

ＨＣＣにおける血管浸潤は全身性腫瘍播種の前提条件であり、移植又は腫瘍切除後の腫瘍再発の最良の予測因子である（Ｔｈｕｌｕｖａｔｈ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２００９；４３：１０１－２）。循環血漿ＤＮＡ濃度が血管浸潤状態（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｓ． ２０１２；１８： ２７１－２７６）及び腫瘍関連変異（Ｏｖｅｒｓｏｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０２０；５５：１４３３－１４４０； Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１６； ７：４０４８１－４０４９０）に相関することを示唆したいくつかの試験があるが、ｃｆＤＮＡのサイズ特徴が血管浸潤に関連するか否かは不明である。

【0175】

ＤＮＡ分子における血管浸潤に関連するサイズ特徴を探究するために、単一分子リアルタイム配列決定を使用してＨＣＣ患者における血漿ＤＮＡを試験した。コホートにおいて、１８人の患者が血管浸潤を有したが、２７人の患者が血管浸潤を有さなかった。図７は、血管浸潤を有するＨＣＣ患者７０２及び血管浸潤を有さないＨＣＣ患者７０４について所与のサイズを上回るｃｆＤＮＡ断片の百分率を同定する棒グラフ７００を示す。赤棒は、血管浸潤を有するＨＣＣ症例を示し、青緑棒は、血管浸潤を有さないＨＣＣ症例を示す。加えて、ｘ軸は、所与のサイズカットオフ（例えば、２００ｂｐ、５００ｂｐ、２ｋｂｐ）より長いＤＮＡ分子の百分率を示す。図７に示すように、血管浸潤を有する対象の血漿ＤＮＡは、血管浸潤を有さない対象より短いサイズ分布を持ち、この差異は２ｋｂのサイズまで明らかであるが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定等の以前の配列決定方法ではこれを明らかにすることはできなかった。

【0176】

いくつかの実施形態において、特定のサイズより大きい（例えば、≧２００ｂｐ、≧５００ｂｐ、≧６００ｂｐ、≧１ｋｂ、≧２ｋｂ、≧３ｋｂ、≧４ｋｂ、≧５ｋｂ、≧１０ｋｂ、他の組み合わせ）ＤＮＡ断片の百分率は、癌患者の血管浸潤状態を非侵襲的に予測するために使用できる。図８は、血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者における＞２００ｂｐの長いＤＮＡ断片の百分率を同定する箱ひげ図９００を示す。ＳＭＲＴ配列決定を使用して長いＤＮＡ分子を同定した。図８に示すように、血管浸潤を有するＨＣＣ患者は、＞２００ｂｐの長いＤＮＡ断片の百分率が有意に低く（Ｐ値：０．０１５、マンホイットニーＵ検定）、ＨＣＣ患者の血管浸潤状態予測での使用可能性が示唆された。更に、血管浸潤状態予測での使用可能性は、非侵襲方式での再発リスクの評価及び予後を可能にすることができる。

【0177】

追加的に又は代替的に、長いＤＮＡ断片と短いＤＮＡ断片のサイズ比は、癌患者における血管浸潤状態予測に非侵襲的に使用できる。図９は、血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者のサイズ比を同定する箱ひげ図９００を示す。血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者のサイズ比を、長いＤＮＡ断片（＞５００ｂｐ）の割合を短いＤＮＡ断片（＜１５０ｂｐ）で割ることで算出した。図９に示すように、血管浸潤を有するＨＣＣ患者は、血管浸潤を有さないＨＣＣ患者よりも、サイズ比が有意に低い（Ｐ値：０．００４、マンホイットニーＵ検定）。図９の結果は、ＨＣＣ患者の血管浸潤状態予測及び非侵襲方式での再発リスク評価と予後の実現におけるその使用可能性を示す。
Ｃ．長い無細胞ＤＮＡ分子の頻度ベースの分析方法

【0178】

図１０は、いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子の頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を描くフローチャート１０００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては癌に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0179】

ステップ１００２で、生体サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子のサイズを測定してもよい。例えば、単一分子リアルタイム配列決定（即ちＳＭＲＴ－ｓｅｑ）（例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑによる）及びナノポア配列決定（例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して無細胞ＤＮＡ分子のヌクレオチドを同定・計数することができる。無細胞ＤＮＡ分子のサイズを特定するためにヌクレオチドの数を計数してもよい。他の実施形態において、ＤＮＡ分子の各末端での配列リードを配列決定してもよく、リードの対を参照ゲノムにアライメントしてＤＮＡ分子のサイズを特定してもよい。

【0180】

ステップ１００４で、第１サイズ範囲内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の第１量を測定してもよい。第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含む。いくつかの実例において、第１サイズ範囲は、ゼロより大きい下限を含む。下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択されてもよい。したがって、サイズ範囲のいくつかの例は、３００～１０００ｂｐ、３００～３０００ｂｐ、３００～８００ｂｐ、４００～８００ｂｐ、４００～１５００ｂｐ、及び５００～３０００ｂｐである。

【0181】

追加的に又は代替的に、第１量の無細胞ＤＮＡ分子は、１つ又は複数の配列モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）に対応する終了配列を有し得る。１つ又は複数の配列モチーフを有する無細胞ＤＮＡ分子を特定するために、配列リードが生体サンプルからの複数の無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得される。配列リードの各々について、配列モチーフは、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々について特定される。終了配列における１組の１つ又は複数の配列モチーフのうちの少なくとも１つを有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の群を特定してもよい。そして、第１量は、第１サイズ範囲を有する複数の無細胞ＤＮＡ分子の群のサブグループの量である。

【0182】

ステップ１００６で、第１量を使用して正規化されたパラメーターの値を生成してもよい。正規化されたパラメーターは、生体サンプル中の第１サイズ範囲内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の頻度であり得る。いくつかの実例において、正規化されたパラメーターは、対数スケールで正規化された、生体サンプル中の第１サイズ範囲内のサイズを有する無細胞ＤＮＡ分子の頻度であり得る。他の例において、第２サイズ範囲内の無細胞ＤＮＡ分子の第２量は第１量の正規化に使用され得る。第２サイズ範囲は第１サイズ範囲と異なってもよい。例えば、第２サイズ範囲は第１サイズ範囲未満（例えば、１～１５０ｂｐ）であってもよい。

【0183】

ステップ１００８で、正規化されたパラメーターを使用して癌のレベルの分類を特定してもよい。例えば、正規化されたパラメーターをカットオフ値と比較してもよい。いくつかの実例において、サンプルが癌を含むか否かを分類するためにカットオフが決定される。カットオフは、特定の長さ（例えば、６００ｂｐ）以上の長さを有する参照サンプルの無細胞ＤＮＡ分子の特定の量又は頻度を表す正規化されたパラメーターに対応し得、ここで参照サンプルは、レベルの分類が既知の癌に関連する。カットオフ値又は比較は、訓練データセットによる機械学習、例えば、図６からの訓練サンプルを使用して決定され得る。

【0184】

他の方法のためのカットオフ値及び比較も、訓練データセットによる機械学習を使用して決定され得る。正規化されたパラメーターとカットオフ（参照）の比較は、例えば、教師あり学習を使用して訓練された機械学習モデルに関与し得る。いくつかの実例において、カットオフ値は、レベルの分類が既知の癌を有する参照サンプルを含む１つ又は複数の訓練データセットを使用して決定される。例えば、正規化されたパラメーター又は分離値（及び場合によっては他の基準、例えばコピー数、及びメチル化レベル）、及び訓練サンプルが採取された分類が既知の訓練対象は、訓練データセットを形成することができる。機械学習モデルのパラメーターは、癌のレベルを分類する最適化精度を提供するように、訓練セットに基づいて最適化されてもよい。機械学習モデルの例としては、ニューラルネットワーク、決定木、クラスタリング、及びサポートベクターマシンを含む。

【0185】

癌のレベルは、癌無し、早期、中期、又は進行期を含み得る。そして分類はレベルのうちの１つから選択され得る。したがって、分類は、癌の複数の病期を含む癌の複数のレベルから特定できる。例として、癌は肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、及び頭頸部扁平上皮癌であり得る。疾患分類の特定は、癌の組織学的状態、例えば、血管浸潤の有無を含み得る。
ＩＩＩ．長い無細胞ＤＮＡ分子及び短い無細胞ＤＮＡ分子の末端モチーフ分析

【0186】

生体サンプルの無細胞ＤＮＡ分子の末端モチーフは、同定して疾患分類に使用することができる。ショートリード配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に基づいて＜６００ｂｐのｃｆＤＮＡ分子における癌診断に末端モチーフシグネチャを使用することが実行可能である以前の試験（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０２０； １０：６６４－６７３）に加えて、長いｃｆＤＮＡ分子における末端モチーフ特徴も、癌診断に使用できる。特に、１－ｍｅｒ、２－ｍｅｒ、３－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、又は他の組み合わせに限定されない末端モチーフの分析は、癌を有する対象と有さない対象を判別するために使用できる。

【0187】

１組の末端モチーフの各末端モチーフについて、生体サンプルの末端モチーフを有する配列の相対頻度を特定してもよい。いくつかの実例において、末端モチーフを有する配列の相対頻度は、参照サンプルの群内の配列モチーフの他の頻度に基づいて特定される。それによって、１組の末端モチーフの配列の相対頻度は生体サンプルのＮ個の頻度のベクターを形成でき、ここでＮは、１組の末端モチーフ中の末端モチーフの数に対応する。生体サンプルのＮ個の頻度のベクターは、疾患の分類が既知（例えば、ＨＣＣ）の参照サンプルの群から決定された複数の参照ベクターと比較してもよい。比較に基づき、生体サンプルの疾患の分類を特定することができる。
Ａ．クラスターベースの分析

【0188】

血漿ＤＮＡ分子の５’４－ｍｅｒ末端モチーフを用いた階層的クラスタリング分析に基づき、ＨＣＣを有する患者及び有さない患者は異なるクラスターに群分けされたことが多い。血漿ＤＮＡ分子は、単一分子配列決定（例えば、ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ）を使用して配列決定してもよく、それによって配列リードは長い無細胞ＤＮＡ分子を含むようになる。末端モチーフは、配列リードごとに特定されてもよく、配列リードの相対頻度は末端モチーフ（例えば、ＣＣＧＣ）のタイプごとに特定されてもよい。ある疾患分類に対応する生体サンプルは、異なるモチーフにわたって配列リードの相対頻度が類似し、一緒に群分けしてクラスターを形成できる。かかる同様な相対頻度は、血漿ＤＮＡの単一分子配列決定から推測された末端モチーフが癌の有無に関する情報を提供できることを示唆し得る。

【0189】

図１１は、いくつかの実施形態に係る、血漿ＤＮＡ分子の２５６個の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析に基づいて生成されたヒートマップ１１００を示す。例えば、生体サンプル（例えば、ＨＣＣサンプル、ＨＢＶ保菌者サンプル）にわたる配列の頻度の平均及び標準偏差は行を表す末端モチーフについて決定されてもよい。そして、生体サンプルについて、末端モチーフを有する配列リードの相対頻度を生成でき、ここで相対頻度は、計算された平均から減算されてから標準偏差で割った末端モチーフを有する配列リードの末端モチーフ頻度に基づいてもよい。次に、末端モチーフの相対頻度の結果は、ヒートマップ１１００中の生体サンプルを表す列の対応する行（例えば、ＨＣＣ０４）において色分け値として示すことができる。プロセスは、他の末端モチーフまで継続してもよく、それによってヒートマップの列全体の色分け値を所与のサンプルについて特定できる。

【0190】

いくつかの実例において、ｚスコアは、無細胞ＤＮＡ分子の配列決定からの配列の末端モチーフの相対頻度を示すために使用される。ｚスコアは、特定の末端モチーフと、頻度のバリエーション（例えば、その所与の末端モチーフのサンプルにわたる）で割った平均頻度（例えば、その所与の末端モチーフのサンプルにわたる）との差であり得る。図１１中、ヒートマップにおける各行は異なる訓練サンプル（例えば、ＨＣＣサンプル、ＨＢＶ保菌者サンプル）にわたる特定の末端モチーフの頻度のｚスコア値を表した。特定の末端モチーフのＺスコアは、訓練サンプル間の特定の末端モチーフの平均及び標準偏差を使用して計算できる。ｚスコアを使用して、末端モチーフ頻度を異なる色で仮想化してより鮮明に比較することができる。

【0191】

生体サンプルは、それらの相対末端モチーフ頻度の類似度に基づいて群分けしてもよい。図１１に示すように、２つのクラスター「Ａ」及び「Ｂ」を形成してもよい。サブグループＡ及びＢを血管浸潤の組織学的状態の低い及び高い発生率に関連付けた。特に、「Ａ」クラスターは、５５．６％が血管浸潤に関与するＨＣＣサンプルを同定し、「Ｂ」クラスターは、８７．５％が血管浸潤に関与するＨＣＣサンプルを同定する。血管浸潤とは、腫瘍細胞（例えば、ｃｔＤＮＡ）が血管及び／又はリンパ管の内腔に存在する疾患状態を指す。血管浸潤は、腫瘍による血管（通常は静脈）への直接浸潤を伴う壁外血管浸潤（ＥＭＶＩ）も含み得る。血管浸潤は比較的重篤な癌を示す可能性がある。これを解剖病理学の報告を調べることで判定した。

【0192】

これらのクラスターを参照サンプルの頻度として使用すると、特定の生体サンプルの末端モチーフ頻度を上記の参照サンプルと比較して疾患分類を特定することができる。

【0193】

これらの結果は、単一分子配列決定から導き出された血漿ＤＮＡ末端モチーフの使用に基づいて組織学的状態の分類を非侵襲的に可能にすることができることを示唆した。更に、血管浸潤の分類は、特に血管浸潤が対応する疾患のより重篤な形態に関与するため、患者の予後に臨床的に関連し得る。
Ｂ．長いＤＮＡ分子の末端モチーフ頻度のクラスターベースの分析

【0194】

５’４－ｍｅｒ末端モチーフを用いた階層的クラスタリング分析に基づき、短いＤＮＡ分子（例えば、＜２００ｂｐ）及び長いＤＮＡ分子（例えば、＞１ｋｂ）を分析した。ある実施形態において、短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子の組み合わせ分析により、長いＤＮＡ分子（例えば＞１ｋｂ）からの２５６個のモチーフの頻度を含有する第１ベクターと短いＤＮＡ分子（例えば、＜２００ｂｐ）からの２５６個のモチーフの頻度を含有する第２ベクターを、５１２個の次元を有する新しいベクターとして連結することができる。追加的に又は代替的に、短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子の組み合わせ分析は、長いＤＮＡ分子（例えば＞１ｋｂ）からの２５６個のモチーフの頻度を含有する第１ベクターと短いＤＮＡ分子（例えば＜２００ｂｐ）からの２５６個のモチーフの頻度を含有する第２ベクターとの比であり得る。いくつかの実施形態において、短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子は、異なるカットオフで定義される。例えば、短いＤＮＡ分子は、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ未満等に限定されないカットオフで定義してもよい。長いＤＮＡ分子は、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂより大きい等に限定されないカットオフで定義してもよい。

【0195】

図１２は、いくつかの実施形態に係る、短い血漿ＤＮＡ（＜２００ｂｐ）の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップ１２００を示す。加えて、図１３は、いくつかの実施形態に係る、長い血漿ＤＮＡ（＞１ｋｂ）の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップ１３００を示す。図１４は、いくつかの実施形態に係る、短い血漿ＤＮＡ（＜２００ｂｐ）及び長い血漿ＤＮＡ（＞１ｋｂ）の両方の４－ｍｅｒ末端モチーフの階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップ１４００を示す。図１５は、ある実施形態に係る、４－ｍｅｒ末端モチーフ比率の階層的クラスタリング分析を使用して生成されたヒートマップ１５００を示す。図１２～１５に示すように、下括弧に示された百分率の各々は、対応する患者群から同定されたＨＣＣ患者の百分率を示す。

【0196】

短いＤＮＡ分子に基づく分析（図１２）と比較して、ＨＣＣ群と非ＨＣＣ群を区別する能力は、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）を使用する場合（図１３）に改善されており、組み合わせ分析（図１４及び１５）において更に強化される。改善は、ＨＣＣを有する患者と有さない患者の間のより明確な分離が図１２と比較して図１３、１４、及び１５から観察されたという事実によって実証できる。例えば、図１２に示すように、階層クラスターを２つの主要な群に分割すると、短いｃｆＤＮＡ分子（例えば＜２００ｂｐ）から導き出された末端モチーフを使用する場合に群間のＨＣＣ患者の百分率を区別することができなかった（６２．０７％対６１．３６％）（Ｐ値：１、フィッシャーの正確検定）。それと対照的に、図１３に示すように、長いｃｆＤＮＡ分子（例えば＞１ｋｂ）から導き出された末端モチーフを使用する場合、群間のＨＣＣ患者の百分率は有意に異なるようになった（８５．７１％対２９．０３％）（Ｐ値：１．５７７ ｘ １０^－６、フィッシャーの正確検定）。更に、短いｃｆＤＮＡ分子及び長いｃｆＤＮＡ分子の末端モチーフを組み合わせる場合、群のＨＣＣ患者の百分率は、図１４（８５．１１％対１９．２３％）（Ｐ値：３．５１ ｘ １０^－８、フィッシャーの正確検定）及び図１５（９２．３１％対２６．４７％）（Ｐ値：５．１２１ ｘ １０^－９、フィッシャーの正確検定）に示すように、より区別可能のようであった。
Ｃ．クラスターベースの分析方法

【0197】

図１６は、いくつかの実施形態に係る、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するフローチャート１６００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては疾患（例えば、癌）に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0198】

ステップ１６０２で、無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。例えば、単一分子リアルタイム配列決定（即ちＳＭＲＴ－ｓｅｑ）（例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる。ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑ）及びナノポア配列決定（例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して生体サンプルから配列リードを取得してもよい。他の配列技術は、例えば、本明細書に記載のように、使用してもよい。

【0199】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択されてもよい。

【0200】

追加的に又は代替的に、配列リードから第１組の配列リードを選択してもよい。第１組の配列リードは、第１サイズ範囲内のサイズを含み得る。そして、配列リードから第２組の無細胞ＤＮＡ分子を選択してもよく、ここで第２組の配列リードは、第２サイズ範囲内のサイズを含み得る。いくつかの実例において、第２サイズ範囲は、第１サイズ範囲の上限より大きい上限を有する。例えば、第１サイズ範囲は、６００ｂｐ未満であり得、第２サイズ範囲は１０００塩基より大きくてもよい。いくつかの例において、２つのサイズ範囲は重複してもよく、例えば、第１サイズ範囲は８００ｂｐ未満であり得、第２サイズ範囲は７００ｂｐ～２０００ｂｐであり得る。

【0201】

ステップ１６０４で、配列リードの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々の配列モチーフを特定してもよい。例えば、配列リードの４－ｍｅｒ末端モチーフを、その末端での４ヌクレオチドを分析することで特定できる。同様に、いくつかの実施形態において、１－ｍｅｒ、２－ｍｅｒ、３－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、又は他の組み合わせに限定されない末端モチーフの他のタイプを使用してもよい。

【0202】

ステップ１６０６で、１組のＮ個の配列モチーフの各々について、配列モチーフの相対頻度を特定してもよい。Ｎ個の相対頻度を特定してもよい。末端モチーフの相対頻度は、その特定の末端モチーフを有するＤＮＡ分子の百分率であり得る。別の例として、相対頻度は、配列モチーフの順位、例えば、末端モチーフを有するＤＮＡ分子（断片）の生の個数の順位であり得る。いくつかの実例において、正規化された頻度は、例えば、図１１について上述したように、ｚスコアである。例として、Ｎは、例えば、使用される末端モチーフのｋ－ｍｅｒサイズに応じて、２、３、４、５、８、１０、１５、１６、２０、５０、６４、１００、１２８、２００、２５６、又はそれ以上に等しい整数であり得る。

【0203】

いくつかの実例において、相対頻度は、生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子に対する、配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の割合に基づいて特定され得る。あるいは、相対頻度は、１組のＮ個の配列モチーフの他の配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、配列モチーフに対応する終了配列を有する無細胞ＤＮＡ分子の割合に基づいて特定され得る。

【0204】

ステップ１６０８で、Ｎ個の相対頻度を使用して１組のＮ個の配列モチーフに対応するＮ個の頻度のベクターを生成してもよい。ベクターにおけるＮ個の頻度の各々は、互いに正規化されてもよく（例えば、順位通り）、又は参照サンプルの群内の配列モチーフの他の頻度に正規化されてもよい（例えば、ｚスコアについて上述した通り）。参照サンプルの群内の各頻度の正規化も、順位を使用して行うことができる。例えば、Ｎ個の頻度のベクターは、参照サンプルの群内の配列モチーフの他の頻度を使用して配列モチーフの相対頻度を正規化することで生成してもよい。いくつかの実例において、Ｎ個の頻度のベクターにおける各頻度は、相対頻度を参照サンプルの群内の配列モチーフの代表頻度と比較して、例えば、ｚスコアを特定することで、特定される。

【0205】

いくつかの実例において、Ｎ個の頻度のベクターは、（ｉ）第１サイズ範囲内の第１組の配列リードのＮ個の相対頻度に対応する第１ベクター、及び（ｉｉ）第２サイズ範囲内の第２配列リード中の配列リードのＮ個の相対頻度に対応する第２ベクターに基づいて、生成してもよい。よって、Ｎ個の頻度のベクターは、短いＤＮＡ分子（例えば、第１組の配列リード）と長いＤＮＡ分子（例えば、第２組の配列リード）の間の相関を同定する値であり得る。

【0206】

ステップ１６１０で、Ｎ個の頻度のベクターは、疾患の分類が既知の参照サンプルの群から決定された複数の参照ベクターと比較してもよい。比較は、ベクターと参照ベクターの距離を特定することを含み得る。例として、参照ベクターは、参照サンプルのもの又は参照サンプルの群（クラスター）を代表するもの、例えば、参照サンプルの群のベクターの統計値（代表値、中央値、平均、又は重心）であり得る。

【0207】

ステップ１６１２で、生体サンプルの疾患の分類を比較に基づいて特定してもよい。いくつかの実例において、分類は、階層クラスタリング及び／又はヒートマップクラスタリングを使用して特定してもよい。他の機械学習技術、例えば、ニューラルネットワーク、決定木、及びサポートベクターマシンも使用され得る。

【0208】

いくつかの実例において、疾患の分類を特定することは、Ｎ個の頻度のベクターに最も近い参照ベクターのクラスターに関連する分類を同定することを含む。例えば、Ｎ個の頻度のベクターと１組のクラスターの参照ベクターの第１クラスターの最も近い参照ベクターとの間の第１距離を特定してもよい。参照ベクターの第１クラスターは、疾患を有すると分類された参照サンプルの群の第１サブグループを表す。Ｎ個の頻度のベクターと１組のクラスターの参照ベクターの第２クラスターの最も近い参照ベクターとの間の第２距離も特定してもよい。参照ベクターの第２クラスターは、疾患を有さないと分類された参照サンプルの群の第２サブグループを表す。次に第１及び第２距離を比較することができる。第１距離が第２距離より大きい場合、対象は疾患を有さないと特定できる。第１距離が第２距離未満である場合、対象は、疾患を有すると特定できる。
Ｄ．短い無細胞ＤＮＡ分子及び長い無細胞ＤＮＡ分子の順位及び分離値

【0209】

様々な末端モチーフの相対頻度を使用して生体サンプルの疾患分類を特定することに加えて、特定の末端モチーフを有する配列の頻度を、生体サンプルの血漿ＤＮＡ分子のサイズ範囲ごとに特定してもよい。いくつかの実例において、末端モチーフの相対頻度は、末端モチーフを有する配列の数を血漿ＤＮＡ分子中に見出され得る他の末端モチーフを有する配列の数と比較したものに基づいて特定される。追加的に又は代替的に、相対頻度は、血漿ＤＮＡ分子の配列全体に対する、末端モチーフを有する配列の百分率であり得る。ＤＮＡ分子の各サイズ範囲の配列の頻度は分離値の特定に使用できる。次に分離値は疾患の分類を特定するために使用できる。

【0210】

図１７は短い血漿ＤＮＡ分子（＜６００ｂｐ）と長い血漿ＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）との間のモチーフ順位の関係を同定する１組のグラフ１７００を示す。図１７中、グラフにおける各円は、４－ｍｅｒ末端モチーフを表す。グラフ「Ａ」は、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象のモチーフ順位を同定し、グラフ「Ｂ」は、ＨＣＣを有する対象のモチーフ順位を同定する。特に、グラフ１７０２において、慢性ＨＢＶ感染症を有する患者について血漿ＤＮＡ分子（＜６００ｂｐ）の２５６個の末端モチーフの順位を、長い血漿ＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）の対応物に対してプロットした。グラフ１７０２におけるピンクの領域１８０６Ａは、血漿ＤＮＡ分子について上位１０位内に順位付けされたが、長い血漿ＤＮＡ分子について１１^ｔｈ以下に順位付けされたモチーフを同定する。逆に、黄色の領域１８０８Ａは、長い血漿ＤＮＡ分子について上位１０位内に順位付けされたが、短い血漿ＤＮＡ分子について１１^ｔｈ以下に順位付けされたモチーフを強調した。短いＤＮＡ分子と長いＤＮＡ分子の間のモチーフパターンが異なると判明した。例えば、ＧＣＴＴ、ＡＣＴＴ、及びＧＴＴＴの順位は、短い血漿ＤＮＡと比較して長い血漿ＤＮＡにおいて上昇したが、ＣＣＡＧ、ＣＣＴＧ、及びＣＣＡＡの順位は低下した。

【0211】

グラフ１７０４において同定されたＨＣＣを有する患者について、血漿ＤＮＡの２５６個の末端モチーフの順位に反映された相対頻度は、慢性ＨＢＶ感染症を有する患者（グラフ１７０２）の末端モチーフの相対頻度と異なった。特に、グラフ１７０２及び１７０４は、血漿ＤＮＡ分子の末端モチーフ頻度を示す。グラフ１７０２と同様に、グラフ１７０４におけるピンクの領域１８０６Ｂは、血漿ＤＮＡ分子について上位１０位内に順位付けされたが、長い血漿ＤＮＡ分子について１１^ｔｈ以下に順位付けされたモチーフを同定する。逆に、黄色の領域１８０８Ｂは、長い血漿ＤＮＡ分子について上位１０位内に順位付けされたが、短い血漿ＤＮＡ分子について１１^ｔｈ以下に順位付けされたモチーフを強調した。例えば、ＨＣＣを有する患者の血漿ＤＮＡにおけるＣＣＡＧ、ＣＣＴＧ、及びＣＣＡＡモチーフに関するモチーフ順位は、ＨＢＶ感染症を有する患者と異なった。よって、これらのデータは、短い血漿ＤＮＡ分子と長い血漿ＤＮＡ分子の間の末端モチーフの分析が癌検出に価値のある情報を提供できることを示唆する。例えば、生体サンプルのＣＣＡＧの分離値をカットオフ値と比較して疾患分類を特定してもよい。しかし、サイズが＞１ｋｂの血漿ＤＮＡ分子を伴うこのような分析は、ショートリード配列決定技術（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォーム）では、長いＤＮＡ分子、例えば＞６００ｂｐのＤＮＡ分子を配列決定する能力の欠如により、得ることができなかった。
Ｅ．長いＤＮＡ分子の末端モチーフ頻度

【0212】

いくつかの実施形態において、末端モチーフ分析は、１つの特定の４－ｍｅｒ末端モチーフの分析に対応する。例えば、ＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を＜２００ｂｐの短い血漿ＤＮＡ分子、＞６００ｂｐの長い血漿ＤＮＡ分子、及び＞１ｋｂの長い血漿ＤＮＡ分子で計算した。
１．肝細胞癌

【0213】

図１８は、ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象の＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子におけるＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図１８００を示す。図１８に示すように、ＨＣＣ群内の短いｃｆＤＮＡ分子のＣＣＣＡ末端モチーフの低下は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームによって明らかにされた以前の知見に一致し（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０２０； １０：６６４－６７３）、ここでＨＣＣにおける低下が観察された。統計的に有意な、ＨＣＣにおけるＣＣＣＡのモチーフ頻度の低下は、他の分類と一部重複する。長いＤＮＡ断片を使用してより良好な結果が得られるか否かを探究した。

【0214】

図１９は、血漿ＤＮＡ分子におけるＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する１組の箱ひげ図１９００を示す。箱ひげ図１９０２は、ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象の６００ｂｐより長い血漿ＤＮＡ分子のＣＣＣＡ頻度を示し、箱ひげ図１９０４は、ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象の＞１ｋｂの血漿ＤＮＡ分子のＣＣＣＡ頻度を示す。図１８とは対照的に、長いＤＮＡ分子が及び本開示のコホートにおいてＳＭＲＴ配列決定を使用して同定・分析された場合、驚いたことに、非ＨＣＣ対象と比較してＨＣＣ患者において長いｃｆＤＮＡ分子のＣＣＣＡのより高い（より低いではなく）モチーフ頻度が観察されたことが発見された。加えて、ＨＣＣと他の分類の分離は、短いｃｆＤＮＡ分子よりも、長いｃｆＤＮＡ分子の方が大きかった。

【0215】

長いＤＮＡ分子を用いた末端モチーフ分析を評価するために、図２０は、ＨＣＣ及び非ＨＣＣ対象を区別する際の短いＤＮＡ分子２００２及び長いＤＮＡ分子２００４中のＣＣＣＡのモチーフ頻度の実績を同定するＲＯＣ曲線２０００を示す。図２０に示すように、短いｃｆＤＮＡの末端モチーフに基づくＡＵＣは０．６９であり、対照的に、長いｃｆＤＮＡのＡＵＣは０．８８であった（Ｐ値：０．００６５、ブートストラップ検定）。長いｃｆＤＮＡ分子から導き出された末端モチーフＣＣＣＡの使用により、短いｃｆＤＮＡ分子の使用と比較して、ＨＣＣ患者を非ＨＣＣ患者と区別する能力が有意により高くなった。

【0216】

いくつかの実施形態において、長いＤＮＡ分子と短いＤＮＡ分子の両方からの情報は、疾患分類の能力を強化するために、１つの分析モデル内に統合される。図２１は、ＨＣＣ患者、ＨＢＶ保菌者、及び健康対象におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図２１００を示す。ＣＣＣＡ率を、ＨＣＣ患者、ＨＢＶ保菌者及び健康対象における長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）のＣＣＣＡモチーフ頻度を短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）のＣＣＣＡモチーフ頻度で割ることで算出した。ＨＣＣ患者は、非ＨＣＣ対象よりも、有意に高いＣＣＣＡ率を表示した（Ｐ値：３．９１９ ｘ １０^－１０、マンホイットニーＵ検定）。短いＤＮＡ分子（図１８）又は長いＤＮＡ分子（図１９）のＣＣＣＡ％のいずれと比較しても、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を区別する能力はＣＣＣＡ率を使用する場合に大幅に強化されていた。

【0217】

例として、図２２は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のＣＣＣＡ率の実績を同定するＲＯＣ曲線２２００を示す。図２２は、０．９のＡＵＣでの長対短のＣＣＣＡ率分析について示す。いくつかの実施形態において、別の末端モチーフ比率（例えばＣＣＣＴ、ＣＣＣＣ、ＣＣＣＧ、ＴＴＴＡ）は癌検出に使用されるか、又は複数の末端モチーフ比率は一緒に癌検出に使用してもよい。ショートリード配列決定技術が長いＤＮＡ分子（例えば＞６００ｂｐ）を分析できず、かかる末端モチーフ比率分析が従来の試験では実行不可能であると考えられたことから、これらの結果は驚くべきものである。
２．結腸直腸癌

【0218】

４人の結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者及び１５人の健康対象からの血漿ＤＮＡ分子のＳＭＲＴ配列決定を行った。図２３は、ＣＲＣ患者及び健康対象における＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図２３００を示す。ＳＭＲＴ－配列決定を使用して血漿ＤＮＡ分子を配列決定した。図２３は、健康対象と比較する場合、ＣＲＣ患者のＣＣＣＡ頻度が有意に低下することを示す（Ｐ値：＜０．０１、マンホイットニーＵ検定）。

【0219】

図２４は、ＣＲＣ患者及び健康対象における１ｋｂより長い血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する箱ひげ図２４００を示す。ＳＭＲＴ配列決定を使用して血漿ＤＮＡ分子を配列決定した。図２４は、健康対象と比較する場合、ＣＲＣ患者のＣＣＣＡ頻度が有意に上昇することを示す（Ｐ値：０．０１、マンホイットニーＵ検定）。ＣＣＣＡ頻度のこのような上昇は、長いｃｆＤＮＡ末端モチーフ特徴が本開示に提示された結腸直腸癌及び肝細胞癌に限定されない複数の癌タイプの検出に適用できることを実証する。従来の配列決定方法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）は長いＤＮＡ分子（例えば、６００ｂｐより大きいサイズを有する血漿ＤＮＡ分子）を同定できないことから、これも驚くべきものである。

【0220】

いくつかの実施形態において、長いＤＮＡ分子及び短いＤＮＡ分子の両方からの情報は、結腸直腸癌患者における疾患分類の能力を強化するために、１つの分析モデル内に統合される。図２５は、ＳＭＲＴ配列決定際のＣＲＣ患者及び健康対象におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図２５００を示す。箱ひげ図２５００に示すように、ＣＣＣＡ率を、ＣＲＣ患者及び健康対象における長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）のＣＣＣＡモチーフ頻度を短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）のＣＣＣＡモチーフ頻度で割ることで算出した。ＣＲＣ患者は、健康対象よりも、有意に高いＣＣＣＡ率を表示した（Ｐ値：０．００４、マンホイットニーＵ検定）。
Ｆ．ナノポア配列決定による末端モチーフ分析

【0221】

いくつかの実施形態において、核酸の末端モチーフ分析においてＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）によるナノポア配列決定が利用される。ナノポア配列決定の効果を実証するために、８人のＨＣＣ患者及び６人のＨＢＶ保菌者から血漿ＤＮＡ分子をナノポア配列決定によって配列決定した。

【0222】

図２６は、ＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者における＜２００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡの末端モチーフ頻度を同定する箱ひげ図２６００を示す。図２６に示すように、ＨＣＣ群内の短いｃｆＤＮＡ分子のＣＣＣＡ末端モチーフの低下は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームによって明らかにされた以前の知見に一致した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０２０； １０：６６４－６７３）。しかし、長いＤＮＡ分子はＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームでは殆ど検出できなかった（分子の０％が＞６００ｂｐ）ため、末端モチーフ分析における長いｃｆＤＮＡ分子の有用性は知られていなかった。

【0223】

図２７は、血漿ＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのモチーフ頻度を同定する１組の箱ひげ図２７００を示す。図２７に示すように、箱ひげ図２７０２は、ＨＣＣ及びＨＢＶ保菌者における６００ｂｐより長い血漿ＤＮＡ分子のＣＣＣＡ頻度を示し、箱ひげ図２７０４は、ＨＣＣ及びＨＢＶ保菌者における１ｋｂより長い血漿ＤＮＡ分子のＣＣＣＡ頻度を示す。図２６とは対照的に、長いＤＮＡ分子が本開示のコホートにおいてナノポア配列決定を使用して同定・分析された場合、非ＨＣＣ対象と比較してＨＣＣ患者において長いｃｆＤＮＡ分子中のＣＣＣＡのより高いモチーフ頻度が観察されたことが発見され、これは、本開示に記載のＳＭＲＴ配列決定プラットフォームから生成された本開示のデータに一致する。

【0224】

いくつかの実施形態において、長いＤＮＡ分子及び短いＤＮＡ分子の両方からの情報は、ナノポア配列決定における疾患分類の能力を強化するために、１つの分析モデル内に統合される。図２８は、ナノポア配列決定際のＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者におけるＣＣＣＡ率を同定する箱ひげ図２８００を示す。ＣＣＣＡ率を、ＨＣＣ患者及びＨＢＶ保菌者における長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）のＣＣＣＡモチーフ頻度を短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）のＣＣＣＡモチーフ頻度で割ることで算出した。図２８に示すように、ＨＣＣ患者は、ＨＢＶ保菌者よりも、有意に高いＣＣＣＡ率を表示した（Ｐ値：０．０１３、マンホイットニーＵ検定）。これらの所見は、本開示の実施形態で提示されたＳＭＲＴ配列決定によって生成された本開示のデータに一致し、複数のプラットフォームにわたる長いｃｆＤＮＡ断片特徴の診断潜在力を強調する。
Ｇ．長い無細胞ＤＮＡ分子の末端モチーフ頻度に基づく疾患分類のための機械学習技術

【0225】

いくつかの実施形態において、末端モチーフ分析は、癌を有する患者と有さない患者を分類するために末端モチーフシグネチャから有用な情報を抽出できる機械学習モデルを使用して実施される。機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶、（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の１つ又は複数のモデルを含む複合モデルを含み得るが、それらに限定されない。
１．ロジスティック回帰

【0226】

いくつかの実施形態において、ロジスティック回帰分析は、４－ｍｅｒ末端モチーフを使用してＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を分類する区別能力を評価するために使用される。ロジスティック回帰（ＬＲ）モデルでは、二値の結果変数間で関係を確立することが可能である。例えば、二値の結果０及び１は、それぞれ、非癌及び癌の癌状態を示す。ＬＲは、予測変数でロジット変換確率を線形関係としてモデリングし、ここで、該予測変数は異なるサイズ範囲のｃｆＤＮＡ分子に由来する末端モチーフを含む。例えば、Ｙを｛０，１｝で非癌及び癌を示す二値の結果変数とし、ｐをｙが１の確率とし、ｐ＝Ｐ（Ｙ＝１）とする。ｐが高いほど、癌を有する可能性が高い。ｘ_１、ｘ_２、…、ｘ_ｋを１組の予測変数とする。一例において、１組の予測変数は、＞１ｋｂのｃｆＤＮＡ分子の２５６個の５’４－ｍｅｒ末端モチーフの頻度であり得る。ｘ_１、ｘ_２、…、ｘ_ｋに対するＹのロジスティック回帰により、下記等式の最尤法を通じてβ_０、β_１、…、β_ｋのパラメーター値を導き出すことができる。

【数1】

該等式は更に下記式に変換できる。

【数2】

【0227】

図２９は、サイズが２００ｂｐ未満の短いＤＮＡ分子における末端モチーフ特徴のロジスティック回帰分析によって生成された結果を同定する箱ひげ図２９００を示す。図２９は、＜２００ｂｐの短いｃｆＤＮＡ分子を用いたロジスティック回帰分析を示す。図２９に示すように、ＨＣＣ患者は、対照対象よりも、癌を有すると分類される確率が高かった。図３０は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）における末端モチーフ特徴を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線３０００を示す。図３０は、０．８９のＡＵＣでの短いＤＮＡ分子の末端モチーフのロジスティック回帰分析を示す。

【0228】

短いＤＮＡ分子に加えて、ロジスティック回帰分析は長いＤＮＡ分子に拡張されてもよい。図３１は、サイズが１ｋｂより大きい長いＤＮＡ分子における末端モチーフ特徴のロジスティック回帰分析から生成された結果を同定する箱ひげ図３１００を示す。図３２は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）の末端モチーフ特徴を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線３２００を示す。＞１０００ｂｐの長いｃｆＤＮＡ分子がロジスティック回帰分析に使用された場合、ＨＣＣ患者は、図２９の結果と比較して、健康及びＨＢＶ保菌者対象より高い確率を示す。更に、ＨＣＣ分類の精度は、図３２に示すように０．９のＡＵＣに達した。確率スコアのカットオフを使用して９９％の特異性を可能にすると、末端モチーフ分析での短いＤＮＡ分子の使用は４２％の感度しか提供できなかったのに対して、末端モチーフ分析での長いｃｆＤＮＡ分子の使用は感度を７０％に向上させる。

【0229】

上記のデータは、本開示で実施される長いｃｆＤＮＡ分子の使用が、診断実績を強化できることを示唆した。Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード配列決定技術を使用して癌患者の血漿の腫瘍ＤＮＡ画分において短いｃｆＤＮＡ分子が濃縮されたことを明らかにした試験（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１５；１１２：Ｅ１３１７－２５）があることから、多くの試験は、癌検出の実績を改善するために短いｃｆＤＮＡ分子の分析に注目することを試みた（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰｌｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６；１２：ｅ１００６１６２、Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１８；１０：ｅａａｔ４９２１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０２１；１０：１５０１－１５１１）。例えば、１つの試験では、配列決定前にベンチトップマイクロ流体デバイスによるインビトロサイズ選択を使用して長いｃｆＤＮＡ分子の除去を試みた（Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１８；１０：ｅａａｔ４９２１）。したがって、長いｃｆＤＮＡ分子を含めて診断実績を強化することは、以前に探究されたことがなく、長いｃｆＤＮＡ分子の使用による診断実績の向上は驚くべきものである。

【0230】

短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子の末端モチーフ特徴は、一緒に使用してロジスティック回帰を用いた癌分類の実績を更に強化することができる。図３３は、＞１ｋｂの長いＤＮＡ分子及び＜２００ｂｐの短いＤＮＡ分子の両方における末端モチーフ特を用いたロジスティック回帰分析を同定する箱ひげ図３３００を示す。図３３に示すように、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方からの末端モチーフ情報が一緒にロジスティック回帰分析に統合された場合、ＨＣＣ対象を健康対象及びＨＢＶを有する対象と明確に区別することができる。図３４は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方に由来する末端モチーフ特徴を組み合わせて用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線３４００を示す。図３４に示すように、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象の間での診断能力は、０．９２のＡＵＣに更に強化された。いくつかの実施形態において、３つ以上のサイズ範囲からの末端モチーフのパターンを使用してもよい。例として、サイズ範囲が＜２００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフ、サイズ範囲が２００～６００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフ、及びサイズ範囲が＞６００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフの頻度は、一緒にロジスティック回帰分析に統合してもよく（４－ｍｅｒ特徴の数：２５６ ｘ ３）、ＨＣＣを有する患者を、癌を有さない患者と区別するＡＵＣが０．９３である。

【0231】

いくつかの実例において、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）におけるモチーフ頻度を短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）のモチーフ頻度で割ることで算出されたモチーフ比率は、ロジスティック回帰に使用される。図３５は、モチーフ比率を用いたロジスティック回帰分析によって生成された結果を同定する箱ひげ図３５００を示す。かかるモチーフ比率がロジスティック回帰分析に使用された場合、ＨＣＣ対象について生成された確率は、健康及びＨＢＶ保菌者対象より大幅に高かった。図３６は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたロジスティック回帰の実績を同定するＲＯＣ曲線３６００を示す。図３６に示すように、ＡＵＣは０．９７に更に向上しており、これは、短いｃｆＤＮＡ分子及び長いｃｆＤＮＡ分子の両方に由来する末端モチーフ情報を相乗的に利用することで癌に対する診断潜在力を強化できることを反映する。
２．サポートベクターマシン

【0232】

いくつかの実施形態において、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分析は、４－ｍｅｒ末端モチーフに基づいて癌対象と非癌対象を分類するために使用される。ＳＶＭ分類器を確立するための訓練データセットがｎサンプルを含むと仮定すると、
（Ｍ_１，Ｙ_１）、…、（Ｍ_ｎ，Ｙ_ｎ）（１）
式中、Ｙ_ｉはサンプルｉについて１（癌対象を示す）又は－１（非癌対象を示す）であり、Ｍ_ｉはサンプルｉについて末端モチーフパターンを含むｐ次元ベクターである。例えば、Ｍ_ｉは２５６個の４－ｍｅｒ末端モチーフを含有するベクターであり得る。あるいは、Ｍ_ｉは、長いｃｆＤＮＡ分子と短いｃｆＤＮＡ分子の比等の２５６個の４－ｍｅｒ末端モチーフに由来する値を含有するベクターであり得る。ＳＶＭは、訓練データセットを使用して訓練して、非癌群と癌群をできるだけ正確に分離する「超平面」を決定することができる。かかる超平面を見つける方式は様々ある。その１つは、下記式を満たす１組の係数（ｐ次元ベクターを有するＷ）を見つけることである。

【数4】

（癌群内の任意の対象について）（２）
及び

【数5】

（非癌群内の任意の対象について）（３）
式中、Ｗは、超平面を決定するｐ次元ベクターの係数であり、Ｍは、ｐ末端モチーフ及びｎサンプルを有する行列（ｐｘｎ次元）であり、ｂは切片である。
式（２）及び（３）は下記式に書き換えることができる。

【数6】

（４）
式中、Ｙ_ｉは－１（非癌）又は１（癌）である。
（２）と（３）の間のマージン距離（Ｄ）は

である。
ここで

は、点から面までの距離の等式を使用して計算される。

【0233】

よって、（４）に供される

を最小化することでＤを最大化する必要がある。この原則に基づき、分類器のパラメーター（Ｗ及びｂ）を決定してもよい。新しいサンプルの癌リスクスコアは、この例において訓練されたパラメーター（Ｗ及びｂ）を使用して計算できる。

【0234】

図３７は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際の末端モチーフ比率を用いたＳＶＭの実績を同定するＲＯＣ曲線３７００を示す。ＳＶＭを、２５６個の末端モチーフ比率を使用して所与の対象の生体サンプルを分類するために使用し、ここで各末端モチーフ比率は、長いＤＮＡ分子と短いＤＮＡ分子との間のそれぞれの末端モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）についての頻度の比率に対応した。図３７に示すように、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方からの末端モチーフ情報が一緒にＳＶＭ分析に統合された場合、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象の間での診断能力は、０．９３のＡＵＣに達した。いくつかの実施形態において、３つ以上のサイズ範囲からの末端モチーフのパターンを使用してもよい。例として、サイズ範囲が＜２００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフ、サイズ範囲が２００～６００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフ、及びサイズ範囲が＞６００ｂｐの分子からの２５６個のモチーフの頻度は一緒にロジスティック回帰分析に統合してもよい。
３．ランダムフォレスト

【0235】

いくつかの実施形態において、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を分類するために４－ｍｅｒ末端モチーフを使用してランダムフォレストツリー分析を行ってもよい。図３８は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたランダムフォレスト分析の実績を同定するＲＯＣ曲線３８００を示す。ランダムフォレストツリーを、２５６個の末端モチーフ比率を使用して所与の対象の生体サンプルを分類するために使用し、ここで各末端モチーフ比率は、長いＤＮＡ分子と短いＤＮＡ分子の間のそれぞれの末端モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）についての頻度の比率に対応した。図３８に示すように、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方からの末端モチーフ情報がランダムフォレストツリー分析に統合された場合、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象の間での診断能力は、０．９４のＡＵＣに達した。
４．線形判別分析

【0236】

いくつかの実施形態において、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を分類するために４－ｍｅｒ末端モチーフを使用して線形判別分析（ＬＤＡ）を行ってもよい。図３９は、ＨＣＣを有する対象とＨＣＣを有さない対象を区別する際のモチーフ比率を用いたＬＤＡ分析の実績を同定するＲＯＣ曲線３９００を示す。線形判別分析を、２５６個の末端モチーフ比率を使用して所与の対象の生体サンプルを分類するために使用し、ここで各末端モチーフ比率は、長いＤＮＡ分子と短いＤＮＡ分子の間のそれぞれの末端モチーフ（例えば、ＣＣＣＡ）についての頻度の比率に対応した。図３９に示すように、長いＤＮＡ分子（＞１ｋｂ）及び短いＤＮＡ分子（＜２００ｂｐ）の両方からの末端モチーフ情報がＬＤＡ分析に統合された場合、ＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象の間での診断能力は、０．９７のＡＵＣに達した。
Ｈ．短いＤＮＡ分子及び長いＤＮＡ分子の分析方法

【0237】

図４０は、いくつかの実施形態に係る、１つ又は複数の末端モチーフを有する配列の相対頻度に基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するフローチャート４０００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては疾患（例えば、癌）に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0238】

ステップ４００２で、無細胞ＤＮＡ分子の配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。例えば、単一分子リアルタイム配列決定（即ちＳＭＲＴ－ｓｅｑ）（例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる。ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ－ｓｅｑ）及びナノポア配列決定（例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）を使用して生体サンプルから配列リードを取得してもよい。他の配列技術は、例えば、本明細書に記載のように、使用してもよい。

【0239】

ステップ４００４で、配列リードを使用して無細胞ＤＮＡ分子のサイズを特定してもよい。例えば、ヌクレオチドの数を計数して無細胞ＤＮＡ分子のサイズを特定してもよい。他の技術も使用され得、例えば、ペアエンド配列決定を使用し、配列リードの対を参照ゲノムにアライメントしてもよい。

【0240】

ステップ４００６で、配列リードの各々について、対応する無細胞ＤＮＡ分子の１つ又は複数の終了配列の各々の配列モチーフを特定してもよい。例えば、配列リードの４－ｍｅｒ末端モチーフは、その末端での４ヌクレオチドを分析することで特定してもよい。引き続きこの例では、第１配列リードは、ＣＣＣＡを配列モチーフとして含み得、第２配列リードはＣＣＡＧを配列モチーフとして含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、１－ｍｅｒ、２－ｍｅｒ、３－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、２０－ｍｅｒ、又は他の組み合わせに限定されない末端モチーフの他のタイプを使用してもよい。

【0241】

ステップ４００８で、第１サイズ範囲を有する無細胞ＤＮＡ分子の第１組について、無細胞ＤＮＡ分子の第１組内の１つ又は複数の配列モチーフの出現の第１相対頻度を特定してもよい。相対頻度は、配列モチーフの順位であり得る。別の例として、相対頻度は、特定の配列モチーフを有するＤＮＡ分子の百分率であり得る。

【0242】

いくつかの実例において、第１相対頻度は、生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子に対する、第１組の無細胞ＤＮＡ分子の割合である。追加的に又は代替的に、第１相対頻度は、他の配列モチーフを有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、第１組の無細胞ＤＮＡ分子の割合である。いくつかの実例において、第１サイズ範囲は、少なくとも８０塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも１５０塩基、少なくとも２００塩基、又は少なくとも３００塩基のうちの１つから選択される上限を含む。例えば、第１サイズ範囲は１～２００ｂｐであり得る。

【0243】

ステップ４０１０で、第２サイズ範囲を有する無細胞ＤＮＡ分子の第２組について、無細胞ＤＮＡ分子の第２組内の１つ又は複数の配列モチーフの出現の第２相対頻度を特定してもよい。いくつかの実例において、第２相対頻度は、生体サンプルからの無細胞ＤＮＡ分子に対する、第２組の無細胞ＤＮＡ分子の割合であり得る。追加的に又は代替的に、第２相対頻度は、他の配列モチーフを有する無細胞ＤＮＡ分子の数に対する、第２組の無細胞ＤＮＡ分子の割合である。

【0244】

いくつかの実例において、第２サイズ範囲は、第１サイズ範囲の上限より大きい上限を有する。例えば、第１サイズ範囲は６００ｂｐ未満であり得、第２サイズ範囲は１０００塩基より大きくてもよい。いくつかの例において、２つのサイズ範囲は重複してもよく、例えば、第１サイズ範囲は８００ｂｐ未満であり得、第２サイズ範囲は７００ｂｐ～２０００ｂｐであり得る。追加的に又は代替的に、第２サイズ範囲は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択される下限を含む。いくつかの実例において、第２サイズ範囲の下限は、第１サイズ範囲の上限より大きい。

【0245】

ステップ４０１２で、第１相対頻度と第２相対頻度の分離値を特定してもよい。いくつかの実例において、分離値は、第１相対頻度と第２相対頻度の比であるか、又は頻度の各関数の比である。例えば、分離値は、第１組の無細胞ＤＮＡ分子（例えば、短いＤＮＡ分子）に対する第２組の無細胞ＤＮＡ分子（例えば、長いＤＮＡ分子）の比であり得、ここで第１及び第２組は、ＣＣＣＡに対応する終了配列を有する。他の実例において、分離値は、２つの頻度の減算だけでなく、頻度間の分離の尺度を提供する関数の組み合わせも含み得る。分離値の特定は、本開示のセクションＩＩＩ．Ｄ及びＩＩＩ．Ｅに更に説明する。

【0246】

ステップ４０１４で、分離値を使用して生体サンプルの疾患の分類を特定してもよい。いくつかの実例において、分類は、分離値を１つ又は複数のカットオフ値と比較することで特定される。疾患は癌（例えば、ＨＣＣ、ＣＲＣ）であり得、分類は、癌の複数の病期を含み得る。例として、癌は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、及び頭頸部扁平上皮癌であり得る。いくつかの実例において、疾患の分類は、疾患の重篤度の分類を同定する。疾患分類の特定は、癌の組織学的状態、例えば、血管浸潤の有無を含み得る。１つ又は複数のカットオフ値は、疾患の分類が既知の参照サンプル（例えば、健康サンプル、疾患を有すると分類された対象からのサンプル）から決定されてもよい。いくつかの実例において、１つ又は複数のカットオフ値のうちのカットオフ値は０．６、０．６５、０．７、又は０．７５の１つから選択されてもよい。

【0247】

上述したように、疾患の分類が既知の訓練サンプル（例えば、図１７に示すもの）による機械学習を使用して、１つ又は複数のカットオフ値を決定してもよい。別の例において、１つ又は複数のカットオフ値との比較は、機械学習モデルを使用して行ってもよい。機械学習モデルは、分離値に適用して疾患の分類を生成することができる。機械学習モデルとしては、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶、（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の１つ又は複数のモデルを含む複合モデルを含み得るが、それらに限定されない。
ＩＶ．疾患分類のための長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターン分析

【0248】

人体のどの組織でも腫瘍形成が発生し得るため、単一分子の起源組織の特定は、癌検査及び癌治療の指導に有用である。血漿ＤＮＡの標的起源組織が、血漿ＤＮＡメチル化ハプロタイプとその組織のメチル化ハプロタイプとの間のＣｐＧ部位にわたるメチル化状態の面での最も少ないミスマッチ（即ちメチル化ミスマッチ）に対応するという仮説に基づき得る１つのアプローチは、本明細書で最小メチル化ミスマッチアプローチと名付けられる。メチル化ミスマッチの数は、同じゲノム位置を起源とする２つのメチル化ハプロタイプ間のＣｐＧ部位にわたるメチル化状態をペアごとに比較することで特定してもよい。同じＣｐＧ位置での２つのメチル化ハプロタイプ間の２つのメチル化状態が異なる場合、１つのミスマッチとして計数される。

【0249】

いくつかの実施形態において、組織及び血漿ＤＮＡ分子から取得された長いＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプは、短いメチル化ハプロタイプと比較して、長いメチル化ハプロタイプが特定の組織に固有の情報価値のあるメチル化パターンを含有する可能性がより高いことから、精度の強化に使用される。

【0250】

図４１は、いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンを参照組織のメチル化パターンと比較する例示図４１００を示す。特に、図４１は、３つのＣｐＧ部位を有する血漿ＤＮＡの短いメチル化ハプロタイプではどの組織がかかる血漿ＤＮＡ分子に寄与するかを特定できない（例えば、肝臓、脳及び肺組織は同じ短いメチル化ハプロタイプを共有する）ことを示す。それと対照的に、１０つのＣｐＧ部位を有する血漿ＤＮＡの長いメチル化ハプロタイプでは、脳、肺、結腸及び白血球からの血漿ＤＮＡのメチル化ハプロタイプがそれぞれ２、３、４及び５のメチル化ミスマッチを示すのと比較して、肝臓からのメチル化ハプロタイプが０の最も少ないメチル化ミスマッチを示すことから、肝臓をかかる血漿ＤＮＡ分子の起源組織として明確に特定できる。

【0251】

いくつかの実施形態において、メチル化ハプロタイプについてのパターン認識分析は、各長い血漿ＤＮＡ分子の起源組織を特定する実績を改善する。そして、起源組織の特定は疾患分類の特定に使用できる。

【0252】

図４２は、いくつかの実施形態に係る、少なくとも１つのメチル化ミスマッチを含む長い無細胞ＤＮＡ分子におけるメチル化パターンを分析する技術４２００を図示する。図４２に示すように、血漿ＤＮＡ分子の起源組織を特定することは、最小メチル化ミスマッチアプローチにとって困難であるかもしれない。特に、所与の血漿ＤＮＡ分子は、腫瘍細胞におけるメチル化ハプロタイプと比較する場合に、部位「２」でメチル化ミスマッチを有するが、非腫瘍細胞（例えば、バフィーコート）のメチル化ハプロタイプと比較する場合に、部位「５」でもメチル化ミスマッチを有する。パターン認識分析ではこの課題に対処できる。例えば、位置４、５、及び６での３つの連続した非メチル化ＣｐＧ部位の存在が、ＨＣＣのより高い尤度を示すと判定することができる。この情報に基づき、位置４、５、及び６でのＣｐＧ部位には、他の位置でのＣｐＧ部位と比較して、腫瘍パターンを示すより高い重みが与えられる。この重みに踏まえて、所与の血漿ＤＮＡ分子は、その位置４、５、及び６での非メチル化ＣｐＧ部位に基づいて腫瘍細胞に関連すると予測することができる。これらのタイプのパターン分析は、所与の血漿ＤＮＡ分子が特定の長さを上回る場合に、より効果的になる。

【0253】

いくつかの実施形態において、血漿ＤＮＡの長さとしては、≧５００ｂｐ、≧６００ｂｐ、≧１ｋｂ、≧２ｋｂ、≧３ｋｂ、≧４ｋｂ、≧５ｋｂ、≧１０ｋｂ又は他の組み合わせを含むが、それらに限定されない。ＣｐＧ部位の数としては、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１５、≧２０、≧２５、≧３０、≧３５、≧４０、≧４５、≧５０、≧６０、≧７０、≧８０、≧９０、≧１００、≧２００、≧３００、≧４００、≧５００、≧１０００、又は他の組み合わせを含み得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、様々な組織及び腫瘍組織からの長いＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプは、メチル化認識酵素変換によって特定される。かかる変換方法の一例は、非破壊酵素反応を伴い、ＴＥＴ２及びＡＰＯＢＥＣ３Ａを利用して（メチル化ではなく）非メチル化シトシンを、チミンとして配列決定されたウラシルに変換するメチル－ｓｅｑ（ＥＭ－ｓｅｑ）である（例えばＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｋｉｔ）。従来の亜硫酸水素塩配列決定は、長いＤＮＡ分子を分解するため、メチル化ハプロタイプ情報が短くなり、血漿ＤＮＡの起源組織特定の精度に悪影響が及ぼされることから、長いＤＮＡ分子を採取する際に欠点がある。
Ａ．長い無細胞ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位

【0254】

図４３は、ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来一塩基バリアント（ＳＮＶ）の普遍性の１ｋｂ分解能での比較４３００を示す。特に、表Ａは、少なくとも対応する数のＣｐＧ部位（例えば、＞１）を有する所与のゲノム（例えば、参照ゲノム）の１ｋｂゲノム領域の数を示す。表Ｂは、少なくとも対応する数のＳＮＶ（例えば、＞２）を有するゲノムの１ｋｂゲノム領域の数を示す。図４３に示すように、少なくとも１０つのＣｐＧ部位を含有する１ｋｂ領域は９７１，８８０であり、ヒトゲノムの３３．７％を占めるのに対して、腫瘍組織からの３８，４６５個の体細胞変異を分析する際に、少なくとも１０つのＳＮＶを含有する１ｋｂ領域はただ２つである。よって、ＣｐＧ部位を大量有する血漿ＤＮＡ分子は十分に取得でき、それによって、それらのメチル化パターンを疾患の予測に使用することができる。

【0255】

図４４は、ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来ＳＮＶの普遍性の３ｋｂ分解能での比較４４００を示す。表Ａは、少なくとも対応する数のＣｐＧ部位（例えば、＞１）を有する所与のゲノム（例えば、参照ゲノム）の３ｋｂゲノム領域の数を示す。表Ｂは、少なくとも対応する数のＳＮＶ（例えば、＞２）を有するゲノムの３ｋｂゲノム領域の数を示す。図４４に示すように、少なくとも１０つのＣｐＧ部位を含有する３ｋｂ領域は８４４，７４２であり、ヒトゲノムの８８．０％を占めるのに対して、少なくとも１０つのＳＮＶを含有する３ｋｂ領域はただ２つである。これらの結果は、長い血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプに基づく分析により、癌の存在に関する情報を提供するために使用できる血漿ＤＮＡ分子の情報を大幅に改善できることを示唆した。

【0256】

対照的に、短い無細胞ＤＮＡ分子のＣｐＧ部位の量は疾患分類に十分ではない可能性がある。図４５は、ゲノム全体にわたるＣｐＧ部位及び癌由来ＳＮＶの普遍性の２００ｂｐ分解能での比較４５００を示す。表Ａは、少なくとも対応する数のＣｐＧ部位（例えば、＞１）を有する所与のゲノム（例えば、参照ゲノム）の２００ｂｐゲノム領域の数を示す。表Ｂは、少なくとも対応する数のＳＮＶ（例えば、＞２）を有するゲノムの２００ｂｐゲノム領域の数を示す。図４５に示すように、１０つのＣｐＧ部位を含有する２００ｂｐ領域の百分率は急速に１．９％と低くなった。この結果は、短い無細胞ＤＮＡ分子に存在するＣｐＧ部位の数（例えば＜２００ｂｐ）が限られるため、血漿ＤＮＡに基づく起源組織分析又は疾患分類に悪影響を及ぼすことを示唆する。

【0257】

よって、長い無細胞ＤＮＡ分子におけるいくつかのＣｐＧ部位のメチル化パターンを使用して、疾患（例えば、癌）の存在を予測できる１つ又は複数のバイオマーカーを同定することができる。例えば、血漿サンプルの長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する配列リードは、メチル化認識配列決定（例えば、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ）を使用して取得できる。各配列リードは、配列リード上の１組のＣｐＧ部位でのメチル化状態を同定するメチル化パターンを含み得る。各配列リードのメチル化パターンは、組織型の参照メチル化パターンと比較してもよく、それによって配列リードの組織分類が特定される。次に配列リードの組織分類を疾患分類の特定に使用できる。

【0258】

例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子のパターン特異性が遥かに高いため、参照組織メチロームの分解能が低い場合でも、分子ごとのメチル化分析を行うことができる。例えば、参照組織メチロームがゲノムの全ての塩基をカバーしていないか又は情報の断片化セクションを含む場合でも、ゲノム全体において長い無細胞ＤＮＡ分子とのマッチがより少ない可能性がある。実際に、長い無細胞ＤＮＡ分子は、参照の曖昧さにも関わらず、その真のマッチにアライメントすることができる。参照メチル化パターンが存在する限り、メチル化パターンの比較を使用して長い無細胞ＤＮＡ分子の割合が特定の組織型に対応するか否かを予測することができる。血漿サンプルにおける特定の組織型に関連する長い無細胞ＤＮＡ分子の高い割合は癌を予測することができる。
Ｂ．起源組織

【0259】

異なるメチル化パターン（即ちメチル化ハプロタイプ情報）を持つ一連のＣｐＧ部位を伴う、ＨＣＣを有する患者における長い血漿ＤＮＡ分子の存在は、単一分子レベルでのそれらの起源組織／起源腫瘍の追跡を促進する。

【0260】

図４６は、無細胞ＤＮＡ分子が腫瘍ＤＮＡに対応するか否かをそのメチル化ハプロタイプ情報に応じて予測するプロセス例を図示する概略図４６００を示す。図４６中、血漿ＤＮＡ分子をＳＭＲＴ配列決定に供した。各配列決定されたリードのＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を、ＨＫモデルを使用して導き出した（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０２１；１１８： ｅ２０１９７６８１１８）。血漿ＤＮＡの起源組織をそのメチル化ハプロタイプによって追跡する実行可能性を実証するために、各参照組織、例えばバフィーコート及びＨＣＣ腫瘍における、血漿ＤＮＡ分子（ＣｐＧ部位にわたるメチル化状態（０／１））とＣｐＧ部位に対応する集計メチル化指数（それぞれ０～１の範囲の連続値）との間のメチル化状態の面での距離を計算してもよい。いくつかの実例において、濃い色は対応するＣｐＧ部位のメチル化（「１」）を示し、白色はＣｐＧ部位の非メチル化（「０」）を示す。参照腫瘍組織の各円グラフは対応するＣｐＧ部位でメチル化された参照ＤＮＡ分子の割合（百分率）を表すことができる。よって、円グラフの大部分が濃い色であることは、高い割合の参照ＤＮＡ分子が対応するＣｐＧ部位でメチル化されていることを意味する。

【0261】

よって、所与の長い無細胞ＤＮＡ分子の各ＣｐＧ部位のメチル化状態は、参照組織の各々の円グラフと比較することができ、組織のマッチングは、総合的に考慮すると長い無細胞ＤＮＡ分子上に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態からのずれが最も少ない参照組織パターンに基づいて特定できる。例えば、ＣｐＧ部位について、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化状態と参照腫瘍組織における参照ＤＮＡ分子の割合との間の第１距離を計算してもよい。例として、ＤＮＡ分子上のメチル化部位（１）と６０％のメチル化指数（密度）を有する参照との間の距離は０．４であり得る。ＤＮＡ分子がメチル化されていない場合、距離は０．６であり得る。同じＣｐＧ部位について、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化状態と参照バフィーコートにおける参照ＤＮＡ分子の割合との間の第２距離を計算してもよい。第１及び第２距離を比較してもよい。この例において、第１距離は第２距離未満であり、これは、ＣｐＧ部位が参照腫瘍組織と同様のメチル化状態を有することを示すことができる。

【0262】

いくつかの実施形態において、メチル化されたと同定された配列決定ＣｐＧの百分率又は割合と定義された、参照組織におけるＣｐＧ部位の各々のメチル化指数は、亜硫酸水素塩配列決定（ＢＳ－ｓｅｑ）データから取得される。追加的に又は代替的に、参照組織における集計メチル化指数は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑデータ（即ちＥＭ－ｓｅｑ）から取得され得る。

【0263】

血漿ＤＮＡ及び参照組織メチロームのメチル化ハプロタイプ間の距離としては、ユークリッド距離、コサイン類似度、ハミング距離、編集距離等を含み得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、距離計算は、異なるゲノム位置に応じて重み付けベクターによって調整できる。例えば、腫瘍組織と非腫瘍組織のメチル化の差異が大きな位置には、より高い重みが割り当てられる。対照的に、腫瘍組織と非腫瘍組織の間のメチル化の差異が小さな位置には、より低い重みが割り当てられる。
Ｃ．メチル化スコアを用いた起源組織分析
１．肝細胞癌（ＨＣＣ）

【0264】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のメチル化パターン分析は、追加の計算を使用して血漿ＤＮＡ分子の起源組織の分析を更に例示することを含み得る。説明的な例として、各血漿ＤＮＡ分子のメチル化パターンを、ホリスティック動態（ＨＫ）モデルを使用してＣｐＧ部位周囲のポリメラーゼ動態信号に応じて特定した（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０２１；１１８： ｅ２０１９７６８１１８）。各血漿ＤＮＡ分子のかかるメチル化パターンを、肝臓組織、バフィーコート、結腸組織、肺組織等に限定されない参照メチル化プロファイルと比較した。いくつかの実施形態において、参照メチル化プロファイルは、高深度亜硫酸水素塩配列決定の結果に基づいて取得される。各参照組織のゲノムにおける各ＣｐＧ部位について、メチル化指数（ＭＩ）を下記式によって計算した。

【数7】

式中、「Ｃ」は配列決定されたシトシン（即ちメチル化ＣｐＧ）の数を表し、「Ｔ」は、配列決定されたチミン（即ち非メチル化ＣｐＧ）の数を表す。

【0265】

肝臓組織とバフィーコートの間のＭＩ差が３０％より大きいＣｐＧ部位を下流分析に情報価値のあるものと認めた。いくつかの実施形態において、ＭＩ差としては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％等を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、その分子において観察されたメチル化パターンと参照メチル化プロファイルの比較に基づいてＤＮＡ分子が特定の組織を起源とする尤度を特定するために、スコアリングシステムが使用される。ｎ個の情報価値のあるＣｐＧ部位を持つ各ＤＮＡ分子について、メチル化スコアＳ（ｌｉｖｅｒ）を下記式によって計算した。

【数8】

式中、

はＣｐＧ部位ｉのメチル化状態を示し、０及び１の

はそれぞれ非メチル化及びメチル化ＣｐＧ部位を表し、

は肝臓におけるＣｐＧ部位ｉのメチル化指数を示す。Ｓ（ｌｉｖｅｒ）が高いほど、ＤＮＡ分子が肝臓組織を起源としている尤度が高い。

【0266】

同様に、血漿ＤＮＡ分子とバフィーコートの間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）を以下にように計算した。

【数9】

【0267】

同様に、血漿ＤＮＡ分子と結腸の間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｃｏｌｏｎ）を以下にように計算した。

【数10】

【0268】

同様に、血漿ＤＮＡ分子と肺の間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｌｕｎｇ）を以下にように計算した。

【数11】

【0269】

Ｓ（ｌｉｖｅｒ）、Ｓ（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、Ｓ（ｃｏｌｏｎ）及びＳ（ｌｕｎｇ）のうち、Ｓ（ｌｉｖｅｒ）が最高であると、対応するＤＮＡ分子は肝臓起源と分類される。さもないと、それは、どのメチル化スコアが最高であるかに応じて、造血系、結腸、又は肺起源と分類される。
２．癌メチル化スコアを用いたＨＣＣ病期予測

【0270】

図４７は、本開示の実施形態に係るメチル化ハプロタイプ分析に基づき、異なる病期のＨＣＣ患者において肝臓起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する箱ひげ図４７００を示す。特に、図４７は、ＢＣＬＣ病期分類システムによる異なる病期のＨＣＣを有する患者における血漿ＤＮＡ分子の百分率を示す。病期の進行に伴い、肝臓由来断片が増加する傾向がある。血漿ＤＮＡ分子の起源組織分析から、患者が患っている癌の病期等、疾患の重篤度を特定できる。よって、メチル化ハプロタイプベースの分析は、治療法選択及び予後予測の指導に効果的に使用できる。

【0271】

本開示に記載の実施形態に係るメチル化ハプロタイプ分析及びメチル化スコアに基づき、癌メチル化スコアと名付けられたメトリックを使用して癌の存在及び／又は重篤度を反映することができる。血漿ＤＮＡ分子のメチル化パターンを、癌を含む参照組織のメチル化プロファイルと比較した。メチル化パターンの面でＤＮＡ分子と分析される腫瘍の間の類似度を反映する第１スコアＳ（ｃａｎｃｅｒ）を下記式によって計算した。

【数12】

式中、

は血漿ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位ｊのメチル化状態であり、

は腫瘍組織（例えば、肺組織、肝臓組織、結腸組織、バフィーコート）の参照メチロームにおける対応するＣｐＧ部位のメチル化指数であり、ｎは血漿ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位の総数である。

【0272】

同様に、ＤＮＡ分子のメチル化パターンと、バフィーコート、肝臓組織、結腸組織、肺組織等に限定されない組織参照メチル化プロファイルとの間の比較の中で最も高い類似度を特定するために、第２スコアＳ（ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ）を下記式によって計算した。

【数13】

【0273】

最後に、下記式を使用してＳ（ｃａｎｃｅｒ）及びＳ（ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ）の両方を統合して癌メチル化スコアを生成した。

【数14】

式中、Ｔは、１つの個体において分析される血漿ＤＮＡ分子の総数である。癌メチル化スコアが高いほど、試験サンプルが癌を有する可能性が高い。この分析における癌タイプとしては、ＨＣＣ、膀胱癌、乳癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、甲状腺癌等を含み得るが、それらに限定されない。

【0274】

図４８は、いくつかの実施形態に係る、異なる病期にわたるＨＣＣ患者の癌メチル化スコアを同定する箱ひげ図４８００を示す。図４８は、ＨＣＣを有する患者の癌メチル化スコア（「ＨＣＣメチル化スコア」とも呼ばれる）が特定された癌メチル化スコア分析を示す。ＨＣＣ患者は、ＢＣＬＣ病期分類システムによる異なる病期のＨＣＣを有した。病期の進行に伴い、ＨＣＣメチル化スコアが徐々に増加した。よって、癌メチル化スコア分析に基づき、患者が患っている癌の病期等、疾患の重篤度を特定できる。よって、癌メチル化スコアは、治療法選択及び予後予測の指導に効果的に使用できる。

【0275】

いくつかの実施形態において、ＨＣＣメチル化スコアに基づいてＨＣＣ患者のコホートに生存率分析を実施した。例えば、ＨＣＣメチル化スコアがＨＣＣメチル化スコアの中央値以下の症例を「群Ａ」と分類し、ＨＣＣメチル化スコアがＨＣＣメチル化スコアの中央値より大きい症例を「群Ｂ」と分類した。カプラン・マイヤー生存率曲線を使用して異なる群間の生存確率分布を反映することができる。本明細書に記載のように、生存率曲線は、所与の群における各年齢まで生存した個体の数又は割合を示すグラフに対応する。生存率曲線の急速な低下は、生存率曲線の緩徐な低下と比較して、所与の群がより早く死亡することを示す。

【0276】

図４９は、いくつかの実施形態に係る、ＨＣＣ患者における生存率分析を同定する１組の生存率曲線４９００を示す。曲線４９０２は、ＨＣＣメチル化スコア分析用の少なくとも７つのＣｐＧ部位を有するＤＮＡ分子を示す。曲線４９０４は、ＨＣＣメチル化スコア分析用の７つ未満のＣｐＧ部位を有するＤＮＡ分子を示す。図４９に示すように、群Ｂ（４９０６Ａ及び４９０６Ｂ）内のＨＣＣ患者は、群Ａ（４９０８Ａ及び４９０８Ｂ）より生存率が悪い傾向にある。少なくとも７つのＣｐＧ部位を有するより長いｃｆＤＮＡ分子（長さの中央値：７５８ｂｐ、曲線４９０２）を使用すると、７つ未満のＣｐＧ部位を有するより短いＤＮＡ分子（長さの中央値：３１１ｂｐ、曲線４９０４）の使用よりも、２群間のカプラン・マイヤー生存率曲線の差より大きくなり、これは、予後予測において長いｃｆＤＮＡ分子の使用が短いｃｆＤＮＡ分子より効果的であることを示唆する。例えば、２年後、曲線４９０２は、群Ａ患者の９１％が生存でき、群Ｂ患者の８１％が生存できることを示し、ここで対応する癌メチル化スコアは短いｃｆＤＮＡ分子から導き出されたものである。対照的に、曲線４９０４は、群Ａ患者の９６％が生存でき、群Ｂ患者の７７％が生存できることを示し、ここで対応する癌メチル化スコアは長いｃｆＤＮＡ分子から導き出されたものである。よって、癌メチル化スコア分析は疾患の生存確率を特定するために使用できる。

【0277】

加えて、癌メチル化スコアは、様々な配列決定プラットフォームを使用して取得された長い配列リードに基づいて効果的に使用できる。図５０は、ＳＭＲＴ－ｓｅｑ（５００２）及びナノポア配列決定（５００４）からのデータを使用して計算されたＨＢＶ保菌者及びＨＣＣ患者のＨＣＣメチル化スコアを同定する箱ひげ図５０００を示す。ＨＣＣメチル化スコアは、本開示における実施形態に従って計算された。図５０に示すように、ＨＣＣ患者は、ＳＭＲＴ－ｓｅｑ（Ｐ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定）及びナノポア配列決定（Ｐ＝０．００２６、マンホイットニーＵ検定）の両方においてＨＢＶ保菌者より有意に高いＨＣＣメチル化スコアを示した。

【0278】

よって、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）によるナノポア配列決定も、核酸の分析に利用できる。ナノポア配列決定の効果を実証するために、８人のＨＣＣ患者及び６人のＨＢＶ保菌者からの血漿ＤＮＡ分子をナノポア配列決定及びＳＭＲＴ配列決定の両方で配列決定した。図５１は、ＳＭＲＴ－ｓｅｑ及びナノポア配列決定からのデータを使用してＨＢＶ保菌者（５１０２）及びＨＣＣ患者（５１０４）からの血漿サンプルにおいて単一分子起源組織分析によって肝臓由来ｃｆＤＮＡの百分率を同定するグラフ５１００を示す。図５１に示すように、ナノポア配列決定を使用してＨＢＶ保菌者及びＨＣＣ患者において肝臓起源と分類されたｃｆＤＮＡ分子の百分率は、ＳＭＲＴ配列決定によるものに一致することを示した（ピアソン相関、ｒ＝０．９９、Ｐ＜０．００１）。
３．結腸直腸癌（ＣＲＣ）

【0279】

ＨＣＣに加えて、ＳＭＲＴ－配列決定を使用してＣＲＣ患者、ＨＣＣ患者及び健康対象からの血漿ＤＮＡ分子を分析し、メチル化スコアにより起源組織を分析した。

【0280】

結腸組織とバフィーコートの間のＭＩ差が３０％より大きいＣｐＧ部位を下流分析に情報価値のあるものと認めた。いくつかの実施形態において、ＭＩ差としては、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％等を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、その分子において観察されたメチル化パターンと参照メチル化プロファイルとの比較に基づいてＤＮＡ分子が特定の組織を起源とする尤度を特定するために、スコアリングシステムが使用される。ｎ個の情報価値のあるＣｐＧ部位を持つＤＮＡ分子について、メチル化スコアＳ（ｃｏｌｏｎ）を下記式によって計算した。

【数15】

式中、

はＣｐＧ部位ｉのメチル化状態を示し、０及び１の

はそれぞれ非メチル化及びメチル化ＣｐＧ部位を表し、

は結腸におけるＣｐＧ部位ｉのメチル化指数を示す。Ｓ（ｃｏｌｏｎ）が高いほど、ＤＮＡ分子が結腸組織を起源とする尤度が高い。

【0281】

同様に、血漿ＤＮＡ分子とバフィーコートの間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）を以下のように計算した。

【数16】

【0282】

同様に、血漿ＤＮＡ分子と肝臓の間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｌｉｖｅｒ）を以下のように計算した。

【数17】

【0283】

同様に、血漿ＤＮＡ分子と肺の間のメチル化パターンの類似度を特定するために、別のメチル化スコアＳ（ｌｕｎｇ）を以下のように計算した。

【数18】

【0284】

Ｓ（ｃｏｌｏｎ）、Ｓ（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、Ｓ（ｌｉｖｅｒ）及びＳ（ｌｕｎｇ）のうち、Ｓ（ｃｏｌｏｎ）が最高である場合、対応するＤＮＡ分子は結腸起源と分類される。さもないと、それは、どのメチル化スコアが最高であるかに応じて、造血系、肝臓、又は肺起源と分類される。

【0285】

図５２は、本開示に提示された実施形態に基づいて１５人の健康対象、４５人のＨＣＣ患者及び４人のＣＲＣ患者において結腸起源と分類された血漿ＤＮＡ分子の百分率を同定する箱ひげ図５２００を示す。この分析例には、少なくとも７つのＣｐＧ部位を有するＤＮＡ分子（長さの中央値：８９６ｂｐ）が含まれた。図５２に示すように、ＣＲＣ患者は、健康対象（Ｐ値：０．０００５、マンホイットニーＵ検定）よりも、結腸起源と分類されたＤＮＡ分子の百分率が有意に高く、ＣＲＣとＨＣＣ患者の間の明確な分離が示される（Ｐ値：０．００１８、マンホイットニーＵ検定）。これは、結腸直腸癌を有する対象と有さない対象を区別する際の本開示における実施形態のメチル化スコア分析の診断能力を実証しただけでなく、癌の起源組織を正確に特定する際の特異性も強調した。
Ｄ．疾患の組織学的状態

【0286】

長い無細胞ＤＮＡ分子に更に分析を行って疾患の組織学的状態を取得してもよい。図５３は、いくつかの実施形態に係るメチル化ハプロタイプ分析に基づき、血管浸潤を有するＨＣＣ患者と有さないＨＣＣ患者の間でＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する１組のバープロット５３００を示す。図５３は、ＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率の中央値が、血管浸潤を有さないＨＣＣ患者（１４．０８％）よりも、血管浸潤を有するＨＣＣ患者の方が高かった（１６．６８％）ことを示す。データは、メチル化ハプロタイプベースの分析によって同定された腫瘍由来ＤＮＡ分子を腫瘍の組織学的状態に関する情報を提供するために使用することを示唆した。
Ｅ．長い無細胞ＤＮＡ分子を用いたメチル化ベースの分析と短い無細胞ＤＮＡ分子を用いたメチル化ベースの分析との比較

【0287】

サイズが１ｋｂより大きい血漿ＤＮＡを使用すると、生体サンプルについて疾患を正確に分類することができる。図５４は、いくつかの実施形態に係る、ＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率を同定する１組のバープロット５４００を示す。図５４は、ＨＣＣ腫瘍起源であると特定されるＤＮＡ分子の百分率が、ＨＣＣを有さない患者よりも、ＨＣＣを有する患者の方が有意に高かった（中央値：１４．７８％対１０．９８％。Ｐ値：０．０２４、マンホイットニーＵ検定）ことを示す。結果は、長い血漿ＤＮＡ分子ごとの組織起源／腫瘍起源の分析が癌検出用のツールとして機能することを示唆した。

【0288】

更に、長い血漿ＤＮＡのメチル化ハプロタイプ分析が短いＤＮＡ分子（＜６００ｂｐ）の使用よりも利点があるか否かを評価するために、ＨＣＣを有する患者と有さない患者からのサンプルのＰａｃＢｉｏ直接メチル化ＨＫモデル分析（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０２１；１１８： ｅ２０１９７６８１１８）を使用して取得された血漿ＤＮＡ配列データを２つの群に分割した。第１群の分子は、＞１ｋｂのサイズに対応し、第２群の分子は＜６００ｂｐのサイズに対応した。第１群について、本開示に提示された実施形態に従ってメチル化ハプロタイプに基づいて腫瘍由来分子の検出を試みた。第２群について、全体的なメチル化レベル（血漿ＤＮＡ分子によるヒトゲノム全体におけるメチル化ＣｐＧ部位の百分率）を計算し、メチル化ハプロタイプ情報の代わりに集計メチル化レベルに基づいて肝臓ＤＮＡ寄与を特定した。

【0289】

図５５は、長い無細胞ＤＮＡの単一分子メチル化配列データの分析の癌検出精度、及び短い無細胞ＤＮＡのメチル化配列データを使用する他の分析の癌検出精度を同定する１組のＲＯＣ曲線５５００を示す。線Ａ（５５０２）は、本開示に提示された実施形態に係る、サイズが＞１ｋｂの血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプ分析を示す。線Ｂ（５５０４）は、＜６００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子によるヒトゲノム全体におけるメチル化ＣｐＧ部位の百分率を示す。線Ｃ（５５０６）は、二次計画法アプローチを使用して、メチル化ハプロタイプ情報の代わりに＜６００ｂｐの血漿ＤＮＡ分子の集計メチル化レベルによって、導き出された肝臓寄与を示す。

【0290】

図５５は、第１群の分子（例えば、長い無細胞ＤＮＡ分子）を用いたメチル化ハプロタイプ分析（ＡＵＣ：０．８３）が、第２群の分子で検査された他の２つの方法（ＡＵＣ：＜０．７）を上回ったことを示す。これらの結果は、癌検出において、長い血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプベースの分析がより短い血漿ＤＮＡ分子のメチル化分析より優れることを実証した。

【0291】

別の比較分析を行って長い無細胞ＤＮＡ分子を用いたメチル化ハプロタイプベースの分析と短い無細胞ＤＮＡ分子の血漿ＤＮＡ組織マッピング分析の実績を比較した。短い無細胞ＤＮＡ分子を取得するために、ショートリード亜硫酸水素塩配列決定技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して３４人の対照及び３８人のＨＣＣ対象を配列決定し、中央値が２億１，１００万の７５ｂｐ ｘ ２ペアエンドリード（範囲：１億１，２００万～１６億８，１００万）であった。

【0292】

図５６は、長いＤＮＡ５６０２（＞１ｋｂ）を用いたメチル化ハプロタイプベースの分析のＨＣＣ検出精度、及び短い血漿ＤＮＡ分子５６０４（＜６００ｂｐ）のショートリード亜硫酸水素塩配列決定を用いた血漿ＤＮＡ組織マッピング分析のＨＣＣ検出精度を同定する１組のＲＯＣ曲線５６００を示す。図５６に示すように、このサンプルのコホートについて、血漿ＤＮＡ組織マッピング分析（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１５；１１２：Ｅ５５０３－５５１２）は、ＨＣＣを有する患者と有さない患者を区別する際に０．７６のＡＵＣを提供した。かかるＡＵＣ値は、短い血漿ＤＮＡ分子に基づく分析の実績が長い血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプに基づく分析の実績（ＡＵＣ：０．８３）を下回ったことを示す。短いＤＮＡ分子の集団からのゲノム領域における集計メチル化確率を利用した血漿ＤＮＡ組織マッピング（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１５；１１２：Ｅ５５０３－５５１２）では、個別の長い血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプに関する情報及び有用性を考慮に入れていなかった。
Ｆ．長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターン分析方法

【0293】

図５７は、いくつかの実施形態に係る、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて対象の生体サンプルを分析するプロセス例を図示するプロセス５７００のフローチャートを示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては複数の組織型の１つ又は複数に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は、生体サンプルにおいて無細胞である。

【0294】

ステップ５７０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。メチル化認識配列決定は、酵素処理を含み得る。いくつかの実例において、メチル化認識配列決定は亜硫酸水素塩処理を含まない。他の実例において、亜硫酸水素塩処理は使用される。配列リードの各々は、配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）でのメチル化状態のメチル化パターンを含み得る。例えば、配列リードは、「－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－」のメチル化パターンを表示する６つのＣｐＧ部位を含み得、ここで「Ｍ」はメチル化状態を表し、「Ｕ」は非メチル化状態を表す。別の例において、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。メチル化パターンは、１組の部位のうちの部位対間の塩基の数（例えば、塩基の指定された数）、及び塩基のアイデンティティを含み得る。

【0295】

ｃｆＤＮＡ分子の部位でのメチル化状態は、本明細書に記載のように、硫酸水素塩変換を使用して調べることができる。亜硫酸水素塩変換とは別に、当業者に既知の他のプロセスを使用してＤＮＡ分子のメチル化状態を調べることができ、これらのプロセスは、メチル化状態に感受性の酵素（例えばメチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に感受性のプラットフォームを用いた単一分子配列決定（例えばナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１３； １１０： １８９１０－１８９１５）及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子リアルタイム分析（Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０２１； １１８： ｅ２０１９７６８１１８）による）を含むが、それらに限定されない。

【0296】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択され得る。

【0297】

１組の部位は、様々な数としてもよい。いくつかの実例において、配列リードの各々の１組の部位は、少なくともＮ個の部位を含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０より多い部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、５００ｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、３つのＣｐＧ部位）を含み得る。

【0298】

ステップ５７０４及び５７０６を、ステップ５７０２から受け取った配列リードのうちの各配列リードに対して行ってもよい。ステップ５７０４で、配列リードのメチル化パターンを第１参照メチル化パターンと比較してもよい。いくつかの実例において、第１参照メチル化パターンは、第１組織型に対応する。第１組織型は疾患組織型であり得る。いくつかの実例において、第１組織型は疾患に関連する。追加的に又は代替的に、配列リードのメチル化パターンを、更に１つ又は複数の他の参照メチル化パターンのうちの各参照メチル化パターンと比較してもよい。各参照メチル化パターンは、複数の組織型のうちの組織型に対応し得る。

【0299】

参照メチル化パターンの値は、二進値（例えば、図４１又は４２中の０及び１）であり得るか又は小数（例えば、２０％のメチル化指数を示す０．２）を有し得る。参照パターンは、組織型に対して一般的であり得るか又は特定の位置に固有であり得る。このようなケースでは、配列リードの位置を特定してもよい。したがって、いくつかの実施形態において、メチル化パターンを参照パターンと比較することは、配列リードの位置を（例えば、参照ゲノムに対して）特定することを含み得、ここで参照メチル化パターンは該位置での参照配列に対応する。

【0300】

いくつかの実例において、配列リードのメチル化パターンと第１参照メチル化パターンとの間の比較は、部位のメチル化状態と同部位での第１参照メチル化パターンのメチル化指数との差に基づいて類似度メトリックを計算することを含み得る。類似度メトリックは、距離（例えば、ユークリッド距離）、コサイン類似度、又はメチル化スコアであり得る。

【0301】

いくつかの実例において、メチル化状態は、対応する部位がメチル化されているか否かを示す。この実例において、メチル化状態は、部位のメチル化を示す２進値を含む。類似度メトリックは、配列リードの集計値（例えば、合計、代表値、中央値）を特定するために１組の部位から決定されてもよい。集計値は配列リードの組織分類を特定するために１つ又は複数のカットオフと比較してもよく、ここで１つ又は複数のカットオフは、第１組織型に関連すると知られる参照サンプルを使用して同定してもよい。追加的に又は代替的に、メチル化パターンと第１参照メチル化パターンの比較は、対応する１組の部位でのメチル化状態に基づいて配列リードのメチル化レベルを特定し、該メチル化レベルに基づいて第１参照メチル化パターンから特定された別のメチル化レベルとの差を特定し、そして該差を１つ又は複数のカットオフ値と比較することを含み得る。メチル化レベルは、メチル化指数、メチル化密度、１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でメチル化された分子の個数、又は１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でのメチル化された分子（例えば、シトシン）の割合であり得る。

【0302】

いくつかの実例において、類似度メトリックは、メチル化スコアである。メチル化スコアを計算するために、第１参照メチル化パターンを表す参照メチル化プロファイルを、第１参照メチル化パターンが取得されたゲノムにおける各ＣｐＧのメチル化指数を計算することで特定してもよい。次に、配列リードの各ＣｐＧ部位について、ＣｐＧ部位のメチル化状態（例えば、０と１間の２進値）と同ＣｐＧ部位での対応するメチル化指数との差を特定してもよい。ＣｐＧ部位にわたって特定された差を集計して配列リードのメチル化スコアを特定してもよい。いくつかの実例において、集計値は、配列リードのメチル化スコアを特定するために、（例えば、配列リードのＣｐＧ部位の総数によって）正規化される。メチル化スコアを特定するステップは、本開示のセクションＩＶ．Ｃ及びＩＶ．Ｄに更に記載される。

【0303】

ステップ５７０６で、比較に基づき、配列リードの組織分類を特定してもよい。組織分類は、上記で図４１、４２、及び４６について説明したように行ってもよい。例えば、比較は、メチル化パターンの１組の部位のうちの各部位について、部位のメチル化状態と第１参照メチル化パターンの対応する部位のメチル化指数との類似度メトリックを特定することで、特定されてもよい。１組の部位にわたる類似度メトリックは、集計値（例えば、類似度メトリックの合計）を特定するために集計されてもよい。集計値がカットオフ値を超える場合、配列リードは第１組織型に関連すると分類できる。集計値がカットオフ値を超えていない場合、配列リードは他の組織型の１つに関連すると分類できる。カットオフ値は、第１組織型に関連すると知られる１つ又は複数の参照サンプルを使用して決定してもよい。

【0304】

別の例において、最も近い参照メチル化パターンは、それぞれの集計値に基づいて１組の参照メチル化パターンの間（例えば、第１参照メチル化パターン及び１つ又は複数の他の参照メチル化パターン）で同定でき、組織分類は、最も高い集計値を有する参照メチル化パターンの対応する組織型と特定できる。特に、上記の段落に記載の集計値は、各参照メチル化パターンについて特定できる。次に、配列リードは、最も高い集計値を有する参照メチル化パターンに関連する組織型に由来すると分類できる。よって、組織分類は、配列リードが複数の組織型の１つに由来すること（又はその由来の程度）を示すことができる。組織分類は、配列リードが複数の組織型の１つに由来する確率を含み得る。１つより多くの組織型の確率を特定してもよい。

【0305】

追加的に又は代替的に、最も近い参照メチル化パターンを、メチル化状態の直接比較に基づいて１組の参照メチル化パターン（例えば、第１参照メチル化パターン及び１つ又は複数の他の参照メチル化パターン）の間で同定してもよく、組織分類を、最も近いメチル化参照パターンの対応する組織型と特定してもよい。例えば、配列リードは「－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－」のメチル化パターンを表示する６つのＣｐＧ部位を有し、ここで「Ｍ」はメチル化状態を表し、及び「Ｕ」は非メチル化状態を表す。他の分子は、「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－」、「－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－」、「－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－」の参照メチル化パターンを表示する他の組織からの対応するＣｐＧ部位を含有する。しかし、（例えば）肝臓組織に対応する参照メチル化パターンは「－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－」であってもよい。この例において、配列リードは、肝臓組織に関連すると特定できる。よって、分子における１組のＣｐＧ部位にわたるメチル化パターンの組み合わせは、細胞性質又は疾患状態を示す「分子バーコード」として機能できる。

【0306】

比較がメチル化スコアの使用を伴う場合、組織分類は、配列リードのメチル化状態及び他の参照メチル化パターンからのメチル化指数に基づいて他のメチル化スコアを特定することを含んでもよい。例えば、第１参照メチル化パターンは第１組織型（例えば、肝臓）に対応し得、第２メチル化パターンは第２組織型（例えば、バフィーコート）に対応し得、第３メチル化パターンは第３組織型（例えば、結腸）に対応し得る。次に、最も高いメチル化スコアに関連する組織型を配列リードの組織分類として特定できる。いくつかの実例において、比較は、２つの参照メチル化パターン（例えば、第１及び第２参照メチル化パターン）のメチル化スコアを比較することを含み、ここで第１参照メチル化パターンは第１組織型に対応し、第２参照メチル化パターンは１つ又は複数の他の組織型に対応する。メチル化スコアを使用して組織分類を行うステップは本開示のセクションＩＶ．Ｃに更に記載される。

【0307】

第１組織型が疾患型である場合、疾患組織（例えば、ＨＣＣ）の参照メチル化プロファイルに対応する第１メチル化スコア（例えば、Ｓ（ｃａｎｃｅｒ）スコア）を特定でき、健康組織（例えば、非ＨＣＣ）の参照メチル化プロファイルに対応する第２メチル化スコア（例えば、Ｓ（ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ）スコア）を特定できる。次に、疾患を分類するために、配列リードについて特定された第１及び第２メチル化スコアを一緒に使用して癌メチル化スコアを特定してもよい。癌メチル化スコアを使用して疾患分類を行うステップは、本開示のセクションＩＶ．Ｄに更に記載される。

【0308】

ステップ５７０８で、生体サンプルの疾患の疾患分類を配列リードの組織分類に基づいて特定してもよい。組織型が疾患組織型である場合、組織分類と疾患分類は同等であり得る。疾患分類について、ステップ５７０６で特定された癌メチル化スコアを使用して疾患分類を特定してもよい。疾患は癌であり得る。疾患分類の特定は、癌による血管浸潤の有無を判定することを含み得る。いくつかの実例において、疾患分類の特定は、（ｉ）第１組織型に由来すると分類された配列リードの第１量を特定すること、及び（ｉｉ）第１量を１つ又は複数の参照値と比較した上で生体サンプルの疾患の分類を特定することを含む。

【0309】

１つ又は複数の参照値は、疾患の分類が既知の参照サンプルから決定されてもよい。配列リードの第１量が１つ又は複数のカットオフ値を超えると、対象は疾患をゆすると分類できる。対照的に、配列リードの第１量が１つ又は複数のカットオフ値を超えていないと、対象は疾患を有さないと分類できる。

【0310】

量は、第１組織型の確率の合計であり得る。例えば、組織分類が確率値又はメチル化スコアに対応する場合、配列リードの第１量は、第１組織型に由来すると分類された配列リードの確率値又はメチル化スコアの合計を含み得る。いくつかの実例において、合計は、確率閾値を上回る配列リードの確率値又はメチル化スコアに基づいて特定される。

【0311】

いくつかの実例において、疾患分類は、第１参照メチル化パターンに対応する配列リードの第１量を１つ又は複数の他の参照メチル化パターンの量と比較することで特定され、ここで１つ又は複数の他の参照メチル化パターンの各々は１つ又は複数の他の組織型に関連する。１つ又は複数の他の組織型に由来すると分類された配列リードの１つ又は複数の他の量を特定してもよい。配列リードの第１量と１つ又は複数の他の量との比較に基づき、生体サンプルの疾患の分類を特定できる。例えば、配列リードの第１量が最大量である場合、対象は第１組織型の疾患を有すると特定できる。

【0312】

疾患の分類は、疾患の重篤度の分類（例えば、疾患無し、早期、中期、進行期）を含み得る。例えば、疾患の分類は、ＢＣＬＣ病期に従う癌の病期を含み得る。次に、分類は病期の１つを選択してもよい。したがって、分類は、疾患の複数の病期（例えば、ＨＣＣのＢＣＬＣ病期の１つ）から特定できる。いくつかの実例において、疾患は癌である。例として、癌は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、及び頭頸部扁平上皮癌であり得る。
Ｖ．疾患重篤度を予測するための長い無細胞ＤＮＡ分子の単一分子メチル化レベル分析

【0313】

疾患重篤度の評価は、治療法決定、予後予測及び監視の指導に重要である。肝細胞癌（ＨＣＣ）を例にすると、早期ＨＣＣ（例えばバルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）０／Ａ）を有する患者は、生存期間の中央値が＞５年と予想され、通常、焼灼術、切除術及び移植のような治癒治療が提供される。対照的に、進行期ＨＣＣ（例えばＢＣＬＣ Ｃ）を有する患者は、生存期間の中央値が＞２年と予想され、通常、全身性治療が提供される（Ｒｅｉｇ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ２０２２；７６：６８１－６９３）。

【0314】

本開示の実施形態によれば、単一分子メチル化パターン分析及びｃｆＤＮＡ起源組織分析に限定されないｃｆＤＮＡ分子のメチル化に基づく分析は、癌病期の予測に限定されない疾患の重篤度の予後判定に使用できる。
Ａ．単一分子メチル化レベルを用いた疾患分類

【0315】

単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ）を使用して４５人のＨＣＣ患者、１３人のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）保菌者及び１５人の健康個体からの血漿ＤＮＡ分子を配列決定した。図５８は、いくつかの実施形態に係る、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ）際の個体の異なる群内の単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図５８００を示す。ＨＣＣ患者からの血漿ＤＮＡ分子は、対照個体よりも、平均単一分子メチル化レベルが有意に低かった（Ｐ値：０．００５、マンホイットニーＵ検定）（図５８）。本明細書における単一分子レベルは、単一分子においてメチル化されたと特定されるＣｐＧ部位の百分率によって定義された。例えば、ＤＮＡ分子が１０つのＣｐＧ部位を含有し且つその５つがメチル化されたと特定された場合、単一分子メチル化レベルは５０％（即ち５／１０＊１００％）となる。単一分子メチル化レベルは、所与の生体サンプルの配列リードの各々について特定されてもよく、ここで統計値（例えば、平均、中央値）は、単一分子メチル化レベルから特定できる。図５８におけるこれらのデータは、単一分子メチル化レベルの使用によりＨＣＣ患者の検出が可能になることを示唆した。

【0316】

いくつかの実施形態において、ＳＭＲＴ－ｓｅｑで分子のサイズ、ＣｐＧ部位の数及びメチル化レベルに限定されない基準に基づいてより多くの長いｃｆＤＮＡ分子を取得できることから、基準を診断実績の更なる強化に使用でき、長いｃｆＤＮＡ分子（例えば＞６００ｂｐ）を配列決定できないＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームについてはこれは適さなかった。

【0317】

図５９は、サイズが＞５００ｂｐであり、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含有し、ＳＭＲＴ－Ｓｅｑにおいてメチル化レベルが≦６０％であるＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図５９００を示す。図５９に示すように、サイズが＞５００ｂｐであり、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含有し、メチル化レベルが≦６０％であるＤＮＡ分子について、それぞれ、健康対象、ＨＢＶ保菌者及びＨＣＣ患者における平均単一分子メチル化レベルを分析した。ＨＣＣを有さない患者と比較してＨＣＣ患者が有意に低いメチル化レベルを示すことを発見した（Ｐ－値：２．１３２ ｘ １０^－８、マンホイットニーＵ検定）。

【0318】

図６０は、いくつかの実施形態に係る、ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ及びショートリード配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）においてＨＣＣ対象と非ＨＣＣ対象を区別する際の単一分子メチル化レベルの実績を同定するＲＯＣ曲線６０００を示す。図６０に示すように、サイズ選択を経ていないＤＮＡ分子全体と比較して、サイズが＞５００ｂｐの分子（６００２）に基づくこのような選択的分析は診断実績を向上させ、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）が０．７から０．８７に向上した。加えて、ショートリード配列決定に基づくこのようなメチル化分析に使用される＞５００ｂｐの分子（６００４）は、０．５６のＡＵＣのみ提供し（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０２０； １０：６６４－６７３）、これは本明細書に開示された実施形態より遥かに悪かった。

【0319】

図６１は、異なるバルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）病期のＨＣＣ患者における単一分子メチル化レベルを同定する箱ひげ図６１００を示す。図６１は、患者における平均単一分子メチル化レベルがＢＣＬＣ病期分類システムに従う異なるＨＣＣ病期に応じて変化したことを示す。癌病期の進行に伴い、単一分子メチル化レベルが徐々に低下した。よって、血漿ＤＮＡ分子の単一分子メチル化レベルは、患者が患っている癌の病期等、疾患の重篤度に関する情報を提供するために使用できる。実際に、血漿ＤＮＡ分子の単一分子メチル化レベルは、治療法選択及び予後予測を指導することができる。いくつかの実例において、長い血漿ＤＮＡ分子（例えば、サイズが６００ｂｐより大きい）の単一分子メチル化レベルは、疾患の重篤度を特定する精度の向上に使用される。
Ｂ．ＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルを使用して疾患分類を特定する方法

【0320】

図６２は、いくつかの実施形態に係る、ＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルを使用して疾患分類を特定するプロセス例を図示するフローチャート６２００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては複数の組織型の１つ又は複数に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0321】

ステップ６２０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。配列リードの各々は、配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）に対応するメチル化状態を含み得る。メチル化認識配列決定は、各無細胞ＤＮＡ分子の各ＣｐＧ部位でのメチル化状態を同定するために使用できる単一分子配列決定又はナノポア配列決定を含み得る。例えば、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ－Ｓｅｑ）又はナノポア配列決定を使用して無細胞ＤＮＡ分子を配列決定して配列リードを取得してもよい。追加的に又は代替的に、亜硫酸水素塩変換、メチル化状態に感受性の酵素（例えばメチル化感受性制限酵素）、及びメチル化結合タンパク質に限定されない他のプロセスは、ＣｐＧ部位のメチル化状態を同定するために使用してもよい。

【0322】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択され得る。

【0323】

いくつかの実例において、配列リードの各々は、対応する無細胞ＤＮＡ分子のメチル化レベルが特定できる、１つ又は複数のメチル化状態を有する１つ又は複数の部位を含む。１つ又は複数の部位の各部位は、メチル化状態に関連し得る。例えば、１つ又は複数の部位はＣｐＧ部位であり得、各部位は、特定のメチル化状態が特定されるＣｐＧ部位であり得る。いくつかの実例において、配列リードの各々の１つ又は複数の部位は、少なくともＮ個の部位を含む。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０より多い部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、５００ｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、３つのＣｐＧ部位）を含み得る。１組の部位のメチル化状態を特定するステップは、図５７のステップ５７０２に更に記載される。

【0324】

ステップ６２０４及び６２０６を、ステップ６２０２から受け取った配列リードのうちの各配列リードに対して行ってもよい。ステップ６２０４で、配列リードの１つ又は複数の部位の各々のメチル化状態を特定してもよい。いくつかの実例において、所与の部位のメチル化状態は、部位がメチル化されたか否かを同定する２進値（例えば、図５８中の０及び１）を含む。

【0325】

ステップ６２０６で、配列リードのメチル化レベルを１つ又は複数の部位のメチル化状態に基づいて特定してもよい。メチル化レベルは、メチル化指数、メチル化密度、１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でメチル化された分子の個数、又は１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でメチル化された分子（例えば、シトシン）の割合であり得る。例えば、メチル化レベルは、配列リードのメチル化ＣｐＧ部位の個数及びＣｐＧ部位の総個数に基づいて特定されたＣｐＧ部位のメチル化パーセントを同定する。例えば、ＤＮＡ分子が１０つのＣｐＧ部位を含有し且つその５つがメチル化されたと特定された場合、単一分子メチル化レベルは５０％（即ち５／１０＊１００％）となる。

【0326】

ステップ６２０８で、生体サンプルの統計値を、配列リードの特定されたメチル化レベルに基づいて特定してもよい。例えば、統計値は、配列リードに対応するメチル化レベルの平均、中央値、又は代表値であり得る。追加的に又は代替的に、統計値は、配列リードのメチル化レベルから特定された集計値（例えば、合計）であり得る。

【0327】

ステップ６２１０で、無細胞ＤＮＡ断片の統計値を参照値と比較して対象の病態の分類のレベルを特定する。参照値は、カットオフ値又は閾値を含み得るか、又はカットオフ値又は閾値を決定するためのものである。カットオフ又は閾値は、参照値は、特定の分類を表すか又は２つ以上の分類を区別するカットオフ又は閾値から導き出され得る。いくつかの実例において、参照値は、病態の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される。統計値がカットオフ値（閾値）を上回る又は下回る対象は、先天的障害を有すると分類され得る。カットオフ値は、参照値に対する統計メトリック（例えば、有意性、Ｐ値、Ｚスコア）によって定義され得る。

【0328】

例として、病態は癌であり得る。例として、レベルは癌無し、早期、中期、又は進行期であり得る。そして分類は、病期の１つを選択し得る。したがって、分類は、癌の複数の病期（例えば、ＢＣＬＣ病期の１つ）から特定され得る。例として、癌は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、及び頭頸部扁平上皮癌であり得る。
ＶＩ．長い無細胞ＤＮＡ分子におけるメチル化パターンに基づく疾患分類のための機械学習技術

【0329】

いくつかの実施形態において、メチル化ハプロタイプのパターン認識分析は、癌を有する患者と有さない患者の分類用のメチル化ハプロタイプから有用な情報を抽出できる機械学習モデルを使用して実施してもよい。配列リードは、亜硫酸水素塩処理を含まない無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得されてもよい。これは、亜硫酸水素塩処理の化学反応は長い無細胞ＤＮＡ分子（例えば、＞６００ｂｐ）に対応する配列リードの取得を妨害し得るからである。いくつかの実例において、各長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンは値の行列に変換され、ここで長い無細胞ＤＮＡ分子は特定の組織型と関連し得る。行列は、組織分類を特定するための機械学習モデルの訓練に使用できる。

【0330】

以前に知られていた技術と比較して、機械学習モデルは、疾患分類において長い無細胞ＤＮＡ分子の特定の部位が他の部位より予測的であることを同定できる。更に、長い無細胞ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位の数の増加により、機械学習モデルをより多様なメチル化パターンで訓練することが可能になる。実際に、機械学習モデルは、一般にＣｐＧ部位がより少ない短いＤＮＡ分子で訓練された別のモデルと比較して、より正確に疾患の分類を特定することができる。

【0331】

機械学習モデルとしては、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶、（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の１つ又は複数のモデルを含む複合モデルを含み得るが、それらに限定されない。
Ａ．機械学習モデル

【0332】

図６３は、いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを用いたメチル化ハプロタイプのパターン認識の例示図６３００を示す。いくつかの実施形態において、機械学習モデルは、ＣＮＮ及びそれに続くＬＳＴＭを含む複合モデルである。特に、図６３は、癌を有する患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを分類するためのメチル化ハプロタイプのパターン認識の使用例を示す。
１．訓練データ

【0333】

ＥＭ－ｓｅｑを使用して腫瘍細胞（緑）及び非腫瘍細胞（青）からの長いメチル化ハプロタイプ（例えば＞５ｋｂ）を取得した。一連の塗りつぶされたドットと塗りつぶされていないドット（即ちメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位）を有する水平線（ＤＮＡ）は、メチル化ハプロタイプを表す。いくつかの実例において、腫瘍細胞からＤＮＡ断片を取得するために、組織ＤＮＡに超音波処理が行われて特定のサイズ（例えば、５ｋｂ、１０ｋｂ）を有する分子が取得される。亜硫酸水素塩配列決定を含むメチル化認識配列決定を使用してデータ訓練用の配列リードを取得してもよい。いくつかの実例において、非腫瘍ＤＮＡ断片はＴ細胞、Ｂ細胞、好中球、肺組織、肝臓等から取得される。

【0334】

各長いメチル化ハプロタイプは、配列構成及びメチル化パターンの両方を含むデータ行列にプログラムされる。データ行列は、塩基のワンホットエンコーディングを含み得、対応する無細胞ＤＮＡ分子の各ＣｐＧ部位のメチル化状態を同定し得る。用語「ワンホットエンコーディング」とは、カテゴリデータが数値表現に変換されるようにカテゴリデータを定量化する技術を指す。特に、該技術は、データセット内のカテゴリの数に等しい長さのベクター（例えば、塩基）を生成することを含み得る。例えば、ある塩基がＴカテゴリに属する場合、このベクターの成分には、１の値が割り当てられるＴ成分を除いて、０の値が割り当てられる。ワンホットエンコーディングにより、数値的に意味のある方式でカテゴリを追跡することができる。

【0335】

行列の１行目は配列情報「…ＡＣＧＴＡＣＧＴＣＴ…」を示し、ここで「…」は簡略化のためにそれらの塩基が省略されることを示した。例示の目的で、第１ＣｐＧ部位はメチル化されておらず、第２ＣｐＧ部位はメチル化された。「ｉ」列において、「Ａ」ヌクレオチドに対応して、「ｉ」列と「Ａ」行が交差する箇所（ここでセルと呼ばれる）に「１」が記入された。同列における他のセルには「０」が記入された。「ｉｉ」列において、非メチル化の「Ｃ」ヌクレオチド及びその直後に続く「Ｇ」ヌクレオチドに対応して、「ｕＣＧ」行に対応するセルに「１」が記入された。「ｉｉ」列における他のセルには「０」が記入された。「ｖｉ」列において、メチル化された「Ｃ」ヌクレオチド及びその直後に続く「Ｇ」ヌクレオチドに対応して、「ｍＣＧ」行に対応するセルに「１」が記入された。「ｖｉ」列における他のセルには「０」が記入された。これらのルールに基づき、メチル化ハプロタイプに関連する配列構成及びメチル化パターンを含むデータ行列が構築された。
２．訓練

【0336】

いくつかの実施形態において、それぞれ腫瘍細胞及び非腫瘍細胞から取得されたいくつかのデータ行列は、腫瘍関連メチル化ハプロタイプと非腫瘍関連メチル化ハプロタイプを区別するための機械学習モデルの訓練に使用され得る。訓練された機械学習モデルは、血漿ＤＮＡに存在するメチル化ハプロタイプが腫瘍細胞又は非腫瘍細胞に由来する尤度を特定するために使用され得る。追加的に又は代替的に、それぞれ癌を有する患者と有さない患者に関連する血漿ＤＮＡから取得されたいくつかのデータ行列は、腫瘍関連メチル化ハプロタイプと非腫瘍関連メチル化ハプロタイプを区別するための機械学習モデルの訓練に使用され得る。

【0337】

いくつかの実施形態において、［分子長ｘ６］の形の２次元（２Ｄ）行列を畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）に入力した。該行列を、カーネルサイズが１０の１２８個のフィルタから構成されたＣＮＮの１Ｄ畳み込み層に渡した。正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）の活性化関数を採用した。その後、プールサイズが２の最大プーリング層及び２のストライドが適用される。引き続き、３２個のユニットを有する双方向の長期短期記憶（ＬＳＴＭ）層を使用した。ＬＳＴＭは、各時点がそれぞれＣｐＧ部位の位置に対応するように解してもよい。よって、ＬＳＴＭがメチル化パターンを疾患の存在と関連付けるように訓練されるように、ＣｐＧ部位の配列のメチル化状態をＬＳＴＭによって分析されてもよい。いくつかの実例において、双方向のＬＳＴＭが使用される。この層で双曲線正接（ｔａｎｈ）活性化関数が採用される。その後、出力を平坦化し、それぞれ１２８個及び６４個のニューロンを含む２つの緻密層に渡した。２つの緻密層についてＲｅＬＵの活性化関数を採用した。最終層は、シグモイド活性化関数を有する単一ニューロンを用い、腫瘍ＤＮＡ分子及び非腫瘍ＤＮＡ分子である尤度を示す確率値を出力する。血漿ＤＮＡ分子に対応する確率値が高いほど、血漿ＤＮＡ分子が腫瘍に由来する尤度が高いことを示唆した。

【0338】

いくつかの実施形態において、確率のカットオフは、腫瘍由来血漿ＤＮＡ分子を検出するために特定の値より大きくてもよく、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９等を含むが、それらに限定されない。確率のカットオフは、非腫瘍由来血漿ＤＮＡ分子を検出するために特定の値より小さくてもよく、０．５、０．４、０．３、０．２、及び０．１等を含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、活性化関数は、正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）、指数線形ユニット（ＥＬＵ）、漏れのある正規化線形ユニット（Ｌｅａｋｙ ＲｅＬＵ）、パラメトリック正規化線形ユニット（Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ＲｅＬＵ）、スケーリングされた指数線形ユニット（ＳＥＬＵ）、ガウス誤差線形ユニット（ＧＥＬＵ）、双曲線正接（ｔａｎｈ）関数、シグモイド関数、ソフトマックス関数、スウィッシュ関数等を含み得るが、それらに限定されない。

【0339】

いくつかの実施形態において、モデルが好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、巨核球、赤血球、単球、ＮＫ細胞、肝臓、肺、食道、心臓、膵臓、結腸、小腸、脂肪組織、副腎、脳、乳房、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮等に限定されない異なる組織からのメチル化ハプロタイプから導きされたデータ行列によって訓練された場合、かかるモデルは、メチル化ハプロタイプに基づいて各血漿ＤＮＡ分子の起源組織／起源腫瘍を特定するために使用され得る。
Ｂ．実施例

【0340】

上記で提案したメチル化ハプロタイプのパターン認識の実行可能性及び潜在的な実績を評価するために、それぞれ、ＨＣＣ腫瘍及びバフィーコート（即ち白血球）サンプルに由来する血漿ＤＮＡ分子の様々な数のメチル化ハプロタイプをシミュレートした。確率モデルを使用して特定のサイズ（例えば２ｋｂ）を有する血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプをシミュレートした。血漿ＤＮＡ分子上のｋ個のＣｐＧ部位（ｋ≧１）のメチル化状態をＭ＝（ｍ_１、ｍ_２、…、ｍ_ｋ）とし、ここでｍ_ｉは血漿ＤＮＡ分子上のＣｐＧ部位ｉでの０（非メチル化状態）又は１（メチル化状態）である。ＨＣＣ腫瘍に由来する血漿ＤＮＡ分子に関連するＭの確率は、ＨＣＣ組織における前のメチル化分布に依存し得る。バフィーコートに由来する血漿ＤＮＡ分子に関連するＭの確率は、バフィーコートにおける前のメチル化分布に依存し得る。

【0341】

ＨＣＣ組織及びバフィーコートサンプルにおける、１、２、…、ｋでの対応するＣｐＧ部位の前のメチル化分布はベータ分布に従う。ベータ分布は、Ｂｅｔａ（α，β）で示される２つの正のパラメーターα及びβによってパラメーター化される。ベータ分布から導き出された値は、０～１の範囲である。目的の組織の高深度亜硫酸水素塩配列決定データに基づき、パラメーターα及びβを、それぞれ、その特定の組織の各ＣｐＧ部位での配列決定されたシトシン（メチル化）及びチミン（非メチル化）の数によって決定した。ＨＣＣ腫瘍組織について、このようなベータ分布をＢｅｔａ（α^Ｔ，β^Ｔ）とした。バフィーコートサンプルについて、このようなベータ分布をＢｅｔａ（α^Ｎ，β^Ｎ）とした。それぞれ、Ｂｅｔａ（α^Ｔ，β^Ｔ）及びＢｅｔａ（α^Ｎ，β^Ｎ）から腫瘍由来及び非腫瘍由来血漿ＤＮＡ分子についてｋ個のＣｐＧ部位（ｋ≧１）のメチル化状態をサンプリングした。特定のヌクレオチド距離内の共メチル化及び共非メチル化に関する前の確率分布は、シミュレーションに統合され得る。例えば、２つの連続したＣｐＧ部位の７９．６％、７５．６％、７１．６％、６８．６％、６６．４％、６５．１％、６２．５％、６１．１％、及び６０．７％が、それぞれ、５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ及び５００ｂｐのヌクレオチド距離内に共メチル化又は共非メチル化されたと発見された。

【0342】

血漿ＤＮＡプールに寄与する腫瘍由来ＤＮＡ分子及び非腫瘍由来ＤＮＡ分子を、５，０００個のランダムに選択されたゲノム領域にわたって１ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、２５ｘ、３０ｘ、３５ｘ、４０ｘ、５０ｘ、６０ｘ、７０ｘ、８０ｘ、９０ｘ、及び１００ｘのいくつかの異なる深度でシミュレートした。特定の深度で、データ行列を本開示における実施形態に従ってそれぞれ腫瘍由来ＤＮＡ分子及び非腫瘍由来ＤＮＡ分子について構築した。訓練プロセス中、腫瘍由来ＤＮＡ分子のデータ行列に対応する出力値を「１」でラベル付けした。非腫瘍由来ＤＮＡ分子のデータ行列に対応する出力値を「０」でラベル付けした。腫瘍由来及び非腫瘍由来ＤＮＡ分子に関連するデータ行列を使用して、ＣＮＮ及びＬＳＴＭを含む深層学習モデルを訓練した。深層学習のモデルパラメーターを、予測出力値と期待出力値の間の予測誤差を最小化することで決定した。訓練されたモデルをを、訓練プロセス中に使用されなかった新しくシミュレートされた血漿ＤＮＡを分類するために適用した。受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して異なる深度でモデル実績を評価した。

【0343】

図６４は、訓練プロセスで使用された異なる配列決定深度にわたって血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別するための機械学習モデルの実績を同定する１組の棒グラフ６４００を示す。各配列決定深度（Ｘ軸）について、青棒６４０２は、訓練データを分類することに基づく機械学習モデルのＡＵＣを同定し、オレンジ棒６４０４は、試験データを分類することに基づく機械学習モデルのＡＵＣを同定する。図６４は、訓練で使用された配列決定深度の増加に伴い、血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別する実績が向上したことを示す。訓練で使用された７０ｘの配列決定深度で実績がプラトーに達し、ＡＵＣが０．９０であった。メチル化ハプロタイプに基づく深層学習モデルを使用する実績（ＡＵＣ：０．９０）は、最小メチル化ミスマッチアプローチ（ＡＵＣ：０．８）を有意に上回った。これらのデータは、提案されたメチル化ハプロタイプのパターン認識が、任意のゲノム領域からの癌由来無細胞ＤＮＡを検出するための一般的で情報価値のあるアプローチであることを示唆した。

【0344】

いくつかの実施形態において、腫瘍ゲノムと非腫瘍ゲノムの間で示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）からの血漿ＤＮＡ分子を選択的に分析し、これによりモデル実績が更に強化される。バフィーコートゲノムと比較して腫瘍ゲノムにおいて高メチル化された５，０００個のＤＭＲを取得た（例えばメチル化レベルの差が少なくとも２０％）。腫瘍由来ＤＮＡ分子及び非腫瘍由来ＤＮＡ分子を、それら５，０００個のＤＭＲについて１ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、２５ｘ、３０ｘ、３５ｘ、４０ｘ、５０ｘ、６０ｘ、７０ｘ、８０ｘ、９０ｘ、及び１００ｘの深度でシミュレートした。

【0345】

図６５は、血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別するための機械学習モデルの実績を同定する１組の棒グラフ６５００を示し、ここで機械学習は異なる配列決定深度にわたって示差的にメチル化された領域を使用して訓練された。各配列決定深度（Ｘ軸）について、青棒６５０２は、訓練データを分類することに基づく機械学習モデルのＡＵＣを同定し、オレンジ棒６５０４は、試験データを分類することに基づく機械学習モデルのＡＵＣを同定する。図６５は、訓練で使用された配列決定深度の増加に伴い、血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別する実績が向上したことを示す。訓練で使用された３０ｘの配列決定深度で実績がプラトーに達し、ＡＵＣが０．９１であり（図６５）、これは同じ配列決定深度での非ＤＭＲゲノム領域（図６４）を上回った。いくつかの実施形態において、０．５を腫瘍由来分子であると分類する確率のカットオフとして使用した場合、３０ｘの配列決定深度で８６％の特異性及び８１％の感受性が達成できる。対照的に、１００ｘの配列決定深度で９１％の特異性及び８７％の感受性が達成できる。メチル化ハプロタイプに基づく深層学習モデルを使用する実績（ＡＵＣ：０．９１）は最小メチル化ミスマッチアプローチ（ＡＵＣ：０．８７）を有意に上回った。これらのデータは、いくつかの実施形態において、ゲノムのサブセットの選択的分析により癌検出が強化されることを示唆した。

【0346】

無細胞ＤＮＡ分子が長いほど、含まれるＣｐＧ部位が多くなる。血漿ＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位がより多くなると、一般に血漿ＤＮＡ分子の起源組織を特定する精度を高めることができる。図６６は、異なる長さの血漿ＤＮＡ分子で癌患者の血漿中の腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡを区別する機械学習モデルの実績を同定する表６６００を示す。図６６は、２００ｂｐのＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプの分析によりただ０．６２のＡＵＣが得られたのに対して、１ｋｂの血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプの分析によりＡＵＣが０．８４に向上したことを示す。５ｋｂの血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプの分析によりＡＵＣが更に０．９８に向上した。これらの結果は、癌患者における長い無細胞ＤＮＡの分析により、血漿ＤＮＡ分子の起源組織／起源腫瘍をより正確に特定するアプローチが提供され、癌、又は自己免疫疾患、臓器移植、外傷等に限定されない他の疾患の検出及び監視の実績が大幅に向上することを示唆した。
Ｃ．機械学習モデルを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて疾患分類を特定する方法

【0347】

図６７は、いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて組織型特性を特定する対象の生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャート６７００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては複数の組織型のうちの１つ又は複数に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0348】

ステップ６７０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。メチル化認識配列決定は、酵素処理を含み得る。いくつかの実例において、メチル化認識配列決定は疾患分類用の配列リードを生成するための亜硫酸水素塩処理を含まない。他の実例において、亜硫酸水素塩処理は使用される。訓練データを生成して機械学習モデルを訓練するために、メチル化認識配列決定に亜硫酸水素塩処理を使用してもよい。配列リードの各々は配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）でのメチル化状態のメチル化パターンを含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。メチル化パターンは、１組の部位の部位対間の塩基の数、及び塩基のアイデンティティを含み得る。

【0349】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択され得る。

【0350】

１組の部位は様々な数としてもよい。いくつかの実例において、配列リードの各々の１組の部位は、少なくともＮ個の部位を含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０より多い部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、５００ｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、３つのＣｐＧ部位）を含み得る。配列リードを取得し配列リードのメチル化状態を特定するステップは、図５７のステップ５７０２に更に記載される。

【0351】

ステップ６７０４及び６７０６を、ステップ６７０２から受け取った配列リードのうちの各配列リードに対して行ってもよい。ステップ６７０４で、配列リードのメチル化パターンを機械学習モデルに入力してもよい。いくつかの実例において、メチル化パターンを機械学習モデルに入力することは、配列リードの配列を機械学習モデルに入力することを含む。配列リードのメチル化パターンを機械学習モデルに入力することは、配列リードの行列を形成することを含み得、例えば、ここで行列は、塩基のワンホットエンコーディング、及び配列リードの１組の部位のメチル化状態を含む。いくつかの実例において、配列リードの位置を特定してもよく（例えば、配列リードを参照配列の対応する位置にアライメントすることによって）、ここで位置も機械学習モデルに入力される。

【0352】

機械学習モデルは、第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット、及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練できる。いくつかの実例において、機械学習モデルは、例えば、図６３について説明したように、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む。いくつかの実例において、配列リードの第１又は第２訓練セットは、１つ又は複数の示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）から取得される。１つ又は複数の他の組織型は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、又は２０より多い組織型を含み得る。１つ又は複数の他の組織型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、肺組織、又は肝臓を含み得るが、それらに限定されない。１つ又は複数の他の組織型はバフィーコートを含み得る。

【0353】

ステップ６７０６で、機械学習モデルの出力に基づき、配列リードの分類を特定してもよい。分類は、配列リードが第１組織型に由来すること（又はその由来の程度）を示すことができる。組織分類は、配列リードが第１組織型に由来する確率を含み得る。第１組織型は疾患組織型であり得る。いくつかの実例において、第１組織型は疾患に関連する。１つより多くの組織型の確率を特定してもよい。

【0354】

ステップ６７０８で、配列リードの分類を使用して第１組織型の特性を特定してもよい。第１組織型の特性は、第１組織型に由来すると分類された配列リード量を同定することができる。いくつかの実例において、第１組織型の特性は、第１組織型に関連する疾患の疾患状態を同定することができる。疾患は癌であり得る。第１組織型の特性は、第１組織型に関連する疾患の予測予後を更に同定することができる。例えば、予測予後は、癌に関連する血管浸潤の存在であり得る。

【0355】

いくつかの実例において、特性を特定することは、（ｉ）第１組織型に由来すると分類された配列リードの第１量を特定すること、及び（ｉｉ）第１量に基づいて第１組織型の生体サンプルの疾患の分類を特定することを含む。第１量を使用して疾患の分類を特定するステップは、図５７のステップ５７０８に更に記載される。
ＶＩＩ．バリアントとメチル化パターンの組み合わせ分析

【0356】

長い無細胞ＤＮＡ分子を用いた疾患分類の精度を強化するために、長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターン分析をＳＮＶベースの分析と組み合わせてもよい。例えば、血漿サンプルにおいて、配列リードを、生得的ゲノムに示される白血球から決定された参照配列等の参照配列と比較することに基づいて配列リードの変異（例えば、ＳＮＶ）を同定してもよい。次に、かかる遺伝子変異につながる配列リードのメチル化パターンを分析してもよい。

【0357】

長い無細胞ＤＮＡ分子のＳＮＶとメチル化パターンの組み合わせ分析を使用する方法は、生体サンプルの無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から配列リードを取得することを含む。各配列リードは、メチル化パターンを含み、ここでメチル化パターンは配列リード上の１組のＣｐＧ部位でのメチル化状態を同定する。配列リードのうちの配列リードは、参照ゲノムの対応する箇所にアライメントしてもよい。次に、配列リードは、１つ又は複数のバリアント（例えば、一塩基バリアント、一塩基多型、増幅）の存在を特定するために、対応する箇所の配列と比較される。バリアントは、マイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、反転、及び／又は微小欠失であり得る。いくつかの実例において、配列リードのＳＮＶは、ＳＮＶが他のリードの閾値数（例えば、５回）を上回ると検出された場合に同定される。１つ又は複数のバリアントが同定される場合、疾患分類を特定するために配列リードのメチル化パターンを更に分析してもよい。
Ａ．ＳＮＶ及びメチル化パターン

【0358】

いくつかの実施形態において、患者のバフィーコートＤＮＡ及び血漿ＤＮＡが配列決定される。バフィーコートＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に限定されないものを使用して配列され得る。血漿ＤＮＡは、長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する配列リードを取得できるように、ＳＭＲＴ－ｓｅｑに限定されないものを使用して配列決定され得る。図６８は、いくつかの実施形態に係る、ＳＮＶ及びＣｐＧメチル化ハプロタイプ情報を用いた組み合わせ分析の例を図示する概略図６８００を示す。図６８に示すように、バフィーコートＤＮＡの配列決定結果に存在しない、対立遺伝子（例えばＧヌクレオチド）を持つ血漿ＤＮＡは、体細胞変異と呼ばれた。かかる体細胞変異を持つ血漿ＤＮＡ分子のメチル化ハプロタイプを分析すると、潜在的な癌の解剖学的位置を特定することができる。

【0359】

いくつかの実施形態において、癌シグナルに関連するメチル化ハプロタイプを疾患分類用のいわゆる体細胞変異と結び付けてもよい。組み合わせ分析を使用して疾患分類用の体細胞変異のみを使用する場合の偽陽性を低減してもよい。例えば、（例えば、メチル化パターンに基づいて）起源腫瘍であると特定される配列決定血漿ＤＮＡ分子によってサポートされる体細胞変異は、腫瘍起源であると特定されない配列決定血漿ＤＮＡ分子によってサポートされる体細胞変異と比較して、真の変異である可能性がより高い。よって、腫瘍起源であると特定される配列決定血漿ＤＮＡ分子によってサポートされる体細胞変異を選択すると、腫瘍由来変異を検出する際の陽性的中率を高めることができる。

【0360】

図６９は、野生型対立遺伝子を持つ第１群の血漿ＤＮＡ分子及び変異を持つ第２群の血漿ＤＮＡ分子の特徴６９００を示す。第１群について、野生型対立遺伝子を持つサイズがそれぞれ８．９ｋｂ、３．７ｋｂ、４．３ｋｂ及び３．９ｋｂの４つの長い血漿ＤＮＡ分子を同定した。これら４つの血漿ＤＮＡ分子は、ＣｐＧ部位にわたるそれらそれぞれのメチル化状態（赤棒）の存在量に基づき、白血球起源のものであると特定された。第２群について、白血球に存在しない変異を持つサイズがそれぞれ９ｋｂ、２．３ｋｂ、及び５．５ｋｂの３つの長い血漿ＤＮＡ分子を同定した。これら３つの血漿ＤＮＡ分子は、ＣｐＧ部位にわたるそれらそれぞれの非メチル化状態（緑棒）の存在量に基づき、ＨＣＣ腫瘍起源のものであると特定された。よって、第２群の血漿ＤＮＡ分子を有する患者は、ＳＮＶとＣｐＧメチル化ハプロタイプを組み合わせた相乗分析に基づいてＨＣＣを有すると診断でき、これは臨床診断に一致した。

【0361】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ分子が長いほど、起源組織分析を促進するＣｐＧ部位が多く含有されることから、ＤＮＡ分子が長いほど、腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡ分子の分類が正確になる。よって、ＳＮＶを持つＤＮＡ分子が長いほど、腫瘍局在分析が正確になる。例えば、例示の目的で、２００ｂｐ及び１ｋｂ等のサイズを有する腫瘍組織から同定された体細胞変異周囲の領域におけるＣｐＧ部位の数を分析した。合計、３８，４６５個の体細胞変異を分析した。

【0362】

図７０は、体細胞変異周囲の２００ｂｐ又は１ｋｂ領域におけるＣｐＧ部位の数の分布を同定する表７０００を示す。参照ゲノムは、それぞれの等サイズ領域（例えば、２００ｂｐ、１ｋｂ）に分割される。対応する数のＣｐＧ部位（例えば、０、≧１、≧１０）及び少なくとも１つのＳＮＶを有するこれらの領域の数を特定した。図７０に示すように、サイズが２００ｂｐの領域のうち２９．７％はＣｐＧ部位を有さなかったが、サイズが１ｋｂの領域のうち４．４％のみはＣｐＧ部位を有さなかった。更に、サイズが２００ｂｐの領域のうち５．１％は少なくとも１０つのＣｐＧ部位を有したが、サイズが１ｋｂの領域についてかかる百分率は３５．７％に増加した。これらの結果は、より豊富なＣｐＧ部位を有するメチル化ハプロタイプに基づき、変異を持つ長い血漿ＤＮＡの使用が、血漿ＤＮＡの起源組織の特定に有益であることを示唆した。他の長さでも同様な結論を出すことができる。サイズが３ｋｂの領域の９０％は少なくとも１０つのＣｐＧ部位を有したが、ＳＮＶについて、実際にゲノム全体にわたって２つの領域のみがある。
Ｂ．疾患分類におけるハプロタイプとメチル化パターンの間の対立遺伝子の不均衡

【0363】

癌細胞はコピー数異常を頻繁に示す（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３；１１０：１８７６１－８、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ２０１３； ５９：１，２１１－２２４、Ｚｅｉｒａ ａｎｄ Ｒａｐｈａｅｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０２０；３６： ｉ３４４－ｉ３５２）。このようなコピー数異常は一般に非腫瘍細胞に存在しない。コピー数異常は、コピー数増加及びコピー数減少を含む。

【0364】

癌を有する患者について、血漿ＤＮＡは、腫瘍由来ＤＮＡ分子及び非腫瘍由来ＤＮＡ分子を含む混合物である。バリアントは腫瘍細胞と非腫瘍細胞の間でコピー数の差を引き起こし得る。かかる差により、ヒトゲノム全体にわたる腫瘍由来ＤＮＡの濃度が明らかに異なり得る。例えば、コピー数増加領域は、比較的高い腫瘍ＤＮＡ濃度を引き起こすが、コピー数減少領域は比較的低い腫瘍ＤＮＡ濃度を引き起こす。コピー数増加及び減少は、癌細胞において単一対立遺伝子的に発生し、対立遺伝子の不均衡（例えばヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ））を引き起こすことが多い（Ｖａｔｔａｔｈｉｌ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１３：２３：１５２－１５８）。

【0365】

言い換えれば、コピー数増加及び減少等のバリアントは、一般に１つのハプロタイプブロックに関与する。いくつかの状況では、両方のハプロタイプともコピー数増加の影響を受けるが、２つのハプロタイプブロック間で増幅されたブロックの数は異なり得る。よって、コピー数増加又は減少の影響を受ける２つの生得的ハプロタイプブロックの間の血漿ＤＮＡ分子の観察された量は異なる。癌においてゲノム全体の低メチル化が頻繁に観察される（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３；１１０：１８７６１－８、Ｅｈｒｌｉｃｈ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ２００２；２１： ５４００－１３）ことから、腫瘍ＤＮＡからの寄与が増加するハプロタイプは、腫瘍ＤＮＡからの寄与が減少する他のハプロタイプよりも、メチル化レベルが低いと予想される。よって、相対的なハプロタイプメチル化不均衡は、癌の存在に関する情報を提供する新しいメトリックとなる。いくつかの実施形態において、癌細胞中のハプロタイプ間の不均衡なハプロタイプメチル化レベルは、癌由来ＤＮＡ分子が血液循環に流される場合、癌患者の血漿におけるこのようなハプロタイプメチル化不均衡の一因となる。

【0366】

マイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、反転、及び／又は微小欠失に限定されないバリアントの他のタイプもこの分析において考慮され得る。

【0367】

図７１は、癌の有無に関する情報を提供する歪んだ対立遺伝子比及び歪んだメチル化レベルを伴う相対的ハプロタイプ不均衡を有するＤＮＡ分子の概略図７１００を示す。図７１に示すように、２つのハプロタイプの間の結果として生じる歪んだ対立遺伝子比及びメチル化レベルを利用して患者における癌の存在を特定してもよい。図７１中、非腫瘍細胞は、ハプロタイプＩ及びＩＩ（それぞれＨａｐ Ｉ及びＨａｐ ＩＩとする）を含有する。コピー数異常、例えばコピー数増加を伴う腫瘍細胞は、１つのハプロタイプＩ及び３つのハプロタイプＩＩを含有する。血漿ＤＮＡ分子は配列決定されてそれぞれハプロタイプＩ及びハプロタイプＩＩに割り当てられる。

【0368】

簡略上、２つの対立遺伝子部位は例示の目的で選択される。Ｈａｐ Ｉと比較してより多い数の分子がＨａｐ ＩＩに割り当てられ、その結果、Ｈａｐ Ｉ上のＴとＧの対立遺伝子と比較してＨａｐ ＩＩ上のＣとＡの対立遺伝子の対立遺伝子比がより高くなる。対立遺伝子上流及び下流のＣｐＧ部位が分析される。ＣとＡの対立遺伝子に関連するＣｐＧ部位は、このケースにおいて２０％のメチル化レベルで低メチル化される。このようなメチル化レベルは、このケースにおいてメチル化レベルが７５％のＴとＧの対立遺伝子に関連するＣｐＧ部位と異なる。対立遺伝子比の増加は、Ｈａｐ ＩＩにおける対立遺伝子に関連するＣｐＧ部位のメチル化レベルの低下と相まって、コピー数増加及び低メチル化を反映するため、腫瘍細胞からの血漿ＤＮＡの寄与に関する情報を提供する。

【0369】

いくつかの実施形態において、同じハプロタイプブロックにおける対立遺伝子に割り当てられた血漿ＤＮＡ分子の数は、血漿ＤＮＡ分子の数の増加によりサンプリング変動が減少することから、分類能力を増強するために一緒に集計してもよい。いくつかの実例において、同じハプロタイプブロックにおける血漿ＤＮＡ分子の各々のメチル化パターンは疾患分類を特定するために使用される。血漿にハプロタイプメチル化不均衡が存在するか否かを特定するための統計的アプローチとしては、逐次確率比検定、二項比例検定、ピアソンのカイ二乗検定、２比率のｚ検定等を含み得るが、それらに限定されない。分析されるＣｐＧ部位の数とては、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１５、≧２０、≧２５、≧３０、≧３５、≧４０、≧４５、≧５０、≧６０、≧７０、≧８０、≧９０、≧１００、≧２００、≧３００、≧４００、≧５００、≧１０００、又は他の組み合わせを含み得るが、それらに限定されない。
Ｃ．起源組織を特定するためのバリアントとメチル化パターンの組み合わせ分析方法

【0370】

図７２は、いくつかの実施形態に係る、バリアント及びメチル化パターンを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて起源組織を特定する生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャート７２００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては複数の組織型の１つ又は複数に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0371】

ステップ７２０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。いくつかの実例において、メチル化認識配列決定は、疾患分類用の配列リードを生成するために亜硫酸水素塩処理を含まない。他の実例において、亜硫酸水素塩処理は使用される。配列リードの各々は、配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）でのメチル化状態のメチル化パターンを含み得る。例えば、所与の配列リードは少なくとも１５個のＣｐＧ部位を含み得る。メチル化パターンは、１組の部位の部位対間の塩基の数、及び塩基のアイデンティティを含み得る。

【0372】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、６ｋｂｐ、７ｋｂｐ、８ｋｂｐ、９ｋｂｐ、１０ｋｂｐのうちの１つから選択され得る。

【0373】

１組の部位は様々な数としてもよい。いくつかの実例において、配列リードの各々の１組の部位は、少なくともＮ個の部位を含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、１ｋｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、１０個のＣｐＧ部位）を含み得る。配列リードを取得し配列リードのメチル化状態を特定するステップは、図５７のステップ５７０２に更に記載される。

【0374】

ステップ７２０４で、配列リードの第１配列リードの位置を特定してもよい。第１配列リードの位置は、第１配列リードを参照ゲノムにアライメントすることで特定してもよい。いくつかの実例において、第１配列リードの位置は、第１配列リードを対象の生得的ゲノムにアライメントすることで特定される。

【0375】

ステップ７２０６で、該位置に対応する第１配列リードにおけるバリアントを検出してもよい。第１配列リードにおけるバリアントは、該位置での参照配列に対するバリアントであり得る。例として、バリアントは、多型、マイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、反転、及び／又は微小欠失であり得る。一塩基多型であるバリアントの例は図６８に示す。

【0376】

ステップ７２０８で、第１配列リードのメチル化パターンを使用してバリアントの起源組織を特定してもよい。起源組織の同定（組織分類）には、本開示のセクションＩＶ、Ｖ、及びＶＩに記載の技術を含めて、本明細書に記載の任意の技術を使用してもよい。例えば、バリアントに関連する起源組織は、図５７のステップ５７０６及び５７０８に記載のように、第１配列リードのメチル化パターンと１つ又は複数の参照メチル化パターンを比較することで特定してもよい。他の方法のこのような説明はこの方法にも同様に適用する。例えば、起源組織の特定は、メチル化パターンを前記位置での第１参照メチル化パターンと比較することを含む。第１参照メチル化パターンは、疾患の疾患組織型に対応し得る。いくつかの実例において、第１参照メチル化パターンは、特定の組織型（例えば、肝臓）に対応する。比較に基づき、配列リードを複数の組織型のうちの１つに由来すると分類できる。

【0377】

参照パターンの値は、二値（例えば、図４１又は４２中の０及び１）であり得るか、又は小数（例えば、２０％のメチル化指数を示す０．２）を有し得る。最も近い参照パターンは、１組の参照パターンから同定されてもよく、組織分類は、最も近い参照パターンの対応する組織型と特定されてもよい。最も近い参照パターンは、参照パターンに対して各部位でのメチル化状態又は指数の差を取ることで特定できる。組織分類は、配列リードが複数の組織型の１つに由来すること（又はその由来の程度）を示すことができる。組織分類は、配列リードが複数の組織型の１つに由来する確率を含み得る。１つより多くの組織型の確率を特定してもよい。

【0378】

いくつかの実例において、起源組織の特定は、位置及びメチル化パターンを機械学習モデルに入力することを含み得る。機械学習モデルは、第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット、及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練してもよい。いくつかの実例において、機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む。いくつかの実例において、配列リードの第１又は第２訓練セットは、１つ又は複数の示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）から取得される。機械学習モデルの出力に基づき、配列リードが第１組織型に由来するか否かを特定する。
Ｄ．癌分類を特定するためのバリアントとメチル化パターンの組み合わせ分析方法

【0379】

図７３は、いくつかの実施形態に係る、バリアント及びメチル化パターンを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子のメチル化パターンに基づいて癌分類を特定する生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャート７３００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては癌に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0380】

ステップ７３０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。メチル化認識配列決定は酵素処理を含み得る。いくつかの実例において、メチル化認識配列決定は亜硫酸水素塩処理を含まない。他の実例において、亜硫酸水素塩処理は使用される。配列リードの各々は、配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）でのメチル化状態のメチル化パターンを含み得る。例えば所与の配列リードは、少なくとも１５個のＣｐＧ部位を含み得る。メチル化パターンは、１組の部位の部位対間の塩基の数、及び塩基のアイデンティティを含み得る。

【0381】

短い無細胞ＤＮＡ分子における単一分子メチル化レベルは、癌分類を特定するのに統計的に十分ではない可能性がある。この問題に対処するために、長い無細胞ＤＮＡ分子を使用してもよい。いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも５００ｂｐ、６００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、６ｋｂｐ、７ｋｂｐ、８ｋｂｐ、９ｋｂｐ、１０ｋｂｐのうちの１つから選択され得る。長いＤＮＡ分子を配列決定することで、所与の長いＤＮＡ分子の１組のＣｐＧ部位の数は多くなり得る（例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、又は１，０００個のＣｐＧ部位）。このように、メチル化された部位の総割合は、１つ又は２つの部位しか有さない断片ではなく、正確な統計特定値となり得る。

【0382】

１組の部位は様々な数としてもよい。いくつかの実例において、配列リードの各々の１組の部位は、少なくともＮ個の部位を含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、１０００ｋｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、１０個のＣｐＧ部位）を含み得る。配列リードを取得し配列リードのメチル化状態を特定するステップは、図５７のステップ５７０２に更に記載される。

【0383】

ステップ７３０４で、配列リードの第１配列リードの位置を特定してもよい。第１配列リードの位置は、第１配列リードを参照ゲノムにアライメントすることで特定してもよい。いくつかの実例において、第１配列リードの位置は、第１配列リードを対象の生得的ゲノムにアライメントすることで特定される。追加的に又は代替的に、他の配列リードのそれぞれの位置も、第１配列リードの同じ位置からの配列リードに基づいて癌分類を特定できるように、特定してもよい。

【0384】

ステップ７３０６で、前記位置に対応する第１配列リードにおけるバリアントを検出してもよい。第１配列リードにおけるバリアントは、前記位置での参照配列に対するバリアントであり得る。バリアントは、マイクロサテライト拡張、挿入、欠失、構造変異、配列重複、増幅、再構成、転位、反転、及び／又は微小欠失であり得る。いくつかの実例において、バリアントは、マイクロサテライト不安定性（例えば、コピー数異常）又は癌のマーカーである特定の配列バリアント（例えば、一塩基バリアント）等のような既知の腫瘍マーカーであり得る。

【0385】

ステップ７３０８で、第１配列リードのメチル化パターン及びバリアントを使用して、癌（又は他の疾患若しくは症状）の分類を特定してもよい。例えば、癌の分類は、メチル化パターンのメチル化レベルに基づいて特定してもよく、ここでメチル化レベルは第１配列リードの１組の部位のメチル化状態から特定される。メチル化レベルは、メチル化指数、メチル化密度、１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でのメチル化された分子の個数、又は１組の部位のうちの１つ又は複数の部位でのメチル化された分子（例えば、シトシン）の割合であり得る。いくつかの実例において、メチル化レベルは、メチル化ＣｐＧ部位の個数及び第１配列リードのＣｐＧ部位の総個数に基づいて特定された、第１配列リードのＣｐＧ部位のメチル化パーセントを同定する。例えば、ＤＮＡ分子が１０個のＣｐＧ部位を含有しその５つがメチル化されたと特定された場合、単一分子メチル化レベルは５０％（即ち５／１０＊１００％）となる。第１配列リードのバリアントは、対応するＤＮＡ分子が腫瘍由来であるか否かを示す第１しるしとして使用でき、配列リードのメチル化パターンは、ＤＮＡ分子が腫瘍由来であることを示す第２しるしとして使用できる。配列リードが腫瘍マーカーを有し且つ閾値より下（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％より下）の単一分子メチル化レベルを有するならば、癌の分類は、癌が存在するとなり得る。例えば、癌による広範囲な低メチル化の結果として、その低下が発生する。

【0386】

追加的に又は代替的に、単一分子メチル化については、例えば、ゲノムにおける特定の位置（ＣｐＧアイランド）が高メチル化された（例えば、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％より大きい）と知られる場合、閾値より大きいか否かが特定されてもよい。この例において、配列リードが腫瘍マーカーを有し且つ閾値より上（例えば、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％より上）の単一分子メチル化レベルを有するならば、癌の分類は、癌が存在するとなり得る。

【0387】

いくつかの実例において、癌の分類を特定することは、メチル化パターンを前記位置での第１参照メチル化パターンと比較することを含む。よって、単一分子メチル化レベルの代わりに、メチル化又は非メチル化部位のパターンを使用してもよい。例えば、肝臓を起源とする６つのＣｐＧ部位を有するｃｆＤＮＡ分子は、「－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－」のメチル化パターンを有し得、ここで「Ｍ」は、メチル化状態を表し、「Ｕ」は、非メチル化状態を表す。しかし、他の組織のからの、対応するＣｐＧ部位を含有する他の分子は、「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－」、「－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－」、「－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－Ｕ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－Ｕ－」、「－Ｕ－Ｕ－Ｕ－Ｍ－Ｍ－Ｍ－」のメチル化パターンを有し得る。この例について、全ての分子が、値が０．５の同一の単一分子メチル化レベルを示すことから、単一分子メチル化レベルを使用して肝臓由来分子を他の組織に由来する分子と区別することができない。対照的に、これら６つのＣｐＧ部位にわたるメチル化パターンを使用すると、肝臓由来分子は、他の組織に由来する分子と比べてユニークになる。この状況では、分子における１組のＣｐＧ部位にわたるメチル化パターンは、細胞性質又は疾患状態、例えば、メチル化パターンに対応する特定の組織型における疾患状態を示す「分子バーコード」として機能することができる。第１参照メチル化パターンは、癌に関連する特定の組織型に対応し得る。比較に基づき、対象を、癌を有すると特定できる。

【0388】

参照メチル化パターンの値は、二値（例えば、図４１又は４２中の０及び１）であり得るか、又は小数（例えば、２０％のメチル化指数を示す０．２）を有し得る。例えば、最も近い参照メチル化パターンは、１組の参照メチル化パターンから同定されてもよく、疾患分類は、最も近い参照メチル化パターンの疾患と特定されてもよい。最も近い参照メチル化パターンは、参照メチル化パターンに対して各部位でのメチル化状態又は指数の差を取ることで特定してもよい。最も近い参照メチル化パターンを同定する追加の詳細は、少なくとも図５７のプロセス５７００及び本開示のセクションＩＶに記載される。

【0389】

いくつかの実例において、癌分類を特定することは、位置及びメチル化パターンを機械学習モデルに入力することを含む。機械学習モデルは、癌細胞由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット、及び正常細胞由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練してもよい。いくつかの実例において、機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む。いくつかの実例において、配列リードの第１又は第２訓練セットは、１つ又は複数の示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）から取得される。機械学習モデルの出力に基づき、配列リードが癌細胞に由来するか否かを特定する。

【0390】

追加的に又は代替的に、複数のＤＮＡ分子を、癌の分類を特定するために使用できる。複数のＤＮＡ分子の各ＤＮＡ分子は、バリアントを含み得る。バリアントは、また、マイクロサテライト不安定性（コピー数異常）又は癌のマーカーである特定の配列バリアント等のような既知の腫瘍マーカーであり得る。それらそれぞれのメチル化パターンに基づき、腫瘍バリアントを有する配列リードの全てのメチル化レベルは、それらそれぞれの組の部位のメチル化状態に基づいて特定できる。かかるメチル化レベルは、１つの部位のみのもの又は複数の部位にわたるものであり得、複数の領域にわたって（例えば、ＣｐＧアイランドにわたって）発生し得る。いくつかの実例において、メチル化レベルは、配列リードの部位の総数に対する、メチル化部位の割合を含む。メチル化レベルは、配列リードの低メチル化又は高メチル化を特定するために閾値と比較してもよい。メチル化レベルが閾値を超えると、癌は対象に存在すると特定できる。閾値の例は上記で提供される。閾値は、癌の分類（例えば、健康、癌存在）が既知の対象から取得された参照サンプルのメチル化レベルを検査することで特定できる。実際に、バリアントを有する無細胞ＤＮＡ分子から特定されたメチル化レベルは、対象に癌が存在するか否かを特定する別のしるしとして使用できる。

【0391】

更に別の実施形態において、使用される複数のＤＮＡ分子の別の例では、バリアントは、欠失又は増幅等のようなコピー数異常（ＣＮＡ）であり得る。コピー数異常は様々な方式で、例えば、領域における個数又はリードを、別の領域における個数（例えば、１つの領域、多数の領域にわたる平均リード密度、別の染色体（複数可）上の領域、又はゲノム全体のリードの総数）と比較することで、特定できる。個数の比は、ＣＮＡが存在するか否かを分類するためにカットオフ値と比較してもよい。ＣＮＡを有する領域について、該領域にアライメントした配列リードの１つ又は複数の部位の集計メチル化レベル（例えば、配列リードについて特定されたメチル化レベルの合計、代表値、又は中央値）は、閾値と比較してもよい。閾値は、癌の分類（例えば、健康、癌存在）が既知の対象から取得された参照サンプルのメチル化レベルに基づいて決定されてもよい。例えば、増幅を有するゲノム領域は、ＣＮＡを有さない別のゲノム領域と比較してそのゲノム領域からの断片がより多い以上、（広範囲な低メチル化により）一般にメチル化レベルがより低い。このため、ＣＮＡが配列リードの増幅に対応する場合、集計メチル化レベルが閾値未満であれば、対象は癌が存在するという分類と特定できる。他の実例において、特定の位置が癌を有する対象において高メチル化されたと知られるならば、メチル化レベルが閾値より大きいか否かを特定することができる。ＣＮＡが特定の領域の配列リードの欠失に対応す場合、集計メチル化レベルが閾値より大きければ、対象は癌が存在するという分類と特定できる。よって、複数のＤＮＡ分子のメチル化パターンは、対象に癌が存在するか否かの追加のしるしとして使用できる。

【0392】

更に別の実施形態において、ハプロタイプ技術は、複数のＤＮＡ分子に使用してもよい。例えば、１つ又は複数のＳＮＰ（ヘテロ接合遺伝子座）での対立遺伝子比を特定してもよい。複数のＳＮＰが使用される場合、対立遺伝子比は、１つのハプロタイプでの配列リードの第１個数、及び他のハプロタイプでの配列リードの第２個数に基づいて特定してもよい。当業者に理解されるように、異なる領域又は異なるハプロタイプのＤＮＡ断片のサイズも使用され得る。そして、異常を有する領域又はハプロタイプのメチル化レベル（例えば、単一メチル化レベルの集計又はＤＮＡ分子にわたって特定されたレベル）は、特定されて閾値と比較してもよい。閾値は、癌の分類（例えば、健康、癌存在）が既知の対象から取得された参照サンプルのメチル化レベルに基づいて決定されてもよい。その位置での対立遺伝子比が特定のハプロタイプでのＤＮＡ分子の増幅を示す場合、特定のハプロタイプに対応する配列リードの集計メチル化レベルが閾値未満であれば、対象は癌が存在するという分類と特定できる。他の実例において、その位置での対立遺伝子比が特定のハプロタイプでのＤＮＡ分子の欠失を示す場合、特定のハプロタイプに対応する配列リードの集計メチル化レベルが閾値より大きければ、対象は癌が存在するという分類と特定できる。よって、欠失について、メチル化レベルは、広範囲なメチル化のため増加するか、又は腫瘍内の領域で高メチル化を有すると知られる領域のため増加する。
ＶＩＩＩ．長いＣＦＤＮＡ分子の複数の特徴に基づく疾患分類のための機械学習

【0393】

長い無細胞ＤＮＡ分子の複数の特徴（例えば、メチル化パターン、配列モチーフ、配列構成）は、対象の疾患の分類を特定するために使用できる。特に、機械学習モデルは、疾患の分類が既知の訓練サンプルから取得された長い無細胞ＤＮＡ分子（例えば、サイズが６００ｂｐより大きい配列）を使用して訓練できる。
Ａ．訓練

【0394】

図７４は、血漿ＤＮＡ分子に存在する断片情報及び後天的情報に基づき、癌を有する患者と有さない患者を区別するための機械学習モデルを訓練するプロセス例を図示する概略図７４００を示す。図７４に示すように、何人かの癌を有する患者と有さない患者からいくつかの血漿ＤＮＡサンプルを取得してもよい。生体サンプルの長い無細胞ＤＮＡ分子の配列リードは、単一分子配列決定又はクラスターベースの配列決定によって取得してもよい。所与の長い無細胞ＤＮＡ分子の配列リードは、対応する組の特徴を同定するために分析されてもよい。末端、サイズ、配列構成、末端モチーフ、メチル化ハプロタイプ、不揃い末端、ゲノム座標等に限定されない各血漿ＤＮＡ分子の特徴は、データ行列にプログラムしてもよい。いくつかの実例において、配列構成は、少なくとも一部の血漿ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（例えば、４－ｍｅｒ）を同定する。配列構成は血漿ＤＮＡ分子全体に及んでもよい。

【0395】

癌を有する患者と有さない患者からのデータ行列は、癌を有する又は有さない患者を分類するための統計モデルの訓練に使用できる。統計モデルとしては、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を含み得るが、それらに限定されない。
Ｂ．分類

【0396】

訓練されたモデルは、新しいサンプルが癌を有するか否かを特定するために使用できる。図７５は、血漿ＤＮＡ分子に存在する断片情報及び後天的情報を用いた癌検出に訓練されたモデルを適用するプロセス例を図示する概略図７５００を示す。例えば、配列リードは、血漿ＤＮＡサンプルから取得されてもよく、ここで少なくとも一部の配列リードは閾値サイズ（例えば、６００ｂｐ）より大きい長さを有する。各配列リードについて、１つ又は複数の特徴が特定される。１つ又は複数の特徴は、配列リードについて、参照ゲノムにおける末端の位置、配列構成、サイズ、１つ又は複数の末端での配列モチーフ、又はＤＮＡメチル化パターンを含み得る。特徴は、訓練された機械学習モデルに入力できる。機械学習モデルは、配列リードの分類を特定するために使用できる出力を生成できる。分類は、配列リードが第１組織型に由来するか、それとも別の組織型に由来するかを同定することができる。

【0397】

配列リードの分類を分析してもよい。例えば、第１組織型に対応する配列リードの量を特定してもよい。量がカットオフ値を超えると、対象は第１組織型に対応する疾患分類と特定できる。
Ｃ．長い無細胞ＤＮＡ分子の複数の特徴に基づく疾患分類に機械学習モデルを使用する方法

【0398】

図７６は、いくつかの実施形態に係る、機械学習モデルを使用して長い無細胞ＤＮＡ分子の複数の特徴に基づいて疾患分類を特定する対象の生体サンプル分析のプロセス例を図示するフローチャート７６００を示す。生体サンプルは、正常細胞及び場合によっては第１組織型の疾患に関連する細胞を起源とするＤＮＡを含み得る。加えて、ＤＮＡの少なくとも一部は生体サンプルにおいて無細胞である。

【0399】

ステップ７６０２で、無細胞ＤＮＡ分子のメチル化認識配列決定から取得された配列リードを受け取ってもよい。メチル化認識配列決定は酵素処理を含み得る。いくつかの実例において、メチル化認識配列決定は、疾患分類の配列リードを生成するために亜硫酸水素塩処理を含まない。対照的に、訓練データを生成して機械学習モデルを訓練するために、亜硫酸水素塩処理をメチル化認識配列決定に使用してもよい。配列リードの各々は、配列リード上の１組の部位（例えば、ＣｐＧ部位）でのメチル化状態のメチル化パターンを含み得る。メチル化パターンは、１組の部位の部位対間の塩基の数、及び塩基のアイデンティティを含み得る。

【0400】

いくつかの実例において、配列リードは、下限及び上限を含み得る第１サイズ範囲内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応する。例として、第１サイズ範囲は、少なくとも１，０００塩基、少なくとも３，０００塩基、又はそれ以上の上限を含み得る。いくつかの実例において、下限は、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも６００塩基、又は少なくとも８００塩基のうちの１つから選択され得る。

【0401】

１組の部位は様々な数としてもよい。いくつかの実例において、配列リードの各々の１組の部位は、少なくともＮ個の部位を含み得る。例えば、所与の配列リードは、少なくとも３つのＣｐＧ部位を含み得る。少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００部位に限定されない他の数も考慮され得る。追加的に又は代替的に、配列リードは、第１サイズ範囲（例えば、５００ｂｐより大きい）内のサイズを有する長い無細胞ＤＮＡ分子に対応し得、少なくともＮ個の部位（例えば、３つのＣｐＧ部位）を含み得る。配列リードを取得し配列リードのメチル化状態を特定するステップは、図５７のステップ５７０２に更に記載される。

【0402】

ステップ７６０４及び７６０６を、ステップ７６０２から受け取った配列リードのうちの各配列リードに対して行ってもよい。ステップ７６０４で、配列リードの１つ又は複数の特徴を機械学習モデルに入力してもよい。いくつかの実例において、１つ又は複数の特徴は、参照ゲノムにおける末端の位置、配列構成、サイズ、１つ又は複数の末端での配列モチーフ、及びＤＮＡメチル化パターンから選択される少なくとも１つを含む。例えば、特徴は、配列リードの配列構成であり得、ここで配列構成は、配列リードのヌクレオチド塩基組成及び／又はヌクレオチド塩基順序を含む（本開示のセクションＩ．Ｂに記載された通り）。別の特徴は、配列リードの末端の位置であり得、ここで末端の位置を特定することは、配列リードを参照ゲノムにアライメントすることを含み得る。別の例において、特徴は、配列リードのＤＮＡメチル化パターンであり得、ここでＤＮＡメチル化パターンは、配列リード上の１組の部位でのメチル化状態を含む（本開示のセクションＩＶ、Ｖ、及びＶＩに記載された通り）。

【0403】

機械学習モデルは、第１組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第１訓練セット、及び１つ又は複数の他の組織型由来であるとラベル付けされた配列リードの第２訓練セットを使用して訓練された。いくつかの実例において、機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）を含む。いくつかの実例において、配列リードの第１又は第２訓練セットは、１つ又は複数の示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）から取得される。機械学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、線形回帰、ロジスティック回帰、深層リカレントニューラルネットワーク（例えば、完全結合型リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）、ゲートリカレントユニット（ＧＲＵ）、長短期記憶、（ＬＳＴＭ））、トランスフォーマーベースの方法（例えばＸＬＮｅｔ、ＢＥＲＴ、ＸＬＭ、ＲｏＢＥＲＴａ）、ベイズ分類器、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｋ平均クラスタリング、ノイズを使用したアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング（ＤＢＳＣＡＮ）、ランダムフォレストアルゴリズム、適応ブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、極端勾配ブースティング（ＸＧＢｏｏｓｔ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、又は上記の機械学習モデルの１つ又は複数を含む複合モデルのうちの１つから選択され得る。

【0404】

１つ又は複数の他の組織型は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、又は２０より多くの組織型を含み得る。１つ又は複数の他の組織型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、肺組織、又は肝臓を含み得るが、それらに限定されない。１つ又は複数の他の組織型はバフィーコートを含み得る。

【0405】

ステップ７６０６で、機械学習モデルの出力に基づき、配列リードの分類を特定してもよい。分類は、配列リードが第１組織型に由来することを示す。組織分類は、配列リードが第１組織型に由来する確率を含み得る。第１組織型は、疾患組織型であり得る。いくつかの実例において、第１組織型は疾患に関連する。

【0406】

ステップ７６０８で、第１組織型に由来すると分類された配列リードの量を特定してもよい。いくつかの実例において、配列リードの量を表すパラメーターが決定される。パラメーターは、第１組織型に由来すると分類されない他の配列リードの量に対する、配列リードの量の割合を含み得る。

【0407】

ステップ７６１０で、配列リードの量を使用して生体サンプルの疾患の分類を特定してもよい。例えば、生体サンプルの疾患の分類を特定することは、量を１つ又は複数のカットオフ値と比較することを含み、ここで１つ又は複数のカットオフは、疾患の分類が既知の参照サンプルを使用して決定される。疾患は癌であり得る。いくつかの実例において、疾患の分類を特定することは、血管浸潤の有無を判定することを含む。量を使用して疾患の分類を特定するステップは、図５７のステップ５７０８に更に記載される。

【0408】

疾患の分類は、疾患の重篤度の分類（例えば、疾患無し、早期、中期、進行期）を含み得る。例えば、疾患の分類は、ＢＣＬＣ病期に従う癌の病期を含み得る。そして、分類は、病期の１つを選択してもよい。したがって、分類は、疾患の複数の病期（例えば、ＨＣＣのＢＣＬＣ病期の１つ）から特定できる。いくつかの実例において、疾患は癌である。例として、癌は、肝細胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、多形性膠芽腫、膵臓癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、及び頭頸部扁平上皮癌であり得る。
ＩＸ．マイクロサテライト不安定性

【0409】

マイクロサテライト不安定性は、結腸癌、胃癌、卵巣癌等を含む様々な癌に関連する。マイクロサテライトは、１～６ヌクレオチドの配列モチーフが複数回反復するＤＮＡのタンデムリピートである。図７７は、ＤＮＡ分子における１組のマイクロサテライト配列７７００の例を示す。

【0410】

これらの反復配列は、何千もの領域に発生し得、ヒトゲノムの他の領域より変異率が高い（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． １９９８；６２：１４０８－１５）。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）が適切に機能せず、標的マイクロサテライトの反復単位が増加又は減少し、その結果体細胞サイズが変化することが原因で発生すると考えられる。ＭＭＲ欠損に関連する広範な不安定性は、重要な制御プロセスにおいて遺伝子を不活性化し腫瘍形成を引き起こし得る体細胞変異の急速な蓄積を示す。現在の研究では、多くの形態の癌、より多くの場合、早期疾患においてＭＭＲ欠損を同定している（Ｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１７；３５７：４０９－４１３）。ＭＳＩ検出は、特異的マーカーに対するＰＣＲとそれに続くＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーのいずれかによって、最初に結腸直腸癌において行われた（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９３；２６０：８１６－８１９）。しかし、これらの方法は、手間と時間がかかり、侵襲的で、寸法精度が低かった。

【0411】

続いて、ＭＳＩ検出は、最も頻繁なマイクロサテライト変化について選択された特異的マーカーに対するＰＣＲ、及びそれに続くゲル電気泳動並びにオートラジオグラフィーを使用することで、小細胞肺癌患者の血漿において行われた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． １９９６； ２（９）：１０３３－５）。しかし、これらのＰＣＲベースの方法では、ＭＳＩ検出の用途が限られたマーカーに制限され、ＰＣＲプライマーの標的とされない他のＭＳＩを保有する癌患者に適用できない。また、これらも、手間と時間がかかり、寸法精度が低かった。

【0412】

超並列次世代配列決定（ＮＧＳ）（即ちショートリード配列決定）も、癌におけるＭＳＩの検出に提案されている（Ｃｏｒｔｅｓ－Ｃｉｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７；８：１５１８０）。しかし、マイクロサテライトの検出可能なサイズ範囲は、ＮＧＳ技術のリード長さによって制限され、典型的には５０～１５０ｂｐである。加えて、ＮＧＳによる短いリードの性質及びマイクロサテライトの高い反復性により、アライメント結果が不正確になる傾向があり、ＭＳＩ分析時に偽陽性が発生する。

【0413】

癌患者における長い血漿ＤＮＡ分子の分析は、ＭＳＩの有無を判定するより正確なツールを提供する。単一分子配列決定によって配列決定された長い血漿ＤＮＡ分子を使用することで、リピートの全長及びその近傍のユニークな配列情報を取得することができ、それによって、かかるリピートゲノム位置及び目的のマイクロサテライトのサイズを正確に検査できる。多型領域が従来のｃｆＤＮＡ（例えば１６０ｂｐ）より長い場合があるため、血漿中の長いｃｆＤＮＡを分析できなければ、これらのマーカーの一部を利用できない。いくつかの実例において、他のタンデムリピート多型（例えば、ミニサテライト）も、長い無細胞ＤＮＡ分子を使用して検出でき、該分子は次に腫瘍由来ＤＮＡの検出に使用され得る。また、少数の既知のＭＳＩマーカーに制限された文献に記載のＰＣＲベースの方法を使用する場合とは対照的に、ＭＳＩ検出のためのロングリード配列決定の使用は、任意のＭＳＩ（例えばゲノムワイドなレベルで）を保有する癌患者に適用できる。

【0414】

図７８は、癌特異的マイクロサテライトマーカーに基づいて腫瘍由来ＤＮＡを検出する一例の概要７８００を図示する。図７８に示すように、いくつかの実施形態において、癌細胞に特有に存在するが正常細胞に存在しないマイクロサテライト変化（ＣＡＧ）_３０を保有する腫瘍由来分子を検出してもよい。いくつかの実施形態において、マイクロサテライト変化に関連するメチル化ハプロタイプは、本開示に提示された実施形態に従って腫瘍位置を特定するために使用できる。
Ｘ．治療
Ａ．治療選択

【0415】

本開示の実施形態では、疾患の再発を正確に予測でき、それによって、対象の疾患転帰及び全生存率を改善するための早期介入及び適切な治療の選択が容易になる。例えば、対応するサンプルが疾患の再発を予測可能な事象において、対象に強化化学療法を選択することができる。別の例では、初期治療を完了した対象の生体サンプルを配列決定して、疾患の再発を予測可能なウイルスＤＮＡを同定することができる。かかる例において、対象の癌が初期治療に抵抗性を示している可能性があるため、対象に代替治療レジメン（例えば、より高用量）及び／又は異なる治療を選択することができる。

【0416】

実施形態は、病態の再発の分類の特定に応じて対象を治療することをも含み得る。例えば、予測が局所領域不全に対応する場合、手術を可能な治療として選択できる。別の例では、予測が遠隔転移に対応する場合、化学療法を可能な治療として追加的に選択できる。いくつかの実施形態において、治療は、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植、又は精密医療を含む。特定された再発の分類に基づき、対象への危害リスクを低減し全生存率を増加する治療計画を立てることができる。実施形態は、治療計画に従って対象を治療することを更に含み得る。
Ｂ．治療のタイプ

【0417】

実施形態は、対象について分類を特定した後に患者の病態を治療することを更に含み得る。治療は、病態の特定されたレベル、臨床上関連するＤＮＡの分画濃度、又は起源組織に応じて提供できる。例えば、同定された変異は、特定の薬物又は化学療法の標的となり得る。起源組織は、手術又は任意の他の形式の治療をガイドするために使用できる。そして、病態のレベルは、あらゆる治療の攻撃性を決定するために使用でき、治療の攻撃性は病態の該レベルに基づいて決定してもよい。病態（例えば、癌）は、化学療法、薬物、食事、療法、及び／又は手術によって治療され得る。いくつかの実施形態において、パラメーター（例えば、量又はサイズ）の値が参照値を超えるほど、治療の攻撃性が高くなり得る。

【0418】

治療は切除を含み得る。例として、膀胱癌について、治療は、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）を含み得る。この手順は、診断、病期分類及び治療に使用される。ＴＵＲＢＴ中、外科医は膀胱鏡を尿道から膀胱に挿入する。そして、腫瘍は、小さなワイヤーループ、レーザー、又は高エネルギー電気を備えるツールを使用して除去される。筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）を有する患者について、ＴＵＲＢＴは、該癌の治療又は除去に使用され得る。別の治療は、根治的膀胱切除術及びリンパ節郭清を含み得る。根治的膀胱切除術は、膀胱全体及び可能な周囲組織と臓器の切除である。治療は尿路変更術も含み得る。尿路変更術は、治療の一環として膀胱を切除する際に、医師が尿の体外に排出される新しい経路を作る場合のことである。

【0419】

治療は、通常、癌細胞の成長及び分裂を防ぐことで癌細胞を破壊する薬物の使用である化学療法を含み得る。薬物は、例えば、マイトマイシン－Ｃ（ジェネリック医薬品として入手可能）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、及び膀胱内化学療法用のチオテパ（Ｔｅｐａｄｉｎａ）に関わり得るが、それらに限定されない。全身化学療法は、例えば、シスプラチンゲムシタビン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、ドキソルビシン、及びシスプラチンに関わり得るが、それらに限定されない。

【0420】

いくつかの実施形態において、治療は、免疫療法を含み得る。免疫療法は、ＰＤ－１と呼ばれるタンパク質を遮断する免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、及びペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）を含み得るが、それらに限定されない。

【0421】

治療の実施形態は、標的療法も含み得る。標的療法は、癌の成長及び生存に寄与する癌の特定の遺伝子及び／又はタンパク質を標的とする治療である。例えば、エルダフィチニブは、癌細胞が成長又は浸潤し続けているＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ２遺伝子変異を伴う局所進行性又は転移性尿路上皮癌を有する者の治療用に承認された経口投与薬物である。

【0422】

いくつかの治療は放射線療法を含み得る。放射線療法は、高エネルギー光子（例えばｘ線）又は他の粒子を使用して癌細胞を破壊することを含み得る。各個別治療に加えて、本明細書に記載のこれらの治療の組み合わせが使用され得る。いくつかの実施形態において、パラメーターの値が閾値を超え、該閾値自体が参照値を超える場合、治療の組み合わせが使用され得る。参照文献における治療に関する情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ＸＩ．システムの例

【0423】

図７９は、本開示の実施形態に係る測定システム７９００を示す。図示のように、システムは、アッセイ装置７９１０内の無細胞ＤＮＡ分子等のサンプル７９０５を含み、ここでアッセイ７９０８はサンプル７９０５に対して行うことができる。例えば、サンプル７９０５をアッセイ７９０８の試薬と接触させて、物理的特徴７９１５の信号を提供することができる。アッセイ装置の例としては、アッセイのプローブ及び／若しくはプライマー又は液滴が（アッセイを含む液滴と共に）移動するチューブを含むフローセルであり得る。物理的特徴７９１５（例えば、蛍光強度、電圧、又は電流）は、検出器７９２０によってサンプルから検出される。検出器７９２０は、一定の間隔（例えば、周期的な間隔）で測定を行って、データ信号を構成するデータ点を取得することができる。１つの実施形態において、アナログデジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。アッセイ装置７９１０及び検出器７９２０は、アッセイシステム、例えば、本明細書に記載の実施形態に従って配列決定を行う配列決定システムを形成することができる。データ信号７９２５は、検出器７９２０から論理システム７９３０に送信される。例として、データ信号７９２５を使用して、ＤＮＡ分子の参照ゲノムにおける配列及び／又は位置を特定することができる。データ信号７９２５は、同時に生成された様々な測定値、例えば、蛍光色素の異なる色又はサンプル７９０５の異なる分子への異なる電気信号を含み得るため、データ信号７９２５は、複数の信号に対応し得る。データ信号７９２５は、ローカルメモリ７９３５、外部メモリ７９４０、又は記憶装置７９４５に記憶され得る。

【0424】

論理システム７９３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）等であってもよいし、それらを含んでもよい。それはディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイ等）及びユーザ入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタン等）を含んでもよいし、それらに結合されてもよい。論理システム７９３０及び他の部品は、スタンドアローン又はネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよいし、検出器７９２０及び／又はアッセイ装置７９１０を含む装置（例えば、配列決定装置）に直接取り付けられても組み込まれてもよい。論理システム７９３０は、プロセッサ７９５０において実行されるソフトウェアも含み得る。論理システム７９３０は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するように測定システム７９００を制御するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム７９３０は、配列決定又は他の物理的操作が実行されるように、アッセイ装置７９１０を含むシステムにコマンドを提供することができる。かかる物理的操作は、例えば、試薬を特定の順序で添加及び除去するように、特定の順序で実行できる。かかる物理的操作は、サンプルを取得してアッセイを行うために使用され得るように、例えば、ロボットアームを含むロボットシステムによって実行され得る。

【0425】

システム７９００は、対象に治療を提供できる治療装置７９６０も含み得る。治療装置７９６０は、治療を決定でき及び／又は治療を実施するために使用できる。かかる治療の例としては、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、及び幹細胞移植を含み得る。論理システム７９３０は、例えば、本明細書に記載の方法の結果を提供するために、治療装置７９６０に接続され得る。治療装置は、（例えば、ロボットシステムを制御するように、治療を制御するために）他の装置からの入力、例えばイメージング装置及びユーザ入力を受信し得る。

【0426】

本明細書で言及したコンピュータシステムのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用し得る。かかるサブシステムの例は、図８０においてコンピュータシステム８０００で示される。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、ここでサブシステムは該コンピュータ装置の部品であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、それぞれがサブシステムであり内部部品を備える、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話及び他のモバイル装置を含み得る。

【0427】

図８０に示すサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンター７４、キーボード７８、記憶装置（複数可）７９、ディスプレイアダプター８２に結合されるモニタ７６（例えば、ＬＥＤ等のような表示画面）等の追加のサブシステムが示される。Ｉ／Ｏコントローラー７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））等の当分野で既知の任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７又は外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ等）を使用して、コンピュータシステム８０００をＩｎｔｅｒｎｅｔ等の広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナーに接続することができる。システムバス７５を介した相互接続により、中央プロセッサ７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ７２又は記憶装置（複数可）７９（例えば、ハードドライブ等の固定ディスク、又は光ディスク）からの複数の命令の実行、及びサブシステム間の情報交換を制御することが可能になる。システムメモリ７２及び／又は記憶装置（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計等のデータ収集装置８５である。本明細書で言及したデータのいずれも、１つの部品から別の部品へ出力でき、ユーザへ出力できる。

【0428】

コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１、内部インターフェースによって、又は１つの部品から別の部品へ接続したり取り外したりできるリムーバブル記憶装置を介して一緒に接続された、複数の同じ部品又はサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワーク上で通信することができる。かかる例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバと見なすことができ、ここで疎の各々は、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバはそれぞれ複数のシステム、サブシステム、又は部品を含み得る。

【0429】

実施形態の態様は、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）、及び／又はモジュラー様式又は統合様式で一般にプログラム可能なプロセッサと共に、メモリに記憶されたコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実施することができるため、プロセッサは、ハードウェア回路を設定するソフトウェア命令、及び設定命令又はＡＳＩＣを有するＦＰＧＡを含み得る。本明細書で使用されるように、プロセッサは、同じ集積チップ上のシングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、又は単一の回路基板上の若しくはネットワーク化の、複数の処理ユニット、並びに専用ハードウェアを含み得る。本明細書で提供される開示及び教示に基づき、当業者は、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使用して、本開示の実施形態を実施するための他の方式及び／又は方法を認識・理解するであろう。

【0430】

本出願に記載のソフトウェア部品又は機能のいずれも、例えば、従来の又はオブジェクト指向の技術を使用して、任意の好適な、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔのようなコンピュータ言語、又はＰｅｒｌ又はＰｙｔｈｏｎ等のスクリプト言語を使用するプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして、実装され得る。ソフトウェアコードは、記憶及び／又は送信のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令又はコマンドとして記憶され得る。好適な非一時的なコンピュータ可読媒体としては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ若しくはフロッピー（登録商標）ディスク等の磁気媒体、又はコンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）若しくはブルーレイディスク等の光学媒体、及びフラッシュメモリ等を含み得る。コンピュータ可読媒体は、このような装置の任意の組み合わせであり得る。加えて、操作の順序は並べ替えられてもよい。プロセスは、その操作が完了する時に終了できるが、図に含まれない追加のステップを有し得る。プロセスは、方法、関数、手順、サブルーチン、サブプログラム等に対応し得る。プロセスが関数に対応する場合、その終了は、呼び出し関数又はメイン関数への該関数の戻り値に対応し得る。

【0431】

かかるプログラムは、符号化され、Ｉｎｔｅｒｎｅｔを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、及び／又は無線ネットワークを介した送信に適合したキャリア信号を使用して送信されてもよい。したがって、コンピュータ可読媒体は、かかるプログラムで符号化されたデータ信号を使用して作製され得る。プログラムコードで符号化されたコンピュータ可読媒体は、互換性装置でパッケージ化されてもよいし、（例えば、Ｉｎｔｅｒｎｅｔダウンロードを介して）他の装置とは別個に提供されてもよい。任意のかかるコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、又はコンピュータシステム全体）上又はその内部に存在してもよく、システム又はネットワークにおける異なるコンピュータ製品上又はその内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、本明細書で言及した結果のいずれかをユーザへ提供するためのモニタ、プリンター、又は他の好適なディスプレイを含み得る。

【0432】

本明細書に記載の方法のいずれも、ステップを実行するように構成され得る１つ又は複数のプロセッサを含むコンピュータシステムによって全部又は部分的に実行され得る。プロセッサで実行される任意の操作（例えば、アライメント、決定、比較、演算、計算）は、リアルタイムで実行され得る。「リアルタイム」という用語は、特定の時間制約内で完了される演算操作又はプロセスを指し得る。時間制約は、１分間、１時間、１日間、又は７日間であり得る。よって、実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれかのステップを実行するように構成された、個別のステップ又は個別のステップの群を実行する異なる部品を備える可能性のあるコンピュータシステムに関し得る。番号付けのステップとして示されたが、本明細書の方法のステップは、同じ時間又は異なる時間又は異なる順序で実行することができる。加えて、これらのステップの一部は、他の方法からの他のステップの一部と共に使用され得る。また、ステップの全部又は一部は選択的である場合もある。加えて、方法のいずれかのステップのいずれも、これらのステップを実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、又は他の手段を用いて実行できる。

【0433】

特定の実施形態の具体的な詳細は、本開示の実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、任意の好適な様態で組み合わせることができる。しかしながら、本開示の他の実施形態は、各個々の態様、又はこれらの個々の態様の具体的な組み合わせに関する具体的な実施形態を対象とし得る。

【0434】

本開示の例示的実施形態の上の説明は、例示及び説明の目的で提示されている。包括的であること、又は本開示を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正及び変更が、先の教示に鑑みて可能である。

【0435】

「一（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、又は「該（ｔｈｅ）」の記述は、明確に反対の記載がない限り、「１つ又は複数」を意味することが意図される。「又は」の使用は、明確に反対の記載がない限り、「排他的な又は」ではなく「包含的な又は」を意味することが意図される。「第１」の構成要素への言及は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。また、「第１」又は「第２」の構成要素への言及は、明示的に述べられていない限り、言及される構成要素を特定の場所に限定するものではない。「～に基づいて」という用語は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。

【0436】

本明細書に１群の置換が開示される場合、それらの群の全ての個々のメンバー、及び該置換を使用して形成できる全てのサブグループ及びクラスは個別に開示されることが理解される。マルクーシュ群又は他の群化が本明細書で使用される場合、該群の全ての個々のメンバー、及び該群の可能な全ての組み合わせ及びサブコンビネーションは、本開示に個別に含まれることが意図される。本明細書で使用されるように、「及び／又は」は、「及び／又は」で区切られたリストにおける項目の１つ、全て、又は任意の組み合わせが該リストに含まれることを意味し、例えば、「１、２及び／又は３」は、「『１』、又は『２』、又は『３』、又は『１及び２』、又は『１及び３』、又は『２及び３』、又は『１、２及び３』」に相当する。

【0437】

「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ、ｈａｓ）」、「と共に（ｗｉｔｈ）」という用語、又はその変形は、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りでは、かかる用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方式で包括的であることを意図している。本明細書で使用されるように、「本質的に…からなる」は、請求項の基本的又は新規な特徴に実質的に影響しない材料又はステップを排除するものではない。

【0438】

例えば、温度範囲、時間範囲、又は組成範囲等、明細書で範囲が与えられる場合、全ての中間範囲及び部分範囲、並びに所与の範囲に含まれる全ての個々の値は本開示に含まれることが意図される。

【0439】

本明細書で言及した全ての特許、特許出願、刊行物、及び説明は、あらゆる目的で参照によって全体として組み込まれる。いずれも先行技術とは認められない。本出願と本明細書に提供される参照文献が矛盾する場合、本出願が優先するものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【国際調査報告】