知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシテイ オブ イリノイの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-10
(54)【発明の名称】画像誘導外科的方法のための腫瘍標的化プローブ
(51)【国際特許分類】
A61B 10/00 20060101AFI20241203BHJP
C07K 14/21 20060101ALI20241203BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
A61B10/00 E
C07K14/21 ZNA
G01N21/64 F
A61B10/00 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532262
(86)(22)【出願日】2022-11-30
(85)【翻訳文提出日】2024-07-26
(86)【国際出願番号】 US2022080631
(87)【国際公開番号】W WO2023102409
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】63/264,732
(32)【優先日】2021-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500436215
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシテイ オブ イリノイ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダス ドゥパッタ、タパス ケイ．
(72)【発明者】
【氏名】ヤマダ、トオル
(72)【発明者】
【氏名】ゴトウ、マサヒデ
(72)【発明者】
【氏名】ナッフォウジェ、サメル
【テーマコード（参考）】
2G043
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043DA02
2G043EA01
2G043FA02
2G043KA01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045BA70
4H045CA11
4H045EA50
(57)【要約】
臨床的に非毒性の腫瘍標的化ペプチドｐ２８及びＦＤＡ承認のＮＩＲ色素インドシアニングリーン（ＩＣＧ）で構成される独特の近赤外（ＮＩＲ）蛍光イメージングプローブＩＣＧ－ｐ２８が、インビボ動態について分析され、臨床実務のために最適化されている。ＩＣＧ－ｐ２８による術中イメージングを使用して、小さい（≦１ｍｍ）リンパ節（ＬＮ）含有がん細胞を同定した。ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術は、対照アプローチと比較して、マージン部位での残存正規化腫瘍ＤＮＡの６．６ｘ１０３倍を超える減少を示し、複数の動物モデルにおいて腫瘍再発率の改善（９２％の特異性）をもたらした。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において腫瘍細胞を術中に同定する方法であって、検出可能に標識されたｐ２８プローブを対象に投与することと；
対象から腫瘍細胞を除去するための手術を行うことと
を含み、
プローブが、腫瘍細胞に局在し、
外科的手順の間、リアルタイム画像を提供するイメージング技術が、プローブによって標識された細胞を検出するために実行され、プローブによって標識されたこれらの細胞が、腫瘍細胞を表す、
方法。
【請求項2】
ｐ２８プローブの検出可能な標識が近赤外蛍光分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
近赤外蛍光分子がインドシアニングリーンである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
プローブが約５０ｎＭ～約２５０ｎＭの濃度で対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
プローブが静脈内又は皮下に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
プローブの投与とイメージング技術の実施との間の期間が約２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
イメージング技術が腫瘍のマージンを描写する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
対象が乳がんを有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
イメージング技術が、８００ｎｍの近赤外線（ＮＩＲ）シグナルを検出するＣＣＤカメラユニットを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
プローブが約１ｍｍのサイズの腫瘍に局在する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
対象が、手術手順中に追加のイメージング技術なしで腫瘍を除去する手術を受けた対象と比較した場合、腫瘍の外科的除去後の腫瘍再発が減少している、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
残存腫瘍細胞について対象を術後評価することをさらに含み、腫瘍を除去する手術を受けた対象に、検出可能に標識されたｐ２８プローブを投与することと；
プローブによって標識された細胞を検出するためにイメージング技術を対象に適用することと
を含み、
イメージング技術が、腫瘍マーカーを発現する細胞を陽性に同定し、これにより、任意の残存腫瘍細胞を同定する、
請求項１に記載の方法。
【請求項13】
腫瘍マーカーを発現する細胞を検出する方法であって、細胞を検出可能に標識されたｐ２８プローブに曝露することと；
プローブを検出するためにイメージング技術を実行することと
を含み、
プローブが、腫瘍マーカーを発現する細胞に共局在し、それにより、腫瘍マーカーを発現する細胞を検出する、
方法。
【請求項14】
ｐ２８プローブの検出可能な標識が近赤外蛍光分子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
近赤外蛍光分子がインドシアニングリーンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
プローブが、約０．２ｐＭ～約２０μＭの濃度で検出可能な蛍光シグナルを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
検出可能に標識されたｐ２８プローブを含む組成物であって、検出可能な標識が近赤外蛍光分子を含む、組成物。
【請求項18】
近赤外蛍光分子がインドシアニングリーンである、請求項１７に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の参照
本出願は、２０２１年１２月１日に出願された米国仮出願第６３／２６４，７３２号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１２月１日に出願された米国仮出願第６３／２６４，７３２号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、ＮＩＨによって授与された連邦助成金番号Ｒ０１ＥＢ０２３９２４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
本発明は、ＮＩＨによって授与された連邦助成金番号Ｒ０１ＥＢ０２３９２４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【0003】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１１月２９日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーの名称はｔｘｔ＿４６４６６－５７．ｔｘｔであり、サイズは２２２９バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１１月２９日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーの名称はｔｘｔ＿４６４６６－５７．ｔｘｔであり、サイズは２２２９バイトである。
【背景技術】
【0004】
乳がんは、主に、周囲の正常な乳房組織マージンを有する腫瘍の外科的切除によって処置される。早期段階では、これらの処置は、乳房保存手術（ＢＣＳ）又は腫瘤切除術の形態をとる。ＢＣＳは満足のいく美容的転帰を提供するが、再切除率は約２０％であり、これらの手術のうち、約８５％が最初の陽性マージンの存在によって行われる。早期段階の乳がん患者については、陰性マージンを達成することにおける固有の課題から、さらなる手術及び追加の組織除去が必要とされることが多いが、既存のガイドラインは、日常的な実務においてより広い陰性マージンを切除することを推奨している。現在、外科医は、健康組織と悪性組織とを区別するために視覚的及び触覚的キューに主に依存しており、したがって腫瘍床に残存病変を残すことがある。ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴなどは、外科的手順の前に腫瘍病変を評価するために典型的に使用される容易に利用可能なイメージングモダリティである。特に、乳がんについては、ＭＲＩ又は超音波を伴うマンモグラフィが現在の標準治療である。これらの従来のイメージングモダリティは、腫瘍検出の進歩及び切除範囲の決定において非常に有用であったが、正確な術中イメージングの必要性は、初期ＢＣＳ時の乳がんの管理における最も重要な満たされていないニーズの１つのままである。
【0005】
新しい迅速で正確な術中マージン評価ツールを特定するための広範な研究が進行中であり、そのうちのいくつかは現在臨床試験を受けている。例えば、バイオフォトニックに基づく技術の中でも、蛍光イメージングを使用する画像誘導手術は、外科医に多くの利点を提供する。近赤外（ＮＩＲ）イメージングは、その顕著な光吸収、リアルタイムの視覚化を支援する能力、及び電離放射線の欠如のために、蛍光誘導手術のための新興の生物医学イメージングモダリティである。ＮＩＲ範囲（７００～９００ｎｍ）におけるインビボイメージングは、その低い散乱、無視できる組織の自己蛍光、及び比較的高い組織浸透のために、可視スペクトルにおけるものよりも優れている。最初のＦＤＡ承認ＮＩＲ色素であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、その証明された安全性及びその使用の実現可能性のために５０年以上にわたって臨床実務で使用されてきた。しかしながら、診断のためにＩＣＧを使用することの主な欠点は、その非常に短い半減期（２～４分）、血漿タンパク質に容易に非特異的に結合する能力、及び受動蛍光色素としての腫瘍特異的リガンド－受容体相互作用機構の欠如である。したがって、ＩＣＧの新しい腫瘍標的化バージョンを作製することは、臨床において有用であり得る。
【発明の概要】
【0006】
現在のがん処置は、腫瘍と周囲の正常組織マージンの両方の切除、その後の早期及び局所進行疾患のための全身治療を含む。しかしながら、陰性マージンを達成することに関連する固有の課題のために、さらなる手術及び組織除去がしばしば必要である。外科的切除を最適化し、腫瘍のない縁を確認するための新規な方法が緊急に必要とされている。本発明者らは、臨床的に非毒性の腫瘍標的化ペプチドｐ２８及びＦＤＡ承認のＮＩＲ色素インドシアニングリーン（ＩＣＧ）で構成される独特の近赤外（ＮＩＲ）蛍光イメージングプローブＩＣＧ－ｐ２８を開発した。本明細書では、臨床実務の設定を最適化するためにインビボ動態を分析し、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた術中イメージングを使用して、小さい（≦１ｍｍ）リンパ節（ＬＮ）含有がん細胞を同定した。腫瘍マーカーとしてｉＲＦＰを安定に発現する異種移植片腫瘍は、ＩＣＧ－ｐ２８との有意な共局在化を示したがＩＣＧ単独では示さなかった。ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術は、対照アプローチ（すなわち、ＩＣＧ又は触診／目視検査のみによる手術）と比較して、マージン部位での残存正規化腫瘍ＤＮＡの６．６ｘ１０３倍を超える減少を示し、受容体発現状態とは無関係に複数の乳がん動物モデルにおいて腫瘍再発率の改善（９２％の特異性）をもたらした。ＩＣＧ－ｐ２８は、完全切除の可能性を高めるために、マージンにおける腫瘍細胞の正確な同定を可能にした。本発明者らの単純で費用効果の高いアプローチは、外科医がリアルタイム３Ｄ様式で腫瘍マージンを術中に同定することを可能にし、再切除率を低下させることによって全体的な転帰を著しく改善する新しい外科的手順を提供する。
【0007】
他の方法、特徴及び／又は利点は、以下の図面及び詳細な説明を検討すると明らかになるか、又は明らかになるであろう。そのような追加の方法、特徴、及び利点はすべて、この説明内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。
【0008】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ヒト特異的Ａｌｕ配列（ｈｕＡｌｕ）に特異的なプライマーであり、センス：５’－ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＴＴ－３’（配列番号１）である。
配列番号１は、ヒト特異的Ａｌｕ配列（ｈｕＡｌｕ）に特異的なプライマーであり、センス：５’－ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＴＴ－３’（配列番号１）である。
【0009】
配列番号２は、ヒト特異的Ａｌｕ配列（ｈｕＡｌｕ）に特異的なプライマーであり、アンチセンス：５’－ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＣ Ａ－３’（配列番号２）である。
【0010】
配列番号３は、マウスＧＡＰＤＨゲノムＤＮＡ配列（ｍＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーであり、センス：５’－ＡＧＧ ＴＣＧ ＧＴＧ ＴＧＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＴＧ－３’（配列番号３）である。
【0011】
配列番号４は、マウスＧＡＰＤＨゲノムＤＮＡ配列（ｍＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーであり、アンチセンス：５’－ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ Ａ－３’（配列番号４）である。
【0012】
配列番号５は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のアズリン由来のｐ２８である
【0013】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】濃度の関数としてのＩＣＧ－ｐ２８のＮＩＲ蛍光のグラフである。
【図1B】様々な条件におけるＮＩＲシグナルのシグナル対ノイズ比のグラフである。
【図1C】サイズの関数としてのＮＩＲシグナルを示す。
【図1D】ゼラチン系ファントムにおける深さの関数としてのＮＩＲシグナルのグラフである。
【図1E】ゼラチン系ファントムの作成の概略図である。
【0015】
【図2A】異種移植マウスモデルにおけるＩＣＧ－ｐ２８を用いたリアルタイムイメージングである。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞をマウスにｓ．ｃ．注射した。白色光写真（上）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（下；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。
【図2B】異種移植マウスモデルにおけるＩＣＧ－ｐ２８を用いたリアルタイムイメージングである。ＩＯＷＡ－１Ｔ乳がん細胞をマウスにｓ．ｃ．注射した。白色光写真（上）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（下；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。
【0016】
【図3A】ＩＣＧ－ｐ２８と腫瘍マーカーｉＲＰＦとの共局在。ＩＣＧ－ｐ２８処理ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞をパラホルムアルデヒド中で固定し、共焦点顕微鏡下で画像を取得した。赤色：腫瘍マーカーｉＲＦＰ（７００ｎｍ）；緑色：ＩＣＧ－ｐ２８（８００ｎｍ）；青色：ＤＡＰＩ（核）；黄色：赤色＋緑色。
【図3B】ＩＣＧ－ｐ２８と腫瘍マーカーｉＲＰＦとの共局在。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ腫瘍を有する無胸腺マウスに、ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独のいずれかを０．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した。注射の２４時間後、ＩＣＧ－ｐ２８群（上段）及びＩＣＧ単独群（下段）の腫瘍及び周囲の軟組織の代表的なエクスビボ画像をＯｄｙｓｓｅｙスキャナで撮影した。画像中の点線は軟組織の外縁を示す。ｉＲＦＰ（赤色：７００ｎｍ）；ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ（緑色：８００ｎｍ）；及び共局在化（黄色－橙色）。
【図3C】ＩＣＧ－ｐ２８と腫瘍マーカーｉＲＰＦとの共局在。各群［ＩＣＧ－ｐ２８群（ｎ＝１０）及びＩＣＧ単独群（ｎ＝５）］における蛍光シグナルの一致率。＊＊：Ｐ＜０．０１。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【図3D】ＩＣＧ－ｐ２８と腫瘍マーカーｉＲＰＦとの共局在。ＮＩＲ蛍光タンパク質ｉＲＦＰ（７００ｎｍ）発現乳がん細胞。ｉＲＦＰ遺伝子を安定に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ）をピューロマイシンの存在下で選択し、ｉＲＦＰからのＮＩＲ蛍光（７００ｎｍのグレースケール）をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）スキャナで確認した。
【0017】
【図4A】ヒト乳がん異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍切除中に行われた術中イメージングの概略図である。
【図4B】試験終了時の腫瘍切除部位の代表的な画像である。
【図4C】各群における再発性腫瘍の平均体積（腫瘍切除後４週間）をグラフで示す。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【0018】
【図5】図５Ａ～５Ｅは、ヒト乳がんＰＤＸモデルの画像誘導手術である。ＴＮＢＣ ＰＤＸ細胞を第４腹部脂肪パッドに接種した。ＮＩＲ剤注射の２４時間後（図５Ａ、ＩＣＧ－ｐ２８、図５Ｂ、ＩＣＧ単独）、腫瘍をＰＤＥイメージングユニットによる可視化下で切除した。白色光写真（左）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（右；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。黄色矢じり：腫瘍。図５Ｃ、ＰＤＸを有するマウスのシグナル対ノイズ比をＰＤＥユニットで記録し、定量的に分析した（１群あたりＮ＝８）。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。結果を平均＋ＳＤとして示す。図５Ｄ～５Ｅでは、ＴＮＢＣ ＰＤＸ細胞を第４腹部脂肪パッドに接種した。ＮＩＲ剤注射の２４時間後（図５Ｄ、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８、図５Ｅ、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ）、ＰＤＥイメージングユニットによる誘導の下で腫瘍を切除した。白色光写真（左）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（右；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。黄色矢じり：腫瘍。
【0019】
【図6A】ＰＤＸ腫瘍を有するＮＳＧマウスからの生検採取部位の概略図である。
【図6B】薬剤間のｈｕＡｌｕ ＤＮＡ及びｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡの標準量を用いて計算したｌｏｇ（ｈｕＡｌｕ ＤＮＡ／ｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡ）の値を示すボックスプロットである。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．００５。結果を平均±ＳＤとして示す。
【図6C】外科的検体の組織学的分析を示す。Ｈ＆Ｅ染色及びＩＣＧ－ｐ２８群から得られた検体（上）における陰性マージンの存在を確認するための増殖マーカーＫｉ－６７の染色の代表的な画像（２００倍）。ＩＣＧ群から得られた検体（下）は、悪性細胞の存在を示す。
【図6D】４週間後の各群の腫瘍体積のグラフである。
【図6E】外科的検体の組織学的分析を示す。Ｈ＆Ｅ染色及び増殖性マーカーＫｉ－６７の染色の代表的な画像（２００倍）。
【0020】
【0021】
【図8A】ＩＣＧ－ｐ２８群からのＨ＆Ｅ染色切片。腫瘍除去後の周囲の乳腺組織は異型過形成を示した（矢じり）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【0023】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、この用語の単数又は複数のいずれかを含む。「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見られるような物質に通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない物質を指す。本明細書で使用される「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」又は「外因性」などの用語は、以下のうちの少なくとも１つが真である核酸配列を指す：（ａ）所与の宿主微生物に対して外来性の（すなわち、天然に見られない）核酸の配列；（ｂ）配列が所与の宿主微生物において天然に見られ得るが、不自然な（例えば、予想よりも大きい）量である；又は（ｃ）核酸の配列が、自然界で互いに同じ関係で見られない２つ以上の部分配列を含む。
【0024】
「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖で構成される化合物を指す。ポリペプチドの「活性部分」は、完全長ポリペプチド未満であるが、測定可能な生物学的活性を保持し、生物学的検出を保持するペプチドを意味する。
【0025】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、良性であろうと悪性（がん性）であろうと、原発部位病変であろうと転移であろうと、任意の新生物成長、増殖又は細胞塊を指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、哺乳動物の疾患又は症状の１つ又は複数の症候を軽減する（熟練医師によって判断して、ある程度）組成物の量を指す。さらに、組成物の「治療有効量」とは、疾患又は症状に関連するか又はその原因となる生理学的又は生化学的パラメータのいずれかが部分的又は完全に正常に戻る量を意味する。当業者は、静脈内、皮下、腹腔内、経口、又は吸入などによって投与される場合、特定の疾患症状又は障害を処置又は予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療上有効であるために必要とされる組成物の正確な量は、多くの患者特有の考慮事項に加えて、例えば、活性薬剤の比活性、使用される送達装置、薬剤の物理的特性、投与目的などの多くの要因に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載の開示を理解した上で、当業者の技術の範囲内である。
【0027】
本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、及び「処置」などは、少なくとも１つの症候の軽減又は抑制による症状の改善、疾患の進行の遅延、疾患の発症の予防又は遅延などを含む、疾患のリスクがあるか又は疾患に罹患している患者に利益を提供する任意の作用を指す。処置はまた、正常細胞に対する最小限の破壊効果で望ましくない増殖細胞の部分的又は完全な破壊を含む。リスクのある対象は、がんを発症する平均より高いリスクを有すると決定された対象であり、これは、例えば、家族歴又はがんを発症する素因を引き起こす遺伝子の検出によって決定することができる。
【0028】
本明細書で使用される「対象」という用語は、サル及びヒトを含む霊長類、ウマ（例えば、馬）、イヌ（例えば、犬）、ネコ、様々な家畜（例えば、豚、ブタ、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物）、並びに飼い慣らされたペット及び動物園で飼育されている動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物の種を指す。
【0029】
本明細書に記載の方法及び工程が特定の順序で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定の工程の順序が変更され得ること及びそのような変更が本発明の変形例に従うことを認識するであろう。さらに、特定の工程は、可能であれば並列プロセスで同時に実行されてもよく、順次実行されてもよい。
【0030】
略語の意味は以下の通りである：使用法から明らかなように「Ｃ」は摂氏又は摂氏度を意味し、「ｓ」は秒（複数可）を意味し、「ｍｉｎ」は分（複数可）を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」又は「ｈｒｓ」は時間（複数可）を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりのポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日数（複数可）を意味し、「μＬ」又は「ｕＬ」又は「ｕｌ」はマイクロリットル（複数可）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（複数可）を意味し、「Ｌ」はリットル（複数可）を意味し、「ｍｍ」はミリメートル（複数可）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」又は「ｕＭ」はマイクロモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（複数可）を意味し、「μｍｏｌ」又は「ｕＭｏｌ」はマイクロモル（複数可）を意味し、「ｇ」はグラム（複数可）を意味し、「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラム（複数可）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（複数可）を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対（複数可）を意味し、「ｋｂｐ」はキロベース対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
【0031】
概要
イメージング剤又は薬物の腫瘍標的化送達は、がん治療における主要な課題の１つである。標的化送達はそのような薬剤の有用性を改善し得るので、小分子、抗体、タンパク質、及びペプチドを含む様々な送達ビヒクルが研究されてきた。ペプチドは、一般に、その高い複雑性のために小分子よりも特異的であり、製造が比較的安価である。特に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、診断剤及び治療剤の送達及び細胞内取り込みを改善するための有望な薬剤であることが示されている。それらはまた、合成の実現可能性、誘導体化の柔軟性、低い免疫原性、及び物理化学的パラメータに関して、より大きな分子量の抗体を超える利点を有する。これらの特徴は、担体分子としてのＣＰＰの開発が腫瘍標的化送達のための有望な戦略であることを示唆している。
イメージング剤又は薬物の腫瘍標的化送達は、がん治療における主要な課題の１つである。標的化送達はそのような薬剤の有用性を改善し得るので、小分子、抗体、タンパク質、及びペプチドを含む様々な送達ビヒクルが研究されてきた。ペプチドは、一般に、その高い複雑性のために小分子よりも特異的であり、製造が比較的安価である。特に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、診断剤及び治療剤の送達及び細胞内取り込みを改善するための有望な薬剤であることが示されている。それらはまた、合成の実現可能性、誘導体化の柔軟性、低い免疫原性、及び物理化学的パラメータに関して、より大きな分子量の抗体を超える利点を有する。これらの特徴は、担体分子としてのＣＰＰの開発が腫瘍標的化送達のための有望な戦略であることを示唆している。
【0032】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）アズリン及びその由来ペプチドｐ２８は、優先的に様々ながん細胞に入り、ｐ５３媒介性の抗増殖効果を誘導する。単一の治療剤として、ｐ２８（ＮＳＣ７４５１０４）を２つの第Ｉ相臨床試験で試験し、進行性固形腫瘍を有する患者並びに再発性及び難治性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍を有する小児患者（ＮＣＩ及び小児脳腫瘍コンソーシアム）において明らかな有害作用、毒性又は免疫原性なしに実証された予備的有効性のために、ＦＤＡ Ｏｒｐｈａｎ Ｄｒｕｇ及びＲａｒｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅの指定を付与した。したがって、ｐ２８は、がん細胞に優先的に浸透し、高度に水溶性であり、安定であり、臨床的にヒトにおいて有意な有害作用、毒性又は免疫原性を示さないので、腫瘍標的化担体として働くことができる潜在的に理想的なＣＰＰである。ここで、本発明者らは、臨床的に非毒性のｐ２８及びＦＤＡ承認ＩＣＧから構成される新しい非侵襲的ＮＩＲベースのプローブＩＣＧ－ｐ２８を開発し、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術がリアルタイム３Ｄ様式でマージンを明確に定義し、臨床的に関連する状況で適切な腫瘍切除をもたらすことを実証した。これらの知見は、ＢＣＳにおける改善された転帰を見込み、（全体的な手順／操作時間に関して）単純化された、より費用効果の高いプロトコルの開発を導くことができる。
【0033】
新しい光学イメージングプローブであるＩＣＧ－ｐ２８は、インビトロでのその光物理的特性、腫瘍におけるその特異的取り込み、及び複数のヒト乳がんマウスモデルにおける腫瘍マージンを正確に同定する能力に関して特徴付けられた。ＩＣＧ－ｐ２８による術中イメージングは、小さい（≦１ｍｍ）ＬＮ転移を特定することができた。ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術は、受容体発現状態とは無関係に、複数の乳がん動物モデルにおける陽性マージン同定及び腫瘍再発率を改善した。一般に、蛍光イメージングは、外科的手順中の腫瘍境界のリアルタイム評価に非常に有益な技術であり、蛍光色素の比較的低コスト、並びに非侵襲性薬剤が使用されるため患者及び医療チームの安全性など、いくつかの利点を提供する。さらに、コントラスト強調を伴う光学イメージングを使用して、外科的視野を変えることなく切除前に腫瘍を視覚化することができる。ＩＣＧ－ｐ２８の優先的浸透により、腫瘍と周囲の正常組織との間の実質的なコントラストが複数の乳がん動物モデルにおいて達成された。
【0034】
「ｐ２８プローブ」は、検出可能に標識された任意のｐ２８分子を指し得ることが理解される。好ましくは、ｐ２８は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から得られたアズリンのアミノ酸５０～７７にある配列番号５を含む。配列番号５を含むか、又はｐ２８と少なくとも９６％同一である任意のポリペプチドが、本明細書中に記載される方法におけるプローブとして使用可能であることが認識される。すなわち、ｐ２８の２７個のアミノ酸のうちの単一のアミノ酸が、異なるアミノ酸での置換によって変化するならば、その新しい配列は、ｐ２８と９６％同一であるであろう。同様に、単一のアミノ酸がｐ２８配列に付加されると、ｐ２８と９６％同一の配列が得られる。「ｐ２８プローブ」は、依然として「ｐ２８プローブ」という用語の範囲内に入るように、保存的アミノ酸置換又は非天然アミノ酸を含み得る。同様に、「ｐ２８プローブ」は、任意の検出可能に標識された物質で修飾され得ることが理解される。ただし、この場合、好ましくは、検出可能な標識は任意の近赤外標識である。
【0035】
いくつかの態様では、検出可能に標識されたｐ２８プローブの組成物が本明細書に記載され、検出可能な標識は近赤外蛍光分子を含む。いくつかの態様では、近赤外蛍光分子はインドシアニングリーンである。
【0036】
いくつかの態様では、腫瘍マーカーを発現する細胞を検出する方法が本明細書に記載される。この方法は、細胞を検出可能に標識されたｐ２８プローブに曝露し、イメージング技術を実施してプローブを検出する工程を含む。この方法は、プローブが腫瘍マーカーを発現する細胞に共局在し、したがって腫瘍マーカーを発現する細胞を検出するという点で有効である。いくつかの態様では、ｐ２８プローブの検出可能な標識は近赤外蛍光分子であり、いくつかの態様では、分子はインドシアニングリーンである。いくつかの態様では、プローブは、約０．２ｐＭ～約２０μＭの濃度で検出可能な蛍光シグナルを示す。
【0037】
いくつかの態様では、対象における腫瘍細胞を手術中に同定する方法が本明細書に記載される。対象は、腫瘍を有することが疑われ得るか、又は腫瘍を有すると診断された対象であり得る。この方法は、検出可能に標識されたｐ２８プローブを対象に投与する工程と、対象から腫瘍細胞を除去するための手術を行う工程とを含み、この方法において、プローブは、腫瘍細胞に局在化される。外科的手順中、プローブによって標識された細胞を検出するためにリアルタイム画像を提供するイメージング技術が実行され、プローブによって標識されたこれらの細胞は細胞である。いくつかの態様では、ｐ２８プローブの検出可能な標識は近赤外蛍光分子であるか、又はインドシアニングリーンである。いくつかの態様では、プローブは、約５０ｎＭ～約２５０ｎＭの濃度で対象に投与される。いくつかの態様では、プローブは静脈内又は皮下に投与される。いくつかの態様では、プローブの投与とイメージング技術の実施との間の期間は、約２４時間である。いくつかの態様では、リアルタイムイメージング技術は、手術手順中の腫瘍のマージンを描写する。いくつかの態様では、本方法は、乳がんを有すると診断された対象に対して行われる。いくつかの態様では、術中イメージング技術は、８００ｎｍの近赤外線（ＮＩＲ）シグナルを検出するＣＣＤカメラユニットを含む。いくつかの態様では、プローブは、約１ｍｍのサイズの腫瘍に局在する。いくつかの態様では、対象は、手術手順中に追加のイメージング技術なしで腫瘍を除去する手術を受けた対象と比較した場合、腫瘍の外科的除去後の腫瘍の再発が減少していることが分かった。
【0038】
いくつかの態様では、本発明は、腫瘍を除去する手術を受けた対象に検出可能に標識されたｐ２８プローブを投与し、プローブによって標識された細胞を検出するためのイメージング技術を対象に適用することによって、残存腫瘍細胞について対象を術後評価することを記載する。イメージング技術は、腫瘍マーカーを発現する細胞を陽性に同定し、したがって任意の残存腫瘍細胞を同定する。
【実施例】
【0039】
例１：インビトロでのＩＣＧ－ｐ２８の特性評価：及びインビボでの動態
ＩＣＧ－ｐ２８は、新しいＮＩＲ化合物であるので、本発明者らは、８００ｎｍのＮＩＲシグナルを検出するＣＣＤカメラユニットから構成されるＦＤＡ ５１０（ｋ）認可のＮＩＲシステムであるＰＤＥ ｎｅｏ（登録商標）イメージングユニットを用いて、その光化学的性質を特性評価した。このＰＤＥシステム（小型制御ユニット及びＬＣＤモニターと結合されたカメラ）は、他の生理学的システムの中でも、肝セグメント及び胆管を識別するためのＩＣＧを用いたＮＩＲイメージングを含む臨床用途に使用されてきた。ＰＤＥユニットの利点は、外科医がカメラユニット（１．１ ｌｂ）を保持し、手術中に様々な角度からリアルタイムのＮＩＲ画像を容易に得ることを可能にするそのサイズ及び可搬性にある。最初に、本発明者らは、ＩＣＧ－ｐ２８を検出する際のＰＤＥユニットの感度を試験した。ＩＣＧ－ｐ２８を５％イントラリピッドエマルジョンに入れ、これは組織の光散乱及び吸収特性を模倣すると報告されている。ＩＣＧ－ｐ２８とＩＣＧ単独の両方が、濃度依存的に０．２ｐＭ～２０μＭの範囲の濃度でほぼ同一の蛍光量子収率（ΦＦ）を示した。
【0040】
ここで図１Ｅを参照すると、ゼラチン系乳房ファントムのＮＩＲイメージング及びゼラチン系ファントムの作成の概略図が記載されている。アガロース中に２００ｎＭのＩＣＧ－ｐ２８を含有するチューブ状封入体（腫瘍）を作製した。続いて、トリス緩衝液中１０％溶融ゼラチンを１７０μＭウシヘモグロビン及び１％（ｖ／ｖ）イントラリピッドエマルジョン（２０％）と混合した。ゼラチン溶液を５０ｍｌチューブに注いだ。ＩＣＧ－ｐ２８を含有するアガロース腫瘍刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）封入体を温ゼラチン系ファントムの中央に配置した。ファントムを４℃で一晩固化させた。固化したら、ファントムを５０ｍｌチューブから取り出し、平らな台の上に置いた。ＰＤＥカメラをファントムの上方にセットした（２００ｍｍの距離を全体にわたって維持した）。深さ検出限界を決定するために、封入体に達するまでファントムを一度に２ｍｍの層にスライスした。すべての深さにおいて、画像をリアルタイムで撮影して強度を定量的に測定した。
【0041】
さらに図１を参照すると、ＩＣＧ－ｐ２８の特性評価が実証されている。図１Ａ、５％イントラリピッドエマルジョン中のＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧからのＮＩＲ蛍光を、３ｍＷ／ｃｍ２の励起強度（Ｎ＝３）でＰＤＥユニットで記録した。イントラリピッド溶液は単独では蛍光を示さず、したがって対照としての役割を果たした。ＩＣＧ－ｐ２８の蛍光量子収率（ΦＦ）は、ピコモル濃度～マイクロモル濃度でＩＣＧのものと同様であった。図１Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍担持マウスにおけるシグナル対ノイズ比（８００ｎｍでのシグナル：腫瘍、ノイズ：周囲の正常組織、大腿筋）をＰＤＥユニットで記録し、用量依存的様式で定量的に分析した。プレスキャンは、ＮＩＲ剤の注射前に行った。＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊：Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．：有意でない。図１Ｃ、２００ｎＭのＩＣＧ－ｐ２８を含有する異なるサイズ（１、２、３及び５ｍｍ）の腫瘍模擬封入体の特異的ＮＩＲシグナル（８００ｎｍ）を測定した。図１Ｄ、０～２ｃｍの深さでファントムに挿入された２００ｎＭのＩＣＧ－ｐ２８を含有する腫瘍模擬封入体の特定のＮＩＲシグナル（８００ｎｍ）を測定した。図１Ｄ（ｉ）、ファントムの側面図。図１Ｄ（ｉｉ）、ファントムの上面図。赤色矢印：腫瘍模擬封入体の位置。ＰＤＥカメラ（３ｍＷ／ｃｍ２の励起強度で画像を取り込んだ）とファントムとの間の距離は２００ｍｍに固定した。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【0042】
ＩＣＧは、ＩＣＧと大きな分子量／複数のドメインを有するＩｇＧ分子（約１５０ｋＤａ）との間の相互作用のためにそのＮＩＲ蛍光を失うので、ＩＣＧにコンジュゲートされた抗体の使用は制限される。対照的に、ＩＣＧをｐ２８にコンジュゲートさせた場合、おそらくｐ２８のサイズ（２．９ｋＤａ、ＩｇＧのサイズの約１／５０）に起因して、その蛍光を失わなかった。
【0043】
単一治療剤としてのｐ２８の前臨床試験及び２つの第Ｉ相臨床試験の結果により、がん患者を処置するためのｐ２８の治療用量が特定された。蛍光イメージング技術は各造影剤の濃度に依存するので、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん腫瘍を有するマウスにおけるＩＣＧ－ｐ２８の最適用量範囲をＰＤＥユニットで決定した。各マウスに、ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独を０．２～１．０ｍｇ／ｋｇ（約５０～２５０ｎＭ）でｉ．ｖ．注射した。マウスを様々な時点（６～７２時間）でイメージングし、腫瘍組織と正常組織（大腿）のＮＩＲシグナル強度の比を計算した。腫瘍と周囲の正常組織との間の有意なコントラストが、０．２～１．０ｍｇ／ｋｇのＩＣＧ－ｐ２８の注射の２４時間後に検出された（図１Ｂ）。より高い用量のＩＣＧ－ｐ２８（＞１．０ｍｇ／ｋｇ）は、高いバックグラウンドシグナルのために、明確なコントラスト（「ウォッシュアウト」）を達成するのにより長い時間を必要としたので、腫瘍特異的シグナルは、臨床使用のための実用的な時間スケール（２４時間）内で０．２～０．５ｍｇ／ｋｇの濃度で最適であると決定された（図１Ｂ）。対照的に、同じ用量でのＩＣＧ単独は迅速に排泄され、ＮＩＲ画像に従って腫瘍部位を識別することができなかった（腫瘍／正常組織比約１）（図１Ｂ）。この結果は、ｐ２８の優先的な取り込みを示し、腫瘍部位でのより長い保持及び周囲組織に対する腫瘍の明確なコントラストのイメージングをもたらす。
【0044】
前述のように、組織測定のためのＮＩＲ波長での光学技術の使用は、自己蛍光の影響を回避し、比較的深い組織の測定を可能にすることができるので有利である。目的のサイズ及び深さの検出限界を決定するために、ＩＣＧ－ｐ２８を含有する様々なサイズの腫瘍模擬封入体（図１Ｃ）及び所定の位置にこれらの封入体を組み込んだファントム（図１Ｄ）をＰＤＥユニットで画像化した。最小の対物レンズ（１ｍｍ）でさえ、ナノモル濃度でのＩＣＧ－ｐ２８のＮＩＲ蛍光イメージングは、ＮＩＲ特異的シグナルを検出することができ（図１Ｃ）、組織散乱特性を模倣するイントラリピッドエマルジョンにおいておよそ１センチメートルの深さで組織をプローブすることができた（図１Ｄ）。
【0045】
これらのイメージング及び投薬パラメータに基づいて、本発明者らは、ヒト乳がんの２つの異なるサブタイプ：全ヒト乳がんのおよそ８０％を占めるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がん、及び全ヒト乳がんの１０～１５％を占め、一般にＥＲ陽性乳がんよりも悪い予後を示すトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ；ＥＲ、プロゲステロン及びＨｅｒ２受容体発現について陰性）を有する免疫不全マウスのリアルタイムＰＤＥイメージングを行った。
【0046】
図２を参照すると、異種移植マウスモデルにおけるＩＣＧ－ｐ２８を用いたリアルタイムイメージングが実証されている。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図２Ａ）又はＩＯＷＡ－１Ｔ（図２Ｂ）乳がん細胞をマウスにｓ．ｃ．注射した。腫瘍（＜１０ｍｍ）が発生したら、０．５ｍｇ／ｋｇのＩＣＧ－ｐ２８をマウスにｉ．ｖ．注射した。ＩＣＧ－ｐ２８注射の２４時間後、マウスを腫瘍除去中にＰＤＥシステムで画像化した。白色光写真（上）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（下；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。肝臓（緑色の矢印）は、ＩＣＧの排泄から比較的高いシグナル強度を示した。赤色矢印：腫瘍。図２Ｃは、原発腫瘍（上）及び表在臀筋に位置する坐骨ＬＮ（下；ｂの黄色の矢じり）のＨ＆Ｅ染色切片であり、腫瘍陽性であることが確認された（倍率２００倍（挿入図４０倍））。
【0047】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）（図２Ａ）又はＩＯＷＡ－１Ｔ（ＥＲ＋、ＰＲ－、Ｈｅｒ２－）ヒト乳がん細胞（図２Ｂ）をｓ．ｃ．異種移植した無胸腺マウスに、ＩＣＧ－ｐ２８を０．５ｍｇ／ｋｇ（約１２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ）でｉ．ｖ．単回注射した。ＩＣＧ－ｐ２８注射の２４時間後、本発明者らは腫瘍によるＩＣＧ－ｐ２８の優先的取り込み及び腫瘍と周囲組織との間の明確なコントラストを観察し（図２Ａ～Ｂ）、本発明者らのアプローチが受容体発現パターンとは無関係に広範なタイプの乳がんに適用できることを示唆した。特に、腫瘍切除中、術中ＮＩＲイメージングは、小さい（≦１ｍｍ）坐骨リンパ節（ＬＮ）における一定期間集中したＩＣＧ－ｐ２８の優先的取り込みを明らかにした（図２Ｂ）。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片は、ＬＮ内のがん細胞の存在を確認し（図２Ｃ）、ＩＣＧ－ｐ２８が乳房実質内の他のがん病巣を同定できることを示唆した。
【0048】
例２：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ腫瘍担持モデルにおける腫瘍マージンのＩＣＧ－ｐ２８に基づく評価
ＩＣＧ－ｐ２８が腫瘍マージンを正確に描写できるかどうかを決定するために、本発明者らは、腫瘍マーカーとしてＮＩＲ蛍光タンパク質ｉＲＦＰを安定に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ（ＴＮＢＣ）細胞株を作製した。これは、ｉＲＦＰとＩＣＧ－ｐ２８との間の蛍光のリアルタイム比較に従って腫瘍マージン検出の精度を評価するための優れた実験モデルを提供する。
ＩＣＧ－ｐ２８が腫瘍マージンを正確に描写できるかどうかを決定するために、本発明者らは、腫瘍マーカーとしてＮＩＲ蛍光タンパク質ｉＲＦＰを安定に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ（ＴＮＢＣ）細胞株を作製した。これは、ｉＲＦＰとＩＣＧ－ｐ２８との間の蛍光のリアルタイム比較に従って腫瘍マージン検出の精度を評価するための優れた実験モデルを提供する。
【0049】
ここで図３Ａを参照すると、ＩＣＧ－ｐ２８処理ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞をパラホルムアルデヒド中で固定し、共焦点顕微鏡下で画像を取得した。赤色：腫瘍マーカーｉＲＦＰ（７００ｎｍ）；緑色：ＩＣＧ－ｐ２８（８００ｎｍ）；青色：ＤＡＰＩ（核）；黄色：赤色＋緑色。図３Ｂにおいて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ腫瘍を有する無胸腺マウスに、ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独のいずれかを０．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した。注射の２４時間後、ＩＣＧ－ｐ２８群（上段）及びＩＣＧ単独群（下段）の腫瘍及び周囲の軟組織の代表的なエクスビボ画像をＯｄｙｓｓｅｙスキャナで撮影した。画像中の点線は軟組織の外縁を示す。ｉＲＦＰ（赤色：７００ｎｍ）；ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ（緑色：８００ｎｍ）；及び共局在化（黄色－橙色）。図３Ｃは、各群［ＩＣＧ－ｐ２８群（ｎ＝１０）及びＩＣＧ単独群（ｎ＝５）］における蛍光シグナルの一致率。＊＊：Ｐ＜０．０１。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【0050】
７００ｎｍチャネルは、８００ｎｍ蛍光（したがってＩＣＧ－ｐ２８からのシグナル）に影響を及ぼすことなく、がん細胞におけるｉＲＦＰ特異的蛍光をモニターするために使用することができるので、インビボでこれらの細胞によって生成された腫瘍を検出するのに適している。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞の共焦点画像（図３Ａ）及びＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ画像（図３Ｄ）は、腫瘍マーカーｉＲＦＰの細胞内発現が腫瘍マージンの正確な決定を可能にすることを示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞を接種した無胸腺マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独をｉ．ｖ．注射した。２４時間後、異種移植された腫瘍及び周囲組織を除去した。図３Ｂの点線は軟組織の外縁を示す。エクスビボ画像は、ｉＲＦＰ（赤色：７００ｎｍ）及びＩＣＧ－ｐ２８（緑色：８００ｎｍ）からのＮＩＲシグナル（マージ）の間の良好な重複を示した（図３Ｂ）。さらに、図１及び図２に提示された結果と同様に、ＩＣＧのみが不良な腫瘍保持を示した（図３Ｂ）。ＩＣＧ－ｐ２８群及びＩＣＧ単独群における７００及び８００ｎｍのＮＩＲシグナルの一致率は、それぞれ８６％及び１２％であった（図３Ｃ）。これらの結果は、ＩＣＧ－ｐ２８が腫瘍部位に優先的に局在し、ｐ２８コンジュゲーションに起因してＩＣＧの安定性を高めることができることを示している。
【0051】
例３：同所性異種移植片の術中イメージング
リアルタイム画像誘導手術が腫瘍再発を減少させることができるかどうかを評価するために、同所性ＭＦＰ異種移植腫瘍モデルを使用した。図４を参照すると、同所性異種移植モデルの術中イメージングが示されている。図４Ａは、ヒト乳がん異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍切除中に行われた術中イメージングの概略図である。ヒト乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＩＯＷＡ－１Ｔ）を、乳首の基部へのｓ．ｃ．注射によって第４腹部脂肪パッドに接種した。マウスが腫瘍を発症したとき、ＰＢＳ、ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧを０．５ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。注射の２４時間後、腫瘍をＰＤＥイメージングユニットで可視化しながら切除した。例外はＰＢＳ群であり、その腫瘍は触診／直接視覚化でのみ同定された（イメージングのガイダンスなし）。腫瘍切除後、マウスをさらに４週間モニターして、腫瘍再発を検出した。図４Ｂでは、試験終了時の腫瘍切除部位の代表的な画像である。図４Ｃでは、各群における再発性腫瘍の平均体積（腫瘍切除後４週間）。結果を平均＋ＳＤとして示す。
リアルタイム画像誘導手術が腫瘍再発を減少させることができるかどうかを評価するために、同所性ＭＦＰ異種移植腫瘍モデルを使用した。図４を参照すると、同所性異種移植モデルの術中イメージングが示されている。図４Ａは、ヒト乳がん異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍切除中に行われた術中イメージングの概略図である。ヒト乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＩＯＷＡ－１Ｔ）を、乳首の基部へのｓ．ｃ．注射によって第４腹部脂肪パッドに接種した。マウスが腫瘍を発症したとき、ＰＢＳ、ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧを０．５ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。注射の２４時間後、腫瘍をＰＤＥイメージングユニットで可視化しながら切除した。例外はＰＢＳ群であり、その腫瘍は触診／直接視覚化でのみ同定された（イメージングのガイダンスなし）。腫瘍切除後、マウスをさらに４週間モニターして、腫瘍再発を検出した。図４Ｂでは、試験終了時の腫瘍切除部位の代表的な画像である。図４Ｃでは、各群における再発性腫瘍の平均体積（腫瘍切除後４週間）。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【0052】
ＴＮＢＣ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＥＲ陽性ＩＯＷＡ－１Ｔ腫瘍を有する無胸腺マウスをＰＢＳ、ＩＣＧ単独又はＩＣＧ－ｐ２８（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置し、腫瘍切除手術中にＰＤＥシステムでＮＩＲ蛍光をモニターし、２ｍｍの安全マージンで腫瘍及び周囲組織を除去した。腫瘍除去中、ＩＣＧ又はＩＣＧ－ｐ２８の投与に関連する明らかな有害事象は観察されず、処置中に他の合併症はなかった。ＰＢＳで処置した対照マウスについては、触診と、蛍光イメージングなしの直接可視化のみをマージン決定のために使用した。腫瘍切除後、切除部位での残りの陽性マージンから生じる腫瘍再発を評価した（図４Ａ）。腫瘍切除後４週間で、ＰＢＳ群のマウスの３１．２％（５／１６）及びＩＣＧ単独群のマウスの２５．０％（４／１６）において手術部位で再発が観察された。対照的に、ＩＣＧ－ｐ２８群の１６匹のマウスのうちの１匹（６．３％）が、切除部位での腫瘍再発を示した。各群の手術部位の代表的な画像を示す（図４Ｂ）。再発腫瘍の平均体積は、ＰＢＳ、ＩＣＧ－ｐ２８及びＩＣＧ群でそれぞれ９４４、１９７、及び４２３ｍｍ３であった（図４Ｃ）。まとめると、これらの所見は、腫瘍マージンの正確な同定を支援することによって、ＩＣＧ－ｐ２８が腫瘍再発の発生率及び再発腫瘍の体積の両方を減少させることによって外科的転帰を改善したことを示している。
【0053】
例４：ＰＤＸ腫瘍モデルにおける画像誘導腫瘍切除
【0054】
ＰＤＸモデルは、元のヒト腫瘍の生物学的特性を保存する際の明確な利点のために、がん研究において広く使用されている。ＩＣＧ－ｐ２８誘導切除（図４Ｃ）で処置した同所性異種移植モデルで観察された腫瘍再発の減少を考慮して、本発明者らはＰＤＸモデル及び原発性ＴＮＢＣ断片（ステージＩＶ）を利用して、より臨床的に関連するモデルにおいてＩＣＧ－ｐ２８をさらに評価した。さらに、この結果がｐ２８の特異的モチーフに起因するかどうかを調べるために、本発明者らは、ＩＣＧにコンジュゲートさせた追加の対照ペプチドを含めた。ｐ２８と同様に、ＡＡ３Ｈと呼ばれるアネキシン由来の非カチオン性ＣＰＰが以前に単離され、がん細胞に浸透することが示された。他のペプチドは、レトロインベルソｐ２８（ＲＩ ｐ２８）であった。ＲＩ修飾は、配列の方向が逆であり、各アミノ酸残基のキラリティーが逆である親ペプチド（ｐ２８）の異性体を表すペプチド模倣体を作製するためのアプローチとしてしばしば使用される。
【0055】
使用時には、図５に示すように、ヒト乳がんＰＤＸモデルの画像誘導手術が行われる。ＴＮＢＣ ＰＤＸ細胞を第４腹部脂肪パッドに接種した。ＮＩＲ剤注射の２４時間後（図５Ａ、ＩＣＧ－ｐ２８、図５Ｂ、ＩＣＧ単独）、腫瘍をＰＤＥイメージングユニットによる可視化下で切除した。白色光写真（左）及びスナップショットＮＩＲ ＰＤＥ画像（右；背面図、８００ｎｍのグレースケール）を示す。黄色矢じり：腫瘍。図５Ｃでは、ＰＤＸを有するマウスのシグナル対ノイズ比をＰＤＥユニットで記録し、定量的に分析した（１群あたりＮ＝８）。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。結果を平均＋ＳＤとして示す。
【0056】
麻酔下で、ＩＣＧ－ｐ２８（図５Ａ）、ＩＣＧ単独（図５Ｂ）又は対照剤（ＰＢＳ、ＩＣＧ－ＲＩ－ｐ２８図５Ｄ又はＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ；図５Ｅ）を注射したマウスのＰＤＥイメージングによるリアルタイムガイダンス下で、２ｍｍの安全マージンで腫瘍及び周囲の乳腺組織を除去した。ＩＣＧ－ｐ２８は、対照剤よりも有意に大きいコントラスト増強及びより容易に同定された腫瘍を提供した。これらの結果は、ＩＣＧ－ｐ２８の腫瘍標的化能がｐ２８の特異的モチーフに起因することを示す。
【0057】
例５：Ａｌｕシーケンシングによる腫瘍マージンにおける残存がん細胞の検出
【0058】
ここで図６を参照すると、腫瘍マージンにおける残存がん細胞の検出が記載されている。図６Ａは、ＰＤＸ腫瘍を有するＮＳＧマウスからの生検採取部位の概略図を示す。図６Ｂは、ゲノムＤＮＡを各検体から抽出し、ＰＣＲアッセイに供したことを示す。ボックスプロットは、薬剤間のｈｕＡｌｕ ＤＮＡ及びｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡの標準量を用いて計算したｌｏｇ（ｈｕＡｌｕ ＤＮＡ／ｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡ）の値を示す。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．００５。結果を平均±ＳＤとして示す。図６Ｃには、外科的検体の組織学的分析が示される。Ｈ＆Ｅ染色及びＩＣＧ－ｐ２８群から得られた検体（上）における陰性マージンの存在を確認するための増殖マーカーＫｉ－６７の染色の代表的な画像（２００倍）。ＩＣＧ群から得られた検体（下）は、悪性細胞の存在を示す。図６Ｄでは、外科的切除後４週間、各群の腫瘍体積を決定した。図６Ｅは、Ｈ＆Ｅ染色及び増殖性マーカーＫｉ－６７の染色の代表的な画像（２００倍）を提供し、示された群から得られた検体における陽性マージンの存在を確認した。
【0059】
本発明者らのイメージングアプローチによるマージン同定の有効性を定量的に決定するために、ＰＣＲに基づくアッセイを使用して、上記のＰＤＸモデルにおける残留ヒトがん細胞を検出した（図５）。画像誘導手術中、ＰＤＥイメージングシステムの誘導下で、２ｍｍの安全マージンで腫瘍及び周囲の乳腺組織を６時及び１２時の位置においてリアルタイムで除去した（図６Ａ）。これらの試料を収集して、ｈｕＡｌｕ ＰＣＲ並びに従来の組織学的分析を行った。ｈｕＡｌｕ及びハウスキーピング遺伝子ｍＧＡＰＤＨを使用した定量分析では、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術は、他の薬剤［ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８又はＰＢＳ：それぞれ－０．９、－１．９、－０．５及び－２．１］を用いた手術よりも周囲組織［ｌｏｇ（ｈｕＡｌｕ ＤＮＡ／ｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡ）＝－５．２］において有意に少ない残存がん細胞を示した（図６Ｂ、図７）。
【0060】
具体的に図７を参照すると、ｈｕＡｌｕ／ｍＧＡＰＤＨ値の正常性試験の結果が示されている。図７Ａでは、図６Ｂに示すデータに基づいて、ＩＣＧ－ｐ２８群からの周囲組織中の残存腫瘍ＤＮＡに対する倍数増加を計算した（＃）。ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術は、対照剤を用いた手術と比較して、マージン部位での残存正規化腫瘍ＤＮＡの６．６ｘ１０３倍の平均減少をもたらした。図７Ｂでは、式Ｙ＝ｌｏｇ（ｈｕＡｌｕ／ｍＧＡＰＤＨ）を使用して対数変換したｈｕＡｌｕ／ｍＧＡＰＤＨ値の分布の正規性を評価するために正規性試験を行った。ＱＱプロットは線形関係を示し、変換されたデータを正規分布として合理的に扱うことができることを示している。
【0061】
この知見は、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術が、対照を用いた手術と比較して、マージン部位での残存正規化腫瘍ＤＮＡの６．６ｘ１０３倍の平均減少をもたらしたこと、及びＩＣＧ－ｐ２８が他の薬剤よりも良好に腫瘍マージンを正確に区別したことを示した。変動係数（ＣＶ）はまた、ＩＣＧ－ｐ２８が、表１に示される比較的小さな分散を示したので、術中プローブとして他のペプチド／薬剤よりも優れていることを示した。
【0062】
【表1】
平均に対する標準偏差によって定義される変動性を示す変動係数（ＣＶ）を計算した。対数正規データの場合、計算式は
【数1】
でありｓ２はサンプル分散である。結果は、すべてのプローブの中で、ＩＣＧ－ｐ２８及びＡＡ３Ｈが良好なＣＶ値（比較的小さな分散）を有したことを明確に示している。この知見は、新しい薬剤ＩＣＧ－ｐ２８の安定性を強く支持する。
【0063】
本発明者らは次に、Ａｌｕ ＰＣＲアッセイに使用した腫瘍マージン試料のセットに対してＨ＆Ｅ及び増殖マーカーＫｉ６７染色を用いて従来の組織学的分析を行った。これらの試験の結果は、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術が乳房組織の縁に明確な陰性マージンをもたらし得ることを明らかにした（図６Ｃ）。ＩＣＧ－ｐ２８群では、１５個の乳腺組織試料のうちの１つが異型過形成を示したが、ＰＢＳ、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８及びＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ群の陽性マージン率は、それぞれ１９、１９、３１及び３８％であった（図６Ｃ、図６Ｅ）。組織学的データは、Ａｌｕ ＰＣＲアッセイから得られた結果を支持し、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術が腫瘍マージンを正確に同定する能力を改善したことを示している。
【0064】
腫瘍再発率は陽性マージンの臨床的に有意な指標であるので、本発明者らはＰＤＸ腫瘍モデルにおける腫瘍再発率を決定した。画像誘導手術の４週間後、手術部位の腫瘍再発率は、ＰＢＳ、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８及びＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ群でそれぞれ２５．０％、５０．０％、３７．５％及び２５．０％であった。ＩＣＧ－ｐ２８群では、腫瘍切除中に異型過形成を有した８匹のマウスのうちの１匹が再発を示した（図８）。再発腫瘍の平均体積は、ＰＢＳ、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８及びＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ群でそれぞれ２，１５１、１，９５２、４０３、１，１５２及び２，４４７ｍｍ３であった（図６Ｄ）。ＩＣＧ－ｐ２８群における再発腫瘍の平均体積は、試験したすべての群の中で最小であった。ＩＣＧ－ｐ２８は、低コントラストを提供し腫瘍を完全に除去することを困難にした対照剤（図５Ｃ）よりも大きなコントラスト増強及びより容易に同定された腫瘍を提供した。これらの所見は、ＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術が腫瘍マージンを正確に同定することができ、腫瘍再発の減少をもたらすことを示唆する。
【0065】
本発明者らは、腫瘍特異的シグナルが、臨床使用に実用的な時間スケール（２４時間）内に０．２～０．５ｍｇ／ｋｇのＩＣＧ－ｐ２８濃度で最適であることを見出した。イメージング及び投薬パラメータでは、ＩＣＧ－ｐ２８は、複数の乳がん動物モデルにおいて有意なコントラスト（ＴＢＲ約４倍）を提供した。ＴＢＲ＞３．０倍は、画像誘導手術に関する研究において適切な術中コントラストを提供するのに十分であり、臨床的な変換の成功に不可欠であることが一般に認められている。対照的に、ＩＣＧ単独は予想通り迅速に排泄され、腫瘍部位は関連するＮＩＲ画像上で区別できなかった（ＴＢＲ約１．１）。この観察はまた、新しい化合物の優先的な取り込みがｐ２８モチーフの存在によるものであり、腫瘍部位でのより長い保持及び腫瘍と周囲組織との間の正確なコントラストイメージングをもたらすことを確認した。ＲＩ ｐ２８の分子量、ｐＩ、電荷、疎水性及びアミノ酸組成はｐ２８のものと全く同じであったが、ＲＩ ｐ２８の全体的な侵入は有意に減少し、優先的侵入を示さなかった（図６）。この知見は、ｐ２８の優先的侵入がアミノ酸配列特異的／立体化学的特異的であることを示唆している。現在、神経膠腫及び肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん及び乳がんなどの種々のがんのために、様々なタイプのＮＩＲイメージングプローブが使用されている。後者については、ベバシズマブ－ＩＲＤｙｅ８００（血管内皮増殖因子Ａ）、ＥＣ１７蛍光色素（葉酸受容体アルファ）、カテプシン活性化可能蛍光剤ＬＵＭ０１５（カテプシンプロテアーゼ）及びトズレリスチド（マトリックスメタロプロテアーゼ）などの一連の治験用蛍光剤が、画像誘導手術における使用について検証されている。しかしながら、これらのイメージング剤の大部分は、前臨床段階のＮＩＲ色素であり、それらの標的化送達のために抗体を使用する（例えば、抗Ｈｅｒ２抗体）。比較すると、ｐ２８の使用にはいくつかの利点がある：ｉ）抗体の使用とは異なり、ｐ２８のＩＣＧへの化学的コンジュゲーションはＩＣＧ蛍光を変化させない（図１）、ｉｉ）ｐ２８は受容体の状態とは無関係に広範囲の乳がんを標的化することができる（図２、図５、図６）、及びｉｉｉ）ＩＣＧ－ｐ２８は、ＦＤＡ承認ＮＩＲ ＩＣＧ色素を有する臨床的に非毒性の腫瘍標的化ｐ２８ペプチドで構成される。
【0066】
ＰＤＸモデルにおけるＩＣＧ－ｐ２８による画像誘導手術は、８匹のマウスのうちの１匹において腫瘍再発をもたらした（図６Ｄ）。しかしながら、Ａｌｕ ＰＣＲアッセイ及び組織学的分析は、６時又は１２時の位置のいずれかで得られたＭＦＰ検体中の残留腫瘍を明らかにしなかった。この表現型の発生には２つの理由が考えられる。１つの可能性は、がん細胞が組織学的分析によって捕捉されなかったことである。検体は、組織学及びＡｌｕ分析によって腫瘍陰性であると判定されたが、さもなければ見逃された少数の腫瘍細胞を含有していた可能性があり、サイズが１ｍｍ未満の微小浸潤性乳房腫瘍の可能性を示している。このサイズの病変は、顕微鏡なしでは見ることができず、腫瘍床で切除されていないままである。この場合、これらの微小病変を管理するために、追加のアプローチ（例えば、放射線又は化学療法などの他の治療アプローチと組み合わせたＩＣＧ－ｐ２８による画像誘導手術）をさらに考慮する必要がある。別の可能性は、組織学的切片（図８）に捕捉された異型過形成が４週間の観察期間中に乳がんに進行した可能性があることである。異型過形成はがんではないが、おそらくＰＤＸモデルの特徴のために、浸潤性／非浸潤性乳がんに移行し得る。それにもかかわらず、ＩＣＧ－ｐ２８群の１匹のマウスのみが腫瘍再発を示し、再発した腫瘍の体積が他の群のマウス由来の腫瘍の体積よりも小さかったことを考慮すると、ＩＣＧ－ｐ２８誘導手術は、腫瘍マージンを正確に同定するのによく役立ち、腫瘍再発率を有意に低下させるようである。全体として、乳がんの複数のサブタイプにおけるＩＣＧ－ｐ２８を用いた画像誘導手術（図４、図６）は、３００ｍｍ３の平均再発腫瘍体積をもたらしたのに対して、ＩＣＧ単独又は術中イメージングなし（ＰＢＳ）の手術は、それぞれ１，１８８ｍｍ３（Ｐ＝０．０１７）及び１，２８９ｍｍ３（Ｐ＝０．０３２）の平均再発腫瘍体積をもたらした。また、ＩＣＧ－ｐ２８群の腫瘍再発率は８％（特異度９２％、Ｎ＝２／２４）であったのに対し、ＩＣＧ群及びＰＢＳ群の腫瘍再発率はそれぞれ３３％（Ｎ＝８／２４）及び２９％（Ｎ＝７／２４）であった。複数の乳がん動物モデルにおけるこれらの結果は、ＩＣＧ－ｐ２８が、明確なマージンの特定を通じて腫瘍再発の発生率及び再発腫瘍の体積の両方を減少させることによって外科的転帰を改善したことを示唆している。したがって、ＩＣＧ－ｐ２８の汎用性は、受容体発現状態とは無関係に広範な種類の乳がんの再発及び再手術のリスクを潜在的に低減し、健康な組織への損傷及び医療費を最小限に抑え、術後の生活の質を改善し、患者の生存率を高めることができる。
【0067】
ＭＲＩ、Ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ及び超音波などの多くのイメージングモダリティは、術前の病期分類及び術中計画においてかなりの役割を果たすが、蛍光イメージングは、その優れた解像度及び感度のために術中の外科的検査及び実務中に使用することができる。腫瘍マージンの正確な同定は、乳がん並びに多くの他のタイプの固形腫瘍の効果的な外科的処置の主な目的である。不十分な陽性マージン同定は、肺及び腎臓腫瘍の切除の約５％、乳がん、前立腺がん及び直腸がんの切除の約２０％、並びに外陰がん及び口腔がんの切除の最大４０～６０％で頻繁に起こる。本発明者らのリアルタイム術中イメージングアプローチは、多くのタイプの固形腫瘍の外科的処置の転帰（例えば、罹患率、生活の質及び費用）に良い影響を与える可能性がある。
【0068】
方法
ペプチド合成及びＩＣＧコンジュゲーション
ペプチド合成及びＩＣＧコンジュゲーション
【0069】
ペプチド、ｐ２８、レトロインベルソｐ２８（ＲＩ ｐ２８）及びＡＡ３Ｈ ２２は、ＣＳ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．によって９５％超の純度及び質量バランスで合成された。ペプチドをＰＢＳ緩衝液にｐＨ７で溶解し、無水ＤＭＳＯ中のＩＣＧ－マレイミドと暗所で室温にて３時間反応させた。反応物をＰＢＳに対して４℃で２４時間透析し（Ｍ．Ｗ．２，０００カットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での濾過によって精製した。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ質量分析によって最終生成物を同定した。
【0070】
ＩＣＧ－ｐ２８特性評価
ＰＤＥ ｎｅｏ（登録商標）（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｅｙｅ；Ｍｉｔａｋａ ＵＳＡ，ＵＴ）は、８００ｎｍのＮＩＲシグナルを検出する電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラユニットから構成される、ＦＤＡ ５１０（ｋ）認可のＮＩＲカメラである。一般に、ＰＤＥユニット（小型制御ユニットに接続されたカメラ及びＬＣＤモニター）は、肝セグメント及び胆管を識別するためのＩＣＧを用いたＮＩＲイメージング臨床用途に使用されてきた。組織の光散乱及び吸収特性を模倣すると報告されている２０％イントラリピッドエマルジョン（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中のＩＣＧ及びＩＣＧ－ｐ２８をＰＤＥカメラユニットによって記録した。様々な濃度のＩＣＧ－ｐ２８（０．２ｐＭ～２０μＭ）及びＩＣＧを３ｍＷ／ｃｍ２の励起でモニターした。
ＰＤＥ ｎｅｏ（登録商標）（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｅｙｅ；Ｍｉｔａｋａ ＵＳＡ，ＵＴ）は、８００ｎｍのＮＩＲシグナルを検出する電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラユニットから構成される、ＦＤＡ ５１０（ｋ）認可のＮＩＲカメラである。一般に、ＰＤＥユニット（小型制御ユニットに接続されたカメラ及びＬＣＤモニター）は、肝セグメント及び胆管を識別するためのＩＣＧを用いたＮＩＲイメージング臨床用途に使用されてきた。組織の光散乱及び吸収特性を模倣すると報告されている２０％イントラリピッドエマルジョン（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中のＩＣＧ及びＩＣＧ－ｐ２８をＰＤＥカメラユニットによって記録した。様々な濃度のＩＣＧ－ｐ２８（０．２ｐＭ～２０μＭ）及びＩＣＧを３ｍＷ／ｃｍ２の励起でモニターした。
【0071】
乳房組織模倣ファントムの構築
【0072】
組織測定のためのＮＩＲ波長での光学技術は、自己蛍光の影響を回避し、比較的深い組織の測定を可能にすることができるので有利である。深さ検出限界を決定するために、ＩＣＧ－ｐ２８を含有する腫瘍模擬封入体を所定の位置で組織ファントムに組み込み、ＰＤＥユニットで画像化した。図１Ｅに示すように、組織ファントムを作製するための以前に公開された手順に修正を加えた。簡単に説明すると、１０％ゼラチン粉末（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を、ｐＨ７．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解した。ゼラチンを５０℃で撹拌することによって溶解し、続いて３７℃に冷却した。次いで、ウシヘモグロビン及びイントラリピッド（２０％；Ｓｉｇｍａ）を添加した。ＮＩＲ蛍光シグナルの最大透過深さを決定するために、２００ｎＭのＩＣＧ－ｐ２８を含有する封入体をファントム組織に配置した。続いて、ファントム組織を封入体に向かって一度に２ｍｍの層に切除した。すべての深度において、術中ＰＤＥ ｎｅｏシステムを用いてリアルタイムイメージングを行った。ＰＤＥカメラとファントムとの間の距離は２００ｍｍに固定した。ＰＤＥ ｎｅｏシステムを用いて取得した画像の強度を定量的に評価した。平均±ＳＤ値を計算した。
【0073】
細胞培養
ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＩＯＷＡ－１Ｔは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞を確立し、本発明者らの研究室で特性評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｐｉＲＦＰプラスミドでトランスフェクトした。ｉＲＦＰ遺伝子を安定に発現するトランスフェクタントを、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で選択した。それらを、５％ ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＭＥＭＥ培地で培養した。トリプルネガティブ乳がん細胞（ＴＭ０００９０）の単世代患者由来異種移植片（ＰＤＸ）細胞をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。
ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＩＯＷＡ－１Ｔは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞を確立し、本発明者らの研究室で特性評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｐｉＲＦＰプラスミドでトランスフェクトした。ｉＲＦＰ遺伝子を安定に発現するトランスフェクタントを、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で選択した。それらを、５％ ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＭＥＭＥ培地で培養した。トリプルネガティブ乳がん細胞（ＴＭ０００９０）の単世代患者由来異種移植片（ＰＤＸ）細胞をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。
【0074】
動物モデル
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｃｈｉｃａｇｏによって承認されたプロトコルの下で実施した。腫瘍モデルは、１．０ｘ１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＩＯＷＡ－１Ｔ又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞を、４～５週齢の雌性アチミックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の右背部（動態分析）及び乳腺脂肪パッド（ＭＦＰ；定性的マージン分析）に皮下（ｓ．ｃ．）移植することにより確立した。追加の定量的マージン分析のために、４～５週齢の雌ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＭＦＰにトリプルネガティブＰＤＸ細胞（ステージＩＶ）を移植することによって腫瘍モデルを確立した。
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｃｈｉｃａｇｏによって承認されたプロトコルの下で実施した。腫瘍モデルは、１．０ｘ１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＩＯＷＡ－１Ｔ又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞を、４～５週齢の雌性アチミックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の右背部（動態分析）及び乳腺脂肪パッド（ＭＦＰ；定性的マージン分析）に皮下（ｓ．ｃ．）移植することにより確立した。追加の定量的マージン分析のために、４～５週齢の雌ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＭＦＰにトリプルネガティブＰＤＸ細胞（ステージＩＶ）を移植することによって腫瘍モデルを確立した。
【0075】
ＩＣＧ－ｐ２８のインビボ動態分析
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４～５週齢の雌性無胸腺マウスにｓ．ｃ．注射した。ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独を、０．２、０．５又は１ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（尾静脈）。動物を、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｉ．ｖ．投与の６～７２時間後に画像化した。腫瘍バックグラウンド比（ＴＢＲ）は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して決定し、関心領域（ＲＯＩ）を腫瘍全体にわたって描画し、バックグラウンドＲＯＩを隣接組織にわたって描画した。ＲＯＩを各腫瘍の周囲に手動で生成した（８００ｎｍチャネル）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４～５週齢の雌性無胸腺マウスにｓ．ｃ．注射した。ＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧ単独を、０．２、０．５又は１ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（尾静脈）。動物を、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｉ．ｖ．投与の６～７２時間後に画像化した。腫瘍バックグラウンド比（ＴＢＲ）は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して決定し、関心領域（ＲＯＩ）を腫瘍全体にわたって描画し、バックグラウンドＲＯＩを隣接組織にわたって描画した。ＲＯＩを各腫瘍の周囲に手動で生成した（８００ｎｍチャネル）。
【0076】
腫瘍マージン評価
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞（０．１ｍｌ ＰＢＳ中１．０×１０６細胞）をマウスの右背部にｓ．ｃ．接種した。マウスが腫瘍（約２００ｍｍ３）を発症したら、マウスにＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧを０．５ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．でｉ．ｖ．注射した。注射の２４時間後、腫瘍及び周囲組織を切除した。検体を、ｉＲＦＰについては７００ｎｍチャネル及びＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧのみについては８００ｎｍチャネルを有するＯｄｙｓｓｅｙスキャナを用いてエクスビボで画像化した。ＩｍａｇｅＪを用いて面積測定を行った。平均＋ＳＤ値を計算した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｉＲＦＰ細胞（０．１ｍｌ ＰＢＳ中１．０×１０６細胞）をマウスの右背部にｓ．ｃ．接種した。マウスが腫瘍（約２００ｍｍ３）を発症したら、マウスにＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧを０．５ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．でｉ．ｖ．注射した。注射の２４時間後、腫瘍及び周囲組織を切除した。検体を、ｉＲＦＰについては７００ｎｍチャネル及びＩＣＧ－ｐ２８又はＩＣＧのみについては８００ｎｍチャネルを有するＯｄｙｓｓｅｙスキャナを用いてエクスビボで画像化した。ＩｍａｇｅＪを用いて面積測定を行った。平均＋ＳＤ値を計算した。
【0077】
腫瘍マージン決定及び腫瘍再発追跡のためのＩＣＧ－ｐ２８の定量的評価
ＮＳＧマウスが同様のサイズ（２００～３００ｍｍ３）のＰＤＸ腫瘍を発症したら、マウスを無作為に５つの群：ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈペプチド、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８及びＰＢＳに分けた。各薬剤は、ＩＣＧ－ｐ２８ ０．５ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．相当の対応する化合物をｉ．ｖ．（尾静脈）注射した。注射の２４時間後、すべての外科的手順を滅菌条件下で開始した。麻酔投与後、ＰＤＥイメージングシステムを使用して、外科的手順全体を通してＮＩＲ蛍光をモニターした。ＰＤＥイメージングシステムの誘導下で、２ｍｍの安全マージンで腫瘍及び周囲の乳腺組織を６時及び１２時の位置においてリアルタイムで除去した。ＰＢＳ群については、視覚的及び触覚的キューを介して同定された悪性組織を白色光照射下で切除したが、ＩＣＧ、ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ及びＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８群では、コントラスト増強を示す組織のみを切除した。蛍光シグナルの画像を隣接モニターに表示し、すべてのＩＣＧ陽性組織病巣（腫瘍組織として疑われる）を切除した。腫瘍切除後、皮膚切開部をナイロン縫合糸を用いて閉じ、マウスをケージに戻した。腫瘍切除後、マウスをそれらのケージにさらに４週間維持し、腫瘍の再発をモニターした。腫瘍再発を手術領域の触診によってモニターした。手術の４週間後、マウスを評価して、切除部位に残りの陽性マージンのために腫瘍のいずれかが再発したかどうかを判定した。
ＮＳＧマウスが同様のサイズ（２００～３００ｍｍ３）のＰＤＸ腫瘍を発症したら、マウスを無作為に５つの群：ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈペプチド、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８及びＰＢＳに分けた。各薬剤は、ＩＣＧ－ｐ２８ ０．５ｍｇ／ｋｇ－ｂ．ｗ．相当の対応する化合物をｉ．ｖ．（尾静脈）注射した。注射の２４時間後、すべての外科的手順を滅菌条件下で開始した。麻酔投与後、ＰＤＥイメージングシステムを使用して、外科的手順全体を通してＮＩＲ蛍光をモニターした。ＰＤＥイメージングシステムの誘導下で、２ｍｍの安全マージンで腫瘍及び周囲の乳腺組織を６時及び１２時の位置においてリアルタイムで除去した。ＰＢＳ群については、視覚的及び触覚的キューを介して同定された悪性組織を白色光照射下で切除したが、ＩＣＧ、ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ及びＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８群では、コントラスト増強を示す組織のみを切除した。蛍光シグナルの画像を隣接モニターに表示し、すべてのＩＣＧ陽性組織病巣（腫瘍組織として疑われる）を切除した。腫瘍切除後、皮膚切開部をナイロン縫合糸を用いて閉じ、マウスをケージに戻した。腫瘍切除後、マウスをそれらのケージにさらに４週間維持し、腫瘍の再発をモニターした。腫瘍再発を手術領域の触診によってモニターした。手術の４週間後、マウスを評価して、切除部位に残りの陽性マージンのために腫瘍のいずれかが再発したかどうかを判定した。
【0078】
Ａｌｕシーケンシングによる腫瘍マージンにおける残存がん細胞の検出
マージンから収集した試料に対して、ヒト特異的Ａｌｕ配列（ｈｕＡｌｕ）を用いた定量分析を行った。ＡｌｕリピートＤＮＡ配列はヒト細胞に特異的であるため、ｈｕＡｌｕｓの存在を検出することにより、マウスに移植されたヒト由来腫瘍を同定することができる。本発明者らは、以前に公開された方法に従って、切除された腫瘍及び周囲のマージン組織におけるｈｕＡｌｕの定量的検出を標準化した。５つの群（ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８、及びＰＢＳ；各群８匹のマウス）のヒト腫瘍細胞を、マウスに存在するｈｕＡｌｕの定量的検出に基づいて同定した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、採取した組織からゲノムＤＮＡを抽出した。マウス組織中のヒト細胞を同定するために、ｈｕＡｌｕに特異的なプライマー（センス：５’－ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＴＴ－３’（配列番号１）；及びアンチセンス：５’－ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＣ Ａ－３’（配列番号２）を使用して、抽出されたゲノムＤＮＡに存在するｈｕＡｌｕリピートをリアルタイムＰＣＲ（５ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、及びＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）によって増幅した。各反応は、以下の条件下で１０μｌの最終容量で実施した：５０℃で２分間及び９５℃で２分間のポリメラーゼ活性化、続いて９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間の３０サイクル。増幅可能なマウスＤＮＡの定量的測定は、マウスＧＡＰＤＨゲノムＤＮＡ配列（ｍＧＡＰＤＨ）を、ｈｕＡｌｕについて記載したのと同じＰＣＲ条件を用いてｍＧＡＰＤＨ特異的プライマー（センス：５’－ＡＧＧ ＴＣＧ ＧＴＧ ＴＧＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＴＧ－３’（配列番号３）アンチセンス：５’－ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ Ａ－３’（配列番号４）で増幅することによって得た。レポーター色素によって放出された蛍光を検出し、閾値サイクル（Ｃｔ）を、各試料中のＰＣＲ産物の量の定量的測定として記録した。マージン中のｈｕＡｌｕ ＤＮＡ及びｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡの量を標準曲線との比較によって計算し、計算したｈｕＡｌｕ ＤＮＡの量をｍＧＡＰＤＨの相対量に対して正規化した。平均±ＳＤ値を計算した。
マージンから収集した試料に対して、ヒト特異的Ａｌｕ配列（ｈｕＡｌｕ）を用いた定量分析を行った。ＡｌｕリピートＤＮＡ配列はヒト細胞に特異的であるため、ｈｕＡｌｕｓの存在を検出することにより、マウスに移植されたヒト由来腫瘍を同定することができる。本発明者らは、以前に公開された方法に従って、切除された腫瘍及び周囲のマージン組織におけるｈｕＡｌｕの定量的検出を標準化した。５つの群（ＩＣＧ－ｐ２８、ＩＣＧ単独、ＩＣＧ－ＡＡ３Ｈ、ＩＣＧ－ＲＩ ｐ２８、及びＰＢＳ；各群８匹のマウス）のヒト腫瘍細胞を、マウスに存在するｈｕＡｌｕの定量的検出に基づいて同定した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、採取した組織からゲノムＤＮＡを抽出した。マウス組織中のヒト細胞を同定するために、ｈｕＡｌｕに特異的なプライマー（センス：５’－ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＴＴ－３’（配列番号１）；及びアンチセンス：５’－ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＣ Ａ－３’（配列番号２）を使用して、抽出されたゲノムＤＮＡに存在するｈｕＡｌｕリピートをリアルタイムＰＣＲ（５ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、及びＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）によって増幅した。各反応は、以下の条件下で１０μｌの最終容量で実施した：５０℃で２分間及び９５℃で２分間のポリメラーゼ活性化、続いて９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間の３０サイクル。増幅可能なマウスＤＮＡの定量的測定は、マウスＧＡＰＤＨゲノムＤＮＡ配列（ｍＧＡＰＤＨ）を、ｈｕＡｌｕについて記載したのと同じＰＣＲ条件を用いてｍＧＡＰＤＨ特異的プライマー（センス：５’－ＡＧＧ ＴＣＧ ＧＴＧ ＴＧＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＴＧ－３’（配列番号３）アンチセンス：５’－ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ Ａ－３’（配列番号４）で増幅することによって得た。レポーター色素によって放出された蛍光を検出し、閾値サイクル（Ｃｔ）を、各試料中のＰＣＲ産物の量の定量的測定として記録した。マージン中のｈｕＡｌｕ ＤＮＡ及びｍＧＡＰＤＨ ＤＮＡの量を標準曲線との比較によって計算し、計算したｈｕＡｌｕ ＤＮＡの量をｍＧＡＰＤＨの相対量に対して正規化した。平均±ＳＤ値を計算した。
【0079】
組織学的分析
切除組織を、緩衝３．７％ホルマリン（Ａｎａｔｅｃｈ）を予め充填した容器に入れ、２４時間固定した。固定後、ホルマリンを７０％エタノールで置き換えた。試料をパラフィン包埋し、ブロックを厚さ４μｍの切片に切断し、スライド上にマウントした。Ｈ＆Ｅ－及びＫｉ－６７染色スライドを、実験群及び外科的切除結果を盲検化した病理学者が分析した。病理学者は、腫瘍の存在、マージンの状態、及び切除組織の一般的な特徴を決定する役割を担った。
切除組織を、緩衝３．７％ホルマリン（Ａｎａｔｅｃｈ）を予め充填した容器に入れ、２４時間固定した。固定後、ホルマリンを７０％エタノールで置き換えた。試料をパラフィン包埋し、ブロックを厚さ４μｍの切片に切断し、スライド上にマウントした。Ｈ＆Ｅ－及びＫｉ－６７染色スライドを、実験群及び外科的切除結果を盲検化した病理学者が分析した。病理学者は、腫瘍の存在、マージンの状態、及び切除組織の一般的な特徴を決定する役割を担った。
【0080】
統計分析
データ処理及び統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＲバージョン４．０．５（Ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて行った。再発腫瘍体積データ及びＡｌｕ配列については、それぞれフリードマンの検定及びＦ検定を使用した。
データ処理及び統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＲバージョン４．０．５（Ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて行った。再発腫瘍体積データ及びＡｌｕ配列については、それぞれフリードマンの検定及びＦ検定を使用した。
【0081】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【国際調査報告】