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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-12-10
(54)【発明の名称】標識された核酸分子集団を生成する方法及びそのキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241203BHJP
C12Q 1/6853 20180101ALI20241203BHJP
C40B 40/02 20060101ALI20241203BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20241203BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241203BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20241203BHJP
C12Q 1/6834 20180101ALI20241203BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 200
C12Q1/6853 Z ZNA
C40B40/02
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6874 Z
C12Q1/6834 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024538195
(86)(22)【出願日】2021-12-24
(85)【翻訳文提出日】2024-08-20
(86)【国際出願番号】 CN2021141195
(87)【国際公開番号】W WO2023115536
(87)【国際公開日】2023-06-29
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517110612
【氏名又は名称】ビージーアイ シェンチェン
【住所又は居所原語表記】Ｍａｉｎ ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｂｅｉｓｈａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔｉａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｙａｎｔｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０８３， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】リャオ， シャ
(72)【発明者】
【氏名】チェン， アオ
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ウェンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】シュウ， シュン
(72)【発明者】
【氏名】ペン， ジアン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ウェンジャオ
(72)【発明者】
【氏名】チェン， シー
(72)【発明者】
【氏名】フー， デフェン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS03
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本出願は、トランスクリプトームシーケンシング及び生体分子空間情報検出に関する。具体的には、本出願は、核酸分子を位置決めする、及び標識する方法、トランスクリプトームシーケンシングのための核酸分子ライブラリーを構築する方法及び方法を実行するためのキットに関する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標識された核酸分子集団を生成する方法であって、以下のステップ：（１）生体試料及び核酸アレイを提供するステップであって、前記核酸アレイが固相支持体を含み、前記固相支持体が複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つのコピーを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが、５’から３’方向にコンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、
各種のオリゴヌクレオチドプローブが異なるタグ配列Ｙを有し、前記タグ配列Ｙが、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの前記固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、ステップ、
（２）前記生体試料を前記核酸アレイと接触させて、これによって前記生体試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の位置が、前記核酸アレイ上の前記オリゴヌクレオチドプローブの位置にマッピングされるようにし、前記生体試料中の前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を前処理して、第１の核酸分子集団を生成するステップであって、前記前処理が、
（ｉ）プライマーＡを使用して、前記生体試料の前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、標識される第１の核酸分子として伸長産物を生成し、それによって前記第１の核酸分子集団を生成するステップであって、前記プライマーＡがコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、前記捕捉配列Ａが、捕捉される前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、前記コンセンサス配列Ａが前記捕捉配列Ａの上流に位置する（例えば、前記プライマーＡの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉ）（ａ）プライマーＡを使用して、前記生体試料の前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、前記ｃＤＮＡ鎖が、前記プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、前記プライマーＡがコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、前記捕捉配列Ａが、捕捉される前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、前記コンセンサス配列Ａが前記捕捉配列Ａの上流に（例えば、前記プライマーＡの５’－末端に）位置する、ステップ、及び（ｂ）プライマーＩ－Ｂを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第１の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップであって、前記プライマーＢが、コンセンサス配列Ｂと、前記３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、前記３’－末端オーバーハングの前記相補配列が前記プライマーＢの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ｂが前記３’－末端オーバーハングの前記相補配列の上流に位置する（例えば、前記プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉｉ）（ａ）プライマーＡ’を使用して、前記生体試料の前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施し、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、前記ｃＤＮＡ鎖が、前記プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、前記プライマーＡ’が捕捉配列Ａを含み、前記捕捉配列Ａが、捕捉される前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である、ステップ、（ｂ）プライマーＢを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、第１の伸長産物を生成するステップであって、前記プライマーＢが、コンセンサス配列Ｂと、前記３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、前記３’－末端オーバーハングの前記相補配列が前記プライマーＢの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ｂが前記３’－末端オーバーハングの前記相補配列の上流に位置する（例えば、前記プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、並びに（ｃ）伸長プライマーを提供し、鋳型として前記第１の伸長産物を使用して伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第２の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップ
を含む、ステップ、
（３）アニーリングを可能にする条件下で、架橋オリゴヌクレオチドを、ステップ（２）の生成物と接触させ、前記架橋オリゴヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドプローブ及び前記オリゴヌクレオチドプローブに対応する位置にある標識される前記第１の核酸分子とアニーリング（例えば、インサイツアニーリング）させ、かつ前記架橋オリゴヌクレオチドとアニーリングした前記第１の核酸分子及びアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得、それによって第２の核酸分子集団を生成するステップ
を含み、
前記架橋オリゴヌクレオチドが、第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、前記第１の領域と前記第２の領域の間に位置する第３の領域を含み、前記第１の領域が前記第２の領域の上流に位置し（例えば、前記第２の領域の５’に位置し）、
前記第１の領域が、ステップ（２）（ｉ）若しくはステップ（２）（ｉｉ）における前記プライマーＡの前記コンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリング可能であるか、又はステップ（２）（ｉｉｉ）における前記プライマーＢの前記コンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリング可能であり、
前記第２の領域が、前記コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である、方法。
【請求項2】
ステップ（３）において、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域及び前記第２の領域が直接隣接している場合に、前記第１の核酸分子の前記オリゴヌクレオチドプローブへのライゲーションが、核酸リガーゼを使用して、同一架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域にハイブリダイズされた核酸分子と、前記第２の領域にハイブリダイズされた核酸分子とをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得ることを含む、又は前記架橋オリゴヌクレオチドが、前記第１の領域、前記第２の領域及びそれらの間に位置する前記第３の領域を含む場合に、前記第１の核酸分子の前記オリゴヌクレオチドプローブへのライゲーションが、核酸ポリメラーゼを使用して、前記第３の領域を鋳型として重合反応を実施すること、並びに核酸リガーゼを使用して、同一架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域にハイブリダイズされた核酸分子と、前記第３の領域及び前記第２の領域にハイブリダイズされた核酸分子とをライゲートして、位置決めタグを有する前記第２の核酸分子としてライゲーション産物を得ることを含み、好ましくは、前記核酸ポリメラーゼが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られたラ前記イゲーション産物が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ｘ１、前記タグ配列Ｙ、前記コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第３の領域の相補配列、及び標識される前記第１の核酸分子の配列を含む、位置決めタグを有する前記第２の核酸分子としてとられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（２）（ｉ）において、前記捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、好ましくは、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来する前記ライゲーション産物が、異なる捕捉配列Ａを有し、前記捕捉配列Ａが、前記第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働き、
好ましくは、ステップ（２）（ｉ）における前記伸長産物（標識される前記第１の核酸分子）が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ａ、前記プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（２）（ｉ）において、前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡがタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、前記タグ配列Ａが、前記第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働き、
好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ａが前記タグ配列Ａの上流に位置し（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置し）、
好ましくは、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来する前記ライゲーション産物が、異なるタグ配列ＡをＵＭＩとして有し、
好ましくは、ステップ（２）（ｉ）における前記伸長産物が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ａと、前記タグ配列Ａと、前記プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡ配列とを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られた前記ライゲーション産物が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ｘ１、前記タグ配列Ｙ、前記コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第３の領域の相補配列、及び標識される第１の核酸分子の配列を含む、位置決めタグを有する前記第２の核酸分子としてとられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（２）（ｉｉ）（ａ）において、前記捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、好ましくは、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来する前記ライゲーション産物が、異なる捕捉配列Ａを有し、前記捕捉配列Ａが、前記第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働き、
好ましくは、ステップ（２）（ｉｉ）における前記第１の伸長産物（標識される第１の核酸分子）が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ａ、前記プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、前記３’－末端オーバーハング配列、任意選択で前記タグ配列Ｂの相補配列、及び前記コンセンサス配列Ｂの相補配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（２）（ｉｉ）（ａ）において、前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡがタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、前記タグ配列Ａが、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働き、
好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ａが前記タグ配列Ａの上流に位置し（例えば、前記プライマーＡの５’－末端に位置し）、
好ましくは、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来する前記ライゲーション産物が、異なるタグ配列ＡをＵＭＩとして有し、
好ましくは、ステップ（２）（ｉｉ）における前記第１の伸長産物（標識される第１の核酸分子）が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ａ、前記タグ配列Ａ、前記プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、前記３’－末端オーバーハング配列、任意選択で前記タグ配列Ｂの相補配列、及び前記コンセンサス配列Ｂの相補配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記プライマーＡが５’－末端に５’リン酸を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（３）の前に、ステップ（２）（ｉ）又はステップ（２）（ｉｉ）の生成物を処理してＲＮＡを除去するステップをさらに含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られた前記ライゲーション産物が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ｘ１、前記タグ配列Ｙ、前記コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第３の領域の相補配列、及び標識される前記第１の核酸分子配列の配列を含む、位置決めタグを有する前記第２の核酸分子としてとられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項12】
ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、前記伸長プライマーが前記プライマーＢ又はプライマーＢ’であり、前記プライマーＢ’が、前記コンセンサス配列Ｂの相補配列のすべて全体又は一部とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、好ましくは、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、前記伸長プライマーが前記プライマーＢ’である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）において、前記プライマーＡ’の捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、好ましくは、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、前記プライマーＢが、前記コンセンサス配列Ｂ、前記３’－末端オーバーハングの相補配列及び前記タグ配列Ｂを含み、
好ましくは、前記第１の伸長産物が、５’から３’に、前記プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ配列と相補的であるｃＤＮＡ配列、前記３’－末端オーバーハング配列、前記タグ配列Ｂの相補配列、前記コンセンサス配列Ｂの相補配列を含み、前記タグ配列Ｂの前記相補配列が、前記第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働き、
好ましくは、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、前記第２の伸長産物（標識される第１の核酸分子）が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ｂ又はその３’－末端部分配列、前記タグ配列Ｂ、前記３’－末端オーバーハング配列の相補配列、前記第１の伸長産物における前記ｃＤＮＡ配列の相補配列を含み、前記タグ配列Ｂが、前記第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
ステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）において、前記プライマーＡ’の前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡ’が、タグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列と、コンセンサス配列Ａとをさらに含み、
好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡ’の３’－末端に位置し、
好ましくは、前記コンセンサス配列Ａが前記捕捉配列Ａの上流に位置し（例えば、前記プライマーＡ’の５’－末端に位置し）、
好ましくは、前記プライマーＢが、コンセンサス配列Ｂ、前記３’－末端オーバーハングの相補配列及びタグ配列Ｂを含み、
好ましくは、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、前記第１の伸長産物が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ａ、任意選択で前記タグ配列Ａ、前記プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、前記３’－末端オーバーハング配列、前記タグ配列Ｂの相補配列及び前記コンセンサス配列Ｂの相補配列を含み、
好ましくは、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、前記第２の伸長産物（標識される第１の核酸分子）が、５’から３’に、前記コンセンサス配列Ｂ又はその３’－末端部分配列、前記タグ配列Ｂ、前記３’－末端オーバーハング配列の相補配列、前記第１の伸長産物における前記ｃＤＮＡ配列の相補配列、任意選択で前記タグ配列Ａの相補配列、及び前記コンセンサス配列Ａの相補配列を含み、
好ましくは、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来する前記ライゲーション産物が、異なるタグ配列ＢをＵＭＩとして有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項15】
伸長プライマーが５’－末端に５’リン酸を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）の前に、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）又はステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）の生成物を処理してＲＮＡを除去するステップをさらに含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、前記ｃＤＮＡ鎖が、その３’－末端オーバーハングを介して前記プライマーＢにアニーリングされ、前記ｃＤＮＡ鎖を、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で鋳型として前記プライマーＢを使用して伸長して、第１の伸長産物が生成される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記３’－末端オーバーハングが、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを有し、好ましくは、前記３’－末端オーバーハングが、２～５のシトシンヌクレオチドの３’－末端オーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（２）において、前記生体試料が前記前処理の前に透過処理される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記生体試料が組織試料であり、好ましくは、前記組織試料が組織切片であり、
好ましくは、前記組織切片が固定された組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織又は急速凍結組織から調製される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ステップ（２）において、前記逆転写が逆転写酵素を使用して実施され、好ましくは、前記逆転写酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有し、
好ましくは、前記逆転写酵素が、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用して、ｃＤＮＡ鎖を合成すること、及びオーバーハングを前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に付加することが可能であり、
好ましくは、前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを有するオーバーハングを付加することが可能であり、
好ましくは、前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に、２～５のシトシンヌクレオチドのオーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）を付加することが可能であり、
好ましくは、逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、並びに上記の逆転写酵素の逆転写活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
ステップ（２）及び（３）が、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法：（１）前記プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及び架橋オリゴヌクレオチドが各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなり、好ましくは、前記プライマーＡ及びプライマーＡ’が、伸長反応を開始することができる、
（２）前記プライマーＢが修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含み、好ましくは、前記プライマーＢが、３’－末端に１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む、
（３）前記タグ配列Ａ及びタグ配列Ｂが各々独立的に、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する、
（４）前記コンセンサス配列Ａ及びコンセンサス配列Ｂが各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（５）前記プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢが各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（６）前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域及び第２の領域が各々独立的に、３～１００ｎｔ（例えば、３～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（７）前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第３の領域が、０～１００ｎｔ（例えば、０～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（８）前記架橋オリゴヌクレオチドが、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（９）前記ポリ（Ｔ）配列が、少なくとも１０又は少なくとも２０（例えば、少なくとも３０）のデオキシチミジン残基を含む、
（１０）前記ランダムオリゴヌクレオチド配列が、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する。
【請求項23】
（４）第２の核酸分子集団を回収及び精製するステップをさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
得られた第２の核酸分子集団及び／又はその相補体が、トランスクリプトームライブラリーを構築するため又はトランスクリプトームシーケンシングのために使用される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
ステップ（１）における前記オリゴヌクレオチドプローブが、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法：（１）前記コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２が各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸）又はそれらの任意の組合せを含み、好ましくは、前記コンセンサス配列Ｘ２が３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）前記コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２が各々独立的に、２～１００ｎｔ（例えば、１０～２００ｎｔ、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ）の長さを有する、
（３）前記オリゴヌクレオチドプローブが各々独立的に、１５～２００ｎｔ（例えば、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する。
【請求項26】
前記オリゴヌクレオチドプローブがリンカーを介して前記固相支持体に結合しており、好ましくは、前記リンカーが活性化基と結合することが可能な連結基であり、前記固相支持体の表面が前記活性化基を用いて修飾されており、
好ましくは、前記リンカーが、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ又は－ＮＨＳを含み、
好ましくは、前記リンカーが－ＤＢＣＯであり、前記固相支持体の表面が、
【化1】
（アジド－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ＮＨＳエステル）を用いて修飾されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
ステップ（１）の前記核酸アレイが、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法：（１）同一固相支持体に結合した前記オリゴヌクレオチドプローブが、同一コンセンサス配列Ｘ１及び／又は同一コンセンサス配列Ｘ２を有する、
（２）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記コンセンサス配列Ｘ１が切断部位を含み、好ましくは、前記切断部位が、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択される方法によって切断又は破壊され得る。
【請求項28】
ステップ（１）の前記核酸アレイが、（１）複数の種類のキャリア配列を提供するステップであって、各種のキャリア配列が、前記キャリア配列の少なくとも１つのコピーを含み、前記キャリア配列が、５’から３’方向に、前記コンセンサス配列Ｘ２の相補配列、前記タグ配列Ｙの相補配列及び固定化配列を含み、各種のキャリア配列の前記タグ配列Ｙの前記相補配列が互いに異なっている、ステップ、
（２）前記複数の種類のキャリア配列を前記固相支持体（例えば、チップ）の表面に結合させるステップ、
（３）固定化プライマーを提供し、前記キャリア配列を鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物を生成して、前記オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、前記固定化プライマーが、前記コンセンサス配列Ｘ１の配列を含み、前記キャリア配列の前記固定化配列とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、好ましくは、前記伸長産物が、５’から３’方向に、前記コンセンサス配列Ｘ１、前記タグ配列Ｙ及び前記コンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなる、ステップ、
（４）前記固定化プライマーを前記固相支持体の表面と連結するステップであって、ステップ（３）及びステップ（４）が任意の順序で実施される、ステップ、
（５）任意選択で、前記キャリア配列の前記固定化配列が切断部位をさらに含み、前記切断が、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除及びＣＲＩＳＰＲ媒介性切除からなる群から選択され得、前記キャリア配列の前記固定化配列に含まれる前記切断部位で切断を実施して、前記キャリア配列を消化し、これによって、ステップ（３）における前記伸長産物が、前記伸長産物が生成される鋳型（すなわち、前記キャリア配列）から分離されるようにし、それによって、前記オリゴヌクレオチドプローブを前記固相支持体（例えば、チップ）の表面と連結するステップ、
を含むステップによって提供され、
好ましくは、各種のキャリア配列が、前記キャリア配列の複数のコピーのコンカテマーから形成されたＤＮＢであり、
好ましくは、前記複数の種類のキャリア配列が以下のステップ：
（ｉ）複数の種類のキャリア－鋳型配列を提供するステップであって、前記キャリア－鋳型配列が、キャリア配列の相補配列を含む、ステップ、
（ｉｉ）各種のキャリア－鋳型配列を鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種のキャリア－鋳型配列の増幅産物を得るステップであって、前記増幅産物が、前記キャリア配列の少なくとも１つのコピーを含み、好ましくは、ローリングサークル複製が実施されて、前記キャリア配列のコンカテマーから形成されたＤＮＢが得られる、ステップ
によりステップ（１）において提供される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
ステップ（１）における前記固相支持体が、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法：（１）前記固相支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、硝子表面、チップ、センサー、電極及びシリコンウエハーからなる群から選択され、好ましくは、前記固相支持体がチップである、
（２）前記固相支持体が、平面、球形又は多孔性である、
（３）前記固相支持体が、シーケンシングプラットフォーム、例えば、シーケンシングチップとして使用でき、好ましくは、前記固相支持体が、イルミナ、ＭＧＩ又はサーモフィッシャーシーケンシングプラットフォームのためのシーケンシングチップである、及び
（４）前記固相支持体が、自発的に、又は１つ若しくは複数の刺激への曝露（例えば、温度変化、ｐＨ変化、特定の化学物質若しくは相への曝露、光への曝露、還元剤への曝露等）により前記オリゴヌクレオチドプローブを放出可能である。
【請求項30】
核酸分子ライブラリーを構築する方法であって、（ａ）請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法によって、標識された核酸分子集団を生成するステップ、
（ｂ）前記標識された核酸分子集団における前記核酸分子を無作為に断片化し、アダプターを付加するステップ、並びに
（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）の産物を増幅及び／又は濃縮するステップ
を含み、それによって、核酸分子のライブラリーを得て、
好ましくは、前記核酸分子ライブラリーが、シーケンシング、例えば、トランスクリプトームシーケンシング、例えば、シングルセルトランスクリプトームシーケンシングのために使用される、方法。
【請求項31】
ステップ（ｂ）を実施する前に、ステップ（プレｂ）：前記標識された核酸分子集団を増幅及び／又は濃縮するステップをさらに含み、好ましくは、ステップ（プレｂ）において、前記標識された核酸分子集団が核酸増幅反応に供されて、増幅産物を生成し、
好ましくは、前記核酸増幅反応が、少なくともプライマーＣ及び／又はプライマーＤを使用して実施され、前記プライマーＣが、前記コンセンサス配列Ｘ１の相補配列又は前記コンセンサス配列Ｘ１の３’－末端配列の相補配列とハイブリダイズ又はアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、前記プライマーＤが、前記標識された核酸分子集団の前記核酸分子とハイブリダイズ又はアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、
好ましくは、ステップ（プレｂ）における前記核酸増幅反応が、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、鎖置換活性及び／又は高いフィデリティーを有するＤＮＡポリメラーゼ）を使用して実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ステップ（ｂ）において、前のステップにおいて得られた核酸分子が無作為に断片に断片化され、アダプターが、トランスポザーゼを使用して前記断片の両末端に付加され、好ましくは、前記トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＭｕＡトランスポザーゼ、スリーピングビューティートランスポザーゼ、マリナ－トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｙ１トランスポザーゼ及びＴｎ５５２トランスポザーゼ、並びに上記のトランスポザーゼの転移活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択され、
好ましくは、前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼであり、
好ましくは、ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）の生成物を増幅するために少なくともプライマーＣ’及び／又はプライマーＤ’が使用され、前記断片の両末端の前記アダプターが、それぞれ第１のアダプター及び第２のアダプターであり、前記プライマーＣ’が、前記第１のアダプターとハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、前記プライマーＤ’が、前記第２のアダプターとハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
核酸試料をシーケンシングする方法であって、（１）請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法によって核酸分子ライブラリーを構築するステップ、及び
（２）前記核酸分子ライブラリーをシーケンシングするステップ
を含む方法。
【請求項34】
（ｉ）核酸を標識するための核酸アレイであって、固相支持体を含み、前記固相支持体が複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブに結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つのコピーを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが、５’から３’方向に、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、各種のオリゴヌクレオチドプローブが異なるタグ配列Ｙを有し、前記タグ配列Ｙが、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの前記固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、核酸アレイ、
（ｉｉ）プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセットであって、
前記プライマーＡがコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、前記捕捉配列Ａが、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、好ましくは、前記コンセンサス配列Ａが前記捕捉配列Ａの上流に位置し（例えば、前記プライマーＡの５’－末端に位置し）、
前記プライマーＡ’が捕捉配列Ａを含み、前記捕捉配列Ａが、捕捉される前記ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、
前記プライマーＢが、コンセンサス配列Ｂと、３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、好ましくは、３’－末端オーバーハングの前記相補配列が前記プライマーＢの３’－末端に位置し、好ましくは、前記コンセンサス配列Ｂが３’－末端オーバーハングの前記相補配列の上流に位置し（例えば、前記プライマーＢの５’－末端に位置し）、前記３’－末端オーバーハングとは、前記プライマーＡ’の前記捕捉配列Ａによって捕捉された前記ＲＮＡを鋳型として使用する逆転写によって生成されたｃＤＮＡ鎖の３’－末端に含まれる１つ又は複数の鋳型とならないヌクレオチドを指す、プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセット、
並びに
（ｉｉｉ）第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、前記第１の領域と前記第２の領域の間に位置する第３の領域を含む、架橋オリゴヌクレオチドであって、前記第１の領域が前記第２の領域の上流に位置し（例えば、前記第２の領域の５’に位置し）、
前記第１の領域が、（ａ）前記プライマーＡの前記コンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリングすること、又は（ｂ）前記プライマーＢの前記コンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリング可能であり、
前記第２の領域が、前記コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である、架橋オリゴヌクレオチド
を含む、キット。
【請求項35】
（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ及び（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域が、前記プライマーＡの前記コンセンサス配列Ａの全体又は一部とアニーリング可能であり、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第２の領域が、前記コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能であり、好ましくは、前記プライマーＡの前記捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記プライマーＡの前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡがタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ａが前記タグ配列Ａの上流に位置し（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置し）、
好ましくは、前記プライマーＡが５’－末端に５’リン酸を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット並びに（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域が、前記プライマーＢの前記コンセンサス配列Ｂの全体又は一部とアニーリング可能であり、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第２の領域が、前記コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能であり、好ましくは、前記プライマーＡ’の前記捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記プライマーＡ’の前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡ’が、タグ配列Ａ及びコンセンサス配列Ａをさらに含み、好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡ’の３’－末端に位置し、好ましくは、前記コンセンサス配列Ａが前記捕捉配列Ａの上流に位置し（例えば、前記プライマーＡ’の５’－末端に位置し）、
好ましくは、前記プライマーＢが、コンセンサス配列Ｂ、３’－末端オーバーハングの相補配列及びタグ配列Ｂを含み、
好ましくは、前記キットがプライマーＢ’をさらに含み、前記プライマーＢ’が、前記コンセンサス配列Ｂの相補配列の全体又は一部とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、
好ましくは、前記プライマーＢ又はプライマーＢ’が、５’－末端に５’リン酸を含み、
好ましくは、前記プライマーＢが修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含み、好ましくは、前記プライマーＢが、３’－末端に１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項37】
（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマー並びに（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第１の領域が、前記プライマーＡの前記コンセンサス配列Ａの全体又は一部とアニーリング可能であり、前記架橋オリゴヌクレオチドの前記第２の領域が、前記コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能であり、好ましくは、前記プライマーＡの前記捕捉配列Ａがランダムオリゴヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記プライマーＡの前記捕捉配列Ａが、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸の特異的配列であり、好ましくは、前記プライマーＡがタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記捕捉配列Ａが前記プライマーＡの３’－末端に位置し、前記コンセンサス配列Ａが前記タグ配列Ａの上流に位置し（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置し）、
好ましくは、前記プライマーＡが５’－末端に５’リン酸を含み、
好ましくは、前記プライマーＢが修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含み、好ましくは、前記プライマーＢが、３’－末端に１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項38】
以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のキット：（１）前記オリゴヌクレオチドプローブ、プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ、プライマーＢ’及び架橋オリゴヌクレオチドが各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなり、好ましくは、前記プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢ’が、伸長反応を開始することが可能であり、好ましくは、前記コンセンサス配列Ｘ２が３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）前記オリゴヌクレオチドプローブが各々独立的に、１５～３００ｎｔ（例えば、１５～２００ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（３）前記プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及びプライマーＢ’が各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（４）前記架橋オリゴヌクレオチドが、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（５）同一固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドプローブが、同一コンセンサス配列Ｘ１及び／又は同一コンセンサス配列Ｘ２を有する、
（６）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記コンセンサス配列Ｘ１が切断部位を含み、好ましくは、前記切断部位が、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択される方法によって切断又は破壊され得る。
【請求項39】
逆転写酵素、核酸リガーゼ、核酸ポリメラーゼ及び／又はトランスポザーゼをさらに含み、好ましくは、前記逆転写酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有し、好ましくは、前記逆転写酵素が、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖を合成すること及び３’－末端オーバーハングを前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に付加することが可能であり、好ましくは、前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを有するオーバーハングを付加することが可能であり、好ましくは、前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に、２～５のシトシンヌクレオチドのオーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）を付加することが可能であり、好ましくは、前記逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、並びに上記の逆転写酵素の逆転写活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択され、
好ましくは、前記核酸ポリメラーゼが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さず、
好ましくは、前記トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＭｕＡトランスポザーゼ、スリーピングビューティートランスポザーゼ、マリナ－トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｙ１トランスポザーゼ、Ｔｎ５５２トランスポザーゼ、並びに上記のトランスポザーゼの転移活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される、請求項３４～３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項40】
核酸ハイブリダイゼーションのための試薬、核酸伸長のための試薬、核酸増幅のための試薬及び核酸を回収又は精製するための試薬、トランスクリプトームシーケンシングライブラリーを構築するための試薬、シーケンシング（例えば、第２又は第３世代シーケンシング）のための試薬又はそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項41】
核酸分子ライブラリーを構築するための、又はトランスクリプトームシーケンシングを実施するための、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法又は請求項３４～４０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、トランスクリプトームシーケンシング及び生体分子空間的情報検出の技術分野に関する。詳細に言えば、本出願は、核酸分子を位置的に標識する方法及びトランスクリプトームシーケンシングのための核酸分子ライブラリーを構築する方法に関する。さらに、本出願はまた、本方法によって構築された核酸分子ライブラリー及び本方法を実行するためのキットにも関する。
【背景技術】
【0002】
組織の細胞の空間的位置は、その機能に大きく影響を及ぼす。この空間的不均一性を調査するために、細胞のゲノム又はトランスクリプトームを、空間座標の知識を用いて定量及び分析することが必要である。しかし、ゲノム又はトランスクリプトーム分析のために小さい組織領域又はさらには単細胞を収集することは、極めて骨の折れ、費用がかかり、精度が低い。したがって、単細胞レベルで、又はさらに細胞内レベルでの生体分子の空間情報（例えば、核酸の局在性、分布及び／又は発現）の高処理量検出を達成できる方法を開発する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【0003】
【図1】図１は、本出願において核酸分子を捕捉及び標識するために使用されるチップの例示的構造を示し、チップ及びチップに結合したオリゴヌクレオチドプローブ（チップ配列とも呼ばれる）を含む図である。各種のオリゴヌクレオチドプローブは、チップのその位置に対応するタグ配列Ｙを含み、各種のオリゴヌクレオチドプローブがチップに結合する領域は、マイクロドットと呼ばれ得る。各種のオリゴヌクレオチドプローブは、単一コピーを含む場合も複数のコピーを含む場合もある。
【図2】図２は、試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖を調製するための例示的スキーム並びにｃＤＮＡ鎖の例示的構造を示す図である。ＣＡ：コンセンサス配列Ａ、ＣＢ：コンセンサス配列Ｂ。
【図3】図３は、ｃＤＮＡ鎖の５’－末端をチップ配列を用いて標識すること（すなわち、ｃＤＮＡ鎖の５’－末端をチップ配列の３’－末端にライゲートすること）によって、チップ配列の情報を含む新規核酸分子（すなわち、チップ配列によって標識された核酸分子）を生成するための例示的スキーム並びにチップ配列情報を含む新規核酸分子の例示的構造を示す図である。ＣＡ：コンセンサス配列Ａ、ＣＢ：コンセンサス配列Ｂ、Ｘ１：コンセンサス配列Ｘ１、Ｙ：タグ配列Ｙ、Ｘ２：コンセンサス配列Ｘ２。
【図4】図４は、試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖の相補鎖を調製するための例示的スキームを及びｃＤＮＡ鎖の相補鎖の例示的構造を示す図である。ＣＡ：コンセンサス配列Ａ、ＣＢ：コンセンサス配列Ｂ、ＥＰ：伸長プライマー。
【発明を実施するための形態】
【0004】
本出願は、標識された核酸分子集団を生成する新規方法並びにこの方法に基づいて核酸分子ライブラリーを構築する、及び高処理量シーケンシングを実施する方法を提供する。
【0005】
標識された核酸分子の集団を生成する方法
【0006】
一態様では、本出願は、標識された核酸分子集団を生成する方法であって、以下の
（１）生体試料及び核酸アレイを提供するステップであって、核酸アレイは、固相支持体を含み、固相支持体は、複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのコピーを含み、オリゴヌクレオチドプローブは、５’から３’方向にコンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、
各種のオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、タグ配列Ｙは、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、ステップ、
（２）生体試料を核酸アレイと接触させて、これによって生体試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の位置が、核酸アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブの位置にマッピングされるようにし、生体試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を前処理して、第１の核酸分子集団を生成するステップであって、前処理が、
（ｉ）プライマーＡを使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、標識される第１の核酸分子として伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップであって、プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉ）（ａ）プライマーＡを使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、ｃＤＮＡ鎖は、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に（例えば、プライマーＡの５’－末端に）位置する、ステップ、（ｂ）プライマーＩ－Ｂを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第１の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップであって、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂと、３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ｂは３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置する（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉｉ）（ａ）プライマーＡ’を使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施し、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、ｃＤＮＡ鎖は、プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、プライマーＡ’は捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である、ステップ、（ｂ）プライマーＢを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、第１の伸長産物を生成するステップであって、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂと、３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ｂが３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置する（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、並びに（ｃ）伸長プライマーを提供し、鋳型として第１の伸長産物を使用して伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第２の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップ
を含む、ステップ、
（３）アニーリングを可能にする条件下で、架橋オリゴヌクレオチドを、ステップ（２）の生成物と接触させ、架橋オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプローブに対応する位置にある標識される第１の核酸分子とアニーリング（例えば、インサイツアニーリング）させ、かつ架橋オリゴヌクレオチドとアニーリングした第１の核酸分子及びアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得、それによって第２の核酸分子集団を生成するステップ
を含む方法を提供し、
架橋オリゴヌクレオチドは、第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、第１の領域と第２の領域の間に位置する第３の領域を含み、第１の領域は第２の領域の上流に位置し（例えば、第２の領域の５’に位置し）、
第１の領域は、ステップ（２）（ｉ）若しくはステップ（２）（ｉｉ）におけるプライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリング可能であるか、又はステップ（２）（ｉｉｉ）におけるプライマーＢのコンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリング可能であり、
第２の領域は、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である。
（１）生体試料及び核酸アレイを提供するステップであって、核酸アレイは、固相支持体を含み、固相支持体は、複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのコピーを含み、オリゴヌクレオチドプローブは、５’から３’方向にコンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、
各種のオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、タグ配列Ｙは、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、ステップ、
（２）生体試料を核酸アレイと接触させて、これによって生体試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の位置が、核酸アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブの位置にマッピングされるようにし、生体試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を前処理して、第１の核酸分子集団を生成するステップであって、前処理が、
（ｉ）プライマーＡを使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、標識される第１の核酸分子として伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップであって、プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉ）（ａ）プライマーＡを使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施して、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、ｃＤＮＡ鎖は、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に（例えば、プライマーＡの５’－末端に）位置する、ステップ、（ｂ）プライマーＩ－Ｂを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第１の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップであって、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂと、３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ｂは３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置する（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、
又は
（ｉｉｉ）（ａ）プライマーＡ’を使用して、生体試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の逆転写を実施し、ｃＤＮＡ鎖を生成するステップであって、ｃＤＮＡ鎖は、プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的であるｃＤＮＡ配列と、３’－末端オーバーハングとを含み、プライマーＡ’は捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である、ステップ、（ｂ）プライマーＢを、（ａ）において生成されたｃＤＮＡ鎖とアニーリングし、伸長反応を実施して、第１の伸長産物を生成するステップであって、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂと、３’－末端オーバーハングの相補配列と、任意選択でタグ配列Ｂとを含み、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ｂが３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置する（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置する）、ステップ、並びに（ｃ）伸長プライマーを提供し、鋳型として第１の伸長産物を使用して伸長反応を実施して、標識される第１の核酸分子として第２の伸長産物を生成し、それによって第１の核酸分子集団を生成するステップ
を含む、ステップ、
（３）アニーリングを可能にする条件下で、架橋オリゴヌクレオチドを、ステップ（２）の生成物と接触させ、架橋オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプローブに対応する位置にある標識される第１の核酸分子とアニーリング（例えば、インサイツアニーリング）させ、かつ架橋オリゴヌクレオチドとアニーリングした第１の核酸分子及びアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得、それによって第２の核酸分子集団を生成するステップ
を含む方法を提供し、
架橋オリゴヌクレオチドは、第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、第１の領域と第２の領域の間に位置する第３の領域を含み、第１の領域は第２の領域の上流に位置し（例えば、第２の領域の５’に位置し）、
第１の領域は、ステップ（２）（ｉ）若しくはステップ（２）（ｉｉ）におけるプライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリング可能であるか、又はステップ（２）（ｉｉｉ）におけるプライマーＢのコンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリング可能であり、
第２の領域は、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である。
【0007】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（３）において、架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域及び第２の領域が直接隣接している場合には、第１の核酸分子のオリゴヌクレオチドプローブへのライゲーションは、核酸リガーゼを使用して、同一架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域とハイブリダイズされた核酸分子及び第２の領域とハイブリダイズされた核酸分子をライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得ることを含み、又は
架橋オリゴヌクレオチドが、第１の領域、第２の領域及びそれらの間に位置する第３の領域を含む場合には、第１の核酸分子のオリゴヌクレオチドプローブへのライゲーションは、核酸ポリメラーゼを使用して、第３の領域を鋳型として重合反応を実施すること、並びに核酸リガーゼを使用して、同一架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域にハイブリダイズされた核酸分子と、第３の領域及び第２の領域にハイブリダイズされた核酸分子とをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得ることを含む。ある特定の実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない。
架橋オリゴヌクレオチドが、第１の領域、第２の領域及びそれらの間に位置する第３の領域を含む場合には、第１の核酸分子のオリゴヌクレオチドプローブへのライゲーションは、核酸ポリメラーゼを使用して、第３の領域を鋳型として重合反応を実施すること、並びに核酸リガーゼを使用して、同一架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域にハイブリダイズされた核酸分子と、第３の領域及び第２の領域にハイブリダイズされた核酸分子とをライゲートして、位置決めタグを有する第２の核酸分子としてライゲーション産物を得ることを含む。ある特定の実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない。
【0008】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブは、１コピーを含む。
【0009】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブは、複数のコピーを含む。
【0010】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブが固相支持体に結合する領域は、マイクロドットと呼ばれる。各種のオリゴヌクレオチドプローブが、１コピーを含む場合には、各マイクロドットは１つのオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、異なるマイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、各種のオリゴヌクレオチドプローブが複数のコピーを含む場合には、各マイクロドットは複数のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、同一マイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは同一タグ配列Ｙを有し、異なるマイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有することを理解することは容易である。
【0011】
ある特定の実施形態では、固相支持体は複数のマイクロドットを含み、各マイクロドットは１種のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは１つ又は複数のコピーを含み得る。
【0012】
ある特定の実施形態では、固相支持体は複数の（例えば、少なくとも１０個、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個又はそれより多い）マイクロドットを含み、ある特定の実施形態では、固相支持体は、少なくとも１０４個（例えば、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個、少なくとも１０１０個、少なくとも１０１１個又は少なくとも１０１２個）のマイクロドット／ｍｍ２を含む。
【0013】
一部の実施形態では、隣接するマイクロドット間の間隔は、１００μｍ未満、５０μｍ未満、１０μｍ未満、５ｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．１μｍ未満、０．０５μｍ未満又は０．０１μｍ未満である。
【0014】
ある特定の実施形態では、マイクロドットは、１００μｍ未満、５０μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．１μｍ未満、０．０５μｍ未満又は０．０１μｍ未満のサイズ（例えば、相当直径）である。
【0015】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉ）及びステップ（３）を含む実施形態
【0016】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（１）、ステップ（２）（ｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られたライゲーション産物は、５’から３’に、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ、コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で架橋オリゴヌクレオチドの第３の領域の相補配列、及び標識される第１の核酸分子の配列を含む位置決めタグを有する第２の核酸分子としてとられる。
【0017】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉ）において、捕捉配列Ａはランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0018】
一部の実施形態では、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来するライゲーション産物は異なる捕捉配列Ａを有し、捕捉配列Ａは、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0019】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉ）における伸長産物（標識される第１の核酸分子）は、５’から３’に、コンセンサス配列Ａ、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列を含む。
【0020】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉ）において、捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とする特異的配列である。
【0021】
ある特定の実施形態では、プライマーＡはタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、タグ配列Ａは、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0022】
ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ａはタグ配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）。
【0023】
ある特定の実施形態では、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来するライゲーション産物は、異なるタグ配列ＡをＵＭＩとして有する。
【0024】
一部の実施形態では、ステップ（２）（ｉ）に記載の伸長産物は、５’から３’に、コンセンサス配列Ａと、タグ配列Ａと、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡ配列とを含む。
【0025】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉ）及びステップ（３）を含む実施形態
【0026】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られたライゲーション産物は、５’から３’に、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ、コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で架橋オリゴヌクレオチドの第３の領域の相補配列、及び標識される第１の核酸分子の配列を含む位置決めタグを有する第２の核酸分子としてとられる。
【0027】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉｉ）（ａ）において、捕捉配列Ａはランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0028】
一部の実施形態では、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来するライゲーション産物は異なる捕捉配列Ａを有し、捕捉配列Ａは、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0029】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉ）における第１の伸長産物（標識される第１の核酸分子）は、５’から３’に、コンセンサス配列Ａ、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、３’－末端オーバーハング配列、任意選択でタグ配列Ｂの相補配列、及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含む。
【0030】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉ）（ａ）において、捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とする特異的配列である。
【0031】
ある特定の実施形態では、プライマーＡはタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、タグ配列Ａは、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0032】
ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ａはタグ配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）。
【0033】
ある特定の実施形態では、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来するライゲーション産物は、異なるタグ配列ＡをＵＭＩとして有する。
【0034】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉ）における第１の伸長産物（標識される第１の核酸分子）は、５’から３’に、コンセンサス配列Ａ、タグ配列Ａ、プライマーＡによってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、３’－末端オーバーハング配列、任意選択でタグ配列Ｂの相補配列、及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含む。
【0035】
ある特定の実施形態では、方法において、プライマーＡは５’－末端に５’リン酸を含む。
【0036】
ある特定の実施形態では、ステップ（３）の前に、方法は、ステップ（２）（ｉ）又はステップ（２）（ｉｉ）の生成物を処理してＲＮＡを除去するステップ（例えば、熱処理するステップ）をさらに含む。
【0037】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉ）及びステップ（３）を含む本出願の例示的実施形態は、以下のとおりに詳細に記載される：
【0038】
１．試料のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖を調製する例示的実施形態は、（図２に示されるように）以下のステップを含む：
【0039】
（１）逆転写酵素（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素）及びプライマーＡを使用して、透過処理された組織試料のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）を逆転写し、ｃＤＮＡを生成し、オーバーハング（例えば、３つのシトシンヌクレオチドを含むオーバーハング）をｃＤＮＡの３’－末端に付加する。逆転写反応を実施するために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する種々の逆転写酵素が使用され得る。ある特定の好ましい実施形態では、使用される逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性を有さない。
を含む。
を含む。
【0040】
プライマーＡは、ポリ（Ｔ）配列及びコンセンサス配列Ａ（図でＣＡとして記されている）を含む。ある特定の実施形態では（例えば、方法が、３’トランスクリプトームライブラリーを構築するために使用される場合）、プライマーＡは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。普通、ポリ（Ｔ）配列は、プライマーＡの３’－末端に位置して、逆転写を開始する。好ましい実施形態では、ＵＭＩ配列は、ポリ（Ｔ）配列の上流（例えば、５’）に位置し、コンセンサス配列Ａは、ＵＭＩ配列の上流（例えば、５’）に位置する。
【0041】
（２）鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ、プライマーＢとして使用できる、コンセンサス配列Ｂ（図中、ＣＢと記される）を含む）を使用して、ｃＤＮＡ鎖とアニーリングするか、又はハイブリダイズし、その後、ＴＳＯとハイブリダイズされたか、又はアニーリングされた核酸断片を、核酸ポリメラーゼの存在下でコンセンサス配列Ｂを鋳型として使用して伸長し、その結果、コンセンサス配列Ｂの相補配列をｃＤＮＡ鎖の３’－末端に付加し、それによって、５’－末端にコンセンサス配列Ａ及びタグ配列Ａを保持する、並びに３’－末端にコンセンサス配列Ｂの相補配列を保持する核酸分子が生成される。
【0042】
ＴＳＯ配列は、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端オーバーハングと相補的である配列を含み得る。例えば、ｃＤＮＡ鎖が、３つのシトシンヌクレオチドのオーバーハングを３’－末端に含む場合には、鋳型スイッチオリゴは、その３’－末端にＧＧＧを含み得る。さらに、ＴＳＯ配列のヌクレオチドはまた、ＴＳＯ配列とｃＤＮＡ鎖の３’－末端オーバーハングの間の相補的対形成のための結合親和性を増強するように修飾され得る（例えば、ＴＳＯ配列は、ロックド核酸を含むように修飾され得る）。
【0043】
何らかの理論によって制限されるものではないが、ＴＳＯの配列又はその部分配列を鋳型として使用して、ハイブリダイズされたか、又はアニーリングされた核酸断片（逆転写産物）を伸長できる限り、種々の適した核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）を使用して、伸長反応を実施できる。ある特定の例示的実施形態では、ハイブリダイズされたか、又はアニーリングされた核酸断片（逆転写産物）は、前記の逆転写ステップにおいて使用された同一逆転写酵素を使用して伸長され得る。
【0044】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップ（２）及びステップ（１）は、同時に実施される。
【0045】
ある特定の実施形態では、方法は、任意選択で、ステップ（３）：ＲＮアーゼＨを添加して、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化して、ｃＤＮＡ一本鎖を形成するステップをさらに含む。
【0046】
ある特定の好ましい実施形態では、方法は、ステップ（３）を含まない。
【0047】
上記の例示的実施形態によって調製されたｃＤＮＡ鎖の例示的構造は、コンセンサス配列Ａ、ＵＭＩ配列、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の配列と相補的である配列及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含む。
【0048】
２．ｃＤＮＡ鎖の５’－末端がオリゴヌクレオチドプローブで標識されて（チップ配列とも呼ばれる）（すなわち、ｃＤＮＡ鎖の５’－末端を、チップ配列の３’－末端にライゲートして）、チップ配列情報を有する新規核酸分子（すなわち、チップ配列を用いて標識された核酸）を形成する例示的実施形態は、以下のステップ（図３に示される）を含む：
５’－末端に、ｃＤＮＡ配列の５’－末端と少なくとも部分的に相補的である（例えば、コンセンサス配列Ａ（ＣＡ）と少なくとも部分的に相補的である）配列（第１の領域、Ｐ１）を含み、３’－末端に、チップ配列の３’－末端と少なくとも部分的に相補的である（例えば、コンセンサス配列Ｘ２と少なくとも部分的に相補的である）配列（第２の領域、Ｐ２）を含む、架橋オリゴヌクレオチドを提供するステップ。
５’－末端に、ｃＤＮＡ配列の５’－末端と少なくとも部分的に相補的である（例えば、コンセンサス配列Ａ（ＣＡ）と少なくとも部分的に相補的である）配列（第１の領域、Ｐ１）を含み、３’－末端に、チップ配列の３’－末端と少なくとも部分的に相補的である（例えば、コンセンサス配列Ｘ２と少なくとも部分的に相補的である）配列（第２の領域、Ｐ２）を含む、架橋オリゴヌクレオチドを提供するステップ。
【0049】
ある特定の好ましい実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドのＰ１及びＰ２配列は、直接隣接しており、それらの間に中間ヌクレオチドはない。
【0050】
ある特定の好ましい実施形態では、Ｐ１配列、Ｐ２配列、コンセンサス配列Ａ及びコンセンサス配列Ｘ２は各々独立的に、２０～１００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ）の長さを有する。架橋オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブ及びｃＤＮＡ鎖とアニーリングされるか、又はハイブリダイズされ、次いで、ｃＤＮＡ鎖の５’－末端が、ＤＮＡリガーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼによってオリゴヌクレオチドプローブの３’－末端にライゲートされ、それによって、オリゴヌクレオチドプローブの配列情報を含む新規核酸分子（すなわち、オリゴヌクレオチドプローブで標識された核酸分子）が生成される。ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない。
【0051】
上記の例示的実施形態によって形成されるようなチップ配列情報を含む新規核酸分子の例示的構造は、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ、コンセンサス配列Ｘ２、コンセンサス配列Ａ、ＵＭＩ配列、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列の相補配列及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含む。
【0052】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉｉ）及びステップ（３）を含む実施形態
【0053】
一部の実施形態では、方法は、ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉｉ）及びステップ（３）を含み、ステップ（３）において得られたライゲーション産物は、５’から３’に、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ、コンセンサス配列Ｘ２、任意選択で架橋オリゴヌクレオチドの第３の領域の相補配列、及び標識される第１の核酸分子の配列を含む位置決めタグを有する第２の核酸分子としてとられる。
【0054】
一部の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、伸長プライマーはプライマーＢ又はプライマーＢ’であり、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂの相補配列の全体又は一部とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能である。
【0055】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、伸長プライマーはプライマーＢ’である。
【0056】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）において、プライマーＡ’の捕捉配列Ａはランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0057】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ、３’末端オーバーハングの相補配列及びタグ配列Ｂを含む。
【0058】
一部の実施形態では、第１の伸長産物は、５’から３’に、プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡ配列と相補的であるｃＤＮＡ配列、３’－末端オーバーハング配列、タグ配列Ｂの相補配列及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含み、タグ配列Ｂの相補配列は、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0059】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、第２の伸長産物（標識される第１の核酸分子）は、第１の伸長産物に５’から３’に、コンセンサス配列Ｂ又はその３’－末端部分配列、タグ配列Ｂ、３’－末端オーバーハング配列の相補配列及びｃＤＮＡ配列の相補配列を含み、タグ配列Ｂは、第２の核酸分子の固有の分子識別子（ＵＭＩ）として働く。
【0060】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）において、プライマーＡ’の捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とする特異的配列である。
【0061】
ある特定の実施形態では、プライマーＡ’は、タグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列と、コンセンサス配列Ａとをさらに含む。
【0062】
ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡ’の３’－末端に位置する。
【0063】
ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡ’の５’－末端に）。
【0064】
ある特定の実施形態では、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ、３’－末端オーバーハングの相補配列及びタグ配列Ｂを含む。
【0065】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、第１の伸長産物は、５’から３’に、コンセンサス配列Ａ、任意選択でタグ配列Ａ、プライマーＡ’によってプライムされた逆転写によって生成され、ＲＮＡと相補的であるｃＤＮＡ配列、３’－末端オーバーハング配列、タグ配列Ｂの相補配列及びコンセンサス配列Ｂの相補配列を含む。
【0066】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）において、第２の伸長産物（標識される第１の核酸分子）は、５’から３’に、コンセンサス配列Ｂ又はその３’末端部分配列、タグ配列Ｂ、３’－末端オーバーハング配列の相補配列、第１の伸長産物におけるｃＤＮＡ配列の相補配列及び任意選択で、タグ配列Ａの相補配列及びコンセンサス配列Ａの相補配列を含む。
【0067】
ある特定の実施形態では、ステップ（３）において、同一種のオリゴヌクレオチドプローブの各コピーに由来するライゲーション産物は、異なるタグ配列ＢをＵＭＩとして有する。
【0068】
ある特定の実施形態では、伸長プライマーは５’－末端に５’リン酸を含む。
【0069】
ある特定の実施形態では、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ｃ）の前に、方法は、ステップ（２）（ｉｉｉ）（ａ）又はステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）の生成物を処理してＲＮＡを除去するステップ（例えば、熱処理するステップ）をさらに含む。
【0070】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）（ｉｉｉ）（ｂ）において、ｃＤＮＡ鎖が、その３’－末端オーバーハングを介してプライマーＢアニーリングされ、ｃＤＮＡ鎖が、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で鋳型としてプライマーＢを使用して伸長されて、第１の伸長産物が生成される。
【0071】
ステップ（１）、ステップ（２）（ｉｉｉ）及びステップ（３）を含む本出願の例示的実施形態は、以下のように詳細に記載される：
【0072】
１．試料中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖の相補鎖を調製する例示的実施形態は、（図４に示されるように）以下のステップ含む：
【0073】
（１）透過処理された試料のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の逆転写を実施するために、逆転写酵素（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素）及びプライマーＡ’を使用してｃＤＮＡが生成され、オーバーハング（例えば、３つのシトシンヌクレオチドを含むオーバーハング）がｃＤＮＡの３’－末端に付加される。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する種々の逆転写酵素が使用されて逆転写反応を実施し得る。ある特定の好ましい実施形態では、使用される逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性を有さない。
【0074】
逆転写プライマーＡ’は、ポリ（Ｔ）配列及びコンセンサス配列Ａ（ＣＡ）を含む。普通、ポリ（Ｔ）配列は、プライマーＡの３’－末端に位置して、逆転写を開始する。
【0075】
（２）プライマーＢが、ｃＤＮＡ鎖とアニーリングされるか、又はハイブリダイズされ、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ（ＣＢ）及びｃＤＮＡの３’－末端オーバーハングの相補配列を含む。ある特定の実施形態では（例えば、方法が、５’トランスクリプトームライブラリーを構築するために使用される場合）、プライマーＢは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。その後、プライマーＢとハイブリダイズされたか、又はアニーリングされた核酸断片が、コンセンサス配列Ｂ及びＵＭＩ配列を鋳型として使用して核酸ポリメラーゼの存在下で伸長されて、その結果、コンセンサス配列Ｂの相補配列及びＵＭＩ配列の相補配列がｃＤＮＡ鎖の３’－末端に付加され、それによって、５’－末端にコンセンサス配列Ａを保持し、３’－末端にコンセンサス配列Ｂの相補配列及びＵＭＩ分子の相補配列を保持する核酸分子が生成され得る。
【0076】
ｃＤＮＡ鎖が、３’－末端に３つのシトシンヌクレオチドのオーバーハングを含む場合に、プライマーＢは、その３’－末端にＧＧＧを含み得る。さらに、プライマーＢのヌクレオチドはまた、プライマーＢとｃＤＮＡ鎖の３’－末端オーバーハングの間の相補的対形成のための結合親和性を増強するように修飾され得る（例えば、プライマーＢは、ロックド核酸を含むように修飾され得る）。
【0077】
理論によって制限されるものではないが、プライマーＢの配列又は部分配列を鋳型として使用して、アニーリングされたか、又はハイブリダイズされた核酸断片（逆転写産物）を伸長できる限り、種々の適した核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）を使用して、伸長反応を実施できる。ある特定の例示的実施形態では、アニーリングされたか、又はハイブリダイズされた核酸断片（逆転写産物）は、前記の逆転写ステップにおいて使用された同一逆転写酵素を使用して伸長され得る。
【0078】
ある特定の好ましい実施形態では、ステップ（２）及びステップ（１）は、同時に実施される。
【0079】
ある特定の実施形態では、方法は、任意選択で、ステップ（３）：ＲＮアーゼＨを添加して、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化して、ｃＤＮＡ一本鎖を形成するステップをさらに含む。
【0080】
ある特定の好ましい実施形態では、方法は、ステップ（３）を含まない。
【0081】
（４）伸長プライマーを使用して、（３）において得られたｃＤＮＡ一本鎖を鋳型として使用して伸長反応を実施して伸長産物を得、伸長プライマーは、コンセンサス配列Ｂの相補配列の全体又は一部とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能である。
【0082】
ある特定の実施形態では、伸長プライマーは、鋳型スイッチオリゴと同一である。
【0083】
上記の例示的実施形態によって調製されたｃＤＮＡ鎖の相補鎖を含む例示的構造は、コンセンサス配列Ｂ、ＵＭＩ配列、ｃＤＮＡ３’－末端オーバーハング配列の相補配列、ｃＤＮＡ配列の相補配列、コンセンサス配列Ａの相補配列を含む。
【0084】
２．ｃＤＮＡ鎖の相補鎖の５’－末端を標識するためにオリゴヌクレオチドプローブ（チップ配列とも呼ばれる）を使用して（すなわち、ｃＤＮＡ鎖の相補鎖の５’－末端が、チップ配列の３’－末端とライゲートされる）、チップ配列の情報を含む新規核酸分子（すなわち、チップ配列で標識された核酸分子）を生成する例示的実施形態は、（図５に示されるように）以下のステップを含む：
５’－末端に、コンセンサス配列Ｂ（ＣＢ）と少なくとも部分的に相補的である配列（第１の領域、Ｐ１）を含み、３’－末端に、コンセンサス配列Ｘ２と少なくとも部分的に相補的である配列（第２の領域、Ｐ２）を含む架橋オリゴヌクレオチドを提供するステップ。
５’－末端に、コンセンサス配列Ｂ（ＣＢ）と少なくとも部分的に相補的である配列（第１の領域、Ｐ１）を含み、３’－末端に、コンセンサス配列Ｘ２と少なくとも部分的に相補的である配列（第２の領域、Ｐ２）を含む架橋オリゴヌクレオチドを提供するステップ。
【0085】
ある特定の好ましい実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドのＰ１及びＰ２配列は、直接隣接しており、それらの間に中間ヌクレオチドはない。
【0086】
ある特定の好ましい実施形態では、Ｐ１配列及びＰ２配列は各々独立的に、２０～１００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ）の長さを有する。
【0087】
架橋オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブ及びｃＤＮＡ鎖の相補鎖とアニーリングされるか、又はハイブリダイズされ、次いで、ｃＤＮＡ鎖の相補鎖の５’－末端がチップ配列の３’－末端にＤＮＡリガーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼによってライゲートされて、オリゴヌクレオチドプローブの配列情報を含む新規核酸分子を形成する（すなわち、オリゴヌクレオチドプローブで標識された核酸分子）。ある特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない。
【0088】
上記の例示的実施形態によって形成されるチップ配列情報を含む新規核酸分子の例示的構造は、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ、コンセンサス配列Ｘ２、コンセンサス配列Ｂ、ＵＭＩ配列、ｃＤＮＡ配列の相補配列及びコンセンサス配列Ａの相補配列を含む。
【0089】
ある特定の実施形態では、３’－末端オーバーハングは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、３’－末端オーバーハングは、２～５のシトシンヌクレオチドの３’－末端オーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）である。
【0090】
一部の実施形態では、方法のステップ（２）において、生体試料は、前処理の前に透過処理される。
【0091】
ある特定の実施形態では、生体試料は組織試料である。
【0092】
ある特定の実施形態では、組織試料は組織切片である。
【0093】
ある特定の実施形態では、組織切片は固定された組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織又は急速凍結組織から調製される。
【0094】
ある特定の実施形態では、生体試料が、核酸アレイと接触される場合には、生体試料の各細胞は、核酸アレイの１つ又は複数のマイクロドットを個々に占有する（すなわち、各細胞は、核酸アレイの１つ又は複数のマイクロドットと個々に接触される）。
【0095】
一部の実施形態では、ステップ（２）において、逆転写酵素を使用することによって逆転写が実施される。
【0096】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する。
【0097】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖を合成すること及びｃＤＮＡ鎖の３’－末端にオーバーハングを付加することが可能である。
【0098】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さのオーバーハングを付加することが可能である。
【0099】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に２～５のシトシンヌクレオチドのオーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）を付加することが可能である。
【0100】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、並びに上記の逆転写酵素の逆転写活性を有するそのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される。
【0101】
ある特定の実施形態では、方法のステップ（２）及び（３）は、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する：
（１）プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及び架橋オリゴヌクレオチドは各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド若しくはそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなる。ある特定の実施形態では、プライマーＡ及びプライマーＡ’は、伸長反応を開始することが可能である、
（２）プライマーＢは修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む。ある特定の実施形態では、プライマーＢは、その３’－末端に、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む、
（３）タグ配列Ａ及びタグ配列Ｂは各々独立的に、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する、
（４）コンセンサス配列Ａ及びコンセンサス配列Ｂは各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（５）プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢは各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（６）架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域及び第２の領域は各々独立的に、３～１００ｎｔ（例えば、３～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（７）架橋オリゴヌクレオチドの第３の領域は、０～１００ｎｔ（例えば、０～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（８）架橋オリゴヌクレオチドは、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（９）ポリ（Ｔ）配列は、少なくとも１０又は少なくとも２０（例えば、少なくとも３０）デオキシチミジン残基を含む、
（１０）ランダムオリゴヌクレオチド配列は、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する。
（１）プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及び架橋オリゴヌクレオチドは各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド若しくはそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなる。ある特定の実施形態では、プライマーＡ及びプライマーＡ’は、伸長反応を開始することが可能である、
（２）プライマーＢは修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む。ある特定の実施形態では、プライマーＢは、その３’－末端に、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む、
（３）タグ配列Ａ及びタグ配列Ｂは各々独立的に、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する、
（４）コンセンサス配列Ａ及びコンセンサス配列Ｂは各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（５）プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢは各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（６）架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域及び第２の領域は各々独立的に、３～１００ｎｔ（例えば、３～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（７）架橋オリゴヌクレオチドの第３の領域は、０～１００ｎｔ（例えば、０～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ）の長さを有する、
（８）架橋オリゴヌクレオチドは、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（９）ポリ（Ｔ）配列は、少なくとも１０又は少なくとも２０（例えば、少なくとも３０）デオキシチミジン残基を含む、
（１０）ランダムオリゴヌクレオチド配列は、５～２００ｎｔ（例えば、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ）の長さを有する。
【0102】
ある特定の実施形態では、方法は、（４）第２の核酸分子集団を回収し、精製するステップをさらに含む。
【0103】
ある特定の実施形態では、方法において、得られた第２の核酸分子集団及び／又はその相補体は、トランスクリプトームライブラリーを構築するため又はトランスクリプトームシーケンシングのために使用される。
【0104】
ある特定の実施形態では、ステップ（１）におけるオリゴヌクレオチドプローブは、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する：
（１）コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２は各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸）又はそれらの任意の組合せを含み、ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｘ２は３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２は各々独立的に、２～１００ｎｔ（例えば、１０～２００ｎｔ、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ）の長さを有する、
（３）オリゴヌクレオチドプローブは各々独立的に、１５～２００ｎｔ（例えば、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する。
（１）コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２は各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸）又はそれらの任意の組合せを含み、ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｘ２は３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２は各々独立的に、２～１００ｎｔ（例えば、１０～２００ｎｔ、１０～１００ｎｔ、２０～１００ｎｔ、２５～１００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、５～３０ｎｔ、６～１５ｎｔ、５～１０ｎｔ、１０～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ）の長さを有する、
（３）オリゴヌクレオチドプローブは各々独立的に、１５～２００ｎｔ（例えば、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する。
【0105】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはリンカーを介して固相支持体に結合している。
【0106】
ある特定の実施形態では、リンカーは活性化基と結合することが可能な連結基であり、固相支持体の表面は活性化基を用いて修飾される。
【0107】
ある特定の実施形態では、リンカーは、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ又は－ＮＨＳを含む。
【0108】
ある特定の実施形態では、リンカーは－ＤＢＣＯであり、固相支持体の表面は、
（アジド－ｄＰＥＧ（Ａｚｉｄｏ－ｄＰＥＧ）（登録商標）８－ＮＨＳエステル）を用いて修飾される。
【化1】
（アジド－ｄＰＥＧ（Ａｚｉｄｏ－ｄＰＥＧ）（登録商標）８－ＮＨＳエステル）を用いて修飾される。
【0109】
一部の実施形態では、ステップ（１）の核酸アレイは、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する：
【0110】
ある特定の実施形態では、同一固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドプローブは、同一コンセンサス配列Ｘ１及び／又は同一コンセンサス配列Ｘ２を有する。
【0111】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのコンセンサス配列Ｘ１は切断部位を含み、一部の実施形態では、切断部位は、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択される方法によって切断又は破壊され得る。
【0112】
一部の特定の実施形態では、ステップ（１）の核酸アレイは、以下のステップによって提供される：
（１）複数の種類のキャリア配列を提供するステップであって、各種のキャリア配列が、キャリア配列の少なくとも１つのコピー（例えば、複数のコピー）を含み、キャリア配列が、５’から３’方向に、コンセンサス配列Ｘ２の相補配列、タグ配列Ｙの相補配列及び固定化配列を含み、各種のキャリア配列のタグ配列Ｙの相補配列は互いに異なっている、ステップ、
（２）複数の種類のキャリア配列を固相支持体（例えば、チップ）の表面に結合させるステップ、
（３）固定化プライマーを提供し、キャリア配列を鋳型として使用してプライマー伸長反応を実施して、伸長産物を生成して、オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、固定化プライマーが、コンセンサス配列Ｘ１の配列を含み、キャリア配列の固定化配列とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、一部の実施形態では、５’から３’方向の伸長産物は、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなる、ステップ、
（４）固定化プライマーを固相支持体の表面と連結するステップであって、ステップ（３）及び（４）が任意の順序で実施される、ステップ、
（５）任意選択で、キャリア配列の固定化配列は切断部位をさらに含み、切断は、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択され得、キャリア配列の固定化配列に含まれる切断部位で切断を実施して、キャリア配列を消化して、ステップ（３）における伸長産物を、伸長産物が生成される鋳型（すなわち、キャリア配列）から分離し、それによって、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体（例えば、チップ）の表面に連結するステップ。
（１）複数の種類のキャリア配列を提供するステップであって、各種のキャリア配列が、キャリア配列の少なくとも１つのコピー（例えば、複数のコピー）を含み、キャリア配列が、５’から３’方向に、コンセンサス配列Ｘ２の相補配列、タグ配列Ｙの相補配列及び固定化配列を含み、各種のキャリア配列のタグ配列Ｙの相補配列は互いに異なっている、ステップ、
（２）複数の種類のキャリア配列を固相支持体（例えば、チップ）の表面に結合させるステップ、
（３）固定化プライマーを提供し、キャリア配列を鋳型として使用してプライマー伸長反応を実施して、伸長産物を生成して、オリゴヌクレオチドプローブを得るステップであって、固定化プライマーが、コンセンサス配列Ｘ１の配列を含み、キャリア配列の固定化配列とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能であり、一部の実施形態では、５’から３’方向の伸長産物は、コンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなる、ステップ、
（４）固定化プライマーを固相支持体の表面と連結するステップであって、ステップ（３）及び（４）が任意の順序で実施される、ステップ、
（５）任意選択で、キャリア配列の固定化配列は切断部位をさらに含み、切断は、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択され得、キャリア配列の固定化配列に含まれる切断部位で切断を実施して、キャリア配列を消化して、ステップ（３）における伸長産物を、伸長産物が生成される鋳型（すなわち、キャリア配列）から分離し、それによって、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体（例えば、チップ）の表面に連結するステップ。
【0113】
ある特定の実施形態では、各種のキャリア配列は、キャリア配列の複数のコピーのコンカテマーから形成されるＤＮＢである。
【0114】
ある特定の実施形態では、複数の種類のキャリア配列がステップ（１）において以下のステップ：
（ｉ）複数の種類のキャリア－鋳型配列を提供するステップであって、キャリア－鋳型配列が、キャリア配列の相補配列を含む、ステップ、
（ｉｉ）各種のキャリア－鋳型配列を鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種のキャリア－鋳型配列の増幅産物を得るステップであって、増幅産物が、キャリア配列の少なくとも１つのコピー（例えば、複数のコピー）を含み、ある特定の実施形態では、ローリングサークル複製が実施されて、キャリア配列のコンカテマーから形成されるＤＮＢが得られる、ステップ
によって提供される。
（ｉ）複数の種類のキャリア－鋳型配列を提供するステップであって、キャリア－鋳型配列が、キャリア配列の相補配列を含む、ステップ、
（ｉｉ）各種のキャリア－鋳型配列を鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種のキャリア－鋳型配列の増幅産物を得るステップであって、増幅産物が、キャリア配列の少なくとも１つのコピー（例えば、複数のコピー）を含み、ある特定の実施形態では、ローリングサークル複製が実施されて、キャリア配列のコンカテマーから形成されるＤＮＢが得られる、ステップ
によって提供される。
【0115】
一部の実施形態では、ステップ（１）における固相支持体は、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する：
（１）固相支持体は、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、硝子表面、チップ、センサー、電極及びシリコンウエハーからなる群から選択され、一部の実施形態では、固相支持体はチップである、
（２）固相支持体は、平面、球形又は多孔性である、
（３）固相支持体は、シーケンシングプラットフォーム、例えば、シーケンシングチップとして使用できる。一部の実施形態では、固相支持体は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＭＧＩ又はサーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）シーケンシングプラットフォームのためのシーケンシングチップである、及び
（４）固相支持体は、自発的に、又は１つ若しくは複数の刺激への曝露（例えば、温度変化、ｐＨ変化、特定の化学物質若しくは相への曝露、光への曝露、還元剤への曝露等）によりオリゴヌクレオチドプローブを放出可能である。
（１）固相支持体は、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、硝子表面、チップ、センサー、電極及びシリコンウエハーからなる群から選択され、一部の実施形態では、固相支持体はチップである、
（２）固相支持体は、平面、球形又は多孔性である、
（３）固相支持体は、シーケンシングプラットフォーム、例えば、シーケンシングチップとして使用できる。一部の実施形態では、固相支持体は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＭＧＩ又はサーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）シーケンシングプラットフォームのためのシーケンシングチップである、及び
（４）固相支持体は、自発的に、又は１つ若しくは複数の刺激への曝露（例えば、温度変化、ｐＨ変化、特定の化学物質若しくは相への曝露、光への曝露、還元剤への曝露等）によりオリゴヌクレオチドプローブを放出可能である。
【0116】
核酸分子ライブラリーを構築する方法
【0117】
別の態様では、本出願はまた、核酸分子ライブラリーを構築する方法であって、
（ａ）上記のような方法に従って、標識された核酸分子集団を生成するステップ、及び
（ｂ）標識された核酸分子集団における核酸分子を無作為に断片化し、アダプターを付加するステップ、及び
（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）の産物を増幅及び／又は濃縮するステップ
を含み、それによって、核酸分子ライブラリーを得る、方法を提供する。
（ａ）上記のような方法に従って、標識された核酸分子集団を生成するステップ、及び
（ｂ）標識された核酸分子集団における核酸分子を無作為に断片化し、アダプターを付加するステップ、及び
（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）の産物を増幅及び／又は濃縮するステップ
を含み、それによって、核酸分子ライブラリーを得る、方法を提供する。
【0118】
ある特定の実施形態では、核酸分子ライブラリーは、シーケンシング、例えば、トランスクリプトームシーケンシング、例えば、シングルセルトランスクリプトームシーケンシングのために使用される。
【0119】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）を実施する前に、方法は、ステップ（プレｂ）：標識された核酸分子集団を増幅及び／又は濃縮するステップをさらに含む。
【0120】
ある特定の実施形態では、ステップ（プレｂ）において、標識された核酸分子集団が核酸増幅反応に供されて、増幅産物を生成する。
【0121】
ある特定の実施形態では、核酸増幅反応が少なくともプライマーＣ及び／又はプライマーＤを使用して実施され、プライマーＣは、コンセンサス配列Ｘ１の相補配列若しくはコンセンサス配列Ｘ１の３’－末端配列の相補配列とハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、プライマーＤは、標識された核酸分子集団の核酸分子とハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である。
【0122】
ある特定の実施形態では、ステップ（プレｂ）における核酸増幅反応は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、鎖置換活性及び／又は高いフィデリティーを有するＤＮＡポリメラーゼ）を使用して実施される。
【0123】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において、核酸分子は無作為に断片に断片化され、トランスポザーゼを使用して断片にアダプターが付加される。一部の実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、前のステップにおいて得られた核酸分子が無作為に断片に断片化され、トランスポザーゼを使用して、断片の両末端に第１のアダプター及び第２のアダプターがそれぞれ付加される。
【0124】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＭｕＡトランスポザーゼ、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポザーゼ、マリナ－（Ｍａｒｉｎｅｒ）トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｙ１トランスポザーゼ、Ｔｎ５５２トランスポザーゼ、並びに上記のトランスポザーゼの転移活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される。
【0125】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。
【0126】
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）の生成物が少なくともプライマーＣ’及び／又はプライマーＤ’を使用して増幅され、プライマーＣ’は、第１のアダプターとハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、プライマーＤ’は、第２のアダプターとハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である。
【0127】
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、少なくともプライマーＣ及び／又はプライマーＤ’を使用して、ステップ（ｂ）の生成物を増幅し、プライマーＤ’は、第１のアダプター若しくは第２のアダプターとハイブリダイズ又はアニーリングして、伸長反応を開始することが可能である。
【0128】
シーケンシング法
【0129】
別の態様では、本出願はまた、核酸試料をシーケンシングする方法を提供し、方法は、
（１）上記のような方法に従って核酸分子ライブラリーを構築するステップ、及び
（２）核酸分子ライブラリーをシーケンシングするステップ
を含む。
（１）上記のような方法に従って核酸分子ライブラリーを構築するステップ、及び
（２）核酸分子ライブラリーをシーケンシングするステップ
を含む。
【0130】
キット
【0131】
別の態様では、本出願はまたキットを提供し、キットは、
（ｉ）核酸を標識するための核酸アレイであって、固相支持体を含み、固相支持体は複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブに結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのコピーを含み、オリゴヌクレオチドプローブは５’から３’方向にコンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、
各種のオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、タグ配列Ｙは、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、核酸を標識するための核酸アレイ、
（ｉｉ）プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセットであって、
プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、一部の実施形態では、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置し（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置し）、
プライマーＡ’は捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、
プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ、３’－末端オーバーハングの相補配列及び任意選択で、タグ配列Ｂを含み、ある特定の実施形態では、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｂは３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置し（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置し）、３’－末端オーバーハングとは、プライマーＡ’の捕捉配列Ａによって捕捉されたＲＮＡを鋳型として使用する逆転写によって生成されたｃＤＮＡ鎖の３’－末端に含まれる１つ又は複数の鋳型とならないヌクレオチドを指す、プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセット
並びに
（ｉｉｉ）第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、第１の領域と第２の領域の間に位置する第３の領域を含む、架橋オリゴヌクレオチドであって、第１の領域は第２の領域の上流に位置し（例えば、第２の領域の５’に位置し）、
第１の領域は、（ａ）プライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリングすること、又は（ｂ）プライマーＢのコンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリングすることが可能であり、
第２の領域は、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である、架橋オリゴヌクレオチド
を含む。
（ｉ）核酸を標識するための核酸アレイであって、固相支持体を含み、固相支持体は複数の種類のオリゴヌクレオチドプローブに結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのコピーを含み、オリゴヌクレオチドプローブは５’から３’方向にコンセンサス配列Ｘ１、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２を含むか、又はそれからなり、
各種のオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、タグ配列Ｙは、その種類のオリゴヌクレオチドプローブの固相支持体上の位置に固有のヌクレオチド配列を有する、核酸を標識するための核酸アレイ、
（ｉｉ）プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセットであって、
プライマーＡはコンセンサス配列Ａ及び捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、一部の実施形態では、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置し（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置し）、
プライマーＡ’は捕捉配列Ａを含み、捕捉配列Ａは、捕捉されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）とアニーリングして、伸長反応を開始することが可能であり、
プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ、３’－末端オーバーハングの相補配列及び任意選択で、タグ配列Ｂを含み、ある特定の実施形態では、３’－末端オーバーハングの相補配列はプライマーＢの３’－末端に位置し、ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｂは３’－末端オーバーハングの相補配列の上流に位置し（例えば、プライマーＢの５’－末端に位置し）、３’－末端オーバーハングとは、プライマーＡ’の捕捉配列Ａによって捕捉されたＲＮＡを鋳型として使用する逆転写によって生成されたｃＤＮＡ鎖の３’－末端に含まれる１つ又は複数の鋳型とならないヌクレオチドを指す、プライマーＡ、又はプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット、又はプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセット
並びに
（ｉｉｉ）第１の領域及び第２の領域、及び任意選択で、第１の領域と第２の領域の間に位置する第３の領域を含む、架橋オリゴヌクレオチドであって、第１の領域は第２の領域の上流に位置し（例えば、第２の領域の５’に位置し）、
第１の領域は、（ａ）プライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体若しくは一部とアニーリングすること、又は（ｂ）プライマーＢのコンセンサス配列Ｂの全体若しくは一部とアニーリングすることが可能であり、
第２の領域は、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である、架橋オリゴヌクレオチド
を含む。
【0132】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブは、１つのコピーを含む。
【0133】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブは、複数のコピーを含む。
【0134】
ある特定の実施形態では、各種のオリゴヌクレオチドプローブが固相支持体に結合している領域は、マイクロドットと呼ばれる。各種のオリゴヌクレオチドプローブが、１つのコピーを含む場合には、各マイクロドットは１つのオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、異なるマイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有し、各種のオリゴヌクレオチドプローブが複数のコピーを含む場合には、各マイクロドットは複数のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、同一マイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは同一タグ配列Ｙを有し、異なるマイクロドットのオリゴヌクレオチドプローブは異なるタグ配列Ｙを有することを理解することは容易である。
【0135】
ある特定の実施形態では、固相支持体は複数のマイクロドットを含み、各マイクロドットは１つの種類のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、各種のオリゴヌクレオチドプローブは１つ又は複数のコピーを含み得る。
【0136】
ある特定の実施形態では、固相支持体は、複数の（例えば、少なくとも１０、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８又はそれより多い）マイクロドットを含み、ある特定の実施形態では、固相支持体は、少なくとも１０４（例えば、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１又は少なくとも１０１２）マイクロドット／ｍｍ２を含む。
【0137】
一部の実施形態では、隣接するマイクロドット間の間隔は、１００μｍ未満、５０μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．１μｍ未満、０．０５μｍ未満又は０．０１μｍ未満である。
【0138】
ある特定の実施形態では、マイクロドットは、１００μｍ未満、５０μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．１μｍ未満、０．０５μｍ未満又は０．０１μｍ未満のサイズ（例えば、相当直径）を有する。
【0139】
ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ及び（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域が、プライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体又は一部とアニーリング可能であり、架橋オリゴヌクレオチドの第２の領域が、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である。
【0140】
ある特定の実施形態では、プライマーＡの捕捉配列Ａはランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0141】
ある特定の実施形態では、プライマーＡの捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とする特異的配列であり、ある特定の実施形態では、プライマーＡはタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ａはタグ配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）。
【0142】
ある特定の実施形態では、プライマーＡは５’－末端に５’リン酸を含む。
【0143】
ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ’及びプライマーＢを含むプライマーセット及び（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域が、プライマーＢのコンセンサス配列Ｂの全体又は一部とアニーリング可能であり、架橋オリゴヌクレオチドの第２の領域が、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である。
【0144】
ある特定の実施形態では、プライマーＡ’の捕捉配列は、ランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0145】
ある特定の実施形態では、プライマーＡ’の捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とすると特異的配列であり、ある特定の実施形態では、プライマーＡ’は、タグ配列Ａ及びコンセンサス配列Ａをさらに含み、ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡ’の３’－末端に位置し、ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ａは捕捉配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡ’の５’－末端に位置する）。
【0146】
ある特定の実施形態では、プライマーＢは、コンセンサス配列Ｂ、３’－末端オーバーハングの相補配列及びタグ配列Ｂを含む。
【0147】
ある特定の実施形態では、キットはプライマーＢ’をさらに含み、プライマーＢ’は、コンセンサス配列Ｂの相補配列の全体又は一部とアニーリングし、伸長反応を開始することが可能である。
【0148】
ある特定の実施形態では、プライマーＢ又はプライマーＢ’は、５’－末端に５’リン酸を含む。
【0149】
ある特定の実施形態では、プライマーＢは修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含み、ある特定の実施形態では、プライマーＢは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、１つ又は複数のロックド核酸）を３’－末端に含む。
【0150】
ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）に記載の核酸を標識するための核酸アレイ、（ｉｉ）に記載のプライマーＡ及びプライマーＢを含むプライマーセット及び（ｉｉｉ）に記載の架橋オリゴヌクレオチドを含み、架橋オリゴヌクレオチドの第１の領域が、プライマーＡのコンセンサス配列Ａの全体又は一部とアニーリング可能であり、架橋オリゴヌクレオチドの第２の領域が、コンセンサス配列Ｘ２の全体又は一部とアニーリング可能である。
【0151】
ある特定の実施形態では、プライマーＡの捕捉配列Ａはランダムオリゴヌクレオチド配列である。
【0152】
ある特定の実施形態では、プライマーＡの捕捉配列Ａは、ポリ（Ｔ）配列又は標的核酸を標的とすると特異的配列であり、ある特定の実施形態では、プライマーＡはタグ配列Ａ、例えば、ランダムオリゴヌクレオチド配列をさらに含み、ある特定の実施形態では、捕捉配列ＡはプライマーＡの３’－末端に位置し、コンセンサス配列Ａはタグ配列Ａの上流に位置する（例えば、プライマーＡの５’－末端に位置する）。
【0153】
ある特定の実施形態では、プライマーＡは５’－末端に５’リン酸を含む。
【0154】
ある特定の実施形態では、プライマーＢは修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む。ある特定の実施形態では、プライマーＢは、３’－末端に１つ又は複数の修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）を含む。
【0155】
ある特定の実施形態では、キットは、以下から選択される１つ又は複数の特徴を有する：
（１）オリゴヌクレオチドプローブ、プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ、プライマーＢ’及び架橋オリゴヌクレオチドは各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなる。ある特定の実施形態では、プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢ’は、伸長反応を開始することが可能である。ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｘ２は３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）オリゴヌクレオチドプローブは各々独立的に、１５～３００ｎｔ（例えば、１５～２００ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（３）プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及びプライマーＢ’は各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（４）架橋オリゴヌクレオチドは、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（５）同一固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドプローブは、同一コンセンサス配列Ｘ１及び／又は同一コンセンサス配列Ｘ２を有する、
（６）オリゴヌクレオチドプローブのコンセンサス配列Ｘ１は切断部位を含み、一部の実施形態では、切断部位は、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択される方法によって切断若しくは破壊され得る。
（１）オリゴヌクレオチドプローブ、プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ、プライマーＢ’及び架橋オリゴヌクレオチドは各々独立的に、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド又はそれらの任意の組合せを含むか、又はそれからなる。ある特定の実施形態では、プライマーＡ、プライマーＡ’及びプライマーＢ’は、伸長反応を開始することが可能である。ある特定の実施形態では、コンセンサス配列Ｘ２は３’－末端に遊離ヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する、
（２）オリゴヌクレオチドプローブは各々独立的に、１５～３００ｎｔ（例えば、１５～２００ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（３）プライマーＡ、プライマーＡ’、プライマーＢ及びプライマーＢ’は各々独立的に、１０～２００ｎｔ（例えば、１０～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（４）架橋オリゴヌクレオチドは、６～２００ｎｔ（例えば、２０～７０ｎｔ、６～１５ｎｔ、１５～２０ｎｔ、２０～３０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、４０～５０ｎｔ、５０～１００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ）の長さを有する、
（５）同一固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドプローブは、同一コンセンサス配列Ｘ１及び／又は同一コンセンサス配列Ｘ２を有する、
（６）オリゴヌクレオチドプローブのコンセンサス配列Ｘ１は切断部位を含み、一部の実施形態では、切断部位は、ニッキング酵素消化、ＵＳＥＲ酵素消化、光応答性切除、化学的切除又はＣＲＩＳＰＲ媒介性切除から選択される方法によって切断若しくは破壊され得る。
【0156】
ある特定の実施形態では、キットは、逆転写酵素、核酸リガーゼ、核酸ポリメラーゼ及び／又はトランスポザーゼをさらに含む。
【0157】
ある特定の実施形態では、逆転写酵素はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有し、ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を鋳型として使用してｃＤＮＡ鎖を合成すること及び３’－末端オーバーハングをｃＤＮＡ鎖の３’－末端に付加することが可能であり、ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又はそれより多いヌクレオチドの長さを有するオーバーハングを付加することが可能であり、ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端に２～５のシトシンヌクレオチドのオーバーハング（例えば、ＣＣＣオーバーハング）を、付加することが可能であり、ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、並びに上記の逆転写酵素の逆転写活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される。
【0158】
ある特定の実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有さない。
【0159】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＭｕＡトランスポザーゼ、スリーピングビューティートランスポザーゼ、マリナ－トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｙ１トランスポザーゼ、Ｔｎ５５２トランスポザーゼ、並びに上記のトランスポザーゼの転移活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体からなる群から選択される。
【0160】
ある特定の実施形態では、キットは、プライマーＣ、プライマーＤ、プライマーＣ’及び／又はプライマーＤ’をさらに含む。例えば、キットは、プライマーＣ、プライマーＤ及びプライマーＤ’をさらに含む。例えば、キットは、プライマーＣ、プライマーＤ、プライマーＣ’及びプライマーＤ’をさらに含む。
【0161】
ある特定の実施形態では、キットは、核酸ハイブリダイゼーションのための試薬、核酸伸長のための試薬、核酸増幅のための試薬、核酸を回収又は精製するための試薬、トランスクリプトームシーケンシングライブラリーを構築するための試薬、シーケンシング（例えば、第２又は第３世代シーケンシング）のための試薬又はそれらの任意の組合せをさらに含む。
【0162】
使用
【0163】
別の態様では、本出願はまた、上記のような標識された核酸分子集団を生成するための方法、又は核酸分子ライブラリーを構築するための、若しくはトランスクリプトームシーケンシングを実施するための上記のようなキットの使用を提供する。
【0164】
用語の定義
【0165】
本出願では、特に断りのない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、分子生物学、生化学、核酸化学、細胞培養等の操作ステップは、本明細書で使用される場合、すべて、対応する技術分野において広く使用される日常的なステップである。一方で、本出願をより理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
【0166】
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又はそれらの変形が本明細書で使用される場合には、これらの用語は、限定的な用語とはされず、代わりに、「それだけには限らない」又は「制限するものではない」を意味すると解釈される。
【0167】
本明細書において別に示されるか、文脈によって明確に矛盾しない限り、本出願を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」並びに「その（ｔｈｅ）」及び同様の指示対象は、単数形及び複数形を対象とすると解釈されるべきである。
【0168】
本明細書において使用される場合、「ＤＮＢ」（ＤＮＡナノボール（ｎａｎｏｂａｌｌ））は、通常のＲＣＡ（ローリングサークル増幅）産物であり、ＲＣＡ産物の特徴を有する。ここで、ＲＣＡ産物は、複数のコピーを有する一本鎖ＤＮＡ配列であり、ＤＮＡに含まれる塩基間の相互作用により、「球状」様構造を形成できる。通常、ライブラリー分子は環状化して、一本鎖環状ＤＮＡを形成し、その後、一本鎖環状ＤＮＡを、ローリングサークル増幅技術を使用して数桁増幅することができ、それによって、ＤＮＢと呼ばれる増幅産物が生成される。
【0169】
本明細書で使用される場合、「核酸分子集団」とは、核酸分子、例えば、標的核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡ）に直接若しくは間接的に由来する核酸分子の集団又は集合を指す。一部の実施形態では、核酸分子集団は核酸分子ライブラリーを含み、核酸分子ライブラリーは、標的核酸分子配列を質的及び／又は量的に代表する配列を含む。他の実施形態では、核酸分子集団は、核酸分子ライブラリーのサブセットを含む。
【0170】
本明細書で使用される場合、「核酸分子ライブラリー」とは、標識された核酸分子（例えば、標識された二本鎖ＤＮＡ、標識されたＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド、標識された一本鎖ＤＮＡ又は標識された一本鎖ＲＮＡ）又は標的核酸分子から直接的若しくは間接的に生成されるその断片の集合又は集団を指し、集合若しくは集団の標識された核酸分子又はその断片の組合せは、標識された核酸分子が生成された標的核酸分子配列の配列を質的に及び／又は量的に代表すると示されている。ある特定の実施形態では、核酸分子ライブラリーはシーケンシングライブラリーである。ある特定の実施形態では、核酸分子ライブラリーは、シーケンシングライブラリーを構築するために使用され得る。
【0171】
本明細書で使用される場合、「ｃＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ鎖」とは、目的のＲＮＡ分子の少なくとも一部分を鋳型として使用し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素（このプロセスは、「逆転写」とも呼ばれる）の触媒下で目的のＲＮＡ分子とアニーリングするプライマーを介して伸長することによって合成された「相補ＤＮＡ」を指す。合成されたｃＤＮＡ分子は、鋳型の少なくとも一部分に対して「相同」若しくは「相補的」であるか、又は鋳型の少なくとも一部分と「塩基対形成する」若しくは「複合体を形成する」。
【0172】
本明細書で使用される場合、用語「上流」は、２つの核酸配列（又は２つの核酸分子）の相対的な位置的関係を説明するために使用され、当業者によって一般に理解される意味を有する。例えば、表現「核酸配列は、別の核酸配列の上流に位置する」とは、５’から３’方向にアラインされた場合に、前者は後者よりもより前方の位置（すなわち、５’－末端により近い位置）に位置することを意味する。本明細書で使用される場合、用語「下流」は、「上流」と反対の意味を有する。
【0173】
本明細書で使用される場合、「タグ配列Ｙ」、「タグ配列Ａ」、「タグ配列Ｂ」、「コンセンサス配列Ｘ１」、「コンセンサス配列Ｘ２」、「コンセンサス配列Ａ」、「コンセンサス配列Ｂ」等は、それにライゲートされた核酸分子又はそれにライゲートされた核酸分子の誘導体産物（例えば、核酸分子の相補的断片、核酸分子の短い断片等）の同定、認識及び／若しくは分子操作又は生化学的操作の手段を提供する（例えば、オリゴヌクレオチドとアニーリングするための部位を提供することによって。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ伸長のプライマーである又は捕捉反応若しくはライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドである。）非標的核酸構成成分を有するオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２の（好ましくは、約６～１００であるが、オリゴヌクレオチドの長さの明確な制限はなく、正確なサイズは多数の因子に依存し、一方でこれらの因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存する）ヌクレオチドからなってもよく、連続的又は非連続的に配置された複数のオリゴヌクレオチドセグメントから構成されてもよい。オリゴヌクレオチド配列は、それがライゲートされる各核酸分子に固有であってもよく、それがライゲートされるある特定の種類の核酸分子に固有であってもよい。オリゴヌクレオチド配列は、ライゲーション、ハイブリダイゼーション又は他の方法を含む任意の方法によって「標識される」ポリヌクレオチド配列に可逆的又は不可逆的にライゲートされ得る。オリゴヌクレオチド配列を核酸分子とライゲートするプロセスは、「標識」と呼ばれることがあり、標識の付加を受ける、又は標識配列を含む核酸分子は、「標識された核酸分子」又は「タグが付けられた核酸分子」と呼ばれる。
【0174】
種々の理由のために、本出願の核酸又はポリヌクレオチド（例えば、「タグ配列Ｙ」、「タグ配列Ａ」、「タグ配列Ｂ」、「コンセンサス配列Ｘ１」、「コンセンサス配列Ｘ２」、「コンセンサス配列Ａ」、「コンセンサス配列Ｂ」、「プライマーＡ」、「プライマーＡ’」、「プライマーＢ」、「プライマーＣ」、「プライマーＤ」、「プライマーＤ’」、「架橋オリゴヌクレオチド」等）は、１つ又は複数の修飾核酸塩基、糖部分又はヌクレオシド間連結を含み得る。例えば、修飾核酸塩基、糖部分又はヌクレオシド間連結を含む核酸又はポリヌクレオチドを使用するいくつかの理由として、それだけには限らないが、（１）Ｔｍの変化、（２）１つ若しくは複数のヌクレアーゼに対するポリヌクレオチドの感受性の変化、（３）標識を連結するための部分を提供すること、（４）標識若しくは標識クエンチャーを提供すること又は（５）溶液の別の分子に取り付けるための、若しくは表面に結合したビオチン等の部分を提供することが挙げられる。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、プライマーは、ランダムな部分に、拘束されたコンホメーションを有する１つ以上の核酸類似体を含むように合成することができ、これには、リボース環が、２’－Ｏ原子を４’－Ｃ原子に連結するメチレン架橋によって「ロック」された１つ又は複数のリボ核酸類似体が含まれるが、これに限定されない。これらの修飾ヌクレオチドは、各分子のＴｍ又は融解温度の約２セルシウス度～約８セルシウス度の増大をもたらす。例えば、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーが使用される一部の実施形態では、方法において修飾ヌクレオチドを使用する１つの指標は、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが一本鎖特異的ＲＮアーゼによって消化され得ることであり得る。
【0175】
本出願の方法において、例えば、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの１つ又は複数の位置の単一ヌクレオチドの核酸塩基は、グアニン、アデニン、ウラシル、チミン若しくはシトシンを含み得る、又は任意選択で、核酸塩基のうち１つ若しくは複数は、修飾塩基、例えば、それだけには限らないが、キサンチン、アリルアミノ－ウラシル、アリルアミノ－チミンヌクレオシド、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、４－チオウラシル、６－チオグアニン、アザウラシル、デアザウラシル、チミンヌクレオシド、シトシン、アデニン又はグアニンを含み得る。さらに、それらは、以下の部分で誘導体化された核酸塩基を含み得る：ビオチン部分、ジゴキシゲニン部分、蛍光又は化学発光部分、クエンチング部分又はいくつかの他の部分。本出願は、列挙された核酸塩基に制限されず、所与のリストは、本出願の方法において使用され得る広範な塩基の例を例示する。
【0176】
本出願の核酸又はポリヌクレオチドに関して、糖部分のうち１つ又は複数は２’－デオキシリボースを含んでよく、又は任意選択で、糖部分のうち１つ又は複数はいくつかの他の糖部分、例えば、それだけには限らないが、いくつかのヌクレアーゼに対して耐性を有するリボース若しくは２’－フルオロ－２’－デオキシリボース若しくは２’－Ｏ－メチル－リボース、又は、可視、蛍光、赤外蛍光若しくは他の検出可能な色素若しくは求電子性、光反応性、アルキニル若しくは他の反応性化学部分を有する化学物質との反応によって標識される、２’－アミノ－２’－デオキシリボース若しくは２’－アジド－２’－デオキシリボースを含んでもよい。
【0177】
本出願の核酸又はポリヌクレオチドのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合であり得るか、又は任意選択で、ヌクレオシド間連結のうち１つ若しくは複数は、修飾された連結、例えば、それだけには限らないが、いくつかのヌクレアーゼに対して耐性である、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート又はホスホロジセレネート連結を含む場合がある。
【0178】
本明細書で使用される場合、用語「ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性」とは、１つ若しくは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）又は単一のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の、ｃＤＮＡの３’－末端への鋳型独立性付加（又は「テーリング」）を触媒する能力を指す。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素の例には、それだけには限らないが、－ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、並びに逆転写活性及び逆転写酵素のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有するそれらのバリアント、改変産物及び誘導体が含まれる。逆転写酵素は、ＲＮアーゼ活性（特に、ＲＮアーゼＨ活性）を有するか、又は有さない。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡを生成するためのＲＮＡの逆転写のために使用される逆転写酵素は、ＲＮアーゼ活性を有さない（特に、ＲＮアーゼＨ活性）。したがって、好ましい実施形態では、ｃＤＮＡを生成するためのＲＮＡの逆転写のために使用される逆転写酵素は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有し、ＲＮアーゼ活性を有さない（特に、ＲＮアーゼＨ活性）。
【0179】
本明細書で使用される場合、「鎖置換活性」を有する核酸ポリメラーゼとは、新規核酸鎖を伸長するプロセスの際に、鋳型鎖と相補的である下流核酸鎖と遭遇した場合に、伸長反応を継続し、鋳型鎖と相補的である該核酸鎖を（分解するのではなく）置き換えることができる核酸ポリメラーゼを指す。
【0180】
本明細書で使用される場合、「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性」を有する核酸ポリメラーゼとは、ポリヌクレオチドの５’－末端から３’－末端の順に３，５－リン酸ジエステル結合の加水分解を触媒でき、それによってヌクレオチドを分解する核酸ポリメラーゼを指す。
【0181】
本明細書で使用される場合、「高いフィデリティー」を有する核酸ポリメラーゼ（又はＤＮＡポリメラーゼ）とは、核酸の増幅の際に、野生型Ｔａｑ酵素（例えば、配列がＵｎｉＰｒｏｔ受託：Ｐ１９８２１．１に示されたＴａｑ酵素）よりも間違ったヌクレオチドを導入する可能性（すなわち、誤り率）が低い核酸ポリメラーゼ（又はＤＮＡポリメラーゼ）を指す。
【0182】
本明細書で使用される場合、用語「アニーリングした」、「アニーリングしている」、「アニーリングする」、「ハイブリダイズされた」、又は「ハイブリダイズしている」等は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を介して複合体を形成するための十分な相補性を有するヌクレオチド配列間の複合体の形成を指す。本出願の目的のために、互いに「相補的である」又は「ハイブリダイズする」又は「アニーリングする」核酸配列は、意図される目的のために、十分に安定な「ハイブリッド」又は「複合体」を形成可能でなくてはならない。核酸分子によって提示された配列内のすべての核酸塩基が、別の核酸分子によって提示される配列内のすべての核酸塩基と塩基対形成又は対形成又は複合体形成可能であることによって、両核酸分子又はその中の提示される対応する配列が互いに「相補的である」又は「アニーリングする」又は「ハイブリダイズする」ことは、必要ではない。本明細書で使用される場合、用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対形成のルールによって関連づけられたヌクレオチドの配列に言及する場合に使用される。例えば、配列５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’と相補的である。相補性は、「部分的」であり得、この場合、核酸塩基の一部のみが、塩基対形成のルールにしたがってマッチングする。任意選択で、核酸の間に「完全」又は「総」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して大きな影響を及ぼす。相補性の程度は、核酸のハイブリダイゼーションに頼る増幅反応及び検出方法において特に重要である。用語「相同性」とは、ある核酸配列の、別の核酸配列に対する相補性の程度を指す。部分相同性（すなわち、相補性）又は完全相同性（すなわち、相補性）があり得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列の標的核酸とのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する配列であり、機能的な用語「実質的に相同」を使用して称される。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロッティング又はノーザンブロッティング、溶液のハイブリダイゼーション等）を使用して低ストリンジェンシー条件下で試験され得る。実質的に相同な配列又はプローブは、低ストリンジェンシーの条件下での完全に相同な配列の標的との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）において競合するか、又は結合を阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能にする条件であるということではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列が特異的（すなわち、選択的）相互作用によって互いに結合することを必要とする。非特異的結合がないことは、相補性を欠くか、又は低い程度の相補性しか有さない（例えば、約３０％未満の相補性）第２の標的を使用することによって試験され得る。特異的結合が低いか、又は存在しない場合には、プローブは、核酸標的とハイブリダイズしない。用語「実質的に相同」とは、二本鎖核酸配列、例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムクローンに関して使用される場合に、本明細書で記載される低ストリンジェンシー条件下で、二本鎖核酸配列の一方の鎖又は両鎖とハイブリダイズできる任意のオリゴヌクレオチド又はプローブであることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「アニーリング」又は「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸鎖の対形成を指す場合に使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション力（すなわち、核酸鎖の間の会合力）は、塩濃度、ハイブリッドを形成するためのＴｍ（融解温度）、他の構成成分の存在（例えば、ポリエチレングリコール又はベタインの有無）、ハイブリダイズされた鎖のモル濃度及び核酸鎖のＧＣ含量等の因子によって影響を受ける条件のストリンジェンシーを含む、核酸間の相補性の程度を含む、当技術分野で公知の多数の因子によって影響を受ける。
【0183】
本明細書で記載されるように、固相支持体は、自発的に、又は１つ若しくは複数の刺激への曝露（例えば、温度変化、ｐＨ変化、特定の化学物質若しくは相への曝露、光への曝露、還元剤等）によりオリゴヌクレオチドプローブを放出可能である。オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブと固相支持体の間の結合の切断又は固相支持体自体の分解又は両方によって放出され得、またオリゴヌクレオチドプローブは、他の試薬によって接近されることを可能にするか、又は接近されることが可能であることが理解される。
【0184】
複数の種類の不安定な結合を固相支持体に付加することによって、固相支持体の異なる刺激に応答する能力が可能になる。各種の不安定な結合は、関連する刺激（例えば、化学的刺激、光、温度等）に対して感受性である場合があり、その結果、不安定な結合各々を介して固相支持体に付着している物質の放出が、適切な刺激を適用することによって制御され得る。熱的に切断可能な結合、ジスルフィド結合及びＵＶ感受性結合に加えて、固相支持体に結合することができる不安定な結合の他の限定されない例には、エステル結合（例えば、酸、塩基又はヒドロキシルアミンを用いて切断され得るエステル結合）、オルトジオール結合（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによって切断され得るオルトジオール結合）、ディールス・アルダー結合（例えば、熱的に切断され得るディールス・アルダー結合）、スルホン結合（例えば、アルカリによって切断され得るスルホン結合）、シリシル（ｓｉｌｉｃｙｌ）エーテル結合（例えば、酸によって切断され得るシリシル（ｓｉｌｉｃｙｌ）エーテル結合）、グリコシド結合（例えば、アミラーゼによって切断され得るグリコシド結合）、ペプチド結合（例えば、プロテアーゼによって切断され得るペプチド結合）又はリン酸ジエステル結合（例えば、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡ酵素）によって切断され得るリン酸ジエステル結合）が含まれる。
【0185】
固相支持体と上記のオリゴヌクレオチドの間の切断可能な結合に加えて、又はそれの代替物として、固相支持体は、自発的に、又は１つ若しくは複数の刺激への曝露（例えば、温度変化、ｐＨ変化、特定の化学物質若しくは相への曝露、光への曝露、還元剤への曝露等）により分解可能、破壊可能又は可溶性であり得る。一部の場合には、固相支持体は、可溶性である場合があり、その結果、固相支持体の材料成分が、特定の化学物質又は環境変化（例えば、温度の変化又はｐＨの変化）への曝露により溶解する。一部の場合には、固相支持体は、高温及び／又はアルカリ条件下で分解又は溶解し得る。一部の場合には、固相支持体は、熱的に分解可能である場合があり、その結果、固相支持体は、適切な温度変化（例えば、加熱）に曝露された場合に分解する。物質（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）と結合している固相支持体の分解又は溶解は、固相支持体からの物質の放出をもたらし得る。
【0186】
本明細書で使用される場合、用語「トランスポザーゼ」及び「逆転写酵素」及び「核酸ポリメラーゼ」とは、特定の化学反応及び生体反応を触媒することに関与するタンパク質分子又はタンパク質分子の凝集体を指す。一般に、本出願の方法、組成物又はキットは、特定の供給源からの特定のトランスポザーゼ、逆転写酵素又は核酸ポリメラーゼの使用に制限されない。むしろ、本出願の方法、組成物又はキットは、本明細書で開示される特定の方法、組成物又はキットの特定の酵素と同等の酵素活性を有する任意の供給源からの任意のトランスポザーゼ、逆転写酵素又は核酸ポリメラーゼを含み得る。さらに、本出願の方法はまた、以下の実施形態を含む：方法のステップにおいて提供され、使用される任意の１種の特定の酵素が、２種又はそれより多い酵素の組合せによって置き換えられ、別個に段階的に、又は同時に一緒に使用されるかに関わらず、２種又はそれより多い酵素が組み合わせて使用される場合に、反応混合物が、その特定の酵素を使用して得られるであろうものと同一の結果物をもたらす。実施例におけるものを含む本明細書で提供される方法、緩衝液及び反応条件は、本出願の方法、組成物及びキットの実施形態にとって現在好ましい。しかし、本出願の酵素の一部のために他の酵素保存緩衝液、反応緩衝液及び反応条件が使用される場合があり、当技術分野で公知であり、本出願における使用に適している場合があり、本明細書に含まれる。
【0187】
［本出願の有益な効果］
本出願は、標識された核酸分子集団を生成する新規方法、並びに本方法に基づいて核酸分子ライブラリーを構築し、及び高処理量シーケンシングを実施し、それによって、試料の高精度の細胞内レベル空間的位置決めを達成する方法を提供する。本出願の方法は、以下から選択される１つ又は複数の有益な技術効果を有する：
本出願は、標識された核酸分子集団を生成する新規方法、並びに本方法に基づいて核酸分子ライブラリーを構築し、及び高処理量シーケンシングを実施し、それによって、試料の高精度の細胞内レベル空間的位置決めを達成する方法を提供する。本出願の方法は、以下から選択される１つ又は複数の有益な技術効果を有する：
【0188】
（１）空間的トランスクリプトームシーケンシングのために使用される伝統的な核酸アレイ（例えば、チップ）のプローブは、固定された捕捉配列を含む。普通、特異的捕捉配列は、それに対応する特異的標的核酸分子のみを捕捉できる。例えば、捕捉配列がポリ（Ｔ）である場合には、対応して、ポリ（Ａ）を含む標的核酸分子を捕捉する。標的核酸分子が変化する場合には、捕捉配列を含むプローブ配列は、それに合うように変更される必要がある、すなわち、核酸アレイ（例えば、チップ）全体が変更される必要があり、これは、実際的な適用では費用がかかり、非効率的である。本出願の核酸アレイ（例えば、チップ）は、捕捉配列を含まず、捕捉配列は、核酸アレイとは独立している逆転写プライマーに存在する（すなわち、捕捉配列及びプローブは、互いに独立している）。捕捉配列が標的核酸分子を捕捉した後、それは架橋オリゴヌクレオチドを介してプローブとライゲートする。
【0189】
したがって、本出願は、プローブ配列を変更することなく（すなわち、核酸アレイ（例えば、チップ）を変更することなく）、異なる標的核酸分子の対応する捕捉配列を設計し、捕捉配列及び架橋オリゴヌクレオチドを変更することによって異なる標的核酸分子の捕捉を達成できる。
【0190】
（２）伝統的な空間的トランスクリプトーム方法はすべて、ポリ（Ｔ）を捕捉配列として使用し、ポリ（Ａ）テールを有さないＲＮＡを捕捉できないが、一方で本出願は、捕捉配列のポリ（Ｔ）を連続ランダム配列群（例えば、ランダムプライマー配列、例えば、Ｎ６、Ｎ８等）と置き換えることによってポリ（Ａ）テールを有さない標的核酸分子の捕捉を達成でき、連続ランダム配列群はまた、同時に固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列としても働くことができる。
【0191】
（３）空間的トランスクリプトームシーケンシングのために使用される伝統的な核酸アレイ（例えば、チップ）は、固定された捕捉プローブを有する。一般に、組織透過処理がまず実施されて、細胞内ＲＮＡを放出する。透過処理が過剰である場合には、ＲＮＡは、隣接する細胞に、組織試料の末梢にさえ広がり、プローブによって捕捉され、ｍＲＮＡのインサイツ捕捉を達成することが不可能になる。透過処理が不完全である場合には、ｍＲＮＡの捕捉効率が影響を受ける。本出願の方法を用いた場合、核酸アレイ（例えば、チップ）は、捕捉配列を含まず（核酸アレイは、空間情報を含み、捕捉配列を含まない）、組織透過処理の目的は、強い透過処理試薬処理を必要とすることなく、それによって、試料の広がりを低減しながら、逆転写プライマーが細胞に侵入し、ｍＲＮＡとインサイツでハイブリダイズすることを可能にすることである。
【0192】
本出願の好ましい実施形態は、添付の図面及び実施例と併せて以下に詳述されるが、当業者は以下の図面及び実施例は、単に本出願を例示するために使用されるのであって、本出願の範囲を制限するものではないということを理解するであろう。本出願の種々の目的及び有利な態様は、添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から当業者に明らかとなろう。
【実施例】
【0193】
本出願を、ここで、本出願を（制限するものではなく）例示することを意図する以下の実施例を参照して説明する。特に断りのない限り、実施例において記載される実験及び方法は、本質的に、当技術分野で周知の、種々の参照文献に記載される従来法に従って実施された。さらに、実施例において具体的な条件が指定されない場合には、従来条件又は製造業者によって推奨される条件に従うべきである。使用される試薬又は機器の製造業者が明記されなかった場合には、それらはすべて、商業的に購入することができる従来の製品であった。当業者は、実施例は、本出願を例として説明するものであって、本出願によって保護されようとする範囲を限定しようとするものではないということは理解するであろう。本明細書で言及されたすべての刊行物及び他の参照文献は、その全文で参照により組み込まれる。
【0194】
配列情報
【0195】
本出願に含まれる配列のうちの一部についての情報は、以下の表１に提供される。
【表1】
【0196】
実施例１：捕捉チップの調製
１．チップの位置情報を含むＤＮＡライブラリー分子の配列を設計し、これは、５’から３’に、コンセンサス配列Ｘ１（Ｘ１）、タグ配列（Ｙ）及びコンセンサス配列Ｘ２（Ｘ２）から構成されていた。ＤＮＡライブラリー分子の通常のヌクレオチド配列は、配列番号１に示した。ＤＮＡライブラリー分子を合成するためにＢｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に委託した。
１．チップの位置情報を含むＤＮＡライブラリー分子の配列を設計し、これは、５’から３’に、コンセンサス配列Ｘ１（Ｘ１）、タグ配列（Ｙ）及びコンセンサス配列Ｘ２（Ｘ２）から構成されていた。ＤＮＡライブラリー分子の通常のヌクレオチド配列は、配列番号１に示した。ＤＮＡライブラリー分子を合成するためにＢｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に委託した。
【0197】
２．ライブラリー分子の増幅及びローディング
（１）ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキット（ＭＧＩから購入、カタログ番号１００００１９８４０）を使用して、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を調製した。具体的な実施形態を手短に以下に記載した。
（１）ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキット（ＭＧＩから購入、カタログ番号１００００１９８４０）を使用して、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を調製した。具体的な実施形態を手短に以下に記載した。
【0198】
手短には、４０μＬの表２に示されるような反応系を調製した。反応系をＰＣＲ装置に入れ、以下の反応条件に従って反応を実施した：９５℃で３分間、４０℃で３分間。反応が完了した後、反応産物を氷上に置き、４０μＬの混合酵素Ｉ、２μＬの混合酵素ＩＩ（ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットからの）、１μＬのＡＴＰ（１００ｍＭの保存溶液、サーモフィッシャーから入手）及び０．１μＬのＴ４リガーゼ（ＮＥＢから入手、カタログ番号： Ｍ０２０２Ｓ）を添加した。ウェルを混合した後、上記の反応系をＰＣＲ装置に入れ、３０℃で２０分間反応させて、ＤＮＢを生成した。
【0199】
【表2】
【0200】
（２）その後、ＳＥＱ５００ ＳＥ５０キットセット（ＭＧＩから購入、１００００１２５５１）を使用して、ＤＮＢをＳＥＱ５００ シーケンシングチップ（ＭＧＩから購入）にロードした。
【0201】
シーケンシングチップにおいて、ＰＥ５０シーケンシングキット（ＭＧＩから購入、１００００１２５５４）のＭＤＡ試薬を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、チップを５Ｘ ＳＳＣで洗浄した。
【0202】
（３）チップの表面を、Ｎ３－ＰＥＧ３５００－ＮＨＳ（ｓｉｇｍａから購入した修飾試薬、カタログ番号：ＪＫＡ５０８６）を用いて修飾した。３０分インキュベートした後、それにチップ配列合成のためのＤＢＣＯ修飾プライマー（配列は配列番号３で示された）を注入し、室温で一晩インキュベートした。
【0203】
３．位置配列情報のシーケンシング及び解読：シーケンシングを、ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０ シーケンシングキットの使用説明書に従って実施し、ＳＥリードの長さを２５ｂｐと設定した。シーケンシングによって生成されたｆｑファイルを後の使用のために保存した。
【0204】
４．チップ配列のコンセンサス配列Ｘ２（配列番号５）の伸長：上記のステップ３に基づいて、１３塩基のｃＰＡＳ反応を継続して、チップ配列を得た（コンセンサス配列Ｘ１（配列番号４）、タグ配列Ｙ及びコンセンサス配列Ｘ２（配列番号５）から構成される、配列番号８）。
【0205】
５．チップ切断：調製したチップを、いくつかの小片に切断した。小片のサイズは、実験上の必要性に従って調整した。チップは、後の使用のために４℃のｐＨ８．０の５０ｍＭのｔｒｉｓ緩衝液に浸漬した。
【0206】
実施例２：ｃＤＮＡのインサイツ合成
１．ｃＤＮＡの合成
マウス組織切片を、凍結切片の標準法に従って調製し、凍結切片を実施例１で調製したチップに取り付けた。凍結メタノールを用いて３０分間固定した後、０．５％ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００を使用して組織を透過処理した。５Ｘ ＳＳＣを使用して、チップを室温で２回洗浄し、２００μＬの、表３に示されるような逆転写酵素反応系を調製し、反応溶液をチップにそれを完全に覆うように添加して、反応を４２℃で９０～１８０分間実施した。ｃＤＮＡの合成を、鋳型としてｍＲＮＡ及びポリＴ含有プライマー（配列は、配列番号６に示され、コンセンサス配列Ａ（ＣＡ）、ＵＭＩ配列及びポリＴ配列から構成された）を使用して逆転写酵素によって実施し、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端にＣＣＣオーバーハングを付加した。ＴＳＯ配列（コンセンサス配列Ｂ（ＣＢ）及びＧＧＧオーバーハングから構成された配列番号７）の、ｃＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーション及びアニーリング（ＴＳＯ配列の末端のＧＧＧとｃＤＮＡ鎖のＣＣＣオーバーハングの間の相補的対形成を介した）後、コンセンサス配列Ｂを鋳型として使用して逆転写酵素によってｃＤＮＡ鎖を継続的に伸長し、その結果、ｃＤＮＡの３’－末端をｃ（ＣＢ）タグ（コンセンサス配列Ｂの相補配列）を用いて標識した。
１．ｃＤＮＡの合成
マウス組織切片を、凍結切片の標準法に従って調製し、凍結切片を実施例１で調製したチップに取り付けた。凍結メタノールを用いて３０分間固定した後、０．５％ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００を使用して組織を透過処理した。５Ｘ ＳＳＣを使用して、チップを室温で２回洗浄し、２００μＬの、表３に示されるような逆転写酵素反応系を調製し、反応溶液をチップにそれを完全に覆うように添加して、反応を４２℃で９０～１８０分間実施した。ｃＤＮＡの合成を、鋳型としてｍＲＮＡ及びポリＴ含有プライマー（配列は、配列番号６に示され、コンセンサス配列Ａ（ＣＡ）、ＵＭＩ配列及びポリＴ配列から構成された）を使用して逆転写酵素によって実施し、ｃＤＮＡ鎖の３’－末端にＣＣＣオーバーハングを付加した。ＴＳＯ配列（コンセンサス配列Ｂ（ＣＢ）及びＧＧＧオーバーハングから構成された配列番号７）の、ｃＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーション及びアニーリング（ＴＳＯ配列の末端のＧＧＧとｃＤＮＡ鎖のＣＣＣオーバーハングの間の相補的対形成を介した）後、コンセンサス配列Ｂを鋳型として使用して逆転写酵素によってｃＤＮＡ鎖を継続的に伸長し、その結果、ｃＤＮＡの３’－末端をｃ（ＣＢ）タグ（コンセンサス配列Ｂの相補配列）を用いて標識した。
【0207】
【表3】
【0208】
合成されたｃＤＮＡ鎖は、以下の配列から構成されていた：逆転写プライマー配列（配列番号６）－ｃＤＮＡ配列－ｃ（ＴＳＯ）配列（配列番号７の相補配列）。
【0209】
２．シーケンシングチップのチップ配列のｃＤＮＡとのライゲーション
ｃＤＮＡ合成後、チップを５Ｘ ＳＳＣで２回洗浄し、１ｍＬの、表４に示されるような反応系を調製し、その適切な容積をチップに注入して、チップが以下のライゲーション反応溶液で満たされることを確実にし、反応を室温で３０分間実施した。
ｃＤＮＡ合成後、チップを５Ｘ ＳＳＣで２回洗浄し、１ｍＬの、表４に示されるような反応系を調製し、その適切な容積をチップに注入して、チップが以下のライゲーション反応溶液で満たされることを確実にし、反応を室温で３０分間実施した。
【0210】
上記の反応によって、ｃＤＮＡ配列の５’－末端をシングルセルシーケンシングチップ配列の３’－末端とライゲートして（すなわち、ｃＤＮＡ配列の５’－末端を、チップ配列で標識した）、位置情報（すなわち、タグ配列Ｙ）を含む新規核酸分子を得、これは、以下の配列構造から構成されていた：チップ配列（配列番号８）－逆転写プライマー配列（配列番号６）－ｃＤＮＡ配列－ｃ（ＴＳＯ）配列（配列番号７の相補配列）。
【0211】
反応が完了した後、チップを５Ｘ ＳＳＣで洗浄した。２００μＬのＢｓｔ重合反応溶液（ＮＥＢ、Ｍ０２７５Ｓ）を使用説明書に従って調製し、チップに注入し、６５℃で６０分間反応させて、位置情報を有する一本鎖核酸分子を得た。
【0212】
【表4】
【0213】
３．ｃＤＮＡの放出
７５μＬの８０ｍＭ ＫＯＨを使用してチップを室温で５分間インキュベートした。液体を収集した後、１０μＬの、１Ｍ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを添加して、ｃＤＮＡ回収溶液を中和した。
７５μＬの８０ｍＭ ＫＯＨを使用してチップを室温で５分間インキュベートした。液体を収集した後、１０μＬの、１Ｍ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを添加して、ｃＤＮＡ回収溶液を中和した。
【0214】
４．ｃＤＮＡの増幅
２００μＬの、表５に示されるような反応系を調製し、それぞれ、３’トランスクリプトームシーケンシング及びライブラリー構築のために使用し、ＰＣＲのために２つのチューブに分けた：
２００μＬの、表５に示されるような反応系を調製し、それぞれ、３’トランスクリプトームシーケンシング及びライブラリー構築のために使用し、ＰＣＲのために２つのチューブに分けた：
【0215】
【表5】
【0216】
上記の反応系をＰＣＲ装置に入れ、反応プログラムを以下のとおりに設定した：９５℃で３分間、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃で∞。反応が完了した後、ＸＰビーズ（ＡＭＰｕｒｅから購入）を磁性ビーズベースの精製及び回収のために使用した。ｄｓＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ機器を使用して定量化し、２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔから購入）を使用して、ｃＤＮＡ増幅産物の長さ分布を検出した。検出結果は図６に示された。
【0217】
実施例３：ｃＤＮＡのライブラリー構築及びシーケンシング
１．Ｔｎ５断片化
ｃＤＮＡ濃度に従って、２０ｎｇのｃＤＮＡ（実施例２のステップ４で得られた）を取り出し、０．５μＭのＴｎ５トランスポザーゼ及び対応する緩衝液（ＢＧＩから購入、カタログ番号：１０００００２８４９３、Ｔｎ５トランスポザーゼのコーティングは、Ｓｔｅｒｅｏｍｉｃｓライブラリー調製キット－Ｓ１の使用説明書に従って操作した）を添加し、十分に混合して、２０μＬの反応系を得、反応を５５℃で１０分間実施し、次いで、５μＬの０．１％ＳＤＳを添加し、室温で５分間十分に混合して、Ｔｎ５転位を終結させた。
１．Ｔｎ５断片化
ｃＤＮＡ濃度に従って、２０ｎｇのｃＤＮＡ（実施例２のステップ４で得られた）を取り出し、０．５μＭのＴｎ５トランスポザーゼ及び対応する緩衝液（ＢＧＩから購入、カタログ番号：１０００００２８４９３、Ｔｎ５トランスポザーゼのコーティングは、Ｓｔｅｒｅｏｍｉｃｓライブラリー調製キット－Ｓ１の使用説明書に従って操作した）を添加し、十分に混合して、２０μＬの反応系を得、反応を５５℃で１０分間実施し、次いで、５μＬの０．１％ＳＤＳを添加し、室温で５分間十分に混合して、Ｔｎ５転位を終結させた。
【0218】
２．ＰＣＲ増幅
１００μＬの以下の反応系を調製した：
１００μＬの以下の反応系を調製した：
【表6】
【0219】
混合後、ＰＣＲ装置に入れ、以下のプログラムを以下のとおりに設定した：９５℃で３分間、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃∞。反応が完了した後、ＸＰビーズを磁性ビーズベースの精製及び回収のために使用した。ｄｓＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ機器を使用して定量化した。
【0220】
３．シーケンシング
８０ｆｍｏｌの上記の断片化された増幅産物を取り出して、ＤＮＢを調製した。４０μＬの反応系を以下のとおりに調製した：
８０ｆｍｏｌの上記の断片化された増幅産物を取り出して、ＤＮＢを調製した。４０μＬの反応系を以下のとおりに調製した：
【表7】
【0221】
上記の反応容積を反応のためにＰＣＲ装置に入れ、反応条件を以下のとおりとした：９５℃で３分間、４０℃で３分間。反応が完了した後、得られた反応溶液を氷上に置き、ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットのＤＮＢ調製に必要な４０μＬの混合酵素Ｉ、２μＬの混合酵素ＩＩ、１μＬのＡＴＰ及び０．１μＬのＴ４リガーゼを添加した。混合後、上記の反応系をＰＣＲ装置に入れ、３０℃で２０分間反応させてＤＮＢを形成した。
【0222】
ＭＧＩＳＥＱ ２０００をサポートするＰＥ５０キットに記載される方法に従って、ＤＮＢをＭＧＩＳＥＱ２０００のシーケンシングチップにロードし、関連使用説明書に従ってシーケンシングを実施した。ＰＥ５０シーケンシングモデルを選択し、これでは、第１鎖のシーケンシングがシーケンシングの２つのセクションに分けられ、２５ｂｐを最初に測定し、次いで、１５サイクルの暗所反応を行い、次いで、１０ｂｐのＵＭＩ配列を測定し、第２鎖シーケンシングを設定して、５０ｂｐを測定した。
【0223】
実施例４：データの分析
アラインメントによって、ｃＤＮＡシーケンシングによって得られた第１鎖の２５ｂｐ配列をチップの位置決め配列のｆｑ（実施例１におけるシーケンシング結果）とマッチングし、その後の分析のために２つのシーケンシングにおける２５ｂｐのマッチングリードを抽出した。２つのシーケンシングにおける２５ｂｐのマッチングリードについて、その第２鎖を分析し、第２鎖の配列をマウスゲノムとアラインして、固有のマッピングリードを抽出した。
アラインメントによって、ｃＤＮＡシーケンシングによって得られた第１鎖の２５ｂｐ配列をチップの位置決め配列のｆｑ（実施例１におけるシーケンシング結果）とマッチングし、その後の分析のために２つのシーケンシングにおける２５ｂｐのマッチングリードを抽出した。２つのシーケンシングにおける２５ｂｐのマッチングリードについて、その第２鎖を分析し、第２鎖の配列をマウスゲノムとアラインして、固有のマッピングリードを抽出した。
【0224】
固有のマッピングリードをチップの空間的位置にマッピングして、図７に示されるようなマウス脳遺伝子発現マップを得、図７がＤＮＢレベル（すなわち、ナノメートルレベル）の分解能に拡大される場合には（図８）、組織試料の単細胞の明らかな凝集があることを見出すことができ、これは、本出願の方法がＲＮＡの拡散を低減し、空間的トランスクリプトームの検出を可能にし、ナノメートルレベルの分解能に到達したことを示した。
【0225】
４０，０００のＤＮＢあたりの捕捉された遺伝子及びＵＭＩの平均数に関する統計値は、平均ほぼ４，０００の遺伝子及び１０，０００のｍＲＮＡ分子を捕捉できたことを示し、これは、本出願の方法は、下流分析のために十分な数の遺伝子及びｍＲＮＡ分子を捕捉できたことを示す。
【0226】
本出願の特定の実施形態が詳細に記載されているが、当業者は、開示されたすべての技術に基づいて詳細に、種々の改変及び変更を行うことができ、これらの変更はすべて本出願の保護範囲内であることを理解するであろう。本出願の全範囲は、添付の特許請求の範囲及び任意のその均等物によって与えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】