特表 2024-545814 生物学的材料を分析するための界面活性剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-12

(54)【発明の名称】生物学的材料を分析するための界面活性剤

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20241205BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241205BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024536416

(86)(22)【出願日】2022-12-19

(85)【翻訳文提出日】2024-07-22

(86)【国際出願番号】 EP2022086592

(87)【国際公開番号】W WO2023117863

(87)【国際公開日】2023-06-29

(31)【優先権主張番号】21306849.7

(32)【優先日】2021-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519186543

【氏名又は名称】スティラ テクノロジーズ

【氏名又は名称原語表記】Ｓｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ

【住所又は居所原語表記】１ Ｍａｉｌ ｄｕ Ｐｒｏｆｅｓｓｅｕｒ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｍａｔｈｅ，９４８００ Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ，Ｆｒａｎｃｅ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ウルスギ，シルヴァン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX01

(57)【要約】

本発明は、特に、生物学的材料を分析する方法、および、マイクロ流体デバイスで使用するための連続油相に関する。本出願人は、分子生物学に適合し、デジタルＰＣＲの性能を向上させ、ならびに、サンプルの無駄およびデッドボリュームを制限する、新規のカテゴリーである界面活性剤およびオイル／界面活性剤システムを確かに特定した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的材料を分析する方法であって、
シリコーンオイルを含む連続油相と、
分散された水相と、
ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体である界面活性剤と、を含む上記生物学的材料を含むエマルジョンを形成する工程；
上記エマルジョン中の上記生物学的材料を処理する工程；および、
上記エマルジョン中の上記生物学的材料を検出する工程を含み、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化1】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化2】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化3】

式（ＩＶ）

【化4】

式（Ｖ）

【化5】

および、
式（ＶＩ）

【化6】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化7】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、方法。

【請求項2】

デジタルＰＣＲ、より好ましくは液滴中のデジタルＰＣＲにおける油相としてのシリコーンオイルおよび界面活性剤の使用であって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化8】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化9】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化10】

式（ＩＶ）

【化11】

式（Ｖ）

【化12】

および、
式（ＶＩ）

【化13】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化14】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、使用。

【請求項3】

シリコーンオイルと界面活性剤とを含む、マイクロ流体デバイス用の連続油相であって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化15】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化16】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化17】

式（ＩＶ）

【化18】

式（Ｖ）

【化19】

および、
式（ＶＩ）

【化20】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化21】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択され、ならびに、
組成物は、上記連続油相の総重量に対して、少なくとも０．５重量％の界面活性剤を含む、連続油相。

【請求項4】

シリコーンオイルと界面活性剤とを含有する少なくとも１つのチャンバーを含む、マイクロ流体デバイスであって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化22】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化23】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化24】

式（ＩＶ）

【化25】

式（Ｖ）

【化26】

および、
式（ＶＩ）

【化27】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化28】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、マイクロ流体デバイス。

【請求項5】

上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化29】

式中、Ｒ_１がＣ_１２アルキルであり、ｍが１０～３５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化30】

式中、ｑが３であり、ｎが１～１５に含まれ、Ｒ_２が式（ＩＩＩ）の化合物であり、

【化31】

式中、ｒが６～９に含まれ、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化32】

式中、ｐが７５～１７５に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載の連続油相、および請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項6】

上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化33】

式中、Ｒ_１がＣ_１６アルキルであり、ｍが２５～７５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化34】

式中、ｑが３であり、ｎが１～５または５～１５に含まれ、Ｒ_２が式（Ｖ）の化合物であり、

【化35】

式中、ｕが１であり、ｔが１０であり、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化36】

式中、ｐが１００～３００に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載の連続油相、および請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項7】

上記シリコーンオイルの粘度が２５℃で０．７～５．０センチストークスに含まれている、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【請求項8】

上記シリコーンオイルがデカメチルテトラシロキサンを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【請求項9】

上記シリコーンオイルが、当該シリコーンオイルの総重量に対して少なくとも６０重量％のデカメチルテトラシロキサンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【請求項10】

上記シリコーンオイルが、オクタメチルトリシロキサンおよび／またはドデカメチルペンタシロキサンをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【請求項11】

上記連続油相が、上記シリコーンオイルの総重量に対して、１～１０重量％のオクタメチルトリシロキサンおよび／または１～１０重量％のドデカメチルペンタシロキサンを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【請求項12】

上記生物学的材料が細胞または核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

上記生物学的材料を処理する上記工程が、好ましくはデジタルＰＣＲによって、上記生物学的材料を増幅することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

上記界面活性剤がＡＢＥ ３６４２である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法、使用、連続油相、マイクロ流体デバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析方法のための材料の分野に関連し、マイクロ流体デバイス用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

１９９０年代半ば、微細加工技術の進歩により、数ミクロンという小さなサイズのデバイスの製造が可能になった。マイクロマシニング、フォトリソグラフィ、ケイ素基板およびガラス基板のエッチング、これらすべてが、試薬および分子を選別することができ、化学反応を分割でき、そして、水性および油性流体の混合物用の液滴発生器として機能することができる流路のネットワークを作り出した。これらのマイクロ流体デバイスは、単一細胞アッセイ、タンパク質および核酸等の高分子の研究、ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の生化学的アッセイの実行に適している。

【0003】

２０００年代初頭までに、油中水型エマルジョンは、生物学的材料をナノリットル／ピコリットルのスケールの液滴に分割することを目的とした応用の可能性について研究されていた。重要な進歩は、油性連続相において界面活性剤を使用することによって、不連続な水相の導入後に形成される液滴の完全性を維持することであった。オイルで満たされたマイクロ流体デバイスに界面活性剤を使用することで、液滴は広くなったチャネルまたはリザーバーに貯留することができ、破壊または融合することなく互いに接触することができる。オイルおよび界面活性剤で満たされたチャネルの広範な流体ネットワークを設計し、プラグまたは液滴の意図的な混合を調整することによって、生化学反応を媒介することができる。

【0004】

フッ素系界面活性剤と組み合わせたフッ素系オイルは、水性液滴内で生体分子を取り扱うのに特に有用である（Holtze et al., Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions, 2008, 8(10), 1632-1639）。

【0005】

しかしながら、フッ素系油を含有するエマルジョンは、当該技術分野で特定されている種々の欠点に悩まされる可能性がある。例えば、水性液滴は一般的にフッ素系油中で浮遊し（フッ素系油の密度は水の密度よりも高い）、液滴の形成および操作が複雑になる可能性がある。場合によっては、ＰＣＲミックスの沈殿を目視で検査する必要があり、エマルジョンは液滴を熱源に近づけるために液滴の下の余分なオイルを除去する必要が生じる可能性があり、および／または、入口ウェル内のＰＣＲミックスの位置はマイクロ流体チップの傾きに敏感である可能性がある。

【0006】

さらに、浮遊する液滴は、特に加熱されたときに、エマルジョンの上方の空気にさらされることによって損傷を受け易くなる可能性があり、ＰＣＲミックスは蒸発に敏感であるため、サンプルの沈殿とサンプル分析との間に時間的な制約が生じ、場合によっては蒸発を防止するためのシーリングオイルの使用が必要となる。

【0007】

それゆえ、シリコーンオイルとシリコーン界面活性剤とを含む連続相に配置された水性液滴を含むエマルジョンを記載するＷＯ２０１４／１４５５８２等の代替システムが提案されており、当該シリコーン界面活性剤は、一般式［シリコーン骨格］［アルキル］ｘ［ポリエーテル］ｙ［ポリシロキサン］ｚによって記載され、ｘは０～５であり、ｙは１～３５であり、ｚは２～５０である。

【0008】

また、ＷＯ２０１７０７０３６３には、シリコーンオイルと、シリコーンオイルに可溶化されたシロキサンブロック共重合体とを含むマイクロ流体デバイス用の充填剤流体が開示されており、シロキサンブロック共重合体は水性液体と実質的に非混和性である。

【0009】

しかしながら、分子生物学に適合する好適な界面活性剤／オイルシステムを特定することは、デジタルＰＣＲの性能を向上させるための大きな目標である。

【0010】

分子生物学への適合性とは、システムがＰＣＲ等の分子生物学で使用される主要な反応プロトコルに障害を与えないことを意味する。

【0011】

デジタルＰＣＲの性能は、特に、液滴の安定性（液滴が互いに接触するときに混合し合体することを実質的に防ぐことを意味する）、ＰＣＲミックスの所与量に対する液滴の数の増加、その結果生じる分析される量の増加、そして最終的には浮遊する液滴の回避を包含する。

【0012】

また、マイクロ流体チップをロードするとき、ＰＣＲミックスの沈殿および位置決めを単純化し、ＰＣＲミックスの蒸発を防いでサンプルの無駄を防ぎ、最終的にデッドボリューム、すなわち分析できないサンプル量を最小化することも重要な目標である。

【発明の概要】

【0013】

本出願人は、分子生物学に適合し、デジタルＰＣＲの性能を向上させ、ならびに、サンプルの無駄およびデッドボリュームを制限する、新規のカテゴリーである界面活性剤およびオイル／界面活性剤システムを特定した。

【0014】

本出願人は、本発明に係る界面活性剤が、他の界面活性剤と比較して、液滴が互いに接触するときに混合し合体することを防止し、液滴数および分析される量を増加させることを実際に実証した。

【0015】

この液滴数および分析される量の増加は、デジタルＰＣＲの定量精度および異なる集団間の蛍光シグナルの分離性を保証し、デジタルＰＣＲの堅牢性および精度を決定する重要なパラメーターとなる。

【0016】

さらに、本発明に係るオイル／界面活性剤システムの密度比は、フッ素系システムと比較して反転しているため、チップローディング（chip loading）が容易になり、サンプルの無駄を防ぎ、デッドボリュームを最小限に抑えることができる。これらは、アッセイ精度および再現性に関して大きな改善である。

【0017】

最後に、シリコーンオイルはフッ素系オイルと比較して密度比が反転しているため、ＰＣＲミックスも蒸発から保護され、チップローディングと処理との間の操作時間を延長することができる。

【0018】

〔詳細な説明〕
（生物学的材料の分析方法）
一実施形態において、本発明は、生物学的材料を分析する方法であって、
シリコーンオイルを含む連続油相と、
分散された水相と、
ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体である界面活性剤と、を含む上記生物学的材料を含むエマルジョンを形成する工程；
上記エマルジョン中の上記生物学的材料を処理する工程；および、
上記エマルジョン中の上記生物学的材料を検出する工程を含み、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化1】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化2】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化3】

式（ＩＶ）

【化4】

式（Ｖ）

【化5】

および、
式（ＶＩ）

【化6】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化7】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、方法に関する。

【0019】

（デジタルＰＣＲにおける油相としてのシリコーンオイルおよび界面活性剤の使用）
一実施形態において、本発明は、デジタルＰＣＲにおける油相としてのシリコーンオイルおよび界面活性剤の使用であって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化8】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化9】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化10】

式（ＩＶ）

【化11】

式（Ｖ）

【化12】

および、
式（ＶＩ）

【化13】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化14】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、使用に関する。

【0020】

（マイクロ流体デバイス用の連続油相）
一実施形態において、本発明は、シリコーンオイルと界面活性剤とを含む、マイクロ流体デバイス用の連続油相であって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化15】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化16】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化17】

式（ＩＶ）

【化18】

式（Ｖ）

【化19】

および、
式（ＶＩ）

【化20】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化21】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択され、ならびに、
組成物は、上記連続油相の総重量に対して、少なくとも０．５重量％の界面活性剤を含む、連続油相に関する。

【0021】

（マイクロ流体デバイス）
一実施形態において、本発明は、シリコーンオイルと界面活性剤とを含有する少なくとも１つのチャンバーを含む、マイクロ流体デバイスであって、
上記界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化22】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化23】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化24】

式（ＩＶ）

【化25】

式（Ｖ）

【化26】

および、
式（ＶＩ）

【化27】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択され、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化28】

式中、ｐは５～３００に含まれ、
末端基は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択され、ならびに、
上記界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］および［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］から選択される、マイクロ流体デバイスに関する。

【0022】

（界面活性剤）
本発明によれば、界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体である。

【0023】

一実施形態において、界面活性剤のブロック［Ａ］は、式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化29】

式中、Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_１８アルキルであり、ｍは１０～１００に含まれている。

【0024】

上記一般式中、特に断りのない限り、アルキルは、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個の炭素原子を含有する直鎖または分岐基を示す。好適なアルキルラジカルの例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシル等である。したがって、Ｃ_１～Ｃ_１８アルキルは、１～１８個の炭素原子を含有するアルキル基に相当する。

【0025】

一実施形態において、ｍは１０～３５、好ましくは１０～１７、または１７～２５に含まれている。

【0026】

一実施形態において、ｍは２５～７５に含まれている。

【0027】

一実施形態において、Ｒ_１はＣ_１２アルキルである。

【0028】

一実施形態において、Ｒ_１はＣ_１６アルキルである。

【0029】

一実施形態において、Ｒ_１はＣ_１２アルキルであり、ｍは１０～３５、好ましくは１０～１７または１７～２５に含まれている。

【0030】

一実施形態において、Ｒ_１はＣ_１６アルキルであり、ｍは２５～７５に含まれている。

【0031】

一実施形態において、界面活性剤のブロック［Ｂ］は、式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化30】

式中、ｑは２～１８に含まれ、ｎは１～５０に含まれ、Ｒ_２は以下の化合物からなる群から選択され：
式（ＩＩＩ）

【化31】

式（ＩＶ）

【化32】

式（Ｖ）

【化33】

および、
式（ＶＩ）

【化34】

式中、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは、は１～３２に含まれ、Ｒ_３は、－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ_３および－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３からなる群から選択される。

【0032】

一実施形態において、ｑは３である。

【0033】

一実施形態において、ｎは１～１５、好ましくは１～５に含まれている。

【0034】

一実施形態において、ｎは５～１５に含まれている。

【0035】

一実施形態において、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは１～１８、好ましくは１～１２、より好ましくは６～９に含まれている。

【0036】

一実施形態において、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは独立して１または１０に等しい。

【0037】

一実施形態において、Ｒ_３は－ＯＨである。

【0038】

一実施形態において、Ｒ_２は式（ＩＩＩ）の化合物である。

【化35】

【0039】

一実施形態において、Ｒ_２は式（Ｖ）の化合物である。

【化36】

【0040】

一実施形態において、Ｒ_２は式（ＩＩＩ）の化合物である。

【化37】

式中、ｒが６～９に含まれ、Ｒ_３が－ＯＨである。

【0041】

一実施形態において、Ｒ_２は式（Ｖ）の化合物である。

【化38】

式中、ｔが１０であり、ｕが１であり、Ｒ_３が－ＯＨである。

【0042】

一実施形態において、界面活性剤のブロック［Ｃ］は、式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化39】

式中、ｐが５～３００に含まれている。

【0043】

一実施形態において、ｐは５～２００、好ましくは７５～１７５、より好ましくは９５～１４０に含まれている。

【0044】

一実施形態において、ｐは１００～３００に含まれている。

【0045】

一実施形態において、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体は、－Ｈ、－ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される末端基を含む。

【0046】

一実施形態において、末端基は、－ＣＨ_３または－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３である。

【0047】

一実施形態において、界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化40】

式中、Ｒ_１がＣ_１２アルキルであり、ｍが１０～３５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化41】

式中、ｑが３であり、ｎが１～１５に含まれ、Ｒ_２が式（ＩＩＩ）の化合物であり、

【化42】

式中、ｒが６～９に含まれ、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化43】

式中、ｐが７５～１７５に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される。

【0048】

一実施形態において、界面活性剤は、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック重合体であり、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化44】

式中、Ｒ_１がＣ_１６アルキルであり、ｍが２５～７５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化45】

式中、ｑが３であり、ｎが１～５または５～１５に含まれ、Ｒ_２が式（Ｖ）の化合物であり、

【化46】

式中、ｕが１であり、ｔが１０であり、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化47】

式中、ｐが１００～３００に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される、

【0049】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］である。

【0050】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ｂ］－［Ｃ］－［Ａ］である。

【0051】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ｃ］－［Ａ］－［Ｂ］である。

【0052】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］である。

【0053】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ａ］－［Ｃ］－［Ｂ］である。

【0054】

一実施形態において、界面活性剤の一般式は、［Ｃ］－［Ｂ］－［Ａ］である。

【0055】

一実施形態によれば、本発明に係るシステムで使用できる界面活性剤は、Gelest（登録商標）社からＡＢＥ ３６４２（ＣＡＳ番号２１２３３５－５２－９）の商品名で市販されている界面活性剤、Siltech Corporation社からＳｉｌｕｂｅ（登録商標）Ｊ２０８－８１２（ＣＡＳ番号２１２３３５－５２－９）の商品名で市販されている界面活性剤、およびSiltech Corporation社からＳｉｌｕｂｅ（登録商標）Ｔ３１０－Ａ－１６（ＣＡＳ番号１４５６８６－３４－６）の商品名で市販されている界面活性剤からなる群から選択することができる。

【0056】

好ましい実施形態において、Gelest（登録商標）社からＡＢＥ ３６４２（ＣＡＳ番号２１２３３５－５２－９）の商品名で市販されている界面活性剤を、本発明に係る界面活性剤として使用することができる。

【0057】

好ましい実施形態において、界面活性剤は、界面活性剤のブロック［Ａ］を１５～５０重量％、好ましくは１８～５０重量％、より好ましくは２０～４０重量％含む。

【0058】

好ましい実施形態において、界面活性剤は、界面活性剤のブロック［Ｂ］を３～１０重量％含む。

【0059】

好ましい実施形態において、界面活性剤は、界面活性剤のブロック［Ａ］を２０～４０重量％、界面活性剤のブロック［Ｂ］を３～１０重量％、および界面活性剤のブロック［Ｃ］を残りの重量、含む。

【0060】

一実施形態において、界面活性剤は、界面活性剤のブロック［Ａ］を３０～３５重量％、界面活性剤のブロック［Ｂ］を７～１０重量％、および界面活性剤のブロック［Ｃ］を残りの重量、含む。

【0061】

一般的に、重量％はＲＭＮ １Ｈ分析によって推定される。

【0062】

（連続油相）
本発明によれば、連続油相はシリコーンオイルを含む。

【0063】

本明細書で使用するシリコーンオイルは、ケイ素原子と酸素原子が交互に結合した骨格構造を有し、ケイ素原子に炭化水素が結合している分子を包含する。ケイ素原子は、炭化水素部分等の種々の部分によって置換されていてもよい。

【0064】

ケイ素オイルは、その粘度に応じて、また任意に、連続油相が使用されるマイクロ流体デバイスの設計に応じて選択してもよい。

【0065】

粘度は、当業者に公知の任意の方法で測定することができる。一般的に、粘度は、回転粘度計等の慣例の粘度計を使用して測定することができる。一般的に、粘度計は、低粘度材料に適合した粘度計であり得る。例えば、ＬＶＴ、ＬＶＤＶ－Ｅ、ＤＶ１ＭＬＶ、ＤＶ２ＴＬＶ、ＤＶ３ＬＴＶ等のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計（AMETEK Brookfield, 11 Commerce Blvd., Middleboro, MA 02346 USA）を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ低粘度付属品と共に使用することができる。

【0066】

一実施形態において、連続油相は、２５℃で０．５～５００センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルを含む。

【0067】

一実施形態において、連続油相は、２５℃で０．５～１００センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルを含む。

【0068】

一実施形態において、連続油相は、２５℃で０．５～５０センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルを含む。

【0069】

一実施形態において、連続油相は、２５℃で０．５～１０センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルを含む。

【0070】

一実施形態において、連続油相は、２５℃で０．７～５センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルを含む。

【0071】

一実施形態において、連続油相の粘度は、２５℃で０．８～４．０センチストークス、好ましくは２５℃で０．９～３．０センチストークス、より好ましくは２５℃で１．０～２．０センチストークスに含まれている。

【0072】

一般的に、連続油相の粘度は２５℃で１．１～１．５センチストークスである。

【0073】

２５℃で０．７～５センチストークスの粘度を有するシリコーンオイルは、例えば特許出願ＷＯ２０２０／１０９３７９およびＷＯ２０２０／１０９３８８に記載されているＯｐａｌ（商標）マイクロ流体デバイスで使用するときに特に有利である。

【0074】

一実施形態において、シリコーンオイルは、デカメチルテトラシロキサンを含む。

【0075】

別の実施形態において、シリコーンオイルは、シリコーンオイルの総重量に対して少なくとも６０重量％のデカメチルテトラシロキサン、好ましくはシリコーンオイルの総重量に対して７０重量％のデカメチルテトラシロキサン、より好ましくはシリコーンオイルの総重量に対して８０重量％のデカメチルテトラシロキサン、さらに好ましくはシリコーンオイルの総重量に対して９０重量％のデカメチルテトラシロキサンを含む。

【0076】

別の実施形態において、シリコーンオイルは、オクタメチルトリシロキサンおよび／またはドデカメチルペンタシロキサンをさらに含む。

【0077】

一実施形態において、連続油相は、１～１０重量％のオクタメチルトリシロキサンおよび／または１～１０重量％のドデカメチルペンタシロキサンを含む。

【0078】

一実施形態において、Ｇｅｌｅｓｔ（登録商標）社から市販されている製品ＤＭＳ－Ｔ０１．５（ＣＡＳ番号：６３１４８－６２－９）をシリコーンオイルとして使用することができる。

【0079】

一実施形態において、連続油相は、本発明に係る界面活性剤を含む。

【0080】

一実施形態において、連続油相は、連続油相の総重量に対して、０．５～５重量％の前述で定義した界面活性剤、好ましくは、連続油相の総重量に対して、０．５～２．５重量％の前述で定義した界面活性剤、より好ましくは、連続油相の総重量に対して、０．５～１．５重量％の前述で定義した界面活性剤を含む。

【0081】

一実施形態において、連続油相は、組成物の総重量に対して、前述に定義した界面活性剤を約１．０重量％含む。

【0082】

好ましい実施形態において、連続油相は、少なくとも６０％のデカメチルテトラシロキサンを含むシリコーンオイルと、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体界面活性剤である界面活性剤と、を含み、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化48】

式中、Ｒ_１がＣ_１２アルキルであり、ｍが１０～３５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化49】

式中、ｑが３であり、ｎが１～１５に含まれ、Ｒ_２が式（ＩＩＩ）の化合物であり、

【化50】

式中、ｒが６～９に含まれ、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化51】

式中、ｐが７５～１７５に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される。

【0083】

別の好ましい実施形態において、連続油相は、少なくとも６０％のデカメチルテトラシロキサンを含むシリコーンオイルと、ブロック［Ａ］、［Ｂ］および［Ｃ］を含むブロック共重合体界面活性剤である界面活性剤と、を含み、
上記界面活性剤のブロック［Ａ］が式（Ｉ）のブロックに相当し、

【化52】

式中、Ｒ_１がＣ_１６アルキルであり、ｍが２５～７５に含まれ、
上記界面活性剤のブロック［Ｂ］が式（ＩＩ）のブロックに相当し、

【化53】

式中、ｑが３であり、ｎが１～５または５～１５に含まれ、Ｒ_２が式（Ｖ）の化合物であり、

【化54】

式中、ｕが１であり、ｔが１０であり、Ｒ_３が－ＯＨであり、
上記界面活性剤のブロック［Ｃ］が式（ＶＩＩ）のブロックに相当し、

【化55】

式中、ｐが１００～３００に含まれ、
末端基が、Ｈ、ＣＨ_３および－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３からなる群から選択される。

【0084】

（分散された水相）
一実施形態において、分散された相は、水、および、任意の水混和性共溶媒（例えば、エーテルグリコールおよびポリエーテルグリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、短鎖有機アルコール、アセトン、短鎖脂肪酸、グリセロール短鎖有機アミン、過酸化水素、または有機酸および無機酸、等）を含む。

【0085】

一実施形態において、分散相は、生物学的反応を実施するための試薬および生物学的材料を含む。

【0086】

（生物学的材料）
生物学的材料とは、限定されないが、生物、器官、組織、細胞（真核細胞および原核細胞を含む）、ウイルスまたはウイルス粒子、核酸（二本鎖および一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む）、プラスミド、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、ホルモン、成長因子、炭水化物および脂質、ならびにそれらの誘導体、組み合わせまたはポリマーを指す。本発明に係る「生物学的材料」は、天然起源または合成起源の材料であってもよい。「生物学的材料」は、限定されないが、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、便、組織または細胞等の生物学的試料から直接抽出、回収または取得してもよい。

【0087】

好ましい実施形態において、生物学的材料とは核酸を指す。

【0088】

（エマルジョンおよび液滴の集団）
「エマルジョン」とは、少なくとも２つの液体を含む組成物を指し、それぞれの液体は他方において実質的に非混和性であり、液体の一方（「分散相」と示す）は他方の液体（「連続相」と示す）中に分割されている。エマルジョンの分散相は、一般的に、コロイド、ミセル、カプセルおよび／または液滴の形態で懸濁されている。分散相および連続相は、一般的には完全に非混和性である。エマルジョンは、一般的に、１種以上の界面活性剤および／または乳化剤をエマルジョンに含有させることにより安定化される。

【0089】

一実施形態において、本発明はまた、シリコーンオイルおよび界面活性剤を含む連続油相中に分散された水相を含む液滴の集団に関する。

【0090】

「分散された水相」、「連続油相」および「界面活性剤」と題された前述の段落で詳述したすべての特徴は、エマルジョンおよび液滴の集団にも適用する。

【0091】

（デジタルＰＣＲ）
一実施形態において、生物学的材料を処理する工程は、好ましくはデジタルＰＣＲによって、より好ましくは液滴中でのデジタルＰＣＲによって、生物学的材料を増幅することを含む。

【0092】

デジタルＰＣＲは以下の３つの技術を包含していると考えてもよい。

【0093】

・マイクロアレイにおけるデジタルＰＣＲ
マイクロ流体ベースのデジタルＰＣＲがよく知られるようになり、より広く実践されるようになったため、２００６年にFluidigm Corporationはこの技術を集積マイクロ流体回路として商品化した。ＢｉｏＭａｒｋシステムは１２７５デジタルアレイという１２個のパネルであるチップをベースにしており、各パネルは反応流体を７６５個の６－ｎＬチャンバーに分割した。１２のキャリアインプットを通してＰＣＲ反応ミックスをロードした後、チップはサーモサイクル（thermocycle）され、蛍光が検出され、シグナルはDigital PCR Analysisソフトウェアによって処理および分析された。

【0094】

・マイクロ液滴におけるデジタルＰＣＲ
反応あたりのコスト制限に対処しながら、スループットおよび感度をさらに向上させる代替的アプローチは、チャンバーベースのシステムよりも多くのパーティションを提供するフローフォーカシング（flow-focusing）によって、ピコリットルサイズの微小液滴リアクターを生成することであった。液滴はマイクロ流体システムで生成され、液滴内で１分子デジタルＰＣＲを実行するためにサーモサイクルされ、エンドポイント増幅はリアルタイムの蛍光曲線で検出および定量される。これらの液滴ベースのラボオンチップシステムは、ＲＮＡゲノムの単一コピーを検出するための逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）の実行、および、単一液滴内での複数のターゲットに向けたマルチプレックス反応の実行にも適応された。

【0095】

この技術は、例えばQuantaLife, Inc.が２０１１年にＱＸ１００ ｄｄＰＣＲ（商標）システムとして商品化した。ｄｄＰＣＲ（商標）プラットフォームで使用されるマイクロ流体消耗品は、１チップあたり８サンプルまで対応可能で、１サンプルあたり１４，０００～１６，０００の液滴を生成した。

【0096】

・クリスタルデジタルＰＣＲ（Crystal Digital PCR）（商標）
先進的なデジタルＰＣＲ装置であるＮａｉｃａ（登録商標）システムは２０１６年にStilla Technologiesから発売された。このシステムは、液滴結晶とも呼ばれる液滴の大きな２Ｄアレイに、閉じ込め勾配を使用してサンプルを分割することでデジタルＰＣＲを実施する。ＰＣＲ反応は液滴結晶を構成する２５～３０，０００個の液滴のそれぞれで起こり、エンドポイントで結晶の高解像度画像を撮影することにより蛍光リードアウト（read-out）が実施される。

【0097】

したがって、本明細書で使用される場合、用語「デジタルＰＣＲ」は、マイクロアレイにおけるデジタルＰＣＲ、マイクロ液滴におけるデジタルＰＣＲおよびクリスタルデジタルＰＣＲ（商標）を包含するが、これらに限定されるものではなく、用語「液滴におけるデジタルＰＣＲ」は、マイクロ液滴におけるデジタルＰＣＲおよびクリスタルデジタルＰＣＲ（商標）を包含する。

【0098】

一実施形態において、生物学的材料を処理する工程は、好ましくはデジタルＰＣＲによって、より好ましくは液滴中のデジタルＰＣＲによって、生物学的材料を増幅することを含む。

【0099】

（マイクロ流体デバイス）
本発明に係るシリコーンオイル／界面活性剤システムは、液滴チャンバーを含むマイクロ流体デバイスにおいて有利である。

【0100】

本発明に係るオイル／界面活性剤システムの密度比は、フッ素系システムと比較して反転しているため、ＰＣＲミックスが液滴チャンバーの近くに沈み、サンプルの無駄を防ぎ、デッドボリュームを最小限に抑えるため、チップローディングが容易になる。

【0101】

本発明に係るシステムは、例えば特許出願ＷＯ２０２０／１０９３７９およびＷＯ２０２０／１０９３８８に記載されているＯｐａｌマイクロ流体デバイスにおいて特に有利である。

【0102】

Ｏｐａｌマイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの入り口マイクロチャネル、１つの液滴チャンバー、１つの出口チャネル、およびサンプルの液滴を受け取るように構成されたローディングウェルを含む。

【0103】

フッ素系システムの場合、ＰＣＲミックスはマイクロ流体チップのローディングウェル内で浮遊する。そのため、ＰＣＲミックスがマイクロ流体チップ内に適切に注入されているかを確認するために、当該ミックスの沈殿（deposition）を検査する必要がある場合がある。さらに、ローディングウェル内の液滴の浮遊性により、ウェル内のミックス位置はチップの傾きに敏感である。

【0104】

逆に、本発明に係るシステムの場合、ＰＣＲミックスはマイクロ流体チップのインジェクターに近接したローディングウェル内に沈む。したがって、ミックス位置は傾斜の影響を受け難く、ミックスピペッティング後の検査は不要である。したがって、チップローディングが容易になる。

【0105】

さらに、密度比の反転により、ＰＣＲミックスも蒸発から保護されるため、チップローディングと処理との間の操作時間を延長することができ、シーリングオイルを分注する補助工程を省くことができる。これはまた、サンプルの無駄を防ぎ、デッドボリュームを最小化するための大きな改善でもある。

【0106】

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとしていかなる意味においても解釈されるべきではない。

【実施例】

【0107】

［材料および方法］
（実施例１および２で使用したプロトコル）
・試薬である、ＰＣＲミックス（バッファＡとＢ）、オリゴマスターミックス、Ｈ_２Ｏ、およびＤＮＡストックを解凍する。
・各チューブを十分にボルテックスし、少なくとも１０秒間遠心する。
・以下のミックスを調製する。

【0108】

３つのＯｐａｌチップを使用し、３色ランの４８の反応物には以下の設定を使用する。各反応の条件が確実に等しくなるように、４８サンプルすべてのＰＣＲミックスをバッチ混合で設定する。

【0109】

【表1】

【0110】

・反応ミックスをボルテックスし、遠心分離する。
・各入口ポートにおいて７μＬのＯｐａｌチップを使用する。
・「Ｏｐａｌテンプレート＿ＰＣＲ＿４５サイクル」プログラムを使用して、ｎａｉｃａ（登録商標）ジオード（Geode）で使用する。
・Ｐｒｉｓｍ３リーダーでチップを読みとる。
・Crystal Minerでデータを開き、３つのチャネルすべてでクラスター分離を確認し、試験した界面活性剤／オイル混合物のｄＰＣＲでの使用適合性を評価するための他の基準もすべて確認する。

【0111】

（実施例３で使用したプロトコル：３－プレックスアッセイ）
・試薬である、ＰＣＲミックス（バッファＡとＢ）、オリゴマスターミックス、Ｈ_２Ｏ、およびＤＮＡストックを解凍する。
・各チューブを十分にボルテックスし、少なくとも１０秒間遠心する。
・以下のミックスを調製する。

【0112】

３つのＯｐａｌチップを使用し、３色ランの４８の反応物には以下の設定を使用する。各反応の条件が確実に等しくなるように、４８サンプルすべてのＰＣＲミックスをバッチ混合で設定する。

【0113】

【表2】

【0114】

・反応ミックスをボルテックスし、遠心分離する。
・各入口ポートにおいて５μＬのＯｐａｌチップを使用する。
・ＰＣＲ４５サイクルプログラムを使用して、ｎａｉｃａ（登録商標）ジオードで使用する。
・Ｐｒｉｓｍ３リーダーでチップを読みとる。
・Crystal Minerでデータを開き、３つのチャネルすべてでクラスター分離を確認し、試験した界面活性剤／オイル混合物のｄＰＣＲでの使用適合性を評価するための他の基準もすべて確認する。
・定量性および分離性のデータをエクセルファイルでエクスポートする。

【0115】

（実施例３で使用したプロトコル：６－プレックスアッセイ）
・試薬である、ＰＣＲミックス（バッファＡとＢ）、オリゴマスターミックス、Ｈ_２Ｏ、およびＤＮＡストックを解凍する。
・各チューブを十分にボルテックスし、少なくとも１０秒間遠心する。
・以下のミックスを調製する。

【0116】

３つのＯｐａｌチップを使用し、６色ランの４８の反応物には以下の設定を使用する。各反応の条件が確実に等しくなるように、４８サンプルすべてのＰＣＲミックスをバッチ混合で設定する。

【0117】

【表3】

【0118】

・反応ミックスをボルテックスし、遠心分離する。
・各入口ポートにおいて５μＬのＯｐａｌチップを使用する。
・ＰＣＲ４５サイクルプログラムを使用して、ｎａｉｃａ（登録商標）ジオードで使用する。
・Ｐｒｉｓｍ６リーダーでチップを読みとる。
・Crystal Minerでデータを開き、３つのチャネルすべてでクラスター分離を確認し、試験した界面活性剤／オイル混合物のｄＰＣＲでの使用適合性を評価するための他の基準もすべて確認する。
・定量性および分離性のデータをエクセルファイルでエクスポートする。

【0119】

［結果］
（実施例１：液滴分析）
ＰＣＲ実験の最初の設定において、８つの異なる界面活性剤をデカメチルテトラシロキサン中５％ｗ／ｗの濃度で使用した。

【0120】

各界面活性剤につき４チャンバー（４回の繰り返し）について得られた結果を以下の表に示す。

【0121】

【表4】

【0122】

試験した他の界面活性剤と比較して、ABE 3642は、液滴数および分析される量が有利に増加させた。２番目の実験セットでは、参照とするABE 3642とともに、３つの新規の界面活性剤が、デカメチルテトラシロキサン中１％ｗ／ｗ（以下に詳述）で、前述で使用された同じ手順に従ってスクリーニングされた。

【0123】

各界面活性剤につき１６チャンバー（１６回の繰り返し）について得られた結果を以下の表に示す。

【0124】

【表5】

【0125】

最良の結果が得られたのはABE 3642であり、これは最も多くの液滴を得ることができるため、分析される量も最も多くなる。Silube J208-812およびSilube T310-A16も安定した油中水滴の生成に好適である一方、CMS-222では１％ｗ／ｗでも０．１％ｗ／ｗでも安定した液滴は観察されなかった。

【0126】

CMS-222は、下記式で表されるシロキサンブロック共重合体である。この界面活性剤では安定した液滴を得ることができない。

【化56】

【0127】

理論に束縛されることを望むものではないが、本発明に係る界面活性剤内の［Ｂ］ブロックのポリエチレングリコール鎖は、液滴が互いに接触するときに混合および合体することを防止するための重要なパラメーターであり、したがって他の界面活性剤と比較して液滴数および分析される量を増加させるための重要なパラメーターであるという仮説が成り立つ。本発明に係る界面活性剤内の［Ａ］ブロックのアルキル鎖は、潜在的に、液滴が互いに接触するときに混合および合体することを防止するための重要なパラメーターでもあり、したがって、他の界面活性剤と比較して液滴数および分析される量を増加させるための重要なパラメーターでもある。

【0128】

ブロック［Ａ］の界面活性剤の重量割合が界面活性剤の２０重量％～４０重量％の範囲にあり、ブロック［Ｂ］の界面活性剤の重量割合が界面活性剤の３重量％～１０重量％の範囲にある場合に、最良の結果が得られた。

【0129】

（実施例２：界面活性剤濃度）
ＡＢＥ ３６４２界面活性剤は、Ｏｐａｌチップにおいてデカメチルテトラシロキサン中０．０５％～１０％の濃度範囲で試験した。

【0130】

【表6】

【0131】

２Ｄ単分子層の安定性は、界面活性剤濃度が０．５％ｗ／ｗ以上（上表に記載）のときに観察されるが、５％ｗ／ｗを超える濃度は生体適合性に有害である可能性がある（界面活性剤濃度が高過ぎることによりＰＣＲが阻害される可能性がある）。

【0132】

（実験例３：分子生物学的適合性実験）
液滴数に加えて、ｄＰＣＲによる定量精度、および、異なる集団間の蛍光シグナルの分離可能性も評価した。これらの実験はすべて、デカメチルテトラシロキサン中１％（ｗ／ｗ）のＡＢＥ ３６４２を使用して行った。

【0133】

定量精度は、フッ素系ケミストリーで満たされたＯｐａｌチップによって得られた結果との比較によって直接評価した。

【0134】

各チャネルについて、ネガティブである液滴（negative droplet）とポジティブである液滴（positive droplet）との間に満足のいく分離性が観察された（ｎａｉｃａ（登録商標）Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｕｉｔｅのCrystal Minerソフトウェアによって計算された分離性指標＞４）。フッ素系化合物で満たされたチップで得られた基準濃度と比較して、定量のずれは観察されなかった。

【0135】

上述の３－プレックスアッセイに加えて、６－プレックスアッセイも実施し、オイル／界面活性剤混合物と他の生物学的対象物との適合性を確認した。この６－プレックスアッセイでは、Phage Lambda（青色チャネル）、PhiX174（青緑色チャネル）、pUC18 MCS L1（緑色チャネル）、pBR 322（黄色チャネル）、Entero Cloaca（pUC57をベースにしたカスタムプラスミド、赤色チャネル）、およびALB（赤外線チャネル）を使用した。定量精度は、標的濃度との比較により評価した。

【0136】

６つのチャネルすべてについて、ネガティブである液滴とポジティブである液滴との間に十分な分離性が観察された（分離性＞４）。目標濃度と比較して、定量のずれは観察されなかった。

【0137】

（実施例４：チップローディングとチップ処理との間の使用時間の評価）
フッ素系システム（Ｏｐａｌチップ）およびケイ素系システム（ＤＭＳ－Ｔ０１．５中の１％のＡＢＥ ３６４２）の比較試験を行い、チップローディングと処理との間のインキュベーション時間の影響を評価した。このために、各チップのチャンバーにＰＣＲ混合物を２分間隔でロードし、最初にロードしたチャンバーではチップロードとＰＣＲとの間に２６分間のインキュベーションを行い、最後にロードしたチャンバーでは直ちにＰＣＲを行った。化学システムあたり２つのチップを、３－プレックスアッセイ検証および実施例３に記載された関連プロトコルで処理した。

【0138】

フッ素系システムでは、注入前のＰＣＲの蒸発によると思われるが、インキュベーション時間により算出された濃度において明らかな増加が観察されたのに対し、ケイ素系システムでは算出された濃度は安定したままであった（すなわち、フッ素系システムでは２６分後に緑チャネルで２５％の増加が観察されたが、ケイ素系システムではずれは観察されなかった）。

【0139】

フッ素系システムとの比較研究に加え、ケイ素系システム（ＤＭＳ－Ｔ０１．５中のＡＢＥ ３６４２ １％）を使用して、チップローディングとＰＣＲとの間のインキュベーション時間の延長について評価した。チップは同時にロードされ、室温で６時間または１０時間インキュベートした後にｄＰＣＲで処理された。算出された濃度の変化を、ロードした直後にチップを処理したときの結果と比較して評価した。これらの試験には、３－プレックスバリデーションアッセイ、および、実施例３で記載した関連プロトコルも使用した。

【0140】

２４チャンバーについて結果が得られた。液滴が１０Ｋ未満のチャンバーは分析前に除外した。

【0141】

【表7】

【0142】

チップローディングおよびｄＰＣＲ処理の間、室温で６時間および１０時間インキュベートした後、３つのチャネルで定量において１０％未満のわずかなずれが観察された。

【0143】

これらの結果は、本発明に係るケイ素系ケミストリーシステムにより、チップローディングおよび処理の間の操作時間を、従来技術のフッ素系システムとは反対に延長できることを立証している。

【国際調査報告】