特表 2024-545833 コロナウイルス科ウイルスによる感染症の処置または予防のためのウイルス様粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-13

(54)【発明の名称】コロナウイルス科ウイルスによる感染症の処置または予防のためのウイルス様粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20241206BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241206BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241206BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20241206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241206BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241206BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61P31/14

A61K39/00 G

A61K48/00

A61K39/00 B

A61K39/215

A61P43/00 121

C12N7/01 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024514081

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-08

(86)【国際出願番号】 EP2022074302

(87)【国際公開番号】W WO2023031322

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】21306199.7

(32)【優先日】2021-09-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518095998

【氏名又は名称】ソルボンヌ ユニヴェルシテ

(71)【出願人】

【識別番号】518095987

【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル （アンセルム）

(71)【出願人】

【識別番号】507139834

【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリック－オピト ドゥ パリ

(71)【出願人】

【識別番号】524078653

【氏名又は名称】コンセホ ナシオナル デ インベスティガシオネス シエンティフィカス イ テクニカス （コニセット）

(71)【出願人】

【識別番号】524078066

【氏名又は名称】ウニベルシダッド カトリカ デ コルドバ （ウセセ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クラッツマン、ダヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ルハン、ウーゴ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA45

4C084AA13

4C084MA52

4C084MA59

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC751

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG08

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA52

4C087MA59

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、新しいウイルス様粒子（ＶＬＰ）、該ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬学的組成物、およびコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによる感染症を予防または処置するために該ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用する方法に関する。有利には、これらのＶＬＰは、経口または経鼻投与されるワクチンとして使用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、少なくとも：
－ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）種、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）種、ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）種およびエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）種からなる群において選択される微生物の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片と、
－コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質またはその断片と
をその表面にディスプレイする、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

【請求項2】

前記微生物が、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ヨツヒメゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＶＬＰ。

【請求項3】

前記ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片、好ましくは前記ＶＳＰの細胞外領域が、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）の膜貫通領域と融合されている、請求項１または２に記載のＶＬＰ。

【請求項4】

前記コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスが、コロナウイルスであり、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項5】

前記ウイルスタンパク質が、スパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質からなる群から選択され、好ましくはＳタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項6】

前記ＶＬＰが、
‐ ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）のＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片と、
‐ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはその断片と
をその表面にディスプレイする、請求項１～５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項7】

前記ＶＬＰが、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス由来の、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の前記Ｎタンパク質またはその断片に、そのカルボキシ末端が融合したＧａｇタンパク質をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項8】

Ｓタンパク質が融合前に安定化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項9】

前記ＶＬＰが、その表面に少なくとも２つの異なるウイルスタンパク質、好ましくはＳタンパク質およびＭタンパク質をディスプレイする、請求項１～８のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項10】

医薬として使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項11】

コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）からのウイルスによる感染症の処置または予防において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項12】

コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）からのウイルスによる感染症に対するワクチンとして使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項13】

前記ＶＬＰが患者／患畜に経口または鼻腔内投与される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用のためのＶＬＰ。

【請求項14】

前記ＶＬＰが、前記コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）からのウイルスに対する、皮下または筋肉内注射によってワクチンを以前に受けたことがある患者／患畜への追加免疫として投与される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の使用のためのＶＬＰ。

【請求項15】

請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新しいウイルス様粒子（ＶＬＰ）、該ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬学的組成物、およびコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによる感染症を予防または処置するために該ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用する方法に関する。有利には、これらのＶＬＰは、経口または経鼻投与されるワクチンとして使用され得る。

【背景技術】

【0002】

２０１９年以前には、６つのコロナウイルス－ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）のみが、ヒトにおいて病気を引き起こすことが知られていた。

【0003】

２０１９年に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）がパンデミックとして出現し、２０１９年１２月から２０２１年６月までの間に世界中で３９０万人を超える命を奪い、約１億８０００万の症例が確認された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに重症疾患を引き起こす傾向があるベータコロナウイルスであり、これが、致死的となり得る肺炎を含む呼吸器感染症の巨大で急速に拡散する大流行の理由である。

【0004】

ＣＯＶＩＤ－１９に対するいくつかの異なるワクチンが短期間で開発され、２０２１年初頭に入手可能となった。しかしながら、世界中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多くの変異体が急速に出現したため、ワクチン接種された集団において誘導される免疫応答の質および持続性を改善する必要性が依然として存在する。特に、効率的な細胞性および／または液性免疫応答、特に粘膜応答などの強固な免疫応答を生成する方法がなお必要とされている。

【0005】

さらに、今日利用可能なＣＯＶＩＤ－１９に対するすべてのワクチンは注射によって送達され、安全性、患者の受容性および罹病の問題を引き起こし、特に資源の乏しい発展途上国において、集団予防接種の費用を増大させ、安全性を低下させる。したがって、特に経口投与によるワクチン接種の簡単な方法が、なお真に必要とされている。実際、経口送達は、他の投与経路を上回る、特に非経口ワクチンと比較した多くの顕著な利点（例えば、簡単な投与および改善された安全性）を提供する。しかしながら、経口経路がワクチンを送達する理想的な手段であるとしても、経口経路は、消化管によってもたらされる多数の障壁のために最も困難でもある。タンパク質ワクチンによる効果的な免疫化を可能にするためには、抗原を保護し、取り込みを増強し、免疫応答を活性化しなければならない。最近、本発明者らは、原虫の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）ならびにインフルエンザウイルスヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼなどのモデル表面抗原をディスプレイする経口投与された生物工学的に作製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、マウスをインフルエンザ感染から防御する免疫応答を生成し得ることを示した（Ｓｅｒｒａｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：３６１（２０１９））。しかしながら、今日まで、ＣＯＶＩＤ－１９に対する経口ワクチンは入手可能でない。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、その表面に原虫の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）およびコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのポリペプチド抗原をディスプレイする新しいウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供することによって、上記のニーズを満たすと考えられる。

【0007】

予測不能なことに、各ＶＳＰ／エンベロープタンパク質の組み合わせは、免疫原としてのそれらの性能に影響を及ぼし得る独自の構造的特殊性を有するので、本発明者らは、経口または経鼻投与などの粘膜経路を介して、強固な免疫応答を誘導するために、またはコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスに対する以前に誘導された免疫応答を増強するために、このようなＶＬＰを使用することができることを示した。さらに、驚くべきことに、本発明者らは、このアプローチが粘膜免疫を誘導することができ、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および拡散を制御するのに特に有用であることを示した。

【0008】

したがって、一局面において、本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、特にレトロウイルス由来のウイルス様粒子であって、少なくとも：
－ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）およびエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）の種からなる群において選択される微生物の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片と、
－コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質またはその断片と
をその表面にディスプレイするウイルス様粒子（ＶＬＰ）、特にレトロウイルス由来のウイルス様粒子に関する。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語は、ウイルスの立体構造を模倣する、ウイルス粒子に似た構造体を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの全部または一部を欠いており、典型的にはおよび好ましくは、ウイルスゲノムの複製および感染成分の全部または一部を欠いているので、非複製的である。本明細書で使用される「非複製的」という用語は、ＶＬＰ中に含まれるまたはＶＬＰ中に含まれないゲノムを複製することができないことを指す。ＶＬＰは、一般に１つまたは複数のウイルスタンパク質から構成される多タンパク質構造体である。ＶＬＰは、適切な状況下でウイルス構造タンパク質の発現時に形成（または「自己集合」）することができる。ＶＬＰは、産生プロセス中に生ウイルスが存在する必要なしに産生され得るので、弱毒化ウイルスを使用して調製されたワクチンの欠点のいくつかを克服する。多種多様なＶＬＰを調製することができる。例えば、エンベロープタンパク質および／または表面糖タンパク質ありまたはなしのいずれかで、単一または複数のカプシドタンパク質を含むＶＬＰを産生することができる。いくつかの事例では、ＶＬＰはエンベロープに包まれておらず、ただ１つの主要なカプシドタンパク質の発現によって集合する。他の事例では、ＶＬＰはエンベロープに包まれており、対応する天然ウイルスに見られる複数の抗原タンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、典型的には、それらの対応する天然ウイルスに類似しており、多価抗原をディスプレイすることができる。

【0010】

ＶＬＰの状況での表面糖タンパク質の提示は、他の形態の抗原提示、例えばＶＬＰと会合していない可溶性抗原と比較して、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質などの抗原タンパク質に対する中和抗体の誘導にとって有利である。中和抗体は、ほとんどの場合、三次構造または四次構造を認識し、これは、多くの場合、エンベロープ糖タンパク質のような抗原タンパク質をそれらの天然のウイルス立体構造で提示することを必要とする。ＶＬＰの表面におけるエンベロープ糖タンパク質の適切な提示は、ほとんど予測不能である。いくつかのエンベロープ糖タンパク質は、それらの膜および／または細胞質尾部を別のウイルスタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）のものと交換するなど、より良好な発現のためにそれらの操作を必要とし得る。しかしながら、野生型ウイルスにおいてエンベロープが多量体として発現される場合、これは、タンパク質の構造、特にその四次構造に影響を及ぼし得る。さらに、同じ膜上へのＶＳＰとエンベロープ糖タンパク質の同時発現は、エンベロープ糖タンパク質の構造を改変し、したがって中和抗体（Ｎａｂ）の引き金を引くその能力を改変する相互作用をもたらし得る。

【0011】

本明細書で使用される場合、「可変表面タンパク質」、「ＶＳＰタンパク質」または「ＶＳＰ」という用語は、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）寄生生物の表面全体を覆い、宿主免疫系によって認識される主要抗原であるポリペプチドを指す。ＶＳＰタンパク質は、いくつかのＶＳＰにおいてＣＸＣモチーフ、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）特異的ジンクフィンガーモチーフ、およびＧＧＣＹモチーフの存在を含むいくつかの特定の特徴を有する複数の「ＣＸＸＣ」モチーフ（Ｘは任意のアミノ酸である）を有するシステインに富むタンパク質である（Ｎａｓｈ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：５８５－５９０（２００２）；Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：４２４（２０１０））。より正確には、ＶＳＰタンパク質は、サイズが２０から２００ｋＤａまで変化する１型膜内在性タンパク質であり、可変アミノ末端システインリッチ領域（宿主／寄生生物界面に相当し、タンパク質消化および低ｐＨに対する耐性をタンパク質に付与する細胞外ドメイン）と、疎水性膜貫通領域および免疫系によって検出されない５アミノ酸のみを含む短いサイトゾル尾部（ＣＲＧＫＡ）を含む保存されたカルボキシ末端領域とを有する。１つのＶＳＰタンパク質のみが、各寄生生物の表面上で、任意の与えられた時間に発現される（Ｎａｓｈ，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５２：１３６９－１３７５（１９９７））。ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰ、より具体的にはジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの細胞外ドメインは、複数のＣＸＸＣモチーフ、好ましくは３～２０アミノ酸、より具体的には５～８アミノ酸のいくつかのアミノ酸によって隔てられた複数のＣＸＸＣモチーフを含む。したがって、いくつかの態様において、ＶＳＰは、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）由来のＶＳＰまたはＶＳＰ様タンパク質の断片、類似体または誘導体であり、ＶＳＰは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のＣＸＸＣモチーフを含む。いくつかの態様において、ＶＳＰは、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰ由来の少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも８０、約９０または少なくとも約１００個のＣＸＸＣモチーフを含む。

【0012】

本発明の文脈内で、「可変表面タンパク質」、「ＶＳＰタンパク質（ＶＳＰ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＶＳＰタンパク質（ＶＳＰ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という用語は、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰタンパク質、特にランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）の完全なレパートリーの任意のＶＳＰを含む。実際には、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）寄生生物は、集合体ＡのＶＳＰをコードする約２００の遺伝子のレパートリーをコードし（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７：１９２１－１９２６（２０１０）；Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：４２４（２０１０）を参照）、Ｓｖａｒｄのグループの２つの報告は、ＶＳＰ集合体ＢおよびＥに由来する分離株のＶＳＰレパートリーを記載した（Ｊｅｒｌｓｔｒｏｍ－Ｈｕｌｔｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：５４３（２０１０）；Ｆｒａｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．５（８）：ｃｌ０００５６０（２００９））。ＶＳＰの細胞外ドメインは、寄生生物が上部小腸の厳しい環境を生き残ることを可能にする。ＶＳＰは、可変なｐＨ（特定のＶＳＰに対して作られたモノクローナル抗体による立体構造エピトープに対する反応性は、ｐＨ２～１２で不変である）、ならびにトリプシンおよびいくつかの他のプロテアーゼによる消化に対して極めて耐性である。さらに、ＶＳＰは、腸粘膜に付着した状態を保つ（Ｒｉｖｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（５）：５５１－７（２０１０））。

【0013】

ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰまたは他の微生物のＶＳＰ様タンパク質などの、少なくとも１つのＣＸＸＣモチーフ（Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドはまた、遺伝子操作によってインビトロで生成され、異種の系で産生され得ることにさらに留意しなければならない。したがって、野生型寄生生物には見られないアミノ酸変異を有するポリペプチド（例えば、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの変異体）を含む、化学的にまたは細胞産生されたポリペプチドが包含される。したがって、ＶＳＰは、固相合成、液相合成または遺伝子工学などの当技術分野における任意の周知の手順によって調製され得る。

【0014】

本発明において使用されるＶＳＰは、化学修飾を受けることができる。化学修飾は、インビボでの酵素分解に対する保護が増加した、および／または膜バリアを横切る能力が増加したＶＳＰを得、それにより、ＶＳＰの半減期を増加させ、ＶＳＰの生物学的活性を維持または改善することを目的とし得る。ＶＳＰを修飾するために、当技術分野で公知の任意の化学修飾を本発明に従って使用することができる。このような化学修飾には、以下のものに限定されないが、以下のものが含まれる。
（ａ）例えば、Ｎ末端アシル化（好ましくはアセチル化）もしくは脱アミノ化、またはＣ末端カルボキシル基のアミドもしくはアルコール基への修飾などの、ＶＳＰタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端への修飾；（ｂ）２つのアミノ酸間でのアミド結合における修飾：２つのアミノ酸を連結するアミド結合の窒素原子またはアルファ炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）；
（ｃ）例えば、２つのアミノ酸を連結するアミド結合のアルファ炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）などの、２つのアミノ酸を連結するアミド結合のアルファ炭素における修飾。
（ｄ）例えば、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸（Ｌエナンチオマー）を対応するＤ－エナンチオマーで置き換えることなどの、キラリティの変化；
（ｅ）（Ｃ末端からＮ末端への）アミノ酸鎖の反転と一緒に、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸（Ｌ－エナンチオマー）が対応するＤ－エナンチオマーと置き換えられるレトロインバージョン；および／または
（ｆ）１つまたは複数のアルファ炭素が窒素原子で置き換えられているアザペプチド。

【0015】

本明細書で使用される「可変表面タンパク質」、「ＶＳＰタンパク質」または「ＶＳＰ」という用語は、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）由来の「ＶＳＰ」タンパク質、他の生物に見出されるＶＳＰおよびＶＳＰ様タンパク質のホモログ（例えば、オルソログおよびパラログ）ならびにそれらの断片、変異体および誘導体も含む。第１の科または種のＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子に関して使用される「ホモログ」という用語は、機能的、構造的またはゲノム分析によって、第１の科または種の元のＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子に対応する第２の科または種のＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子であると決定された、第２の科または種の別個のＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「ホモログ」という用語は、共通の祖先ＤＮＡ配列から受け継がれた基準ＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子に関連する任意のＶＳＰタンパク質またはＶＳＰコード遺伝子を指す。ホモログという用語は、オルソログおよびパラログの両方を含む。「オルソログ」という用語は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種のＶＳＰホモログを指す。典型的には、オルソログは、それらの一次構造の相違（変異）にもかかわらず、同じまたは類似の機能を保持する。「パラログ」という用語は、共通の祖先遺伝子の遺伝的重複によって進化した同じ種内のＶＳＰホモログを指す。多くの場合、パラログは関連する機能を示す（が、必ずしも同一の機能を示さない）。特定の種が、別の種と共有される祖先ＤＮＡ配列から複数の関連遺伝子を進化させている限りにおいて、オルソログという用語はパラログという用語を包含することができる。ほとんどの場合、ホモログは、機能的、構造的またはゲノム類似性を有する。遺伝子プローブおよびＰＣを使用して、酵素または遺伝子のホモログを容易にクローニングすることができる技術は公知である。クローニングされた配列のホモログとしての同一性は、機能的アッセイを使用して、および／または遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。

【0016】

「ＶＳＰ様タンパク質」またはその断片は、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）と配列相同性および生化学的特性を共有するジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）以外の微生物に由来するポリペプチド、特に複数のＣＸＸＣモチーフ、好ましくは５～８つのアミノ酸によって隔てられた複数のＣＸＸＣモチーフを含有するポリペプチドの中から選択され得る。実際、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰ配列の細胞外ドメイン（クエリ）と他のＶＳＰ様分子配列のアラインメントによって、ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）およびエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）の種に属するタンパク質中に、とりわけ５～８つのアミノ酸によって隔てられた複数のＣＸＸＣモチーフの存在が観察された。したがって、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）の種の表面キナーゼ、ならびにゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）の種およびテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の種の表面タンパク質の一次配列の代表的な断片は、（ｐＨ、温度およびタンパク質消化に対する耐性を担うジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰと比較して）ＶＳＰ様構造中の、ＣＸＸＣモチーフを含有する保存されたドメインを予測する。

【0017】

本発明において、「ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）」、「テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）」、「ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）」および「エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）」という用語は、微生物の属を指し、それらの各々は、異なる宿主に感染すると思われる様々な種を含む。例えば、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）は、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）（腸鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）または十二指腸鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）とも呼ばれる）、ジアルジア・エンテリカ（Ｇｉａｒｄｉａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ジアルジア・ムリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｍｕｒｉｓ）、ジアルジア・シモンジ（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｉｍｏｎｄｉ）、ジアルジア・ボビス（Ｇｉａｒｄｉａ ｂｏｖｉｓ）、ジアルジア・カニス（Ｇｉａｒｄｉａ ｃａｎｉｓ）、ジアルジア・キャティ（Ｇｉａｒｄｉａ ｃａｔｉ）およびジアルジア・ミクロチ（Ｇｉａｒｄｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含むが、これらに限定されない。

【0018】

一態様において、本発明は、微生物がランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ヨツヒメゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）および赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0019】

一態様において、微生物は、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）である。別の態様において、微生物は、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）である。別の態様において、微生物は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）である。別の態様において、微生物は、ヨツヒメゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）である。

【0020】

本明細書で使用される場合、「タンパク質の断片」という用語は、一般に、本用語がＶＳＰまたはウイルスタンパク質を指すかどうかにかかわらず、任意の指定されたタンパク質またはポリペプチドの少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の連続するまたは不連続なアミノ酸を含む任意のポリペプチドを包含する。「タンパク質の断片」という用語が本発明に従って抗原に適用される場合には、そのような断片は、インビボで抗体の産生またはＴ細胞の刺激を誘導することが可能であるべきである。したがって、タンパク質の断片は、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むべきである。「タンパク質の断片」という用語が、本発明に従って、他の微生物のＶＳＰまたはＶＳＰ様タンパク質に適用される場合には、そのような断片は、細胞、特に粘膜細胞、より具体的には腸の上皮細胞に付着し、最終的にそれ自体で免疫応答を誘導する能力を保持することが可能であるべきである。

【0021】

好ましい態様において、（細胞外ドメインは、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰタンパク質の複数のＣＸＸＣモチーフを含むアミノ末端のシステインリッチ領域であるので）ＶＳＰは、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの細胞外ドメインまたはその断片である。実際、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの細胞外ドメインは、ｐＨ、温度およびタンパク質消化に耐性のドメインである。したがって、別の好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの細胞外ドメインまたはその断片のみを含む。したがって、このような態様においては、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの膜貫通領域および細胞質尾部は排除される。ペプチドシグナルも除去され得ることに留意されたい。

【0022】

一態様において、本発明は、上で定義されたＶＬＰであって、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、ＶＬＰに関する。

【0023】

特定の態様において、本発明は、上で定義されたＶＬＰであって、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、ＶＬＰに関する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0024】

本発明において、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片は、ＶＬＰの表面に露出されている。これに関して、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片は、エンベロープタンパク質もしくはその断片、合成リンカーなどの様々な構造への結合を通じて、または抗体を含む化学反応もしくは酵素反応を通じて露出され得る。

【0025】

一態様において、ＶＬＰは、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片に融合されたエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含むエンベロープタンパク質をディスプレイする。

【0026】

一態様において、ＶＬＰは、例えばＶＳＶエンベロープタンパク質またはその断片との遺伝的または化学的融合によって、ＶＬＰの表面に露出されたＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片と融合した、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のエンベロープタンパク質またはその断片（例えば、ＶＳＶ Ｇ糖タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域および／または細胞質尾部（ＣＴ））などのウイルスのエンベロープタンパク質をディスプレイする。

【0027】

一態様において、本発明は、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片、好ましくはＶＳＰの細胞外領域がＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質の膜貫通領域と融合されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0028】

一態様において、ＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片は、配列番号１２５を含むかまたは配列番号１２５からなる。

【表2】

【0029】

一態様において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科ウイルスのウイルスタンパク質またはその断片がＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質の膜貫通領域と融合されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0030】

別の特定の態様において、エンベロープは官能化されていてもよく、それにより、共有結合または非共有結合相互作用を通じた、エンベロープへの関心対象の任意の選択された分子の結合が可能になる。官能化されたエンベロープは、リンカーを含み得、リンカーは、関心対象の任意の選択された分子の（特異的な）結合を可能にする。一例として、エンベロープはアビジンまたはビオチン部分を含み得、アビジンまたはビオチン部分への分子の特異的結合を可能にする。

【0031】

真核細胞中でのカプシドタンパク質Ｇａｇの発現が、ゲノムを含まないレトロウイルス粒子を生成するのに十分である。一態様において、ＶＬＰは、レトロウイルスまたはレンチウイルスのＧａｇタンパク質（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）もしくはＨＩＶ Ｇａｇタンパク質、またはそれらの断片など）、さらにより好ましくは修飾されたレトロウイルスＧａｇタンパク質を含む。

【0032】

本発明において、ＶＬＰは、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質またはその断片をディスプレイする（すなわち、ＶＬＰの外面に含む）。

【0033】

実際、本発明のＶＬＰは、消化管において大規模な分解を受けることなく、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス由来の抗原タンパク質の、粘膜内への正しい送達を促進する。このウイルスタンパク質（またはその断片）は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスに対する免疫応答を誘導するための抗原として使用される。コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスには、レトウイルス亜科（ｌｅｔｏｖｉｒｉｎａｅ）およびオルトコロナウイルス亜科（ｏｒｔｈｏｃｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）が含まれる。レトウイルス亜科（ｌｅｔｏｖｉｒｉｎａｅ）には、アルパレトウイルス（ａｌｐａｌｅｔｏｖｉｒｕｓ）が含まれる。オルトコロナウイルス亜科（ｏｒｔｈｏｃｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）には、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルスおよびガンマコロナウイルスが含まれる。例えば、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９とも呼ばれる）を含む重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、中東呼吸器症候群関連（ＭＥＲＳ）コロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）およびこれらの変異体からなる群から選択され得る。

【0034】

一態様において、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスは、コロナウイルスであり、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１およびこれらの変異体からなる群から選択される。

【0035】

最も好ましい態様において、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体である。

【0036】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、多くの変異体を有する。ほとんどの変化は、ウイルスの特性にほとんどあるいは全く影響を有さない。しかしながら、いくつかの変化は、ウイルスがどの程度容易に広がるか、関連する疾患の重症度、または治療薬、診断ツールもしくはその他の公衆衛生および社会的手段の性能などの、ウイルスの特性に影響を及ぼし得る。

【0037】

一態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって名付けられた、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ、イータ、シータ、イオタおよびカッパ変異体を含む群から選択される。

【0038】

一態様において、本発明は、ウイルスタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質である、上で定義されたＶＬＰに関する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。

【0039】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（またはＳタンパク質）は、宿主細胞表面受容体ＡＣＥ２へのウイルス付着を媒介し、ウイルス膜と宿主細胞膜間での融合を補助することによってウイルス侵入を促進する。これは、最も露出されたおよび免疫原性のウイルスタンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク糖タンパク質は、２つのフューリン様プロテアーゼ切断部位を有する三量体高分子である。これらの部位の１つは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特徴的な多塩基性残基を有するＳ１サブユニットとＳ２サブユニットとの境界にある。他の切断部位は、Ｓ２サブユニット内に位置する。

【0040】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜糖タンパク質（またはＭタンパク質）は、β－コロナウイルス全体にわたって保存されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜糖タンパク質（またはＭタンパク質）は、三重膜貫通ドメインを有し、スパイクの設置を促進する。

【0041】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（またはＥタンパク質）は、β－コロナウイルス全体にわたって保存されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（またはＥタンパク質）は、五量体化して、ビロポリンと呼ばれる、膜を横切るイオン孔を形成する小さな膜内在性タンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（またはＥタンパク質）は、ウイルスの集合および放出に不可欠である。

【0042】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（またはＮタンパク質）は、感染の初期段階で発現され、最も豊富なタンパク質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（またはＮタンパク質）は、ウイルスＲＮＡに結合することによってリボ核タンパク質のコアを形成する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（またはＮタンパク質）は、ＲＮＡが細胞内に入り、細胞成分と相互作用するのを助ける。

【0043】

一態様において、本発明は、ウイルスタンパク質がＳタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質およびＮタンパク質、好ましくはＳタンパク質からなる群から選択される、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0044】

非限定的な例において、本発明は、
－Ｓタンパク質が、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなり、
－Ｍタンパク質が、配列番号１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、および
－Ｎタンパク質が、配列番号１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる
上で定義されたＶＬＰに関する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【0045】

一態様において、本発明のＶＬＰは、
－ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）のＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片、および
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはその断片
をその表面にディスプレイする。

【0046】

一態様において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質がグリコシル化されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0047】

一態様において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質であり、前記Ｓタンパク質がグリコシル化されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0048】

グリコシル化の調節は、免疫回避のために病原体によってしばしば利用される。「自己の」グリカンでタンパク質免疫原上のエピトープを覆い隠すことは、その下に存在するタンパク質表面を液性免疫監視から遮蔽することもできる。ウイルス抗原にグリコシル化を適用することは、抗体の結合エピトープ中にグリカンを組み込む広く中和する抗体の誘発を改善するための効率的な戦略である。

【0049】

一態様において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスタンパク質のウイルスタンパク質が融合前立体構造で安定化されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0050】

一態様において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのウイルスタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質であり、前記Ｓタンパク質が融合前立体構造で安定化されている、上で定義されたＶＬＰに関する。

【0051】

融合前立体構造にあるウイルスタンパク質は、ウイルスのエンベロープが、ウイルスが感染する細胞の膜と融合する前の立体構造状態にある。融合前安定化されたウイルスタンパク質は、それらの野生型対応物と比較して優れた免疫原であることが多い。さらに、融合前安定化は、おそらくは、より安定した融合後構造を採る傾向から生じる誤った折り畳みを防止することによって、ウイルス融合糖タンパク質の組換え発現を増加させる傾向がある。

【0052】

一態様において、本発明のＶＬＰは、少なくとも２つの異なるウイルスタンパク質、好ましくはＳおよびＭタンパク質をその表面にディスプレイする。

【0053】

一態様において、本発明のＶＬＰは、少なくとも３つの異なるウイルスタンパク質、好ましくはＳ、ＭおよびＮタンパク質をその表面にティスプレイする。

【0054】

一態様において、本発明のＶＬＰは、そのカルボキシ末端に、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス由来のさらなる抗原に融合したＧａｇタンパク質をさらに含む。一態様において、本発明のＶＬＰは、Ｇａｇタンパク質に融合されたＮタンパク質またはその断片をさらにディスプレイする。特定の態様において、Ｎの第１（ａａ５～１０２）および第２の半分（ａａ２４２～３５３）がＧａｇタンパク質に融合される。一態様において、本発明のＶＬＰは、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス由来の、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質またはその断片に、そのカルボキシ末端が融合されたＧａｇタンパク質をさらに含む。これは、融合されたＮタンパク質またはその断片に対するさらなる優れたＴ細胞応答を提供する。

【0055】

好ましい態様において、本発明のＶＬＰは、
－ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）のＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片、
－好ましくは融合前立体構造で安定化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはその断片、および
－場合により、Ｇａｇタンパク質に融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質またはその断片
を、その表面にディスプレイする。

【0056】

好ましい態様において、本発明のＶＬＰは、
－ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）のＶＳＰ、ＶＳＰ様タンパク質またはそれらの断片、
－好ましくは融合前立体構造で安定化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質またはその断片、
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質またはその断片、および
－場合により、Ｇａｇタンパク質に融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質またはその断片
を、その表面にディスプレイする。

【0057】

本発明のＶＬＰに対して上で与えられたすべての態様および特徴は、前記ＶＬＰを含む以下に記載される本発明の他の局面に準用される。

【0058】

別の局面において、本発明は、上で定義されたＶＬＰを有効成分として含む薬学的組成物に関する。

【0059】

一態様において、本発明の薬学的組成物はワクチンである。

【0060】

一態様において、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。

【0061】

「薬学的に許容され得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与したときに有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容され得る賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を指す。

【0062】

このような薬学的に許容され得る賦形剤には、水、塩、緩衝剤、アジュバント、担体または組成物の有効性を改善するために望ましい他の物質が含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物の調製における使用に適した薬学的材料の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（１９９０））を含む多数の情報源に提供されている。

【0063】

さらに、薬学的組成物は、追加のアジュバントまたは免疫原性もしくは生物学的に活性な作用物質を含み得る。例えば、薬学的組成物は、アルミニウム、特にリン酸アルミニウム、ＡＳ０３、ＭＦ５９およびＡＳ０４から選択されるアジュバントをさらに含むことができる。

【0064】

しかしながら、本発明の有利な特徴は、アジュバントの非存在下でさえ、組成物の高い免疫原性であるので、他の態様において、薬学的組成物はアジュバントを欠いている。アジュバントの非存在は、さらに、ワクチン接種における安全上の懸念を表す望ましくない炎症性Ｔ細胞応答の発生を最小限に抑える。

【0065】

本発明の薬学的組成物は、好ましくは経口投与または粘膜投与のために製剤化される。経口投与または粘膜投与のために使用される用量は、様々なパラメータの関数として、特に関連する病態の様式の関数として、または処置の所望の期間の関数として適合させることができる。薬学的組成物は、任意の適切な粘膜に投与され得、投与には、（消化器系の粘膜を介した）経口投与、経鼻投与、経膣投与、舌下投与、眼投与、直腸投与、泌尿器（ｕｒｉｎａｌ）投与、乳房内（ｉｎｔｒａｍａｍｍａｌ）投与、肺投与、耳投与（すなわち、耳を介して）および頬側投与、好ましくは頬側投与または舌下投与（口腔粘膜投与）が含まれる。好ましい態様において、薬学的組成物は、経口または経鼻投与用に製剤化される。

【0066】

製剤化されると、薬学的組成物は、投与製剤と適合する様式で、および治療上有効な量で投与される。製剤は、例えば経口投与または粘膜投与のための錠剤または他の固体の種類、徐放カプセル；および現在使用されている任意の他の形態などの様々な剤形で容易に投与される。したがって、薬学的組成物は、スプレー、エアロゾル、混合物、懸濁液、分散液、エマルジョン、ゲル、ペースト、シロップ、クリーム、軟膏、インプラント（耳、眼、皮膚、鼻、直腸および膣）、乳房内調製物、膣坐剤（ｖａｇｉｔｏｒｉｅｓ）、坐剤または子宮坐剤（ｕｔｅｒｉｔｏｒｉｅｓ））の形態であり得る。ある態様において、リポソームの使用が企図される。リポソームの形成および使用は、当業者に公知である。

【0067】

より具体的には、薬学的組成物は、ＶＬＰ、特にその表面にディスプレイされているウイルスタンパク質が、必要に応じて上部消化管の酵素的および化学的分解に耐性であるように製剤化される。

【0068】

別の局面において、本発明は、医薬として使用するための上で定義されたＶＬＰに関する。

【0069】

本発明は、ウイルス感染症の予防および／または処置を必要とする対象におけるウイルス感染症の予防および／または処置の方法であって、有効量の上で定義されたＶＬＰを前記対象に投与する工程を含む、方法にも関する。

【0070】

本発明は、医薬の製造における上で定義されたＶＬＰの使用にも関する。

【0071】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類などの哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明による対象はヒトである。

【0072】

本発明の文脈において、本明細書で使用される「処置する」または「処置」という用語は、このような用語が適用される疾患もしくは感染症、またはこのような疾患もしくは感染症の１つもしくは複数の症候を元に戻し、緩和し、その進行を阻害し、または予防することを意味する。

【0073】

本発明の意味の範囲内で、疾患または感染症に関する「予防する」または「予防」という用語は、前記疾患または感染症の発生のリスクの減少を意味することを意図している。

【0074】

「有効量」は、対象に治療的または予防的利益を付与するために必要なＶＬＰの最小量を意図する。例えば、哺乳動物に対する有効量は、感染症症候、疾患進行または感染症に関連する生理的状態もしくは感染症に屈することへの耐性の改善を誘導し、改善し、またはその他引き起こすような量である。

【0075】

別の局面において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスによる感染症の処置または予防において使用するための上で定義されたＶＬＰに関する。

【0076】

本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスによる感染症の予防および／または処置を必要とする対象におけるコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスによる感染症の予防および／または処置の方法であって、有効量の上で定義されたＶＬＰを前記対象に投与する工程を含む、方法にも関する。

【0077】

本発明は、コロナウイルス科（コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスによる感染症を予防および／または処置するための医薬の製造における上で定義されたＶＬＰの使用にも関する。

【0078】

別の局面において、本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスによる感染症に対するワクチンとして使用するための上で定義されたＶＬＰに関する。

【0079】

本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスに対する対象のワクチン接種（または免疫化）の方法であって、有効量の上で定義されたＶＬＰを前記対象に投与する工程を含む方法にも関する。

【0080】

本発明は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスに対するワクチンの製造における、上で定義されたＶＬＰの使用にも関する。

【0081】

１つの好ましい態様において、薬学的組成物は粘膜経路によって投与される。

【0082】

一態様において、本発明のＶＬＰは、患者／患畜に経口投与または鼻腔内投与される。

【0083】

一態様において、本発明のＶＬＰは、皮下または筋肉内注射によって、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）のウイルスに対するワクチン、好ましくはアデノウイルスをベースとするワクチンを以前に受けたことがある患者／患畜に追加免疫として投与される。

【0084】

一態様において、本発明のＶＬＰは、患者／患畜に２回投与される。

【0085】

一態様において、本発明のＶＬＰは、患者／患畜に３回以上投与される。

【0086】

一態様において、患者／患畜は、本発明のＶＬＰの第１の投与および本発明のＶＬＰの第２の投与を受け、両投与は、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３～４週間間隔が空けられる。

【0087】

一態様において、ＶＬＰは、気道消化管の、特に気管支および肺胞中の粘膜表面による免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を誘導するために、患者／患畜に投与される。ＩｇＡの産生は、例に示されているように、気管支肺胞洗浄液中のＩｇＡを検出することにより測定することができる。

【0088】

以下の図面および例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。本発明の特定の態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得、均等物が置き換えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、方法、１つの方法工程または複数の方法工程を本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの修正が行われ得る。このような修正はすべて、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。

【図面の簡単な説明】

【0089】

【図1】マウスにおけるスパイクの異なる変異体の免疫原性。Ｓｗｔ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ野生型（元の武漢株Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿０４５５１２およびその変異体Ｄ６１４Ｇ）。Ｓｓｔ１：Ｓ人工サブタイプ１（Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、６８２ＲＲＡＲ－６８５ＧＳＡＳ（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ））。Ｓｓｔ２：Ｓ人工サブタイプ２（Ｔ７９１Ｃ／Ａ８７９Ｃ、６８２ＲＲＡＲ－６８５ＧＳＡＳ（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ））。Ｓｓｔ３：Ｓ人工サブタイプ３（Ｓ８８４Ｃ／Ａ８９３Ｃ、６８２ＲＲＡＲ－６８５ＧＳＡＳ（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ））。Ｓｓｔ４：Ｓ人工サブタイプ４（Ｇ８８５Ｃ／Ｑ９１３Ｃ、６８２ＲＲＡＲ－６８５ＧＳＡＳ（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ））。Ｓｓｔ５：Ｓ人工サブタイプ５（Ｓ８８４Ｃ／Ｑ９１３Ｃ、６８２ＲＲＡＲ－６８５ＧＳＡＳ（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ））。

【図2】ハムスターにおける異なるワクチン製剤の経口投与に対する血清抗体応答。

【図3】ハムスターにおける異なるワクチン製剤の筋肉内投与に対する血清抗体応答。

【図4】気管支肺胞洗浄ＩｇＡ応答。

【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入に対する中和抗体。

【図6】筋肉内にワクチン接種されたハムスターの経口追加免疫後の気管支肺胞ＩｇＡ。

【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で攻撃されたワクチン接種されたハムスター。

【実施例】

【0090】

例
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する熱安定的な、経口投与される、エンベロープに包まれたウイルス様粒子（ｅ－ＶＬＰ）ワクチンを設計および評価するために、以下の実験を実施した。

【0091】

ｅ－ＶＬＰは、強固な中和免疫応答を誘導するのに特に適している。実際、ｅ－ＶＬＰは、ｅ－ＶＬＰが由来する細胞と同じ脂質膜を有する。同様に、ＶＬＰが発現するウイルスエンベロープタンパク質は、感染した細胞の脂質膜上でウイルスエンベロープタンパク質が有するのと同じ立体構造、およびウイルス自体と同じ立体構造を有する。中和抗体（Ｎａｂ）の多くは、立体配置構造を標的とするので、ｅ－ＶＬＰはＮａｂ誘導に特に適している。さらに、ｅ－ＶＬＰは、腸内寄生生物であるランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）由来の可変表面タンパク質（ＶＳＰ）とともに利用することができ、ｅ－ＶＬＰに経口投与後の耐性を与える。

【0092】

Ｍ発現ありまたはなしで、様々な形態のＳタンパク質を発現するＶＳＰで装飾されたｅ－ＶＬＰ（ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰ）を作製し、試験した。予想外なことに、ＳおよびＭの融合前の安定化された形態を発現するＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは、マウスおよびハムスターにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強固な粘膜Ｎａｂを誘発し、これはウイルス攻撃からの完全な保護につながることが見出された。このようなワクチンは、初回－追加ワクチン戦略において、または効率的な同種追加免疫を許容しないプラットフォーム（アデノウイルスプラットフォームなど）をベースとする既存のワクチンおよび疾患の重篤な形態に対して非常に効率的であるが、感染症をもたらさないｍＲＮＡベースのワクチンに対する追加免疫として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する武器の一部となり得る。

【0093】

材料および方法
ウイルス。１ｍＬあたり０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１μｇのＬ－１－トシルアミド－２－フェニルエチルクロロメチルケトン処理されたトリプシンを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で、ＶｅｒｏＥ６細胞中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株を増殖させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いたすべての実験は、ＣＩＤＩＥ ＣＯＮＩＣＥＴ（アルゼンチン）のバイオセーフティレベル３（ＢＳＬ３）封じ込め実験室で、またはソルボンヌ大学（フランス）の強化されたＢＳＬ３封じ込め実験室で行われた。

【0094】

実験動物。免疫化実験および攻撃実験のために、以前の経験に基づいて群サイズを選択し、同じ性の同腹仔を無作為に割り当てた。各実験およびすべての手順のための動物の数は、実験動物の管理および使用に関する施設委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ）によって承認されたプロトコルに従った。群あたり１ヶ月齢の５匹の雌および５匹の雄のＳＰＦゴールデンシリアンハムスターを攻撃実験において使用し、群あたり６ヶ月齢の５匹の雌および５匹の雄のゴールデンシリアンハムスターを免疫化研究において使用した。攻撃実験のために、ケタミン－キシラジン麻酔下で、群あたり１０匹のハムスターに、鼻腔内経路を介して１０^５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１００μＬ中）またはＰＢＳ（モック）を接種した。感染前にベースライン体重を測定し、体重を２８日間監視した。動物は、採血中に危害を加えられなかった。

【0095】

中和アッセイ。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるマイクロ中和アッセイによって、ウイルス中和抗体価について、鼻腔内に接種されたハムスターから１４ｄｐｉに採取された血清を試験した。簡潔にまとめると、５０倍連続希釈された（１：５０～１：５０００）血清試料を１００ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞に添加し、３７℃で７２時間さらにインキュベートした。細胞傷害効果の５０％を阻害する最大希釈として、中和抗体価を定義した。

【0096】

ＶＬＰ発現プラスミド。ｐＧａｇについては、プラスミドｐＢＬ３６－ＨＣＶからの酵素消化によって、そのＣ末端Ｐｏｌ配列を持たないＭＬＶ ＧａｇのＧａｇカプシドタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＧ８．１）をコードするｃＤＮＡ配列を得て、ｐｈＣＭＶ発現ベクターにクローニングした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体については、ｃＤＮＡ配列もｐｈＣＭＶ発現ベクターにクローニングした。すべてのプラスミドを配列決定によって確認した。

【0097】

ＶＬＰの生成、生産、精製および検証。形質移入試薬としてＰＥＩを使用して、ｐＧａｇ、ｐＧａｇ－Ｎ_１、ｐＧａｇ－Ｎ_２、ｐＳおよびその変異体、ならびにｐＭプラスミドＤＮＡで、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３－１２６７細胞のいずれかの一過性形質移入によってＶＬＰを生産した。Ｔ１７５フラスコ中において７０％コンフルエンスで、３：１のＰＥＩ：ＤＮＡ質量比でフラスコあたり７０μｇの全ＤＮＡで細胞を形質移入した。ＶＬＰ含有上清を形質移入の７２時間後に回収し、０．４５μｍ孔径の膜を通してろ過し、遠心フィルターデバイス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ－７０－１００Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で２０倍濃縮し、ＳＷ４１Ｔ Ｂｅｃｋｍａｎローター（２５，０００ｒｐｍ、４時間、４℃）中の２０％スクロースクッションを通した超遠心分離によって精製した。無菌ＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中にペレットを再懸濁した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質を測定した。ウエスタンブロッティングのために、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜上に転写した後、特異的な一次抗体とインキュベートした。アルカリホスファターゼがコンジュゲートされた二次抗体を使用し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質によって二次抗体を検出した。

【0098】

免疫化。ゴールデンシリアンハムスターを４時間絶食させ、次いで、２回、１００μｇの異なるＶＬＰを毎週投与して経口的に免疫化した。皮下免疫化については、２回、１０μｇの異なるＶＬＰを毎週投与した。陰性対照群（ナイーブ）の動物は、ビヒクルのみで経口免疫化を受けた。免疫化の間、動物は麻酔を受けなかった。

【0099】

流体採取。ハムスターの後眼窩洞から血液を毎週採取し、血清を分離し、－８０℃で保存した。プロテアーゼ阻害剤を含む１ｍＬのＰＢＳの注入－吸引によって、気管を通じて気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を収集した。

【0100】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試験。インビトロで生産された死滅した全ウイルスのホモジネートでプレートを増感させることによって、ＥＬＩＳＡによってスパイクタンパク質に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のレベルを決定した。精製されたタンパク質：ヒトコロナウイルスＨＣｏＶ－２２９Ｅスパイクタンパク質（Ｓ１＋Ｓ２ ＥＣＤ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．４０６０５－Ｖ０８Ｂ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ａｃｔｉｖｅ Ｔｒｉｍｅｒ）Ｒ＆Ｄ Ｃａｔ．＃１０５４９－ＣＶ）を用いて、スパイクの定量を行った。以下の二次抗体を使用した：マウス抗ハムスターＩｇＧカクテル、クローン：Ｇ９４－５６、Ｇ７０－２０４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号＃５５４００９）。マウス抗ハムスターＩｇＭ、クローン：Ｇ１８８－９、（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４０３５）。ハムスター免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅｓカタログ番号ＭＢＳ０２９６６８）。マウスモノクローナル（Ｈ６）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ａｂｃａｍ．カタログ番号ａｂ２７３１６９）。

【0101】

統計解析。インビトロタンパク質分解濃度測定実験に対して、対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用した。それぞれテューキー多重比較検定またはボンフェローニ事後検定を用いてデータセットに対して一元配置または二元配置のＡＮＯＶＡを行うために、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。すべての図は、平均±平均値の標準誤差を示す。統計学的に有意な差は、各グラフにおいて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１として示されており、ｎｓ＝有意でない。

【0102】

例Ｉ－マウスにおけるＳの異なる変異体の免疫原性
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）を用いて実験を行った。オープン構造の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を安定化するためのスパイクタンパク質（または「Ｓｓｔ」と呼ばれるサブタイプ）および前融合状態で安定化されたＳタンパク質のいくつかの変異体を設計した。いくつかの点変異：Ｃｙｓ－分子クランプ、フューリン切断部位除去およびＰｒｏ置換を使用した。次いで、記載したようにＶＬＰを生産し、正しい組成について検証した。ｅ－ＶＬＰをＢａｌｂ／ｃマウスに経口投与し、血清およびＢＡＬ ＩｇのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した（図１）。

【0103】

注目すべきことに、フューリン切断部位を欠き（ｍｏｄＦｕｒｉｎＣＳ）、２つのＰｒｏ置換を有するスパイク変異体は、高レベルの抗体を誘発するのに最も効率的であった。両性のＯｂ／Ｏｂ、Ｄｂ／Ｄｂおよび老齢マウスで行われた同一の実験は同様の結果を示し（図示せず）、基礎となる状態、マウスの性別または年齢にかかわらず、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰの経口投与が群間で変化しないことを示した。したがって、ゴールデンシリアンハムスターモデルにおける免疫化および攻撃実験のためにｅ－ＶＬＰに含めるために、Ｓの最も効果的な変異体、すなわちＳｓｔ１を選択した。

【0104】

例ＩＩ－異なるワクチン製剤の経口投与に対する抗体応答
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳのＣ末端細胞質尾部（ＣＴ）は、Ｓ糖タンパク質の適切なグリコシル化のために重要であることが知られている。このため、受容体結合ドメイン（ＲＤＢ）の近くに多数のグリコシル化部位が存在するので、Ｓのグリコシル化の差が効率的なＮａｂの生成に影響を及ぼすはずであると仮定された。この理由から、小胞体（ＥＲ）保持を消失するようにＣＴを改変した（ｍｏｄＣＴ）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープ膜タンパク質Ｍをｅ－ＶＬＰ中に組み込んだ。実際、Ｍは、グリコシル化の最初の段階を改善するためにＳをＥＲに保持することが知られており、その後、そこで最終的なグリコシル化が達成されるゴルジ装置全体を移動する間、ＳのＣＴに付着された状態を保つ。それがｅ－ＶＬＰ中にＭを含める主な理由であったが、その後の報告は、Ｃｏｖｉｄ－１９に罹患した後に回復した患者におけるこのタンパク質のいくつかのエピトープに対する特異的Ｔ細胞応答を示した。したがって、ｅ－ＶＬＰのエンベロープ中へのＭの組み込みは、Ｓの適切なグリコシル化だけでなく、ウイルスに対するより強い細胞応答の産生にも利益をもたらし得る。したがって、Ｍあり／なしおよび改変されたＣＴあり／なしのｅ－ＶＳＰを生成した。ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）由来のＶＳＰがＶＬＰ表面上に組み込まれた経口投与用のｅ－ＶＬＰおよびＶＳＰがない筋肉内注射用のｅ－ＶＬＰも、両免疫化経路を比較するために生産した。

【0105】

経口投与された製剤は、異なるｅ－ＶＬＰを装飾するジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの非存在は一切の免疫応答を回避することを示し、上部小腸に沿ったＶＬＰの破壊によるものである可能性が最も高い（図２Ａおよび２Ｂ）。さらに、ＳのＣＴの改変は、野生型ＣＴを有するＳと比較して、動物において生成される血清ＩｇＧまたはＩｇＡのいずれかを誘導する上で有害であるようであった。しかしながら、ＭがＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰ中に組み込まれた場合、ＩｇＧおよびＩｇＡ血清抗体力価は増大した。

【0106】

例ＩＩＩ－異なるワクチン製剤の筋肉内投与に対する抗体応答。
ハムスターに筋肉内（ｉ．ｍ．）投与されたＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは、血清中の高レベルの両Ｉｇを誘導し、ｅ－ＶＬＰ上のジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰの存在は、普通のｅ－ＶＬＰより高いレベルの抗体を促進した（図３）。予想通り、血清ＩｇＧのレベルはＩｇＡのレベルよりも高かった。すべての筋肉内投与された製剤において、個々の動物間で重要な変動が見られた。しかしながら、他のワクチン製剤によって得られた値または回復期患者から得られた血漿中の値と比較すれば、これらの値は許容可能であった。

【0107】

これらの動物において経口または筋肉内のいずれかで投与された同じ製剤間で観察された差は、経口経路は動物間でより高い程度の変動を示すことが予想されるが、それは異なる製剤間ほど可変的でなく、生成されたＩｇの種類によって説明され得ることを示唆している。特に、筋肉内投与は、添加されたアジュバントの非存在下で行われたことを考えると、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰの高い免疫原性は、ＴＬＲ－４を活性化することが実証されているＶＳＰのアジュバント特性によって説明することができる。ＶＳＰを欠くｅ－ＶＬＰのより低い免疫原性は、ＶＬＰの微粒子特性およびＶＬＰの表面上の抗原の反復的曝露のみに依存し得る。

【0108】

これらの結果は、ｅ－ＶＬＰの表面上のＶＳＰの存在は経口投与されたときに粒子の破壊を回避するために不可欠であるが、普通のｅ－ＶＳＰはアジュバントの非存在下で注射によって投与されたときにかなりの応答を生成し、ＶＳＰが存在すると強く増加した応答であることを明確に示している。

【0109】

例ＩＶ－気管支肺胞洗浄ＩｇＡ応答
経口的にまたは製剤の注射によって免疫された動物においてＩｇＡの存在を分析すると、筋肉内に免疫された動物は、ＶＳＰ、Ｍおよび安定化されたＳを含有するｅ－ＶＬＰバージョンのみが気管支肺胞洗浄液中に高力価のＩｇＡを示した経口投与された動物と比較して、一貫して低レベルのＩｇＡ力価を有することが認められた（図４）。同じく、これらの結果は、ｅ－ＶＬＰ製剤の高い免疫原性、および経口投与のために粒子を保護し、免疫賦活化するためにＶＳＰが決定的に重要であることを確認する。

【0110】

例Ｖ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入に対する中和抗体
さらに、経口および筋肉内投与された選択されたｅ－ＶＬＰのいずれにも存在するＩｇＡは、ＢＡＬ中の高レベルのＮａｂを示し、ＶＳＰおよびＭが粒子に含まれた場合にそれらのレベルは増大した（図５）。注目すべきことに、野生型Ｓタンパク質および安定化されたＳタンパク質はいずれも、同等の力価のＮａｂを生成することが可能であり、既にヒトに投与されている異なる市販のワクチンにわたって既に観察されている現象である。

【0111】

例ＶＩ－筋肉内投与後の経口追加免疫
ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは熱安定的であり、数サイクルの凍結／解凍にさえ耐えるので、ワクチン注射用の冷凍用品が不足している世界の地域で使用するのに極めて適している。実際、ほとんどの国が既に大規模なワクチン接種キャンペーンを開始しているにもかかわらず、現在のワクチンの高いレベルの冷蔵、筋肉内投与されたワクチンの殺菌免疫の欠如、または筋肉内投与のための訓練された人員の必要性によって引き起こされる厄介な問題のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症が世界のほとんどの地域で続いている。

【0112】

これらの理由のため、注射によって以前にワクチン接種された動物に経口追加免疫を適用した。これらの動物では、ＶＳＰ、安定化されたＳおよびＭを含有する製剤の第３の用量は、筋肉内に２つの用量を与えたのみのものと比較して、ＢＡＬ中のＩｇＡのレベルの６倍の増加を誘導した（図６）。

【0113】

例ＶＩＩ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃
最後に、選択されたＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰ製剤で免疫した動物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で攻撃し、ハムスターの応答を決定した。この事例では、ＶＳＰ偽型化ありまたはなしで、安定化されたＳおよびＭが粒子上に存在するｅ－ＶＬＰの製剤のみを試験した。

【0114】

結果は、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰによる経口免疫化が、注射によって免疫され、次いで経口的に追加免疫を行われた動物と同様に、感染後２週間の間、動物の体重減少を防ぐことを示した。反対に、ハムスターの実験的感染症について報告されているように、対照動物はその期間中に体重を減少させ、その後すぐに回復した。筋肉内でのみ免疫された動物では、中間の状況が観察され得る（図７）。

【0115】

ＶＩＩＩ－結論
これらの実験結果は、経口投与後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＮＡｂを生成するなどのために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質をジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）ＶＳＰとともにｅ－ＶＬＰ上に同時発現させることが可能であることを初めて示す。普通のｅ－ＶＬＰはＡｂ応答を生成しなかったが、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは筋肉内投与に対する応答の範囲でＡｂ応答を生成した。ＶＳＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅｎｖタンパク質の適切な立体構造を維持しながらＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅｎｖタンパク質を分解から保護することを示すので、これは注目に値する。

【0116】

さらに、これらの結果はまた、分解からの保護をもたらすだけでなく、強力なアジュバント効果も有するＶＳＰの二重特性も示す。実際、ワクチンが筋肉内投与される場合、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは常に、それらの普通のｅ－ＶＬＰより高い力価の抗体をもたらした。注目すべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＬＰは筋肉内投与後に良好なＮａｂ応答を生成することが最近報告されたが、粘膜部位でのＩｇＡの報告は存在しない。

【0117】

その容易さに加えて、経口投与は、より良好な粘膜免疫を誘発するという利点も有することが知られている。これは実際にここでも当てはまり、血漿のレベルは高いが、経口投与後にのみＢＡＬ ＩｇＡも検出可能である。ウイルスの伝播を低下させるはずであるので、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンにとって明らかな利点である。この線で、それ以外には感染から保護されているように見えたワクチン接種されたマカクのＢＡＬ中に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がなお検出された。

【0118】

本研究では、特異的Ｔ細胞応答を試験しなかった。しかしながら、ｅ－ＶＬＰはこのような応答を強固に誘導することが知られており、実際、ＶＳＰ－ＨＡ－ＶＬＰを使用すると、強力なＣＴＬがＨＡを発現する腫瘍細胞を死滅させることができた（Ｓｅｒｒａｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：３６１（２０１９））。さらに、ここでのＩｇＧおよびＩｇＡ応答はＴ細胞依存性であることが周知であり、したがって、優れた抗体応答は優れたＴ細胞応答を証明する。

【0119】

この線で、ウイルス粒子／ＶＬＰの形成および放出を誘導するレトロウイルスタンパク質前駆体であるＧＡＧへのウイルスペプチドの融合が、このペプチドに対するさらなる強力なＴ細胞応答の生成を可能にすることが以前に示された。大きな断片もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ構造タンパク質、または一続きの免疫優性ペプチドのＧａｇへの融合は、明らかに、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰの免疫原性をさらに増強するための手段であろう。

【0120】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは、おそらく投与の初回－追加免疫スキームを用いて、独立型ワクチン（ｓｔａｎｄ－ａｌｏｎｅ ｖａｃｃｉｎｅ）として使用され得る。ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは熱安定的であり、室温でその特性を保持するので、熱安定的なワクチンから恩恵を受ける国でのワクチン接種にとって特に有利であり得る。ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰは、他のワクチン設計のための追加免疫としても使用され得る。

【0121】

この線で、現在使用されているワクチンによって与えられる保護の持続期間はなお不明である。感染した患者の追跡調査は、少なくとも一部の患者については、Ｎａｂの持続性および保護の期間が数ヶ月であり得ることを示している。ウイルス変異体の出現に加えて、これらにより、ワクチン接種者の免疫応答を定期的に増強することが必要になる可能性がある。いくつかのワクチン設計、特にアデノウイルスベクターに基づくものでは、同じベクターの再投与は、ベクターに対して生成される免疫応答のためにあまり効率的ではないことがあり得る。これらの理由のため、ＶＳＰ－ｅ－ＶＬＰによる追加免疫は特に興味深いものであり得る。他のワクチン設計については、特に他の年に反復投与が必要とされる場合、経口投与されるワクチンはより許容され得る。

【0122】

総合すると、それぞれのワクチン設計に特有の問題（欠点の中でも特に、熱安定性、副作用、粘膜免疫誘導の欠如、ベクターに対する免疫原性）に鑑みると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して複数のワクチンを利用できることにより、パンデミックを抑制する機会がより多く保証される。

【0123】

その結果、熱安定的な経口投与されるｅ－ＶＬＰワクチンは、このウイルスに対する武器にとって貴重な新戦力となるであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】