特表 2024-545942 植物の有限性を変えるための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-12-16

(54)【発明の名称】植物の有限性を変えるための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20241209BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20241209BHJP

   C12N 5/04 20060101ALI20241209BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241209BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20241209BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241209BHJP

   A01H 6/54 20180101ALI20241209BHJP

   A01H 6/20 20180101ALI20241209BHJP

   A01H 6/00 20180101ALI20241209BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20241209BHJP

   A01H 6/82 20180101ALI20241209BHJP

   A01H 6/60 20180101ALI20241209BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241209BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A ZNA

A01H5/10

C12N5/04

C12N5/10

C12N15/29

C12N15/11 Z

A01H6/54

A01H6/20

A01H6/00

A01H6/46

A01H6/82

A01H6/60

C12N15/09 100

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527331

(86)(22)【出願日】2022-11-07

(85)【翻訳文提出日】2024-07-08

(86)【国際出願番号】 US2022079380

(87)【国際公開番号】W WO2023086765

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/278,903

(32)【優先日】2021-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501231613

【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100216839

【弁理士】

【氏名又は名称】大石 敏幸

(74)【代理人】

【識別番号】100228980

【弁理士】

【氏名又は名称】副島 由加里

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ブラウワー－トーランド，ブレント

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジョンウン

(72)【発明者】

【氏名】メリル，キース

(72)【発明者】

【氏名】ライマーキス，リンダ

(72)【発明者】

【氏名】スレウィンスキー，トーマス・エル

(72)【発明者】

【氏名】ウーテン，ジュニア・デイヴィッド・アール

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA47

(57)【要約】

ダイズ植物におけるＴＦＬ１レベルを変化させるための組成物及び方法が提供される。ＴＦＬ１遺伝子の抑制、変異誘発及び／または編集を通じて、茎先端の最終分化のタイミングに関連する遺伝子の発現を変化させるための方法及び組成物も提供される。ＴＦＬ１レベルの低下、ならびに植物丈の低下及び耐倒伏性の向上などの改善された特性を含む、ＴＦＬ１遺伝子の発現もしくは活性を低下させる抑制エレメントまたは変異を有する、改変された植物細胞及び植物が更に提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変を欠く以外は同一である植物、植物種子、植物部位もしくは植物細胞におけるＴＦＬ１もしくはその相同体の発現または活性と比較して、ＴＦＬ１もしくはその相同体の発現もしくは活性を低下させる前記改変を含む、改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項2】

前記改変は、内在性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の少なくとも１つの対立遺伝子に存在する、請求項１に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項3】

前記ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体は、配列番号２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項4】

前記改変は、前記ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の非コード領域にある、請求項２または３に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項5】

前記非コード領域は、プロモーター、イントロン、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項6】

前記改変は、前記ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の前記プロモーターにある、請求項５に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項7】

前記植物は、マメ科植物、ワタ植物もしくはカノーラ植物であるか、または前記植物種子、前記植物部位もしくは前記植物細胞は、マメ科植物、ワタ植物、カノーラ植物、トウモロコシ植物、モロコシ植物、イネ植物、コムギ植物、オオムギ植物、トマト植物もしくはコショウの植物の植物種子、植物部位もしくは植物細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項8】

前記植物はマメ科植物であるか、または前記植物種子、前記植物部位もしくは前記植物細胞は、マメ科の植物の植物種子、植物部位もしくは植物細胞である、請求項７に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項9】

前記マメ科植物は、ダイズ植物、インゲンマメ植物、エンドウマメ植物、ヒヨコマメ植物、アルファルファ植物、ラッカセイ植物、イナゴマメ植物、レンズマメ植物、またはカンゾウ植物である、請求項８に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項10】

前記マメ科植物はダイズ植物である、請求項９に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項11】

前記ＴＦＬ１遺伝子はＴＦＬ１ｂ遺伝子である、請求項１０に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項12】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位、または前記植物細胞は、前記改変に関してヘテロ接合性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項13】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位、または前記植物細胞は、前記改変に関してホモ接合性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項14】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位または前記植物細胞は、前記ＴＦＬ１遺伝子の第１の対立遺伝子における第１の改変と、前記ＴＦＬ１遺伝子の第２の対立遺伝子における第２の改変と、を含み、前記第１の改変及び前記第２の改変は互いに異なる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項15】

前記改変は、欠失、挿入、置換、逆位、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項16】

前記改変は、配列番号４、６７～７７、７９及び８１からなる群から選択される配列の３’末端から約２００ヌクレオチド以上に位置する、請求項１５に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項17】

前記改変は欠失を含む、請求項１６に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項18】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位、または植物細胞は、前記ＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーターの少なくとも１つの対立遺伝子における改変を含み、前記改変は、
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３９～ヌクレオチド１５６８の３０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１７～ヌクレオチド１６０４の３８８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５１８～ヌクレオチド１６２９の１１２塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９５１～ヌクレオチド１２２２の２７２塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６４～ヌクレオチド１４０７の４４塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１５１６の１５０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド７５４～ヌクレオチド１８０６の１０５３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１６～ヌクレオチド１３１９の１０４塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１１５９～ヌクレオチド１９６５の８０７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド７６０～ヌクレオチド１２１４の４５５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９３９～ヌクレオチド１０２８の９０塩基対の欠失；
配列番号４のヌクレオチド１０２９～ヌクレオチド１０６５の配列が欠失し、逆位し、同じ位置に再挿入されている、３７塩基対の逆位；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１０６６～ヌクレオチド１６６４の５９９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９５２～ヌクレオチド１５５２の６０１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１６７７～ヌクレオチド１８０８の１３２塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５２４～ヌクレオチド１５５８の３５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド４７６～ヌクレオチド１４０５の９３０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１５５９の１９５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９２８～ヌクレオチド１５６０の６３３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド５９３～ヌクレオチド１８１３の１２２１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５５６の５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３７～ヌクレオチド１５６５の２９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２０９～ヌクレオチド１２４６の３８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１６００の４９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５３～ヌクレオチド１６０１の４９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３７８の１１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３９５の２８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３４４～ヌクレオチド１３８４の４１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１９～ヌクレオチド１４５３の２３５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１５～ヌクレオチド１２２７の１３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３７０～ヌクレオチド１３７６の７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２２０～ヌクレオチド１５５６の３３７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１６～ヌクレオチド１３７６の１６１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３８４の１７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６６～ヌクレオチド１６４８の２８３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３７０～ヌクレオチド１４８９の１２０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４１～ヌクレオチド１６１５の７５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１３７５の９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５１～ヌクレオチド１６０１の５１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３７１～ヌクレオチド１３７７の７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１５５３の１８６塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１３７８の１４塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１３８０の１６塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５９４の４３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１３７６の１０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１６８２の１３１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９５４～ヌクレオチド１３９１の４３８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３５～ヌクレオチド１５６０の２６塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３４～ヌクレオチド１６４４の１１１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド９３７～ヌクレオチド１５９９の６６３塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５１～ヌクレオチド１６４８の９８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５２６～ヌクレオチド１５５９の３４塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５２８～ヌクレオチド１６０６の７９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４２～ヌクレオチド１６０２の６１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１４～ヌクレオチド１５９４の３８１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１５５４の１８７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６９～ヌクレオチド１４７７の１０９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５０～ヌクレオチド１５５４の５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド７３４～ヌクレオチド２０００の１２６７塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３７１～ヌクレオチド１５６０の１９０塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３７～ヌクレオチド１５７２の３６塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４１～ヌクレオチド１５８６の４６塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５５６の５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド６６９～ヌクレオチド１６２３の９５５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５２１～ヌクレオチド１５５８の３８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１３６９～ヌクレオチド１４７７の１０９塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４０～ヌクレオチド１５５４の１５塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１２１７～ヌクレオチド１６７４の４５８塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４６～ヌクレオチド１６２６の８１塩基対の欠失；
参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５４７～ヌクレオチド１６３５の８９塩基対の欠失；及び
これらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項19】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位または前記植物細胞は、前記ＴＦＬ１ｂ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の前記プロモーターにおける改変を含み、前記改変は、参照配列の配列番号４のヌクレオチド１２３７位～１５７０位の間のゲノム領域内に含まれる、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項20】

前記改変は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドの欠失を含む、請求項１９に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項21】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位または前記植物細胞は、前記欠失、前記挿入、前記置換または前記逆位以外の領域で、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する、前記ＴＦＬ１ｂ遺伝子の染色体配列を含む、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項22】

前記植物、前記植物種子、前記植物部位または前記植物細胞は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される、ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項23】

前記改変は、前記改変を欠く以外は同一である植物、植物種子、植物部位もしくは植物細胞におけるＴＦＬ１タンパク質の発現レベルと比較して、前記ＴＦＬ１タンパク質の発現レベルを変化させる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項24】

前記改変は、前記改変を欠く以外は同一である植物、植物種子、植物部位もしくは植物細胞における前記ＴＦＬ１タンパク質の発現レベルと比較して、前記ＴＦＬ１タンパク質の発現レベルを低下させる、請求項２３に記載の改変された植物、植物種子、植物部位、または植物細胞。

【請求項25】

前記改変は、前記改変を欠く以外は同一である植物の有限性表現型と比較して、前記植物の有限性表現型を変化させる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の改変された植物。

【請求項26】

前記改変は、前記改変を欠く以外は同一である前記有限性と比較して、前記植物の有限性を増加させる、請求項２５に記載の改変された植物。

【請求項27】

植え付け後、前記改変された植物は、前記改変を欠く以外は同一である植物よりも早くその終末開花日に達する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の改変された植物。

【請求項28】

前記改変された植物は、前記改変を欠く以外は同一である植物の倒伏率と比較して、減少した前記倒伏率を示す、請求項１～２７のいずれか一項に記載の改変された植物。

【請求項29】

前記改変された植物は、前記改変を欠く以外は同一である植物の収率と比較して、実質的に同じまたは増加した前記収率を示す、請求項１～２８のいずれか一項に記載の改変された植物。

【請求項30】

前記改変された植物は、前記は同一である植物の感受性と比較して、真菌性病害に対して低い前記感受性を示す、請求項１～２９のいずれか一項に記載の改変された植物。

【請求項31】

配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項32】

配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、ガイドＲＮＡ。

【請求項33】

改変されたＴＦＬ１遺伝子を含む植物を生産する方法であって、前記方法は、
ａ）植物細胞の内在性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体中の少なくとも１つの標的部位に改変を導入することと、
ｂ）前記ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体に前記改変を含む工程（ａ）の１つ以上の植物細胞を同定及び選択することと、
ｃ）工程（ｂ）で選択された少なくとも１つ以上の細胞から少なくとも１つの植物を再生することと、を含む、前記方法。

【請求項34】

前記標的部位は、内因性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の非コード領域に位置する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記非コード領域は、プロモーター、イントロン、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記非コード領域はプロモーターである、請求項３６に記載の方法。

【請求項37】

前記改変は、前記植物細胞における少なくとも１種の部位特異的ゲノム改変酵素の存在によって促進される、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記部位特異的ゲノム改変酵素は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、及びこれらの任意の組み合わせである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記部位特異的ゲノム改変酵素は、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはこれらのいずれかのバリアントを含む、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記部位特異的ゲノム改変酵素は、前記標的部位で少なくとも１つの鎖切断を生じさせる、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

前記改変は、置換、挿入、逆位、欠失、重複及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項42】

前記改変は欠失である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記欠失は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドの領域を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

植物の有限性を増加させるための方法であって、ＴＦＬ１遺伝子の内在性プロモーターの少なくとも１つの対立遺伝子を改変することを含み、その結果、ＴＦＬ１タンパク質の生産が、前記改変を欠く以外は同一である植物におけるＴＦＬ１タンパク質の生産と比較して、減少する、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１１月１２日出願の米国仮特許出願第６３／２７８，９０３号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の組込み
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ操作システムで２６５キロバイトと測定され、２０２２年１１月７日に作成されたファイル名「ＭＯＮＳ５２２ＵＳ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」中に含まれる配列表は、本明細書と共に電子出願され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、農業バイオテクノロジーの分野、より具体的には、植物におけるゲノム編集のための方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

正確なゲノム編集技術は、遺伝子の発現及び機能の操作のための強力なツールであり、重要な農業的形質を改善する可能性がある。有限性を変え、収量を増加させ、倒伏を減らし、及び他の有益な結果を得るために、様々な作物植物の植物ゲノムを効果的かつ効率的に編集するための新規な組成物及び方法を開発することが、当技術分野において継続的に必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本明細書では、改変を欠く以外は同一である植物、植物種子、植物部位もしくは植物細胞におけるＴＦＬ１もしくはその相同体の発現または活性と比較して、ＴＦＬ１もしくはその相同体の発現もしくは活性を低下させる改変を含む、改変された植物、植物種子、植物部位または植物細胞が提供される。いくつかの実施形態では、改変は、内在性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の少なくとも１つの対立遺伝子に存在する。ＴＦＬ１遺伝子は、ＴＦＬ１ｂ遺伝子であり得る。特定の実施形態では、ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体は、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。他の実施形態では、改変は、ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の非コード領域内にあり、その非限定的な例としては、プロモーター、イントロン、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域及びこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で提供される植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、例えば、マメ科植物、ワタ植物、カノーラ植物、トウモロコシ植物、モロコシ植物、イネ植物、コムギ植物、オオムギ植物、トマト植物もしくはコショウ植物、もしくは他の作物、観賞用植物、または他の種類の植物種からのものであり得る。更なる実施形態では、マメ科植物は、ダイズ植物、インゲンマメ植物、エンドウマメ植物、ヒヨコマメ植物、アルファルファ植物、ラッカセイ植物、イナゴマメ植物、レンズマメ植物、またはカンゾウ植物である。具体的な実施形態では、マメ科植物は、ダイズ植物である。いくつかの実施形態では、植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、改変に関してヘテロ接合性であり、他の実施形態では、植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、改変に関してホモ接合性である。特定の実施形態では、植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、ＴＦＬ１遺伝子の第１の対立遺伝子における第１の改変と、ＴＦＬ１遺伝子の第２の対立遺伝子における第２の改変と、を含むものとして定義され、第１の改変及び第２の改変は互いに異なる。

【0006】

本明細書で提供される改変された植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、特定の実施形態では、ＴＦＬ１もしくはその相同体の発現または活性を低下させる改変を含み得、改変は、欠失、挿入、置換、逆位またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、例えば、改変は、配列番号４、６７～７７、７９及び８１からなる群から選択される配列の３’末端から約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５もしくは３００ヌクレオチド、またはそれ以上に位置する。他の実施形態では、ＴＦＬ１ｂ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子のプロモーターにおける改変は、配列番号４の参照配列のヌクレオチド１２３７位～１５７０位の間のゲノム領域内に含まれる。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５または少なくとも約１５０の連続ヌクレオチドの欠失を含む。植物、植物種子、植物部位または植物細胞はまた、例えば、ＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーターの少なくとも１つの対立遺伝子に改変を含むことができ、改変は、配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５３９～ヌクレオチド１５６８の３０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１７～ヌクレオチド１６０４の３８８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５１８～ヌクレオチド１６２９の１１２塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９５１～ヌクレオチド１２２２の２７２塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６４～ヌクレオチド１４０７の４４塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１５１６の１５０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド７５４～ヌクレオチド１８０６の１０５３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１６～ヌクレオチド１３１９の１０４塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１１５９～ヌクレオチド１９６５の８０７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド７６０～ヌクレオチド１２１４の４５５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９３９～ヌクレオチド１０２８の９０塩基対の欠失；配列番号４のヌクレオチド１０２９～ヌクレオチド１０６の配列が欠失し、逆位し、同じ位置に再挿入されている、３７塩基対の逆位；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１０６６～ヌクレオチド１６６４の５９９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９５２～ヌクレオチド１５５２の６０１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１６７７～ヌクレオチド１８０８の１３２塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５２４～ヌクレオチド１５５８の３５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド４７６～ヌクレオチド１４０５の９３０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１５５９の１９５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９２８～ヌクレオチド１５６０の６３３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド５９３～ヌクレオチド１８１３の１２２１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５５６の５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５３７～ヌクレオチド１５６５の２９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２０９～ヌクレオチド１２４６の３８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１６００の４９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５３～ヌクレオチド１６０１の４９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３７８の１１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３９５の２８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３４４～ヌクレオチド１３８４の４１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１９～ヌクレオチド１４５３の２３５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１５～ヌクレオチド１２２７の１３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３７０～ヌクレオチド１３７６の７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２２０～ヌクレオチド１５５６の３３７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１６～ヌクレオチド１３７６の１６１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１３８４の１７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６６～ヌクレオチド１６４８の２８３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３７０～ヌクレオチド１４８９の１２０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４１～ヌクレオチド１６１５の７５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１３７５の９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５１～ヌクレオチド１６０１の５１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３７１～ヌクレオチド１３７７の７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１５５３の１８６塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１３７８の１４塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１３８０の１６塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５９４の４３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１３７６の１０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１６８２の１３１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９５４～ヌクレオチド１３９１の４３８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５３５～ヌクレオチド１５６０の２６塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５３４～ヌクレオチド１６４４の１１１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド９３７～ヌクレオチド１５９９の６６３塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５１～ヌクレオチド１６４８の９８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５２６～ヌクレオチド１５５９の３４塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５２８～ヌクレオチド１６０６の７９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４２～ヌクレオチド１６０２の６１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１４～ヌクレオチド１５９４の３８１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６８～ヌクレオチド１５５４の１８７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６９～ヌクレオチド１４７７の１０９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５０～ヌクレオチド１５５４の５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド７３４～ヌクレオチド２０００の１２６７塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３７１～ヌクレオチド１５６０の１９０塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５３７～ヌクレオチド１５７２の３６塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４１～ヌクレオチド１５８６の４６塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５５２～ヌクレオチド１５５６の５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド６６９～ヌクレオチド１６２３の９５５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５２１～ヌクレオチド１５５８の３８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１３６９～ヌクレオチド１４７７の１０９塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４０～ヌクレオチド１５５４の１５塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１２１７～ヌクレオチド１６７４の４５８塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４６～ヌクレオチド１６２６までの８１塩基対の欠失；配列番号４の参照配列と比較して、ヌクレオチド１５４７～ヌクレオチド１６３５の８９塩基対の欠失；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、植物、植物種子、植物部位または植物細胞は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される、ポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で提供される植物、植物種子、植物部位または植物細胞はまた、例えば、欠失、挿入、置換または逆位以外の領域で、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する、ＴＦＬ１ｂ遺伝子の染色体配列を含むことができる。

【0007】

また、本明細書では、改変を欠く点以外は同一である植物と比較して、植物の有限性表現型を変化させる改変を含む、改変された植物またはその種子、植物部位、細胞も提供される。特定の実施形態では、改変は、改変を欠く点以外は同一である植物の有限性と比較して、植物の有限性を増大させる。いくつかの実施形態では、改変された植物は、改変を欠く点以外は同一である植物と比較して、より早く終末開花日に達し、倒伏率の低下を示し、実質的に同じもしくは増加した収量を示し、もしくは真菌性病害に対するより低い感受性を示し、またはこれらの任意の可能な組み合わせを示す。

【0008】

特定の実施形態では、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８からなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチドが提供される。また、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、ガイドＲＮＡが提供される。

【0009】

更に本明細書に、改変されたＴＦＬ１遺伝子を含む植物を生産するための方法が開示され、前記方法は、ａ）植物細胞の内在性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体中の少なくとも１つの標的部位に改変を導入することと、ｂ）前記ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体に前記改変を含む工程（ａ）の１つ以上の植物細胞を同定及び選択することと、ｃ）工程（ｂ）で選択された少なくとも１つ以上の細胞から少なくとも１つの植物を再生することと、を含む。いくつかの実施形態では、標的部位は、内在性ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体の非コード領域に位置する。他の実施形態では、非コード領域は、プロモーター、イントロン、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。更なる実施形態では、非コード領域はプロモーターである。更に別の実施形態では、改変は、前記植物細胞における少なくとも１種の部位特異的ゲノム改変酵素の存在によって促進される。このような酵素の非限定的な例としては、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの例には、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはこれらのいずれかのバリアントが含まれる。本開示に従って使用できるいくつかの部位特異的ゲノム改変酵素は、標的部位で少なくとも１つの鎖切断を生じさせる。本明細書に開示される方法は、例えば、置換、挿入、逆位、欠失、重複及びこれらの組み合わせを含む、本開示による任意の改変を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、改変は欠失であり、欠失は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドの領域を含む。

【0010】

本明細書で提供される方法は、例えば、所望の表現型を有する植物の生産に使用できる可能性がある。そのような表現型の非限定的な例としては、終末開花日の早期化、倒伏率の低下、収量の実質的な同一または増加、真菌性病害に対する感受性の低下、及び有限性の増加、またはこれらの任意の可能な組み合わせが挙げられる。そのような表現型は、具体的な実施形態では、本開示による表現型を付与する改変を欠く点以外では同一である植物と比較した場合、植物中に存在するとして定義され得る。

【0011】

以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、本開示の特定の態様を更に実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによってより深く理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の転写開始部位（ｔｉｓ）の上流の約２ｋｂプロモーター領域上のｇＲＮＡの相対位置を示す。

【図2】独特で重複のないホモ接合性欠失を示す。アスタリスク（＊）は、２０塩基対未満の小さな欠失を示す。なお、対立遺伝子名は接頭辞「ＡＬ」を省略している。

【図3】プロモーター編集により生成された様々なＤｔ１対立遺伝子を含む、植物の苗条先端及び葉におけるＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の相対発現レベルを示す。葉組織におけるＧｍＴＦＬ１ｂの発現は、試験したすべての試料でほんのわずかであった。

【図4】頂部の総状花序表現型を示す画像を示す。写真は、野生型植物の終末開花日から２日以内に撮影された。

【図5】ダイズＴＦＬ１ｂポリペプチド配列と、ＢＬＡＳＴ検索によって同定された関連植物種からの推定相同体のポリペプチド配列と、の対比較を示す。表の右上の三角形の小数点付きの数字は、２つの配列間で重複するアラインメント位置に対するアラインメント位置の同一残基の割合を示す。左下の三角形の整数は、アラインメント位置における２つの配列間の残基のバリエーションの数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

配列の簡単な説明
配列番号１は、グリシンマックスＴＦＬ１ｂ（ＧｍＴＦＬ１ｂ）遺伝子のポリヌクレオチドコード配列である。

【0014】

配列番号２は、ＴＦＬ１ｂタンパク質のアミノ酸配列である（配列番号１によってコードされる）。

【0015】

配列番号３は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびにイントロンを含む、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のポリヌクレオチド配列である。

【0016】

配列番号４は、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の転写開始部位（ｔｉｓ）の上流の２ｋｂプロモーター領域のポリヌクレオチド配列である。配列番号４は、野生型ダイズ植物で配列番号３の直前にある。

【0017】

配列番号５は、Ｃｐｆ１遺伝子と適合する共通の足場のポリヌクレオチド配列である。

【0018】

配列番号６は、ダリアモザイクウイルスＦＬＴプロモーターのポリヌクレオチド配列である。

【0019】

配列番号７は、イネ用にコドン最適化されたラクノスピラ科細菌Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチド配列である。

【0020】

配列番号８は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍからの核局在化シグナルのポリヌクレオチド配列である。

【0021】

配列番号９は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａユビキチンプロモーターのポリヌクレオチド配列である。

【0022】

配列番号１０は、トウモロコシ用にコドン最適化されたラクノスピラ科細菌Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチド配列である。

【0023】

配列番号１１は、ダイズＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ３）プロモーターのポリヌクレオチド配列である。

【0024】

配列番号１２は、ダイズ７ＳＬ＿ＣＲ１０プロモーターのポリヌクレオチド配列である。

【0025】

配列番号１３～２９は、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーター領域の編集に使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内のスペーサー配列のポリヌクレオチド配列である。

【0026】

配列番号３０～４６及び８２～１２８は、配列番号４と比較して、様々な欠失（及び、配列番号４０の場合には逆位）を有するＧｍＴＦＬ１ｂプロモーターの対立遺伝子のポリヌクレオチド配列である。

【0027】

配列番号４７は、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の５’ＵＴＲのポリヌクレオチド配列である。

【0028】

配列番号４８、４９及び５０は、それぞれ、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の第１、第２及び第３のイントロンのポリヌクレオチド配列である。

【0029】

配列番号５１は、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の３’ＵＴＲのポリヌクレオチド配列である。

【0030】

配列番号５２～６６、７８及び８０は、それぞれ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号５２）、Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ（配列番号５３）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（配列番号５４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号５５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（配列番号５６）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（配列番号５７）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ（配列番号５８）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（配列番号５９）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（配列番号６０）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（配列番号６１）、Ｚｅａ Ｍａｙｓ（配列番号６２）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（配列番号６３）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号６４）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号６５）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号６６）、Ａｒａｃｈｉｓ Ｈｙｐｏｇａｅａ（配列番号７８）、及びＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号８０）に見られるＴＦＬ１ｂタンパク質相同体のアミノ酸配列である。

【0031】

配列番号６７～７７、７９及び８１は、それぞれ、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号６７）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号６８）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（配列番号６９）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号７０）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号７１）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（配列番号７２）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（配列番号７３）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ（配列番号７４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（配列番号７５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号７６）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号７７）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（配列番号７９）、及びＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号８１）に見られるＴＦＬ１ｂ遺伝子相同体の転写開始部位（ｔｉｓ）の上流の約２ｋｂのプロモーター領域のポリヌクレオチド配列である。

【0032】

茎の生長習性は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）における植物丈、開花時期及び開花期間、節の生成、根の構造などの植物の特性に直接影響を及ぼす重要な農業的形質である。植物丈は、収量の可能性及び耐倒伏性に直接影響を及ぼす可能性があるため、ダイズ及び他の作物において特に重要な農業形質である。植物丈は、苗条頂端分裂組織での栄養相から生殖相への移行のタイミングによって影響される。ダイズでは、苗条頂と枝先端の両方における生長習性及び茎先端の最終分化のタイミングは、Ｄｔ１（無限生長１）遺伝子座によって制御される。Ｄｔ１遺伝子座はまた、枝密度、茎莢密度、茎節数、莢ごとの３つの種子の数及び総種子数などの他の関連形質にも影響を及ぼす。Ｄｔ１の野生型発現は無限生長を特定し、有限生長を引き起こすｄｔ１（有限生長１）対立遺伝子に対して不完全な優占度を有する。茎先端のＤｔ１遺伝子座で遺伝子ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １ｂ（ＧｍＴＦＬ１ｂ）の発現は、ダイズＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ ＴオルソログであるＦＴ２ａによって誘導される、最終分化から頂端分裂組織を保護する。

【0033】

例えば、商業的に栽培されているダイズ品種の大部分は、無限または有限という２つの茎の生長習性のいずれかを有するものとして分類される。無限性ダイズ植物と有限性ダイズ植物は、栄養生長期中の発育では類似しているが、生殖／開花期の茎の生長習性には大きな違いがある。無限性ダイズ品種は、茎の先端から数週間にわたって高さが伸びる植物を生産するが、同時に、植物がまだ栄養生長期にあるときに開花が茎の低い位置で始まる。対照的に、有限性ダイズ品種は、生殖相の開始時（Ｒ１相）に主茎の高さの成長を完了する植物を生産し、ほぼ同時に、その植物が生産するすべての花を生産する。その結果、有限性植物は、無限性植物の約１／２～約２／３の丈しかない。

【0034】

一般に、無限性ダイズ品種は、有限性品種と比較して、収量の可能性が高くなるが、上部がより重いため茎が倒伏しやすいという欠点がある。しかし、発育におけるその重要な役割のため、Ｄｔ１遺伝子座はダイズの栽培植物化の初期に固定され、その結果、遺伝子座の多様性が全体的に欠如した。このため、新しい有限性表現型を持つ品種を開発する取り組みが妨げられてきた。更に、ダイズ栽培における植物間競争では、柔軟性に優れた背の高い植物が有利となるため、変異誘発スクリーニングにおいてさえ、有限性の程度にばらつきがある、より短く、よりコンパクトな半有限性植物が選択される可能性は非常に低い。

【0035】

本開示は、ダイズ及び他の作物における現在の無限性生長習性と有限性生長習性との間の新規な中間表現型（半有限性）を付与する操作された対立遺伝子、ならびにそれらの生産方法を提供するという点で、当技術分野における重要な進歩を表し、これにより、主要な形質が改善され、作物の倒伏が減少し、苗及び圃場あたりの生産性が向上する。本明細書に開示される方法及び組成物は、従来の植物育種またはランダム変異誘発からは選択できない多様性を創出する機会を提供する。したがって、本明細書では、例えば、ダイズなどの作物では、これまでの市場は主に有限性及び無限性の品種のみからなっていたにもかかわらず、生産者に固有の利益を提供する半有限性植物の開発を含む、そのような利点を達成するために使用され得る、植物の有限性を改変するための方法及び組成物が提供される。

【0036】

新規な生長習性表現型を有するダイズ及び他の植物を生産するために、本開示は、特定の実施形態では、ＴＦＬ１ｂ遺伝子プロモーターの編集を介して、Ｄｔ１遺伝子座に新規対立遺伝子を作成するための方法及び組成物を提供する。例えば、ＴＦＬ１ｂ遺伝子の上流のプロモーター領域は、配列の約１．２ｋｂを標的とする８つのガイドＲＮＡを共発現することによって、本明細書に開示されるように改変された。３０～１７４６ｂｐの一連の欠失を含む編集された個体が選択され、評価された。驚くべきことに、その結果、有限性から超無限性までの範囲に分類される、明らかな有限性表現型のスペクトルを有するＤｔ１遺伝子座における一連の対立遺伝子を表す、編集されたｄｔ１系統を作成できることが示された。無限性背景品種の終末開花日の３週間前からほぼ１週間後までの範囲の終末開花日を付与する、対立遺伝子が生成され、最適な程度の半有限性を操作する能力が初めて可能になった。したがって、本開示は、倒伏を減少させ、それによって植物当たりの生産性を増加させることによって収量を保護する可能性のある新規の半有限性表現型を付与する、ダイズ及び他の作物における新規の操作された対立遺伝子の生産を可能にするという点で、当技術分野における重要な進歩を表す。

【0037】

Ｉ．ゲノム編集
特定の実施形態では、本開示は、部位特異的組込みまたはゲノム編集を使用する、ゲノム改変を介して作成される植物、植物部位、植物細胞及び種子を提供する。ゲノム編集を使用し、１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性を変化させる、または植物ゲノム中の所望の位置で挿入配列もしくは導入遺伝子を組み込むなど、植物のゲノム中の所望の標的部位で１つ以上の編集（複数可）または変異（複数可）を作製することができる。植物のゲノム内の任意の部位または遺伝子座は、ゲノム編集（または、遺伝子編集）あるいは導入遺伝子、コンストラクトもしくは転写可能ＤＮＡ配列の部位指向性組込みを作製するために選択され得る可能性がある。本明細書で使用する場合、ゲノム編集または部位指向性組込みのための「標的部位」とは、部位特異的ヌクレアーゼによって結合されかつ切断され、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の核酸骨格及び／またはその相補ＤＮＡ鎖へ二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖ニックが導入される、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の位置を指す。標的部位は、例えば、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２９、または少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含み得る。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのための「標的部位」は、標的部位での二本鎖核酸（ＤＮＡ）分子または染色体のいずれかの相補鎖の配列を含み得る。部位特異的ヌクレアーゼは、非コーディングガイドＲＮＡ（例えば、これらに限定されないが、本明細書で更に記載されるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））経由などで、標的部位へ結合し得る。本明細書で提供されている非コードガイドＲＮＡは、標的部位に相補性（例えば、標的部位で二本鎖核酸分子のいずれかの鎖または染色体に相補性）であってもよい。完全な同一性または相補性は、非コードガイドＲＮＡが標的部位に結合するまたはハイブリッド形成するのに必要とされなくてもよいことを理解されたい。例えば、標的部位と非コードＲＮＡとの間の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのミスマッチ（または、それ以上）は容認されてもよい。「標的部位」はまた、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼなどの非コードＲＮＡ分子によって誘導されなくてもよい他の任意の部位特異的ヌクレアーゼによって結合されかつ切断され、ポリヌクレオチド配列及び／またはその相補性なＤＮＡ鎖にＤＳＢまたは一本鎖ニックを導入する、植物ゲノム内のポリヌクレオチド配列の位置も指す。本明細書で使用する場合、「標的領域」または「標的化された領域」は、２つ以上の標的部位が隣接するポリヌクレオチドの配列または領域を指す。限定するものではないが、いくつかの実施形態では、標的領域は、変異、欠失、挿入または逆位が行われ得る。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの配列または分子の標的領域を説明するために使用される場合の「隣接する」とは、標的領域を囲むポリヌクレオチドの配列または分子の２つ以上の標的部位を指し、標的領域の両側に１つの標的部位がある。

【0038】

本明細書で使用する場合、「標的ゲノム編集技術」とは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、リコンビナーゼ、またはトランスポザーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼを使用する、植物のゲノム内の特定の位置の正確な及び／または標的化編集を可能にする（すなわち、編集がほとんどまたは完全に非無作為である）任意の方法、プロトコルまたは技術を指す。本明細書で使用する場合、「編集」または「ゲノム編集」とは、内在性植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００もしくは少なくとも２５，０００ヌクレオチドの標的変異、欠失、逆位または置換を生成することを指す。本明細書で使用する場合、「編集」または「ゲノム編集」とはまた、植物の内因性植物ゲノム内への少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００もしくは少なくとも２５，０００ヌクレオチドの標的挿入または部位指向性組込みを包含し得る。単数形の「編集（ｅｄｉｔ）」または「ゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔ）」は、１つのそのような標的変異、欠失、逆位、置換または挿入を指すが、複数形の「編集（ｅｄｉｔｓ）」または「ゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｓ）」は、２つ以上の標的変異（複数可）、欠失（複数可）、逆位（複数可）、置換（複数可）及び／または挿入（複数可）を指し、それぞれの「編集」は、標的ゲノム編集技術を介して導入される。

【0039】

いくつかの実施形態によれば、部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼによって作成された二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックの修復を介して、所望の標的部位でゲノムに所望の編集、変異または挿入を行うための鋳型として機能する、ドナー鋳型分子と共に同時送達されてもよい。いくつかの実施形態によれば、部位特異的ヌクレアーゼは、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子と共に同時送達されてもよい。

【0040】

本明細書で提供される部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。例えば、Ｋｈａｎｄａｇａｌｅ ｅｔ ａｌ.（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｐ１０：３２７－３４３，２０１６）及びＧａｊ ｅｔ ａｌ.（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７－４０５，２０１３）を参照のこと。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）に由来し得る切断ドメイン（または、切断ドメインの半分）へ融合させた、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、標準的（Ｃ２Ｈ２）または非標準的（例えば、Ｃ３ＨまたはＣ４）であってもよい。ＤＮＡ結合ドメインは、標的部位に依存する１以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を含み得るが、通常、３～４（またはそれ以上）のジンクフィンガーから構成され得る。ＤＮＡ結合ドメイン中の複数のジンクフィンガーは、リンカー配列（複数可）によって分離され得る。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変によって、二本鎖ＤＮＡのほぼすべての区間を切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的部位ＤＮＡ配列を結合するように操作されたジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインへ融合させた、非特異的ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼに由来する）から構成される単量体から二量体を形成する。標的部位への部位特異的結合に寄与するジンクフィンガーαヘリックスの開始点に対して－１位、＋２位、＋３位及び＋６位のアミノ酸は、特定の標的配列に適合するように変更する及びカスタマイズすることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成し、異なる配列特異性を備えたＺＦＮを生成し得る。

【0041】

特異的標的配列を標的とし、それらへ結合するためにＺＦＮを設計する方法及び規則は当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願第２００５／００６４４７４号、同第２００９／０１１７６１７号、及び同第２０１２／０１４２０６２号を参照されたい。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインはＤＮＡを切断するために二量体化が必要であり得、そのため、Ｃ末端領域を備えた２つのＺＦＮが切断部位の反対のＤＮＡ鎖を結合するために必要である（５～７ｂｐで分離される）。２つのＺＦ結合部位がパリンドロームならば、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮは、本明細書で使用する場合、広義であり、別のＺＦＮからの援助無しに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体のＺＦＮを包含する。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するために一緒に機能するように操作される、ＺＦＮの対の一方または双方のメンバーを指すために使用されてもよい。ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法のうちの１つを使用して再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは、理論的にはほとんどあらゆる標的配列（例えば、植物ゲノム中の遺伝子でまたはその付近で）を標的とするように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公的に利用可能な方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、及びＭｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。

【0042】

転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、例えば、植物の遺伝子のゲノム遺伝子座でまたはその近傍で、事実上任意のＤＮＡ配列にも結合するように操作することができる。ＴＡＬＥは、３３～３４アミノ酸の１３～２８の反復単量体から構成される中央のＤＮＡ結合ドメインを有する。それぞれの単量体のアミノ酸は、１２位及び１３位での超可変アミノ酸残基以外は、高度に保存される。２つの可変アミノ酸は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸対のＮＩ、ＮＧ、ＨＤ及びＮＮは、優先的に、それぞれ、アデニン、チミン、シトシン及びグアニン／アデニンを認識し、ＲＶＤの調整により一続きのＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせの選択によって、特異的なＤＮＡ結合ドメインを操作することを可能にした。

【0043】

ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインへのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの融合によって生成された人工制限酵素である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、ＰｖｕＩＩ、ＭｕｔＨ、ＴｅｖＩ、ＦｏｋＩ、ＡｌｗＩ、ＭｌｙＩ、ＳｂｆＩ、ＳｄａＩ、ＳｔｓＩ、ＣｌｅＤＯＲＦ、Ｃｌｏ０５１及びＰｅｐｔ０７１からなる群から選択される。ＴＡＬＥＮ対のそれぞれのメンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位へ結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化し、標的部位で二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用する場合、別のＴＡＬＥＮからの援助無しに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体のＴＡＬＥＮを幅広く包含する。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するために一緒に機能する、１対のＴＡＬＥＮのうちの一方または両方のメンバーを指す。

【0044】

野生型のＦｏｋＩ切断ドメイン以外に、変異を備えたＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントは、切断特異性及び切断活性を改善するように設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な向き及び間隔での、標的ゲノム中の部位のための固有のＤＮＡ結合ドメインを備えた２つのコンストラクトを必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。ＰｖｕＩＩ、ＭｕｔＨ及びＴｅｖＩの切断ドメインは、ＴＡＬＥによる使用のためのＦｏｋＩ及びＦｏｋＩのバリアントの有用な代替物である。ＰｖｕＩＩは、ＴＡＬＥにカップリングされた場合に高度に特異的な切断ドメインとして機能する（Ｙａｎｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ８２５３９，２０１３）。ＭｕｔＨは、ＤＮＡ中の鎖に特異的ニックを導入することが可能である（Ｇａｂｓａｌｉｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４１：ｅ８３，２０１３）。ＴｅｖＩは、ＤＮＡ中の二本鎖切断を標的化された部位で導入する（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４：１７６２， ２０１３）。

【0045】

ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の関係性は、設計可能なタンパク質を可能にする。ＤＮＡＷｏｒｋｓなどのソフトウエアプログラムを使用し、ＴＡＬＥコンストラクトを設計することができる。ＴＡＬＥコンストラクトを設計する他の方法は、当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４０：Ｗ１１７－１２２，２０１２）、Ｃｅｒｍａｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３９：ｅ８２，２０１１）及びｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照されたい。別の態様では、本明細書で提供されるＴＡＬＥＮは、標的ＤＳＢを生成することが可能である。

【0046】

部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーなどの微生物で通常同定されるメガヌクレアーゼは、高い活性及び長い認識配列（１４ｂｐ超）を備え、標的ＤＮＡの部位特異的消化をもたらす、固有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作されたバージョンは、通常、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４～４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼのＤＮＡの認識及び切断の機能が単一ドメイン中で絡み合うので、メガヌクレアーゼの操作はＺＦＮ及びＴＡＬＥＮよりも困難であり得る。変異誘発及びハイスループットスクリーニングの特殊な方法を使用し、固有の配列を認識して、改善されたヌクレアーゼ活性を保持する新規のメガヌクレアーゼバリアントを生成する。

【0047】

部位特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びこれらの任意の相同体または改変バージョン、ならびにアルゴノート（アルゴノートタンパク質の非限定的例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルゴノート（ＴｔＡｇｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、及びこれらの任意の相同体または改変バージョンが挙げられる）からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９またはＣｐｆ１酵素である。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡの有無にかかわらずタンパク質として送達されてもよく、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ酵素と複合体を形成して、リボ核タンパク質として送達されてもよい。

【0048】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼについては、ガイドＲＮＡ分子を更に提供し、塩基対形成またはハイブリッド形成を介してエンドヌクレアーゼを植物のゲノムの標的部位に指向させ、標的部位でまたはその近傍でＤＳＢまたはニックを生じてもよい。ガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ核酸分子として、もしくはプロモーターに作動可能に連結されたガイドＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子、コンストラクトもしくはベクターとして、植物の細胞もしくは組織に形質転換されてもよいし、または導入されてもよい。当技術分野で理解されているように、ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはエンドヌクレアーゼをゲノム内の特定の標的部位に誘導または指向させることができる他の任意のＲＮＡ分子を含み得る。化膿性連鎖球菌に由来するプロトタイプのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であるＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ガイドとトランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）という２つのＲＮＡに自然に結合し、ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ｃｒＲＮＰ）を構築する。「単鎖ガイドＲＮＡ」（または「ｓｇＲＮＡ」）は、リンカー配列によってｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合したｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子であり、単一のＲＮＡ転写物または分子として発現され得る。ガイドＲＮＡは、遺伝子でもしくはその付近などの植物ゲノム内の標的部位と同一または相補的なガイドまたはターゲティング配列（本明細書では「スペーサー配列」とも称される）を含む。ガイドＲＮＡは、通常、タンパク質をコードしない非コードＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡのガイド配列は、例えば、１２～４０のヌクレオチド長、１２～３０のヌクレオチド長、１２～２０のヌクレオチド長、１２～３５のヌクレオチド長、１２～３０のヌクレオチド長、１５～３０のヌクレオチド長、１７～３０のヌクレオチド長もしくは１７～２５のヌクレオチド長、または約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のヌクレオチド長などの少なくとも１０のヌクレオチド長であってもよい。ガイド配列は、ゲノムの標的部位でのＤＮＡ配列の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％もしくは１００％同一であってもよいし、または相補性であってもよい。

【0049】

上述のように、ゲノム編集の標的遺伝子は、ダイズＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ１ｂ（ＧｍＴＦＬ１ｂ）遺伝子を含む、抑制について本明細書に記載されるＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ１様遺伝子のいずれかであり得る。ゲノム編集によるＴＦＬ１遺伝子のノックダウンの変異に関して、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＴＦＬ１遺伝子のプロモーター及び／またはエンハンサー配列、もしくはイントロン、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列などの上流または下流の配列に対して標的とされ、ＴＦＬ１遺伝子の１つ以上のプロモーター及び／または調節配列を変異させ、その発現レベルに影響を及ぼすことができるか、またはその発現レベルを低下させることができる。ダイズにおけるＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のノックダウンに関して、ガイドＲＮＡが使用され得、これは、配列番号３もしくは４の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドまたはそれに相補的な配列（例えば、配列番号３もしくは４の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドまたはそれに相補的な配列）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％同一または相補的であるガイド配列を含むが、代替スプライシング及び異なるエクソン／イントロン境界が生じる可能性もある。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列に関して「連続」という用語は、配列中に欠失またはギャップがないことを意味する。

【0050】

本明細書で使用する場合、所与の配列に関して、「相補体」、「相補的配列」及び「逆相補体」は、互換的に使用される。３つの用語はすべて、ヌクレオチド配列の逆相補的配列、すなわち、ヌクレオチドの逆の順序で所定の配列に相補的な配列を指す。

【0051】

本明細書で使用する場合、「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。アンチセンスＲＮＡ分子は、センスＲＮＡ鎖、配列またはｍＲＮＡと組み合わせて、配列の相補性により二重鎖を形成できる、一本鎖核酸である。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖を指す。遺伝子または遺伝子座の「センス鎖」とは、遺伝子もしくは遺伝子座から転写されたＲＮＡ分子と同じ配列を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡの鎖である（ＲＮＡのウラシル及びＤＮＡのチミンを除く）。

【0052】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、当技術分野で公知のように、ガイドＲＮＡのターゲティング配列に相補的なゲノム標的部位配列の５’末端に直接隣接して上流にある、すなわち、（ガイドＲＮＡのターゲティング配列に対して）ゲノム標的部位のセンス（＋）鎖の直接下流（３’）にある、ゲノム中に存在し得る。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．２（２）：５９－７０（２０１４））を参照されたい。（ガイドＲＮＡのターゲティング配列に対して）標的部位に隣接するセンス（＋）鎖上のゲノムＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ－３’を含み得る。しかしながら、概して、ガイドＲＮＡの対応する配列（すなわち、ガイドＲＮＡのターゲティング配列の直接下流（３’））は、ゲノムＰＡＭ配列に相補的でなくてもよい。

【0053】

いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、リコンビナーゼである。使用され得るリコンビナーゼの非限定的な例としては、ＤＮＡ認識モチーフに付着したセリンリコンビナーゼ、ＤＮＡ認識モチーフに付着したチロシンリコンビナーゼ、またはＤＮＡ認識モチーフに付着した当技術分野で公知の任意のリコンビナーゼ酵素が挙げられる。特定の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼはリコンビナーゼまたはトランスポザーゼであり、これは、ＤＮＡ結合ドメインに付着もしくは融合したＤＮＡトランスポザーゼまたはリコンビナーゼであり得る。リコンビナーゼの非限定的例としては、本明細書で提供されるＤＮＡ認識モチーフに付着したＣｒｅリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ及びＴｎｐ１リコンビナーゼからなる群から選択される、チロシンリコンビナーゼが挙げられる。本開示の一態様では、本明細書で提供されるＣｒｅリコンビナーゼまたはＧｉｎリコンビナーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、またはＣａｓ９ヌクレアーゼへ繋留される。別の態様では、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、及びＴＰ－９０１インテグラーゼからなる群から選択されるセリンリコンビナーゼは、本明細書で提供されるＤＮＡ認識モチーフへ付着され得る。更に別の態様では、ＴＡＬＥ－ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＴＡＬＥ変異誘発因子からなる群から選択されるＤＮＡトランスポゼースは、本明細書で提供されるＤＮＡ結合ドメインへ付着され得る。

【0054】

リコンビナーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮなどの部位特異的ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型ではなく、代わりに、ＤＳＢもしくはニックを引き起こすためにそれらの標的部位を決定するそれらのタンパク質構造に依存するか、またはそれらはＤＮＡ結合タンパク質ドメインもしくはモチーフへ融合、繋留もしくは付着される。部位特異的ヌクレアーゼ（または、融合／付着／繋留したＤＮＡ結合ドメイン）のタンパク質構造は、部位特異的ヌクレアーゼを標的部位へ向けることができる。これらの実施形態の多くによれば、リコンビナーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮなどの非ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼは、公知の方法に従って、設計、操作及び構築され得、植物の内在性遺伝子のゲノム遺伝子座でまたはその付近での標的部位を標的としてそれへ結合し、かかるゲノム遺伝子座でＤＳＢまたはニックを作成する。非ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼによって作成されたＤＳＢまたはニックは、ＤＳＢまたはニックの修復を介して遺伝子発現のノックダウンを引き起こす可能性があり、その結果、細胞修復機構により、ＤＳＢまたはニックの部位での配列の変異または挿入が生じる可能性がある。このような細胞修復機構は、ドナー鋳型分子によって誘導され得る。

【0055】

本明細書で使用する場合、組換えポリヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡのドナー鋳型または配列であり得る、「ドナー分子」、「ドナー鋳型」または「ドナー鋳型分子」（まとめて「ドナー鋳型」）は、相同核酸鋳型もしくは配列（例えば、相同配列）及び／または植物細胞のゲノム中のニックもしくはＤＳＢの修復経由の植物細胞のゲノムの中への部位指向性の標的化された挿入または組換えのための挿入配列を有する核酸分子として定義される。ドナー鋳型は、１つ以上の相同配列（複数可）及び／または標的化された組込みのための挿入配列を含む分離したＤＮＡ分子であり得るか、またはドナー鋳型は、１つ以上の他の発現カセット、遺伝子／導入遺伝子、及び／または転写可能ＤＮＡ配列を更に含むＤＮＡ分子の配列部分（すなわち、ドナー鋳型領域）であり得る。例えば、「ドナー鋳型」は、導入遺伝子もしくはコンストラクトの部位指向性組込みのために、または植物のゲノム内の標的部位の中へ挿入、欠失、置換などのような変異を導入する鋳型として、使用され得る。本明細書で提供される標的化されたゲノム編集技法は、１以上、２以上、３以上、４以上もしくは５以上のドナー分子または鋳型の使用を含み得る。本明細書で提供されるドナー鋳型は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０の遺伝子（複数可）もしくは導入遺伝子（複数可）及び／または転写可能ＤＮＡ配列（複数可）を含み得る。あるいは、ドナー鋳型は、遺伝子、導入遺伝子、または転写可能ＤＮＡ配列を含まなくてもよい。

【0056】

限定するものではないが、ドナー鋳型の遺伝子／導入遺伝子または転写可能なＤＮＡ配列には、例えば、殺虫剤耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素利用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、収量向上遺伝子、栄養品質遺伝子、ＤＮＡ結合遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、ＲＮＡｉまたは抑制コンストラクト、部位特異的ゲノム改変酵素遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の単一のガイドＲＮＡ、ジェミニウイルスベースの発現カセット、または植物ウイルス発現ベクター系が挙げられてもよい。他の実施形態によれば、ドナー鋳型の挿入配列は、タンパク質をコードする配列、または内在性遺伝子を抑制のために標的とし得る非コーディングＲＮＡ分子をコードする転写可能ＤＮＡ配列を含み得る。ドナー鋳型は、コーディング配列、遺伝子、または転写可能ＤＮＡ配列へ作動可能に結合されたプロモーター（構成的プロモーター、組織特異的プロモーターもしくは組織優先的プロモーター、発生ステージプロモーター、または誘導可能プロモーターなど）を含み得る。ドナー鋳型は、リーダー、エンハンサー、プロモーター、転写開始部位、５’－ＵＴＲ、１以上のエクソン（複数可）、１以上のイントロン（複数可）、転写終結部位、領域または配列、３’－ＵＴＲ、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよく、それらはそれぞれが、非コードＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質をコードするコード配列、遺伝子（または導入遺伝子）、または転写可能なＤＮＡ配列に作動可能に結合されてもよい。ドナー鋳型は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの分子、またはプラスミドであり得る。

【0057】

ドナー鋳型の「挿入配列」は、植物細胞のゲノムの中への標的化された挿入のために設計された配列であり、それは任意の好適な長さであり得る。例えば、ドナー鋳型の挿入配列は、２～５０，０００の間、２～１０，０００の間、２～５０００の間、２～１０００の間、２～５００の間、２～２５０の間、２～１００の間、２～５０の間、２～３０の間、１５～５０の間、１５～１００の間、１５～５００の間、１５～１０００の間、１５～５０００の間、１８～３０の間、１８～２６の間、２０～２６の間、２０～５０の間、２０～１００の間、２０～２５０の間、２０～５００の間、２０～１０００の間、２０～５０００の間、２０～１０，０００の間、５０～２５０の間、５０～５００の間、５０～１０００の間、５０～５０００の間、５０～１０，０００の間、１００～２５０の間、１００～５００の間、１００～１０００の間、１００～５０００の間、１００～１００００の間、２５０～５００の間、２５０～１０００の間、２５０～５０００の間、または２５０～１０，０００の間のヌクレオチドまたは塩基対の長さであり得る。ドナー鋳型は、相同組換え経由で植物のゲノム内の標的部位の中への変異または挿入配列の組込みを指向させるように少なくとも１つの相同配列または相同アーム（２つの相同アームなど）も有し、相同配列または相同アーム（複数可）は、同一もしくは相補的であるか、または、植物のゲノム内の標的部位でもしくはその付近での配列へのパーセント同一性もしくはパーセント相補性を有する。ドナー鋳型が相同アーム（複数可）及び挿入配列を含む場合に、相同アーム（複数可）は、ドナー鋳型の挿入配列に近接するかまたはそれを取り囲むだろう。それぞれの相同アームは、植物のゲノム内の標的ＤＮＡ配列のうちの連続する少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２５００、または少なくとも５０００のヌクレオチドへ、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一または相補的である。

【0058】

部位指向性組込みのための当技術分野において公知の任意の方法が、本開示と共に使用され得る。挿入配列を備えたドナー鋳型分子の存在下において、ＤＳＢまたはニックは、ドナー鋳型と植物ゲノムの相同アーム（複数可）との間の相同組換えによって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、植物ゲノムの中への挿入配列の部位指向性組込みをもたらして、ＤＳＢまたはニックの部位で標的化された挿入事象を生成し得る。したがって、導入遺伝子、転写可能ＤＮＡ配列、コンストラクトまたは配列が、ドナー鋳型の挿入配列中に所在するならば、導入遺伝子、転写可能ＤＮＡ配列、コンストラクトまたは配列の部位特異的な挿入または組込みが達成され得る。

【0059】

標的遺伝子を抑制するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくは逆方向反復ＲＮＡ配列の発現を含む本開示の実施形態に従って、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）もしくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現による共抑制もしくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して、ＴＦＬ１遺伝子を抑制することができる。更に、ＴＦＬ１遺伝子内またはその近傍のコード及び／または非コードゲノム配列または領域を標的とする、センス及び／またはアンチセンスＲＮＡ分子を使用し、遺伝子のサイレンシングを引き起こすことができる。したがって、これらの方法のいずれも、組織特異的または組織優先的な方法での内因性ＴＦＬ１遺伝子の標的化された抑制に使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００９／００７０８９８号、同第２０１１／０２９６５５５号、及び同第２０１１／００３５８３９号を参照のこと。

【0060】

ＤＳＢまたはニックの導入を使用し、植物のゲノム中の標的化された変異を導入することもできる。このアプローチに従って、変異（欠失、挿入、逆位及び／または置換など）は、ＤＳＢまたはニックの不完全な修復を介して標的部位で導入され、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンを産生し得る。かかる変異は、ドナー鋳型分子を使用せずに、標的化された遺伝子座の不完全な修復によって生成され得る。遺伝子の「ノックアウト」は、タンパク質の非発現または非機能的タンパク質の発現をもたらす、遺伝子の内在性遺伝子座でもしくはその付近でのＤＳＢまたはニックを誘導することによって達成され得るが、遺伝子の「ノックダウン」は、コードされたタンパク質の機能を消失させる方法で、遺伝子のコード配列に影響しない部位で不完全に修復される遺伝子の内在性遺伝子座でもしくはその付近でのＤＳＢまたはニックを誘導することによって、類似する方法で達成され得る。例えば、内在性遺伝子座内のＤＳＢまたはニックの部位は、遺伝子の上流または５’領域（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー配列）中に存在して、発現のレベルに影響を及ぼし得るか、または低減し得る。

【0061】

同様に、遺伝子のかかる標的化されたノックアウトまたはノックダウンの変異は、ＤＳＢまたはニックの修復を介して標的部位でもしくはその付近で特定のまたは所望される変異を指向させるドナー鋳型分子により生成され得る。ドナー鋳型分子は、挿入配列の有無にかかわらず、標的化されたゲノム配列に比べて１つ以上の変異（１つ以上の欠失、挿入、逆位及び／または置換など）をＤＳＢもしくはニックの部位でまたはその付近で含む、相同配列を含み得る。例えば、遺伝子の標的化されたノックアウトまたはノックダウンの変異は、少なくとも遺伝子の一部を置換、挿入、欠失または逆位させることによって（遺伝子のコード配列にフレームシフトもしくは未成熟停止コドンを導入するか、またはプロモーター配列もしくは遺伝子の他の非コード調節エレメントの配列を破壊することによってなど）達成され得る。遺伝子の一部の欠失は、２つの標的部位でＤＳＢまたはニックを作成し、標的部位が隣接する介在標的領域の欠失を引き起こすことによっても導入され得る。

【0062】

一態様では、本開示は、ＴＦＬ１遺伝子の変異対立遺伝子を含む改変ダイズ植物、またはその植物部位を提供し、変異対立遺伝子は、内因性ＴＦＬ１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも２００の連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つのゲノム改変を含む。ダイズＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーター配列は、ＴＦＬ１ｂ遺伝子の転写開始部位の上流の２ｋｂのポリヌクレオチド配列である、配列番号４の配列を含む。ゲノム改変は、配列番号４の配列内の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも２００の連続したヌクレオチドを含む、領域の欠失であり得る。配列番号４におけるそのような欠失には、配列番号４のヌクレオチド１５３９～ヌクレオチド１５６８、ヌクレオチド１２１７～ヌクレオチド１６０４、ヌクレオチド１５１８～ヌクレオチド１６２９、ヌクレオチド９５１～ヌクレオチド１２２２、ヌクレオチド１３６４～ヌクレオチド１４０７、ヌクレオチド１３６７～ヌクレオチド１５１６、ヌクレオチド７５４～ヌクレオチド１８０６、ヌクレオチド１２１６～ヌクレオチド１３１９、ヌクレオチド１１５９～ヌクレオチド１９６５、ヌクレオチド７６０～ヌクレオチド１２１４、ヌクレオチド９３９～ヌクレオチド１０２８、ヌクレオチド１０６６～ヌクレオチド１６６４、ヌクレオチド９５２～ヌクレオチド１５５２、ヌクレオチド１６７７～ヌクレオチド１８０８、ヌクレオチド１５２４～ヌクレオチド１５５８、ヌクレオチド４７６～ヌクレオチド１４０５、ヌクレオチド１３６５～ヌクレオチド１５５９、ヌクレオチド９２８～ヌクレオチド１５６０、またはヌクレオチド５９３～ヌクレオチド１８１３にわたる領域が含まれ得る。

【0063】

一態様では、ゲノム改変は、配列番号４の配列内の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの領域の反転であり得る。そのような逆位は、除去され、逆位され、及び配列番号４の同じ位置に再挿入された配列番号４のヌクレオチド１０２９～ヌクレオチド１０６５の領域を含み得る。一態様では、ＴＦＬ１遺伝子の変異対立遺伝子は、内因性ＴＦＬ１遺伝子のプロモーター領域に２つ以上の改変を含み得る。ダイズＴＦＬ１ｂ 遺伝子のそのような変異対立遺伝子の例は本明細書に開示されており、例えば、配列番号４の配列中に２つの欠失を含む対立遺伝子が含まれ、第１の欠失は配列番号４のヌクレオチド９５２～ヌクレオチド１５５２の領域にわたり、第２の欠失は配列番号４のヌクレオチド１６７７～ヌクレオチド１８０８にわたり、対立遺伝子は配列番号４の配列内に２つの欠失及び逆位を含み、第１の欠失は配列番号４のヌクレオチド９３９～ヌクレオチド１０２８の領域にわたり、第２の欠失は配列番号４のヌクレオチド１０６６～ヌクレオチド１６６４にわたり、逆位は、除去され、逆位され、及び配列番号４の同じ位置に再挿入された配列番号４のヌクレオチド１０２９～ヌクレオチド１０６５にわたる領域を含む。

【0064】

他の標的改変をプロモーター領域に行い、ダイズＴＦＬ１ｂ遺伝子及びその相同体に新規の対立遺伝子を作成することもできる。配列番号６７～７７、７９及び８１は、それぞれ、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号６７）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号６８）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（配列番号６９）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号７０）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号７１）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（配列番号７２）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（配列番号７３）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ（配列番号７４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（配列番号７５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号７６）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（配列番号７７）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（配列番号７９）、及びＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（配列番号８１）に見られるＴＦＬ１ｂ遺伝子相同体の転写開始部位の上流の約２ｋｂのポリヌクレオチド配列を表す。例えば、１つ以上の改変部位は、配列番号４、６７～７７、７９及び８１の配列の３’末端から約２００ヌクレオチドに、または２００ヌクレオチドを超える位置に位置し得る。一態様では、配列番号４のヌクレオチド１２３７位～ヌクレオチド１５７０位にわたるＤＮＡの領域内で１つ以上の改変を行い、ダイズＴＦＬ１ｂ遺伝子に新規の対立遺伝子を作成することができる。

【0065】

更なる態様では、本開示は、ＴＦＬ１遺伝子の変異対立遺伝子を含む改変ダイズ植物またはその植物部位を提供し、変異対立遺伝子は１つ以上のジャンクション配列を含み、ジャンクション配列はジャンクション部位で少なくとも３０、少なくとも６０、少なくとも１００ヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、「ジャンクション」または「ジャンクション部位」とは、欠失、挿入、置換または逆位の部位におけるヌクレオチド配列間の接続点である。欠失の場合、ジャンクションは、以前に欠失に隣接していた配列の欠失部位の接続点である。例えば、本明細書に記載の参照配列の配列番号４と比較して、ヌクレオチド１５３９～ヌクレオチド１５６８の３０塩基対の欠失の場合、ジャンクション部はヌクレオチド１５３８～ヌクレオチド１５６９の間にあるであろう。挿入、置換または逆位の場合、ジャンクションは、挿入、逆位または置換された配列と隣接するＤＮＡ配列の間の接続点である。挿入、置換または逆位の場合、１つのジャンクションは挿入、置換または逆位の５’末端に見出せ、別のジャンクションは挿入、置換または逆位の３’末端に見出せる。「ジャンクション配列」とは、ジャンクションにわたる任意の長さのＤＮＡ配列を指す。ジャンクション配列は、少なくとも１０のヌクレオチド、少なくとも１５のヌクレオチド、少なくとも２０のヌクレオチド、少なくとも２５のヌクレオチド、少なくとも３０のヌクレオチド、少なくとも４０のヌクレオチド、少なくとも５０のヌクレオチド、少なくとも６０のヌクレオチド、少なくとも７０のヌクレオチド、少なくとも８０のヌクレオチド、少なくとも９０のヌクレオチド、少なくとも１００のヌクレオチド、少なくとも２００のヌクレオチド、少なくとも３００のヌクレオチドまたはそれ以上を含む。

【0066】

ＩＩ．ゲノム編集のためのコンストラクト
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡコンストラクト及びベクターが提供され、コード配列は、植物発現可能なプロモーターに作動可能に結合されている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに関して、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡコンストラクト及びベクターが更に提供され、ガイドＲＮＡは、標的ＴＦＬ１遺伝子でもしくはその近傍など植物のゲノム内の標的部位に対してパーセント同一性または相補性を有する、十分な長さのガイド配列を含む。部位特異的ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡをコードする組換えＤＮＡコンストラクト及びベクターのポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターなどの植物で発現可能なプロモーターに作動可能に結合され得る。

【0067】

本明細書で使用する場合、「遺伝子」とは、遺伝的及び機能的単位を形成し、１つ以上の配列関連ＲＮＡ及び／またはポリペプチド分子をコードする、核酸配列を指す。遺伝子は一般に、遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡ）の発現を調節する適切な調節配列に作動可能に結合されたコード領域を含む。遺伝子は、これらに限定されないが、プロモーター、非翻訳領域（ＵＴＲ）、エクソン、イントロン及び他の上流または下流の調節配列を含む、様々な配列エレメントを有することができる。

【0068】

本明細書で使用する場合、「対立遺伝子」とは、遺伝子または特定の遺伝子座の代替核酸配列（例えば、同じ遺伝子もしくは遺伝子座の他の対立遺伝子とは異なる遺伝子または遺伝子座の核酸配列）を指す。そのような対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と比較して、変異対立遺伝子の核酸配列に１つ以上の変異または編集が存在する場合、（ｉ）野生型、または（ｉｉ）変異体とみなすことができる。遺伝子の変異体または編集された対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と比較して、遺伝子の活性もしくは発現レベルが低下または消失している可能性がある。例えば、ＴＦＬ１遺伝子の変異体または編集された対立遺伝子は、内在性ＴＦＬ１遺伝子の上流のプロモーター領域に欠失を有する可能性がある。ダイズなどの二倍体生物の場合、第１の対立遺伝子は１つの染色体上に発生することができ、第２の対立遺伝子は第２の相同染色体の同じ遺伝子座に発生することができる。植物の一方の染色体上の遺伝子座にある一方の対立遺伝子が変異体または編集された対立遺伝子であり、植物の相同染色体上のもう一方の対応する対立遺伝子が野生型である場合、したがって、その植物は変異体または編集された対立遺伝子についてヘテロ接合性であると記載される。ただし、遺伝子座の両方の対立遺伝子が変異体または編集された対立遺伝子である場合、その植物は変異体または編集された対立遺伝子についてホモ接合性であると記載される。遺伝子座で変異体または編集された対立遺伝子がホモ接合性である植物は、ヘテロ対立遺伝子または二対立遺伝子の場合、同じ変異体もしくは編集された対立遺伝子、または異なる変異体もしくは編集された対立遺伝子を含む可能性がある。

【0069】

本明細書で使用する場合、「野生型遺伝子」または「野生型対立遺伝子」とは、特定の植物種で最も一般的な配列もしくは遺伝子型を有する遺伝子もしくは対立遺伝子、または遺伝子もしくは対立遺伝子の発現及び活性に有意な影響を及ぼさない最も一般的な配列もしくは遺伝子型と比較して、自然変異、多型もしくは他のサイレント変異のみを有する別の配列もしくは遺伝子型を指す。実際、「野生型」遺伝子または対立遺伝子には、最も一般的な配列または遺伝子型と比較して、遺伝子または対立遺伝子の正常な機能、活性、発現または表現型の結果に実質的に影響を及ぼす、変異、多型または他の種類の変異は含まれていない。

【0070】

一般に、「バリアント」という用語は、それぞれ、参照（天然）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して、そのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列で合成または天然に作成された、いくつかの差異を有する分子を指す。これらの差異には、天然のポリヌクレオチドもしくはアミノ酸配列における置換、挿入、欠失またはそのような変化の任意の所望の組み合わせが含まれる。

【0071】

本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指し、通常、植物、植物部位もしくは植物細胞、組織もしくは器官などの細胞、組織、器官もしくは生物における内因性遺伝子、異種遺伝子、導入遺伝子もしくはＲＮＡ及び／またはタンパク質コード配列などのヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。

【0072】

ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、コンストラクト、ベクターなどに関する「組換え」という用語は、人工であり、通常は天然で見出されない、及び／またはそれが通常は天然で見出されない情況で存在する、ポリヌクレオチドまたはタンパク質分子または配列を指し、ヒトの介入無しには同じ様式で天然に存在しない２つ以上のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の組み合わせを含む、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、コンストラクトなどを包含し、例えば、作動可能に結合されるが、互いに対して異種の少なくとも２つのポリヌクレオチドまたはタンパク質配列を含む、ポリヌクレオチド分子、タンパク質、コンストラクトなどである。例えば、「組換え」という用語は、同じ分子（例えば、プラスミド、コンストラクト、ベクター、染色体、タンパク質など）中の２つ以上のＤＮＡまたはタンパク質配列の任意の組み合わせであって、かかる組み合わせは人工であり、通常は天然で見出されないものを指し得る。この定義で使用する場合、「通常は天然で見出されない」という語句は、ヒトによる導入無しでは天然で見出されないことを意味する。組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質分子、コンストラクトなどは、（ｉ）天然では互いに接近して存在する他のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）から分離される、及び／または（ｉｉ）天然に互いと接近していない他のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）に隣接（または、それらと連続）する、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）を含み得る。かかる組換えポリヌクレオチド分子、タンパク質、コンストラクトなどは、細胞の外側で、遺伝子操作された及び／または構築されたポリヌクレオチドまたはタンパク質分子、または配列も指し得る。例えば、組換えＤＮＡ分子は、任意の操作されたプラスミド、または人工プラスミド、ベクターなどを含むことができ、直線状分子または環状ＤＮＡ分子を包含し得る。そのようなプラスミド、ベクターなどは、原核生物の複製開始点及び選択可能なマーカー、ならびにおそらく植物の選択可能なマーカー遺伝子などに加えて、１以上の導入遺伝子または発現カセットを含む様々な維持エレメントを含有することができる。「作動可能に結合された」という用語は、プロモーターなどが作動または機能して、少なくとも特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、発生ステージ（複数可）、及び／または条件（複数可）において、関連する転写可能ＤＮＡ配列またはコーディング配列の転写及び発現を開始する、援助する、影響する、引き起こす、及び／または促進するような、プロモーターまたは他の調節エレメントと関連する転写可能ＤＮＡ配列または遺伝子のコーディング配列（または導入遺伝子）との間の機能的な結合を指す。

【0073】

本出願における「単離されたＤＮＡ分子」もしくは「単離されたポリヌクレオチド」、または等価の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドが、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内ではないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、エレメントが生物のゲノム内にあり、エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とはみなされない。ただし、これらのエレメントのそれぞれ及びこれらのエレメントの下位部分は、エレメントが生物のゲノム内になく、エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。同様に、タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする配列が天然に見出される生物のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列となる。天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されているとみなされる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であるとみなされる。

【0074】

通常当技術分野において理解されるように、「プロモーター」という用語は概して、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び／またはＴＡＴＡボックスを含有し、関連する転写可能ポリヌクレオチド配列及び／または遺伝子（または、導入遺伝子）の転写及び発現を支援または増進するＤＮＡ配列を指し得る。プロモーターは、公知のもしくは天然に存在するプロモーター配列または他のプロモーター配列から合成的に産生され得るか、それらから変更され得るか、またはそれらに由来し得る。プロモーターとしては、２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも挙げることができる。本開示のプロモーターは、したがって公知のまたは本明細書で提供される他のプロモーター配列（複数可）に組成で類似するが同一ではない、プロモーター配列のバリアントまたはその断片を包含し得る。本明細書で提供されるプロモーター、またはそのバリアントもしくは断片は、「最小プロモーター」を含み得、これは、転写の基礎レベルを提供し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体を認識し、結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等の配列で構成される。プロモーターは、構成的、発生的、組織特異的、誘導可能など、プロモーターへ作動可能に結合された、関連するコード配列もしくは転写可能配列または遺伝子（導入遺伝子を包含する）の発現のパターンに関する様々な基準に従って分類され得る。植物のすべてまたは大部分の組織において発現を駆動するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。発生の特定の期間または段階中に発現を駆動するプロモーターは、「発生」プロモーターと称される。他の植物の組織に比べて植物の特定の組織において促進された発現を駆動するプロモーターは、「組織促進的」プロモーターまたは「組織優先的」プロモーターと称される。したがって、「組織優先的」プロモーターは、植物の特異的組織（複数可）中の比較的より高いか、または選択的な発現を引き起こすが、植物の他の組織（複数可）中のより低いレベルの発現を伴う。植物の特異的組織（複数可）内で発現し、植物の他の組織中でほとんどまたはまったく発現しないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。「誘導可能」プロモーターは、環境刺激（寒冷、渇水または光など）または他の刺激（創傷または化学物質適用など）に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターは、例えば、異種、同種、キメラ、合成などのその起源の点で分類することもできる。

【0075】

本明細書で使用する場合、「植物で発現可能なプロモーター」は、植物細胞または組織において関連する転写可能ＤＮＡ配列、コード配列もしくは遺伝子の転写及び発現を開始する、援助する、影響する、引き起こす、及び／または促進することができる、プロモーターを指す。

【0076】

「異種の」という用語は、関連するポリヌクレオチド配列（例えば、転写可能ＤＮＡ配列またはコード配列もしくは遺伝子）に関してプロモーターまたは他の調節配列に関し、ヒトによる導入無しでは天然で、かかる関連するポリヌクレオチド配列へ作動可能に結合されない（例えば、プロモーターもしくは調節配列は、関連するポリヌクレオチド配列に比べて異なる起源を有する、及び／または、プロモーターもしくは調節配列は、プロモーターもしくは調節配列により形質転換される植物種中に天然に存在しない）、プロモーターまたは調節配列である。

【0077】

本明細書で使用する場合、「内因性遺伝子」または「内因性遺伝子座」とは、その天然の元の染色体位置にある遺伝子または遺伝子座を指す。本明細書で使用する場合、「内因性ＴＦＬ１遺伝子」とは、その元の染色体位置にあるＴＦＬ１遺伝子座を指す。

【0078】

本明細書で使用する場合、タンパク質コード遺伝子との関連で、「エクソン」とは、タンパク質またはポリペプチド配列をコードする情報を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のセグメントを指す。

【0079】

本明細書で使用する場合、遺伝子の「イントロン」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードする情報を含まず、最初にＲＮＡ配列に転写されるが、その後成熟ＲＮＡ分子からスプライシング除去される、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のセグメントを指す。

【0080】

本明細書で使用する場合、遺伝子の「非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、遺伝子（または、導入遺伝子）から発現されるＲＮＡ分子または配列（例えば、ｍＲＮＡ分子）のセグメントを指すが、ＲＮＡ分子のエクソン配列及びイントロン配列は含まれない。「非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、ＲＮＡ分子のＤＮＡセグメント、またはそのようなＵＴＲセグメントをコードする配列も指す。非翻訳領域は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子または配列のコード領域と比較して、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子もしくは配列の５’末端に位置するか、または３’末端に位置するかに応じて、５’－ＵＴＲまたは３’－ＵＴＲになる（すなわち、それぞれ、エクソン及びイントロン配列の上流（５’）または下流（３’））。

【0081】

本明細書で使用する場合、「転写終結配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼ複合体から新たに合成された転写ＲＮＡ分子の放出を誘発し、遺伝子または遺伝子座の転写の終了を示す、シグナルを含む核酸配列を指す。

【0082】

本明細書で使用する場合、「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」または「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）」は、同じ生物学的機能を実行するタンパク質群のタンパク質、例えば、同じＴＦＬ１様タンパク質ファミリーに属し、本開示の改変された植物において共通の強化された形質を提供するタンパク質を意味する。相同体は、相同遺伝子によって発現される。相同遺伝子に関して、相同体には、オルソログ、例えば、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化し、同じ機能を保持しているタンパク質をコードする異なる種で発現される遺伝子が含まれるが、パラログ、すなわち、重複によって関連しているが、異なる機能を持つタンパク質をコードするように進化した遺伝子は含まれない。相同遺伝子には、天然に存在する対立遺伝子、及び人工的に作成されたバリアントが含まれる。

【0083】

２つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列との関連において本明細書で使用される「同一性パーセント」、「％同一性」または「パーセント同一」という用語は、（ｉ）２つの最適にアラインメントされた配列（ヌクレオチドまたはタンパク質）を比較ウィンドウにわたって比較し、（ｉｉ）両方の配列において同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列の場合）またはアミノ酸残基（タンパク質の場合）が生じている位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、（ｉｉｉ）一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、次いで（ｉｖ）この商に１００％を掛けて同一性パーセントを取得することによって算出される。「同一性パーセント」が、特定の比較ウィンドウを指定せずに参照配列に対して算出される場合、同一性パーセントは、アラインメントの領域にわたる一致した位置の数を参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本出願の目的に関して、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適にアラインメントされる（それらのアラインメントにおけるギャップを許容する）場合、クエリ配列に対する「同一性パーセント」は、２つの配列間で同一の位置の数を、クエリ配列における、その長さ（または、比較ウィンドウ）にわたる位置の総数で割り、次いでそれに１００％を掛けたものに等しい。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用される場合、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって分子の機能特性を変化させない保存的アミノ酸置換によって異なっている場合が多いと認識される。配列が保存的置換において異なっている場合、配列同一性パーセントは、上方調整して、置換の保存的性質を補正してもよい。そのような保存的置換によって異なっている配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。塩基配列に対して同一性パーセントを有する配列は、塩基配列の活性を示し得る。

【0084】

遺伝暗号の縮重により、遺伝子から生成されるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性が得られる。最適にアラインメントしたとき、相同体タンパク質またはそれらの対応するヌクレオチド配列は、通常、植物細胞で発現させたとき、変化した有限性表現型を付与することに関連すると同定されたタンパク質またはその対応するヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の同一性がある。本発明の実施形態によれば、ＴＦＬ１遺伝子またはその相同体は、配列番号２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ダイズＴＦＬ１ｂタンパク質（配列番号２）の相同体の例としては、配列番号５２～６６、７８及び８０の配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【0085】

相同体は、タンパク質配列の比較により、例えば、手動で、またはコンピューターベースのツールを使用して、配列の類似性から推定される。配列の同一性パーセントを算出する配列の最適なアラインメントに関して、２つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列間の配列同一性または類似性を比較するために使用することができる、様々なペアワイズまたはマルチプル配列アラインメントアルゴリズム及びプログラム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（登録商標）（ＢＬＡＳＴ）などが当技術分野で公知である。ＢＬＡＳＴは、例えば、様々な生物のタンパク質配列のデータベースに対して基本生物のクエリタンパク質配列を検索し、類似の配列を見つけるために使用することもできる。生成された概要の期待値（Ｅ値）を使用し、配列の類似性のレベルを測定できる。特定の生物の最も低いＥ値を持つタンパク質のヒットは、必ずしもオルソログであるとは限らない、または唯一のオルソログであるとは限らないため、オルソログを同定するために有意なＥ値を持つヒット配列をフィルタリングするために逆クエリが使用される。逆クエリには、基本生物のタンパク質配列のデータベースに対する重要なヒットの検索が伴う。逆クエリの最良のヒットがクエリタンパク質自体またはクエリタンパク質のパラログである場合、ヒットはオルソログとして識別できる。逆クエリプロセスにより、オルソログは、すべての相同体の中でパラログから更に区別され、遺伝子の機能的同等性の推論が可能になる。

【0086】

２つのヌクレオチド配列に関して本明細書で使用する場合、「相補性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」または「相補性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、同一性パーセントの概念と同様であるが、クエリ配列とサブジェクト配列が直線的に配置され、ループ、ステムまたはヘアピンなどの二次折り畳み構造を伴わずに最適に塩基対形成された場合に、サブジェクト配列のヌクレオチドと最適に塩基対形成またはハイブリダイズするクエリ配列のヌクレオチドの割合を指す。このような相補性パーセントは、２本のＤＮＡ鎖、２本のＲＮＡ鎖、またはＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間であり得る。「相補性パーセント」は、（ｉ）２つのヌクレオチド配列を線状かつ完全に展開された配置で（すなわち、折り畳みまたは二次構造なしで）比較ウィンドウにわたって最適に塩基対形成またはハイブリダイズさせ、（ｉｉ）比較ウィンドウにわたって２つの配列間で塩基対を形成する位置の数を決定して相補的位置の数を求め、（ｉｉｉ）相補的位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、（ｉｖ）この商に１００％を掛けて２つの配列の相補性パーセントを求めることによって計算される。２つの配列の最適な塩基対形成は、水素結合によるＧ－Ｃ、Ａ－Ｔ及びＡ－Ｕなどのヌクレオチド塩基の既知の対形成に基づいて決定することができる。「相補性パーセント」が、特定の比較ウィンドウを指定することなく、参照配列との関連で算出される場合、同一性パーセントは、２つの線状配列間の相補的位置を参照配列の全長で割ることによって決定される。したがって、本出願の目的に関して、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が最適に塩基対形成される（ミスマッチまたは非塩基対のヌクレオチドは許容されるが、折り畳みまたは二次構造はない）場合、クエリ配列に対する「同一性パーセント」は、２つの配列間で同一の位置の数を、クエリ配列における、その長さにわたる位置の総数で割り（または、比較ウィンドウにわたるクエリ配列における位置の総数で割り）、次いでそれに１００％を掛けたものに等しい。

【0087】

本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの「断片」とは、本明細書で開示されるＤＮＡ分子またはタンパク質の少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上を含む配列を指す。出発プロモーター分子からそのような断片を作成する方法は、当技術分野で周知である。ＤＮＡ分子またはタンパク質の断片は、それらが由来するＤＮＡ分子またはタンパク質の活性を示す場合がある。

【0088】

別の態様によれば、本開示は、植物の収量を増加させる、有限性を変更する、または倒伏を減少させるなど、表現型を変更するための方法であって、（ａ）（ｉ）本明細書に記載のＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子などのダイズＴＦＬ１遺伝子及びその相同体に対応する植物の内在性遺伝子を同定することと、（ｉｉ）標的変異誘発を介して植物細胞内の内在性遺伝子のプロモーター配列を改変し、内在性遺伝子の発現レベルを改変することと、によって植物細胞のゲノムを改変すること、及び（ｂ）植物細胞から植物を再生または発生させることを含む、前記方法を提供する。異なる植物種に由来する様々なＴＦＬ１遺伝子及びタンパク質は、それらが類似の核酸及び／またはタンパク質配列を有し、少なくとも１つの既知のＴＦＬ１遺伝子またはタンパク質と保存されたアミノ酸及び／または構造ドメイン（複数可）を共有する場合、同定され、本開示で使用するためのＴＦＬ１相同体またはオルソログとみなされる可能性がある。

【0089】

本開示の形質転換ベクターまたはコンストラクトにおける植物選択可能マーカー導入遺伝子は、抗生物質または除草剤などの選択剤の存在により、形質転換細胞または組織の選択を補助するために使用することができ、植物選択可能マーカー導入遺伝子は、選択剤に対する耐性または抵抗性を提供する。したがって、選択剤は、Ｒ_０植物における形質転換細胞または組織の割合を増加させるなど、植物選択マーカー遺伝子を発現する形質転換細胞の生存、発生、成長、増殖などに偏りまたは有利となる可能性がある。一般的に使用される植物選択マーカー遺伝子としては、抗生物質（例えば、カナマイシン及びパロモマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）、ストレプトマイシンもしくはスペクチノマイシン（ａａｄＡ）ならびにゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４））に対する耐性もしくは抵抗性を付与するもの、または除草剤（例えば、グルホシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）、ジカンバ（ＤＭＯ）及びグリホサート（ｐｒｏＡまたはＥＰＳＰＳ））に対する耐性もしくは抵抗性を付与するものが挙げられる。植物をスクリーニング可能なマーカー遺伝子も使用することができ、これは、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または様々な発色基質が公知であるβグルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）を発現する遺伝子などの形質転換体を視覚的にスクリーニングする能力を提供する。植物形質転換はまた、形質転換外植片、組織、植物及び／または植物部位の培養、発生もしくは再生の１つ以上の工程または段階中に、選択の非存在下で行うこともできる。

【0090】

ＩＩＩ．形質転換方法
標的ゲノム編集に必要な１つ以上の分子（例えば、ガイドＲＮＡ（複数可）及び／または部位特異的ヌクレアーゼ）をコードする組換えＤＮＡ分子またはコンストラクトで植物細胞、組織または外植片を形質転換するための方法ならびに組成物が提供される。宿主植物細胞の形質転換のための好適な方法には、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入することができる（例えば、組換えＤＮＡコンストラクトが植物染色体に安定的に組み込まれる場合、または組換えＤＮＡコンストラクトもしくはＲＮＡが植物細胞に一過性に供給される場合）事実上、あらゆる方法が含まれ、それらは当技術分野で周知である。細胞形質転換のための２つの有効な方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ媒介形質転換、及び微粒子または粒子銃媒介形質転換などの細菌を介した形質転換である。微粒子銃法は、例えば、米国特許第ＵＳ５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、及び同第６，３９９，８６１号に示される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法は、例えば、米国特許第５，５９１，６１６号に記載される。マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、真空浸潤、圧力、超音波処理、炭化ケイ素繊維撹拌、ＰＥＧ媒介性形質転換などの植物形質転換のための他の方法も、当技術分野で公知である。

【0091】

植物材料の形質転換は、例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる栄養素の混合物などの栄養培地での組織培養で実施される。レシピエント細胞の標的としては、分裂組織細胞、茎頂、胚軸、カルス、未成熟または成熟胚、ならびに小胞子及び花粉などの配偶子細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。カルスは、これらに限定されないが、未成熟または成熟胚、胚軸、苗の頂端分裂組織、小胞子などを含む組織源から開始されてもよい。形質転換核を含む細胞は、形質転換植物内で増殖する。当技術分野で公知の植物細胞の形質転換のための任意の適切な方法または技術を、本発明の方法に従って使用することができる。形質転換では、ＤＮＡは、通常、いずれか１つの形質転換実験において、わずかな割合を占める標的植物細胞に導入される。マーカー遺伝子を使用して、組換えＤＮＡ分子をそれらのゲノムに受容すること及び組み込むことにより、安定に形質転換された細胞を同定するための有効な系を提供する。

【0092】

本明細書で使用する場合、「再生」及び「再生すること」という用語は、１つ以上の培養工程を介して１つ以上の植物細胞から植物を増殖または発生させるプロセスを指す。ＤＮＡ配列の挿入もしくは編集を含む形質転換または編集した細胞、組織または外植片は、当技術分野で公知の方法に従って、培養、プラグもしくは土壌中でトランスジェニック植物に成長、発達または再生され得る。したがって、本開示の特定の実施形態は、ゲノム編集から生じる改変されたゲノムＤＮＡを有する細胞から植物を再生するための方法及びコンストラクトに関する。次に、再生された植物は、更なる植物を繁殖させるために使用できる。

【0093】

本開示の一態様によれば、再生された植物、またはその子孫植物、植物部位もしくは種子は、発生もしくは再生された植物、またはその子孫植物、植物部位もしくは種子において、編集もしくは変異による、もしくは挿入配列、導入遺伝子などの部位特異的組込みによるマーカー、形質もしくは表現型に基づいて、スクリーニングまたは選択されることができる。所与の変異、編集、形質または表現型が劣性である場合、形質または表現型を観察することができるように、最初のＲ_０植物からの１つ以上の世代または交配（例えば、自殖）は、編集または変異のためのホモ接合の植物を生成するのに必要であり得る。子孫植物（Ｒ_１種子から増殖させた植物または後続世代中の植物など）は、任意の公知の接合性アッセイを使用して（ヘテロ接合体とホモ接合体と野生型植物との間の区別を可能にする、一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイ、ＤＮＡ塩基配列決定、熱増幅もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び／またはサザンブロッティング等の使用によって）、接合性について試験され得る。

【0094】

標的編集もしくは導入遺伝子の存在に関して細胞または植物などをスクリーニングする及び／または同定する、ならびに標的編集もしくは導入遺伝子を含む細胞または植物を選択するための方法ならびに技術が提供され、これは、１つ以上の表現型もしくは形質、または細胞もしくは植物における分子マーカーもしくはポリヌクレオチドもしくはタンパク質配列の有無に基づくことができる。本明細書で使用する場合、「分子技法」とは、核酸、タンパク質もしくは脂質の使用、操作もしくは解析を伴う、分子生物学、生化学、遺伝子学、植物生物学、または生物物理学の分野で公知の任意の方法を指す。限定されないが、ゲノムにおける改変配列の存在を検出するのに有用な分子技法としては、表現型スクリーニング；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｉｎｆｉｎｉｕｍ技術によるＳＮＰ解析などの分子マーカー技術；サザンブロット；ＰＣＲ；酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び配列決定（例えば、サンガー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、４５４、Ｐａｃ－Ｂｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標））が挙げられる。一態様では、本明細書で提供される検出方法は、表現型スクリーニングを含む。別の態様では、本明細書で提供される検出方法は、ＳＮＰ解析を含む。更なる態様では、本明細書で提供される検出方法は、サザンブロットを含む。更なる態様では、本明細書で提供される検出方法は、ＰＣＲを含む。一態様では、本明細書で提供される検出方法は、ＥＬＩＳＡを含む。更なる態様では、本明細書で提供される検出方法は、核酸またはタンパク質配列を決定することを含む。限定されないが、核酸は、ハイブリダイゼーションを使用して検出することができる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）において詳細に論じられている。

【0095】

核酸は、当技術分野で慣例的な技法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、限定されないが、組換え核酸技術及び／またはＰＣＲを含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技法は、例えばＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消化及びライゲーションを含み、これを使用して核酸を単離することができる。単離された核酸は、単一核酸分子または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして、化学的に合成することもできる。

【0096】

検出（例えば、増幅産物、ハイブリダイゼーション複合体またはポリペプチドの）は、ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体に付着または会合し得る、検出可能な標識を使用して達成することができる。「標識」という用語は、直接的標識及び間接的標識の使用を包含することが意図される。検出可能な標識には、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が含まれます。改変された（例えば、編集された）植物または植物細胞のスクリーニング及び選択は、分子生物学の当業者に公知の任意の方法論によって行うことができる。スクリーニング及び選択の方法論の例としては、サザン分析、ポリヌクレオチド検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物検出のためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガー配列決定、次世代配列決定技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）など）、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び酵素結合イムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色などの他の技術を使用して、ポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出することもできる。参照した技術のすべてを実行するための方法は、当技術分野で公知である。

【0097】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。ポリペプチドの一例は、タンパク質である。本明細書で提供されるタンパク質は、本明細書で提供される核酸分子によってコードされ得る。ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって、天然源（例えば、生体試料）から精製することができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることによって精製することもできる。更に、精製されたポリペプチドは、化学合成によって得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定することができる。

【0098】

ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が挙げられる。本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本明細書で提供されるポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知の方法を使用してマイクロタイタープレートなどの固体支持体に結合させることができる。

【0099】

組換えＤＮＡ分子またはガイドＲＮＡを含む形質転換ベクターで形質転換され得る植物には、様々な顕花植物または被子植物が含まれ得、これらは、様々な双子葉類（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ）（双子葉類（ｄｉｃｏｔ））植物種または単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ）（単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔ））植物種を含むものとして更に定義され得る。双子葉植物は、マメ科（マメ科植物など）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｓｐｐ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂｕｔａｔａｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｐｐ．）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）などの果樹、プラム、アンズ、モモ、サクランボなど、ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ．）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）などのＰｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、コショウ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ブドウ （Ｖｉｔｉｓ、Ｍｕｓｃａｄｉｎｉａ））、トマト （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）のメンバー、ならびにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ科メンバー、特に、種子油の供給源として有用なアブラナ属種であり得る。マメ科植物（Ｌｅｇｕｍｅ）及びマメ科植物（ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｐｌａｎｔ）には、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キマメ（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）、グアル（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）、キャロブ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）、フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ－ｇｒａｅｃｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、ミドリマメ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｕｎａｔｕｓ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓまたはＬｅｎｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ Ｈｙｐｏｇａｅａ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）、及びヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）が含まれる。単子葉植物には、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｓｐｐ．）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、ならびにトウモロコシ （Ｚｅａ Ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）などの穀物が含まれる。本開示が広範囲の植物種に適用され得ることを考慮すると、本開示は更に、丸莢、長角果、果実、堅果、塊茎などのマメ科植物の莢に類似した他の植物構造にも適用される。

【0100】

ＩＶ．ゲノム改変された植物
本明細書で使用する場合、植物、植物種子、植物部位、植物細胞、及び／または植物ゲノムとの関連で「改変された」とは、野生型もしくは対照植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムと比較した、１つ以上の目的の遺伝子の発現レベル及び／または内因性配列の操作された変化を含む、植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムを指す。実際、「改変された」という用語は更に、化学的変異誘発、トランスポゾンの挿入もしくは切除、もしくは他の公知の変異誘発技術によって導入された、またはゲノム編集によって導入された内因性ＴＦＬ１遺伝子の発現に影響を及ぼす１つ以上の欠失を有する、植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムを指し得る。一態様では、改変された植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムは、１つ以上の導入遺伝子を含むことができる。したがって、明確にするために、改変された植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムには、野生型または対照植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムと比較して、ＴＦＬ１遺伝子の改変された発現レベル、発現パターン及び／または配列を有する変異、編集及び／またはトランスジェニック植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムが含まれる。

【0101】

改変された植物、植物部位、種子などは、変異誘発、ゲノム編集もしくは部位特異的組込み、遺伝子形質転換、またはこれらの組み合わせを受けている可能性がある。そのような「改変された」植物、植物種子、植物部位及び植物細胞には、ＴＦＬ１遺伝子に対する分子変化（例えば、発現レベル及び／または活性の変化）を保持する、子孫であるか、または「改変された」植物、植物種子、植物部位及び植物細胞に由来する、植物、植物種子、植物部位ならびに植物細胞が含まれる。本明細書で提供される改変された種子は、本明細書で提供される改変された植物を生じさせることができる。本明細書で提供される改変された植物、植物種子、植物部位、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書で提供される組換えＤＮＡコンストラクトもしくはベクター、またはゲノム編集を含み得る。「改変された植物生成物」は、本明細書で提供される改変された植物、植物部位、植物細胞もしくは植物染色体、またはその任意の一部もしくは成分から作成された任意の生成物であり得る。

【0102】

改変された植物は、それ自身または他の植物と更に交雑して、改変された植物の種子及び子孫を作成することができる。改変された植物はまた、ＤＮＡ配列もしくはコンストラクトまたは編集（例えば、ゲノム欠失）を含む第１の植物と、ＤＮＡ配列もしくはコンストラクトまたは編集を欠く第２の植物とを交雑することによって調製することができる。例えば、ＤＮＡ配列または逆位は、形質転換または編集に適した第１の植物系統に導入され、これは、その後、第２の植物系統と交雑して、ＤＮＡ配列または編集（例えば、欠失）を第２の植物系統に遺伝子移入することができる。これらの交雑の子孫を更に、より望ましい系統へと６～８世代または戻し交雑のように複数回戻し交雑し、元の親系統と実質的に同じ遺伝子型を有するがＤＮＡ配列または編集の導入のための子孫植物を作成してもよい。本明細書で提供される改変された植物、植物細胞または種子は、ハイブリッド植物、植物細胞または種子であり得る。本明細書で使用する場合、「ハイブリッド」は、子孫がそれぞれの親からの遺伝物質を含むように、異なる品種、系統、近交系または種由来の２つの植物を交雑することによって作成される。当業者であれば、より高次のハイブリッドも同様に生成できることを認識している。

【0103】

本明細書で提供される改変された植物、植物部位、植物細胞または種子は、エリート品種またはエリート系統のものであり得る。「エリート品種」または「エリート系統」とは、優れた農学的成績についての育種及び選抜から生じた品種を指す。

【0104】

本明細書で使用する場合、「対照植物」（または同様に「対照」植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノム）という用語は、改変された植物（または、改変された植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノム）との比較に使用され、ＴＦＬ１遺伝子に影響を及ぼすゲノム編集（複数可）（例えば、欠失）を除き、改変された植物（または、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノム）と同一または類似の遺伝的背景（例えば、同一の親系統、ハイブリッド交雑、近交系、テスターなど）を有する、植物（または、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノム）を指す。例えば、対照植物は、改変された植物を作製するために使用された近交系と同じ近交系であってもよく、または対照植物は、改変された植物と同じ近交系親系統の雑種交雑の生成物であってもよいが、ただし、対照植物には、ＴＦＬ１遺伝子に影響を及ぼすトランスジェニックイベントまたはゲノム編集（複数可）が存在しないことを除く。同様に、「非改変対照植物」とは、改変された植物と実質的に類似または本質的に同一の遺伝的背景を共有するが、改変された植物のゲノムに対する１つ以上の操作された変更（例えば、変異または編集）がない植物を指す。改変された植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムとの比較を目的として、「野生型植物」（または同様に「野生型」植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノム）とは、非トランスジェニック及び非ゲノム編集対照植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムを指す。本明細書で使用する場合、「対照」植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムはまた、分析すべき特性または形質の比較のために十分に類似しているとみなされる場合、改変された植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムに類似した（しかし、同じまたは同一ではない）遺伝的背景を有する植物、植物種子、植物部位、植物細胞及び／または植物ゲノムであり得る。

【0105】

本明細書で使用する場合、「抑制する」、「抑制」、「阻害する」、「阻害」、「阻害すること」、「ノックアウト」、「ノックダウン」及び「下方制御」という用語は、植物発育の同じ段階（複数可）での野生型もしく対照植物、細胞または組織における、そのような標的ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現レベルと比較して、植物発育の１つ以上の段階（複数可）での植物、植物細胞または植物組織の標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現レベルの低下、低減、または排除を指す。いくつかの実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低下したＴＦＬ１遺伝子発現レベルを有する、改変された植物が提供される。更なる実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、５％～４０％、５％～５０％、５％～６０％、５％～７０％、５％～７５％、５％～８０％、５％～９０％、５％～１００％、７５％～１００％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～７５％、２５％～７５％、３０％～８０％、または１０％～７５％低下したＴＦＬ１遺伝子発現レベルを有する、改変された植物が提供される。

【0106】

いくつかの実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低下したＴＦＬ１ ｍＲＮＡレベルを有する、改変された植物が提供される。いくつかの実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、５％～４０％、５％～５０％、５％～６０％、５％～７０％、５％～７５％、５％～８０％、５％～９０％、５％～１００％、７５％～１００％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～７５％、２５％～７５％、３０％～８０％、または１０％～７５％低下したＴＦＬ１ ｍＲＮＡ発現レベルを有する、改変された植物が提供される。いくつかの実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低下したＴＦＬ１タンパク質発現レベルを有する、改変された植物が提供される。いくつかの実施形態によれば、対照植物と比較して、少なくとも１つの植物組織において、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、５％～４０％、５％～５０％、５％～６０％、５％～７０％、５％～７５％、５％～８０％、５％～９０％、５％～１００％、７５％～１００％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～７５％、２５％～７５％、３０％～８０％、または１０％～７５％低下したＴＦＬ１タンパク質発現レベルを有する、改変された植物が提供される。

【0107】

本開示は、これらに限定されないが、収量の増加、有限性の増加、終末開花日に達するまでの時間の短縮、倒伏率の低下、及び真菌性病害に対する感受性の低下を含む、改善された経済的に重要な特徴を有する植物に関する。収量に関してより具体的には、本開示は、本明細書に記載のゲノム編集または変異を含む改変された植物に関し、植物は、対照植物と比較して収量が増加している。本開示の多くの植物は、対照植物と比較して、収量の増加または収量形質成分の改善を示した。収量は、作物から得られる測定可能な経済的価値の生産物として定義できる。収量は、量及び／または品質の範囲で定義できる。例えば、ダイズ収量には、植物あたりの莢、エーカーあたりの莢、植物あたりの種子、莢あたりの種子、種子あたりの重量、莢あたりの重量、節あたりの莢、節数、及び植物あたりの節間の数が含まれ得る。収量は、例えば、器官の数及び大きさ、植物の構造（枝の数、植物バイオマスなど）、開花時期及び開花期間、穀粒の充填期間といったいくつかの要因に直接依存する可能性がある。根の構造及び発達、光合成効率、栄養素の取り込み、ストレス耐性、初期の成長力、老化の遅れ、機能的緑葉維持表現型は、収量を決定する重要な要因となり得る。したがって、上記の要因を最適化することは、作物の収量の増加に貢献できる。

【0108】

本開示の組換えＤＮＡで形質転換された植物細胞を含む、または植物細胞に由来する改変された植物は、積み重ねられた形質で更に強化されることができ、例えば、作物植物に有益な農学的形質（除草剤及び／または害虫抵抗性形質など）を提供する、１つ以上の農学的関心の遺伝子と組み合わせた、本明細書に開示されるＤＮＡの発現の結果として生じる増強された形質を有する改変された作物植物が挙げられる。例えば、本開示の組換えＤＮＡコンストラクトによって付与される形質は、鱗翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目及び他の昆虫に対する抵抗性、または栄養価の改善などの品質形質の改善を提供するために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の遺伝子を使用するなど、昆虫抵抗性を提供する形質など、農学的関心の他の形質と積み重ねることができる。昆虫／線虫／ウイルス抵抗性を付与するための分子及び方法は、米国特許第５，２５０，５１５号、同第５，８８０，２７５号、同第６，５０６，５９９号、同第５，９８６，１７５号、及び米国特許出願公開第２００３／０１５００１７Ａ１号に開示されている。

【0109】

トランスジェニック植物耐性が証明されており、本開示の方法及び組成物が適用できる除草剤には、グリホサート、ジカンバ、グルホシネート、スルホニル尿素、ブロモキシニル、ノルフルラゾン、２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ）酢酸、アリールオキシフェノキシプロピオネート、ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害剤（ＨＰＰＤ）、及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤（ＰＰＯ）除草剤が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で公知の除草剤耐性に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子には、グリホサート耐性を付与するための米国特許第５，０９４，９４５号、同第５，６２７，０６１号、同第５，６３３，４３５号及び同第６，０４０，４９７号に開示されている５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするポリヌクレオチド分子；グリホサート耐性を付与するための米国特許第５，４６３，１７５号に開示されているグリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）及び米国特許出願公開第２００３／００８３４８０Ａ１号に開示されているグリホサート－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）をコードするポリヌクレオチド分子；ジカンバ耐性を付与するための米国特許出願公開第２００３／０１３５８７９Ａ１号に開示されているジカンバモノオキシゲナーゼ；ブロモキシニル耐性を付与するための米国特許第４，８１０，６４８号に開示されているブロモキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）をコードするポリヌクレオチド分子；ノルフルラゾン耐性についてＭｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ.（Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：８３３－８４０，１９９３）及びＭｉｓａｗａら（Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：４８１－４８９，１９９４）に記載されたフィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ）をコードするポリヌクレオチド分子；スルホニル尿素系除草剤に対する耐性を付与するためのＳａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ.（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８８－２１９３，１９９０）に記載されているアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ、別名ＡＬＳ）をコードするポリヌクレオチド分子；グルホシネート及びビアラホス耐性を付与するためのＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ.（ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３－２５１９，１９８７）に開示されているバー遺伝子として公知のポリヌクレオチド分子；Ｎ－アミノメチルホスホン酸耐性を付与するための米国特許出願公開第２００３／０１０６０９Ａ１号に開示されているポリヌクレオチド分子；ピリジン除草剤耐性を付与するための米国特許第６，１０７，５４９号に開示されているポリヌクレオチド分子；が含まれるが、これらに限定されない。グリホサート、アトラジン、ＡＬＳ阻害剤、イソキソフルトール及びグルホシネート除草剤などの複数の除草剤に対する耐性を付与するための分子ならびに方法は、米国特許第６，３７６，７５４号及び米国特許出願公開第２００２／０１１２２６０号に開示されている。

【0110】

真菌性病害抵抗性を付与する遺伝エレメント、方法及び導入遺伝子も、本開示で使用することができる（米国特許第６，６５３，２８０号、同第６，５７３，３６１号、同第６，５０６，９６２号、同第６，３１６，４０７号、同第６，２１５，０４８号、同第５，５１６，６７１号、同第５，７７３，６９６号、同第６，１２１，４３６号、同第６，３１６，４０７号、同第６，５０６，９６２号）。真菌によって引き起こされるダイズ病害には、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｍｅｉｂｏｍｉａｅ（ダイズさび病）、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｍａｔｉｕｍ ｖａｒ．ｔｒｕｎｃａｔｕｍ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズ炭疽病）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ根と茎の腐敗）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ茎の腐敗）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ（突然死症候群）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（Ｆｕｓａｒｉｕｍ根腐れ）、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ（炭腐病）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（褐点病）、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ（Ｐｙｔｈｉｕｍ種子腐敗）、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｖａｒ．ｓｏｊａｅ（莢枯病）、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｌｏｎｇｉｃｏｌａ（茎枯病）、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ 種子腐敗）、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ（べと病）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ根と茎の腐敗、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ葉枯病）、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｒｅｇａｔａ（落葉病）、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ Ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｖａｒ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ（枝枯病）、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ（紫斑病）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ． （褐色輪紋病）、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ（斑点病）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ（白絹病）、Ａｒｋｏｏｌａ ｎｉｇｒａ（黒葉枯病）、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ Ｂａｓｉｃｏｌａ（黒根腐病）、Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｉｆｅｒａ、Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ ｔｒｉｓｐｏｒａ （Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ葉枯病）、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ斑点病）、Ｍｙｃｏｌｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（Ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ根腐れ）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ茎腐れ）、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ ｓｏｊｉｃｏｌａ（Ｐｈｙｌｏｓｔｉｃｔａ斑点病）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ斑点病）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｒｏｔａｌａｒｉａｅ（黒根腐病）、Ｄａｃｔｕｌｉｏｃｈａｅｔａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（赤葉枯病）、Ｓｐａｃｅｌｏｍａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（赤カビ病）、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ葉枯病）、Ｃｏｒｙｎｅｓｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ（褐色輪紋病）、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ ｃｏｒｙｌｉ（子実汚斑病）、及びＰｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍｏｍｎｉｖｏｒｕｍ（ワタ根腐れ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0111】

Ｖ．定義
以下の定義は、本明細書で使用される本開示の関連の実施形態を参照して、これらの用語の意味を定義し明確にするために、及び本開示の理解において当業者を導くために提供される。特に明記しない限り、用語は、関連技術、特に分子生物学及び植物形質転換の分野における、それらの従来の意味及び用法に従って理解されるべきである。

【0112】

本開示の要素またはその実施形態（複数可）を導入するとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び「前記（ｓａｉｄ）」という冠詞は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。

【0113】

「及び／または」という用語は、２つ以上の項目の列挙で使用される場合、この用語が関連付けられている項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはすべての項目を意味する。

【0114】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」という用語は、包括的であり、列挙される要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することが意図される。例えば、１つ以上の工程を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、それらの１つ以上の工程のみ保持することに限定されず、他の列挙されていない工程も包含し得る。同様に、１つ以上の特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の組成物またはデバイスは、それらの１つ以上の特徴のみ保持することに限定されず、他の列挙されていない特徴も包含し得る。

【0115】

本明細書で使用する場合、「植物」には、再生または発育の任意の段階にある植物全体、外植片、植物部位、苗木、または小植物が含まれる。

【0116】

本明細書で使用する場合、「植物部位」は、分裂組織、苗条器官／構造（例えば、葉、茎または節）、根、花または花の器官／構造（例えば、苞、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯、及び胚珠）、種子、胚、胚乳、種皮、果実、成熟した子房、珠芽、または他の植物組織（例えば、維管束組織、表皮組織、基本組織など）もしくはその一部などの植物の任意の器官またはインタクトな組織を指すことができる。本開示の植物部位は、生育可能、生育不可能、再生可能、及び／または再生不可能であってもよい。「珠芽」には、植物全体に成長できるあらゆる植物部位が含まれる。

【0117】

「胚」は、成体植物のすべてまたは一部へと発育し得る前駆体組織（例えば、分裂組織）からなる、植物種子の一部である。「胚」は更に、植物胚の部分を包含し得る。

【0118】

「分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍ）」または「分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）」は未分化細胞または分裂組織的細胞を含み、それらは、１つ以上の種類の植物部位、組織または構造（例えば、苗条、茎、根、葉、種子などのすべてまたは一部）を産生するように分化することが可能である。

【0119】

本明細書で使用する場合、「有限性生長習性」とは、主茎が成熟した莢の房で終わった後に栄養生長が停止することを指す。有限性ダイズ品種は、主茎のすべてまたはほとんどの節が発育したときに開花し始める。それらは、通常、長さ数センチメートルであり得、多数の花が咲き得る、細長い総状花序がある。本明細書で使用する場合、「無限性生長習性」とは、生殖期間の一部を通じて葉と花が同時に発育し、末端頂点に１～３個の莢を有することを指す。無限性ダイズ品種は、その適応緯度で栽培した場合、主茎の節の約半分が発育したときに開花する。それらは短い総状花序を有し、花はほとんどなく、末端節には数個の花しかない。「半有限性」ダイズ品種も主茎の節の約半分が発達したときに開花するが、主茎の節の発育と開花は無限性品種よりも突然停止する。その総状花序は短く、頂生の花を除いてほとんど花はないが、頂生の花は植物の下方の花よりも数倍多い。

【0120】

本明細書で使用する場合、「倒伏」とは、穀物作物の植物の地面レベル近くでの茎の曲がりを指す。倒伏は１～９のスケールで評価される。一般に、スコア１は直立した植物を示す。スコア５は植物が地面に対して４５度の角度で傾いていることを示し、スコア９は植物が地面に横たわっていることを示す。表４は、対照及び改変されたダイズ植物を評価するために本明細書で使用される倒伏スケールを示す。

【0121】

本明細書で使用する場合、「終末開花日」とは、均一な圃場区画内の植物の５０％の主茎の末端節に１つの開いた花が存在する日を指す。

【0122】

本明細書で使用する場合、植物発育の「栄養相」は、発芽と開花の間の成長期間である。ダイズの栄養相の段階は次のとおりである：ＶＥ（出芽）、ＶＣ（子葉期）、Ｖ１（最初の三小葉の葉）、Ｖ２（２番目の三小葉の葉）、Ｖ３（３番目の三小葉の葉）、Ｖ（ｎ）（ｎ番目の三小葉の葉）、Ｖ６（まもなく開花）。本明細書で使用する場合、植物発育の「生殖相」は、開花から収穫の終わりまでの期間である。ダイズの生殖相の段階は次のとおりである：Ｒ１（開花開始、最初の花）、Ｒ２（満開、上部２節に花）、Ｒ３（最初の莢、上部４節に３／１６インチの莢）、Ｒ４（完全な莢、上部４節に３／４インチの莢）、Ｒ５（上部４節に１／８インチの種子）、Ｒ６（上部４節に完全なサイズの種子）、Ｒ７（成熟し始め、成熟した莢が１つ）、Ｒ８（完全に成熟、植物の莢の９５％が成熟した色に達している）。ダイズの栄養相及び生殖相は当業者に周知であり、これらの相を説明する数多くの出版物をワールドワイドウェブ及び他の場所で見つけることができる（例えば、Ｎｏｒｔｈ Ｄａｋｏｔａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ａ－１１７４，Ｊｕｎｅ１９９９，Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ａｎｄ Ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ Ａｕｇｕｓｔ２００４）。

【0123】

本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特段に指示されない限り、または文脈によって特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。任意の及びすべての実施例、または本明細書における特定の実施形態に関して提供される例示的な文言（例えば「など」）の使用は、単に本開示を例示することを意図しており、特許請求の範囲に記載されない限り、本開示の範囲に対する限定をもたらさない。

【0124】

本開示を詳細に記載してきたが、添付の請求項中で更に定義される本開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに、修飾物、変動物、及び同等な実施形態が可能であることは明らかであろう。更に、以下のものを包含する本開示中のすべての実施例が、非限定的実施例として提供されることが認識されるべきである。

【実施例】

【0125】

実施例１．遺伝子編集コンストラクトの設計。
遺伝子編集を利用して有限性座位の標的変異誘発を行うことで、様々な有限性表現型を付与する対立遺伝子を作成する機会が得られ、その結果、ダイズ植物の構造及び生長習性に多様性がもたらされる。茎先端でのダイズＤｔ１遺伝子座の優性対立遺伝子であるＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の特異的な内因性発現は、頂端分裂組織を最終分化から保護し、無限性をもたらす。有限性のレベルは、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーター領域の改変を通じて、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の発現レベルを変化させることによって調節できる。ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のコード配列は配列番号１として提供され、ＴＦＬ１ｂタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２として提供され、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含むＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列は配列番号３として提供される。

【0126】

ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の上流プロモーター領域を、遺伝子編集を使用する変異誘発の標的とした。植物形質転換用の４つの遺伝子編集コンストラクトは、図１に示すように、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の転写開始部位（ｔｉｓ）の上流にある２ｋｂプロモーター領域（配列番号４）内の様々な位置を標的とする、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して設計された。

【0127】

植物形質転換ベクターコンストラクトのそれぞれは、ｇＲＮＡによって標的とされる複数の位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を作成するように設計された。ＤＳＢ部位間の大きなセグメントの欠失と同様に、ＤＳＢ部位での小さな欠失が可能である。

【0128】

本実施例では、ゲノム編集コンストラクトはそれぞれ一般に、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子プロモーター領域における遺伝子編集及びＤＳＢの生成に関連する２～３個の機能領域またはカセットを含んでいた：Ｃｐｆ１タンパク質の発現、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子プロモーター領域を標的とする２～４個のｇＲＮＡの発現、及び任意選択で、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子プロモーター領域を標的とする更に４個のｇＲＮＡの発現。各ｇＲＮＡユニットには、Ｃｐｆ１遺伝子（配列番号：５）と適合する共通の足場、及び表１に列挙されているようにその意図された標的部位に相補的な固有のスペーサー／ターゲティング配列が含まれている。ｇＲＮＡスペーサーをコードするＤＮＡ配列及び意図された標的部位は、表１に列挙されている。

【表1-1】

【表1-2】

【0129】

編集コンストラクトｐＭ５５２のＣｐｆ１発現カセットは、核局在化シグナル（配列番号８）の１コピーで両側を挟まれた、イネにコドン最適化されたＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素（配列番号７）をコードする配列に作動可能に結合したダリアモザイクウイルスＦＬＴプロモーター（配列番号６）を含んだ。例えば、Ｇａｏ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（８）：７８９－７９２，２０１７）を参照のこと。表１に示す他の４つのコンストラクトにおけるＣｐｆ１発現カセットは、核局在化シグナル（配列番号８）の１コピーで両側を挟まれた、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素（配列番号１０）をコードするトウモロコシにコドン最適化された配列に作動可能に連結されたＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａユビキチンプロモーター（配列番号９）を含んでいた。

【0130】

すべてのコンストラクトに存在する１種類のｇＲＮＡ発現カセットは、ダイズＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ３）プロモーター（配列番号１１）に作動可能に結合された２～４個のｇＲＮＡをコードする配列を含んでいた。表１に列挙したスペーサー配列は、ＧｍＴＦＬ１ｂのプロモーター領域の代替切断部位を標的とした。ｐＭ５５２にのみ存在する更なる種類のｇＲＮＡ発現カセットは、ダイズ７ＳＬ＿ＣＲ１０プロモーター（配列番号１２）に作動可能に結合された別の４つのガイドＲＮＡをコードする配列を含んでいた。表１に列挙したスペーサー配列は、ＧｍＴＦＬ１ｂのプロモーター領域の代替切断部位を標的とする。

【0131】

具体的には、植物形質転換のための遺伝子編集コンストラクトは、参照配列の配列番号４のヌクレオチド１２３７位～ヌクレオチド１５７０位にわたるＤＮＡの領域を標的とするｇＲＮＡを含むように設計される。

【0132】

実施例２．ＧｍＴＦＬ１ｂのプロモーター領域における編集、及びゲノム編集された植物の接合性の確認。
近交系野生型ダイズ系統を、上記の実施例１に記載のｐＭ５５２ベクターを用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を介して形質転換した。形質転換された植物組織を成長させ、成熟したＲ_０植物を作成した。１つ以上の固有のゲノム編集を有するＲ_０植物を自家交雑し、Ｒ_１植物を作成した。編集されたＧｍＴＦＬ１ｂプロモーター配列を含み、編集されたＴ－ＤＮＡ配列を欠いている対立遺伝子に関してホモ接合性であるＲ_１植物を自家交雑し、Ｒ_２植物を作成した。

【0133】

ＧｍＴＦＬ１ｂプロモーター領域に行われた編集を決定するために、アンプリコン配列決定技術を使用し、野生型配列と比較するために２ｋｂプロモーター領域の変異配列を作成した。アンプリコン配列決定には、次世代配列決定のための対象ゲノム領域全体にわたる１つ以上の固有のＰＣＲ産物の作成が含まれる。次に、各試料からの配列データを参照配列にマッピングし、コンセンサス配列の違いを同定する。標的プロモーター領域の変異を幅広くカバーするために、長さ３０～１２２１塩基対（ｂｐ）の範囲の固有の欠失を持つ植物が選択された。１つ以上の編集を有するＲ_０植物を自殖させることによって作成された個々のＲ_１植物を、編集の性質及び編集された変異体または対立遺伝子の接合性についてアッセイし、表２に記載する。表２に記載のすべての編集された植物は、ｐＭ５５２コンストラクトの形質転換ベクターを使用して作成された。表２では、「Ｒ_０事象」はＲ_０植物識別子であり、「対立遺伝子名」は固有の対立遺伝子の識別子であり、ヌル（ＷＴ）は編集されていない近交系ダイズ植物に対応する。「原因傷害」とは、２ｋｂのプロモーター配列（配列番号４）の５’末端を起点とした、プロモーターの欠失セグメントの開始座標及び終了座標を示す。「Ｒ_１接合性」とは、Ｒ_１植物の接合性を、ホモ接合、ヘテロ接合、未決定（ＮＤ）、または致死（致死表現型をもたらした編集の場合）として示す。対立遺伝子ＡＬ４３０ａは、内因性ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子に対する３つの改変を含む：２つの欠失（配列番号４の９３９位で始まり、１０２８位で終わるセグメント、及び配列番号４の１０６６位で始まり、１６６４位で終わるセグメント）及び逆位変異（逆位され、欠失領域に再挿入された配列番号４の１０６５位で始まり、１０２９位で終わるセグメント）。

【表2】

【0134】

上記の表２のホモ接合性編集を、図１に示されたｇＲＮＡスペーサーとアラインメントして、図２に更に示している。

【0135】

同様に、成熟度群３．５のダイズ植物を使用し、ｐＭ２０５、ｐＭ２０６及びｐＭ２０７コンストラクトの形質転換ベクターを使用して編集された植物を作成した。１つ以上の編集を有するＲ_０植物を自殖させることによって作成された個々のＲ_１植物を、編集の性質及び編集された変異体または対立遺伝子の接合性についてアッセイし、表３に記載する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0136】

同様に、成熟度群５．９のダイズ植物を使用し、ｐＭ２０４及びｐＭ２０５コンストラクトの形質転換ベクターを使用して編集された植物を作成した。１つ以上の編集を有するＲ_０植物を自殖させることによって作成された個々のＲ_１植物を、編集の性質及び編集された変異体または対立遺伝子の接合性についてアッセイし、表４に記載する。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0137】

実施例３．改変されたダイズ植物におけるＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の発現レベル。
ＧｍＴＦＬ１ｂプロモーター変異体のホモ接合性対立遺伝子（Ｄｔ１対立遺伝子）を有するＲ_２植物と野生型対照植物を選択し、標的遺伝子の発現の違いを評価するためのサンプリングのために制御された環境で生育させた。植物は、ＶＣ相でサンプリングされ、ＶＣ相は、出芽相の後だが、子葉と単葉が完全に広がる、Ｖ１相の前の期間として定義される。単葉の葉と頂部の組織をドライアイス上で収集し、ＴａｑＭａｎアッセイによる遺伝子発現解析を行った。対立遺伝子エントリあたり１０個の生物学的複製を測定した。

【0138】

表５及び図３は、様々なホモ接合性Ｄｔ１対立遺伝子を有する編集されたダイズ植物のＶＣ相での葉及び頂部の組織におけるＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の相対発現レベルを示す。編集された植物は、編集コンストラクトｐＭ５５２を使用して作成された。図３に示すように、葉組織におけるＧｍＴＦＬ１ｂの発現は、試験したすべての試料でほんのわずかであった。

【表5】

【0139】

プロモーターがゲノム編集によって変異したため、Ｄｔ１対立遺伝子のほとんどは、内因性プロモーターを有する野生型植物と比較して、ＧｍＴＦＬ１ｂの発現レベルの低下を引き起こした。しかし、変異対立遺伝子ＡＬ３９８及びＡＬ４４７ｂは、遺伝子発現レベルの増加を示した。ＴＦＬ１の発現は、試験した試料のうち２つを除くすべてで大幅に減少した。

【0140】

実施例４．編集された対立遺伝子を含む、植物の終末開花日及び成熟日表現型の評価。
編集された植物の表現型を試験するために、ＧｍＴＦＬ１ｂプロモーター変異体のホモ接合性対立遺伝子（Ｄｔ１対立遺伝子）を有するＲ２植物及び野生型対照植物を選択し、標準的な農学的手法の下で屋根付き苗床及び耕地で栽培した。

【0141】

編集されたすべての植物は、ほぼ有限性のＡＬ４３０ａ対立遺伝子の植物であっても、野生型と同等以上の良好な出芽を示した。編集されたすべての植物は、野生型の無限性対照と同様に開花を開始した。編集された植物では着花に検出可能な変化は観察されず、Ｄｔ１遺伝子座によって制御される茎の成長習性形質が着花を制御する遺伝子と相互作用しないことを示している。

【0142】

屋根付きの苗床で観察されたように、編集されたＤｔ１対立遺伝子を持つ植物は、ほぼ有限性表現型から野生型よりも無限な（極端な無限性）までの範囲の有限性表現型を示し、いくつかの異なる品種の半有限性挙動は、図４に示すように、異なる終末開花日によって最初に証明された。終末開花日は、均一な圃場区画内の植物の５０％の主茎の末端節に１つの開いた花が存在する日として定義される。この評価の圃場は、畝間３０インチの長さ５フィートの畝２列からなり、圃場あたり約８０個の種子が播種され、畝間の圃場には１．５フィートの路地があった。

【0143】

ダイズ圃場における倒伏は、評価スケールを使用してＲ６発育相で始まる複数の観察を通じて評価され、茎の倒伏を示す各圃場の部分が決定される。観察は、後期Ｒ_７発育相の老化まで継続する。圃場は、表６のスケールを使用して倒伏を評価される。

【表6】

【0144】

観察圃場における野生型植物及びホモ接合性の編集された対立遺伝子の植物について、終末開花日、成熟日、及び倒伏評価を決定した。終末開花日は、ここで、試験の年の１月１日からの暦日数として計算される。成熟日は、圃場内の莢の９５％が成熟した莢の色に達した日として定義される。正確な成熟度が確認されなかった場合、成熟日の開始が記載された日付より早いもしくは遅いを示す「＞」または「＜」記号が表示される。終末開花日と成熟日は、すべての圃場が発育相に達するまで実験圃場を連続的に観察することによって決定される。発育相のスコアリングは、均一で損傷のない圃場の所定の２０インチ内部区画で圃場レベル（約１５個の連続した植物を含む）で実施された。測定された圃場区画の植物の５０％以上が発育相にある場合、圃場は問題の発育相に達しているとみなされる。有限性の変化は、植え付けから終末開花までの日数（ＤＯＴＦ）で定量化できる。試験のすべての植物で同じの所定の植え付け日の耕地では、対照との差異を簡単に計算するために、終末開花日及び他の生物季節学的特徴をその年の暦日によって記録できる。耕地環境における植物の観察から、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子プロモーター領域の編集された対立遺伝子は、表７に示すように、野生型の無限性植物より２２日早い開花日から４日遅い開花日まで、多様な終開花日をもたらした。編集された植物は、ｐＭ５５２編集コンストラクトを使用して作成された。

【表7】

【0145】

表７に示すように、終末開花日の変化は、対立遺伝子ＡＬ３９８、ＡＬ３９１ｂ及びＡＬ４４７ｂを有する植物を除き、ほとんどの編集された植物でＲ８成熟日の遅延を伴わなかった。これらの植物はすべて、未編集の野生型植物よりも遅い終末開花日を有し、野生型の植物よりも無限性である。

【0146】

より強い有限性またはより早い終末開花日の植物は、倒伏に対してより抵抗性のある植物を作成する構造的特徴を生み出すことが予想される。実際、表７に示すように、終末開花日が早い植物では倒伏が減少する明らかな傾向が見られる。ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーター領域のゲノム編集により、半有効性の様々なレベルに対応する様々な終末開花日を持つ植物が作成され、倒伏の危険性の軽減または排除につながった。倒伏は、特に背の高いエリートダイズ品種の場合、収穫価値の損失の原因となる。倒伏の減少により、ダイズの収穫価値及び収量が増加する可能性がある。倒伏の減少や立位性の向上により、樹冠を閉じた後のすべての地点で耕地へのアクセスのしやすさが改善される可能性があり、効果的な施肥及び害虫駆除などの利点がもたらされる。

【0147】

ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の平均相対発現レベルを表５から表７にコピーする。無限性ダイズにおける内在性ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子は無限性形質の優性対立遺伝子であるため、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の発現レベルの低下は、無限性のレベルの低下（または、有限性の増加）をもたらす。表７に示すように、平均相対発現レベルが低いほど、終末開花日がより早い、または有限性がより強いことに対応する傾向がある。この対応関係は、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子の発現レベルが、編集された植物の終末開花日または有限性レベルの予測因子として使用できることを示している。

【0148】

相対発現レベルの違いは、機能喪失型変異体だけでなく、無限性における機能獲得型変異体とも相関する。機能獲得型変異体は、野生型植物と比較して極端な無限性を示すと共に、ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子のプロモーター領域のゲノム編集による高次形態対立遺伝子の作成と一致する発現の増加を示す。

【0149】

実施例５．植物あたりの莢数から導出される潜在収量推定値。
実施例４に示すように、早い終末開花日表現型を有する編集されたダイズ植物は、改良された倒伏性及び立位性の特性を有する傾向があった。しかし、終末開花日が早いと、主幹と枝が未熟のまま終わるため、収量が失われる可能性もあり、植物の生産的な節の数が、頂芽優性の早期の断定及び生殖発育への供給源の完全な献身によって達成された節効率の改善が相殺できないほどに減少する。植物の高さ（及び、おそらく総節数）を実質的に変えることなく、有限な頂端節の生産性を保持しながら、野生型よりも著しく早い終末開花日を維持できることは注目に値する。これは、半有限性形質の導入によって植物あたりの莢の収量が減少しない可能性がある一方で、依然として立位性の向上による利点を享受できることを意味する。

【0150】

植物あたりの莢数は、均一で損傷のない圃場の所定の２０インチ内部区画（約１５個の連続した植物を含む）の圃場レベルで決定される。Ｒ６相またはそれ以降では、各圃場の所定の区画のすべての植物が切断されて、莢が失われないように包装される。各束からの莢は体系的に計数され、記録される。エントリ（対立遺伝子）あたりの莢数は、エントリあたりの計数されたすべての植物の平均として報告される。最適な倒伏特性を示した、編集された対立遺伝子ＡＬ３９１ａ及びＡＬ４１１ａを含む植物（表７を参照）、ならびに野生型不定植物を、植物あたりの莢数について評価し、予備結果を以下の表８に示す。

【表8】

【0151】

編集された植物は、ｐＭ５５２編集コンストラクトを使用して作成された。植物あたりの莢数は、誤差の範囲内で３つの植物群間で同等である。編集された半有限性植物は、莢を失うことなく、立位性が向上したことを示した。実際、編集された半有限性植物の平均莢数は、野生型の無限性植物よりも多く、半有限性の導入により、倒伏の減少による収量損失の削減と共に生産性の向上がもたらされる可能性があることが示唆されている。

【0152】

Ｄｔ１遺伝子座はダイズ栽培化の初期に固定されたため、これらの編集された対立遺伝子は無限性ダイズ生殖質に再現され得、半有限性を付与し、栽培系統に形質をもたらす可能性がある。特に収量の多い環境では、ダイズ耕地全体での立位性及び生産性の向上により、重要な価値が生み出され得る。更に、半有限性形質から生じるよりコンパクトな植物種は、狭い畝での成長及び更に高い密度での成長を促進する可能性がある。これらの集約的な農業構成の下では、コンパクトで直立した植物種により、樹冠の下の空気の流れが改善され、それによって湿度が低下し、これにより、経済的に重要な白かび病及び突然死症候群（ＳＤＳ）に対する感受性の低下を含む、真菌性病害に対する感受性が低下する可能性がある。

【0153】

実施例６．ＴＦＬ１相同体の遺伝子編集。
総収穫高と多様性に基づく配列比較のために、ナス科、アブラナ科及びマメ科のメンバーに加え、ワタ及び単子葉穀物を含む、農業に関連する植物種のサブセットが選択された。各種からヒットしたポリペプチド配列を最も高い同一性で同定するために、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰプログラムを使用し、ダイズＴＦＬ１ｂ（Ｄｔ１）ポリペプチド配列をクエリ配列として、非重複配列コレクションデータベースを検索セットとして使用した。同定された配列は、ＣＬＣ ＷｏｒｋｂｅｎｃｈのＣＬＵＳＴＡＬタイプのアルゴリズムによってアラインメントされた（非常に正確なアラインメントのためのデフォルトのパラメータ）。対比較は表形式で提供される（図５）。

【0154】

Ｚｅａ Ｍａｙｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ及びＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍに見られるＴＦＬ１ｂ遺伝子相同体の転写開始部位（ｔｉｓ）の上流の２ｋｂプロモーター領域のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号６７～７７、７９及び８１として本明細書に提供される。これらの追加の植物種または他の植物種において改変された有限性表現型を有する植物を作成するために、実施例１で上述したものと同様の手順を使用することができる。

【0155】

実施例１で上述したのと同様のプロセスに従って、約１０個の編集ガイドＲＮＡを、一般的なｇＲＮＡ設計制約に従って、ＴＦＬ１ｂ相同体の約２ｋｂのプロモーター領域にわたってほぼ等間隔で設計することができる（図１を参照）。配列番号６７～７７、７９及び８１の配列の３’末端に位置する約２００のヌクレオチドの基底プロモーター領域は、プロモーターが完全に機能しなくなる可能性を最小限に抑えるために回避されることができる。ｇＲＮＡ設計に続いて、実施例１に記載の工程に沿った工程に従って編集コンストラクトを作成し、編集された植物を作成することができ、これを更に分子的及び表現型の特徴付けに供させて、所望のレベルの相対発現及び有限性の調節を選択することができる。
実施例７．編集されたＤｔ１対立遺伝子を含む植物の追加の表現型特徴の評価。

【0156】

編集されたＤｔ１対立遺伝子を含むダイズ植物の更なる表現型特徴を評価した。本実施例に記載されているすべての形質効果は、所定のエントリの無限性野生型植物（成熟度群３．５の非改変ダイズ植物）に対する平均値のΔとして報告される。

【0157】

圃場には、畝間２０インチの長さ１０フィートの畝４列が含まれた。圃場の各範囲には、畝間に３フィートの路地があった。圃場あたり合計２８８個の種子を播種した。各試験エントリは実験ごとに１２圃場で複製され、野生型比較植物を含む十分な圃場を含む各試験エントリ複製セットでランダム化マッピングが行われた。以下に説明する形質指標は、耕地の各圃場について収集された。報告される得られる形質値は、１２回の反復すべてについての平均値のΔ、つまり、試験平均値と比較平均値の差である。この実験計画では、Ｐ値＜０．２は、統計的に有意であるとみなされる。発育相のスコアリングは、均一で損傷のない圃場の所定の２０インチ内部区画で圃場レベル（約１５個の連続した植物を含む）で実施された。測定された圃場区画の植物の５０％以上が発育相にある場合、圃場は特定の発育相に達しているとみなされた。大規模な定量的比較のために、相の決定は、植え付けから所望の相までの日数の観点から報告される。

【0158】

完全成熟日、植物あたりの枝の数、植物の高さ、及び植物の倒伏（立位）を含む植物の発育及び形態形質は、Ｒ８発育相で評価された。完全成熟は、植え付け日から、植物の莢の９５％が成熟した莢の色に達する日までの日数に基づいて決定された。植物の高さは、直線状の主茎の長さの直接測定値として記録された。植物の倒伏を、上記の実施例４に記載したように評価した。結果を以下の表９に示す。

【表9-1】

【表9-2】

【0159】

上記の実施例４の表７に示すように、ＡＬ３９８などの極端な無限性対立遺伝子（ＧｍＴＦＬ１ｂ遺伝子発現レベルの増加を示す）を有する植物は、成熟が著しく遅延すると共に終結も遅延した。しかしながら、上記の表９に示すように、ＡＬ３９８対立遺伝子を含む植物における終結の遅延には、適度に高い枝数、植物丈の増加、及び倒伏の増加が伴った。半有限性対立遺伝子を持つすべての植物は、無限性野生型植物より１日以上早く成熟したＡＬ４３７対立遺伝子を持つ植物を除き、無限性野生型植物の１日以内に成熟した。半有限性対立遺伝子を含む植物は、無限性野生型植物と比較して、２インチ～３０インチの範囲で植物丈が大幅に減少した。半有限性対立遺伝子を含む植物はより立位しており、野生型の無限性植物よりも１～４．７ポイント（１０％～４７％）低い倒伏評価を示した。これは、部分的には植物丈の低下によるものである。植物丈と倒伏の減少にもかかわらず、ほとんどの半有限性対立遺伝子は、無限性野生型植物と統計学的な差はないものの、植物あたり多数の枝をつけることを可能にした。対立遺伝子ＡＬ４３７を持つ植物のみが、枝数を大幅に減少させた。

【0160】

植物あたりの節数、植物あたりの莢数、及び節あたりの莢数を含む二次収量成分も評価した。二次収量成分は、均一で損傷のない圃場の所定の２０インチ内部区画で圃場レベル（約１５個の連続した植物を含む）で決定された。Ｒ８相では、各圃場の所定の区画のすべての植物が切断されて、莢が失われないように包装された。各植物の莢数及び節数を、系統的に計数して記録した。植物番号が記録され、所定の圃場の莢が主要収量成分分析のためにまとめられた。節あたりの莢数は、計数値から計算された。結果を以下の表１０に示す。

【表10】

【0161】

耕地での著しい早期終末を有する半有限性対立遺伝子を保有する植物はまた、枝数の損失がなく、成熟度が１日を超えて変化することなく、耕地での立位性が大幅に向上したことを示した。これらの特徴は、半有限性対立遺伝子が生産性を低下させることなく立位性を向上させる可能性があることを示唆している。しかし、茎先端の早期終末はまた、植物の生産的な節の数が、頂芽優性の早期の断定及び生殖発育への供給源の完全な献身によって達成された節効率の改善が相殺できないほどに減少することにより、収量が失われる可能性がある。半有限性対立遺伝子を保有する植物は、対立遺伝子に応じてある程度の植物丈の減少を示すが、これらの減少は、一般に植物あたりの生産的な節の大幅な変化とは関連しない。節の保持と一致して、ほとんどの半有限性対立遺伝子は、無限性野生型植物で計数された植物あたりの莢数と同等か、それよりも有意に高い植物あたりの莢数を付与する。試験したほとんどの半有限性植物の植物あたりの莢数は、無限性野生型植物と同等～２３莢多い範囲である。半有限性植物の莢数の増加は節効率の向上と関連しており、これは、節あたりの莢数が大幅に増加することによって示される。例外は、ＡＬ４３０ａ及びＡＬ４１１ｂ対立遺伝子であり、これらは、以前に表８に示したように、Ｄｔ１の早期終末及びほぼ機能喪失の程度による植物丈の極端な低下により、莢形質指標が有意にマイナスであった。

【0162】

植物あたりの種子、１０００個の種子重量、及び穀物収量推定値を含む主要な収量成分も、評価された。主要な収量成分は、所定の圃場内のすべての植物から収集した莢を脱穀し、測定された植物の数で正規化することによって圃場レベルで決定された。脱穀により、種子の総重量と種子数が返される。圃場あたりの１０００個の種子の重量は、種子の総重量を種子数で割り、１０００を掛けることによって計算される。穀物収量推定値は、単位面積あたりの推定種子に単一種子重量を乗算し、換算係数４５．３７５を乗算した関数であり、エーカーあたり６０ポンドのブッシェルという相対比較のためだけの推定値が返される。結果を以下の表１１に示す。

【表11-1】

【表11-2】

【0163】

本明細書に記載のほとんどの半有限性対立遺伝子で観察された二次収量成分は、無限性野生型植物と比較して同等であるか、または有意に正であった。これらの特性は、編集によって収量を損なうことなくダイズの立位性を大幅に改善できることを示している。正の二次収量成分を持つ対立遺伝子はまた、多くの場合、耕地で植物あたりの種子の増加を示した。これらの実験では、ほとんどの半有限性対立遺伝子で種子重量のある程度の減少が示された。しかし、種子重量の減少にもかかわらず、正の種子数を持つ半有限性対立遺伝子を保有するすべての植物は、依然としてニュートラルから正の穀物収量推定値を示した。対立遺伝子ＡＬ４１１ｂ及びＡＬ４３０ａは、植物丈の極端な低下に起因して、莢形質指標が著しく負であることが以前に指摘されたが、植物あたりの種子数及び穀物収量推定値の減少も示した。これは、茎先端の終末の減少に対する形質の大きさの有用な限界を示している。これらの観察は、場合によっては、収量の可能性だけでなく、立位性を高めるために適切な大きさの半有限性を付与する対立遺伝子の使用の可能性を実質的に裏付けている。

【0164】

以下の地上形質を評価した：樹冠被覆率評価、植え付けからＲ１相（開花の始まり）までの日数、及び植え付けから終末莢（ＴＰ）までの日数。樹冠被覆率は、圃場面積のうち植物が占める割合を示す。評価は、圃場の真上から見たときに、圃場内の緑色のピクセルと非緑色のピクセルを区別する、無人航空機によって取得されたリモートＲＧＢイメージングデータに基づいて行われる。例えば、樹冠被覆率４０％は、圃場の植栽スペースの６０％が空いている可能性が高いことを示す。終末期は、終末花または終末莢の形成日を観察することによって決定した。Ｒ１相及び終末莢相の期間は、すべての圃場が規定の発育相に達するまで、実験圃場を連続的に観察することによって決定した。着花は、植物の主茎のいずれかの節に開花した日付を記録することによって決定した。終末莢は、主茎の終末節に長さ３／１６インチ（０．５ｃｍ）以上の莢が１つあった日付を記録することによって決定した。結果を以下の表１２に示す。

【表12】

【0165】

Ｄｔ１遺伝子座に対する編集によって影響を受ける主な形質は、終了日である。Ｄｔ１遺伝子座の編集から生じる終末形質の変化のスペクトルは、植物の高さ及び立位性において比例した下流の変化をもたらす。半有限性対立遺伝子では、植え付けから終末莢までの日数が大幅に短縮され、無限性野生型植物よりも３．５日～１２日の範囲で早く、着花と成熟における最小限の変化と関連している。対立遺伝子ＡＬ４３７を保有する植物は、無限性野生型植物から１日以内に開花を開始した。Ｄｔ１編集により、半有限性対立遺伝子に応じて、終末における様々な大きさの統計的に有意な変化が生じた。測定されたほとんどの半有限性な編集された植物の地上形質は、Ｒ１生長相における無限性野生型植物と有意な差はなかった。

【0166】

バイオマスに関連する根の乾燥重量、苗条の乾燥重量、苗条と根の比率の地下形質も、Ｒ１相で決定された。これらの形質は、均一で損傷のない圃場の所定の２０インチ内部区画で圃場レベル（約１５個の連続した植物を含む）で評価された。Ｒ１相では、各圃場の所定の区画のすべての植物を地面から完全に取り出し、計数し、苗条と根の部分に分け、オーブンに移すために包装した。植物試料を完全に乾燥させた後、重量を圃場ごとに記録した。根と苗条のバイオマスは、植物あたりの平均で報告された。苗条と根の比率は、各エントリの平均苗条乾燥重量を平均根乾燥重量で割ることによって計算した。結果を以下の表１３に示す。

【表13】

【0167】

半有限性対立遺伝子を保有するほとんどの植物の地下バイオマス測定値及び比率は、Ｒ１生長相における無限性野生型植物と有意な差はなかった。半有限性対立遺伝子の１つであるＡＬ４３７は例外であり、３つのバイオマス指標すべてに対して有意に負であり、これは、植物全体のサイズが小さく、苗条が不釣り合いに小さいことを示している。これは、表１２に示すように、この対立遺伝子の樹冠被覆率が著しく小さいことから明らかである。

【0168】

全体として、これらの形質結果は、安定または向上した収量の可能性を備えた、より立位したダイズ品種の基礎となる固有の対立遺伝子を取得するための半有限性編集の有用性を示している。更に、結果は、Ｄｔ１遺伝子座の編集により、半有限性対立遺伝子だけでなく、準有限性対立遺伝子、有限性対立遺伝子、及び極端な無限性対立遺伝子も作成できることを示している。

【0169】

本開示を詳細に記載してきたが、本明細書及び添付の請求項で記載される本開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに、修飾物、変動物、及び同等な実施形態が可能であることは明らかであろう。更に、本開示における実施例はすべて非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】